KR102221587B1 - D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 발현 벡터, 형질전환체 및 pH 감지용 바이오 센서 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 포함하는 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 배지의 pH를 탐지 하기 위한 바이오 센서에 관한 것으로, 본 발명에 따른 발현 벡터는 감소하는 pH에 대한 반응성이 높아 대장균에서 D-자일론산 대사 산물을 생산하기 위한 합성 회로에 적용할 경우, D-자일론산 축적에 의해 감소되는 pH를 조절함으로써 D-자일론산 대사 산물의 생산 수율 및 생산 균주의 성장 증가시킬 수 있다.
Description
본 발명은 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 포함하는 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 배지의 pH를 탐지 하기 위한 바이오 센서에 관한 것이다.
조작된 균주의 대사 경로에 바이오 센서의 통합은 최대 생산성을 위한 최적화된 생합성 경로에 효과적이다. 이러한 접근은 특정 수준에서 독성이 있는 대사 경로의 전구 물질이나 관심 생산물의 합성을 담당하는 효소의 발현 시기 및 수준을 미세하게 조정함으로써 화학적 생산의 신진대사 부담을 최소화하기 위한 병목 현상을 완화하는 것을 목표로 한다(Keasling, 2010; Ajikumar et al., 2010).
공학적 대사 경로의 최적화를 위한 리보 스위치, 전사 인자 또는 효소와 같은 바이오 센서에 대한 엄청난 장래성에도 불구하고 바이오 센서 기술에 대한 몇 가지 제약이 계속해서 제기되고 있다(Jung et al., 2018). 지금까지 화학적 생산을 위한 인공 대사 경로의 내장된 대부분의 바이오 센서는 세포 내 자극이나 분자만을 검출 할 수 있을 뿐, 세포외 환경에 있고 세포질 막을 통과 할 수 없는 것들은 검출할 수 없다는 문제점이 있다. 예를 들어 Chong and Ching (2016)의 연구에서 유기인계 농약(organophosphorus pesticides)의 가수분해 생성물인 4-니트로페놀(4-nitrophenol)이 세포막을 통해 침투할 수 있는 살충제를 직접 감지하는 대신 작동 분자로 사용되어 세포내 바이오 센서로 감지 할 수 있게 하였다. 이 제한은 외부 자극을 감지 할 수 있는 특성화된 수용체가 없기 때문이다. 따라서, 외부 자극을 검출할 수 있는 바이오 센서를 찾고, 대사 신호 경로의 자율적인 조절을 허용하는 정보를 세포 신호로 변환할 필요가 있다.
대장균(Escherichia coli)에는 외부 자극을 탐지하는 잠재적인 바이오 센서로 활용할 수 있는 자연적 투과막 신호 시스템이 있다. 막 통합 일체형 시스템은 ToxR family(콜레라균(Vibrio cholerae)의 독성 주요 조절 인자의 이름을 따서 명명 됨), 세포질의(periplasmic) 센서 도메인 및 세포내 winged helix-turn-helix DNA 결합 도메인을 가진 bitopic 막 단백질(단일 막관통 단백질 α-helix)로 구성된다(Jung et al., 2018). 이들은 또한 포스포릴 수용체 도메인이 없기 때문에 박테리아 막 관통 신호 시스템의 가장 단순한 형태로 간주된다. 광범위하게 연구된 박테리아 transmembrane one-component 조절제 중 하나는 CadC이다. 이 레귤레이터는 낮은 pH 및 라이신의 두 가지 자극에 의해 활성화된다(Fritz et al., 2009). CadC의 주변 세포질 영역(periplasmic domain; 페리플라즘 도메인)은 산성 아미노산 잔기의 부분적 양성자화 결과로서 pH의 감소를 직접 감지한다(D198, D200, E461, E468, and D471) (Jung et al., 2018; Dell et al., 1994; Haneburger et al., 2011). 이것은 서브 도메인/모노머들 사이의 반발력을 감소시키고 박테리아 세포질에서 CadC에 의한 전사 활성화를 개시하는 주변 세포질 영역의 이합체화를 촉진시킨다(Eichinger et al., 2011; Lindner and White, 2014).
감각 도메인에 의해 수신된 신호는 DNA 결합 도메인 트렌스멤브레인 나선(transmembrane helix)을 통해 cadBA 프로모터와 상호 작용하여 오페론의 발현을 유도함으로써 형질 도입된다(Buchner et al., 2015; K
per et al., 2005). 실제로, CadC는 전체 길이의 막-통합 수용체가 cadBA 프로모터에 결합할 수 있는 신호 전달의 드문 방식을 갖는다. 더욱이, 라이신 특이적인 이차 수송체 LysP에 대한 CadC의 헤테로 올리고머 상호 작용은 낮은 pH에 의해 활성화되는 전사 인자로서의 능력을 제한한다. 라이신의 부재는 전사 활성화를 방해하는 반면, 두 단백질의 상호 작용은 라이신 및 낮은 pH의 존재 하에서 손상되어 헤테로-올리고머 상호 작용의 구조 변화 및 불안정화를 초래한다(Dell et al., 1994; Rauschmeier et al., 2014; Tetsch et al., 2008). LysP는 라이신 존재 하에서 라이신 의존성 형태 변화를 통해 CadC에 신호를 전달한다.
CadC는 대장균의 transmembrane에 결합되어있을 때 세포외 자극을 감지하는 잠재적인 바이오 센서이지만 LysP와의 이종 고분자 상호 작용은 라이신의 존재를 필요로 하는 순수한 pH 센서로서의 기능을 제한한다. 따라서, 이 한계를 극복하기 위해, 라이신 비의존성 CadC 변이체를 확인하고, 본 발명에서 pH 센서로서 사용하였다. 첫 번째 변이체는 라이신과 무관한 것으로 입증된 아미노산 클러스터(F159 ~ 165)가 결실된 CadC이다(Tetsch et al., 2008). Testch et al.의 연구에서(2008), 이 CadC 변종은 과발현되지 않았음에도 불구하고 다른 변이 형에서 더 높은 활성을 보였다.
자일론산(Xylonate)의 축적은 자일로오스(Xylose) 산화 경로(XOP)를 에틸렌 글리콜과 같은 부가가치 화합물의 합성을 위한 유일한 경로로 사용하는 대장균의 대사 공학에서 문제가 되어 왔으며, 특히 자일로오스 탈수소효소(xylose dehydrogenase; xdh)를 과다 발현한 경우에 자일론산(Xylonate) 축적 문제가 심화되었다. 배지에서의 자일론산의 축적은 조작된 균주에서 pH 저하에 대한 스트레스 반응을 유도할 수 있으며, 조작된 균주의 최적 성장 및 최적의 효소 기능에 대해 세포외 환경이 적합하지 않아 수율과 생산성이 낮아진다. 낮은 pH에서 최적으로 기능하는 효소가 있지만 대부분의 효소는 중성 pH에서 최적이다. 이전의 연구에서, D-자일로오스의 D-자일론산으로의 전환은 pH 수준이 4.0에 도달하면 멈추는 것으로 관찰되었다(Liu et al., 2012). 이 결과에 근거하여, 자일로오스 탈수소효소(xylose dehydrogenase)는 낮은 pH의 영향을 받을 수 있다고 가정하였다. 또한, Valdehuesa et al. (2013)은 배양물에서 검출된 유일한 유기산인 D-자일론산의 축적으로 인해 pH의 저하가 또한 관찰되었다고 보고했다. 이 연구는 또한 자일론산 축적의 결과로 pH가 낮아짐에 따라 최종 생산물의 생산성과 수율이 낮다는 것을 문제점을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, pH 센서로서 CadC 단백질의 염기서열인 서열번호 1에서 475bp 내지 495bp가 결실된 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자 및 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 락토오스 단백질을 코딩하는 lacI 유전자 및 상기 lacI 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및, 자일로오스 탈수소효소를 코딩하는 xylBcc 유전자, 자일로노락토네이즈를 코딩하는 xylC 유전자 및 락토오스 단백질의 발현에 따라 하류의 xylBcc 유전자 및 xylC 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 를 함유하는 발현 벡터는 낮은 pH에 대한 반응성이 우수하므로, 이를 Dahms 경로에 적용할 경우, pH가 감소함에 따라 자일로스 탈수소효소의 발현을 하향 조절하여 배지에서 pH가 감소하는 것을 방지하고 일정 수준의 pH를 유지함으로써 D-자일로오스 대사 산물의 생산성 및 Dahms 경로를 지닌 균주의 성장을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 pH에 대한 반응성이 우수한 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 함유하는 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 배지의 pH를 탐지 하기 위한 바이오 센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은, i) pH 센서로서 CadC 단백질의 염기서열인 서열번호 1에서 475bp 내지 495bp가 결실된 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자 및 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; ii) 락토오스 단백질을 코딩하는 lacI 유전자 및 상기 lacI 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및 iii) 자일로오스 탈수소효소를 코딩하는 xylBcc 유전자, 자일로노락토네이즈를 코딩하는 xylC 유전자; 및, 락토오스 단백질의 발현에 따라 하류의 xylBcc 유전자 및 xylC 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 를 함유하는 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 본 발명과 관련된 발현 벡터는 프로모터가 lacIq 프로모터 및 cadBA 프로모터인 벡터로서, 프로모터는 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 벡터는 숙주세포의 게놈내로 통합되어 있는 형태일 수도 있다.
