KR101281962B1

KR101281962B1 - 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하기 위해 ｇｐｒ119 수용체를 사용하는 방법

Info

Publication number: KR101281962B1
Application number: KR1020087027461A
Authority: KR
Inventors: 지-리앙 추; 제임스 엔. 레오나드
Original assignee: 아레나 파마슈티칼스, 인크.
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2007-04-10
Publication date: 2013-07-08
Anticipated expiration: 2027-04-10
Also published as: HRP20110068T1; ATE487940T1; CA2618488C; RS51745B; EA201101475A1; NZ571110A; AU2007238805B2; NO20084746L; EP2402750A1; UA97479C2; US20100203038A1; JP4521838B2; HK1117911A1; DE602007010420D1; EP1971862A2; CA2618488A1; MEP27308A; WO2007120689A2; CY1111123T1; SI1971862T1

Abstract

본 발명은 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하기 위해 GPR119 수용체를 사용하는 방법에 관한 것이다. GPR119 수용체의 작동제는 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하고, 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키기 위한 치료제로서 유용하다. GPR119 수용체의 작동제는 특정 개체에게서 골 형성을 증진시켜 준다.

GPR119 수용체의 작동제, 골다공증 치료, 골 질량 증가

Description

특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하기 위해 ＧＰＲ119 수용체를 사용하는 방법 {Methods of using GPR119 receptor to identify compounds useful for increasing bone mass in an individual}

다음 논의는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이지만, 본 발명에 대한 선행 기술로 의도되거나 인정되지 않는다.

A. 골다공증

골다공증은 골 질량 손실과 골격근의 미세구조 악화로 인해 골 강도 손상을 유발시키는 것을 특징으로 하는 신체장해성 질병으로, 환자는 취약한 골절 위험에 노출될 가능성이 크다. 골다공증 환자는 유럽, 일본 및 미국에서 7천 5백만명 이상이고, 유럽과 미국에서만도 2백 3십만명 이상에게서 골절이 유발된다. 미국에서는, 폐경 후 모든 백인 여성 중의 25% 이상이 골다공증에 걸리고, 80세 이상의 여 성에게서는 그 비율이 70%로 상승한다. 50세 이상 여성 3명 중의 1명에게서 골다공증성 골절이 유발될 것인데, 이로 인해 상당한 수준의 사회적 및 재정적 부담이 야기된다. 이 질병은 여성에게만 국한되지 않고, 중년 남성에게도 영향을 미칠 수 있다. 2050년까지, 전세계적으로 남성의 엉덩이 골절 발생률은 310% 증가하고 여성은 240% 증가할 것으로 추정된다. 평생 임상적으로 나타나는 엉덩이, 아래팔, 및 척추 골절에 동시에 걸릴 위험은 대략 40%인데, 이는 심혈관계 질환 위험률과 맞먹는다. 따라서, 골다공증성 골절은 상당한 경제적 비용과 사망율 및 발병율을 유발시킨다. 노인 집단의 경우, 효과적인 예방 전략이 개발되지 않는 다면 골다공증성 골절 환자 수와 이에 따른 비용이 향후 50년 내에 최소 두배가 될 것이다 [참고: 예를 들어, Atik et al., Clin Orthop Relat Res (2006) 443:19-24; Raisz, J Clin Invest (2005) 115:3318-3325; and World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis].

B. 글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 폴리펩티드 (GIP)

글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 폴리펩티드 (GIP; 위장 억제성 폴리펩티드로서 공지되기도 함)는 음식물 섭취 후 십이지장 내분비 K 세포로부터 방출되는 42개 아미노산의 펩티드 인크레아틴 호르몬이다. 방출되는 GIP의 양은 주로, 소모된 글루코스의 양에 의존적이다. GIP는 췌장 베타 세포에서 글루코스-의존성 인슐린 분비를 자극하는 것으로 밝혀졌다. GIP는 특이적 G 단백질-커플링된 수용체, 즉 GIPR를 통하여 그의 작용을 매개한다.

GIP는 위치 2에 알라닌을 함유하고 있기 때문에, GIP의 분해를 조절하는 효 소인 디펩티딜 펩티다제-4 (DPP-IV)에 대한 우수한 기질이다. 완전한 길이의 GIP(1-42)는 소화관 K 세포로부터 분비된지 수 분 내에 생불활성 GIP(3-42)로 신속하게 전환된다. DPP-IV를 억제하는 것이 GIP 생활성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: 예를 들어, Drucker, Cell Metab (2006) 3:153-165; Mclntosh et al., Regul Pept (2005) 128:159-165; Deacon, Regul Pept (2005) 128:117-124; and Ahren et al., Endocrinology (2005) 146:2055-2059]. 완전한 길이의 생활성 GIP를, 예를 들어 혈액 내에서 분석하는 것은 N-말단 특이적 검정을 이용하여 수행할 수 있다 [참고: 예를 들어, Deacon et al, J Clin Endocrinol Metab (2000) 85:3575-3581].

최근에는, GIP가 골 형성을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. GIP는 골형성성 수용체를 활성화시켜, 골형성과 연관이 있는 콜라겐 유형 I 합성과 알칼리성 포스파타제 활성을 증가시켜 주는 것으로 밝혀졌다. GIP는 시험관 내에서 파골 세포 활성과 분화를 억제시키는 것으로 밝혀졌다. GIP 투여가 난소 절제술로 인한 골 손실을 예방시키는 것으로 밝혀졌다. GIP 수용체 (GIPR) 녹아웃 (knockout) 마우스는 골 크기 감소, 낮은 골 질량, 골 마이크로아키텍처 및 생화학적 특성 변경, 및 특히 골 형성에 있어서 골 교체를 위한 파라미터 변경의 명백한 증거를 나타낸다 [참고: 예를 들어, Zhong et al, Am J Physiol Endocrinol Metab (2007) 292:E543-E548; Bollag et al., Endocrinology (2000) 141:1228-1235; Bollag et al., Mol Cell Endocrinol (2001) 177:35-41; Xie et al., Bone (2005) 37:759-769; and Tsukiyama et al., Mol Endocrinol (2006) 20:1644-1651].

골 밀도 또는 형성을 유지시키거나 증가시키기 위한 GIP의 유용성은 GIP 펩티드를 투여함으로써 감소된 골 석회화 (bone mineralization)를 치료하는 것에 관한 미국 특허 제6,410,508호를 허여함으로써 미국 특허상표청에 의해 승인되었다. 그러나, 현 GIP 펩티드 작동제는 환자 치료 순응도에 불리한 영향을 미치는 경구 생체내 이용 효율 결여로 인해 곤경에 처해 있다. 관심을 끄는 대체 접근 방식은 내인성 GIP 활성 수준을 증가시키기 위한 경구적 활성 조성물을 개발하는 것이다.

C. GPR119

GPR119는 G 단백질-커플링된 수용체이다 (GPR119; 예를 들어, 인간 GPR119, GenBank^® 승인 번호 AAP72125 및 그의 대립 유전자; 예를 들어, 마우스 GPR119, GenBank^? 승인 번호 AY288423 및 그의 대립 유전자). 특정 작동제에 의한 GPR119 활성화는 세포내 cAMP의 수준 상승을 가져다 주고, 이는 GPR119가 Gs와 커플링된다는 사실에 일치한다. 특허 문헌에서는, GPR119가 RUP3으로서 지칭되었고 [참고: 예를 들어, WO 00/31258]; GPR119는 또한, 글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 수용체 (GDIR)로서 지칭되었다.

D. G 단백질-커플링된 수용체

인간에게는 수 많은 수용체 부류가 존재하긴 하지만, 가장 풍부하고 치료적으로 관련이 있는 것은 G 단백질-커플링된 수용체 (GPCR) 부류로써 제시된다. 대략 30,000개 내지 40,000개 유전자가 인간 게놈 내에 존재하는 것으로 추정되는데, 이중에서 대략 2%가 GPCR을 암호화하는 것으로 추정된다.

GPCR은 의약품을 개발하는 데에 있어서 중요한 분야를 나타낸다. GPCR에서 활성인 약물은 두통, 인지 기능장해, 고혈압, 소화성 궤양, 비염 및 천식과 같이 다양한 광범위한 스펙트럼의 인간 질병에 대해 치료적 이익을 가져다 준다. 임상적으로 시판되고 있는 약물 약 500개 중에서, 30% 이상이 GPCR 기능의 조정제이다. 이들 약물은 대략 30개의 널리 규명된 GPCR에서 그들의 활성을 발휘한다 [참고: 예를 들어, Wise et al, Annu Rev Pharmacol Toxicol (2004) 44:43-66].

GPCR은 7개의 알파 나선을 형성하는 22 내지 24개 소수성 아미노산의 7개 서열을 갖는 공통의 구조적 모티프를 공유하고 있는데, 상기 나선 각각은 막을 관통하고 있다 [각각의 관통은 숫자로써 확인된다: 즉 막관통-1 (TM-1), 막관통-2 (TM-2) 등]. 막관통 나선은 세포 막의 외부 또는 "세포외" 측면 상의 막관통-2와 막관통-3 사이, 막관통-4와 막관통-5 사이, 및 막관통-6과 막관통-7 사이의 아미노산 가닥 [이들은 각각 "세포외" 영역 1, 2 및 3 (EC-1, EC-2 및 EC-3)으로서 지칭된다]에 의해 연결된다. 막관통 나선은 또한, 세포 막의 내부 또는 "세포내" 측면 상의 막관통-1과 막관통-2 사이, 막관통-3과 막관통-4 사이, 및 막관통-5와 막관통-6 사이의 아미노산 가닥 [이들은 각각 "세포내" 영역 1, 2 및 3 (IC-1, IC-2 및 IC-3)으로서 지칭된다]에 의해 연결된다. 상기 수용체의 "카복시" ("C") 말단은 세포 내의 세포내 공간에 있고, 수용체의 "아미노" ("N") 말단은 세포 외부의 세포외 공간에 있다.

일반적으로, 특정 리간드가 상기 수용체와 결합하는 경우에는 (종종, 수용체의 "활성화"로서 지칭된다), 수용체의 입체 형태가 변화되는데, 이는 세포내 영역 과 세포내 "G-단백질" 간의 커플링을 촉진시켜 준다. GPCR은 G 단백질에 대해 불규칙한 것으로 보고되었는데, 즉 GPCR은 1개 이상의 G 단백질과 상호 작용할 수 있다 [참고: Kenakin, Life Sciences (1988) 43. 1095-1101]. 기타 G 단백질이 존재하긴 하지만, 현재 확인된 G 단백질은 Gq, Gs, Gi, Gz 및 Go이다. G 단백질과 커플링하는 리간드-활성화 GPCR은 신호 전달 케스케이드 과정 ("신호 변환"으로서 지칭된다)을 개시시킨다. 정상적인 조건 하에서는, 신호 변환으로 인해 궁극적으로, 세포성 활성화 또는 세포성 억제가 일어난다. 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, IC-3 루프 뿐만 아니라 수용체의 카복시 말단이 G 단백질과 상호 작용하는 것으로 여겨진다.

또한, 몇 가지 부류의 GPCR을 포스포리파제 C 경로와 커플링시키는 것으로 여겨지는 불규칙한 G 단백질 (예: G15 또는 G16) [참고: Offermanns & Simon, J Biol Chem (1995) 270:15175-80], 또는 다수의 상이한 GPCR을 동일한 경로, 예를 들어 포스포리파제 C와 커플링시키는 것으로 설계된 키메라 G 단백질이 있다 [참고: Milligan & Rees, Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20:118-24].

생리적 조건 하에서는, GPCR이 두 가지 상이한 입체 형태, 즉 "불활성" 상태와 "활성" 상태 사이의 평형으로 세포 막에 존재한다. 불활성 상태의 수용체는 생물학적 반응을 유도시키는 신호 변환을 개시시켜 주는 세포내 신호 변환 경로에 연결될 수 없다. 수용체 입체 형태를 활성 상태로 변화시키면, 변환 경로에 연결될 수 있어 (G 단백질을 통함) 생물학적 반응을 일으킨다.

수용체는 리간드 또는 화합물 (예: 약물)에 의해 활성 상태로 안정화될 수 있다. 수용체의 아미노산 서열에 대한 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 최근의 발견들은 수용체를 활성 상태 입체 형태로 증진 및 안정화시키기 위한 리간드 또는 약물 이외의 수단을 제공한다. 이들 수단은 수용체에 대한 리간드 결합 효과를 모방함으로써 활성 상태의 수용체를 효과적으로 안정화시켜 준다. 이러한 리간드-비의존성 수단에 의한 안정화는 "구성적 수용체 활성화"로 명명된다.

발명의 요약

본 발명은 GPR119 작동제를, 예를 들어 경구 투여에 의해 특정 개체에게 투여하는 것이 GPR119 수용체에서 작용하여 상기 개체에게서 GIP 수준을 증가시킬 수 있다는 본 출원인의 예상치 못한 발견에 관한 것이다. 본 발명은 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환 (예를 들어, 골다공증)을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 및 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하기 위한 GPR119 관련 방법을 특징으로 한다. GPR119 작동제는 특정 개체에게서 골 형성을 증진 (예를 들어, 증가)시키는 데에 유용하다. 특정 양태에서는, 개체가 인간이다.

인간 GPR119 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열 1에 제공된다. 상기 암호화된 인간 GPR119 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 2에 제공된다.

제1 국면 에서, 본 발명은

(a) 시험 화합물을, G 단백질-커플링된 수용체를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 막과 접촉시키는데, 상기 G 단백질-커플링된 수용체가

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(iii) 서열 2의 아미노산 2-335 [단, G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하지 않는다];

(iv) 특이적 프라이머 서열 3 및 서열 4를 사용하여 인간 DNA 샘플 상에서 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체의 아미노산 서열;

(v) 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체의 아미노산 서열;

(vi) 서열 2의 변이체;

(vii) (a') 서열 2와의 동일률이 약 80% 이상인 G 단백질-커플링된 수용체

의 아미노산 서열; 및

(b') 서열 2의 20개 이상 연속되는 아미노산을 포함하는 G 단백질-

커플링된 수용체의 아미노산 서열

로 이루어진 군 중에서 선택되는 경우, (vi)의 아미노산 서열;

(viii) 서열 2를 갖는 G 단백질-커플링된 수용체의 구성적 활성 버전의 아미노산 서열; 및

(ix) (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및

(b) G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극할 수 있는 시험 화합물의 능 력을 결정하는 단계

[G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극할 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 지표이다]

를 포함하는, GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2와의 동일률이 약 80% 이상인 G 단백질-커플링된 수용체의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 대립 유전자이다.

특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 오르토로그 (ortholog)이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 포유류 오르토로그이다.

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 재조합이다.

특정 양태에서, 상기 방법은 GIP 분비촉진제를 확인하는 방법이다.

특정 양태에서, 상기 방법은 수용체의 작동제를 확인하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 상기 방법은 수용체의 부분 작동제를 확인하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 상기 방법은 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물을 확인하는 방법이다.

특정 양태에서, 상기 방법은 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하는 방법이다.

본 발명은 부가적으로, 상기 제1 국면의 단계 (a) 및 (b)를 포함하고, 추가로

(c) 임의로, 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 합성하는 단계;

(d) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 시험관 내에서 척추 동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및

(e) 상기 화합물이 척추 동물 장내분비 세포로부터의 GIP 분비 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터의 GIP 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

[척추 동물 장내분비 세포로부터의 GIP 분비 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터의 GIP 분비를 자극할 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 지표이다]

특정 양태에서, 척추 동물 장내분비 세포는 포유류 장내분비 세포이다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 K 세포이다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 소장으로부터 유래된 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 십이지장 또는 공장 조직을 포함한다 [참고: 예를 들어, Sondhi et al, Pharmacogenomics J (2006) 6:131-140]. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 장내분비 세포주이다. 특정 양태에서, GIP를 분비할 수 있는 세포는 GIP를 분비할 수 있도록 공학 처리시킨 재조합 세포이다.

(d) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 척추 동물에게 투여하는 단계; 및

(e) 상기 화합물이 척추 동물 내에서 GIP 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

[척추 동물 내에서 GIP 수준을 증가시킬 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 지표이다]

특정 양태에서, GIP 수준은 총 GIP의 혈액 또는 혈장 농도이다. 특정 양태에서, GIP 수준은 생활성 GIP의 혈액 또는 혈장 농도이다.

특정 양태에서, 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류는 비인간 포유류이다.

(e) 상기 화합물이 척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

[척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시킬 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 지표이다]

를 포함하는, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 척추 동물에게서 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 골 질량 수준을 측정하는 것은 이중 에너지 X선 흡수측정법 (DXA)을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것은 DXA를 사용하여 엉덩이에서 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 골 질량 수준을 측정하는 것이 DXA 이외의 기술, 예를 들어 단일 X선 흡수측정법 (SXA) [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다는 것이 명백히 고려되어야 한다. 특정 양태에서, 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류는 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물 또는 포유류는 난소 절제된 랫트 또는 난소 절제된 마우스이다.

(d) 임의로, 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 제공하는 단계;

(e) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 시험관 내에서 척추 동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및

(f) 상기 화합물이 척추 동물 장내분비 세포로부터의 GIP 분비 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터의 GIP 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

(e) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 척추 동물에게 투여하는 단계; 및

(f) 상기 화합물이 척추 동물 내에서 GIP 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

(f) 상기 화합물이 척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 특정 개체에게서 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것은 DXA를 사용하여 엉덩이에서 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 골 질량 수준을 측정하는 것이 DXA 이외의 기술, 예를 들어 단일 X선 흡수측정법 (SXA) [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다는 것이 명백히 고려되어야 한다.

특정 양태에서, 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류는 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물 또는 포유류는 난소 절제된 랫트 또는 난소 절제된 마우스이다.

특정 양태에서, 상기 확인된 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 상기 확인된 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 상기 확인된 화합물은 수용체의 작동제이다. 몇몇 양태에서, 상기 작동제는 부분 작동제이다.

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 G 단백질과 커플링된다. 특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 활성화는 세포내 cAMP의 수준을 증가시킨다. 특정 양태에서, G 단백질은 Gs이다.

특정 양태에서, 인간 DNA 샘플은 인간 게놈 DNA이다.

몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)이다. RT-PCR 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 특정 양태에서, 인간 DNA 샘플은 인간 cDNA이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 조직으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, GPR119를 발현하는 인간 조직은 췌장 또는 췌장 섬이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 세포 유형으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, cDNA는 췌장 베타 세포로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, cDNA는 췌장 세포주로부터 유래된다.

특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포 닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

특정 양태에서, 엄격한 혼성화 조건은 50% 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 15O mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 5O mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 (Denhardt's) 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ㎍/ml 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 혼성화한 다음, 0.1xSSC를 포함하는 용액 중에서 65℃ 하에 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니 트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 GPCR이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 변이체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 G 단백질을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. GPCR:G 융합 구조물을 제조하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, 국제 공개공보 WO 02/42461].

특정 양태에서, 숙주 세포는 발현 벡터를 포함하고, 이러한 발현 벡터는 G 단백질-커플링된 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 양태에서, 발현 벡터는 pCMV이다. 이러한 벡터는 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규칙 하에 1998년 10월 13일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 [ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA)]에 기탁되었다. 상기 DNA를 ATCC가 시험한 결과, 살아 있는 것으로 결정되었다. ATCC는 pCMV에 다음 기탁 번호를 할당하였다: ATCC #203351. 기타 적합한 발현 벡터가 당업자에게 용이하게 명백할 것이고, 광범위한 발현 벡터가 시판되고 있다 [공급처: 예를 들어, Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA; 및 Invitrogen, Carlsbad, CA].

몇몇 양태에서, 숙주 세포는 척추 동물 세포이다. 몇몇 양태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 몇몇 양태에서, 포유류 숙주 세포는 293 세포, 293T 세포, CHO 세포, MCB3901 세포 및 COS-7 세포로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 몇몇 양태에서, 숙주 세포는 멜라닌 보유 세포이다. 기타 적합한 숙주 세포가 당업자에게 용이하게 명백할 것이고, 광범위한 세포주가 시판되고 있다 [공급처: American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209].

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 G 단백질-커플링된 수용체가 Gs-커플링된 수용체라는 것과 일치한다.

몇몇 양태에서, 상기 결정 단계는 G 단백질-커플링된 수용체가 불규칙한 G 단백질, 예를 들어 Gα15 또는 Gα16을 통하여 포스포리파제 C 경로와 커플링된다는 것과 일치한다. 불규칙한 G 단백질은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Offermanns et al., J Biol Chem (1995) 270:15175-15180]. 몇몇 양태에서, 상기 결정 단계는 G 단백질-커플링된 수용체가 키메라 G 단백질을 통하여, 예를 들어 포스포리파제 C 경로와 커플링된다는 것과 일치한다. 키메라 G 단백질은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Milligan et al., Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20:118-124; and WO 02/42461].

몇몇 양태에서, 상기 결정 단계는 제2 메신저의 수준을 측정하는 것을 통해서이다.

몇몇 양태에서, 상기 결정 단계는 사이클릭 AMP (cAMP), 사이클릭 GMP (cGMP), 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 (IP₃), 디아실글리세롤 (DAG), MAP 키나제 활성, MAPK/ERK 키나제 키나제-1 (MEKK1) 활성, 및 Ca²⁺으로 이루어진 군 중에서 선택된 제2 메신저의 수준을 측정하는 것을 통해서이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 제2 메신저는 cAMP이다. 특정 양태에서, 세포내 cAMP 수준을 증가시킨다.

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 G 단백질-커플링된 수용체를 포함하는 막을 사용하여 수행한다.

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 멜라닌 보유 세포 검정의 사용을 통해서이다. 특정 양태에서, 색소 분산 수준을 증가시킨다.

몇몇 양태에서, 상기 결정 단계는 리포터 (reporter) 검정을 통해서이다. 몇몇 양태에서, 리포터 검정은 CRE-Luc 리포터 검정이다.

몇몇 양태에서, 상기 결정 단계는 세포내 cAMP의 수준을 증가시킴으로써 매개된 활성 측정을 통해서이다.

몇몇 양태에서, 상기 결정 단계는 CRE-Luc 리포터 검정을 통해서이다. 특정 양태에서, 루시퍼라제 활성 수준을 증가시킨다.

몇몇 양태에서, 상기 결정 단계는 G 단백질-커플링된 수용체를 포함하는 막에 대한 GTPγS 결합성 측정을 통해서이다. 특정 양태에서, GTPγS를 [³⁵S]로 표지시킨다. 특정 양태에서, GPCR을 포함하는 막에 대한 GTPγS 결합성을 증가시킨다.

몇몇 양태에서, 시험 화합물은 소분자이다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 폴리펩티드가 아니다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 지질이 아니다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 폴리펩티드 또는 지질이 아니다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 폴리펩티드이다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 폴리펩티드인데, 단 이러한 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 지질이다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이다.

몇몇 양태에서, 상기 방법은 임의로, GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물의 구조를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

몇몇 양태에서, 상기 방법은 임의로, GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물의 명칭 또는 구조를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.

몇몇 양태에서, 상기 방법은 임의로, GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 생성하거나 합성하는 단계를 추가로 포함한다.

몇몇 양태에서, 상기 방법은 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 제약 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.

제2 국면 에서, 본 발명은

(a) 제1 국면에 따르는 방법에 의해 확인된 바 있는 화합물을 시험관 내에서 척추 동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 화합물이 척추 동물 장내분비 세포로부터의 GIP 분비 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터의 GIP 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

[척추 동물 장내분비 세포로부터의 GIP 분비 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터의 GIP 분비를 자극할 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 추가의 지표이다]

본 발명은 부가적으로,

(a) 제1 국면에 따르는 방법에 의해 확인된 바 있는 화합물을 척추 동물에게 투여하는 단계; 및

(b) 상기 화합물이 척추 동물 내에서 GIP 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

[척추 동물 내에서 GIP 수준을 증가시킬 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 추가의 지표이다]

본 발명은 부가적으로,

(b) 상기 화합물이 척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

[척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시킬 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 추가의 지표이다]

제3 국면 에서, 본 발명은

(a) GPR119 작동제를 시험관 내에서 척추 동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및

(b) GPR119 작동제가 척추 동물 장내분비 세포로부터의 GIP 분비 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터의 GIP 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

[척추 동물 장내분비 세포로부터의 GIP 분비 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터의 GIP 분비를 자극할 수 있는 GPR119 작동제의 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 지표이다]

본 발명은 부가적으로,

(a) GPR119 작동제를 척추 동물에게 투여하는 단계; 및

(b) GPR119 작동제가 척추 동물 내에서 GIP 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

[척추 동물 내에서 GIP 수준을 증가시킬 수 있는 GPR119 작동제의 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 지표이다]

본 발명은 부가적으로,

(a) GPR119 작동제를 척추 동물에게 투여하는 단계; 및

(b) GPR119 작동제가 척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

[척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시킬 수 있는 GPR119 작동제의 능력은 GPR119 작동제가 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 지표이다]

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 척추 동물에게서 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 골 질량 수준을 측정하는 것은 이중 에너지 X선 흡수측정법 (DXA)을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것은 DXA를 사용하여 엉덩이에서 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 골 질량 수준을 측정하는 것이 DXA 이외의 기술, 예를 들어 단일 X선 흡수측정법 (SXA) [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다는 것이 명백히 고려되어야 한다. 특정 양태에서, 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류는 비인간 포유류이 다. 특정 양태에서, 척추 동물 또는 포유류는 난소 절제된 랫트 또는 난소 절제된 마우스이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 내인성 GPR119의 작동제이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 인간 GPR119의 작동제이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 GPR119 부분 작동제이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 선택적 GPR119 작동제이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 소분자이다. 몇몇 양태에서, 소분자는 폴리펩티드가 아니다. 몇몇 양태에서, 소분자는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, 소분자는 지질이 아니다. 몇몇 양태에서, 소분자는 폴리펩티드 또는 지질이 아니다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 경구적으로 이용 가능하다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 EC₅₀ 값이 약 10 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 양태에서, GPR119 작동제는 서열 2를 갖는 인간 GPR119에서 EC₅₀ 값이 약 10 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 양태에서, GPR119 작동제는 아데닐릴 사이클라제 검정 (예시되는 아데닐릴 사이클라제 검정이 실시예 7 및 실시예 8에 제공된다; 하기 참고) 하에 서열 2를 갖는 인간 GPR119에서 EC₅₀ 값이 약 10 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 양태에서, GPR119 작동제는 멜라닌 보유 세포 검정 (예시되는 멜라닌 보유 세포 검정이 실시예 9에 제공된다; 하기 참고) 하에 서열 2를 갖는 인간 GPR119에서 EC₅₀ 값이 약 10 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다.

