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CN118685438A - 一种基于nad(h)辅因子循环系统合成d-木糖醇的方法及其专用工程菌 - Google Patents

一种基于nad(h)辅因子循环系统合成d-木糖醇的方法及其专用工程菌 Download PDF

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CN118685438A
CN118685438A CN202411091123.0A CN202411091123A CN118685438A CN 118685438 A CN118685438 A CN 118685438A CN 202411091123 A CN202411091123 A CN 202411091123A CN 118685438 A CN118685438 A CN 118685438A
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Abstract

本发明公开了一种基于NAD(H)辅因子循环系统合成D‑木糖醇的方法及其专用工程菌。本发明提供了一种构建用于合成D‑木糖醇的工程菌株的方法，包括如下步骤：使受体菌同时表达NAD(H)依赖型的D‑木糖还原酶和NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶，得到用于合成D‑木糖醇的工程菌株。本发明对于D‑木糖醇的生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。

Description

一种基于NAD(H)辅因子循环系统合成D-木糖醇的方法及其专 用工程菌
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于NAD(H)辅因子循环系统合成D-木糖醇的方法及其专用工程菌。
背景技术
D-木糖醇（D-xylitol）是一种五碳糖醇，广泛存在于植物及微生物体内。D-木糖醇是一种天然甜味剂，2004年，被美国能源部确认为由生物质合成的十二大高附加值化学品之一。D-木糖醇应用广泛于化工、医药、食品、化妆品、农业生等多个领域。（1）作为医药中间体，D-木糖醇被应用于各种药物合成，如抗肿瘤药、维生素类及心脑血管用药等；（2）D-木糖醇具有湿润功能，可作为润湿剂用于化妆品的生产；（3）D-木糖醇可作为牙膏的保湿剂和抗冻剂，能抑制口腔常见菌（例如致龋菌）的生长，保持口腔健康；（4）食用D-木糖醇时会产生清凉感，因此在奶制品、软饮料口香糖以及巧克力等领域具有广泛用途。此外，将D-木糖醇制作为叶片肥喷洒在农作物上可以增强农作物抗逆性，促进其对营养元素吸收，提高质量和品质。
目前，工业生产D-木糖醇的主要方法是化学催化加氢法。然而，该化学合成法存在反应条件苛刻（高温高压）、催化剂（重金属）昂贵有污染、产率低、副产物多不利于分离等问题。生物转化法（微生物发酵法和酶催化）是一种环境友好、发展迅速的方法。其关键酶D-木糖还原酶可以催化D-木糖为D-木糖醇，该酶通常需要以还原型NADP(H)作为辅因子（Jin,LQ., Xu, W., Yang, B. et al. Efficient Biosynthesis of Xylitol from Xylose byCoexpression of Xylose Reductase and Glucose Dehydrogenase inEscherichia coli. Appl Biochem Biotechnol 187, 1143–1157, 2019）。由于辅因子NADP(H)价格昂贵，导致生物转化法难以在工业上得到大规模地生产与应用。NAD(H)相比于NADP(H)价格较低，已经有研究人员通过共利用辅因子NAD(H)和NADP(H)合成D-木糖醇，从而降低辅因子成本（Jo JH, Oh SY, Lee HS, Park YC, Seo JH. Dual utilization of NADPH and NADHcofactors enhances xylitol production in engineeredSaccharomyces cerevisiae.Biotechnol J. 10(12), 1935-43, 2015）。
综上所述，本领域迫切需要开发一种辅因子成本较低合成D-木糖醇的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于NAD(H)辅因子循环系统合成D-木糖醇的方法及其专用工程菌。
第一方面，本发明要求保护一种构建用于合成D-木糖醇的工程菌株的方法。
本发明要求保护的构建用于合成D-木糖醇的工程菌株的方法，可包括如下步骤：使受体菌同时表达NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶和NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶，得到用于合成D-木糖醇的工程菌株。
进一步地，所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶可来源于马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶可来源于硫杆菌（Starkeya）。
更进一步地，所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶可为如下任一所示：
（A1）氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质；
（A2）SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
（A3）与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母具有相同功能的蛋白质；
（A4）在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
更进一步地，所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶可为如下任一所示：
（B1）氨基酸序列如SEQIDNo.3所示的蛋白质；
（B2）SEQ ID No.3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
（B3）与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于硫杆菌具有相同功能的蛋白质；
（B4）在SEQ ID No.3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gapexistence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
上述蛋白质中，所述95％以上的同一性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94%的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89%的同一性。所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84%的同一性。