본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 D-자일론산 반응성 발현조절 서열과 목적하는 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 발현 벡터는 조절 요소로 pH 센서로서 CadC 단백질의 염기서열인 서열번호 1에서 475bp 내지 495bp가 결실된 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자 및 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 필수적으로 포함하고, 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 D-자일로오스 대사 과정에서 D-자일론산의 생성에 의해 감소하는 pH에 대한 반응성이 우수하며, 이에 따라 본 발명에서는 상기 발현 벡터를 pH 센서라고 지칭하였다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된(pH 센서를 갖는) 균주는 형질전환되지 않은(pH 센서를 갖는 균주)보다 높은 pH에서 자일론산 생성이 억제되는 것을 확인하였다(실시예 1 및 도 2b, 2c 참조). 이러한 결과는, 본 발명에 따른 발현 벡터는 감소하는 pH에 대한 반응성이 우수하므로, 자일로오스 산화 경로의 최적화를 위한 도구로서 이용 가능함을 시사한다.
본 발명의 발현 벡터에 있어서, 상기 i)에서 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 프로모터 lacIq이고, ii)에서 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 프로모터 cadBA이며, iii)에서 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 프로모터 T7인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발현 벡터에 있어서, 상기 D-자일로오스 대사 산물은 에틸렌글리콜, 글리콜산, 1,2,4-부탄트리올, 1,4-부탄디올, 에탄올 및 옥살로글루타르산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 발현 벡터의 자일론산 축적 조절 메커니즘을 확인한 결과, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 대장균은 배지의 pH를 6.0 이상으로 유지시킴과 동시에 바이오매스도 증가시켰다(실시예 2 및 도 3a 내지 도 3d 참조). 이러한 결과는, 본 발명에 따른 발현 벡터가 배지의 pH가 감소되는 것을 빠르게 감지하여 자일론산의 생성을 일시적으로 억제시키고, 바이오매스를 증가시켜 대장균 세포의 성장을 증가시킴으로써 D-자일론산 대사 산물의 생산성을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질 전환된 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에 있어서, 벡터로 형질전환 가능한 숙주세포는 재조합 단백질을 생산하는 숙주세포로서 공지된 것이라면 어떠한 것이든 이용가능하다. 숙주세포로는 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에 있어서, 상기 D-자일로오스 대사 산물은 에틸렌글리콜, 글리콜산, 1,2,4-부탄트리올, 1,4-부탄디올, 에탄올 및 옥살로글루타르산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 포함하는 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 배지의 pH를 탐지 하기 위한 바이오 센서를 제공한다.
본 발명의 바이오 센서에 있어서, 상기 바이오 센서는 배지의 pH가 5.5 내지 6.5 이하로 떨어지는 것을 방지하고, 배지의 pH를 5.5 내지 6.5로 유지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바이오 센서에 있어서, D-자일로오스 대사 산물은 에틸렌글리콜, 글리콜산, 1,2,4-부탄트리올, 1,4-부탄디올, 에탄올 및 옥살로글루타르산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, D-자일로오스 대사 산물 중 하나인 에틸렌 글리콜의 생산성을 확인하기 위하여, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 균주를 실험 배지에서 배양한 결과, 상기 균주가 배양된 배지에는 생성된 자일론산이 거의 없었으며, 대조 균주 대비 에틸렌 글리콜 생산성이 우수하였다(실시예 4 및, 도 5b 내지 도 5d). 이러한 결과는, 본 발명에 따른 발현 벡터가 배지의 pH가 감소되는 것을 빠르게 감지하여 자일론산의 생성을 억제시킴으로써 D-자일론산 대사 산물인 에틸렌 글리콜의 생산성을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 발현 벡터는 감소하는 pH에 대한 반응성이 높아 대장균에서 D-자일론산 대사 산물을 생산하기 위한 합성 회로에 적용할 경우, D-자일론산 축적에 의해 감소되는 pH를 조절함으로써 D-자일론산 대사 산물의 생산 수율 및 생산 균주의 성장 증가시킬 수 있다.
도 1은 CadC 변종을 이용한 낮은 pH 센서의 구성 및 용량 감지를 확인한 결과로서, 도 1a는 낮은 pH 센서의 구조(PT7, 박테리오파지 T7 프로모터; cadCv, 라이신 비의존성 pH 민감성 cadC 변이체(cadC ΔF159-165 또는 CadC 1-215 ); PcadBA, 낮은 pH에서 CadC에 의해 활성화되는 cadB(카다베린 및 lysine antiporter(라이신 역수송체) 유전자) 및 cadA (라이신 데시복실라제 유전자)의 천연 프로모터; sfGFP, superfolder 녹색 형광 단백질(리포터 단백질))이고, 도 1b는 중성 pH(7.0) 조건 하에서 재조합 균주의 sfGFP 형광을 측정한 결과이며, 도 1c는 낮은 pH(5.8) 조건에서 재조합 균주의 sfGFP 형광을 측정한 결과. 도 1b 및 도 1c에서, 0H와 12H는 OD600이 0.6에 도달했을 때 형광 측정 값을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 유잔자 회로 및 이를 적용한 대장균에서 낮은 pH-의존성 자일론산의 생산 결과를 나타낸다. 도 2a는 lacIq 프로모터의 하류에 있는 cadC ΔF159-165 로 구성된 자일로오스 산화 경로에서 조작된 발현 벡터(pH 센서)를 도식화한 것으로, T7 프로모터 하류에는 자일론산 생산 유전자인 xylB CC (xylose dehydrogenase) 및 xyl C (xylonolactonase)가 위치하고, lacI 유전자(LacI 리프레서 코딩 유전자)는 cadBA 프로모터의 하류에 위치한다. 도 2b 및 도2c는 발현 벡터(pH 센서)가 없는 BLXA 균주 및 발현 벡터(pH 센서)가 있는 BLXAPH 균주의 자일론산 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 xylose oxidative pathway(XOP)에서 발현 벡터(pH 센서)에 의한 자일론산 축적의 조절을 보여주는 것으로, 도 3a 및 3b는 자일로오스 탈수소효소의 pH 수준 및 효소 활성을 나타내는 결과이고, 도 3c 및 도3d는 균주의 자일로오스 소모, 자일론산 축적 및 바이오매스 생성 결과이다.
도 4a는 배지의 pH 레벨을 나타내는 것이고, 도 4b는 효소 활성나타내며, 도 4c 및 도 4d는 EWXA and EWXAPH에서 자일론산 소모 및 자일론산 축적을 확인한 결과이다.
도 5는 낮은 pH 조절을 통한 에틸렌 글리콜 생산 결과를 나타내는 것으로, 도 5a는 발현 벡터(pH 센서)에 의해 조절되는 에틸렌 글리콜 생합성 과정을 도식화한 것이고, 도 5b는 대조 균주 EWEG 및 EWEGPH에 따른 배지의 pH를 나타내는 결과이고, 도5c 및 도 5d는 EWEGPH 및 EWEG 균주에서의 대사 산물 농도를 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 사용된 플라스미드 지도이다.
도 2는 본 발명에 따른 유잔자 회로 및 이를 적용한 대장균에서 낮은 pH-의존성 자일론산의 생산 결과를 나타낸다. 도 2a는 lacIq 프로모터의 하류에 있는 cadC ΔF159-165 로 구성된 자일로오스 산화 경로에서 조작된 발현 벡터(pH 센서)를 도식화한 것으로, T7 프로모터 하류에는 자일론산 생산 유전자인 xylB CC (xylose dehydrogenase) 및 xyl C (xylonolactonase)가 위치하고, lacI 유전자(LacI 리프레서 코딩 유전자)는 cadBA 프로모터의 하류에 위치한다. 도 2b 및 도2c는 발현 벡터(pH 센서)가 없는 BLXA 균주 및 발현 벡터(pH 센서)가 있는 BLXAPH 균주의 자일론산 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 xylose oxidative pathway(XOP)에서 발현 벡터(pH 센서)에 의한 자일론산 축적의 조절을 보여주는 것으로, 도 3a 및 3b는 자일로오스 탈수소효소의 pH 수준 및 효소 활성을 나타내는 결과이고, 도 3c 및 도3d는 균주의 자일로오스 소모, 자일론산 축적 및 바이오매스 생성 결과이다.