예시되는 GPR119 작동제는, 예를 들어 국제 특허출원 PCT/US2004/001267 (WO 04/065380으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/005555 (WO 04/076413으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/022327 (WO 05/007647로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/022417 (WO 05/007658로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2005/019318 (WO 2005/121121로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2004/050046 (WO 2005/061489로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US06/00567 (WO 2006/083491로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050264 (WO 2006/067531로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050265 (WO 2006/067532로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050266 (WO 2006/070208로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP2005/018412 (WO 06/040966으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP2005/019000 (WO 2006/043490으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050176 (WO 2007/003960으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050177 (WO 2007/003961로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050178 (WO 2007/003962로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050182 (WO 2007/003964로서 공개됨); 및 국제 특허출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로서 공개됨)에 기재되어 있다.

특정 양태에서, 상기 방법은 GPR119 작동제를 제공하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 제1 국면에 따르는 방법에 의해 확인 가능하다.

특정 양태에서, 상기 방법은 GPR119 작동제를 확인하기 위해 제1 국면에 따르는 방법을 수행하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 상기 방법은 제1 국면에 따르는 방법에 의해 GPR119 작동제를 확인하는 것을 포함한다.

제4 국면 에서, 본 발명은

(a) G 단백질-커플링된 수용체를 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드와 접촉시키는데, 상기 G 단백질-커플링된 수용체가

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(iii) 서열 2의 아미노산 2-335 [단, 상기 수용체는 서열 2의 아미노산 서 열을 포함하지 않는다];

(vi) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

(ix) (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단계;

(b) 상기 공지된 리간드와 수용체 간의 복합체를 탐지하는 단계; 및

(c) 상기 복합체가 시험 화합물의 부재 하에서 보다 시험 화합물의 존재 하에서 덜 형성되는지를 결정하는 단계

[이러한 결정은 시험 화합물이 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하 는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 지표이다]

특정 양태에서, 상기 수용체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 오르토로그이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 포유류 오르토로그이다.

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 재조합이다.

특정 양태에서, 공지된 리간드는 내인성 척추 동물, 포유류 또는 인간 GPR119 수용체의 리간드 또는 작동제이다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는 내인성 척추 동물, 포유류 또는 인간 GPR119 수용체의 공지된 작동제이다. 특정 양태 에서, 공지된 리간드는 내인성 인간 GPR119 수용체의 리간드 또는 작동제이다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는, 예를 들어 국제 특허출원 PCT/US2004/001267 (WO 04/065380으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/005555 (WO 04/076413으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/022327 (WO 05/007647로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/022417 (WO 05/007658로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2005/019318 (WO 2005/121121로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2004/050046 (WO 2005/061489)으로서 공개됨; 국제 특허출원 PCT/US06/00567 (WO 2006/083491로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050264 (WO 2006/067531로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050265 (WO 2006/067532로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050266 (WO 2006/070208로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP02/0935O (WO 03/026661로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP2005/018412 (WO 06/040966으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP2005/019000 (WO 2006/043490으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050176 (WO 2007/003960으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050177 (WO 2007/003961로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050178 (WO 2007/003962로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050182 (WO 2007/003964로서 공개됨); 또는 국제 특허출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는 내인성 척추 동물, 포유류 또는 인간 GPR119 수용체 의 내인성 리간드이다.

특정 양태에서, 임으로 표지된 공지된 리간드는 표지된 공지된 리간드이다. 특정 양태에서, 표지된 공지된 리간드는 방사성 표지된 공지된 리간드이다. 특정 화합물을 방사성 표지시키는 기술, 예를 들어 본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체의 공지된 리간드를 표지시키는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, 국제 공개공보 WO 04/065380; 하기 실시예 11].

G 단백질-커플링된 수용체와 G 단백질-커플링된 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물 간의 복합체를 탐지하기 위한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, 국제 공개공보 WO 04/065380; 하기 실시예 12].

본 발명은 부가적으로, 상기 제4 국면의 단계 (a) 내지 (c)를 포함하고, 추가로

(d) 임의로, 그의 존재 하에서 보다 적은 양의 복합체가 단계 (c)에서 형성되는 화합물을 합성하는 단계;

(e) 그의 존재 하에서 보다 적은 양의 복합체가 단계 (c)에서 형성되는 화합물을 시험관 내에서 척추 동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및

(e) 그의 존재 하에서 보다 적은 양의 복합체가 단계 (c)에서 형성되는 화합물을 척추 동물에게 투여하는 단계; 및

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 특정 개체에게서 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA를 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것은 DXA를 사용하여 엉덩이에서 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 골 질량 수준을 측정하는 것이 DXA 이외의 기술, 예를 들어 단일 X선 흡수측정법 (SXA) [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다는 것이 명백히 고려되어야 한다. 특정 양태에서, 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류는 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물 또는 포유류는 난소 절제된 랫트 또는 난소 절제된 마우스이다.

(d) 임의로, 그의 존재 하에서 보다 적은 양의 복합체가 단계 (c)에 따라서 형성되는 화합물을 합성하는 단계;

(e) 임의로, 그의 존재 하에서 보다 적은 양의 복합체가 단계 (c)에 따라서 형성되는 화합물을 제공하는 단계;

(f) 그의 존재 하에서 보다 적은 양의 복합체가 단계 (c)에 따라서 형성되는 화합물을 시험관 내에서 척추 동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및

(g) 상기 화합물이 척추 동물 장내분비 세포로부터의 GIP 분비 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터의 GIP 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

를 포함하는, GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다. 특정 양태에서, 척추 동물 장내분비 세포는 포유류 장내분비 세포이다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 K 세포이다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 소장으로부터 유래된 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 십이지장 또는 공장 조직을 포함한다 [참고: 예를 들어, Sondhi et al, Pharmacogenomics J (2006) 6:131-140]. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 장내분비 세포주이다. 특정 양태에서, GIP를 분비할 수 있는 세포는 GIP를 분비할 수 있도록 공학 처리시킨 재조합 세포이다.

(f) 그의 존재 하에서 보다 적은 양의 복합체가 단계 (c)에 따라서 형성되는 화합물을 척추 동물에게 투여하는 단계; 및

(g) 상기 화합물이 척추 동물 내에서 GIP 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

를 포함하는, GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다. 특정 양태에서, 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류는 비인간 포유류이다.

(g) 상기 화합물이 척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

특정 양태에서, 인간 DNA 샘플은 인간 게놈 DNA이다.

몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)이다. RT-PCR 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 특정 양태에서, 인간 DNA 샘플은 인간 cDNA이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 조직 으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, GPR119를 발현하는 인간 조직은 췌장 또는 췌장 섬이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 세포 유형으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, cDNA는 췌장 베타 세포로부터 유래된다. 특정 양태에서, cDNA는 췌장 세포주로부터 유래된다.

특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

특정 양태에서, 엄격한 혼성화 조건 (예: 고도로 엄격한 조건)은 50% 포름아 미드, 5xSSC (1xSSC = 15O mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 5O mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ㎍/ml 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 혼성화한 다음, 0.1xSSC를 포함하는 용액 중에서 65℃ 하에 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태 에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 GPCR이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 G 단백질을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. GPCR:G 융합 구조물을 제조하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, 국제공개공보 WO 02/42461].

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 G 단백질-커플링된 수용체를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 수행한다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 발현 벡터를 포함하고, 이러한 발현 벡터는 GPCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 양태에서, 발현 벡터는 pCMV이다. 이러한 벡터는 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규칙 하에 1998년 10월 13일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 [ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA)]에 기탁되었다. 상기 DNA를 ATCC가 시험한 결과, 살아 있는 것으로 결정되었다. ATCC는 pCMV에 다음 기탁 번호를 할당하였다: ATCC #203351. 기타 적합한 발현 벡터가 당업자에게 용이하게 명백할 것이고, 광범위한 발현 벡터가 시판되고 있다 [공급처: 예를 들어, Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA; 및 Invitrogen, Carlsbad, CA].

제5 국면 에서, 본 발명은

(a) 서열 2의 아미노산 1-335;

(b) 서열 2의 아미노산 2-335;

(c) 서열 2의 아미노산 2-335 [단, GPCR은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하지 않는다];

(d) 특이적 프라이머 서열 3 및 서열 4를 사용하여 인간 DNA 샘플 상에서 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체의 아미노산 서열;

(e) 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체의 아미노산 서열;

(f) 서열 2의 변이체;

(g) (i) 서열 2와의 동일률이 약 80% 이상인 G 단백질-커플링된 수용체

의 아미노산 서열; 및

(ii) 서열 2의 20개 이상 연속되는 아미노산을 포함하는 G 단백질-

커플링된 수용체의 아미노산 서열

로 이루어진 군 중에서 선택되는 경우, (f)의 아미노산 서열;

(h) 서열 2를 갖는 G 단백질-커플링된 수용체의 구성적 활성 버전의 아미노산 서열; 및

(i) (a) 내지 (h) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질-커플링 된 수용체를 사용하는 것을 특징으로 하는, GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하기 위해 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 특징으로 한다.

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 재조합이다.

제6 국면 에서, 본 발명은 제1 국면, 제2 국면, 제3 국면, 제4 국면 또는 제5 국면에 따라서 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하는 단계; 및 이러한 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 제약 조성물로 제형화하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

제7 국면 에서, 본 발명은 시험 화합물을 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물로서 스크리닝하기 위해 G 단백질-커플링된 수용체를 사용하는 것을 특징으로 하는데, 상기 G 단백질-커플링된 수용체가

(a) 서열 2의 아미노산 1-335;

(b) 서열 2의 아미노산 2-335;

(f) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

로 이루어진 군 중에서 선택되는 경우, (f)의 아미노산 서열;

(i) (a) 내지 (h) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

특정 양태에서, 상기 수용체는 재조합이다.

특정 양태에서, 시험 화합물은 소분자이다.

특정 양태에서, 시험 화합물은 GPR119 작동제이다

특정 양태에서, GPR119 작동제는 내인성 GPR119의 작동제이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 인간 GPR119의 작동제이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 GPR119 부분 작동제이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 선택적 GPR119 작동제이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 소분자이다.

특정 양태에서, GPR119 작동제는 경구적으로 이용 가능하다.

제8 국면 에서, 본 발명은

(a) G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물 (이러한 화합물 은 제1 국면에 따르는 방법에 의해 결정되거나 확인되었다)을 시험관 내에서 척추 동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는데, 상기 G 단백질-커플링된 수용체가

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(vi) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

(ix) (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 재조합이다.

특정 양태에서, 척추 동물 장내분비 세포는 포유류 장내분비 세포이다. 특 정 양태에서, 장내분비 세포는 K 세포이다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 소장으로부터 유래된 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 십이지장 또는 공장 조직을 포함한다 [참고: 예를 들어, Sondhi et al, Pharmacogenomics J (2006) 6:131-140]. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 장내분비 세포주이다. 특정 양태에서, GIP를 분비할 수 있는 세포는 췌장 세포이다 [GIP의 췌장 발현에 관해서는 문헌 (Xie et al, Bone 2007)을 참고할 수 있다]. 특정 양태에서, GIP를 분비할 수 있는 세포는 GIP를 분비할 수 있도록 공학 처리시킨 재조합 세포이다.

본 발명은 부가적으로,

(a) G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물 (이러한 화합물은 제1 국면에 따르는 방법에 의해 결정되거나 확인되었다)을 척추 동물에게 투여하는데, 상기 G 단백질-커플링된 수용체가

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(vi) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

(ix) (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 재조합이다.

특정 양태에서, GIP 수준은 총 GIP의 혈액 또는 혈장 또는 혈청 농도이다. 특정 양태에서, GIP 수준은 생활성 GIP의 혈액 또는 혈장 또는 혈청 농도이다.

본 발명은 부가적으로,

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(iii) 서열 2의 아미노산 2-335 [단, G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2 의 아미노산 서열을 포함하지 않는다];

(vi) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

(ix) (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

[척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시킬 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유 용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 추가의 지표이다]

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 재조합이다.

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 척추 동물에게서 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 골 질량 수준을 측정하는 것은 이중 에너지 X선 흡수측정법 (DXA)을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것은 DXA를 사용하여 엉덩이에서 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 골 질량 수준을 측정하는 것이 DXA 이외의 기술, 예를 들어 단일 X선 흡수측정법 (SXA) [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다는 것이 명백히 고려되어야 한다.

특정 양태에서, 인간 DNA 샘플은 인간 게놈 DNA이다.

몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)이다. RT-PCR 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 특정 양태에서, 인간 DNA 샘플은 인간 cDNA이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 조직으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, GPR119를 발현하는 인간 조직은 췌장 또는 췌장 섬이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 세포 유형으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, cDNA는 췌장 베타 세포로부터 유래된다. 특정 양태에서, cDNA는 췌장 세포주로부터 유래된다.

특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필 -[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

특정 양태에서, 엄격한 혼성화 조건 (예: 고도로 엄격한 조건)은 50% 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 15O mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 5O mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ㎍/ml 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 혼성화한 다음, 0.1xSSC를 포함하는 용액 중에서 65℃ 하에 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR 은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 소분자이다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 폴리펩티드가 아니다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 지질이 아니다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 폴리펩티드 또는 지질이 아니다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 폴리펩티드이다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 폴리펩티드인데, 단 이러한 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 지질이다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이다.

몇몇 양태에서, 상기 방법은 임의로, GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징 으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물의 구조를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

몇몇 양태에서, 상기 방법은 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 제약으로서 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.

제9 국면 에서, 본 발명은

(a) 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의 로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물 (이러한 화합물은 제4 국면에 따르는 방법에 의해 결정되거나 확인되었다)을 시험관 내에서 척추 동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는데, 상기 G 단백질-커플링된 수용체가

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(iii) 서열 2의 아미노산 2-335 [단, 상기 수용체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하지 않는다];

(vi) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

(viii) 서열 2를 갖는 G 단백질-커플링된 수용체의 구성적 활성 버전의 아 미노산 서열; 및

(ix) (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

특정 양태에서, G 단백질-커플링된 수용체는 재조합이다.

특정 양태에서, 척추 동물 장내분비 세포는 포유류 장내분비 세포이다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 K 세포이다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 소장으로부터 유래된 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 십이지장 또는 공장 조직을 포함한다 [참고: 예를 들어, Sondhi et al, Pharmacogenomics J (2006) 6:131-140]. 특정 양태에서, 장내분비 세포는 장내분비 세포주이다. 특정 양태에서, GIP를 분비할 수 있는 세포는 췌장 세포이다 [GIP의 췌장 발현에 관해서는 문헌 (Xie et al, Bone 2007)을 참고할 수 있다]. 특정 양태에서, GIP를 분비할 수 있는 세포는 GIP를 분비할 수 있도록 공학 처리시킨 재조합 세포이다.

본 발명은 부가적으로,

(a) 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물 (이러한 화합물은 제4 국면에 따르는 방법에 의해 결정되거나 확인되었다)을 척추 동물에게 투여하는데, 상기 G 단백질-커플링된 수용체가

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(vi) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

(ix) (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

본 발명은 부가적으로,

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(vi) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

(ix) (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

[척추 동물 내에서 골 질량 수준을 증가시킬 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 GIP 분비촉진제, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데에 유용한 화합물, 또는 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물이라는 추가의 지표이다]

특정 양태에서, 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인 간 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류는 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물 또는 포유류는 난소 절제된 랫트 또는 난소 절제된 마우스이다.

특정 양태에서, 상기 결정 단계는 척추 동물에게서 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA를 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것은 DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, DXA를 사용하여 T-스코어를 측정하는 것은 DXA를 사용하여 엉덩이에서 T-스코어를 측정하는 것을 포함한다. 골 질량 수준을 측정하는 것이 DXA 이외의 기술, 예를 들어 단일 X선 흡수측정법 (SXA) [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]을 사용하여 골 질량 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다는 것이 명백히 고려되어야 한다. 특정 양태에서, 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물은 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류는 비인간 포유류이다.

특정 양태에서, 인간 DNA 샘플은 인간 게놈 DNA이다.

몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)이다. RT-PCR 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 특정 양태에서, 인간 DNA 샘플은 인간 cDNA이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 조직으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, GPR119를 발현하는 인간 조직은 췌장 또는 췌 장 섬이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 세포 유형으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, cDNA는 췌장 베타 세포로부터 유래된다. 특정 양태에서, cDNA는 췌장 세포주로부터 유래된다.

특정 양태에서, 엄격한 혼성화 조건 (예: 고도로 엄격한 조건)은 50% 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 15O mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 5O mM 인산나트 륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ㎍/ml 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 혼성화한 다음, 0.1xSSC를 포함하는 용액 중에서 65℃ 하에 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

몇몇 양태에서, 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물은 소분자이다. 몇몇 양태에서, 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 폴리펩티드가 아니다. 몇몇 양태에서, 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리 간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 지질이 아니다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 소분자인데, 단 이러한 소분자는 폴리펩티드 또는 지질이 아니다. 몇몇 양태에서, 시험 화합물은 폴리펩티드이다. 몇몇 양태에서, 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물은 폴리펩티드인데, 단 이러한 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물은 지질이다. 몇몇 양태에서, 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 아니다. 몇몇 양태에서, 그의 존재 하에 G 단백질-커플링된 수용체와 이러한 수용체에 대한 임의로 표지된 공지된 리간드 간의 복합체가 해당 화합물의 부재 하에서 보다 적은 양으로 형성되는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이다.

특정 양태에서, 공지된 리간드는 내인성 척추 동물, 포유류 또는 인간 GPR119 수용체의 리간드 또는 작동제이다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는 내인성 척추 동물, 포유류 또는 인간 GPR119 수용체의 공지된 작동제이다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는 내인성 인간 GPR119 수용체의 리간드 또는 작동제이다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는, 예를 들어 국제 특허출원 PCT/US2004/001267 (WO 04/065380으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/005555 (WO 04/076413으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/022327 (WO 05/007647로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2004/022417 (WO 05/007658로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/US2005/019318 (WO 2005/121121로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2004/050046 (WO 2005/061489)으로서 공개됨; 국제 특허출원 PCT/US06/00567 (WO 2006/083491로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050264 (WO 2006/067531로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050265 (WO 2006/067532로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2005/050266 (WO 2006/070208로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP02/0935O (WO 03/026661로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP2005/018412 (WO 06/040966으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/JP2005/019000 (WO 2006/043490으로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050176 (WO 2007/003960으로서 공개됨); 국 제 특허출원 PCT/GB2006/050177 (WO 2007/003961로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050178 (WO 2007/003962로서 공개됨); 국제 특허출원 PCT/GB2006/050182 (WO 2007/003964로서 공개됨); 또는 국제 특허출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이다. 특정 양태에서, 공지된 리간드는 내인성 척추 동물, 포유류 또는 인간 GPR119 수용체의 내인성 리간드이다.

본 발명은 본원에 첨부된 도면과 연계해서 예시된다:

도 1은 야생형 마우스에서 혈액 GIP 수준에 대한 GPR119 작동제 투여 효과를 약력학적으로 분석한 것을 도시한 것이다. A. GPR119 작동제로서 화합물 1을 사용하여 수행한, 시간 경과에 따른 분석. B. GPR119 작동제로서 화합물 3을 사용하여 수행한, 시간 경과에 따른 분석. C. GPR119 작동제로서 화합물 3을 사용하여 수행한 용량 적정 분석.

도 2는 야생형 마우스와 비교해서 GPR119-결핍성 (녹아웃) 마우스에서 혈액 GIP 수준에 대한 GPR119 작동제 투여 효과를 도시한 것이다. A. GPR119 작동제로서 화합물 1을 사용하여 비교를 수행하였다. B. GPR119 작동제로서 화합물 2를 사용하여 비교를 수행하였다.

본 발명은 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용한 화합물을 확인하기 위해 GPR119 수용체를 사용하는 방법을 특징으로 한다. GPR119 수용체의 작동제는 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하고, 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키기 위한 치료제로서 유용하다. 본 발명은 적어도 부분적으로는, GPR119 작동제를, 예를 들어 경구 투여에 의해 특정 개체에게 투여하는 것이 GPR119 수용체에서 작용하여 상기 개체에게서 GIP 수준을 증가시킬 수 있다는 본 출원인의 놀라운 발견에 기초한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "리간드"는 특정 폴리펩티드, 예를 들어 GPR119와 특이적으로 결합하는 분자 (예: 시험 화합물)를 의미한다. 리간드는, 예를 들어 폴리펩티드, 지질, 소분자, 항체이다. 화합물 1은 GPR119 수용체 폴리펩티드의 예시되는 리간드이다 [참고: 화합물 1의 화학식과 화학명이 제시된 표 A]. 화합물 1은 국제 특허출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민 (표 A 참고)이 GPR119 수용체 폴리펩티드의 예시되는 리간드이다. 화합물 2는 GPR119 수용체 폴리펩티드의 예시되는 리간드이다. 화합물 2는 국제 특허출원 PCT/US2004/022417 (WO 2005/007658로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. 화합물 3은 GPR119 수용체 폴리펩티드의 예시되는 리간드이다. 화합물 3은 국제 특허출원 PCT/US2004/022327 (WO 2005/007647로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. 내인성 리간드는 본래의 폴리펩티드, 예를 들어 GPR119에 대한 내인성 천연 리간드인 리간드이다. 리간드는 "길항제", "작동제", "부분 작동제" 또는 "역 작동제" 등일 수 있다.

(2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민

본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동제"는 GPCR과의 결합을 통하여 GPCR을 활성화시켜 GPCR에 의해 매개된 세포내 반응을 유발시키도록 하는 작용제 (예: 리간드, 시험 화합물)를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "부분 작동제"는 GPCR과의 결합을 통하여 GPCR을 활성화시켜, 완전한 작동제 보다는 덜한 정도이긴 하지만 GPCR에 의해 매개된 세포내 반응을 유발시키도록 하는 작용제 (예: 리간드, 시험 화합물)를 의미한다.

용어 "길항제"는 작동제 또는 부분 작동제와 대략 동일한 부위에서 GPCR과 결합하고, 바람직하게는 GPCR과 경쟁적으로 결합하지만, 활성 형태의 GPCR에 의해 개시된 세포내 반응을 활성화시키지 않음으로써 작동제 또는 부분 작동제에 의한 세포내 반응을 억제시킬 수 있는 작용제 (예: 리간드, 시험 화합물)를 의미한다. 길항제는 전형적으로, 작동제 또는 부분 작동제의 부재 하에서 기준선 세포내 반응을 저하시키지 않는다.

용어 "역 작동제"는 GPCR과 결합하고, 활성 형태의 상기 수용체에 의해 개시된 기준선 세포내 반응을, 작동제 또는 부분 작동제의 부재 하에 관찰되는 정상 기준 수준 활성 아래로 억제시키는 작용제 (예: 리간드, 시험 화합물)를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "GPR119 작동제"는 GPR119 수용체와 결합하고 작동제로서 작용하는 화합물을 지칭한다. 화합물 1은 예시되는 GPR119 작동제이다 [참고: 화합물 1의 화학식과 화학명이 제시된 표 A]. 화합물 1은 국제 특허출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 예시되는 GPR119 작동제이다. 화합물 2는 예시되는 GPR119 작동제이다. 화합물 2는 국제 특허출원 PCT/US2004/022417 (WO 2005/007658로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. 화합물 3은 예시되는 GPR119 작동제이다. 화합물 3은 국제 특허출원 PCT/US2004/022327 (WO 2005/007647로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택적 GPR119 작동제"는 하나 이상의 관련 수용체, 예를 들어 코르티코트로핀-방출 인자-1 (CRF-1) 수용체에 비해 GPR119 수용체에 대한 선택성을 지닌 GPR119 작동제를 지칭한다. 화합물 1은 예시되는 선택적 GPR119 작동제이다 [참고: 화합물 1의 화학식과 화학명이 제시된 표 A]. 화합물 1은 국제 특허출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 예시되는 선택적 GPR119 작동제이다. 화합물 2는 예시되는 선택적 GPR119 작동제이다. 화합물 2는 국제 특허출원 PCT/US2004/022417 (WO 2005/007658로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다. 화합물 3은 예시되는 선택적 GPR119 작동제이다. 화합물 3은 국제 특허출원 PCT/US2004/022327 (WO 2005/007647로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다.

용어 "GIP 분비촉진제"는 특정 개체, 예를 들어 척추 동물 또는 포유류에 대한 투여시 특정 세포, 예를 들어 장내분비 세포에서 GIP의 분비를 증진시켜 주거나 또는 총 GIP 수준, 예를 들어 혈액 또는 혈장 총 GIP 수준을 증가시켜 주는 작용제 (예: 리간드, 시험 화합물)를 의미한다. 특정 양태에서, GIP 분비촉진제는 특정 개체에게서 총 GIP 수준, 예를 들어 혈액 또는 혈장 총 GIP 수준을 증가시키는 데에 적합한 화합물이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "개체"는 척추 동물을 지칭하는데, 이에는 어류 (예: 상업적으로 양식된 어류, 관상어 등), 양서류 (예: 개구리, 두꺼비, 애완용 양서류 등), 파충류 (예: 뱀, 도마뱀, 거북, 애완용 파충류 등), 조류 (예: 치킨, 칠면조, 애완용 조류 등) 및 포유류 (예: 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 돼지, 개, 고양이, 말, 암소, 양, 염소, 비인간 영장류, 비인간 포유류, 애완용 비인간 포유류, 인간 등)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 개체는 어류이다. 특정 양태에서, 개체는 양서류이다. 특정 양태에서, 개체는 파충류이다. 특정 양태에서, 개체는 조류이다. 특정 양태에서, 개체는 칠면조이다. 과거 25년 동안, 가슴 근육 질량이 보다 큰 칠면조에 대한 상업적 도태 압력으로 인해, 골격 원형 보존에 대한 수요가 증가하게 되었다. 그러나, 이러한 가슴 근육 질량 증가는 골격 상의 대상성 변화를 동반하지 않았고, 그 결과 칠면조 산업은 다리 상의 문제점을 경험하게 되었다. 젊은 숫컷 칠면조에서 장골 골절이 보고되었다 [참고: 예를 들어, Crespo et al, Poult Sci (2000) 79:602-608]. 특정 양태에서, 개체는 포유류이다. 특정 양태에서, 개체는 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 돼지, 개, 고양이, 말, 암소, 양, 염소, 비인간 영장류 또는 인간이다 (이에는 본 발명의 양태가 개별적으로 또는 조합하여 포함될 수 있다). 특정 양태에서, 개체는 말이다. 레이싱, 보측 및 기타 경쟁적 이벤트와 같은 활동에 관여하는 말인 퍼포먼스 (performance) 말은 골절에 걸리기 쉽다. 특정 양태에서, 개체는 개 또는 고양이이다. 특정 양태에서, 개체는 인간 애완용 동물 (예: 개, 고양이 등), 농장용 동물 (예: 암소, 양, 염소, 돼지, 치킨 등), 스포츠용 동물 (예: 말, 개 등), 하역용 동물 (예: 노새, 낙타 등) 또는 외래 동물 (예: 동물원에 있는 동물 등)인데, 이에는 본 발명의 양태가 개별적으로 또는 조합하여 포함될 수 있다. 특정 양태에서, 개체는 비인간 포유류이다. 특정 양태에서, 개체는 비인간 영장류 (예: 붉은털 원숭이, 침팬지 등)이다. 특정 양태에서, 개체는 인간이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방 또는 치료를 필요로 하는"이란 개체에게 치료가 요구되거나 이러한 치료로부터 이득을 얻게 될 것인지에 관해 간호인 (예를 들어, 인간의 경우에는 의사, 간호사, 간호 실시자이고; 비인간 척추 동물의 경우, 특히 비인간 포유류의 경우에는 수의사이다)이 판단하는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"은 다음 중의 한 가지 이상을 포함하는, 조사자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 추구하고자 하는 특정 조직, 시스템, 동물, 개체 또는 인간에게서의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발시키는 활성 화합물 또는 의약품의 양을 지칭한다:

(1) 질병 예방: 예를 들어, 특정 질병, 질환 또는 장애에 걸리기 쉬울 수 있지만, 아직 이러한 질병의 병리 상태 또는 증상을 경험하거나 표시하지 않은 개체에게서 상기 질병, 질환 또는 장애를 예방한다;

(2) 질병 억제: 예를 들어, 특정 질병, 질환 또는 장애의 병리 상태 또는 증상을 경험하거나 표시하는 개체에게서 이러한 질병, 질환 또는 장애를 억제한다 (즉, 상기 병리 상태 및/또는 증상의 추가 발생을 저지시킨다);

(3) 질병 개선: 예를 들어, 특정 질병, 질환 또는 장애의 병리 상태 또는 증상을 경험하거나 표시하는 개체에게서 이러한 질병, 질환 또는 장애를 개선시킨다 (즉, 상기 병리 상태 및/또는 증상을 반전시킨다).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료적 효능"은 다음 중의 한 가지 이상을 포함하는, 조사자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 추구하고자 하는 특정 조직, 시스템, 동물, 개체 또는 인간에게서의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발시키는 것을 지칭한다:

용어 "예방시키는 데에 유효한 양"은 예방시키고자 하는 생물학적 또는 의학적 사건의 발생 위험을 예방하거나 저하시켜 줄 약물의 양을 지칭한다. 많은 경우에 있어, 예방시키는 데에 유효한 양은 치료적 유효량과 동일하다.