在所述方法中，使所述受体菌表达所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶和所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶可通过如下实现：向所述受体菌中导入所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶的编码基因和所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶的编码基因。
进一步地，所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶的编码基因可为如下任一：
（C1）核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（C2）在严格条件下与SEQ ID No.2所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子；
（C3）与SEQ ID No.2所限定的DNA序列具有99％以上、95％以 上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子。
进一步地，所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶的编码基因可为如下任一：
（D1）核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；
（D2）在严格条件下与SEQ ID No.4所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子；
（D3）与SEQ ID No.4所限定的DNA序列具有99％以上、95％以 上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子。
上述编码基因中，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gapexistence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
上述编码基因中，所述95％以上的同一性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94%的同一性。所述85％以上的同一性可为至少86％、87％、88％、89%的同一性。所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84%的同一性。
在所述方法中，所述受体菌可为大肠杆菌。
在本发明的一个实施案例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BW25113。
在所述方法中，所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶的编码基因和所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶的编码基因可通过重组载体的形式导入所述受体菌中。
在本发明的一个实施案例中，所述重组载体为将所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶的编码基因和所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶的编码基因克隆入pBAD/HisB载体后得到的重组质粒。具体地，所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶的编码基因（SEQ ID No.2）克隆到pBAD/HisB载体的酶切位点XhoI和SpeI之间，所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶的编码基因（SEQ ID No.4）克隆到pBAD/HisB载体的酶切位点SpeI和PstI之间。
第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述的方法构建得到的工程菌株。
第三方面，本发明要求保护用于合成D-木糖醇的成套产品。
本发明所要求保护的用于合成D-木糖醇的成套产品，可为如下任一：
（E1）成套产品1：包括前文第二方面中所述工程菌株、D-木糖、甲酸盐和NAD(H)。
进一步地，所述成套产品1中还可包括L-阿拉伯糖。
其中，L-阿拉伯糖用于诱导所述工程菌株表达所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶和所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶。
（E2）成套产品2：包括前文第一方面中所述的NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶、前文第一方面中所述的NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶、D-木糖、甲酸盐和NAD(H)；
所述NAD(H)为NAD+和/或NADH。
利用所述成套产品合成D-木糖醇，是以D-木糖为底物。具体合成线路如图1所示。
在本发明的一个实施案例中，所述甲酸盐为甲酸钠。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
（F1）前文第二方面中所述工程菌株在合成D-木糖醇中的应用；
（F2）前文第三方面中所述的成套产品在合成D-木糖醇中的应用。
第五方面，本发明要求保护一种合成D-木糖醇的方法。
本发明要求保护的合成D-木糖醇的方法，可包括如下步骤（G1）或（G2）：
（G1）将前文第二方面中所述工程菌株经L-阿拉伯糖诱导培养，得到诱导后菌株，用所述诱导后菌株全细胞催化D-木糖反应，得到D-木糖醇。
（G2）用前文第一方面中所述的NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶和前文第一方面中所述的NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶催化D-木糖反应，得到D-木糖醇。
其中，（G1）为全细胞催化法；（G2）为酶催化法。
进一步地，（G1）中，将所述工程菌株经L-阿拉伯糖诱导培养是在含有L-阿拉伯糖且其终浓度为2g/L的培养基中进行的，所述诱导培养的温度为30℃，所述诱导培养的时间为12-16小时（如12小时）。
进一步地，（G1）中，用所述诱导后菌株全细胞催化D-木糖反应（所述诱导后菌株为全细胞催化剂）的反应体系中D-木糖的终浓度为100-200g/L（如100g/L）。所述反应体系的温度为30℃-50℃（如37℃）、反应pH为5.0-7.0（如pH6.0），反应时间为12-24小时（如24h）。
更进一步地，在（G1）和（G2）中，所述催化D-木糖反应的反应体系中还含有甲酸盐（如甲酸钠）和NAD(H)；所述NAD(H)为NAD+和/或NADH。
在本发明的一个实施案例中，（G1）中，所述催化D-木糖反应的反应体系中，甲酸盐（甲酸钠）的终浓度为1.0mol/L，所述NAD(H)为NAD+，NAD+的终浓度为0.5mmol/L。