도 4a는 배지의 pH 레벨을 나타내는 것이고, 도 4b는 효소 활성나타내며, 도 4c 및 도 4d는 EWXA and EWXAPH에서 자일론산 소모 및 자일론산 축적을 확인한 결과이다.
도 5는 낮은 pH 조절을 통한 에틸렌 글리콜 생산 결과를 나타내는 것으로, 도 5a는 발현 벡터(pH 센서)에 의해 조절되는 에틸렌 글리콜 생합성 과정을 도식화한 것이고, 도 5b는 대조 균주 EWEG 및 EWEGPH에 따른 배지의 pH를 나타내는 결과이고, 도5c 및 도 5d는 EWEGPH 및 EWEG 균주에서의 대사 산물 농도를 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 사용된 플라스미드 지도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실험방법]
DNA 조작
표준 기술을 모든 유전자 조작 실험에 사용하였다(Green and Sambrook 2012). 약간의 변경을 가한 Gibson 등온 조립 방법을 DNA 조립에 사용하였다(Gibson et al. 2009). 본 발명에서 사용된 재조합 플라스미드 및 대장균 균주 목록은 표 1에 나타내었다. Michael Davidson과 Geoffrey Waldo(Addgene plasmid # 54519) (P
delacq et al. 2006)로 부터 기증받은 plasmid sfGFP-pBAD를 sfGFP 유전자를 위해 사용하였다. 모든 PCR 반응은 표 2에 기재된 적절한 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 Phusion High-fidelity DNA 중합 효소를 사용하여 수행하였다. 본 발명에서 사용된 유전자 요소와 유전자의 전체 목록은 표 3에 나타내었다. 구축된 플라스미드는 one-step TSS(형질 전환 및 저장 솔루션) 프로토콜을 사용하여 화학적으로 유능한 DH5α 세포로 형질 전환되었으며(Chung 외. 1989), DNA 시퀀싱을 통해 염기서열을 확인하였다.
| 플라스미드 | 상대적 특징 | 레퍼런스 |
| pACM4 | pACYC-Duet derivative; with ePathBrick feature; T7 promoter; Cmr | Xu et al., 2012 |
| pRSETA | T7 promoter; ampR | Invitrogen |
| sfGFP-pBAD | PpBAD-sfGFP (Addgene #54519) | * |
| pRT7 | pRSETA carrying sfGFP under T7 promoter | This work |
| pRCADC1 | pRSETA carrying sfGFP under cadAB promoter; Mutant cadC_ㅿF159-165 (Deletion of amino acids F159-F165 of cadC) under T7 promoter. | This work |
| pRCADC2 | pRSETA carrying sfGFP under cadAB promoter; Truncated cadC1-215 (CadC protein with 1-215 amino acids only) under T7 promoter. | This work |
| pRBC | pRSETA carrying codon-optimized xylB and xylC from C. crescentus under T7 promoter. | This work |
| pRBCPH | pRSETA carrying codon-optimized xylB and xylC from C. crescentus under T7 promoter, , lacI under cadAB promoter, and cadC_ㅿF159-165 under lacIq promoter. | This work |
| pAB | pACM4 without lacI carrying yjgB from E.coli under lacIq promoter. | This work |
| Strains | ||
| E. coli DH5α | F’ Φ80lacZㆍΔM15 ㆍf(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rk -,mk +)phoAsupE44thi-1gyrA96relA1 | Enzynomics |
| BL21(DE3) | F - ompT hsdS B (rB - mB -) gal dcm (DE3) | Novagen |
| BL21(DE3) ΔxylAB | BL21 (DE3) with deletion in xylAB genes | This work |
| E. coli W3110 (DE3) ΔxylAB | F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1λ-(DE3); ATCC No.27325; with deletion in xylAB genes | Liu et al., 2012 |
| E. coli W3110 ΔxylABΔyjgBΔaldA | F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1λ-(DE3); ATCC No.27325; with deletion in xylA, xylB, yjgB and aldA genes | Cabulong et al., 2017 |
| BLC | BL21(DE) pRSETA | This work |
| BLT7 | BL21(DE) pRT7 | This work |
| BLPH1 | BL21(DE) pRCADC1 | This work |
| BLPH2 | BL21(DE) pRCADC2 | This work |
| BLXA | BL21(DE3) ΔxylAB pRBC | This work |
| BLXAPH | BL21(DE3) ΔxylAB pRBCPH | This work |
| EWXA | E. coli W3110 (DE3) pRBC | This work |
| EWXAPH | E. coli W3110 (DE3) pRBPH | This work |
| EWEG | E. coli W3110 ΔxylABΔyjgBΔaldA pRBC pAB | This work |
| EWEGPH | E. coli W3110 ΔxylABΔyjgBΔaldA pRBCPH pAB | This work |
*sfGFP-pBAD는 Michael Davidson & Geoffrey Waldo (Addgene plasmid # 54519)로부터 기증 받았다.
| 프라이머 이름 | 염기서열 (5’→3’)* | |
| Gibson Assembly a 를 위한 클로닝 프라이머 | ||
| 서열번호 | ||
| 9 | 1CadCdelta159-165/1-215 F | tgacgataaggatcgatgggATGCAACAACCTGTAGTTCGCGTTGGCGAATG |
| 10 | 1CadCdelta159-165 R | acgacaacagGGTAGTGAATCGTTTGCTTTTAACTGGGGATTGTTC |
| 11 | 2 CadCdelta1 59-165 F | attcactaccCTGTTGTCGTTAGGTATCTGTGTAGCACTG |
| 12 | 2 CadCdelta159-165 R | aattccatggTTATTCTGAAGCAAGAAATTTGTCGAGATAAGG |
| 13 | T7 Terminator for CadCdelta159-165 F | ttcagaataaCCATGGAATTCGAAGCTTGATCCGGCTGC |
| 14 | CadC1-215 R | aattccatggTTAATACGGGGAACTCCAGCTGTTACAACTTTTATTTACCATATTAATG |
| 15 | T7-Terminator for CadC1-215R | cccgtattaaCCATGGAATTCGAAGCTTGATCCGGCTGC |
| 16 | T7-Terminator for CadCdelta159-165/1-215 R | ccggagttacTTCGCTATTACGCCAGATCCGGATATAGTTCC |
| 17 | CadABp F | taatagcgaaGTAACTCCGGGTTGATTTATGCTCGGAAATATTTG |
| 18 | CadABp R | tgctcaccatGCTCTTCTCCTAATTTCATTTTTGAATTTGGAG |
| 19 | sfGFP F | ggagaagagcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC |
| 20 | sfGFP R | ctttgttagcagccggatcaTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGTGAG |
| 21 | lacO-xdh F control | gagaccacaacggtttccctGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTG |
| 22 | lacO-xdh R control | ttcctcctgtTCAACGCCAACCCGCGTCGATC |
| 23 | xylC F control | ttggcgttgaACAGGAGGAATGACCGCGCAG |
| 24 | xylC R control | agctgcagatctcgagctcgTTAAACCAGACGAACTTCGTGCTGC |
| 25 | xdH-xylC F | GagaccacaacggtttccctATGTCTTCTGCGATCTACCCGTCTCTG |
| 26 | xdH-xylC R | gatccccatcgatTCAACGCCAACCCGCGTCGATC |
| 27 | T7 Terminator F | ttggcgttgaATCGATGGGGATCCGAGCTCGAGATCTGC |
| 28 | T7 Terminator R | acggtgaaaaGCCGCTACAGGGCGCGTCCC |
| 29 | lacIq Promoter F | ctgtagcggcTTTTCACCGTCATCACCGAAAC |
| 30 | lacIq Promoter R | caggttgttgcatCCTGAATTGACTCTCTTCCGG |
| 31 | CadCΔF159-165 F | tcaattcaggATGCAACAACCTGTAGTTCGC |
| 32 | CadCΔF159-165 R | ggcaaattctTTATTCTGAAGCAAGAAATTTGTCGAGATAAGG |
| 33 | rrnB Terminator F | ttcagaataaAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAG |
| 34 | rrnB Terminator R | agctgcagatctcgagctcgAACGCAAAAAGGCCATCCGTC |
| 35 | pacM4 without lacI F | aattgcgttgGGTGTCCGGGATCTCGACGC |
| 36 | pacM4 without lacI R | cccggacaccCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGC |
| 37 | pacM4 for yjgB F | ATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATG |
| 38 | pacM4 for yjgB R | GCGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCAC |
| 39 | yjgB F | CCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATATGTCGATGATAAAAAGCTATGCCGCAAAAGAAGCGGGCG |
| 40 | yjgB R | GTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCAAAAATCGGCTTTCAACACCACGCGGTAACGCGCCTTA |
* 5 '오버행은 밑줄로 표시하였다.