용어 "조성물"은 한 가지 이상의 성분을 포함하는 물질을 의미한다.

용어 "활성 성분"은 질병의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방시키는 데에 있어서 약리학적 활성 또는 기타 직접적 효과를 제공해 주는 모든 성분을 의미한다.

용어 "제약 조성물"은 한 가지 이상의 활성 성분을 포함함으로써, 포유류에서 조사 및 치료할 수 있는 조성물을 의미한다.

"제약상 허용 가능한" 이란 담체, 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 염이 제형의 기타 성분과 화합성이어야만 하고, 그의 수용자에 대해 유해하지 않아야 한다는 것을 의미한다.

용어 "투여 형태"는 특정 약물이 생성되고 투여되는 물리적 형태, 예를 들어 정제, 캅셀제 또는 주사제를 의미한다.

"골 (뼈)"은 조밀한 유기 매트릭스와 무기, 미네랄 성분을 포함하는, 대부분의 척추 동물의 골격 대다수를 형성하고 있는 조밀하고 반-경직성의 다공성 석회화 연결 조직을 의미한다. 골은 척추 동물의 골격을 구성하고 있는 수 많은 원자상 별개의 구조이다.

용어 "골 질량" 및 "골 미네랄 밀도 (BMD)"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 인간에게서의 BMD는 통상적으로, 표준 방사선 기술인 이중 에너지 X-선 흡수측정법 (DXA)에 의해 측정한다. BMD를 평가하기 위해 개발된 많은 기술 중에서, DXA가 기술적으로 가장 고도로 개발된 것이고, 생물학적으로 가장 철저히 입증된 것이다. 적합하게 적응시킨 소프트웨어를 수반한 DXA 기술을 또한 사용하여 동물 연구에서 BMD를 신뢰할 만한 수준으로 평가할 수 있다. DXA는 골다공증을 진단하고, 예후하며 (골절 예보), 이러한 장애의 자연 병력을 모니터링하며, 치료에 대한 반응을 평가하는 데에 사용한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "낮은 골 질량"은 특정 개체에게서 골 미네랄 밀도 (BMD)의 감소 또는 저하를 지칭하고, 이에는 세계 보건 기구 [World Health Organization (WHO)]에 의해 정의된 바와 같은 골다공증과 골감소증 둘 다가 포함된다. WHO는 젊은 성인 기준 평균의 1 표준 편차 내의 BMD 값을 정상치로 규정하였다 (T-스코어 ≥ -1). WHO는 젊은 성인 기준 평균 아래의 1 초과 표준 편차이지만, 상기 값 아래의 2.5 미만 표준 편차인 BMD 값을 골감소증으로 규정하였다 (T-스코어 ＜ -1 내지 ＞ -2.5). WHO는 골다공증을 보다 중증 형태의 골감소증으로서 특징지웠고, 젊은 성인 평균 아래의 2.5 이상 표준 편차의 BMD 값으로써 규정하였다 (T-스코어 ≤2.5) [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis; 이의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 보다 흔하게는, 골감소증이 -1 미만 -2 초과의 T-스코어로서 규정되고, 골다공증은 -2 이하의 T-스코어로서 규정된다. 본 발명의 특정 양태에서, T-스코어는 DXA를 이용하여 엉덩이에서 측정한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "골다공증"은 젊은 성인 기준 평균 아래의 2 이상 표준 편차의 BMD 값으로써 규정하거나 (T-스코어 ≤ 약 2) 또는 간호인 (예를 들어, 인간의 경우에는 의사, 간호사, 간호 실시자이고; 비인간 척추 동물의 경우에는 수의사이다)에 의해 이루어진 진단을 지칭한다.

골다공증은 일차 또는 이차로서 분류될 수 있다 [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "골다공증"은 일차 골다공증과 이차 골다공증을 포괄한다. 특정 양태에서, 골다공증은 일차 골다공증이다. 특정 양태에서, 골다공증은 이차 골다공증이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "일차 골다공증"은 폐경 (자연적, 미성숙 또는 외과적), 노화, 또는 이들 둘 다와 연관이 있다. 본 발명에서는 폐경 (자연적, 미성숙 또는 외과적)과 연관된 일차 골다공증, 노화와 연관된 일차 골다공증, 및 폐경과 노화 둘 다와 연관된 일차 골다공증이 개별적으로 또는 조합하여 해당 양태에 포함될 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "이차 골다공증"은 폐경이나 노화와 연관되지 않고, 오히려 의학적 질환 또는 약제 또는 약물 사용과 연관되는 골다공증을 지칭한다. 골다공증 위험 증가는 숙주의 의학적 질환, 예를 들어 내분비 및 대사성 장애, 및 악성 질환과 연관이 있고, 특정 약제 및 약물 사용과 연관이 있으며, 이의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis; Williams Textbook of Endocrinology, 10^th Edition; 이의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 이차 골다공증은 또한, 부동화와 연관될 수 있다. 의학적 질환, 약제 또는 약물 사용, 또는 부동화에 따른 골다공증의 진단은 간호인 (예를 들어, 인간의 경우에는 의사, 간호사, 간호 실시자이고; 비인간 척추 동물의 경우에는 수의사이다)에 의해 이루어질 수 있다.

"골 골절"이란 뼈의 완전하거나 불완전한 파괴, 파열 또는 균열을 의미한다. 골절의 진단은 정상적으로, 임상적 검사와 방사선을 이용한 발견에 의존한다. 본 발명에서는, 골 골절에 외상성 골절, 장기간 골절 및 병리학적 골절이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "외상성 골절"은 뼈의 자연적 탄성을 초과하는 국부적 충동 정도를 나타내는 역치상 외상과 관련이 있는 즉시 골절을 지칭한다. 이는 연질 조직 및 아주 종종 피부에 대한 동시 손상을 동반할 수 있다. 외상성 골절은 폐쇄적일 수 있다 (인접한 연질 조직은 손상될 수 있으나, 연질부를 덮고 있는 것은 대부분 보존된다). 외상성 골절은 개방성일 수 있다 (파괴된 골 말단이 광범위한 연질 조직 손상에 의해 돌출되어, 외부로부터의 병원체가 상처 부위에 직접 유입될 수 있다).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "장기간 골절"은 만성 골절, 부서지기 쉬운 골절, 스트레스 골절 또는 자연 골절 유형 I을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "병리학적 골절"은 자연 골절 유형 II를 지칭한다. 병리학적 골절은 이를 예기하는 적당한 외상 없이 자발적으로 일어난다. 뼈는 기존에 전신 질환 [예: 골다공증, 골형성 장애 또는 파제트 (Paget) 변형성 골염] 또는 국부적 골 병변 (예: 전이, 방사선성 골괴사, 또는 골 종양)에 의해 손상을 받았을 수도 있다 [참고: Adler, Claus-Peter, BONE DISEASES, p. 114 (Springer-Verlag, Germany 2000)].

골절에는 또한, 경사 비틀린 골절, 횡골절, 분쇄 골절, 압축 골절, 늑골 골절, 잠행성 (creeping) 골절 및 골절된 대퇴부 연결부가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: Adler, Claus-Peter, BONE DISEASES, Springer-Verlag, Germany (2000)].

본원에 사용된 바와 같은 용어 "낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환"에는 골감소증, 골다공증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 치주 질환, 치조골 손실, 골절개술 골 손실, 유아 특발성 골 손실, 척추 만곡 및 키 손실이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 골다공증은 일차 골다공증이다. 특정 양태에서, 골다공증은 이차 골다공증이다. 특정 양태에서, 이차 골다공증은 의학적 질환과 연관이 있다. 특정 양태에서, 이차 골다공증은 약제 또는 약물 사용과 연관이 있다. 특정 양태에서, 이차 골다공증은 부동화와 연관이 있다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환에는 또한, 파제트병 (Paget's disease), 전이성 암으로 인한 골 손실, 및 골용해성 병변, 예를 들어 종양성 질환, 방사선 요법 또는 화학요법에 의해 유발된 병변이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환에는 또한, 골다공증의 장기간 합병증, 예를 들어 척추 만곡, 키 손실 및 보철 수술이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환이 개별적으로 또는 조합하여 해당 양태에 포함될 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다 [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis; Williams Textbook of Endocrinology, lO^th Edition, Larsen et al, Eds. (2002), W.B. Saunders Company; and Endocrinology and Metabolism, 4^th Edition, Felig et al, Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다].

본원에 사용된 바와 같은 "골 질환"은 뼈의 비정상과 관계된 장애 또는 질환을 지칭한다. 골 질량 또는 골 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따라서 치료될 수 있는 골 질환에는 골감소증, 골다공증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 치주 질환, 치조골 손실, 골절개술 골 손실, 유아 특발성 골 손실, 척추 만곡 및 키 손실이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 골다공증은 일차 골다공증이다. 특정 양태에서, 골다공증은 이차 골다공증이다. 특정 양태에서, 이차 골다공증은 의학적 질환과 연관이 있다. 특정 양태에서, 이차 골다공증은 약제 또는 약물 사용과 연관이 있다. 특정 양태에서, 이차 골다공증은 부동화와 연관이 있다. 골 질량 또는 골 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따라서 치료될 수 있는 골 질환에는 또한, 파제트병, 및 전이성 암으로 인한 골 손실이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 골 질량 또는 골 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따라서 치료될 수 있는 파괴성 골 장애에는 골다공증, 골관절염, 및 골용해성 병변, 예를 들어 종양성 질환, 방사선 요법 또는 화학요법에 의해 유발된 병변이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는, 골 질량 또는 골 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따라서 치료될 수 있는 골 질환이 개별적으로 또는 조합하여 해당 양태에 포함될 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다 [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis; Williams Textbook of Endocrinology, lO^th Edition, Larsen et al, Eds. (2002), W.B. Saunders Company; and Endocrinology and Metabolism, 4^th Edition, Felig et al, Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다].

본 발명은 또한 골 질량 또는 골 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따르는 치료로부터 이득을 얻는 기타 질환에 관한 것인데, 이에는 안면 재건술, 상악 재건술, 하악 재건술, 치주 질환 또는 발치 후 증강된 골 치유, 증강된 장골 확장, 증강된 보철 내증식 및 증가된 골 유합증이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

용어 "내인성"은 특정 개체 (예를 들어, 인간이지만, 이에 제한되지 않는다)가 천연적으로 생성시키는 물질을 의미한다. 이와는 달리, "비-내인성"은 특정 개체 (예를 들어, 인간이지만, 이에 제한되지 않는다)가 천연적으로 생성시키지 못하는 물질을 의미한다.

G 단백질-커플링된 수용체의 "생물학적 활성 단편"은 천연 발생적 GPCR의 구조적 및 생화학적 기능을 지닌 GPCR의 단편을 의미한다. 특정 양태에서, 생물학적 활성 단편은 G 단백질과 커플링된다. 특정 양태에서, 생물학적 활성 단편은 GPCR의 공지된 리간드와 결합한다.

용어 "프라이머"는 본원에서, 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 특이적 뉴클레오티드 서열을 의미하고, 표적 뉴클레오티드 서열과 혼성화하기 위해 사용된다. 프라이머는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소에 의해 촉매된 뉴클레오티드 중합에 대한 개시 점으로서 제공된다.

용어 "발현 벡터"는 이러한 발현 벡터에 대해 재조합인 적당한 숙주 세포에서 클로닝된 DNA의 전사와 전사된 mRNA의 해독을 위해 요구되는 DNA 서열을 의미한다. 적당하게 구축된 발현 벡터는 숙주 세포에서 자기 복제를 위한 복제 기점, 선별성 마커, 제한된 수의 유용한 제한 효소 부위, 고 카피 수에 대한 포텐셜, 및 활성 프로모터를 함유해야 한다. 전사될 클로닝된 DNA는 발현 벡터 내에서 구성적으로 또는 조건부로 활성인 프로모터와 작동적으로 연결된다.

용어 "숙주 세포"는 내부에 혼입된 벡터를 가질 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 벡터는 전형적으로, GPCR 또는 GPCR 융합 단백질의 발현이 일어날 수 있게 해주는 데에 적합한 프로모터 서열과 작동적으로 연계해서 이러한 GPCR 또는 GPCR 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 함유할 것이다. 특별한 양태에서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포이다. 특정 양태에서, 진핵 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이다. 특정 양태에서, 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 특정 양태에서, 진핵 숙주 세포는 멜라닌 보유 숙주 세포이다.

용어 "접촉" 또는 "접촉하는"은 2개 이상의 부분을 접합시키는 것을 의미한다.

용어 "조정" 또는 "변형"은 특별한 활성, 기능 또는 분자의 양, 질 또는 효과를 증가 또는 감소시키는 것을 지칭한다. 제한되지 않고 예시하자면, G 단백질-커플링된 수용체의 작동제, 부분 작동제, 역 작동제 및 길항제가 상기 수용체의 조정제이다.

용어 "소분자"는 분자량이 몰당 약 10,000 그램 미만인 화합물을 의미하고, 이에는 펩티드, 펩티드 모방제, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 유기 화합물 또는 무기 화합물 (즉, 이종-유기 화합물 또는 유기-금속성 화합물 포함), 및 그의 염, 에스테르 및 기타 제약상 허용 가능한 형태가 포함된다. 특정 양태에서, 소분자는 분자량이 몰당 약 5,000 그램 미만인 유기 또는 무기 화합물이다. 특정 양태에서, 소분자는 분자량이 몰당 약 1,000 그램 미만인 유기 또는 무기 화합물이다. 특정 양태에서, 소분자는 분자량이 몰당 약 800 그램 미만인 유기 또는 무기 화합물이다. 특정 양태에서, 소분자는 분자량이 몰당 약 600 그램 미만인 유기 또는 무기 화합물이다. 특정 양태에서, 소분자는 분자량이 몰당 약 500 그램 미만인 유기 또는 무기 화합물이다.

본원에 사용된 아미노산 약어가 표 B에 제시된다:

용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 지칭하는데, 이러한 중합체의 길이는 상관이 없다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 상기 용어는 또한, 폴리펩티드의 발현 후 변형을 명시하거나 배제하지 않는다. 예를 들어, 글리코실 기, 아세틸 기, 포스페이트 기, 지질 기 등의 공유 부착을 포함하는 폴리펩티드가 상기 용어 폴리펩티드에 명백히 포괄된다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 쇄 또는 이중체 형태의 1개 초과 뉴클레오티드의 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열을 지칭한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 합성, 재조합, 생체외 발생 또는 그의 조합을 포함한 공지된 모든 방법 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 정제 방법을 활용함으로써 제조할 수 있다.

용어 "항체"는 본원에서 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 포괄한다.

용어 "제2 메신저"는 수용체 활성화의 결과로서 생성된 세포내 반응을 의미한다. 제2 메신저에는, 예를 들어 이노시톨 1,4,5-트리포스레이트 (IP₃), 디아실글리세롤 (DAG), 사이클릭 AMP (cAMP), 사이클릭 GMP (cGMP), MAP 키나제 활성, MAPK/ERK 키나제 키나제-1 (MEKK1) 활성, 및 Ca²⁺이 포함될 수 있다. 제2 메신저 반응은 수용체 활성화 결정을 위해 측정할 수 있다.

용어 "수용체 기능성"은 자극을 수용하고 세포 내에서의 효과를 조정하기 위한 수용체의 정상적 작동을 지칭하고, 이에는 유전자 전사 조절, 이온 유입 또는 방출 조절, 촉매적 반응 수행, 및/또는 G 단백질을 통한 활성 조정, 예를 들어 제2 메신저 반응 유발이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

용어 "반응" 또는 "수용체의 기능성"과 관계된 용어 "자극" 또는 "자극하는"은 특정 반응 또는 수용체의 기능성이 특정 화합물의 부재 하에서와는 반대로 이러한 화합물의 존재 하에서 증가되는 것을 의미한다.

용어 "반응" 또는 "수용체의 기능성"과 관계된 용어 "억제" 또는 "억제하는"은 특정 반응 또는 수용체의 기능성이 특정 화합물의 부재 하에서와는 반대로 이러한 화합물의 존재 하에서 저하 또는 방지되는 것을 의미한다.

용어 "화합물 효능"은 수용체 결합 친화성과는 반대로 수용체 기능성을 억제 또는 자극할 수 있는 화합물의 능력 측정을 의미한다.

본원에서 "후보 화합물"과 상호 교환적으로 사용된 용어 "시험 화합물"은 스크리닝 기술을 할 수 있는 분자 (예를 들어, 화학적 화합물이 있지만, 이에 제한되지 않는다)를 의미한다.

G 단백질-커플링된 수용체와 관계된 용어 "구성적 활성"은 G 단백질-커플링된 수용체가 작동제-비의존성 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.

용어 "시험 화합물"과 관계된 용어 "직접 확인하는" 또는 "직접 확인된"은 G 단백질-커플링된 수용체에 대한 공지된 리간드 (예: 공지된 작동제)의 부재 하에서 G 단백질-커플링된 수용체에 대항한 화합물을 스크리닝하는 것을 의미한다.

특정 범위 값이 제공되는 경우, 각 사이 값은 달리 표시되지 않는 한 하한치의 1/10, 해당 범위의 상한치와 하한치 사이, 및 기타 언급되거나 이와 같이 언급된 범위 내의 사이 값이 본 발명에 포괄된다는 것을 인지해야 한다. 이들 보다 적은 범위의 상한치와 하한치는 독립적으로, 보다 적은 범위 내에 포함될 수 있고, 또한 본 발명 내에 포괄되는데, 언급된 범위 내에 구체적으로 배제된 제한치를 전제로 한다. 언급된 범위에 제한치 중의 하나 또는 둘 다가 포함되는 경우, 포함된 제한치 중의 하나 또는 둘 다를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.

A. 도입

다음 섹션 순서는 효율을 제시하기 위한 것이며, 다음 설명과 청구의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

B. 수용체 발현

1 . 관심있는 GPCR 폴리펩티드

본 발명의 GPCR은

(a) 서열 2의 아미노산 1-335;

(b) 서열 2의 아미노산 2-335;

(f) 서열 2의 변이체;

의 아미노산 서열; 및

커플링된 수용체의 아미노산 서열

로 이루어진 군 중에서 선택되는 경우, (f)의 아미노산 서열;

(i) (a) 내지 (h) 중의 어느 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명의 GPCR은 서열 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 내인성 G 단백질-커플링된 수용체이다. 몇몇 양태에서, 내인성 G 단백질-커플링된 수용체이고, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 포유류 G 단백질-커플링된 수용체이다. 몇몇 양태에서, 내인성 G 단백질-커플링된 수용체이고, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 포유류 GPR119 수용체이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 화합물 1 [참고: 화합물 1의 화학식과 화학명이 제시된 표 A]과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 상기 수용체 하에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 수용체이다. 특정 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 상기 수용체 하에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 G 단백질-커플링된 수용체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

몇몇 양태에서, 인간 DNA는 게놈 DNA이다.

몇몇 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)이다. RT-PCR 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 몇몇 양태에서, 인간 DNA는 GPR119를 발현하는 조직 또는 세포 유형으로부터 유래된 인간 cDNA이다. 몇몇 양태에서, GPR119를 발현하는 인간 조직은 췌장 또는 췌장 섬이다. 특정 양태에서, cDNA는 GPR119를 발현하는 인간 세포 유형으로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, cDNA는 췌장 베타 세포주로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 GPCR은 재조합이다. 몇몇 양태에서, 재조합 GPCR은 재조합 인간 GPR119이다.

특정 양태에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 GPCR은 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 GPCR은 내인성이다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 GPCR은 포유류 GPR119이다. 몇몇 양태에서, 내인성인 본 발명의 GPCR은 포유류 GPR119이다.

제한되지 않고 예시하자면, N-말단 메티오닌 잔기의 결실이 본 발명에 사용될 수 있는 생물학적 활성 단편을 제공하는 것으로 고려된다. 특정 양태에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 화합물 1과 특이적으로 결합하는, 그의 N-말단에서 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그 (적혈구응집소 인플루엔자 바이러스로부터 유래됨)를 포함하는 펩티드와 임의로 융합된 단편이다. 특정 양태에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합하는, 그의 N-말단에서 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그 (적혈구응집소 인플루엔자 바이러스로부터 유래됨)를 포함하는 펩티드와 임의로 융합된 단편이다. 특정 양태에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합하는, 그의 N-말단에서 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드와 임의로 융합된 단편이다. 특정 양태에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합하는, 그의 N-말단에서 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드와 임의로 융합된 단편이다. 특정 양태에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 그의 N-말단에서 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드와 임의로 융합된 단편에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인, 그의 N-말단에서 상기 펩티드와 임의로 융합된 단편이다. 특정 양태에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 그의 N-말단에서 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드와 임의로 융합된 단편에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인, 그의 N-말단에서 상기 펩티드와 임의로 융합된 단편이다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타내는, 그의 N-말단에서 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드와 임의로 융합된 단편이다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다. 특정 양태에서, 상기 단편은 그의 N-말단에서 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그로 본질적으로 이루어진 펩티드와 융합된다. N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진 펩티드를 특정 폴리펩티드 단편의 N-말단과 융합시키기 위한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 상업적으로 수득할 수 있다 [공급처: 예를 들어, Clontech, Mountain View, CA].

서열 2의 인간 GPR119의 대립 유전자성 변이체는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 인간 GPR119는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.

서열 2의 인간 GPR119의 척추 동물 오르토로그인 변이체는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 서열 2의 인간 GPR119의 포유류 오르토로그인 변이체는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 제한없이 예시하자면, 마우스 GPR119 (예: GenBank^? 승인 번호 AY288423), 랫트 GPR119 (GenBank^? 승인 번호 AAN95195), 햄스터 GPR119, 개 GPR119, 및 비인간 영장류 GPR119는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.

특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 GPCR이다.

서열 2와의 동일률이 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 서열 2의 변이체는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 특정 양태에서, 서열 2와의 동일률이 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 서열 2의 변이체는 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 변이체는 내인성 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 변이체는 비-내인성 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 내인성 GPCR인 서열 2의 변이체는 포유류 GPCR이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 화합물 1과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 상기 수용체 하에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 수용체이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 상기 수용체 하에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 변이체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다. 동일률 (%)은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 변이체 GPCR은 서열 2와의 동일률이 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 서열 2와의 "동일률"이 95%인 변이체 GPCR이란, 이러한 변이체의 아미노산 서열이 서열 2의 아미노산 1-335와 동일한데, 단 이것이 서열 2의 각 100개 아미노산당 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 서열 2의 아미노산 서열과의 동일률이 95% 이상인 아미노산 서열을 획득하기 위해서는, 서열 내의 아미노산 잔기 중의 5% 이하 (100개 중의 5개 이하)가 서열 2의 아미노산 1-335와 비교해서 삽입, 결실 또는 치환될 수 있다. 이들 변경은 아미노 또는 카복시 말단, 또는 특정 서열이나 이러한 서열 내의 1개 이상의 연속되는 군 사이에 산재된 이들 말단 위치 사이의 어느 부위에서도 일어날 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 변이체 G 단백질-커플링된 수용체는 1개 또는 수 개 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가에 의해 서열 2로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 G 단백질-커플링된 수용체이다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 변이체 G 단백질-커플링된 수용체는 서열 2의 아미노산 서열 중의 10개 이하의 보존적 아미노산 치환 및/또는 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환에 의해 서열 2로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 G 단백질-커플링된 수용체이다. 특정 양태에서, 아르기닌, 리신 및 히스티딘은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 글루탐산 및 아스파르트산은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 글루타민 및 아스파라긴은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 루이신, 이소루이신 및 발린은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌은 서로 보존적으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환, 아미노산 결실 및 아미노산 부가는 어느 위치에서도 일어날 수 있다 (예를 들어, C- 또는 N-말단, 또는 내부 위치). 몇몇 양태에서, 변이체는 내인성 G 단백질-커플링된 수용체이다. 몇몇 양태에서, 변이체는 내인성 척추 동물 G 단백질-커플링된 수용체이다. 몇몇 양태에서, 변이체는 내인성 포유류 G 단백질-커플링된 수용체이다. 몇몇 양태에서, 변이체는 내인성 인간 G 단백질-커플링된 수용체이다. 몇몇 양태에서, 변이체는 비-내인성 G 단백질-커플링된 수용체이다. 몇몇 양태에서, 변이체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다. 특정 양태에서, 서열 2로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 G 단백질-커플링된 수용체는 화합물 1이 리간드인 G 단백질-커플링된 수용체이다. 특정 양태에서, 서열 2로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값을 갖는 리간드인 G 단백질-커플링된 수용체이다. 특정 양태에서, 서열 2로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 G 단백질-커플링된 수용체는 화합물 1이 작동제인 G 단백질-커플링된 수용체이다. 특정 양태에서, 서열 2로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 G 단백질-커플링된 수용체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 G 단백질-커플링된 수용체이다.