本发明通过构建偶联NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶和甲酸脱氢酶的专用工程菌，基于NAD(H)辅因子循环系统，催化底物D-木糖合成D-木糖醇。实验证明，本发明所构建的工程菌可以得到D-木糖醇的最高产量为140g/L。本发明对于D-木糖醇的生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。
附图说明
图1为偶联D-木糖还原酶（KMXR）和甲酸脱氢酶（SFDH），并基于NAD(H)辅因子循环系统催化D-木糖合成D-木糖醇的途径示意图。
图2为D-木糖和D-木糖醇的标准品的液相图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。对于同一条件参数下的色谱图来说，待测样本中与标准品保留时间相同（±0.1min）的峰可认定为目标峰。
大肠杆菌BW25113：NBRPE.colistrain，产品目录号：ME9062 (https://shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/resource/strainGeneMutant/list)。
下述实施例中的Trans1-T1感受态细胞是北京全式金生物的产品，产品目录号为CD501。
载体pBAD/HisB：Invitrogen公司，产品目录号V430-01。
D-木糖醇：Aladdin公司，产品目录号X100092。
D-木糖：Aladdin公司，产品目录号X101009。
实施例1、产D-木糖醇重组工程菌X01的构建
本实施例中所涉及的NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶来源于马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，对应的编码核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本实施例中所涉及的来源于硫杆菌（Starkeya）NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，对应的编码核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
1、KMXR基因片段的获得
以包含SEQ ID No.2的人工合成序列（由南京金斯瑞生物科技公司合成）为模板，采用引物P1和P2进行PCR扩增，得到PCR产物，即D-木糖还原酶的编码基因序列。引物序列如下：
P1：5’-gtgccgcgcggcagcctcgagATGACCTACCTGGCTCCGAC-3’（下划线部分为XhoI识别序列）；
P2：5’-ctcaccgaattcaccactagtTTAGATGAAGGTCGGAAATTC-3’（下划线部分为SpeI识别序列）。
通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，PCR产物大小约为1000bp，与目的片段相符，命名为KMXR基因片段。将KMXR基因片段进行胶回收。
2、pBAD/HisB-KMXR重组载体的构建
将载体pBAD/HisB用XhoI和SpeI双酶切后，回收载体片段（约3500bp）；将步骤1回收的KMXR基因片段与回收的载体片段用Gibson方法（Gibson DG, Young L, Chuang RY,Venter JC, Hutchison CA, 3rd, Smith HO: Enzymatic assembly of DNA moleculesup to several hundred kilobases. Nat Methods 2009, 6:343-345.）进行连接，得到连接产物。将连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，进行测序验证，测序正确的载体命名为pBAD/HisB-KMXR。pBAD/HisB-KMXR结构描述：将pBAD/HisB载体的酶切位点XhoI和SpeI之间的小片段替换为SEQ ID No.2所示DNA片段后得到的重组质粒。
3、SFDH基因片段的获得
以包含SEQ ID No.4的人工合成序列（由南京金斯瑞生物科技公司合成）为模板，采用引物P3和P4进行PCR扩增，得到PCR产物，即过甲酸脱氢酶的编码基因序列。引物序列如下：
P3：5’-cgcggggtgctcgcgggctgaggagatataccactagtATGGCTAAAGTTCTGTGCGTTC-3’（下划线部分为SpeI识别序列）；
P4：5’-ctgccgcgcggcaccagctgcagTTAAACAGCTTTTTTGAATTTAG-3’（下划线部分为PstI识别序列）。
通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，PCR产物大小约为1200bp，与目的片段相符，命名为SFDH基因片段。将SFDH基因片段进行胶回收。
4、pXRFDH重组载体的构建
将步骤2获得的pBAD/HisB-KMXR载体用SpeI和PstI双酶切后，回收载体片段（约4500bp）；将步骤3回收的SFDH基因片段与回收的载体片段用Gibson方法进行连接，得到连接产物。将连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，进行测序验证，将测序正确的载体命名为pXRFDH。pXRFDH结构描述：将pBAD/HisB载体的酶切位点XhoI和SpeI之间的小片段替换为SEQ ID No.2所示DNA片段，同时将SpeI和PstI之间的小片段替换为SEQ ID No.4所示DNA片段后得到的重组质粒。
5、重组工程菌X01的构建
将步骤4构建的表达载体pXRFDH用化学转化法转化大肠杆菌BW25113，在含链霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选阳性克隆，即得到相应的重组工程菌株，命名为X01。
实施例2、重组工程菌X01催化D-木糖合成木糖醇
图1为偶联D-木糖还原酶（KMXR）和甲酸脱氢酶（SFDH），并基于NAD(H)辅因子循环系统催化D-木糖合成D-木糖醇的途径示意图。本实施例以实施例1制备的能够表达KMXR和SFDH的重组工程菌X01作为全细胞催化剂催化D-木糖合成D-木糖醇。
1、取试验菌株的单克隆，接种至含50μg/mL链霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm=0.6-0.8。
2、完成步骤1后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其浓度为2g/L，30℃、200rpm振荡培养12小时。
3、完成步骤2后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。
4、重组工程菌催化底物D-木糖合成D-木糖醇
反应体系的组成包括步骤3得到的菌体沉淀、D-木糖和甲酸盐缓冲液。
反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体浓度30g(湿重)/L、D-木糖100g/L、甲酸钠溶液1.0mol/L，辅因子NAD+添加量为0.5mmol/L（各浓度均为相应组分在体系中的终浓度）。
调整反应体系的pH为6.0，控制反应体系的温度37℃，反应24h后反应结束，离心收集的上清液，待测。