|
서열
번호 |
Name | Sequence (5’→3’) |
| 1 | cadC WT | ATGCAACAACCTGTAGTTCGCGTTGGCGAATGGCTTGTTACTCCGTCCATAAACCAAATTAGCCGCAATGGGCGTCAACTTACCCTTGAGCCGAGATTAATCGATCTTCTGGTTTTCTTTGCTCAACACAGTGGCGAAGTACTTAGCAGGGATGAACTTATCGATAATGTCTGGAAGAGAAGTATTGTCACCAATCACGTTGTGACGCAGAGTATCTCAGAACTACGTAAGTCATTAAAAGATAATGATGAAGATAGTCCTGTCTATATCGCTACTGTACCAAAGCGCGGCTATAAATTAATGGTGCCGGTTATCTGGTACAGCGAAGAAGAGGGAGAGGAAATAATGCTATCTTCGCCTCCCCCTATACCAGAGGCGGTTCCTGCCACAGATTCTCCCTCCCACAGTCTTAACATTCAAAACACCGCAACGCCACCTGAACAATCCCCAGTTAAAAGCAAACGATTCACTACCTTTTGGGTATGGTTTTTTTTCCTGTTGTCGTTAGGTATCTGTGTAGCACTGGTAGCGTTTTCAAGTCTTGATACACGTCTTCCTATGAGCAAATCGCGTATTTTGCTCAATCCACGCGATATTGACATTAATATGGTAAATAAAAGTTGTAACAGCTGGAGTTCCCCGTATCAGCTCTCTTACGCGATAGGCGTGGGTGATTTGGTGGCGACATCACTTAACACCTTCTCCACCTTTATGGTGCATGACAAAATCAACTACAACATTGATGAACCGAGCAGTTCCGGTAAAACATTATCTATTGCGTTTGTTAATCAGCGCCAATACCGTGCTCAACAATGCTTTATGTCGATAAAATTGGTAGACAATGCAGATGGTTCAACCATGCTGGATAAACGTTATGTCATCACTAACGGTAATCAGCTGGCGATTCAAAATGATTTACTGGAGAGTTTATCAAAAGCGTTAAACCAACCGTGGCCACAACGAATGCAGGAGACGCTCCAGAAAATTTTGCCGCATCGTGGTGCGTTATTAACTAATTTTTATCAGGCACATGATTATTTACTGCATGGCGATGATAAATCATTGAACCGTGCCAGTGAATTATTAGGTGAGATTGTTCAATCATCCCCAGAATTTACCTACGCGAGAGCAGAAAAAGCATTAGTTGATATCGTGCGCCATTCTCAACATCCTTTAGATGAAAAACAATTAGCAGCACTGAACACAGAAATAGATAACATTGTTACACTGCCGGAATTGAACAACCTGTCCATTATATATCAAATAAAAGCGGTCAGTGCTCTGGTAAAAGGTAAAACAGATGAGTCTTACCAGGCGATAAATACTGGCATTGATCTTGAAATGTCCTGGCTAAATTATGTGTTGCTTGGCAAGGTTTATGAAATGAAGGGGATGAACCGGGAAGCAGCTGATGCATATCTCACCGCCTTTAATTTACGCCCAGGGGCAAACACCCTTTACTGGATTGAAAATGGTATATTCCAGACTTCTGTTCCTTATGTTGTACCTTATCTCGACAAATTTCTTGCTTCAGAATAA |
| 2 | CadC ΔF159-165 | ATGCAACAACCTGTAGTTCGCGTTGGCGAATGGCTTGTTACTCCGTCCATAAACCAAATTAGCCGCAATGGGCGTCAACTTACCCTTGAGCCGAGATTAATCGATCTTCTGGTTTTCTTTGCTCAACACAGTGGCGAAGTACTTAGCAGGGATGAACTTATCGATAATGTCTGGAAGAGAAGTATTGTCACCAATCACGTTGTGACGCAGAGTATCTCAGAACTACGTAAGTCATTAAAAGATAATGATGAAGATAGTCCTGTCTATATCGCTACTGTACCAAAGCGCGGCTATAAATTAATGGTGCCGGTTATCTGGTACAGCGAAGAAGAGGGAGAGGAAATAATGCTATCTTCGCCTCCCCCTATACCAGAGGCGGTTCCTGCCACAGATTCTCCCTCCCACAGTCTTAACATTCAAAACACCGCAACGCCACCTGAACAATCCCCAGTTAAAAGCAAACGATTCACTACCCTGTTGTCGTTAGGTATCTGTGTAGCACTGGTAGCGTTTTCAAGTCTTGATACACGTCTTCCTATGAGCAAATCGCGTATTTTGCTCAATCCACGCGATATTGACATTAATATGGTAAATAAAAGTTGTAACAGCTGGAGTTCCCCGTATCAGCTCTCTTACGCGATAGGCGTGGGTGATTTGGTGGCGACATCACTTAACACCTTCTCCACCTTTATGGTGCATGACAAAATCAACTACAACATTGATGAACCGAGCAGTTCCGGTAAAACATTATCTATTGCGTTTGTTAATCAGCGCCAATACCGTGCTCAACAATGCTTTATGTCGATAAAATTGGTAGACAATGCAGATGGTTCAACCATGCTGGATAAACGTTATGTCATCACTAACGGTAATCAGCTGGCGATTCAAAATGATTTACTGGAGAGTTTATCAAAAGCGTTAAACCAACCGTGGCCACAACGAATGCAGGAGACGCTCCAGAAAATTTTGCCGCATCGTGGTGCGTTATTAACTAATTTTTATCAGGCACATGATTATTTACTGCATGGCGATGATAAATCATTGAACCGTGCCAGTGAATTATTAGGTGAGATTGTTCAATCATCCCCAGAATTTACCTACGCGAGAGCAGAAAAAGCATTAGTTGATATCGTGCGCCATTCTCAACATCCTTTAGATGAAAAACAATTAGCAGCACTGAACACAGAAATAGATAACATTGTTACACTGCCGGAATTGAACAACCTGTCCATTATATATCAAATAAAAGCGGTCAGTGCTCTGGTAAAAGGTAAAACAGATGAGTCTTACCAGGCGATAAATACTGGCATTGATCTTGAAATGTCCTGGCTAAATTATGTGTTGCTTGGCAAGGTTTATGAAATGAAGGGGATGAACCGGGAAGCAGCTGATGCATATCTCACCGCCTTTAATTTACGCCCAGGGGCAAACACCCTTTACTGGATTGAAAATGGTATATTCCAGACTTCTGTTCCTTATGTTGTACCTTATCTCGACAAATTTCTTGCTTCAGAATAA |
| 3 | cadC1-215 | ATGCAACAACCTGTAGTTCGCGTTGGCGAATGGCTTGTTACTCCGTCCATAAACCAAATTAGCCGCAATGGGCGTCAACTTACCCTTGAGCCGAGATTAATCGATCTTCTGGTTTTCTTTGCTCAACACAGTGGCGAAGTACTTAGCAGGGATGAACTTATCGATAATGTCTGGAAGAGAAGTATTGTCACCAATCACGTTGTGACGCAGAGTATCTCAGAACTACGTAAGTCATTAAAAGATAATGATGAAGATAGTCCTGTCTATATCGCTACTGTACCAAAGCGCGGCTATAAATTAATGGTGCCGGTTATCTGGTACAGCGAAGAAGAGGGAGAGGAAATAATGCTATCTTCGCCTCCCCCTATACCAGAGGCGGTTCCTGCCACAGATTCTCCCTCCCACAGTCTTAACATTCAAAACACCGCAACGCCACCTGAACAATCCCCAGTTAAAAGCAAACGATTCACTACCTTTTGGGTATGGTTTTTTTTCCTGTTGTCGTTAGGTATCTGTGTAGCACTGGTAGCGTTTTCAAGTCTTGATACACGTCTTCCTATGAGCAAATCGCGTATTTTGCTCAATCCACGCGATATTGACATTAATATGGTAAATAAAAGTTGTAACAGCTGGAGTTCCCCGTATTAA |
| 4 | cadAB promoter |
GTAACTCCGGGTTGATTTATGCTCGGAAATATTTGTTGTTGAGTTTTTGTATGTTCCTGTTGGTATAATATGTTGCGGCAATTTATTTGCCGCATAATTTTTATTACATAAATTTAACCAGAGAATGTCACGCAATCCATTGTAAACATTAAATGTTTATCTTTTCATGATATCAACTTGCGATCCTGATGTGTTAATAAAAAACCTCAAGTTCTCACTTACAGAAACTTTTGTGTTATTTCACCTAATCTTTAGGATTAATCCTTTTTTCGTGAGTAATCTTATCGCCAGTTTGGTCTGGTCAGGAAATAGTTATACATCATGACCCGGACTCCAAATTCAAAAATGAAATTAGGAGAAGAGC |