서열 2의 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 75개 이상 또는 100개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 G 단백질-커플링된 수용체인 서열 2의 변이체는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 특정 양태에서, 서열 2의 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 75개 이상 또는 100개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 서열 2의 변이체는 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 변이체는 내인성 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 변이체는 비-내인성 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 내인성 GPCR인 서열 2의 변이체는 포유류 GPCR이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 화합물 1과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 상기 수용체 하에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 수용체이다. 특정 양태에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 상기 수용체 하에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 변이체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 75개 이상 또는 100개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 G 단백질-커플링된 수용체는 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

몇몇 양태에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 변이체 GPCR은 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 내인성 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 비-내인성 GPCR이다. 몇몇 양태에서, 내인성 GPCR이고, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 포유류 내인성 GPCR이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 대립 유전자이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 화합물 1과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 실시예 12 (하기 참고)에 따르는 수용체 결합 검정에서 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 IC₅₀ 값으로 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민과 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 상기 수용체 하에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 수용체이다. 특정 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이, 실시예 8 (하기 참고)에 따르는 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정에서 상기 수용체 하에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는 작동제인 수용체이다. 몇몇 양태에서, 고도로 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 GPCR은 탐지 가능한 수준의 구성적 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 이러한 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다. 혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 몇몇 양태에서, 엄격한 혼성화 조건 (예: 고도로 엄격한 조건)은 50% 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 15O mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 5O mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ㎍/ml 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, 0.1xSSC에서 필터를 약 65℃ 하에 세척하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서, 엄격한 혼성화 조건 (예: 고도로 엄격한 조건)은 50% 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 15O mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 5O mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ㎍/ml 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, 0.1xSSC/0.1% SDS (나트륨 도데실 설페이트) 또는 0.2xSSC/0.1% SDS 중에서 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃ 또는 약 65℃ 하에 세척하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서, 고도로 엄격한 조건은 65℃ 하에 0.1xSSC로 세척하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서, 고도로 엄격한 조건은 50℃, 약 55℃, 약 60℃ 또는 약 65℃ 하에 0.1xSSC/0.1% SDS 또는 0.2xSSC/0.1% SDS로 세척하는 것을 포함한다.

몇몇 양태에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 GPCR은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 비-내인성 구성적 활성화 수용체인데, 서열 2의 아미노산 위치 224에서의 루이신이 루이신 이외의 아미노산으로 치환된다. 몇몇 양태에서, 루이신 이외의 아미노산은 리신이다. 몇몇 양태에서, 루이신 이외의 아미노산은 알라닌이다. 몇몇 양태에서, 루이신 이외의 아미노산은 아르기닌이다. 몇몇 양태에서, 루이신 이외의 아미노산은 히스티딘이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

특정 양태에서, 본 발명의 GPCR은 서열 2를 갖는 G 단백질-커플링된 수용체의 구성적 활성 버전을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 수용체의 구성적 활성 버전은 서열 2를 갖는 내인성 구성적 활성 버전이다. 몇몇 양태에서, 상기 수용체의 구성적 활성 버전은 서열 2의 아미노산 위치 224에 돌연변이를 나타내는 비-내인성 구성적 활성 버전이다. 몇몇 양태에서, 돌연변이된 잔기는 루이신 이외의 잔기가 되도록 돌연변이되었다. 몇몇 양태에서, 돌연변이된 잔기는 리신 잔기가 되도록 돌연변이되었다. 몇몇 양태에서, 돌연변이된 잔기는 알라닌 잔기가 되도록 돌연변이되었다. 몇몇 양태에서, 돌연변이된 잔기는 아르기닌 잔기가 되도록 돌연변이되었다. 몇몇 양태에서, 돌연변이된 잔기는 히스티딘 잔기가 되도록 돌연변이되었다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, 구성적 활성은 색소 분산을 진행하도록 멜라닌 보유 세포를 유발시키기 위한 것이다.

특정 양태에서, 본 발명의 GPCR은 G 단백질과 융합 단백질의 일부를 형성한다.

a. 서열 동일률

특정 양태에서, 동일률은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 베이직 로칼 얼라인먼트 서치 툴 [Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST")]을 사용하여 평가한다 [참고: 예를 들어, Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:2264-2268; Altschul et al., J Mol Biol (1990) 215:403-410; Altschul et al., Nature Genetics (1993) 3:266-272; and Altschul et al., Nucleic Acids Res (1997) 25:3389-3402; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. BLAST 프로그램은 디폴트 (default) 파라미터 또는 사용자가 제공한 변형된 파라미터와 함께 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 파라미터가 디폴트 파라미터이다.

특정 양태에서, 조회 서열 (예: 서열 2의 아미노산 서열)과 심문하고자 하는 서열 간의 가장 우수한 전반적인 매치를 결정하는 데에 바람직한 방법 (전체적인 서열 정렬로서 지칭되기도 함)은 문헌 [참고: Brutlag et al., Comp App Biosci (1990) 6:237-245; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬에서 조회 서열과 심문 서열은 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 전체적인 서열 정렬 결과가 동일률(%)이다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용된 바람직한 파라미터는 다음과 같다: 매트릭스=PAM 0, k-튜플=2, 미스매치 페널티=1, 연결성 페널티=20, 무작위화 군=25, 길이=0, 컷오프 (Cutoff) 스코어=1, 윈도우 크기=서열 길이, 갭 페널티=5, 갭 크기 페널티=0.05, 윈도우 크기=247 또는 보다 짧은 경우에도 심문 아미노산 서열 길이. 심문 서열이 내부 결실로 인해서가 아니라 N- 또는 C-말단 결실로 인해 조회 서열 보다 더 짧은 경우, 그 결과 (동일률)는 수동으로 교정해야만 하는데, 이는 FASTDB 프로그램이 전체적인 동일률을 계산할 때 심문 서열의 N- 및 C-말단 절단을 고려하지 않기 때문이다. 조회 서열과 비교해서 N- 및 C-말단에서 절단된 심문 서열의 경우, 동일률은 조회 서열의 총 염기 %로서, 상응하는 심문 서열 잔기와 매치/정렬되지 않는 심문 서열의 N- 및 C-말단인 조회 서열 잔기 수를 계산함으로써 교정한다. 특정 잔기가 매치/정렬되는지는 FASTDB 서열 정렬 결과에 의해 결정한다. 이어서, 이러한 비율 (%)을 명시된 파라미터를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일률로부터 공제하여 최종 동일률 스코어에 도달한다. 이러한 최종 동일률 스코어가 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 조회 서열과 매치/정렬되지 않는 심문 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기 만이 동일률 스코어를 수동으로 조정하기 위한 것으로 간주된다. 즉, 심문 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단 잔기 외부의 조회 서열 잔기 만이 간주된다.

예를 들어, 90개 아미노산 잔기 심문 서열을 100개 잔기 조회 서열과 정렬시켜 동일률을 결정한다. 심문 서열의 N-말단에서 결실이 일어나므로, FASTDB 정렬은 N-말단에서의 제1 잔기와 매치/정렬되지 않는다. 쌍을 형성하지 않은 10개 잔기는 잔기의 10% (매칭되지 않은 N- 및 C-말단에서의 잔기 수/조회 서열 내의 잔기 총 수)이므로, FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일률 스코어로부터 10%를 공제한다. 나머지 90개 잔기가 완벽하게 매칭되었다면, 최종 동일률은 90%일 것이다. 또 다른 예에서는, 90개 잔기 심문 서열을 100개 잔기 조회 서열과 비교한다. 이때 결실은 내부적이므로, 조회 서열과 매치/정렬되지 않은 심문 서열의 N- 또는 C-말단에서의 잔기는 없다. 이러한 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일률은 수동으로 교정되지 않는다. 다시 한번, 조회 서열과 매치/정렬되지 않은, FASTDB 정렬에서 표시된 바와 같은 대상 서열의 N- 및 C-말단 외부에 위치한 잔기 만이 수동으로 교정된다. 본 발명의 목적상 기타 교정은 만들어지지 않는다.

b. 융합 단백질

특정 양태에서, 관심있는 폴리펩티드는 융합 단백질이고, 이는 예를 들어, 친화성 태그 도메인 또는 리포터 도메인을 함유할 수 있다. 적합한 친화성 태그에는 또 다른 부분, 통상적으로 또 다른 폴리펩티드, 가장 통상적으로 항체와 특이적으로 결합될 수 있는 모든 아미노산 서열이 포함된다. 적합한 친화성 태그에는 당해 분야에 공지된 바와 같은, 에피토프 태그, 예를 들어 V5 태그, FLAG 태그, HA 태그 (적혈구응집소 인플루엔자 바이러스로부터 유래됨), myc 태그 등이 포함된다. 적합한 친화성 태그에는 또한, 결합성 도메인이 공지되어 있는 도메인, 예를 들어 당해 분야에 공지된 바와 같은 HIS, GST 및 MBP 태그; 및 특이적 결합 파트너, 예를 들어 항체, 특히 모노클로날 항체가 이용 가능한 기타 단백질로부터의 도메인이 포함된다. 적합한 친화성 태그에는 또한, 적합한 결합 파트너, 예를 들어 IgG Fc 수용체를 사용하여 탐지 및 특이적으로 결합할 수 있는 단백질-단백질 상호 작용 도메인, 예를 들어 IgG Fc 영역이 포함된다. 이러한 융합 단백질은 그의 N-말단 메티오닌 잔기가 대체 아미노산으로 치환되거나 결실된 GPCR과 동일 프레임 내에서 융합된 이종 N-말단 도메인 (예: 에피토프 태그)을 함유할 수 있다는 것이 명백히 고려된다.

적합한 리포터 도메인에는 폴리펩티드의 존재를 리포팅할 수 있는 모든 도메인이 포함된다. 친화성 태그를 사용하여, 예를 들어 태그와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 이용하여 폴리펩티드의 존재를 리포팅할 수 있는 것으로 인식되긴 하지만, 발광 리포터 도메인이 보다 통상적으로 사용된다. 적합한 발광 리포터 도메인에는 루시퍼라제 [예를 들어, 개똥벌레, 바르굴라 (Vargula), 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 또는 레닐라 무엘레리 (Renilla muelleri)로부터 유래된 것], 또는 그의 발광 변이체가 포함된다. 기타 적합한 리포터 도메인에는 형광성 단백질 [예를 들어, 해파리, 산호 및 기타 강장 동물, 예를 들면 애쿠오리아 (Aequoria), 레닐라 (Renilla), 프틸로사르쿠스 (Ptilosarcus), 스틸라툴라 (Stylatula) 종으로부터 유래된 것] 또는 그의 발광 변이체가 포함된다. 이들 리포터 단백질의 발광 변이체는 당해 분야에 극히 널리 공지되어 있고, 본래의 리포터 단백질과 비교해서 보다 밝거나, 보다 어둡거나 또는 상이한 여기 및/또는 방출 스펙트럼을 가질 수 있다. 예를 들어, 몇몇 변이체는 더 이상 그린을 나타내지 않도록 변경되는데, 이는 블루, 시안, 옐로우, 강화된 옐로우 레드 (각각 BFP, CFP, YFP eYFP 및 RFP로 명명됨)를 나타낼 수 있거나, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 기타 방출 스펙트럼을 지닌다. 기타 적합한 리포터 도메인에는 생화학적 또는 색상 변화를 통하여 폴리펩티드의 존재를 리포팅할 수 있는 도메인, 예를 들어 β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 및 분비된 배아 알칼리성 포스파타제가 포함된다.

또한 당해 분야에 공지된 바와 같이, 친화성 태그 또는 리포터 도메인은 관심있는 폴리펩티드 내의 어떠한 위치에서도 제시될 수 있다. 그러나, 대부분의 양태에서는 이들이 관심있는 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단 끝에 제시된다.

2. 관심있는 GPCR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산

핵산을 조작하기 위한 유전자 암호 및 재조합 기술은 공지되어 있고 관심있는 GPCR 폴리펩티드의 아미노산 서열은 상기와 같이 기재되었기 때문에, 관심있는 GPCR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 설계와 생성은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특정 양태에서는, 표준 재조합 DNA 기술 [참고: Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.] 방법을 사용한다. 예를 들어, GPCR 암호화 서열은 반드시 본원에 기재된 바 대로 할 필요가 없는 각종 재조합 방법들 중의 한 가지를 사용하거나 이를 조합하여 사용하여 GPCR 암호화 서열의 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여, 특정 단백질을 암호화하는 핵산 서열 중의 뉴클레오티드를 연속해서 치환, 결실 및/또는 부가할 수도 있다. 예를 들어, 부위 지시된 돌연변이 유발 및 아클로닝을 사용하여 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 중의 핵산 잔기를 도입/결실/치환할 수 있다. 기타 양태에서는, PCR을 사용할 수 있다. 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 전적으로 올리고뉴클레오티드로부터 화학적으로 합성함으로써 만들 수도 있다 [참고: 예를 들어, Cello et al.. Science (2002) 297:1016-8]. 몇몇 양태에서, 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 코돈은 특별한 종, 특히 포유류, 예를 들어 마우스, 랫트, 햄스터, 비인간 영장류, 또는 인간 종 세포에서의 발현을 위해 최적화시킨다. 몇몇 양태에서, 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 코돈은 특별한 종, 특히 양서류 종 세포에서의 발현을 위해 최적화시킨다.

a. 벡터

본 발명은 추가로, 대상 핵산을 포함하는 벡터 ("구조물"로서 지칭되기도 함)를 제공한다. 본 발명의 많은 양태에서, 대상 핵산 서열은 이러한 서열을 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터 포함)과 작동적으로 연결시킨 후에 숙주에서 발현될 것이다. 대상 핵산은 또한 전형적으로, 숙주 세포에서 에피솜 또는 숙주 염색체성 DNA의 통합부로서 복제될 수 있는 발현 벡터에 놓아둔다. 통상적으로, 발현 벡터는 선별성 마커, 예를 들어 테트라사이클린 또는 네오마이신을 함유하여, 목적하는 DNA 서열로 형질전환시킨 세포를 탐지할 수 있게 된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,704,362호; 이는 본원에 참고로 도입된다]. 단일 및 이중 발현 카세트 벡터를 포함한 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.]. 적합한 벡터에는 바이러스성 벡터, 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체 (인간 인공 염색체, 세균성 인공 염색체, 효모 인공 염색체 등), 미니-염색체 등이 포함된다. 레트로바이러스성, 아데노바이러스성 및 아데노 관련 바이러스성 벡터를 사용할 수 있다.

특정 세포에서 관심있는 폴리펩티드를 생성시킬 목적으로 각종 발현 벡터가 당해 분야에서 이용 가능하고, 이에는 시판되고 있는 발현 벡터가 포함된다 [공급처: 예를 들어 Invitrogen, Carlsbad, CA; Clontech, Mountain View, CA; Stratagene, La Jolla, CA]. 시판용 발현 벡터에는 CMV 프로모터에 의거한 벡터가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 한 가지 적합한 발현 벡터는 pCMV이다. 발현 벡터는 아데노바이러스성일 수 있다. 예시되는 아데노바이러스성 벡터는 AdEasyTM으로서 구입할 수 있다 [구입처: Qbiogene (Carlsbad, CA)] [참고: He TC et al, Proc Natl Acad Sci USA (1998) 95:2509-2514; 및 미국 특허 제5,922,576호; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 기타 적합한 발현 벡터는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 대상 핵산은 통상적으로, 관심있는 대상 폴리펩티드를 암호화하는 단일 개방 판독 프레임을 포함하지만, 특정 양태에서는 관심있는 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포가 진핵 세포, 예를 들어 포유류 세포 (예: 인간 세포)일 수 있기 때문에, 개방 판독 프레임이 인트론에 의해 중단될 수 있다. 대상 핵산은 전형적으로, 대상 핵산 이외에도 RNA 안정성, 해독 효율 등을 지시할 수 있는 3' 및 5' 비해독 영역 (UTR)을 함유할 수 있는 전사 단위의 일부이다. 대상 핵산은 또한, 대상 핵산 이외에도 관심있는 폴리펩티드의 전사 및 발현을 지시하는 프로모터, 및 전사 종결인자를 함유하는 발현 카세트의 일부일 수 있다.

진핵성 프로모터는 진핵 숙주 세포에서 기능적인 모든 프로모터일 수 있고, 이에는 바이러스성 프로모터 및 진핵성 유전자로부터 유래된 프로모터가 포함된다. 예시되는 진핵성 프로모터에는 다음이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 마우스 메탈로티오네인 I 유전자 서열의 프로모터 [참고: Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288, 1982]; 헤르페스 (Herpes) 바이러스의 TK 프로모터 [참고: McKnight, Cell 31:355-365, 1982]; SV40 초기 프로모터 [참고: Benoist et al., Nature (London) 290:304-310, 1981]; 효모 gall 유전자 서열 프로모터 [참고: Johnston et al., Proc. Natl, Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975, 1982]; Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-59SS, 1984], CMV 프로모터, EF-1 프로모터, 엑디손 (Ecdysone)-반응성 프로모터(들), 테트라사이클린-반응성 프로모터 등. 바이러스성 프로모터가 특히 관심이 있을 수 있는데, 이는 이러한 프로모터가 일반적으로 특히 강력한 프로모터이기 때문이다. 특정 양태에서는, 표적 병원체의 프로모터인 프로모터가 사용된다. 본 발명에 사용하기 위한 프로모터는 이들이 도입되는 세포 유형 (및/또는 동물)에게서 기능적이 되도록 선별한다. 특정 양태에서는, 상기 프로모터가 CMV 프로모터이다.

특정 양태에서, 대상 벡터는 선별성 마커의 발현을 위해 제공될 수도 있다. 적합한 벡터 및 선별성 마커는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 다음 문헌에 논의되어 있다 [참고: Ausubel, et al, (Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995) and Sambrook, et al, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (2001) Cold Spring Harbor, N.Y.)]. 각종 상이한 유전자가 선별성 마커로서 이용되었고, 선별성 마커로서 대상 벡터에 이용된 특별한 유전자는 주로 편의성 문제로서 선택된다. 공지된 선별성 마커 유전자에는 티미딘 키나제 유전자, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자, 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자, CAD, 아데노신 데아미나제 유전자, 아스파라긴 합성 효소 유전자, 항생제 내성 유전자, 예를 들어 tetr, ampr, Cmr 또는 cat, kanr 또는 neor (아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자), 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 등이 포함된다. 상기 언급된 바와 같이, 관심있는 폴리펩티드는 친화성 도메인 및/또는 리포터 도메인을 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, GPCR의 C- 또는 N-말단에서 리포터 또는 태그와 GPCR 간의 융합물을 만드는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고 [참고: 예를 들어, McLean et al, Mol. Pharma. Mol Pharmacol. 1999 56:1182-91; Ramsay et al., Br. J. Pharmacology, 2001, 315-323], 추가로 기재되지 않을 것이다. 이러한 융합 단백질은 그의 N-말단 메티오닌 잔기가 결실되거나 대체 아미노산으로 치환된 GPCR과 동일 프레임 내에서 융합된 이종 N-말단 도메인 (예: 에피토프 태그)을 함유할 수 있다는 것이 명백히 고려된다. 관심있는 폴리펩티드가 먼저, 본래의 폴리펩티드로부터 제조된 다음, 상기 언급된 바와 같은 적합한 리포터/태그에 작동적으로 연결될 수 있다는 것을 인지해야 한다.

대상 핵산은 또한, 통상적으로 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 구축을 용이하게 하기 위해, 제한 부위, 다중 클로닝 부위, 프라이머 결합 부위, 연결 가능한 말단, 재조합 부위 등을 함유할 수 있다.

b. 숙주 세포

본 발명은 추가로, 대상 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 적합한 숙주 세포에는 원핵 세포, 예를 들어 세균성 세포 [예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)] 뿐만 아니라 진핵 세포, 예를 들어 동물 세포 (예: 곤충, 포유류, 어류, 양서류, 조류 또는 파충류 세포), 식물 세포 [예: 옥수수 또는 아라비도프시스 (Arabidopsis) 세포] 또는 진균성 세포 [예: 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 세포]가 포함된다. 특정 양태에서, 핵산을 암호화하는 관심있는 폴리펩티드의 발현에 적합한 모든 세포를 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 통상적으로, 동물 숙주 세포주를 사용하는데, 그의 예는 다음과 같다: 원숭이 신장 세포 (COS 세포), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 세포 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아성 신장 세포 [HEK-293 ["293"], 참고: Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977)]; HEK-293T ["293T"] 세포; 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국산 햄스터 난소 세포 [CHO, 참고: Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)]; 시리아산 골든 햄스터 세포 MCB3901 (ATCC CRL-9595); 마우스 세르톨리 (Sertoli) 세포 [TM4, 참고: Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]; 원숭이 신장 세포 (CVI ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포 [참고: Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)]; NIH/3T3 세포 (ATCC CRL-1658); 및 마우스 L 세포 (ATCC CCL-1). 특정 양태에서는, 멜라닌 보유 세포를 사용한다. 멜라닌 보유 세포는 하등 척추 동물에게서 발견되는 피부 세포이다. 관련 물질 및 방법이 미국 특허 제5,462,856호 및 미국 특허 제6,051,386호에 따라서 수행될 것이다. 이들 특허 전문이 본원에 참고로 도입된다.

부가의 세포주가 당업자에게 명백할 것이고, 광범위한 세포주가 다음 공급처 [American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209]로부터 입수 가능하다.

C. 후보 화합물의 스크리닝

1. 일반적 GPCR 스크리닝 검정 기술

G 단백질 수용체가 활성화되면, 이는 G 단백질 (예: Gq, Gs, Gi, Gz, Go)와 결합하고 GTP가 G 단백질과 결합하는 것을 자극한다. 이때, G 단백질은 GTPase로서 작용하고 GTP를 서서히 GDP로 가수분해시킴으로써, 정상 조건 하에서 상기 수용체를 탈활성화시킨다. 그러나, 활성화 수용체는 GDP를 지속적으로 GTP로 교환시킨다. GTP의 비-가수분해 가능한 유사체 [³⁵S]GTPγS를 사용하여 활성화 수용체를 발현하는 막과의 결합 증강을 모니터링할 수 있다. [³⁵S]GTPγS를 사용하여 리간드의 부재 및 존재 하에 막과 커플링되는 G 단백질을 모니터링할 수 있는 것으로 보고된다. 당해 분야에 널리 공지되고 이용 가능한 기타 예들 중에서 이러한 모니터링의 한 예가 문헌 [참고: Traynor and Nahorski in 1995]에 보고되었다. 이러한 검정 시스템의 바람직한 사용은 후보 화합물을 초기 스크리닝하기 위한 것인데, 이는 상기 시스템이 일반적으로, 수용체의 세포내 도메인과 상호 작용하는 특별한 G 단백질과 상관없이 모든 G 단백질-커플링된 수용체에 적용 가능하기 때문이다.

2. 특이적 GPCR 스크리닝 검정 기술

상기 "일반적" G 단백질-커플링된 수용체 검정 (즉, 작동제 또는 역 작동제인 화합물을 선별하기 위한 검정)을 사용하여 후보 화합물을 일단 확인하면, 몇몇 양태에서는 해당 화합물이 수용체 부위에서 상호 작용하였는지를 확증하기 위해 추가로 스크리닝하는 것이 바람직하다. 예를 들어, "일반적" 검정에 의해 확인된 화합물은 상기 수용체와 결합하지 않을 수 있지만, 대신 세포내 도메인으로부터 G 단백질을 "분리"시킬 수 있다.

a. Gs, Gz 및 Gi

Gs는 효소 아데닐릴 사이클라제를 자극한다. 한편, Gi (및 Gz 및 Go)는 아데닐릴 사이클라제를 억제한다. 아데닐릴 사이클라제는 ATP가 cAMP로 전환되는 것을 촉매하므로, Gs 단백질과 커플링되는 활성화 GPCR은 cAMP의 증가된 세포성 수준과 연관이 있다. 한편, Gi (또는 Gz, Go) 단백질과 커플링되는 활성화 GPCR은 cAMP의 감소된 세포성 수준과 연관이 있다 [참고: 일반적으로, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Chpt. 8, From Neuron To Brain (3^rd Ed.) Nichols, J.G. et al eds. Sinauer Associates, Inc. (1992)]. 따라서, cAMP를 탐지하는 검정을 활용하여 후보 화합물이, 예를 들어 수용체에 대한 역 작동제인지를 (즉, 이러한 화합물은 cAMP의 수준을 감소시킬 것이다) 결정할 수 있다. cAMP를 측정하는 것으로 당해 분야에 공지된 각종 접근 방식을 활용할 수 있고; 몇몇 양태에서 바람직한 접근 방식은 ELISA에 의거한 포맷에서 항-cAMP 항체를 사용하는 것에 좌우된다. 활용될 수 있는 또 다른 유형의 검정은 완전 세포 제2 메신저 리포터 시스템 검정이다. 유전자 상의 프로모터는 특별한 유전자가 암호화하는 단백질의 발현을 구동시킨다. 사이클릭 AMP는 cAMP-반응성 DNA 결합성 단백질 또는 전사 인자 (CREB)의 결합을 증진시킴으로써 유전자 발현을 구동시킨 다음, cAMP 반응 요소로 불리우는 특이적 부위에서 상기 프로모터와 결합하고 유전자의 발현을 구동시킨다. 리포터 유전자, 예를 들어 β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제 전에 다중 cAMP 반응 요소를 함유하는 프로모터를 갖는 리포터 시스템을 구축할 수 있다. 따라서, 활성화 Gs-연결된 리포터는 cAMP의 축적을 유발시켜 유전자를 활성화시키고 리포터 단백질의 발현을 유발시킨다. 이어서, 표준 생화학적 검정을 이용하여 리포터 단백질, 예를 들어 β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제를 탐지할 수 있다 [참고: Chen et al. 1995].

b. Go 및 Gq

Gq 및 Go는 효소 포스포리파제 C의 활성화와 연관이 있는데, 이러한 효소는 궁극적으로 인지질 PIP₂를 가수분해시켜 다음 2가지 세포내 메신저를 방출시킨다: 디아사이클글리세롤 (DAG) 및 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 (IP₃). IP₃의 축적 증가는 Gq- 및 Go-관련 수용체의 활성화와 연관이 있다 [참고: 일반적으로, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Chpt. 8, From Neuron To Brain (3^rd Ed.) Nichols, J.G. et al eds. Sinauer Associates, Inc. (1992)]. IP₃ 축적을 탐지하는 검정을 활용하여 후보 화합물이, 예를 들어 Gq- 또는 Go-관련 수용체에 대한 역 작동제인지를 (즉, 이러한 화합물은 IP₃의 수준을 감소시킬 것이다) 결정할 수 있다. Gq-의존성 포스포리파제 C가 AP1 요소를 함유하는 유전자의 활성화를 유발시키는 AP1 리포터 검정을 사용하여 Gq-관련 수용체를 검사할 수도 있었으므로, 활성화 Gq-관련 수용체는 상기 유전자의 발현 증가의 명백한 증거이기 때문에, 이에 대한 역 작동제는 상기 발현 저하의 명백한 증거일 것이고, 작동제는 발현 증가의 명백한 증거일 것이다. 이러한 탐지를 위해 상업적으로 입수 가능한 검정이 이용 가능하다.