5、对步骤4得到的上清液进行HPLC检测，测定体系中的D-木糖醇浓度。进一步计算转化率，转化率(%)=D-木糖醇浓度(g/L)×终体积(L)/D-木糖浓度(g/L)×初始体积(L)。
HPLC系统：Agilent 1260；色谱柱：Aminex HPX-87C(300mm×7.8mm)；
流动相：双蒸水溶液。
流速：0.5mL/min；
温度：80℃；
检测器：RID。
图2为D-木糖和D-木糖醇标准品的液相图谱。
结果见表1。可当初始原料浓度为150g/L时，转化率高于90%，D-木糖醇的最大浓度为142g/L，随着底物D-木糖浓度增加，转化率也随之降低。
表1、工程菌X01催化D-木糖合成D-木糖醇
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1. 一种构建用于合成D-木糖醇的工程菌株的方法，包括如下步骤：使受体菌表达NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶和NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶，得到用于合成D-木糖醇的工程菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶来源于马克斯克鲁维酵母；和/或
所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶来源于硫杆菌；
和/或
所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶为如下任一所示：
（A1）氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质；
（A2）SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
（A3）与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母具有相同功能的蛋白质；
（A4）在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
和/或
所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶为如下任一所示：
（B1）氨基酸序列如SEQIDNo.3所示的蛋白质；
（B2）SEQ ID No.3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
（B3）与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于硫杆菌具有相同功能的蛋白质；
（B4）在SEQ ID No.3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：使所述受体菌表达所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶和所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶是通过如下实现的：向所述受体菌中导入所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶的编码基因和所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶的编码基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶的编码基因为如下任一：
（C1）核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（C2）在严格条件下与SEQ ID No.2所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子；
（C3）与SEQ ID No.2所限定的DNA序列具有99％以上、95％以 上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子；
和/或
进一步地，所述NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶的编码基因为如下任一：
（D1）核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；
（D2）在严格条件下与SEQ ID No.4所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子；
（D3）与SEQ ID No.4所限定的DNA序列具有99％以上、95％以 上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述受体菌为大肠杆菌；
进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BW25113。
6.利用权利要求1-5中任一所述的方法构建得到的工程菌株。
7.用于合成D-木糖醇的成套产品，为如下任一：
（E1）成套产品1：包括权利要求6所述工程菌株、D-木糖、甲酸盐和NAD(H)；
进一步地，所述成套产品1中还包括L-阿拉伯糖；
（E2）成套产品2：包括权利要求1-5任一中所述的NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶、权利要求1-5任一中所述的NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶、D-木糖、甲酸盐和NAD(H)；
所述NAD(H)为NAD+和/或NADH。
8.如下任一应用：
（F1）权利要求6所述工程菌株在合成D-木糖醇中的应用；
（F2）权利要求7所述的成套产品在合成D-木糖醇中的应用。
9.一种合成D-木糖醇的方法，包括如下步骤（G1）或（G2）：
（G1）将权利要求6所述工程菌株经L-阿拉伯糖诱导培养，得到诱导后菌株，用所述诱导后菌株全细胞催化D-木糖反应，得到D-木糖醇；
（G2）用权利要求1-5任一中所述的NAD(H)依赖型的D-木糖还原酶和权利要求1-5任一中所述的NAD(H)依赖型的甲酸脱氢酶催化D-木糖反应，得到D-木糖醇。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：在（G1）中，将所述工程菌株经L-阿拉伯糖诱导培养是在含有L-阿拉伯糖且其终浓度为2g/L的培养基中进行的；和/或，所述诱导培养的温度为30℃；和/或，所述诱导培养的时间为12-16小时；
和/或
在（G1）中，用所述诱导后菌株全细胞催化D-木糖反应的反应体系中，D-木糖的终浓度为100-200g/L；和/或，用所述诱导后菌株全细胞催化D-木糖反应的反应温度为30℃-50℃，和/或，反应pH为5.0-7.0，和/或，反应时间为12-24小时；
和/或
在（G1）和（G2）中，所述催化D-木糖反应的反应体系中还含有甲酸盐和NAD(H)；所述NAD(H)为NAD+和/或NADH；
进一步地，在（G1）中，所述催化D-木糖反应的反应体系中，甲酸盐的终浓度为1.0mol/L，所述NAD(H)为NAD+，NAD+的终浓度为0.5mmol/L。
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