| 5 | xylBCc | ATGTCCTCAGCCATCTATCCCAGCCTGAAGGGCAAGCGCGTCGTCATCACCGGCGGCGGCTCGGGCATCGGGGCCGGCCTCACCGCCGGCTTCGCCCGTCAGGGCGCGGAGGTGATCTTCCTCGACATCGCCGACGAGGACTCCAGGGCTCTTGAGGCCGAGCTGGCCGGCTCGCCGATCCCGCCGGTCTACAAGCGCTGCGACCTGATGAACCTCGAGGCGATCAAGGCGGTCTTCGCCGAGATCGGCGACGTCGACGTGCTGGTCAACAACGCCGGCAATGACGACCGCCACAAGCTGGCCGACGTGACCGGCGCCTATTGGGACGAGCGGATCAACGTCAACCTGCGCCACATGCTGTTCTGCACCCAGGCCGTCGCGCCGGGCATGAAGAAGCGTGGCGGCGGGGCGGTGATCAACTTCGGTTCGATCAGCTGGCACCTGGGGCTTGAGGACCTCGTCCTCTACGAAACCGCCAAGGCCGGCATCGAAGGCATGACCCGCGCGCTGGCCCGGGAGCTGGGTCCCGACGACATCCGCGTCACCTGCGTGGTGCCGGGCAACGTCAAGACCAAGCGCCAGGAGAAGTGGTACACGCCCGAAGGCGAGGCCCAGATCGTGGCGGCCCAATGCCTGAAGGGCCGCATCGTCCCGGAGAACGTCGCCGCGCTGGTGCTGTTCCTGGCCTCGGATGACGCGTCGCTCTGCACCGGCCACGAATACTGGATCGACGCCGGCTGGCGTTGA |
| 6 | xylCCc | ATGACCGCGCAGGTTACCTGCGTTTGGGACCTGAAAGCGACCCTGGGTGAAGGTCCGATCTGGCACGGTGACACCCTGTGGTTCGTTGACATCAAACAGCGTAAAATCCACAACTACCACCCGGCGACCGGTGAACGTTTCTCTTTCGACGCGCCGGACCAGGTTACCTTCCTGGCGCCGATCGTTGGTGCGACCGGTTTCGTTGTTGGTCTGAAAACCGGTATCCACCGTTTCCACCCGGCGACCGGTTTCTCTCTGCTGCTGGAAGTTGAAGACGCGGCGCTGAACAACCGTCCGAACGACGCGACCGTTGACGCGCAGGGTCGTCTGTGGTTCGGCACTATGCACGACGGTGAAGAAAACAACTCTGGTTCTCTGTACCGTATGGACCTGACCGGTGTTGCGCGTATGGACCGTGACATCTGCATCACCAACGGTCCGTGCGTTTCTCCGGACGGTAAAACCTTCTACCACACCGACACCCTGGAAAAAACCATCTACGCGTTCGACCTGGCGGAAGACGGTCTGCTGTCTAACAAACGTGTTTTCGTTCAGTTCGCGCTGGGTGACGACGTTTACCCGGACGGTTCTGTTGTTGACTCTGAAGGTTACCTGTGGACCGCGCTGTGGGGTGGTTTCGGTGCGGTTCGTTTCTCTCCGCAGGGTGACGCGGTTACCCGTATCGAACTGCCGGCGCCGAACGTTACCAAACCGTGCTTCGGTGGTCCGGACCTGAAAACCCTGTACTTCACCACCGCGCGTAAAGGTCTGTCTGACGAAACCCTGGCGCAGTACCCGCTGGCGGGTGGTGTTTTCGCGGTTCCGGTTGACGTTGCGGGTCAGCCGCAGCACGAAGTTCGTCTGGTTTAA |
| 7 | yjgB | ATGTCGATGATAAAAAGCTATGCCGCAAAAGAAGCGGGCGGCGAACTGGAAGTTTATGAGTACGATCCCGGTGAGCTGAGGCCACAAGATGTTGAAGTGCAGGTGGATTACTGCGGGATCTGCCATTCCGATCTGTCGATGATCGATAACGAATGGGGATTTTCACAATATCCGCTGGTTGCCGGGCATGAGGTGATTGGGCGCGTGGTGGCACTCGGGAGCGCCGCGCAGGATAAAGGTTTGCAGGTCGGTCAGCGTGTCGGGATTGGCTGGACGGCGCGTAGCTGTGGTCACTGCGACGCCTGTATTAGCGGTAATCAGATCAACTGCGAGCAAGGTGCGGTGCCGACGATTATGAATCGCGGTGGCTTTGCCGAGAAGTTGCGTGCGGACTGGCAATGGGTGATTCCACTGCCAGAAAATATTGATATCGAGTCCGCCGGGCCGCTGTTGTGCGGCGGTATCACGGTCTTTAAACCACTGTTGATGCACCATATCACTGCTACCAGCCGCGTTGGGGTAATTGGTATTGGCGGGCTGGGGCATATCGCTATAAAACTTCTGCACGCAATGGGATGCGAGGTGACAGCCTTTAGTTCTAATCCGGCGAAAGAGCAGGAAGTGCTGGCGATGGGTGCCGATAAAGTGGTGAATAGCCGCGATCCGCAGGCACTGAAAGCACTGGCGGGGCAGTTTGATCTCATTATCAACACCGTCAACGTCAGCCTCGACTGGCAGCCCTATTTTGAGGCGCTGACCTATGGCGGTAATTTCCATACGGTCGGTGCGGTTCTCACGCCGCTGTCTGTTCCGGCCTTTACGTTAATTGCGGGCGATCGCAGCGTCTCTGGTTCTGCTACCGGCACGCCTTATGAGCTGCGTAAGCTGATGCGTTTTGCCGCCCGCAGCAAGGTTGCGCCGACCACCGAACTGTTCCCGATGTCGAAAATTAACGACGCCATCCAGCATGTGCGCGACGGTAAGGCGCGTTACCGCGTGGTGTTGAAAGCCGATTTTTGA |
| 8 | sfgfp | ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCGCCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCAGCTTCAAGGACGACGGCACCTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTTCAACAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACGTGGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGTGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA |
배양 조건
33.7mM Na2HPO4, 22.0mM KH2PO4, 8.55mM NaCl, 9.35mM NH4Cl, 1.0mM MgSO4, 0.5g/L yeastextract, 1.0g/L peptone 및 2.5g/L glucose을 포함하는 M9 (MM9)를 형광 분석에 이용하였다. 33.7mM Na2HPO4, 22.0mM KH2PO4, 8.55mM NaCl, 9.35mM NH4Cl, 2.0mM MgSO4, 2g/L casaminoacid, 1.0mM thiamineHCl, 0.1mM CaCl2 및 0.4% glycerol(v/v)를 포함하는 M9(MM9) 배지는 자일론산 생성 및 댐스 회로의 최적화에 이용하였다.
형광 분석
균주를 LB broth 배지에서 밤새 배양하고, 각 샘플 100㎕를 MM9 배지에 첨가한 후, 멸균된 2M 황산 또는 6M 수산화 나트륨으로 pH 7.0으로 조정 하였다. 세포를 적절한 양의 2M 황산을 첨가함으로써 낮은 pH (5.8) 및 약 0.6의 OD600로 유도 하였다. 샘플을 낮은 pH로 유도한 12시간 전후로 수집 하였다. 배지의 pH는 실험을 통해 모니터링 하였다. 수집된 샘플을 21206xg에서 2분간 원심 분리하고 상등액을 버린 후, 물 1ml를 각 샘플에 첨가 하였다. 세포를 OD600에서의 흡광도에 기초하여 표준화 하였다. 형광 분광계 FluoroMate FS-2(Scinco, Korea)를 사용하여 세포를 형광 분석 하였다. 형광 분광기는 sfGFP에 대해 485nm 여기(excitation), 507nm 방출(emission)로 설정하였다. 특정 형광은 OD 600값 당 형광으로 정의하였다(given in a.u).
바이오매스 및 대사 산물 정량화
재조합 대장균 균주의 바이오매스 및 대사 산물을 이전에 기술한 것과 동일한 조건에 따라 분석하고 정량화 하였다(Liu et al. 2013). 바이오매스를 정량하기 위해, 샘플을 2ml의 예비 건조 및 사전 칭량된 원심 분리 튜브에 수집하고, 8,000xg에서 10분 동안 펠렛화한 다음, 탈이온수로 두 번 세척한 하고, 105℃에서 건조시켰다. 600nm(OD 600)에서의 광학 밀도와 관련된 건조 세포 중량의 표준 곡선을 생성하였다. 하나의 OD600 단위는 건조 셀 중량의 0.32gL-1과 같다. 반면, 용리액으로 5mM H2SO4를 사용하는 Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 x 7.8 mm)가 장착된 HPLC를 사용하여 0.4 ml/min의 일정한 유속으로 공급된 대사 산물 농도를 정량화하였다. 컬럼은 55℃에서 유지하였으며, 피크는 물 2414 굴절률 검출기를 사용하여 검출하였다.