3. GPCR 융합 단백질

역 작동제 또는 작동제를 직접 확인하기 위해 후보 화합물을 스크리닝하는 데에 사용하기 위해, 내인성의 구성적 활성 GPCR 또는 비-내인성의 구성적 활성화 GPCR을 사용하는 것은, 본질적으로 상기 수용체가 이에 결합되는 내인성 리간드의 부재 하에서 조차도 활성이라는 점에서 흥미로운 스크리닝 챌린지를 제공해 준다. 따라서, 후보 화합물의 존재 하에서의 비-내인성 수용체와 상기 화합물의 부재 하에서의 비-내인성 수용체 간을 구별하기 위해 (이러한 구별 목적은 상기 화합물이 역 작동제 또는 작동제인지 또는 이러한 수용체에 대해 전혀 영향을 미치지 않는지에 관한 이해를 돕기위한 것이다), 몇몇 양태에서는 상기 구별을 증강시킬 수 있는 접근 방식을 활용하는 것이 바람직하다. 몇몇 양태에서는, 바람직한 접근 방식이 GPCR 융합 단백질을 사용하는 것이다.

일반적으로, 일단 상기 제시된 검정 기술 (및 당업자에게 공지된 기타 기술)을 사용하여 비-내인성 GPCR을 구성적으로 활성화시킨 것으로 확인되면, 내인성 GPCR과 커플링되는 주요 G 단백질을 결정하는 것이 가능하다. G 단백질을 GPCR과 커플링시키는 것은 평가될 수 있는 신호 전달 경로를 제공한다. 몇몇 양태에서는, 포유류 또는 멜라닌 보유 세포 발현 시스템을 사용하여 스크리닝을 수행하는 것이 바람직한데, 시스템 그 자체로는 내부에 내인성 G 단백질을 갖고 있는 것으로 예상될 것이다. 따라서, 본질적으로 이러한 시스템에서는, 비-내인성의 구성적 활성화 GPCR이 지속적으로 신호를 보낼 것이다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 상기 수용체에 대한 역 작동제의 존재 하에서는 특히 스크리닝 맥락에서 역 작동제와 접촉하는 경우에 수용체 간을 보다 잘 용이하게 구별할 수 있을 것으로 예상되게 상기 신호를 증강시키는 것이 바람직하다.

GPCR 융합 단백질은 GPCR과 커플링되는 G 단백질의 효능을 증강시켜 준다. GPCR 융합 단백질은 내인성의 구성적 활성 GPCR 또는 비-내인성의 구성적 활성화 GPCR를 이용한 스크리닝에 바람직할 수 있는데, 이는 이러한 접근 방식이 상기 스크리닝 기술에서 발생되는 신호를 증가시키기 때문이다. 이는 상당한 "신호 대 소음" 비를 촉진시키는 데에 있어서 중요하므로, 이러한 상당한 비가 본원에 기재된 바와 같은 후보 화합물을 스크리닝하는 데에 바람직하다.

GPCR 융합 단백질의 발현에 유용한 구조물의 구축은 당업자의 이해 범위 내이다. 시판용 발현 벡터 및 시스템은 조사자의 특별한 요구에 맞출 수 있는 각종 접근 방식을 제공해준다. 이러한 GPCR 융합 단백질 구조물을 구축하는 데에 있어서의 중요한 기준에는 GPCR 서열과 G 단백질 서열 둘 다가 동일 프레임 내에 있고 (바람직하게, 내인성 GPCR에 대한 서열은 G 단백질 서열의 상단이다), GPCR의 "중지" 코돈이 결실 또는 대체되어 GPCR의 발현시 G 단백질이 발현될 수도 있다는 것이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. GPCR을 G 단백질에 직접 연결할 수 있거나, 또는 둘 사이에 스페이서 잔기가 존재할 수 있다 (바람직하게, 약 12개 이하이지만, 이러한 수는 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다). 편의상, 스페이서를 사용하는 것이 바람직하다. 몇몇 양태에서는, 비-내인성 GPCR과 커플링되는 G 단백질이 GPCR 융합 단백질 구조물 창출에 앞서 확인되는 것이 바람직하다. 상기 언급된 바와 같이, Gi, Gz 및 Go와 커플링되는 활성화 GPCR는 이들 유형의 GPCR 챌린징에 기초한 cAMP 제조 검정의 형성을 억제하는 것으로 예상된다 [즉, cAMP 신호는 활성화시 감소하므로, 예를 들어 (이러한 신호를 추가로 감소시켜 줄) 작동제 챌린징을 직접적으로 확인할 수 있다]. 본원에 기재되는 바와 같이, 이들 유형의 수용체의 경우에는 실행 가능한 사이클라제 의거 검정을 확립하기 위한 일환으로, GPCR의 내인성 G 단백질에 기초하지 않은 GPCR 융합 단백질을 창출시키는 것이 가능하다. 따라서, 예를 들어 내인성 Gi 커플링된 수용체는 Gs 단백질과 융합될 수 있고, 이러한 융합 구조물은 발현시, 내인성 GPCR이, 예를 들어 "천연" Gi 단백질 보다는 오히려 Gs와 커플링되도록 "강제"하거나 "구동"시키므로, 사이클라제에 의거한 검정이 확립될 수 있다. 따라서, Gi, Gz 및 Go 커플링된 수용체의 경우, 몇몇 양태에서는 GPCR 융합 단백질을 사용하고 검정이 아데닐릴 사이클라제 활성 탐지에 기초하는 경우에는 이러한 융합 구조물이 Gs (또는 효소 아데닐릴 사이클라제의 형성을 자극하는 등가의 G 단백질)를 이용하여 확립되도록 하는 것이 바람직하다.

Gs, Gi, Gz 또는 Go 단백질과 융합된 Gq 단백질을 활용하는 G 단백질 융합 구조물은 동등하게 유효하다. 몇몇 양태에서, 바람직한 융합 구조물은 G 단백질 α-소단위체 ("Gαq")의 처음 6개 아미노산을 결실시키고 Gαq의 C-말단부에서 마지막 5개 아미노산을 관심있는 G 단백질의 Gα의 상응하는 아미노산으로 대체시킨 Gq 단백질을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 융합 구조물은 Gi 단백질과 융합된 Gq (6개 아미노산 결실)를 가질 수 있어, "Gq/Gi 융합 구조물"이 생성될 수 있다. 이러한 융합 구조물은 내인성 Gi 커플링된 수용체가 그의 비-내인성 G 단백질 Gq와 커플링되도록 하므로, cAMP 생성 대신 제2 메신저, 예를 들어 이노시톨 트리포스페이트 또는 디아실글리세롤을 측정할 수 있다.

4. 표적 Gi 커플링된 GPCR을 단일 증강인자 Gs 커플링된 GPCR로 공동 형질감염시킴 (cAMP에 의거한 검정)

Gi 커플링된 수용체는 아데닐릴 사이클라제를 억제하는 것으로 공지되어 있으므로, cAMP 생성 수준을 감소시키는데, 이로써 cAMP 수준 챌린징을 평가할 수 있게 된다. 특정 양태에서, 활성화시 주로 Gi와 커플링되는 수용체의 활성화 지표로서 cAMP 생성 저하를 측정하는 데에 유효한 기술은 신호 증강인자, 예를 들어 활성화시 주로 Gs와 커플링되는 비-내인성의 구성적 활성화 수용체 (예: TSHR-A623I; 하기 참고)를 Gi 연결된 GPCR로 공동 형질감염시킴으로써 달성할 수 있다. 명백한 바와 같이, Gs 커플링된 수용체의 활성화는 cAMP 생성 증가에 기초하여 결정할 수 있다. Gi 커플링된 수용체를 활성화시키면 cAMP 생성이 저하된다. 따라서, 이러한 공동 형질감염 접근 방식은 이들 "반대" 효과를 유리하게 활용한다. 예를 들어, 비-내인성의 구성적 활성화 Gs 커플링된 수용체 ("신호 증강인자")를 발현 벡터 단독으로 공동 형질감염시키면, 기준선 cAMP 신호가 제공된다 (즉, Gi 커플링된 수용체가 cAMP 수준을 저하시킬 것이지만, 이러한 "저하"는 구성적 활성화 Gs 커플링된 신호 증강인자에 의해 확립된 cAMP 수준 상의 실재적 증가에 대해 상대적일 것이다). 이어서, 상기 신호 증강인자를 "표적 수용체"로 공동 형질감염시킴으로써, Gi 커플링된 표적 수용체의 역 작동제는 측정된 cAMP 신호를 증가시킬 것이지만, Gi 커플링된 표적 수용체의 작동제는 이러한 신호를 감소시킬 것이다.

이러한 접근 방식을 사용하여 직접 확인되는 후보 화합물은 독립적으로 평가하여, 이들 화합물이 신호 증강성 수용체를 표적으로 하지 않도록 해야 한다 (이는 공동-형질감염된 수용체에 대항하여 스크리닝하기에 앞서 또는 후에 수행할 수 있다).

조성물/제형 및 치료 방법

당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 GPR119 작동제를 본 발명에 따라서 사용하기 위한 제약 조성물 및 약제로 제형화할 수 있다. 적당한 제형화는 선택된 투여 경로에 의존적이다. 특정 양태에서, 상기 투여는 비인간 척추 동물 또는 비인간 포유류에게 한다.

본 발명의 치료법, 즉 GPR119 작동제와 관계된 치료법과 관련해서, 본 발명에 따르는 화합물은 적합한 어떠한 방식으로든 투여할 수 있다. 적합한 투여 경로에는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 경구, 비내, 직장, 경점막, 경피 또는 장내 투여, 비경구 전달 (근육내, 피하, 수질내 주사 뿐만 아니라 수막강내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내, 비내, 폐내 (흡입) 또는 안내 주사 포함)하는 것이 포함된다. 기타 적합한 투여 경로는 에어로솔 및 데포 제형이다. 본 발명의 약제의 지속 방출 제형, 특히 데포가 명백히 고려된다. 특정의 바람직한 양태에서는, 본 발명에 따르는 화합물을 경구 투여한다. 본 발명에 따르는 화합물은 고형 또는 액상 형태, 예를 들어 정제, 캅셀제, 산제, 시럽, 엘릭서제 등, 에어로솔, 멸균성 용제, 현탁제 또는 에멀션 등으로 만들 수 있다. 특정 양태에서는, GPR119 작동제를 경구 투여한다.

경구 투여용 제형은 고형 정제 및 캅셀제 제형 이외에도, 수성 용제 및 현탁제 형태일 수 있다. 수성 용제 및 현탁제는 멸균성 산제 또는 과립으로부터 제조할 수 있다. 화합물을 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 옥수수 유, 면실유, 땅콩유, 참깨유, 벤질 알코올, 염화나트륨, 및/또는 각종 완충액에 용해시킬 수 있다. 기타 아주반트가 당해 분야에 광범위하고도 널리 공지되어 있다.

GPR119 작동제의 제약 조성물은 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 연화, 유화, 피막화, 포착화, 동결건조 공정 또는 분무 건조를 통하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따라서 사용하기 위한 제약 조성물은 활성 화합물을 제약상 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진시켜 주는 보조제 및 부형제를 포함하는 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제약상 허용 가능한 담체는 당해 분야에서 입수 가능하다 [참고: 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Gennaro et al., eds.), 20^th Edition, 2000, Lippincott Williams & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (Rowe et al., eds), 4^th Edition, 2003, Pharmaceutical Press; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 적당한 제형은 선택된 투여 경로에 의존적이다. 본원에서의 용어 "담체" 물질 또는 "부형제" 물질은 그 자체가 치료제는 아니고, 치료제를 대상체에게 전달하기 위한 비히클, 또는 담체 및/또는 희석제 및/또는 아주반트로서 사용되거나, 또는 그의 조작이나 저장 특성을 개선시키거나 또는 조성물의 용량 단위를 경구 투여용으로 적합한 별개의 제품 (예: 캅셀제 또는 정제)으로 제형화하는 것을 허용하거나 촉진시키기 위해 제약 조성물에 부가되는 모든 물질을 의미한다. 부형제에는 희석제, 붕해제, 결합제, 접착제, 습윤제, 중합체, 윤활제, 활탁제, 불유쾌한 미각 또는 냄새를 은폐 또는 중화시키기 위해 부가된 물질, 향미제, 염료, 방향제, 및 조성물의 외관을 개선시키기 위해 부가된 물질이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 허용 가능한 부형제에는 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 탄산마그네슘, 탈크, 젤라틴, 아카시아 검, 나트륨 알지네이트, 펙틴, 덱스트린, 만니톨, 솔비톨, 락토스, 슈크로스, 전분, 젤라틴, 셀룰로스성 물질, 예를 들어 알카노산의 셀룰로스 에스테르 및 셀룰로스 알킬 에스테르, 저 융점 왁스 코코어 버터 또는 분말, 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올 및 폴리에틸렌 글리콜, 및 기타 제약상 허용 가능한 물질이 포함된다. 제약 조성물의 성분은 편리한 투여를 위해 피막화하거나 정제화할 수 있다.

제약상 허용 가능한이란 약리학적/독성학적 관점에서 환자에게 허용 가능하고, 조성물, 제형, 안정성, 환자 허용도 및 생체내 이용 효율에 관한 물리적/화학적 관점에서 제약 화학자에게 허용 가능한 물질 및/또는 특성을 지칭한다.

당의정 코어에 적합한 피복재를 제공한다. 이를 위하여, 농축된 당 용액을 사용할 수 있는데, 이는 임의로, 아라비 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 락커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 색소를 정제 또는 당의정 피복재에 가하여 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 확인하거나 성상 확인할 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 제약 조성물에는 젤라틴을 만든 푸쉬-피트 (push-fit) 캅셀제 뿐만 아니라 젤라틴과 가소제 (예: 글리세롤 또는 솔비톨)로 만든 연질의 밀폐된 캅셀제가 포함된다. 푸쉬-피트 캅셀제는 활성 성분을 충진제, 예를 들어 락토스, 결합제 (예: 전분) 및/또는 윤활제 (예: 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트), 및 임의로 안정화제와 혼합하여 함유할 수 있다. 연질 캅셀제에서는, 활성 화합물을 적합한 액상물, 예를 들어 지방 오일, 액상 파라핀, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 크레모포어, 캅물 (capmul), 매질 또는 장쇄 모노-, 디- 또는 트리-글리세라이드에 용해 또는 현탁시킬 수 있다. 이들 제형에 안정화제를 가할 수도 있다.

부가적으로, GPR119 작동제는 지속 방출 시스템을 사용하여 전달할 수 있다. 각종 지속 방출 물질이 확립되었고, 당업자에게 널리 공지되어 있다. 지속 방출 정제 또는 캅셀제가 특히 바람직하다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 이용할 수 있다. 투여 형태는 미국 특허 제4,256,108호, 제4,166,452호 및 제4,265,874호에 기재된 기술에 의해 피복시켜 제어 방출을 위한 삼투압 치료적 정제를 형성시킬 수도 있다.

본 발명의 치료법, 즉 GPR119 작동제와 관계된 치료법은 단독으로 투여 또는 제공할 수 있거나, 또는 기타 한 가지 이상의 제약상 또는 생리학적으로 허용 가능한 화합물과 병용해서 투여 또는 제공할 수 있다는 것이 명백히 고려된다. 본 발명의 한 국면에서, 기타 제약상 또는 생리학적으로 허용 가능한 화합물은 GPR119 작동제가 아니다. 본 발명의 한 국면에서, 기타 제약상 또는 생리학적으로 허용 가능한 화합물은 칼슘, 비타민 D, 에스트로겐, 티볼론, 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM; 예를 들어, 랄록시펜, 타목시펜), 비포스포네이트 (예를 들어, 에티드로네이트, 알렌드로네이트, 리세드로네이트), 칼시토닌, 비타민 D의 1α-히드록시화 대사물, 플루오라이드, 티아지드, 동화작용성 스테로이드, 이프리플라본, 비타민 K, 부갑상선 호르몬 (PTH), 스트론튬, 스타틴, 오스테오프로테레린, EP4 수용체 선택적 작동제, 카나비노이드 수용체 유형 2 (CB2) 선택적 작동제, 및 p38 MAP 키나제 억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 의약품이다 [참고: 예를 들어, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis].

한 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 특정 양의 GPR119 작동제를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 조성물을 특징으로 한다. 한 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 특정 양의 GPR119 작동제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 담체를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 제약 조성물을 특징으로 한다.

한 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 특정 양의 GPR119 작동제를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 조성물을 특징으로 한다. 한 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 특정 양의 GPR119 작동제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 담체를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 제약 조성물을 특징으로 한다. 본 발명은 또한, GPR119 작동제가 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하고/하거나 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 있어서 효과를 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 조성물 또는 제약 조성물의 투여 형태에 관한 것이다.

한 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 특정 양의 GPR119 작동제를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 조성물을 특징으로 한다. 한 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 특정 양의 GPR119 작동제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 담체를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 제약 조성물을 특징으로 한다. 본 발명은 또한, GPR119 작동제가 특정 개체에게서 GIP 수준을 증가시키는 데에 있어서 효과를 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 조성물 또는 제약 조성물의 투여 형태에 관한 것이다.

본 발명에 사용하기 적합한 제약 조성물에는 활성 성분이 그들의 의도한 목적을 달성시켜 주는 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하거나 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용하다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환은 본 발명에 따른다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 특정 개체에게서 GIP 수준을 증가시키는 데에 유용하다. 본 발명과 관련해서, 본 발명에 따르는 의도한 목적을 달성시키기에 충분한 GPR119 작동제의 양 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 설명 측면에서 당업자의 능력 내이다.

동물 연구 (마우스, 랫트, 토끼, 돼지 및 비인간 영장류를 이용한 연구가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다)로부터 획득한 데이터를, 인간에게서 사용하기 위한 특정 범위의 투여량을 제형화하는 데에 사용할 수 있다. 일반적으로, 당업자는 동물 모델 시스템에서 획득한 생체내 데이터를 또 다른 종, 예를 들어 인간에게 어떻게 외삽하여 추정하는지를 이해하고 있다. 몇몇 상황 하에서는, 이들 외삽 추정이 또 다른 것 (예: 인간)과 비교해서 단지 동물 모델의 체중에만 근거할 수 있고; 기타 상황 하에서는, 이들 외삽 추정이 간단히 체중에만 근거하는 것이 아니라, 각종 인자를 삽입하여 이루어진다. 대표적인 인자에는 환자의 유형, 연령, 체중, 성별, 식이 및 의학적 질환, 질병의 중증도, 투여 경로, 이용된 특별한 화합물의 약리학적 고려 사항, 예를 들어 활성, 효능, 약동학적 및 독성학 프로파일, 약물 전달 시스템이 활용되는 지의 여부, 급성 또는 만성 질병 상태가 치료되는지 아니면 예방되는지의 여부, 또는 본 발명의 화합물 이외에 약물 병용의 일부로서 추가의 활성 화합물이 투여되는지의 여부가 포함된다. 본 발명의 화합물 및/또는 조성물을 사용하여 특정 질병 상태를 치료하기 위한 투여 섭생은 상기 인용된 바와 같은 각종 인자에 따라서 선택된다. 따라서, 이용된 실제적 투여 섭생은 광범위하게 다양할 수 있으므로, 바람직한 투여 섭생으로부터 벗어날 수 있고, 당업자는 이들 전형적인 범위를 벗어난 투여량 및 투여 섭생을 시험할 수 있고, 경우에 따라 본 발명의 방법에 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

예시되는 동물 모델 시스템은 랫트 난소절제술 (OVX) 골 손실 모델이다. 이러한 난소절제된 랫트는 에스트로겐 고갈된 인간 골격의 중요한 임상적 특징과 치료제의 반응을 정확하게 모방하는 탁월한 임상전 동물 모델이다. 이러한 모델에서, 치료 효능은 난소절제술과 연관된 골 손실이 부분적으로 또는 완전히 예방되는 경우에 달성된다 [참고: 예를 들어, Bollag et al, Mol Cell Endocrinol (2001) 177:35-41; and Jee et al, J Musculoskel Neuron Interact (2001) 1:193-207]. 특정 양태에서, 치료 효능은 난소절제술과 연관된 골 손실이 약 10% 이상 예방되거나, 약 20% 이상 예방되거나, 약 30% 이상 예방되거나, 약 40% 이상 예방되거나, 약 50% 이상 예방되거나, 약 60% 이상 예방되거나, 약 70% 이상 예방되거나, 약 75% 이상 예방되거나, 약 80% 이상 예방되거나, 약 85% 이상 예방되거나, 약 90% 이상 예방되거나, 약 95% 이상 예방되거나 또는 100% 예방되는 경우에 달성된다.

부가의 예시되는 동물 모델 시스템은 마우스에서 글루코스 챌린지 후 혈액 GIP 수준 증가이다. 특정 양태에서, 혈액 GIP 수준은 혈장 GIP 수준이다. 특정 양태에서, GIP 수준은 글루코스-비의존성 GIP 수준이다. 특정 양태에서, GIP 수준은 글루코스-의존성 GIP 수준이다. 특정 양태에서, GIP는 총 GIP이다. 특정 양태에서, 총 GIP는 중심적으로 또는 C-말단적으로 지시된 검정을 사용하여 측정한다. 특정 양태에서, GIP는 생활성 GIP이다. 특정 양태에서, 생활성 GIP는 N-말단 특이적 검정을 사용하여 측정한다. 특정 양태에서, 생활성 GIP는 골 형성을 증진시키기 위한 활성을 지닌다. 특정 양태에서, 치료 효능은 혈액 GIP 수준이 약 10% 이상, 약 25% 이상, 약 50% 이상, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상, 약 300% 이상, 약 400% 이상, 또는 약 500% 이상 증가시키는 경우에 달성된다.

투여량과 투여 간격을 조정하여 의도한 치료 효과를 제공할 수 있다. 본 발명에 따르는 GPR119 작동제의 정확한 투여량은 GPR119 작동제, 그의 효력, 투여 방식, 환자의 연령 및 체중, 및 치료하고자 하는 질환의 중증도에 따라서 다양하다는 것을 인지해야 할 것이다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 담당 의사가 선택할 수 있다. 제한되지 않고 예시하자면, 본 발명에 따르는 GPR119 작동제의 양은 약 0.001 mg/체중 kg 미만, 약 0.005 mg/체중 kg 미만, 약 0.01 mg/체중 kg 미만, 약 0.05 mg/체중 kg 미만, 약 0.1 mg/체중 kg 미만, 약 0.5 mg/체중 kg 미만, 약 1 mg/체중 kg 미만, 약 5 mg/체중 kg 미만, 약 10 mg/체중 kg 미만, 약 50 mg/체중 kg 미만, 또는 약 100 mg/체중 kg 미만이다. 특정 양태에서, 본 발명에 따르는 GPR119 작동제의 양은 약 0.001-100 mg/체중 kg 미만, 약 0.001-50 mg/체중 kg 미만, 약 0.001-10 mg/체중 kg 미만, 약 0.001-5 mg/체중 kg 미만, 약 0.001-1 mg/체중 kg 미만, 약 0.001-0.5 mg/체중 kg 미만, 약 0.001-0.1 mg/체중 kg 미만, 약 0.001-0.05 mg/체중 kg 미만, 약 0.001-0.01 mg/체중 kg 미만, 또는 약 0.001-0.005 mg/체중 kg 미만이다.

목적하는 결과를 달성하기 위해 매일 또는 규칙적으로 투여될 수 있는 본 발명의 조정제 (예: GPR119 작동제)의 양에 대한 바람직한 투여 범위는 0.1-100 mg/체중 kg이다. 기타 바람직한 투여량 범위는 0.1-30 mg/체중 kg이다. 기타 바람직한 투여량 범위는 0.1-10 mg/체중 kg이다. 기타 바람직한 투여량 범위는 0.1-3.0 mg/체중 kg이다. 물론, 이들 1일 투여량은 1일 동안 주기적으로 소량으로 전달 또는 투여될 수 있다. 이들 투여량 범위는 단지 바람직한 범위이고, 이로써 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 인지해야 한다.

투여량과 투여 간격을 개별적으로 조정하여 의도한 치료 효과를 달성시켜 주는 본 발명에 따르는 GPR119 작동제의 혈장 수준을 제공할 수 있다. 투여 간격은 또한, 의도한 치료 효과를 달성하도록 선택된 GPR119 작동제 농도 범위에 대한 값을 사용하여 결정할 수 있다. GPR119 작동제는 혈장 수준을 시간의 10 내지 90% 동안, 바람직하게 시간의 30 내지 99% 동안, 가장 바람직하게 시간의 50 내지 90% 동안 선택된 GPR119 작동제 농도 범위 내에서 유지시켜 주는 섭생을 이용하여 투여해야 한다. 국소 투여 또는 선택적 섭취의 경우에는, 의도한 치료 효과를 제공해 주는 GPR119 작동제 농도 범위는 혈장 농도와 관계가 없을 수 있다.

투여된 조성물의 양은 물론, 치료받고 있는 개체, 이러한 개체의 체중, 질환 중증도, 투여 방식, 및 처방의의 판단에 좌우될 것이다.

한 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 특정 양의 GPR119 작동제를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 조성물의 치료적 유효량을, 이를 필요로 하는 특정 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하거나 골 질량을 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 특정 양태에서는, 상기 조성물이 제약 조성물이다.

한 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 특정 양의 GPR119 작동제를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 조성물의 치료적 유효량을, 이를 필요로 하는 특정 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하거나 골 질량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 관련 국면에서, 본 발명은 GPR119 작동제를 특정 개체에게서 GIP 수준을 증가시키는 데에 있어서 효과를 제공하기에 충분한 양으로 투여하는 상기 방법을 특징으로 한다. 특정 양태에서는, 상기 조성물이 제약 조성물이다.

본 발명의 치료법, 즉 GPR119 작동제와 관계된 치료법은 특정 개체에게서 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하고, 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유용하다.

낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환에는 골감소증, 골다공증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 치주 질환, 치조골 손실, 골절개술 골 손실, 유아 특발성 골 손실, 파제트병, 전이성 암으로 인한 골 손실, 골용해성 병변, 척추 만곡 및 키 손실이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환은 골다공증이다. 특정 양태에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환은 골다공증이다. 특정 양태에서, 골다공증은 일차 골다공증이다. 특정 양태에서, 골다공증은 이차 골다공증이다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환에는 또한, 골다공증의 장기간 합병증, 예를 들어 척추 만곡, 키 손실 및 보철 수술이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환이 개별적으로 또는 조합하여 해당 양태에 포함될 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 특정 양태에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환은 일차 골다공증이다.

특정 양태에서, 골 질량 증가를 필요로 하는 개체는 골 미네랄 밀도 (BMD)가 젊은 성인 기준 평균 아래의 1 초과 (T-스코어 < -1), 1.5 이상 (T-스코어 ≤ -1.5), 2 이상 (T-스코어 ≤ -2), 또는 2.5 이상 (T-스코어 ≤ -2.5) 표준 편차이다. 특정 양태에서, 골 질량 증가를 필요로 하는 개체는 골절 치료를 필요로 한다. 특정 양태에서, 골절 치료를 필요로 하는 개체는 외상성 골절, 장기간 골절 또는 골다공증성 골절이 있다. 특정 양태에서, 개체는 골 질환 치료를 필요로 한다. 특정 양태에서, 골 질환 치료를 필요로 하는 개체는 골감소증, 골다공증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 치주 질환, 치조골 손실, 골절개술 골 손실, 유아 특발성 골 손실, 파제트병, 전이성 암으로 인한 골 손실, 골용해성 병변, 척추 만곡 또는 키 손실을 나타낸다. 특정 양태에서, 골 질환 치료를 필요로 하는 개체는 골다공증을 나타낸다. 특정 양태에서, 골다공증은 일차 골다공증이다. 특정 양태에서, 골다공증은 이차 골다공증이다. 본 발명에 따라서 치료될 수 있는 파괴성 골 장애에는 골다공증, 골관절염, 및 골용해성 병변, 예를 들어 종양성 질환, 방사선 요법 또는 화학요법에 의해 유발된 병변이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 골다공증은 일차 골다공증이다. 특정 양태에서, 골다공증은 이차 골다공증이다.

본 발명의 치료법, 즉 GPR119 작동제와 관계된 치료법은 특정 개체에게서 안면 재건술, 상악 재건술, 하악 재건술, 치주 질환 또는 발치 후 골 치유을 증강시키거나, 장골 확장을 증강시키거나, 보철 내증식을 증강시키거나 또는 골 유합증을 증가시키는 데에 부가적으로 유용하다.

특정 양태에서, 개체는 척추 동물이다. 특정 양태에서, 척추 동물인 개체는 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유류이다. 특정 양태에서, 개체 또는 척추 동물은 포유류이다. 특정 양태에서, 포유류인 개체 또는 척추 동물은 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 돼지, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 염소, 비인간 포유류, 비인간 영장류 또는 인간이다. 특정 양태에서, 개체는 인간이다. 특정 양태에서, 인간은 폐경 후 여성 또는 65세 이상 남성이다.

추가의 상세한 설명이 없이도, 당업자는 전술된 설명을 이용하여 본 발명을 완전히 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 전술된 상세한 설명은 단지 이해를 돕기 위해 제공된 것이고 이로써 제한되지 말아야 하는데, 이는 본 발명의 범위 내에서의 변형이 당업자에게 명백할 수 있기 때문이다.

본 출원은 표시된 날짜에 미국 특허상표청에 유.에스. 엑스프레스 메일로 출원된 다음 가 특허원으로부터의 우선권의 이득을 청구하고 있다: 미국 가특허원 제60/791,550호 (2006년 4월 11일자로 출원됨). 전술된 가 특허원의 전문이 본원에 참고로 도입된다.

본원 전반에 걸쳐 각종 공개공보, 특허 및 특허원이 인용된다. 본원에 참고된 이들 공개공보, 특허 및 특허원의 기술 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 본원에 특정의 공개공보, 특허 또는 특허원의 출원인을 인용하는 것은 이러한 공개공보, 특허 또는 특허원의 출원인에 의해 선행 기술로서 승인되지 않는다.

추가의 상세한 설명이 없이도, 당업자는 전술된 설명을 이용하여 본 발명을 완전히 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 전술된 상세한 설명은 단지 이해를 돕기 위해 제공된 것이고 이로써 제한되지 말아야 한다. 당업자는 해당 과정으로부터의 적당한 변동을 즉시 인식할 것이다.

실시예 1: 야생형 마우스에서 혈액 GIP 수준에 대한 GPR119 작동제 투여 효과의 약력학적 분석

A. C57blk/6 숫컷 마우스를 18시간 동안 단식시키고, 무작위로 14개 군에 할당하였다 (각 군에 대해 6마리). 도 1A 에 표시된 바와 같이, 마우스에게 비히클 (PET; 80% PEG400, 10% 에탄올, 10% 트윈 80)을 경구 투여하거나 또는 본 발명에 따르는 GPR119 작동제 [화합물 1; (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소 프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민]를 20 mg/kg으로 경구 투여하였다. 처치한지 30분 후, 글루코스 거환 3 g/kg을 경구 전달하고, 글루코스 거환 후 0분 (글루코스 거환 투여하지 않음), 2, 5, 10, 20, 40 및 60분 째에 혈장을 수집하였다. 설치류 GIP ELISA 키트 (구입처: Linco Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catalog # EZRMGIP-55K])를 공급업자의 지시에 따라서 사용함으로써, 혈장 GIP 수준을 결정하였다. 도 1A 에 제시된 결과로부터, GPR119 작동제를 투여하면 마우스의 혈액 중에 글루코스-의존성 GIP 수준과 글루코스-비의존성 GIP 수준 둘 다가 명백히 증가하였다. 화합물 1은 마우스에서 혈장 총 GIP를 자극하였다. 화합물 1은 국제 특허출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다.

B. C57blk/6 숫컷 마우스를 18시간 동안 단식시키고, 무작위로 14개 군에 할당하였다 (각 군에 대해 6마리). 도 1B 에 표시된 바와 같이, 마우스에게 비히클 (20% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 (HPCD))을 경구 투여하거나 또는 본 발명에 따르는 GPR119 작동제 (화합물 3)를 10 mg/kg으로 경구 투여하였다. 처치한지 30분 후, 글루코스 거환 3 g/kg을 경구 전달하고, 글루코스 거환 후 0분 (글루코스 거환 투여하지 않음), 5, 10, 20, 60 및 120분 째에 혈장을 수집하였다. 설치류 GIP ELISA 키트 (구입처: Linco Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catalog # EZRMGIP-55K])를 공급업자의 지시에 따라서 사용함으로써, 혈장 GIP 수준을 결정하였다. 엑셀 프로그램을 이용하 여 통계학적 분석을 수행하였다. 각 군에서 6마리 마우스를 이용한 결과에 기초하여 평균 GIP 농도치를 계산하고 평균 ± SEM으로 제시하였다. 도 1B 에 제시된 결과로부터, GPR119 작동제를 투여하면 마우스의 혈액 중에 글루코스-의존성 GIP 수준과 글루코스-비의존성 GIP 수준 둘 다가 명백히 증가하였다. 화합물 3은 마우스에서 혈장 총 GIP를 자극하였다. 화합물 3은 국제 특허출원 PCT/US2004/022327 (WO 2005/007647로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다.

C. C57blk/6 숫컷 마우스를 18시간 동안 단식시키고, 무작위로 14개 군에 할당하였다 (각 군에 대해 6마리). 마우스에게 비히클 (20% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 (HPCD))을 경구 투여하거나 또는 본 발명에 따르는 GPR119 작동제 (화합물 3)를 1, 3 또는 10 mg/kg으로 경구 투여하였다. 처치한지 30분 후, 글루코스 거환 3 g/kg을 경구 전달하고, 글루코스 거환 후 0분 (글루코스 거환 투여하지 않음) 또는 5분 째에 혈장을 수집하였다. 설치류 GIP ELISA 키트 (구입처: Linco Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catalog # EZRMGIP-55K])를 공급업자의 지시에 따라서 사용함으로써, 혈장 GIP 수준을 결정하였다. 엑셀 프로그램을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 각 군에서 6마리 마우스를 이용한 결과에 기초하여 평균 GIP 농도치를 계산하고 도 1C 에 제시하였다. 도 1C 로부터, GPR119 작동제 (화합물 3)가 마우스에서 혈장 총 GIP를 용량 의존적 방식으로 명백히 자극하였다. 화합물 3은 국제 특허출원 PCT/US2004/022327 (WO 2005/007647로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다.

실시예 2: 야생형 마우스와 비교해서 GPR119-결핍성 (녹아웃) 마우스에서 혈 액 GIP 수준에 대한 GPR119 작동제 투여 효과

A. GPR119-결핍성 숫컷 마우스와 야생형 한배 새끼를 18시간 동안 단식시켰다. 표시된 바와 같이 (n=5), 마우스에게 비히클 (PET; 80% PEG400, 10% 에탄올, 10% 트윈 80)을 경구 투여하거나 또는 본 발명에 따르는 GPR119 작동제 [화합물 1; (2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[l,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민]를 20 mg/kg으로 경구 투여하였다. 처치한지 30분 후, 안구의 눈뒤 정맥을 통하여 혈액 (100 마이크로리터)을 수집한 다음 (시간 0), 글루코스 거환 3 g/kg을 경구 투여하였다. 글루코스를 전달한지 5분 후에, 또 다른 혈액 샘플 (100 마이크로리터)을 수집하였다 (시간 5분). 혈장을 원심분리 후에 수집하고, 설치류 GIP ELISA 키트 (구입처: Linco Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catalog # EZRMGIP-55K])를 공급업자의 지시에 따라서 사용함으로써 GIP 수준을 결정하였다. 도 2A 에 제시된 결과로부터, 투여된 GPR119 작동제가 마우스의 혈액 중에 글루코스-비의존성 GIP 수준과 글루코스-의존성 GIP 수준을 증가시키기 위해서는 기능성 GPR119 수용체가 필요하였다는 것이 명백하다. 화합물 1은 야생형 마우스에서 혈장 총 GIP를 자극하였다. 화합물 1은 국제 특허출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다.

B. GPR119-결핍성 숫컷 마우스와 야생형 한배 새끼를 18시간 동안 단식시켰다. 표시된 바와 같이 (n=5), 마우스에게 비히클 (40% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 (HPCD))을 경구 투여하거나 또는 본 발명에 따르는 GPR119 작동제 (화합 물 2)를 30 mg/kg으로 경구 투여하였다. 처치한지 30분 후, 안구의 눈뒤 정맥을 통하여 혈액 (100 마이크로리터)을 수집한 다음 (시간 0), 글루코스 거환 3 g/kg을 경구 투여하였다. 글루코스를 전달한지 5분 후에, 또 다른 혈액 샘플 (100 마이크로리터)을 수집하였다 (시간 5분). 혈장을 원심분리 후에 수집하고, 설치류 GIP ELISA 키트 (구입처: Linco Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catalog # EZRMGIP-55K])를 공급업자의 지시에 따라서 사용함으로써 GIP 수준을 결정하였다. 각 군에서 5마리 마우스를 이용한 결과에 기초하여 평균 GIP 농도치를 계산하였다. 도 2B 에 제시된 결과로부터, 투여된 GPR119 작동제가 마우스의 혈액 중에 글루코스-비의존성 GIP 수준과 글루코스-의존성 GIP 수준을 증가시키기 위해서는 기능성 GPR119 수용체가 필요하였다는 것이 명백하다. 화합물 2는 야생형 마우스에서 혈장 총 GIP를 자극하였다. 화합물 2는 국제 특허출원 PCT/US2004/022417 (WO 2005/007658로서 공개됨)에 기재된 화합물과 동일하다.

실시예 3: 난소절제된 랫트에서 골 질량에 대한 GPR119 작동제 투여 효과

본 발명에 따르는 GPR119 작동제는 다음 문헌에 기재된 생체내 난소절제된 (OVX) 랫트 모델을 이용하여, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하고/하거나 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 유효한 것으로 밝혀졌다 [참고: 예를 들어, Bollag et al, Mol Cell Endocrinol (2001) 177:35-41].

8주생의 20마리 버진 암컷 OVX 및 20마리 버진 비-OVX 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 랫트 (150-175 g)를 다음 구입처 [Harlan Sprague-Dawley, Inc. (Indianapolis, IN)]로부터 구입하였다. 동물에게 정상 상업적 펠렛 식이 [테그랩 (Teklab) 설치류 식이 (1.46% 칼슘)]를 임의로 공급하고, 물은 자유로이 마시게 하였다. 랫트를 4개의 체중-부합된 실험 군으로 무작위로 나누고, 비히클을 경구투여하거나 본 발명에 따르는 GPR119 작동제를 경구 투여하도록 선별하였다. 처치는 6주 동안 매일 지속되었다.

1. 대조군. 10마리 비-OVX 랫트에게 비히클을 경구 투여하였다.

2. 대조군 + 처치. 10마리 비-OVX 랫트에게 GPR119 작동제를 경구 투여하였다.

3. OVX. 10마리 OVX 랫트에게 비히클을 경구 투여하였다.

4. OVX + 처치. 10마리 OVX 랫트에게 GPR119 작동제를 경구 투여하였다.

랫트의 체중을 매일 재고 길이를 기준선에 측정한 다음, 6주째에 다시 측정하였다. 처치 개시에 앞서 및 6주째에, 홀로직 (Hologic) QDR 1000/W (공급처: Waltham, MA)를 사용하여 이중 에너지 X선 흡수측정법 (DXA)을 모든 동물에 대해 수행하고, 소프트웨어 랫트 전신 버전 5.53을 사용하여 데이터를 분석하였다. 골 미네랄 밀도 (BMD)를 척추에서 결정하였다.

처치한지 6주 후 척추 골 밀도 상의 변화율 (%)을 결정하였다. GPR119 작동제를 투여하면, 척추 골 밀도에 대한 난소절제술의 부정적인 효과가 감쇠된 것으로 밝혀졌다. 척추 골 밀도에 대한 난소절제술의 부정적인 효과 감쇠는 상기 처치가 낮은 골 질량을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하고/하 거나 특정 개체에게서 골 질량을 증가시키는 데에 효능이 있다는 지표이다.

실시예 4: 골절 치유에 대한 GPR119 작동제의 투여 효과

본 발명에 따르는 GPR119 작동제는 다음에 기재된 생체내 검정을 이용하여 골절을 치료하는 데에 유효한 것으로 밝혀졌다.

골절 기술

3개월생 스프라그-돌리 랫트를 케타민으로 마취시켰다. 우측 경골 또는 대퇴골 근접부의 앞안쪽면 상에 1 cm 절개하였다. 다음은 경골 외과적 기술을 서술한다. 절개는 뼈를 통하여 수행하였고, 전방 모서리에 대해 2 mm 중앙에 있는 경골 조면 (tibial tuberosity)의 원위 면에 대해 4 mm 근접부에 1 mm 구명을 뚫었다. 0.8 mm 스텐레스 스틸 튜브를 이용하여 수질내 네일링을 수행하였다 (최대 하중 36.3 N, 최대 경도 61.8 N/mm, 뼈와 동일한 조건 하에 시험함). 수질 도관에 구멍을 뚫는 일은 수행하지 않았다. 무딘 입에 특이적으로 설계된 조정 가능한 겸자를 사용하여 3-점 벤딩함으로써 정강종아리 접합부 위 2 mm에 표준화 밀폐식 골절을 생성시켰다. 연질 조직 손상을 최소화하기 위해, 상기 골절이 전위되지 않도록 주의해야 한다. 피부는 모노필라멘트 나일론 봉합사로 밀폐시켰다. 수술은 멸균성 조건 하에 수행하였다. 네일링 직후에 모든 골절에 방사선 투과사진을 찍었고, 명시된 골간 부위를 벗어난 골절이나 전위된 네일을 지닌 랫트는 배제시켰다. 나머지 동물은 다음 군으로 무작위로 나누었는데, 골절 치유를 시험하기 위해서는 매시점마다 각 아군당 10 내지 12마리 동물이 있다. 랫트에게 비히클 또는 GPR119 작동제를 매일 경구 투여하였다. GPR119 작동제는 0.001 mg/체중 kg 내지 100 mg/ 체중 kg의 양으로 사용하였다. 처치는 10, 20, 40 및 80일 동안 지속되었다.

10, 20, 40 및 80일째에, 각 군으로부터 10 내지 12마리 랫트를 케타민으로 마취시키고, 방혈시킴으로써 희생시켰다. 양 정강종아리 뼈를 해부하여 꺼내고 모든 연질 조직을 스트립핑하였다. 각 군에 대해 5 내지 6마리 랫트로부터의 뼈를 조직학적 검사를 위해 70% 에탄올에 저장하고, 각 군에 대해 또 다른 5 내지 6마리 랫트로부터의 뼈는, 수행되는 생물역학적 시험과 방사선 투과사진을 위해 완충 링거 용액 (+4℃, pH 7.4)에 저장하였다.

조직학적 분석

골절된 뼈를 조직학적 분석하는 방법은 기존에 다음 문헌에 공개되었다 [참고: Mosekilde and Bak (Bone (1993) 14:19-27)]. 간단하게 언급하면, 골절 부위를 골절 라인의 각 측면에 대해 8 mm에 금을 내고, 메틸메타크릴레이트에서 칼슘이 제거되지 않은 상태로 포매시킨 다음, 전두골 박편을 라이헤르트-정 폴리커트 마이크로톰 (Reichert-Jung Polycut microtome) 상에서 8 ㎛ 두께로 절단하였다. 마송 (Masson)-삼색 염색된 중앙-전두엽 박편 (경골 및 비골 포함)은 처치하였거나 처치하지 않은 골절 치유에 대한 세포성 및 조직 반응을 가시화하기 위해 사용하였다. 시리우스 (Sirius) 레드 염색된 박편을 사용하여 유합 조직의 특징을 입증하고 골절 부위에서 층판골과 무층골 간을 구별하기 위해 사용하였다. 다음 측정을 수행하였다: (1) 골절 갭 - 골절 내의 피질 골 말단 간의 가장 짧은 거리로서 측정됨, (2) 유합 조직 길이 및 유합 조직 직경, (3) 유합 조직의 총 골 용적 부위, (4) 유합 조직 부위 내부 조직 면적당 골질 조직, (5) 유합 조직 내의 섬유성 조직, 및 (6) 유합 조직 내의 연골 부위.

생물역학적 분석

생물역학적 분석 방법은 기존에 다음 문헌에 공개되었다 [참고: Bak and Andreassen (Calcif Tissue Int (1989) 45:292-297)]. 간단하에 언급하면, 모든 골절의 방사선 투과사진을 생물역학적 시험 이전에 찍었다. 치유중인 골절의 역학적 특성은 파괴적 3-점 또는 4-점 벤딩 과정에 의해 분석하였다. 최대 하중, 경도, 최대 하중 하에서의 에너지, 최대 하중 하에서의 편향, 및 최대 응력을 결정하였다.

실시예 5

내인성 인간 GPR119의 완전한 길이 클로닝

내인성 인간 GPR119를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 GPR119 특이적 프라이머

5'-GTCCTGCCACTTCGAGACATGG-3' (서열 3; 센스, 개시 코돈으로서 ATG)

5'-GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC-3' (서열 4; 안티센스, 정지 코돈의 3')

를 사용하고 주형으로서 인간 게놈 DNA를 사용함으로써 클로닝하였다. TaqPlus Precision™ DNA 폴리머라제 (공급처: Stratagene)는 다음 주기 단계 2 내지 단계 4를 35회 반복함으로써 증폭시키기 위해 사용하였다: 94℃, 3분; 94℃, 1분; 58℃, 1분; 72℃, 2분; 72℃, 10분. 예정된 크기의 1.0 Kb PCR 단편을 분리하고 pCRII-TOPO™ 벡터 (공급처: Invitrogen) 내로 클로닝하며, T7 DNA 서열 키트 (공급처: Amersham)를 사용하여 완전하게 서열 분석하였다 [핵산 서열에 대해서는 서열 1을 참고하고; 추론된 아미노산 서열에 대해서는 서열 2를 참고할 수 있다].

실시예 6

수용체 발현

G 단백질-커플링된 수용체를 발현시키기 위한 각종 세포가 당해 분야에서 입수 가능하지만, 진핵 세포를 활용하는 것이 가장 바람직하다. 특정 양태에서는, 포유류 세포 또는 멜라닌 보유 세포를 활용하였다. 다음은 예시적이고; 당업자는 전문 기능공의 요구에 우선적으로 유익한 기술을 결정할 수 있는 능력을 지닌 것으로 여겨진다 [참고: 멜라닌 보유 세포에 관한 하기 실시예 9].

a. 일시적 형질감염

1일째, 10 cm 디쉬당 293 세포 6x10⁶개를 도말하였다. 2일째, 2개의 반응용 튜브를 제조하였다 (각 튜브에 대한 추적 비율은 판에 따라 결정된다): 튜브 A는 4 ㎍ DNA [예를 들어, pCMV 벡터; 수용체 cDNA를 수반한 pCMV vector 등]를 0.5 ml 혈청 무함유 DMEM (공급처: Gibco BRL)에서 혼합함으로써 제조하였고; 튜브 B는 24 ㎕ 리포펙타민 (공급처: Gibco BRL)을 0.5 ml 혈청 무함유 DMEM에서 혼합함으로써 제조하였다. 튜브 A와 B를 역위시켜 혼합하고 (수 차례), 실온 하에 30 내지 45분 동안 항온 배양하였다. 이 혼합물을 "형질감염용 혼합물"로서 지칭하였다. 도말시킨 293 세포를 1X PBS로 세척한 다음, 5 ml 혈청 무함유 DMEM를 가하였다. 1 ml의 상기 형질감염용 혼합물을 세포에 가한 다음, 37℃/5% CO₂ 하에 4시간 동안 항온 배양하였다. 형질감염용 혼합물을 흡인시켜 제거한 다음, 10 ml의 DMEM/10% 태아 소 혈청을 가하였다. 세포를 37℃/5% CO₂ 하에 항온 배양하였다. 48시간 동안 항온 배양한 후, 세포를 수거하고 분석용으로 활용하였다.

b. 안정한 세포주

대략 12x10⁶개 293 세포를 15 cm 조직 배양 판 상에 도말하였다. 10% 태아 소 혈청 및 1% 나트륨 피루베이트, L-글루타민 및 항생제를 함유하는 DME 고 글루코스 배지에서 성장시켰다. 293 세포를 도말한지 24시간 후 (또는 대략 80% 밀집도에 도달할 때까지), 세포를 12 ㎍의 DNA (예: 수용체 cDNA를 수반한 pCMV-neo^r 벡터)를 사용하여 형질감염시켰다. 이러한 12 ㎍의 DNA를 60 ㎕의 리포펙타민 및 2 ml의 DME 고 글루코스 혈청 무함유 배지와 합하였다. 배지를 판으로부터 흡인시키고, 세포를 혈청 무함유 배지로 1회 세척하였다. 상기 DNA, 리포펙타민, 및 배지 혼합물을 10 ml의 혈청 무함유 배지와 함께 판에 가하였다. 37℃ 하에 4 내지 5시간 동안 항온 배양한 후, 배지를 흡인시키고 25 ml의 혈청 함유 배지를 가하였다. 형질감염시킨지 24시간 후에, 상기 배지를 다시 흡인시키고, 혈청을 함유하는 신선한 배지를 가하였다. 형질감염시킨지 48시간 후에, 배지를 흡인시키고 제네티신 (G418 약물)을 최종 농도로 함유하는 혈청 함유 배지를 가하였다. 대략 12x10⁶개 293 세포를 15 cm 조직 배양 판 상에 도말하였다. 10% 태아 소 혈청 및 1% 나트륨 피루베이트, L-글루타민 및 항생제를 함유하는 DME 고 글루코스 배지에서 성장시켰다. 293 세포를 도말한지 24시간 후 (또는 대략 80% 밀집도에 도달할 때까지), 세 포를 12 ㎍의 DNA (예: 수용체 cDNA를 수반한 pCMV 벡터)를 사용하여 형질감염시켰다. 이러한 12 ㎍의 DNA를 60 ㎕의 리포펙타민 및 2 ml의 DME 고 글루코스 혈청 무함유 배지와 합하였다. 배지를 판으로부터 흡인시키고, 세포를 혈청 무함유 배지로 1회 세척하였다. 상기 DNA, 리포펙타민, 및 배지 혼합물을 10 ml의 혈청 무함유 배지와 함께 판에 가하였다. 37℃ 하에 4 내지 5시간 동안 항온 배양한 후, 배지를 흡인시키고 25 ml의 혈청 함유 배지를 가하였다. 형질감염시킨지 24시간 후에, 상기 배지를 다시 흡인시키고, 혈청을 함유하는 신선한 배지를 가하였다. 형질감염시킨지 48시간 후에, 배지를 흡인시키고 제네티신 (G418 약물)을 최종 농도 500 ㎍/ml로 함유하는 혈청 함유 배지를 가하였다. 형질감염된 세포는 지금, G418 내성 유전자를 함유하는 양성적으로 형질감염된 세포에 대한 선별을 진행하고 있다. 선별이 일어남에 따라 배지를 4 내지 5일 마다 대체시켰다. 선별 동안, 세포를 안정한 풀이 창출되도록 성장시키거나 안정한 클로날 선별을 위해 분할하였다.

실시예 7

후보 화합물을, 예를 들어 GPR119 작동제로서 스크리닝하기 위한 검정

후보 화합물을, 예를 들어 GPR119 작동제로서 스크리닝하기 위한 각종 접근 방식이 이용 가능하다. 다음은 예시적이고; 당업자는 전문 기능공의 요구에 우선적으로 유익한 기술을 결정할 수 있는 능력을 지닌 것으로 여겨진다. 화합물을 G 단백질-커플링된 수용체의 작동제로서 스크리닝하기 위한 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, 국제 공개공보 WO 02/42461].

1. 막 결합 검정: [ ³⁵ S]GTPγS 검정

G 단백질-커플링된 수용체가 리간드 결합이나 구성적 활성화의 결과로서 그의 활성 형태로 존재하는 경우, 상기 수용체는 G 단백질과 커플링되고, GDP의 방출을 자극하여, 연속해서 GTP를 G 단백질에 결합시킨다. G 단백질-수용체 복합체의 알파 소단위체는 GTPase로서 작용하고, GTP가 GDP로 되도록 서서히 가수분해시키는데, 이때 상기 수용체는 통상 탈활성화된다. 활성화된 수용체는 GDP를 지속적으로 GTP로 교환시켜 준다. 비-가수분해 가능한 GTP 유사체인 [³⁵S]GTPγS를 활용하여 활성화 수용체를 발현하는 막에 대한 [³⁵S]GTPγS의 결합성 증강을 입증할 수 있다. 활성화를 측정하기 위해 [³⁵S]GTPγS 결합성을 이용하는 경우의 이점은 (a) 모든 G 단백질-커플링된 수용체에 총칭적으로 적용 가능하다는 것과, (b) 막 표면에 근접하여 세포내 케스케이드에 영향을 미치는 분자를 골라내는 경향이 덜하는 것이다.

본 검정은 관련 수용체를 발현하는 막에 대한 [³⁵S]GTPγS 결합을 자극할 수 있는 G 단백질-커플링된 수용체의 능력을 활용하였다. 본 검정은 일반적이고, 모든 G 단백질-커플링된 수용체 하에서의 약물 발견에 적용된다.