효소 활성 분석
D-자일로오스 탈수소효소 활성은 이전에 보고된 방법에 따라 조세포 추출물로부터 측정하였다(Bergh
ll et al., 2007). 세포를 4,000xg 및 4℃에서 원심 분리하여 수집 하였다. 수확된 세포를 세척하고 Tris-HCl(50mM, pH 8.0)로 재현탁시킨 다음, 라이소자임 1mg mL-1을 첨가하여 용해시킨 후 저온(얼음 하)에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 세포 현탁액을 얼음 위에서 10 분 동안 초음파 처리하였다(5초 버스트와 5초 냉각 주기). 가공되지 않은 용해물은 4 ℃에서 30 분간 10,000g에서 원심 분리한 후 수득하였다. 단백질 농도는 Bradford 분석을 통해 결정하였다(Bradford, 1976). 자일로오스 탈수소효소(Xylose dehydrogenase)는 D-자일로오스의 산화를 촉매하고, 보조인자인 NAD+를 감소시켰다. 보조인자 감소로 형성된 NADH의 분광광도 측정을 통해 활성을 확인 하였다. 340 nm에서의 흡광도의 변화는 반응에서 소비된 D-자일로오스의 농도에 비례한다(εNADH = 6220cm-1M-1). 1ml의 반응 혼합물은 Tris HCl (50mM, pH 8.0), NAD+ (100mM) 및 조세포 추출물 (10㎕)을 함유한다. NAD+에서 NADPH로의 반응을 갖는 고유의 효소를 포화시키기 위하여 기질 D-자일로오스(10 mM)를 반응 혼합물을 37 ℃에서 30분 동안 배양 한 후 나중에 첨가하였다.
참고예 1: CadC 변이체의 pH 민감성 설계 및 확인
Tetsch et al. (2008)은 아미노산 클러스터(F159 ~ 165)가 결실된 CadC는 주변 세포질 영영의 C-terminal 부분이 절단된 CadC1-215와 마찬가지로 낮은 pH 및 라이신 부재 하에 활성화될 수 있음이 알려져 있다. 이 두 라이신-독립적 CadC 변이체는 다른 변이체들 사이에서 상대적으로 높은 pH 감지 능력으로 인해 공학 대사 경로에서 잠재적인 세포외 pH 센서이다. 원칙적으로, 비유도 조건 하에서 H-NS는 cadBA 프로모터 영역 내에서 H-NS1, H-NS2, H-NS4 및 H-NS5의 4 개의 부위에 결합함으로써 억제자 복합물의 형성하며, 이는 cadBA 프로모터 영역 내에서 DNA의 루핑(looping) 및 RNA 폴리머라제에 대한 -35 / -10 결합 영역의 점유를 초래한다(Kuper and Jung 2005). 낮은 pH로 CadC를 활성화시키면 cad1 결합 부위에 결합하여 H-NS 분자를 방출하고 RNA 중합 효소가 비점화된 -35 / -10 부위에 결합함으로써 억제자 복합체가 불안정해진다. 이어서, 또다른 CadC는 cad2 결합 부위에 결합하여 cad1 결합된 CadC와 이합체를 형성하여 cadBA 오페론이 활성화된다.
상기와 같은 CadC 막전위 전사 인자의 특성을 기초로 CadC 변이체의 발현 벡터(pH 센서)를 설계하고 확인하였다. 구체적으로, CadCv를 합성 유도제인 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하지 않고도 구성적으로 만드는 lacI 억제자 및 lac 오퍼레이터가 없는 pRSETA 벡터에서 T7 프로모터 하류에 위치시키고, 반면에 리포터 단백질 sfGFP를 cadBA 프로모터의 하류에 위치하도록 설계하여 센서를 제작하였다(도 1a).
그 결과, 도 1b 및 도 1c에서 확인할 수 있듯이, 제작된 발현 벡터(pH 센서)는 BLPH1의 경우 거의 5배 증가하고 BLPH2의 경우 1배 증가하는 것을 통해 낮아지는 pH에 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 제작된 발현 벡터(pH 센서)는 낮아지는 pH 의존적인 전사 활성을 나타내어 표적 화합물의 생산을 최적화하는데 사용될 수 있는 산성 중간체를 포함하는 합성 대사 조절을 수행할 수 있음을 시사한다.
실시예 1: 개량된 대장균에서 pH-의존적 자일론산의 생성
배지에서의 자일론산 축적은 pH 저하에 의해 조작된 균주에서 스트레스 반응을 유도하며, 이는 최적의 성장 및 최적의 효소 기능에 부적합한 세포외 환경을 만들어 낮은 수율 및 생산성을 발생시킨다. 따라서 자일론산의 축적을 조절할 수 있는 pH 센서의 개발은 자일로스(xylose) 산화 경로에서 생산 역가와 수율을 최적화하는데 큰 가능성을 가지고 있다. 이것은 자일로오스를 자일론산으로 전환시키는 효소인 자일로오스 탈수소효소를 암호화하는 xylBcc 유전자를 끄면 가능하다.
본 발명의 참고예 1로부터 확인한 바와 같이, CadC ΔF159-165 는 CadC 1-215 와 비교하여 낮아지는 pH에 대한 우수한 반응을 나타내어 발현 벡터의 구성요소로 선택하였다. 자일론산에 의해 발생하는 낮아지는 pH에 대한 바이오 센서의 반응을 테스트하기 위한 발현 벡터(pH 센서; 유전자 회로)는 도 2a와 같이 제작하였다. 구체적으로, CadC ΔF159-165 는 프로모터 lacIq 하류에, lacI 유전자는 cadBA 프로모터 하류에 위치하도록 하였다. 또한, 각각 자일로오스 탈수소효소 및 xylonolactonase를(효소는 자일로오스에서 자일론산으로의 전환에 관여한다)를 코딩하는 xylB cc 와 xylC 유전자는 T7 프로모터의 하류에 위치하도록 하였다. 그 다음, 플라스미드를 BL21(DE3) ΔxylAB로 형질 전환시켜 BLXAPH 균주에서 자일로오스 이성질화 효소 경로를 불안정화시켰다.
그 결과, 도 2b 및 도 2c에서 확인할 수 있듯이, 제작된 발현 벡터는 pH가 떨어지는 것에 대한 반응성을 나타내었고, 또한, 낮은 pH에서는 발현벡터(pH 센서)가 없는 BLXA 대조군 대비 자일론산 생성이 억제되었다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 회로가 자일로오스 산화 경로의 최적화를 위한 잠재적 도구로서 이용 가능함을 보여준다.
실시예 2: pH 센서에 의한 Dahms Pathway의 최적화
합성 pH 센서가 어떻게 자일론산의 축적을 조절 하는지를 더 확인하기 위하여, 시험 플라스미드 및 대조 플라스미드로서 각각 플라스미드 pRBCPH 및 pRBC를 대장균 W3110 (DE3) ΔxylAB로 형질 전환시킨 후, 자일로오스 산화 경로에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 3a 내지 도 3d에서 확인할 수 있듯이, 발현 벡터(pH 센서)를 자일로오스 산화 경로에 통합시킴으로써 성공적으로 자일론산의 축적을 낮추었으며, 발효를 통해 배지의 pH를 6.0 이상으로 유지 시켰으며, 효과적으로 바이오매스를 증가시켰다. 이는 본 발명에 따른 발현 벡터(pH 센서)의 효과에 기인한 것이며, 이러한 결과는 발현 벡터(pH 센서)가 Dahms Pathway를 최적화하는 효과적인 도구가 될 수 있음을 시사한다.
실시예 3: 순환 피딩 실험
이종 경로의 정확한 제어 및 조절을 시험하기 위해, 균주 EWXAPH를 순환 피딩 실험 하였다. 36 시간마다 자일로오스 4gL-1을 첨가하고, 샘플은 기질의 첨가 전후에 수집 하였다. 이 실험에서, 결과는 자일론산 축적 단독으로부터 유도된 낮은 pH에 대한 발현 벡터(pH 센서)의 감도를 나타냈다.
그 결과, 도 4a 및 도 4b에서 확인할 수 있듯이, 바이오 센서의 반응은 자일로오스 탈수소효소 재발현(도 4b)의 성공적인 조절을 가능하게 하여 pH 수준을 조절한다(도 4a). 더욱이, 감소된 자일론산 축적은 실험 전반에 걸쳐 센서의 큰 가능성을 보여주었다.