막 제조

몇몇 양태에서는, 본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체를 포함하고, 후보 화합물을, 예를 들어 상기 수용체의 작동제로서 확인하는 데에 사용하기 위한 막을 바람직하게 다음과 같이 제조하였다:

a. 재료

"막 스크래프 완충액"은 2O mM HEPES 및 1O mM EDTA, pH 7.4로 구성되고; "막 세척용 완충액"은 20 mM HEPES 및 0.1 mM EDTA, pH 7.4로 구성되며; "결합용 완충액"은 2O mM HEPES, 100 mM NaCl 및 10 mM MgCl₂, pH 7.4로 구성되었다.

b. 과정

모든 재료는 과정 내내 얼음 상에 유지시켰다. 먼저, 배지를 세포의 융합성 단층으로부터 흡인시킨 다음, 10 ml 찬 PBS로 세척시킨 후, 흡인시켰다. 그 후, 5 ml의 막 스크래프 완충액을 가하여 세포를 스크랩핑한 다음, 세포성 추출물을 50 ml 원심분리용 튜브에 옮겼다 (4℃ 하에 17분 동안 20,000 rpm으로 원심분리시킴). 그 후, 상등액을 흡인시키고 펠릿을 30 ml 막 세척용 완충액에 재현탁시킨 다음, 4℃ 하에 17분 동안 20,000 rpm으로 원심분리시켰다. 이어서, 상등액을 흡인시키고, 펠릿을 결합용 완충액에 재현탁시켰다. 이어서, 브린크만 폴리트론 (Brinkman Polytron™) 균질화기를 사용하여 이를 균질화시켰다 (모든 재료가 현탁될 때까지 15 내지 20초 집단 방출시켰다). 이를 본원에서 "막 단백질"로서 지칭하였다.

브래드포드 (Bradford) 단백질 검정

균질화시킨 후, 나중에 사용하기 위해 브래드포드 단백질 검정을 이용하여 막의 단백질 농도를 결정하였다 [단백질을 약 1.5 mg/ml로 희석시키고, 등분한 다음 동결 (-80℃)시킬 수 있다]. 동결시킨 경우, 사용하기 위한 프로토콜은 다음과 같다: 검정 당일, 동결된 막 단백질을 실온 하에 해동시킨 다음, 폴리트론을 이용 하여 약 5 내지 10초 동안 약 12 x 1,000 rpm으로 와동 및 균질화시켰는데; 다수를 제조하는 경우에는, 상이한 제제의 균질화 과정 사이에 균질화기를 철저히 소독해야 한다.

a. 재료

결합용 완충액 (상기에 따름); 브래드포드 염료 시약; 브래드포드 단백질 표준은 제조업자의 지시에 따라서 활용하였다 (Biorad, cat. no. 500-0006).

b. 과정

2벌로 된 튜브를 제조하는데, 1개는 막을 포함하고, 다른 1개는 대조군으로서 "블랭크"를 포함하였다. 각각은 800 ㎕ 결합 완충액을 함유하였다. 그 후, 10 ㎕의 브래드포드 단백질 표준 (1 mg/ml)을 각 튜브에 가한 다음, 10 ㎕의 막 단백질을 단지 1개 튜브에만 가하였다 (블랭크에는 가하지 않았다). 그 후, 200 ㎕의 브래드포드 염료 시약을 각 튜브에 가한 다음, 각각을 와동시켰다. 5분 후, 상기 튜브를 재와동시키고, 내부에 있는 재료를 큐베트로 옮겼다. 이어서, CECIL 3041 분광광도레를 파장 595에서 사용하여 상기 큐베트를 판독하였다.

확인 검정

a. 재료

GDP 완충액은 37.5 ml 결합용 완충액과 2 mg GDP (공급처: Sigma, cat. no. G-7127)로 이루어졌고, 0.2 μM GDP를 수득하기 위해 결합용 완충액 중에 일련의 희석물로 이루어졌는데(각 웰 중의 GDP의 최종 농도는 0.1 μM GDP이다); 각 웰은 후보 화합물을 포함하고, 200 ㎕의 최종 용적은 lOO ㎕ GDP 완충액 (최종 농도, 0.1 μM GDP), 결합용 완충액 중의 50 ㎕ 막 단백질, 및 결합용 완충액 중의 50 ㎕ [³⁵S]GTPγS (0.6 nM) [결합용 완충액 10 ml당 2.5 ㎕ [³⁵S]GTPγS]으로 이루어졌다.

b. 과정

후보 화합물은 바람직하게, 96-웰 판 포맷을 사용하여 스크리닝하였다 (이들은 -80℃ 하에 동결시킬 수 있다). 막 단백질 (또는 대조군으로서, 표적 GPCR을 제외한 발현 벡터를 수반한 막)을 현탁될 때까지 간단하게 균질화시켰다. 이어서, 상기 제시된 브래드포드 단백질 검정을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 그 다음, 막 단백질 (및 대조군)을 결합용 완충액 중에서 0.25 mg/ml이 되도록 희석시켰다 (최종 검정 농도, 12.5 ㎍/웰). 그 후, 100 ㎕의 GDP 완충액을 월락 신티스트립 [Wallac Scintistrip™ (Wallac)]의 각 웰에 가하였다. 이어서, 5 ㎕ 핀-툴 (pin-tool)을 사용하여 5 ㎕의 후보 화합물을 상기 웰에 옮겼다 (즉, 200 ㎕의 총 검정 용적 중의 5 ㎕는 1:40 비이므로, 후보 화합물의 최종 스크리닝 농도는 10 μM이다). 다시, 오염을 피하기 위해 각 전이 단계 후, 물 (1X), 에탄올 (1X) 및 물 (2X)을 포함하는 3가지 저장고로 상기 핀 툴을 세정시켜야 하는데 - 과도한 액체는 각 세정 후 상기 툴로부터 진탕시켜야 하고, 종이와 킴와이프스를 이용하여 건조시켜야 한다. 그 후, 50 ㎕의 막 단백질을 각 웰에 가하고 (표적 GPCR을 갖지 않는 막을 포함하는 대조군 웰을 또한 활용하였다), 실온에서 5 내지 10분 동안 예비-항온 배양하였다. 그 후, 결합용 완충액 중의 50 ㎕의 [³⁵S]GTPγS (0.6 nM)를 각 웰에 가한 다음, 실온 하에 60분 동안 진탕기 상에서 항온 배양하였다 (다시 언급하 면, 본 실시예에서는 판을 호일로 덮었다). 이어서, 판을 22℃ 하에 15분 동안 4000 RPM으로 스피닝함으로써 검정을 중지시켰다. 이어서, 8 채널 매니폴드를 이용하여 판을 흡인시키고 판 덮개로 밀봉시켰다. 이어서, 세팅 "Prot. #37"를 사용하여 월락 1450 상에서 판을 판독하였다 (제조업자의 지시에 따름).

2. 아데닐릴 사이클라제 검정

세포에 의거한 검정에 사용하도록 설계된 플래쉬 판™ 아데닐릴 사이클라제 키트 (공급처: New England Nuclear; Cat. No. SMP004A)를 조 혈장 막에 사용하도록 변형시킬 수 있다. 이러한 플래쉬 판 웰은 cAMP를 인식하는 특이적 항체를 함유하기도 하는 신틸리언트 피막을 함유할 수 있다. 이러한 웰에서 생성된 cAMP는 cAMP 항체에 대한 방사성 cAMP 추적자의 결합을 놓고 직접 경쟁함으로써 정량화할 수 있다. 다음은 상기 수용체를 발현하는 세포 중에서 cAMP 수준 상의 변화를 측정하기 위한 간단한 프로토콜로서 제공된다.

특정 양태에서는, 변형된 플래쉬 판™ 아데닐릴 사이클라제 키트 (공급처: New England Nuclear; Cat. No. SMP004A)가 다음 프로토콜에 따라서 후보 화합물을, 예를 들어 GPR119 작동제로서 확인하기 위해 활용되었다.

본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체로 형질감염시킨 세포를 형질감염시킨지 대략 3일 후에 수거하였다. 현탁된 세포를 2O mM HEPES, pH 7.4 및 1O mM MgCl₂을 함유하는 완충액 중에서 균질화시킴으로써 막을 제조하였다. 브린크만 폴리트론™을 대략 10초 동안 사용하여 얼음 상에서 균질화를 수행하였다. 이로써 생성된 균 질화물을 4℃ 하에 15분 동안 49,000 X g으로 원심분리시켰다. 이어서, 이로써 생성되는 펠릿을 2O mM HEPES, pH 7.4 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 완충액에 재현탁시키고, 10초 동안 균질화시킨 다음, 4℃ 하에 15분 동안 49,000 X g으로 원심분리시켰다. 이어서, 이로써 생성되는 펠릿을 활용될 때까지 -80℃ 하에 저장하였다. 직접 확인 스크리닝하는 당일에는, 막 펠릿을 실온 하에 서서히 해동시키고, 2O mM HEPES, pH 7.4 및 1O mM MgCl₂를 함유하는 완충액에 재현탁시켜 최종 단백질 농도 0.60 mg/ml을 수득하였다 (상기와 같이 재현탁된 막은 사용할 때까지 얼음 상에 놓아두었다).

cAMP 표준 및 탐지용 완충액 [2 μCi의 추적자 ([¹²⁵I]cAMP (100 ㎕) 내지 11 ml 탐지용 완충액)을 포함함]을 제조업자의 지시에 따라서 제조하고 유지시켰다. 스크리닝하기 위한 검정용 완충액을 신선하게 제조하였는데, 이는 2O mM HEPES, pH 7.4, 1O mM MgCl₂, 2O mM 포스포크레아틴 (공급처: Sigma), 0.1 단위/ml 크레아틴 포스포키나제 (공급처: Sigma), 50 μM GTP (공급처: Sigma), 및 0.2 mM ATP (공급처: Sigma)를 함유하였으며; 이어서, 검정용 완충액을 활용할 때까지 얼음 상에 저장하였다.

후보 화합물을 40 ㎕ 막 단백질 (30 ㎍/웰) 및 50 ㎕의 검정용 완충액과 함께, 바람직하게는 예를 들어, 96-웰 판 웰 (3 ㎕/웰; 12 μM 최종 검정 농도)에 가하였다. 이어서, 이 혼합물을 온화하게 진탕시키면서 실온 하에 30분 동안 항온 배양하였다.

항온 배양 후, 100 ㎕의 탐지용 완충액을 각 웰에 가한 다음, 2 내지 24시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, "Prot. #31"을 사용하여 월락 마이크로베타™ 판 판독기에서 판을 계수하였다 (제조업자의 지시에 따름).

3. CRE-Luc 리포터 검정

293 및 293T 세포를 웰당 2 x 10⁴개 세포 밀도로 96 웰 판에 도말하고, 제조업자의 지시에 따라서 그 다음날 리포펙타민 시약 (BRL)을 이용하여 형질감염시켰다. DNA/지질 혼합물을 다음과 같이 각 6-웰 형질감염을 위해 제조하였다: 100 ㎕의 DMEM 중의 260 ng의 플라스미드 DNA를 100 ㎕의 DMEM 중의 2 ㎕의 지질과 온화하게 혼합하였다 [260 ng의 플라스미드 DNA는 200 ng의 8xCRE-Luc 리포터 플라스미드, 본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체를 포함하는 50 ng의 pCMV 또는 pCMV 단독, 및 lO ng의 GPRS 발현 플라스미드 (pcDNA3 (공급처: Invitrogen) 중의 GPRS)로 이루어진다]. 8XCRE-Luc 리포터 플라스미드는 다음과 같이 제조하였다: 벡터 SRIF-β-gal은 랫트 소마토스타틴 프로모터 (-71/+51)를 pβgal-베이직 벡터 (공급처: Clontech) 내의 BglV-HindIII 부위에서 클로닝함으로써 수득하였다. 아데노바이러스 주형 AdpCF126CCRE8로부터 PCR함으로써 cAMP 반응 요소의 8개 카피를 수득하였고 [참고: Suzuki et al., Hum Gene Ther (1996) 7:1883-1893; 이의 전문이 본원에 참고로 도입된다], Kpn-BglV 부위에서 SRIF-β-gal 벡터 내로 클로닝하였는데, 이로써 8xCRE-β-gal 리포터 벡터가 생성되었다. 8xCRE-Luc 리포터 플라스미드는 8xCRE-β-gal 리포터 벡터 중의 베타-갈락토시다제 유전자를 HindIII-BamHI 부위에서 pGL3-베이직 벡터 (공급처: Promega)로부터 수득한 루시퍼라제 유전자로 대체시킴으로써 생성시켰다. 실온 하에 30분 동안 항온 배양한 후, 400 ㎕의 DMEM을 이용하여 DNA/지질 혼합물을 희석시키고, 100 ㎕의 상기 희석된 혼합물을 각 웰에 가하였다. 세포 배양 항온 배양기에서 4시간 동안 항온 배양한 후, 10% FCS를 수반한 100 ㎕의 DMEM을 각 웰에 가하였다. 그 다음 날, 형질감염시킨 세포를 10% FCS를 수반한 200 ㎕/웰의 DMEM을 이용하여 변화시켰다. 8시간 후, 상기 웰을 페놀 레드를 수반하지 않은 100 ㎕/웰의 DMEM으로 변화시킨 후, PBS로 1회 세척하였다. 그 다음날 제조업자의 지시에 따라서 LucLite™ 리포터 유전자 검정 키트 (공급처: Packard)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정한 다음, 1450 마이크로베타™ 신틸레이션 및 발광 계수기 (공급처: Wallac) 상에서 판독하였다.

실시예 8: 예를 들어, GPR119 작동제 활성에 대한 완전 세포 아데닐릴 사이클라제 검정

공급업자의 프로토콜에 따라서 플래쉬 판™ 아데닐릴 사이클라제 키트 (공급처; New England Nuclear)를 사용하여 사이클릭 AMP 측정을 수행하였다. HEK293 세포를 15-cm 조직 배양 디쉬에서 정규 성장 배지 (DMEM/10% FBS) 중의 디쉬당 12x10⁶개 세포 밀도로 도말하였다. 그 다음날, 10 ㎍의 빈 (empty) 벡터 DNA 또는 발현 플라스미드 DNA를 제조업자의 프로토콜에 따라서 리포펙타민 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 세포 내로 형질감염시켰다. 배양한지 24시간 후, 형질감염된 세포를 GIBCO 세포 해리 완충액 (Cat #13151-014)에 수거하고, 1,100 rpm으로 5분 동안 원심분리시킴으로써 펠릿화하고, 적당한 용적의 검정용 완충액 (50% 1xPBS 및 50% 자극용 완충액) 내로 조심스럽게 재현탁시켜 2x10⁶개 세포/ml의 최종 세포 계수치를 수득하였다. 표시되는 경우 목적하는 검정 농도 하의 50 ㎕ 검정용 완충액에서 시험 화합물을 제조하고, 96 웰 플래쉬 판의 웰 내로 피펫팅하였다. 이어서, 상기와 같이 제조된 세포 현탁액을 가하였다 (웰당 50 ㎕). 실온 하에 60분 동안 항온 배양한 후, 추적자 [¹²⁵I]-cAMP를 함유하는 100 ㎕의 탐지용 혼합물을 상기 웰에 가하였다. 판을 2시간 더 항온 배양한 후, 월락 마이크로베타 신틸레이션 계수기에서 계수하였다. cAMP/웰 값을 각 검정 판 상에 포함되는 표준 cAMP 곡선으로부터 외삽하였다.

빈 벡터로 형질감염시킨 HEK293 세포에서와 비교해서 GPR119-형질감염시킨 HEK293 세포에서의 cAMP 수준 증가는 시험 화합물이 GPR119 수용체 기능성을 자극하는 화합물이란 지표이다.

실시예 9: 예를 들어, GPR119 작동제 활성에 대한 멜라닌 보유 세포 검정

멜라닌 보유 세포를 문헌 [참고: Potenza et al., Pigment Cell Research (1992) 5:372-378]에 보고된 바와 같이 배양 하에 유지시키고, 전기천공을 이용하여 GPR119 수용체 (GPR119; 예를 들어, 인간 GPR119, GenBank^? 승인 번호 AAP72125 및 그의 대립 유전자)를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 전기천공 후, 형질감염된 세포를 검정을 위해 96 웰 판 내로 도말하였다. 이어서, 세포를 48시간 동안 성장시켜 전기천공 과정으로부터 회수하고 최대 수용체 발현 수준을 획득 하였다.

검정 당일, 세포 상의 성장 배지를 1O nM 멜라토닌을 함유하는 혈청-무함유 완충액으로 대체시켰다. 멜라토닌은 멜라닌 보유 세포 중의 내인성 Gi-커플링된 GPCR을 통하여 작용하여 세포내 cAMP 수준을 저하시켰다. 저하된 cAMP 수준에 반응하여, 멜라닌 보유 세포는 그들의 색소를 세포 중앙으로 전위시켰다. 이의 총체적 효과는 600 내지 65O nM 하에 측정된, 웰 중의 세포 단층의 흡광도 판독치 상의 상당한 감소이다.

멜라토닌에서 1시간 동안 항온 배양한 후, 세포는 완전히 색소-응집되었다. 이때, 기준선 흡광도 판독치를 수집하였다. 일련의 시험 화합물 희석물을 판에 가하고, GPR119 작동제 활성을 지닌 화합물은 세포내 cAMP 수준을 증가시켰다. 이러한 증가된 cAMP 수준에 반응하여 멜라닌 보유 세포는 그들의 색소를 세포 말단부로 다시 전위시켰다. 1시간 후, 자극된 세포는 완전히 색소-분산되었다. 이러한 분산된 상태의 세포 단층은 600 내지 650 nm 범위에서 훨씬 더 많은 빛을 흡수하였다. 기준선 판독치와 비교해서 측정된 흡광도 상의 증가로 인해, 수용체 자극 정도를 정량화할 수 있고 용량-반응 곡선을 플롯팅할 수 있다.

멜라닌 보유 세포 검정에 관한 재료 및 방법은 미국 특허 제5,462,856호 및 제6,051,386호 (이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되었다.

빈 벡터로 형질감염시킨 멜라닌 보유 세포에서와 비교해서 GPR119-형질감염시킨 멜라닌 보유 세포에서의 색소 분산 상의 증가는 시험 화합물이 GPR119 수용체 기능성을 자극하는 화합물이란 지표이다.

특정 화합물을 GPR119 작동제로서 확인하기 위한 기타 검정은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다 [참고: 예를 들어, 상기 실시예 7].

실시예 10: 예를 들어, GPR119 작동제 활성에 대한 효모 리포터 검정

효모 세포에 의거한 리포터 검정은 기존에 다음 문헌에 보고되었다 [참고: 예를 들어, Miret et al, J Biol Chem (2002) 277:6881-6887; Campbell et al, Bioorg Med Chem Lett (1999) 9:2413-2418; King et al, Science (1990) 250:121-123; WO 99/14344; WO 00/12704; and US 6,100,042]. 간단하게 언급하면, 내인성 효모 G-알파 (GPA1)를 결실시키고, 이를 다중 기술을 사용하여 구축된 G-단백질 키메라로 대체시키도록 효모 세포를 공학 처리하였다. 부가적으로, 내인성 효모 알파-세포 GPCR, Ste3을 결실시켜 선택되는 포유류 GPCR의 상동성 발현을 허용하였다. 효모에서는, 진핵 세포에서 보존되는 페로몬 신호 전달 변환 경로 (예를 들어, 분열 촉진물질-활성화 단백질 키나제 경로) 요소가 Fusl의 발현을 구동시킨다. β-갈락토시다제 (LacZ)를 Fusl 프로모터 (Fuslp)의 제어 하에 놓아둠으로써, 특정 시스템을 개발하였고, 이로 인해 수용체가 활성화되어 효소적 정보판독이 유발되었다.

효모 세포를 문헌 [참고: Agatep et al, 1998, Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol. Technical Tips Online, Trends Journals, Elsevier]에 기재된 리튬 아세테이트 방법을 적응시킴으로써 형질전환시켰다. 간단하게 언급하면, 효모 세포를 효모 트립톤 판 (YT) 상에서 밤새 성장시켰다. 운반체 단일-가닥 DNA (lO ㎍), 2개 Fuslp-LacZ 리포터 플라스미드 각각 2 ㎍ (하나는 URA 선별 마커를 수반하고, 다른 하나는 TRP를 수반한다), 효모 발현 벡터 (2 ㎍ 복제 기점) 중의 2 ㎍의 GPR119 (예: 인간 수용체) 및 리튬 아세테이트/폴리에틸렌 글리콜/TE 완충액을 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브 내로 피펫팅하였다. 수용체를 함유하는 효모 발현 플라스미드/수용체를 함유하지 않는 대조군은 LEU 마커를 갖는다. 효모 세포를 상기 혼합물에 접종하고, 반응을 30℃ 하에 60분 동안 진행시켰다. 이어서, 효모 세포를 42℃ 하에 15분 동안 열-쇽시켰다. 이어서, 세포를 세척하고 선별용 판 상에 확산시켰다. 이러한 선별용 판은 LEU, URA 및 TRP가 배제된 합성적으로 규정된 효모 배지이다 (SD-LUT). 30℃ 하에 2 내지 3일 동안 항온 배양한 후, 선별용 판 상에서 성장하는 집락을 LacZ 검정에서 시험하였다.

β-갈락토시다제에 대한 형광측정 효소 검정을 수행하기 위하여, 대상 GPR119 수용체를 수반하는 효모 세포를 액상 SD-LUT 배지에서 밤새 불포화 농도가 되도록 성장시켰다 (즉, 세포는 여전히 분할 중이고, 아직까지 정지 상에 도달하지 않았다). 이들을 신선한 배지에서 최적의 검정 농도로 희석시키고, 90 ㎕의 효모 세포를 96-웰 블랙 폴리스티렌 판 (공급처: Costar)에 가하였다. DMSO에 용해되고 10% DMSO 용액 중에서 1OX 농도가 되도록 희석시킨 시험 화합물을 판에 가하고, 이 판을 30℃ 하에 4시간 동안 놓아두었다. 4시간 후, β-갈락토시다제에 대한 기질을 각 웰에 가하였다. 이들 실험에서는, 플루오레세인을 방출시키는 효소에 대한 기질인 플루오레세인 디(β-D-갈락토피라노시드) (FDG)를 사용하여, 형광측정성 정 보 판독을 허용하였다. 웰당 20 ㎕의 500 μM FDG/2.5% 트리톤 XlOO을 가하였다 (세포가 투과 가능하도록 하기 위해서는 세정제가 필요하다). 세포를 상기 기질과 함께 60분 동안 항온 배양한 후, 웰당 20 ㎕의 1 M 탄산나트륨을 가하여 반응을 종결시키고 형광 신호를 증강시켰다. 이어서, 판을 485/535 nm 하에 형광측정기에서 판독하였다.

빈 벡터로 형질전환시킨 효모 세포에서와 비교해서 GPR119-형질전환시킨 효모 세포에서의 형광 신호 상의 증가는 시험 화합물이 GPR119 수용체 기능성을 자극하는 화합물이란 지표이다 (예를 들어, 화합물은 GPR119의 작동제 또는 부분 작동제이다). 특정 양태에서, 본 발명의 화합물은 배경 신호 (비히클 단독의 존재 하에 수득된 신호) 이상으로 형광 신호 증가를 가져다 준다.

실시예 11: 방사성 표지된 화합물

특정 양태에서는, 본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물을 방사성 표지시켰다. 본원에 기재된 바와 같이 방사성 표지된 화합물은 화합물을 확인/평가하기 위한 스크리닝 검정에 사용할 수 있다. 일반적인 의미에서, 새로이 합성되거나 확인된 화합물 (즉, 시험 화합물)을 대상으로 하여, 방사성 표지된 공지된 리간드와 수용체 간의 복합체 형성을 저하시킬 수 있는 능력에 의해, 수용체에 대한 방사성 표지된 공지된 리간드의 결합을 저하시킬 수 있는 능력에 관하여 평가할 수 있다. 본 발명의 화합물에 혼입될 수 있는 적합한 방사성 핵종에는 ³H (또한 T로서 기재됨), ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁸F, ¹²⁵I, ⁸²Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ¹⁵O, ¹³N, ³⁵S 및 ⁷⁷Br이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. ³H, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ⁸²Br이 혼입되는 화합물이 일반적으로 가장 유용할 것이다.

"방사성 표지된 화합물"은 하나 이상의 방사성 핵종이 혼입된 화합물이라는 것을 인지해야 한다. 몇몇 양태에서는, 방사성 핵종이 ³H, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³⁵S 및 ⁸²Br로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서는, 방사성 핵종이 ³H 또는 ¹⁴C이다. 더우기, 본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물에 나타낸 모든 원자는 이러한 원자의 가장 흔하게 존재하는 동위원소이거나 가장 드문 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소일 수 있다는 것을 인지해야 한다.

본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물에 적용 가능한 방법을 포함한, 방사성 동위원소를 유기 화합물 내로 혼입시키기 위한 합성 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 활성 수준의 삼중 수소를 표적 분자 내로 혼입시키는 것이 포함되는데, 다음이 포함된다: A. 삼중 수소 기체를 이용한 촉매적 환원 방법 - 이 과정은 통상적으로 고 특이적 활성 생성물을 산출시키고 할로겐화 또는 불포화 전구체를 필요로 한다. B. 수소화붕소 나트륨 [³H]을 이용한 환원 방법 - 이 과정은 다소 저렴하고, 알데히드, 케톤, 락톤, 에스테르 등의 환원 가능한 관능기를 함유하는 전구체를 필요로 한다. C. 수소화 리튬 알루미늄 [³H]을 이용한 환원 방법 - 이 과정은 거의 이론적 특이적 활성의 생성물을 제공 해준다. 이는 알데히드, 케톤, 락톤, 에스테르 등의 환원 가능한 관능기를 함유하는 전구체를 필요로 한다. D. 삼중 수소 기체 노출 표지화 - 이 과정은 교환 가능한 양성자를 함유하는 전구체를 적합한 촉매의 존재 하에 삼중 수소 기체에 노출시키는 것을 포함한다. E. 메틸 요오다이드 [³H]를 이용하는 N-메틸화 - 이 과정은 적당한 전구체를 고 특이적 활성 메틸 요오다이드 [³H]로 처리함으로써 O-메틸 또는 N-메틸 (³H) 생성물을 제조하기 위해 통상적으로 이용된다. 이 방법은 일반적으로, 고 특이적 활성, 예를 들어 약 80 내지 87 Ci/mmol을 허용해준다.