실시예 4: pH 센서의 통합을 통한 에틸렌 글리콜의 효율적인 생산
센서는 에틸렌 글리콜의 생산성을 확인 하기 위하여 추가로 적용되었다. 이 실험에서 배지는 1gL-1 펩톤 및 0.5gL-1 효모 추출물 및 4gL-1 자일로오스를 포함하는 최소 배지 M9로 변경하였다. 본 발명에서는 Cabulong et al. (2016) E. coli W3110 ΔxylABΔyjgBΔaldA균주를 사용하였다. 플라스미드 pRBCPH 및 pAB (표 1) 모두 상기 균주로 형질 전환시켰으며, 이의 에틸렌 글리콜의 생산 결과는 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 5b 내지 도 5d에서 확인할 수 있듯이, 제작된 균주 EWEGPH는 배지에서 자일론산 염의 흔적이 거의 없고, 대조 균주와 비교하여 상대적으로 높은 에틸렌 글리콜의 생산성을 나타내었다.
<110> MYONGJI UNIVERSITY INDUSTRY AND ACADEMIA COOPERATION FOUNDATION
<120> EXPRESSION VECTOR FOR PRODUCING D-XYLOSE METABOLITES,
TRANSFORMANT, AND BIOSENSOR FOR PH SENSING
<130> P19-0014/MJU
<150> KR 2019/0000712
<151> 2019-01-03
<160> 40
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1539
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of cadC WT
<400> 1
atgcaacaac ctgtagttcg cgttggcgaa tggcttgtta ctccgtccat aaaccaaatt 60
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gctcaacaca gtggcgaagt acttagcagg gatgaactta tcgataatgt ctggaagaga 180
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gataatgatg aagatagtcc tgtctatatc gctactgtac caaagcgcgg ctataaatta 300
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agtattgtca ccaatcacgt tgtgacgcag agtatctcag aactacgtaa gtcattaaaa 240
gataatgatg aagatagtcc tgtctatatc gctactgtac caaagcgcgg ctataaatta 300
atggtgccgg ttatctggta cagcgaagaa gagggagagg aaataatgct atcttcgcct 360
ccccctatac cagaggcggt tcctgccaca gattctccct cccacagtct taacattcaa 420
aacaccgcaa cgccacctga acaatcccca gttaaaagca aacgattcac taccctgttg 480
tcgttaggta tctgtgtagc actggtagcg ttttcaagtc ttgatacacg tcttcctatg 540
agcaaatcgc gtattttgct caatccacgc gatattgaca ttaatatggt aaataaaagt 600
tgtaacagct ggagttcccc gtatcagctc tcttacgcga taggcgtggg tgatttggtg 660
gcgacatcac ttaacacctt ctccaccttt atggtgcatg acaaaatcaa ctacaacatt 720
gatgaaccga gcagttccgg taaaacatta tctattgcgt ttgttaatca gcgccaatac 780
cgtgctcaac aatgctttat gtcgataaaa ttggtagaca atgcagatgg ttcaaccatg 840
ctggataaac gttatgtcat cactaacggt aatcagctgg cgattcaaaa tgatttactg 900
gagagtttat caaaagcgtt aaaccaaccg tggccacaac gaatgcagga gacgctccag 960
aaaattttgc cgcatcgtgg tgcgttatta actaattttt atcaggcaca tgattattta 1020
ctgcatggcg atgataaatc attgaaccgt gccagtgaat tattaggtga gattgttcaa 1080
tcatccccag aatttaccta cgcgagagca gaaaaagcat tagttgatat cgtgcgccat 1140
tctcaacatc ctttagatga aaaacaatta gcagcactga acacagaaat agataacatt 1200
gttacactgc cggaattgaa caacctgtcc attatatatc aaataaaagc ggtcagtgct 1260
ctggtaaaag gtaaaacaga tgagtcttac caggcgataa atactggcat tgatcttgaa 1320
atgtcctggc taaattatgt gttgcttggc aaggtttatg aaatgaaggg gatgaaccgg 1380
gaagcagctg atgcatatct caccgccttt aatttacgcc caggggcaaa caccctttac 1440
tggattgaaa atggtatatt ccagacttct gttccttatg ttgtacctta tctcgacaaa 1500
tttcttgctt cagaataa 1518
<210> 3
<211> 648
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of cadC1-215
<400> 3
atgcaacaac ctgtagttcg cgttggcgaa tggcttgtta ctccgtccat aaaccaaatt 60
agccgcaatg ggcgtcaact tacccttgag ccgagattaa tcgatcttct ggttttcttt 120
gctcaacaca gtggcgaagt acttagcagg gatgaactta tcgataatgt ctggaagaga 180
agtattgtca ccaatcacgt tgtgacgcag agtatctcag aactacgtaa gtcattaaaa 240
gataatgatg aagatagtcc tgtctatatc gctactgtac caaagcgcgg ctataaatta 300
atggtgccgg ttatctggta cagcgaagaa gagggagagg aaataatgct atcttcgcct 360
ccccctatac cagaggcggt tcctgccaca gattctccct cccacagtct taacattcaa 420
aacaccgcaa cgccacctga acaatcccca gttaaaagca aacgattcac taccttttgg 480
gtatggtttt ttttcctgtt gtcgttaggt atctgtgtag cactggtagc gttttcaagt 540
cttgatacac gtcttcctat gagcaaatcg cgtattttgc tcaatccacg cgatattgac 600
attaatatgg taaataaaag ttgtaacagc tggagttccc cgtattaa 648
<210> 4
<211> 364
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of cadAB promoter
<400> 4
gtaactccgg gttgatttat gctcggaaat atttgttgtt gagtttttgt atgttcctgt 60
tggtataata tgttgcggca atttatttgc cgcataattt ttattacata aatttaacca 120
gagaatgtca cgcaatccat tgtaaacatt aaatgtttat cttttcatga tatcaacttg 180
cgatcctgat gtgttaataa aaaacctcaa gttctcactt acagaaactt ttgtgttatt 240
tcacctaatc tttaggatta atcctttttt cgtgagtaat cttatcgcca gtttggtctg 300
gtcaggaaat agttatacat catgacccgg actccaaatt caaaaatgaa attaggagaa 360
gagc 364
<210> 5
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of xylBCc
<400> 5
atgtcctcag ccatctatcc cagcctgaag ggcaagcgcg tcgtcatcac cggcggcggc 60
tcgggcatcg gggccggcct caccgccggc ttcgcccgtc agggcgcgga ggtgatcttc 120
ctcgacatcg ccgacgagga ctccagggct cttgaggccg agctggccgg ctcgccgatc 180
ccgccggtct acaagcgctg cgacctgatg aacctcgagg cgatcaaggc ggtcttcgcc 240
gagatcggcg acgtcgacgt gctggtcaac aacgccggca atgacgaccg ccacaagctg 300
gccgacgtga ccggcgccta ttgggacgag cggatcaacg tcaacctgcg ccacatgctg 360
ttctgcaccc aggccgtcgc gccgggcatg aagaagcgtg gcggcggggc ggtgatcaac 420
ttcggttcga tcagctggca cctggggctt gaggacctcg tcctctacga aaccgccaag 480
gccggcatcg aaggcatgac ccgcgcgctg gcccgggagc tgggtcccga cgacatccgc 540
gtcacctgcg tggtgccggg caacgtcaag accaagcgcc aggagaagtg gtacacgccc 600
gaaggcgagg cccagatcgt ggcggcccaa tgcctgaagg gccgcatcgt cccggagaac 660
gtcgccgcgc tggtgctgtt cctggcctcg gatgacgcgt cgctctgcac cggccacgaa 720
tactggatcg acgccggctg gcgttga 747
<210> 6
<211> 870
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of xylCCc
<400> 6
atgaccgcgc aggttacctg cgtttgggac ctgaaagcga ccctgggtga aggtccgatc 60
tggcacggtg acaccctgtg gttcgttgac atcaaacagc gtaaaatcca caactaccac 120
ccggcgaccg gtgaacgttt ctctttcgac gcgccggacc aggttacctt cctggcgccg 180
atcgttggtg cgaccggttt cgttgttggt ctgaaaaccg gtatccaccg tttccacccg 240
gcgaccggtt tctctctgct gctggaagtt gaagacgcgg cgctgaacaa ccgtccgaac 300
gacgcgaccg ttgacgcgca gggtcgtctg tggttcggca ctatgcacga cggtgaagaa 360
aacaactctg gttctctgta ccgtatggac ctgaccggtg ttgcgcgtat ggaccgtgac 420
atctgcatca ccaacggtcc gtgcgtttct ccggacggta aaaccttcta ccacaccgac 480
accctggaaa aaaccatcta cgcgttcgac ctggcggaag acggtctgct gtctaacaaa 540
cgtgttttcg ttcagttcgc gctgggtgac gacgtttacc cggacggttc tgttgttgac 600
tctgaaggtt acctgtggac cgcgctgtgg ggtggtttcg gtgcggttcg tttctctccg 660
cagggtgacg cggttacccg tatcgaactg ccggcgccga acgttaccaa accgtgcttc 720
ggtggtccgg acctgaaaac cctgtacttc accaccgcgc gtaaaggtct gtctgacgaa 780
accctggcgc agtacccgct ggcgggtggt gttttcgcgg ttccggttga cgttgcgggt 840
cagccgcagc acgaagttcg tctggtttaa 870
<210> 7
<211> 1020
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of yjgB
<400> 7
atgtcgatga taaaaagcta tgccgcaaaa gaagcgggcg gcgaactgga agtttatgag 60
tacgatcccg gtgagctgag gccacaagat gttgaagtgc aggtggatta ctgcgggatc 120
tgccattccg atctgtcgat gatcgataac gaatggggat tttcacaata tccgctggtt 180
gccgggcatg aggtgattgg gcgcgtggtg gcactcggga gcgccgcgca ggataaaggt 240
ttgcaggtcg gtcagcgtgt cgggattggc tggacggcgc gtagctgtgg tcactgcgac 300
gcctgtatta gcggtaatca gatcaactgc gagcaaggtg cggtgccgac gattatgaat 360
cgcggtggct ttgccgagaa gttgcgtgcg gactggcaat gggtgattcc actgccagaa 420
aatattgata tcgagtccgc cgggccgctg ttgtgcggcg gtatcacggt ctttaaacca 480
ctgttgatgc accatatcac tgctaccagc cgcgttgggg taattggtat tggcgggctg 540
gggcatatcg ctataaaact tctgcacgca atgggatgcg aggtgacagc ctttagttct 600
aatccggcga aagagcagga agtgctggcg atgggtgccg ataaagtggt gaatagccgc 660
gatccgcagg cactgaaagc actggcgggg cagtttgatc tcattatcaa caccgtcaac 720
gtcagcctcg actggcagcc ctattttgag gcgctgacct atggcggtaa tttccatacg 780
gtcggtgcgg ttctcacgcc gctgtctgtt ccggccttta cgttaattgc gggcgatcgc 840
agcgtctctg gttctgctac cggcacgcct tatgagctgc gtaagctgat gcgttttgcc 900
gcccgcagca aggttgcgcc gaccaccgaa ctgttcccga tgtcgaaaat taacgacgcc 960
atccagcatg tgcgcgacgg taaggcgcgt taccgcgtgg tgttgaaagc cgatttttga 1020
1020
<210> 8
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of sfgfp
<400> 8
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg cgcggcgagg gcgagggcga tgccaccaac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cgccacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcagc 300
ttcaaggacg acggcaccta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaacttcaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacgtggagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgt gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actcacggca tggacgagct gtacaagtaa 720
720
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1CadCdelta159-165/1-215 (forward primer)
<400> 9
tgacgataag gatcgatggg atgcaacaac ctgtagttcg cgttggcgaa tg 52
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1CadCdelta159-165 (reverse primer)
<400> 10
acgacaacag ggtagtgaat cgtttgcttt taactgggga ttgttc 46
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2CadCdelta1 59-165 (forward primer)
<400> 11
attcactacc ctgttgtcgt taggtatctg tgtagcactg 40
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2CadCdelta159-165 (reverse primer)
<400> 12
aattccatgg ttattctgaa gcaagaaatt tgtcgagata agg 43
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 Terminator for CadCdelta159-165 (forward primer)
<400> 13
ttcagaataa ccatggaatt cgaagcttga tccggctgc 39
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CadC1-215 (reverse primer)
<400> 14
aattccatgg ttaatacggg gaactccagc tgttacaact tttatttacc atattaatg 59
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7-Terminator for CadC1-215 (reverse primer)
<400> 15
cccgtattaa ccatggaatt cgaagcttga tccggctgc 39
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7-Terminator for CadCdelta159-165/1-215 (reverse primer)
<400> 16
ccggagttac ttcgctatta cgccagatcc ggatatagtt cc 42
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CadABp (forward primer)
<400> 17
taatagcgaa gtaactccgg gttgatttat gctcggaaat atttg 45
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CadABp (reverse primer)
<400> 18
tgctcaccat gctcttctcc taatttcatt tttgaatttg gag 43
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sfGFP (forward primer)
<400> 19
ggagaagagc atggtgagca agggcgagga gctgttcac 39
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sfGFP (reverse primer)
<400> 20
ctttgttagc agccggatca ttacttgtac agctcgtcca tgccgtgag 49
<210> 21
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacO-xdh control (forward primer)
<400> 21
gagaccacaa cggtttccct ggaattgtga gcggataaca attcccctct agaaataatt 60
ttg 63
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacO-xdh control (reverse primer)
<400> 22
ttcctcctgt tcaacgccaa cccgcgtcga tc 32
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylC control (forward primer)
<400> 23
ttggcgttga acaggaggaa tgaccgcgca g 31
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylC control (reverse primer)
<400> 24
agctgcagat ctcgagctcg ttaaaccaga cgaacttcgt gctgc 45
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xdH-xylC (forward primer)
<400> 25
gagaccacaa cggtttccct atgtcttctg cgatctaccc gtctctg 47
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xdH-xylC (reverse primer)
<400> 26
gatccccatc gattcaacgc caacccgcgt cgatc 35
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 Terminator (forward primer)
<400> 27
ttggcgttga atcgatgggg atccgagctc gagatctgc 39
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 Terminator (reverse primer)
<400> 28
acggtgaaaa gccgctacag ggcgcgtccc 30
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacIq Promoter (forward primer)
<400> 29
ctgtagcggc ttttcaccgt catcaccgaa ac 32
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacIq Promoter (reverse primer)
<400> 30
caggttgttg catcctgaat tgactctctt ccgg 34
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CadCdeltaF159-165 (forward primer)
<400> 31
tcaattcagg atgcaacaac ctgtagttcg c 31
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CadCdeltaF159-165 (reverse primer)
<400> 32
ggcaaattct ttattctgaa gcaagaaatt tgtcgagata agg 43
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rrnB Terminator (forward primer)
<400> 33
ttcagaataa agaatttgcc tggcggcagt ag 32
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rrnB Terminator (reverse primer)
<400> 34
agctgcagat ctcgagctcg aacgcaaaaa ggccatccgt c 41
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pacM4 without lacI (forward primer)
<400> 35
aattgcgttg ggtgtccggg atctcgacgc 30
<210> 36
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pacM4 without lacI (reverse primer)
<400> 36
cccggacacc caacgcaatt aatgtaagtt agctcactca ttaggc 46
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pacM4 for yjgB (forward primer)
<400> 37
attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat g 41
<210> 38
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pacM4 for yjgB (reverse primer)
<400> 38
gcgcaacgca attaatgtaa gttagctcac tcattaggca c 41
<210> 39
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yjgB (forward primer)
<400> 39
ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat atgtcgatga taaaaagcta tgccgcaaaa 60
gaagcgggcg 70
<210> 40
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yjgB (reverse primer)
<400> 40
gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcaaaaatcg gctttcaaca ccacgcggta 60
acgcgcctta 70
Claims (9)
- i) pH 센서로서 CadC 단백질의 염기서열인 서열번호 1에서 475bp 내지 495bp가 결실된 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자 및 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터;
ii) 락토오스 단백질을 코딩하는 lacI 유전자 및 상기 lacI 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및
iii) 자일로오스 탈수소효소를 코딩하는 xylBcc 유전자 및 자일로노락토네이즈를 코딩하는 xylC 유전자; 및 락토오스 단백질의 발현에 따라 하류의 xylBcc 유전자 및 xylC 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 를 함유하고,
상기 i)에서 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 프로모터 lacIq이고, ii)에서 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 cadBA이며, iii)에서 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 프로모터 T7인 것을 특징으로 하는 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 발현 벡터.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 D-자일로오스 대사 산물은 에틸렌글리콜, 글리콜산, 1,2,4-부탄트리올, 1,4-부탄디올, 에탄올 및 옥살로글루타르산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제1항의 발현 벡터로 형질 전환된 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 형질전환체.
- 제4항에 있어서,
상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 제4항에 있어서,
상기 D-자일로오스 대사 산물은 에틸렌글리콜, 글리콜산, 1,2,4-부탄트리올, 1,4-부탄디올, 에탄올 및 옥살로글루타르산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 제1항의 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 포함하는 D-자일로오스 대사 산물을 생산하기 위한 배지의 pH를 감지하기 위한 바이오 센서.
- 제7항에 있어서,
상기 바이오 센서는 배지의 pH가 5.5 내지 6.5 이하로 감소하는 것을 방지하고, 배지의 pH를 5.5 내지 6.5로 유지하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
- 제7항에 있어서,
상기 D-자일로오스 대사 산물은 에틸렌글리콜, 글리콜산, 1,2,4-부탄트리올, 1,4-부탄디올, 에탄올 및 옥살로글루타르산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
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-
2019
- 2019-06-19 KR KR1020190073014A patent/KR102221587B1/ko active Active
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| ISRN Biochem. 2013, 2013: 645983. |
| Molecular Microbiology (2008) 67(3), 570-583. |
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| KR20200084753A (ko) | 2020-07-13 |
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