활성 수준의 ¹²⁵I를 표적 분자 내로 혼입시키기 위한 합성 방법에는 다음이 포함된다: A. 샌드마이어 (Sandmeyer) 등의 방법 - 이 과정은 아릴 또는 헤테로아릴 아민을 디아조늄 염, 예를 들어 테트라플루오로보레이트 염으로 변환시킨 다음, 연속해서 Na¹²⁵I를 이용하여 ¹²⁵I 표지된 화합물로 변환시킨다. 대표적 과정이 문헌 [참고: Zhu, D.-G. and co-workers in J. Org. Chem. 2002, 67, 943-948]에 보고되었다. B. 페놀의 오르토 ¹²⁵요오드화 - 이 과정은 문헌 [참고: Collier, T. L. and co-workers in J. Labelled Compd Radiopharm. 1999, 42, S264-S266]에 보고된 바와 같이 페놀의 오르토 위치에 ¹²⁵I를 혼입시켜 줄 수 있다. C. ¹²⁵I를 이용한 아릴 및 헤테로아릴 브로마이드 교환 - 이 과정은 일반적으로 2 단계 과정이다. 제1 단계는 예를 들어, Pd 촉매된 반응 [즉, Pd(Ph₃P)₄]을 사용하여 또는 아릴 또는 헤테 로아릴 리튬을 통하여, 트리-알킬틴할라이드 또는 헥사알킬디틴 [예: (CH₃)₃SnSn(CH₃)₃]의 존재 하에 아릴 또는 헤테로아릴 브로마이드를 상응하는 트리-알킬틴 중간체로 전환시키는 것이다. 대표적 과정이 문헌 [참고: Bas, M.-D. and co-workers in J. Labelled Compd Radiopharm. 2001, 44, S280-S282]에 보고되었다.

전술된 기술은 예시적이며 제한적이지 않다. 본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물을 방사성 표지화하는 기타 기술이 당업자에게 널리 공지되어 있다.

실시예 12: 수용체 결합 검정

시험 화합물을 대상으로 하여, 본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물과 수용체 간의 복합체 형성을 저하시킬 수 있는 능력에 관하여 평가할 수 있다. 특정 양태에서는, 공지된 리간드를 방사성 표지시킨다. 방사성 표지된 공지된 리간드는 화합물을 확인/평가하기 위한 스크리닝 검정에 사용할 수 있다. 일반적인 의미에서, 새로이 합성되거나 확인된 화합물 (즉, 시험 화합물)을 대상으로 하여, 방사성 표지된 공지된 리간드와 수용체 간의 복합체 형성을 저하시킬 수 있는 능력에 의해, 수용체에 대한 방사성 표지된 공지된 리간드의 결합을 저하시킬 수 있는 능력에 관하여 평가할 수 있다.

시험 화합물의 존재 하에 방사성 표지된 공지된 리간드의 특이적 결합 수준이 시험 화합물의 부재 하에 방사성 표지된 공지된 리간드의 특이적 결합 수준보다 덜하다는 것은 방사성 표지된 공지된 리간드와 수용체 간의 복합체가 시험 화합물의 부재 하에서 보다 시험 화합물의 존재 하에서 덜 형성된다는 지표이다.

본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물과 수용체 간의 복합체를 탐지하기 위한 검정 프로토콜

A. 수용체의 제조

60 ㎕ 리포펙타민 (15 cm 디쉬당)을 사용하여 본 발명의 G 단백질-커플링된 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 10 ㎍ 발현 벡터로 293 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 이와 같이 일시적으로 형질감염시킨 세포를 배지 변화시키면서 디쉬에서 24시간 동안 (75% 밀집도) 성장시키고, 디쉬당 10 ml의 헤르페스-EDTA 완충액 (2O mM 헤르페스 + 10 mM EDTA, pH 7.4)을 이용하여 제거하였다. 이 세포를 벡크만 코울터 (Beckman Coulter) 원심분리기에서 20분 동안 17,000 rpm (JA-25.50 회전자)으로 원심분리시켰다. 연속해서, 펠릿을 2O mM 헤르페스 + 1 mM EDTA, pH 7.4에 재현탁시키고, 50-ml 다운스 (Dounce) 균질화기를 이용하여 균질화시킨 다음, 다시 원심분리시켰다. 상등액을 제거한 후, 펠릿을 결합 검정에 사용할 때까지 -80℃ 하에 저장하였다. 검정에 사용하는 경우, 막을 얼음 상에서 20분 동안 해동시킨 다음, 10 mL의 항온 배양용 완충액 (20 mM 헤르페스, 1 mM MgCl₂, 10O mM NaCl, pH 7.4)을 가하였다. 이어서, 막을 와동시켜 조악한 막 펠릿을 재현탁시키고, 브린크만 PT-3100 폴리트론 균질화기를 이용하여 세팅 6 하에 15초 동안 균질화시켰다. BRL 브래드포드 단백질 검정을 이용하여 막 단백질의 농도를 결정 하였다.

B. 결합 검정

총 결합에 관해서는, 총 용적 50 ㎕의 적당하게 희석된 막 [5O mM 트리스 HCl (pH 7.4), 1O mM MgCl₂, 및 1 mM EDTA를 함유하는 검정용 완충액 중에 희석됨; 5-50 ㎍ 단백질]을 96-웰 폴리프로필렌 미세역가 판에 가한 다음, 100 ㎕의 검정용 완충액과 50 ㎕의 방사성 표지된 공지된 리간드를 가하였다. 비특이적 결합에 관해서는, 100 ㎕ 대신 50 ㎕의 검정용 완충액을 가하고, 방사성 표지되지 않은 상기 공지된 리간드 10 μM을 50 ㎕ 더 가한 후에, 50 ㎕의 상기 방사성 표지된 공지된 리간드를 가하였다. 이어서, 판을 실온 하에 60 내지 120분 동안 항온 배양하였다. 브란델 (Brandell) 96-웰 판 수거기를 사용하여 마이크로플레이트 장치 GF/C 유니필터 여과 판을 통하여 검정용 판을 여과시킨 다음, 0.9% NaCl을 함유하는 찬 5O mM 트리스 HCl, pH 7.4로 세척함으로써 상기 결합 반응을 종결시켰다. 이어서, 여과 판의 바닥을 밀봉시키고, 50 ㎕의 옵티페이스 슈퍼믹스 (Optiphase Supermix)를 각 웰에 가하며, 판의 상부를 밀봉시킨 다음, 판을 트리룩스 (Trilux) 마이크로베타 신틸레이션 계수기에서 계수하였다. 방사성 표지된 공지된 리간드와 수용체 간의 복합체가 시험 화합물의 존재 하에서는 덜 형성되는지를 결정하기 위해, 100 ㎕의 검정용 완충액을 부가하는 것 대신, 100 ㎕의 적당하게 희석된 상기 시험 화합물을 적당한 웰에 가한 다음, 50 ㎕의 상기 방사성 표지된 공지된 리간드를 가하였다.

C. 계산

시험 화합물을 초기에는 10, 1 및 0.1 μM 하에 검정한 다음, 중간 용량이 방사성 표지된 공지된 리간드의 결합을 약 50% 억제시킬 수 있도록 (즉, IC₅₀) 선택된 농도 범위 하에 검정하였다. 시험 화합물의 부재 하에서의 특이적 결합도 (B₀)는 총 결합도 (B_T) - 비-특이적 결합도 (NSB)의 차이이고, 유사하게 시험 화합물의 존재 하에서의 특이적 결합도 (B)는 전위 결합도 (B_D) - 비특이적 결합도 (NSB)의 차이이다. IC₅₀은 억제 반응 곡선, % B/B_O 대 시험 화합물 농도의 로짓-로그 플롯으로부터 결정하였다.

K_i는 청 앤드 프루스토프 (Cheng and Prustoff) 변환에 의해 계산하였다:

K_i = IC₅₀/(I+[L]/K_D)

상기에서, [L]은 검정에 사용된 방사성 표지된 공지된 리간드의 농도이고, K_D는 동일한 결합 조건 하에 독립적으로 결정된 방사성 표지된 공지된 리간드의 해리 상수이다.

실시예 13

소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 조직 내의 세포 또는 장내분비 세포주에서의 GIP 분비에 대한 GPR119 작동제의 효과

본 발명에 따르는 GPR119 작동제는 본원에 기재된 시험관내 검정을 사용하여 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 조직 [예를 들어, 십이지장 또는 공장 조 직; 참고: Sondhi et al, Pharmacogenetics J (2006) 6: 131-140] 내의 세포 또는 장내분비 세포주에서 GIP 분비를 자극하는 것으로 나타날 수 있다. 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 조직 내의 세포 또는 장내분비 세포주를 완전 배양 배지 (DMEM/10% FBS)에서 1일째에 24-웰 판에 도말하였다. 2일째에, 배양 배지를 저 글루코스 배지 (DMEM/3 mM 글루코스/10% FBS)로 대체시켰다. 3일째에, 세포를 1xPBS로 2회 세척하였다. 이와 같이 세척한 세포를 조직 배양 항온 배양기에서 37℃ 및 5% CO₂ 하에 1시간 동안 15 mM 글루코스를 수반한 혈청 무함유 DMEM에서, 비히클 또는 각종 농도의 GPR119 작동제 (예를 들어, 1 nM 내지 20 μM)으로 자극하거나 또는 양성 대조군으로서 포르스콜린 (forskolin) (1 μM)으로 자극하였다. 이어서, 상등액을 수집하고, 500 g 및 4℃ 하에 5분 동안 원심분리함으로써 정화시켰다. 상등액 내로 방출된 GIP는 공급업자의 지시에 따라서 공급처 (LINCO Research Laboratory [Rat/Mouse Gastric Inhibitory Polypeptide (Total) ELISA Catalog # EZRMGIP-55K])로부터 구입한 시약을 사용하여 ELISA함으로써 결정하였다.

전술된 명세서가 예시 목적으로 제공된 실시예와 함께 본 발명의 원리를 교시하고 있긴 하지만, 본 발명의 실시에는 다음 청구의 범위 및 그의 등가 내에 있는 바와 같은 통상의 모든 변동, 적응 또는 변형이 포괄된다는 것을 인지해야 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Arena Pharmaceuticals, Inc. Chu, Zhi-Liang Leonard, James <120> METHODS OF USING GPR119 RECEPTOR TO IDENTIFY COMPOUNDS USEFUL FOR INCREASING BONE MASS IN AN INDIVIDUAL <130> 122.WO1 <150> 60/791,550 <151> 2006-04-11 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1008 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 1 atggaatcat ctttctcatt tggagtgatc cttgctgtcc tggcctccct catcattgct 60 actaacacac tagtggctgt ggctgtgctg ctgttgatcc acaagaatga tggtgtcagt 120 ctctgcttca ccttgaatct ggctgtggct gacaccttga ttggtgtggc catctctggc 180 ctactcacag accagctctc cagcccttct cggcccacac agaagaccct gtgcagcctg 240 cggatggcat ttgtcacttc ctccgcagct gcctctgtcc tcacggtcat gctgatcacc 300 tttgacaggt accttgccat caagcagccc ttccgctact tgaagatcat gagtgggttc 360 gtggccgggg cctgcattgc cgggctgtgg ttagtgtctt acctcattgg cttcctccca 420 ctcggaatcc ccatgttcca gcagactgcc tacaaagggc agtgcagctt ctttgctgta 480 tttcaccctc acttcgtgct gaccctctcc tgcgttggct tcttcccagc catgctcctc 540 tttgtcttct tctactgcga catgctcaag attgcctcca tgcacagcca gcagattcga 600 aagatggaac atgcaggagc catggctgga ggttatcgat ccccacggac tcccagcgac 660 ttcaaagctc tccgtactgt gtctgttctc attgggagct ttgctctatc ctggaccccc 720 ttccttatca ctggcattgt gcaggtggcc tgccaggagt gtcacctcta cctagtgctg 780 gaacggtacc tgtggctgct cggcgtgggc aactccctgc tcaacccact catctatgcc 840 tattggcaga aggaggtgcg actgcagctc taccacatgg ccctaggagt gaagaaggtg 900 ctcacctcat tcctcctctt tctctcggcc aggaattgtg gcccagagag gcccagggaa 960 agttcctgtc acatcgtcac tatctccagc tcagagtttg atggctaa 1008 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 2 Met Glu Ser Ser Phe Ser Phe Gly Val Ile Leu Ala Val Leu Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ile Ile Ala Thr Asn Thr Leu Val Ala Val Ala Val Leu Leu Leu 20 25 30 Ile His Lys Asn Asp Gly Val Ser Leu Cys Phe Thr Leu Asn Leu Ala 35 40 45 Val Ala Asp Thr Leu Ile Gly Val Ala Ile Ser Gly Leu Leu Thr Asp 50 55 60 Gln Leu Ser Ser Pro Ser Arg Pro Thr Gln Lys Thr Leu Cys Ser Leu 65 70 75 80 Arg Met Ala Phe Val Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Val Leu Thr Val 85 90 95 Met Leu Ile Thr Phe Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Lys Gln Pro Phe Arg 100 105 110 Tyr Leu Lys Ile Met Ser Gly Phe Val Ala Gly Ala Cys Ile Ala Gly 115 120 125 Leu Trp Leu Val Ser Tyr Leu Ile Gly Phe Leu Pro Leu Gly Ile Pro 130 135 140 Met Phe Gln Gln Thr Ala Tyr Lys Gly Gln Cys Ser Phe Phe Ala Val 145 150 155 160 Phe His Pro His Phe Val Leu Thr Leu Ser Cys Val Gly Phe Phe Pro 165 170 175 Ala Met Leu Leu Phe Val Phe Phe Tyr Cys Asp Met Leu Lys Ile Ala 180 185 190 Ser Met His Ser Gln Gln Ile Arg Lys Met Glu His Ala Gly Ala Met 195 200 205 Ala Gly Gly Tyr Arg Ser Pro Arg Thr Pro Ser Asp Phe Lys Ala Leu 210 215 220 Arg Thr Val Ser Val Leu Ile Gly Ser Phe Ala Leu Ser Trp Thr Pro 225 230 235 240 Phe Leu Ile Thr Gly Ile Val Gln Val Ala Cys Gln Glu Cys His Leu 245 250 255 Tyr Leu Val Leu Glu Arg Tyr Leu Trp Leu Leu Gly Val Gly Asn Ser 260 265 270 Leu Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Tyr Trp Gln Lys Glu Val Arg Leu 275 280 285 Gln Leu Tyr His Met Ala Leu Gly Val Lys Lys Val Leu Thr Ser Phe 290 295 300 Leu Leu Phe Leu Ser Ala Arg Asn Cys Gly Pro Glu Arg Pro Arg Glu 305 310 315 320 Ser Ser Cys His Ile Val Thr Ile Ser Ser Ser Glu Phe Asp Gly 325 330 335 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 gtcctgccac ttcgagacat gg 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 gaaacttctc tgcccttacc gtc 23

Claims

(a) G 단백질-커플링된 수용체 119 (GPR119) 작동제를 척추동물 장내분비 세포 또는 글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 펩티드 (GIP)를 분비할 수 있는 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계, 및

(b) GPR119 작동제가 척추동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터 GIP 분비를 촉진하는지 여부를 결정하는 단계

를 포함하며,

여기서 GPR119 작동제가 척추동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터 GIP 분비를 촉진할 수 있는 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제임을 나타내는 지표인,

GIP 분비촉진제를 확인하는 방법.
제1항에 있어서, GPR119 작동제가 인간 GPR119의 작동제인 방법.
제1항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성인 방법.
제1항에 있어서, GPR119 작동제가 선택적 GPR119 작동제인 방법.
제4항에 있어서, GPR119 작동제가 코르티코트로핀 방출 인자-1 (CRF-1) 수용체 보다 GPR119에 대해 선택성을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 장내분비 세포가 K 세포인 방법.
제1항에 있어서, 장내분비 세포가 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 세포인 방법.
제1항에 있어서, 장내분비 세포가 십이지장 조직으로부터 유래된 세포인 방법.
제1항에 있어서, 장내분비 세포가 공장 조직으로부터 유래된 세포인 방법.
제1항에 있어서, 척추동물 장내분비 세포가 포유동물 장내분비 세포인 방법.
제1항에 있어서, 장내분비 세포가 장내분비 세포주로부터 유래된 것인 방법.
제1항에 있어서, GIP를 분비할 수 있는 세포가 GIP를 분비할 수 있도록 조작된 재조합 세포인 방법.
제1항에 있어서, GIP를 분비할 수 있는 세포가 췌장 세포인 방법.
제1항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 10 μM 미만인 방법.
제1항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 1 μM 미만인 방법.
제1항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제1항에 있어서, GPR119 작동제는 경구 활성이며 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
(a) G 단백질-커플링된 수용체 119 (GPR119) 작동제를 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계, 및

(b) GPR119 작동제가 상기 포유동물에서 혈액 글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 펩티드 (GIP) 수준을 증가시키는지 여부를 결정하는 단계

를 포함하며,

여기서 GPR119 작동제가 상기 포유동물에서 혈액 GIP 수준을 증가시킬 수 있는 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제임을 나타내는 지표인,

GIP 분비촉진제를 확인하는 방법.
제18항에 있어서, GPR119 작동제가 인간 GPR119의 작동제인 방법.
제18항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성인 방법.
제18항에 있어서, GPR119 작동제가 선택적 GPR119 작동제인 방법.
제21항에 있어서, GPR119 작동제가 코르티코트로핀 방출 인자-1 (CRF-1) 수용체 보다 GPR119에 대해 선택성을 갖는 것인 방법.
제18항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 10 μM 미만인 방법.
제18항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 1 μM 미만인 방법.
제18항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제18항에 있어서, GPR119 작동제는 경구 활성이며 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
(a) G 단백질-커플링된 수용체 119 (GPR119) 작동제를 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계,

(b) GPR119 작동제가 상기 포유동물에서 혈액 글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 펩티드 (GIP) 수준을 증가시키는지 여부를 결정하는 단계 (여기서, GPR119 작동제가 포유동물에서 혈액 GIP 수준을 증가시킬 수 있는 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제임을 나타내는 지표임), 및

(c) GIP 분비촉진제의 효과를 갖는 GPR119 작동제를 제약상 허용가능한 담체와 함께 제제화하는 단계

를 포함하는,

GIP 분비촉진제의 효과를 갖는 GPR119 작동제를 포함하는 제약 조성물의 제조 방법.
제27항에 있어서, GPR119 작동제가 인간 GPR119의 작동제인 방법.
제27항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성인 방법.
제27항에 있어서, GPR119 작동제가 선택적 GPR119 작동제인 방법.
제30항에 있어서, GPR119 작동제가 코르티코트로핀 방출 인자-1 (CRF-1) 수용체 보다 GPR119에 대해 선택성을 갖는 것인 방법.
제27항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 10 μM 미만인 방법.
제27항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 1 μM 미만인 방법.
제27항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제27항에 있어서, GPR119 작동제는 경구 활성이며 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제27항에 있어서, 제약 조성물이 투여 형태인 방법.
GPR119 작동제가 사전에 GPR119 작동제를 투여한 포유동물로부터 수득한 생물학적 샘플에서 혈액 GIP 수준을 증가시킨다고 결정된 것이며, 여기서 GPR119 작동제가 상기 생물학적 샘플에서 혈액 GIP 수준을 증가시킬 수 있는 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제임을 나타내는 지표인, GIP 분비촉진제의 효과를 갖는 GPR119 작동제를 제약상 허용가능한 담체와 함께 제제화하는 단계를 포함하는, GIP 분비촉진제의 효과를 갖는 GPR119 작동제를 포함하는 제약 조성물의 제조 방법.
제37항에 있어서, GPR119 작동제가 인간 GPR119의 작동제인 방법.
제37항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성인 방법.
제37항에 있어서, GPR119 작동제가 선택적 GPR119 작동제인 방법.
제40항에 있어서, GPR119 작동제가 CRF-1 수용체 보다 GPR119에 대해 선택성을 갖는 것인 방법.
제37항에 있어서, 포유동물이 비-인간 포유동물인 방법.
제37항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
제37항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 10 μM 미만인 방법.
제37항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 1 μM 미만인 방법.
제37항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제37항에 있어서, GPR119 작동제는 경구 활성이며 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제37항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플인 방법.
제37항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장 샘플인 방법.
제37항에 있어서, 제약 조성물이 투여 형태인 방법.
(a) G 단백질-커플링된 수용체 119 (GPR119) 작동제를 척추동물 장내분비 세포 또는 글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 펩티드 (GIP)를 분비할 수 있는 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계,

(b) GPR119 작동제가 척추동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터 GIP 분비를 촉진하는지 여부를 결정하는 단계 (여기서, GPR119 작동제가 척추동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터 GIP 분비를 촉진할 수 있는 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제임을 나타내는 지표임), 및

(c) GIP 분비촉진제의 효과를 갖는 GPR119 작동제를 제약상 허용가능한 담체와 함께 제제화하는 단계

를 포함하는,

GIP 분비촉진제의 효과를 갖는 GPR119 작동제를 포함하는 제약 조성물의 제조 방법.
제51항에 있어서, GPR119 작동제가 인간 GPR119의 작동제인 방법.
제51항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성인 방법.
제51항에 있어서, GPR119 작동제가 선택적 GPR119 작동제인 방법.
제54항에 있어서, GPR119 작동제가 코르티코트로핀 방출 인자-1 (CRF-1) 수용체 보다 GPR119에 대해 선택성을 갖는 것인 방법.
제51항에 있어서, 장내분비 세포가 K 세포인 방법.
제51항에 있어서, 장내분비 세포가 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 세포인 방법.
제51항에 있어서, 장내분비 세포가 십이지장 조직으로부터 유래된 세포인 방법.
제51항에 있어서, 장내분비 세포가 공장 조직으로부터 유래된 세포인 방법.
제51항에 있어서, 척추동물 장내분비 세포가 포유동물 장내분비 세포인 방법.
제51항에 있어서, 장내분비 세포가 장내분비 세포주로부터 유래된 것인 방법.
제51항에 있어서, GIP를 분비할 수 있는 세포가 GIP를 분비할 수 있도록 조작된 재조합 세포인 방법.
제51항에 있어서, GIP를 분비할 수 있는 세포가 췌장 세포인 방법.
제51항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 10 μM 미만인 방법.
제51항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 1 μM 미만인 방법.
제51항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제51항에 있어서, GPR119 작동제는 경구 활성이며 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제51항에 있어서, 제약 조성물이 투여 형태인 방법.
GPR119 작동제가 척추동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포와 시험관내에서 접촉되어 척추동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터 GIP 분비를 촉진한다고 결정된 것이며, 여기서 GPR119 작동제가 척추동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터 GIP 분비를 촉진할 수 있는 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제임을 나타내는 지표인, GIP 분비촉진제의 효과를 갖는 GPR119 작동제를 제약상 허용가능한 담체와 함께 제제화하는 단계를 포함하는, GIP 분비촉진제의 효과를 갖는 GPR119 작동제를 포함하는 제약 조성물의 제조 방법.
제69항에 있어서, GPR119 작동제가 인간 GPR119의 작동제인 방법.
제69항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성인 방법.
제69항에 있어서, GPR119 작동제가 선택적 GPR119 작동제인 방법.
제72항에 있어서, GPR119 작동제가 CRF-1 수용체 보다 GPR119에 대해 선택성을 갖는 것인 방법.
제69항에 있어서, 장내분비 세포가 K 세포인 방법.
제69항에 있어서, 장내분비 세포가 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 세포인 방법.
제69항에 있어서, 장내분비 세포가 십이지장 조직으로부터 유래된 세포인 방법.
제69항에 있어서, 장내분비 세포가 공장 조직으로부터 유래된 세포인 방법.
제69항에 있어서, 척추동물 장내분비 세포가 포유동물 장내분비 세포인 방법.
제69항에 있어서, 장내분비 세포가 장내분비 세포주로부터 유래된 것인 방법.
제69항에 있어서, GIP를 분비할 수 있는 세포가 GIP를 분비할 수 있도록 조작된 재조합 세포인 방법.
제69항에 있어서, GIP를 분비할 수 있는 세포가 췌장 세포인 방법.
제69항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 10 μM 미만인 방법.
제69항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 1 μM 미만인 방법.
제69항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제69항에 있어서, GPR119 작동제는 경구 활성이며 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제69항에 있어서, 제약 조성물이 투여 형태인 방법.
G 단백질-커플링된 수용체 119 (GPR119) 작동제가 사전에 GPR119 작동제와 시험관내에서 접촉된 척추동물 장내분비 세포 또는 글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 펩티드 (GIP)를 분비할 수 있는 세포로부터 GIP 분비를 촉진하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 GPR119 작동제가 척추동물 장내분비 세포 또는 GIP를 분비할 수 있는 세포로부터 GIP 분비를 촉진할 수 있는 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제임을 나타내는 지표인, GIP 분비촉진제를 확인하는 방법.
제87항에 있어서, GPR119 작동제가 인간 GPR119의 작동제인 방법.
제87항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성인 방법.
제87항에 있어서, GPR119 작동제가 선택적 GPR119 작동제인 방법.
제90항에 있어서, GPR119 작동제가 코르티코트로핀 방출 인자-1 (CRF-1) 수용체 보다 GPR119에 대해 선택성을 갖는 것인 방법.
제87항에 있어서, 장내분비 세포가 K 세포인 방법.
제87항에 있어서, 장내분비 세포가 소장의 K 세포 풍부 영역으로부터 유래된 세포인 방법.
제87항에 있어서, 장내분비 세포가 십이지장 조직으로부터 유래된 세포인 방법.
제87항에 있어서, 장내분비 세포가 공장 조직으로부터 유래된 세포인 방법.
제87항에 있어서, 척추동물 장내분비 세포가 포유동물 장내분비 세포인 방법.
제87항에 있어서, 장내분비 세포가 장내분비 세포주로부터 유래된 것인 방법.
제87항에 있어서, GIP를 분비할 수 있는 세포가 GIP를 분비할 수 있도록 조작된 재조합 세포인 방법.
제87항에 있어서, GIP를 분비할 수 있는 세포가 췌장 세포인 방법.
제87항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 10 μM 미만인 방법.
제87항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 1 μM 미만인 방법.
제87항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제87항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성이며 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
G 단백질-커플링된 수용체 (GPR119) 작동제가 사전에 GPR119 작동제를 투여한 포유동물로부터 수득한 생물학적 샘플에서 혈액 글루코스-의존성 인슐린분비촉진성 펩티드 (GIP) 수준을 증가시키는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 GPR119 작동제가 상기 생물학적 샘플에서 혈액 GIP 수준을 증가시킬 수 있는 능력은 GPR119 작동제가 GIP 분비촉진제임을 나타내는 지표인, GIP 분비촉진제를 확인하는 방법.
제104항에 있어서, GPR119 작동제가 인간 GPR119의 작동제인 방법.
제104항에 있어서, GPR119 작동제가 경구 활성인 방법.
제104항에 있어서, GPR119 작동제가 선택적 GPR119 작동제인 방법.
제107항에 있어서, GPR119 작동제가 코르티코트로핀 방출 인자-1 (CRF-1) 수용체 보다 GPR119에 대해 선택성을 갖는 것인 방법.
제104항에 있어서, 포유동물이 비-인간 포유동물인 방법.
제104항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
제104항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 10 μM 미만인 방법.
제104항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 1 μM 미만인 방법.
제104항에 있어서, GPR119 작동제는 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.
제104항에 있어서, GPR119 작동제는 경구 활성이며 GPR119-형질감염 세포에서 cAMP를 상승시키기 위한 EC₅₀이 100 nM 미만인 방법.