KR101072736B1

KR101072736B1 - 간세포 성장 인자에 대한 단클론 항체

Info

Publication number: KR101072736B1
Application number: KR1020067023964A
Authority: KR
Inventors: 김경진; 위-치 수
Original assignee: 갤럭시 바이오테크, 엘엘씨
Priority date: 2004-04-15
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2011-10-11
Anticipated expiration: 2024-08-13
Also published as: CN1964738A; CR8698A; US20090104192A1; US7687063B2; ZA200609407B; ES2346886T3; SI1734995T1; AU2004319276B2; HK1094167A1; MXPA06011822A; PT1734995E; JP2011012067A; US20070160613A1; IL178474A0; DE602004028168D1; AU2004319276C1; JP4594381B2; IL178474A; DK1734995T3; JP2007532643A

Abstract

본 발명은 간세포 성장 인자에 대한 중화 단클론 항체, 이를 포함하는 약제 조성물, 이러한 약제조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 예를 들어 교아세포종을 억제하기 위한 치료 방법에 관한 것이다.

Description

간세포 성장 인자에 대한 단클론 항체 {MONOCLONAL ANTIBODIES TO HEPATOCYTE GROWTH FACTOR}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2004년 4월 15일에 출원된 미국 특허 출원 제10/825,060호의 부분 계속 출원으로, 2003년 4월 18일에 출원된 가출원 미국 특허 출원 제60/464,061호의 이익을 주장하며 이들 출원 모두는 모든 목적으로 전체 내용이 참조로 통합된다.

발명이 속하는 분야

본 출원은 전체적으로 단클론 항체(mAb) 및 신규한 생물물질을 개발하기 위한 재조합 DNA 기술의 조합 및 보다 구체적으로 예를 들어 간세포 성장 인자에 결합하고 이를 중화시키는 단클론 항체의 생산에 관한 것이다.

배경 기술

인간 간세포 성장 인자(HGF)는 간엽 세포에 의해 생성되는 다기능성 이종이량체 폴리펩티드이다. HGF는 다양한 세포 형태의 성장 및 분산(scattering) 뿐만 아니라 혈관신생(angiogenesis), 형태형성(morphogenesis), 및 모토제네시스(motogenesis)를 자극하는 것으로 증명되었다(참조: Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar and Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier and Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). HGF의 다면발현성 특성은 이의 수용체, 원발암유전자(proto-oncogene) cMet에 의해 엔코딩되는 막투과성 티로신 키나아제를 통해 매개된다. 다양한 정상적인 세포 기능을 조절하는 것에 더해, HGF와 이의 수용체 c-Met은 종양의 개시, 침윤, 및 전이에 관여하는 것으로 증명된 바 있다(참조: Jeffers et al., J. Mol. Med. 74:505, 1996; Comoglio and Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002). HGF/cMet는 폐, 결장, 직장, 위, 신장, 난소, 피부, 다발성 골수종 및 갑상선 조직으로부터 유래된 종양을 포함하는 다양한 인간 고형 종양 상에서 함께 발현되고 종종 과발현된다(참조: Prat et al., Int. J. Cancer 49:323, 1991; Chan et al., Oncogene 2:593, 1988; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993; Derksen et al., Blood 99:1405, 2002). HGF는 이들 종양에 대해 자가분비성(autocrine) 성장 인자(참조: Rong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4731, 1994; Koochekpour et al., Cancer Res. 57:5391, 1997 ) 및 측분비성(paracrine) 성장 인자(참조: Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993), 및 항애팝토시스 조절제(참조: Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257, 2001)로서 작용한다.

HGF는 플라스미노겐 및 다른 혈액 응고 효소와 서열 및 구조 유사성을 가지는 102kDa 단백질이다(참조: Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993, 이들 각각은 본원에 참조로 통합된다)(도 1). 인간 HGF는 728개 아미노산 전구체(프리프로HGF)로서 합성되고, 이는 불활성 단일 사슬 형태(프로HGF)로 세포내 절단과정을 거친다(참조: Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell. Biol. 127: 1783, 1994). 세포외 분비시에, 프로HGF는 절단되어 α-서브유닛과 β-서브유닛으로 구성된 생물학적 활성 이황화물결합 이종이량체 분자를 생성한다(참조: Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al., EMBO J. 11:4825, 1992). α-서브유닛은 N-말단 헤어핀 도메인과 네개의 크링글(kringle) 도메인으로 구성된 440개 잔기(당화시 69kDa)를 함유한다. β-서브유닛은 234개 잔기(34kDa)를 함유하고 단백질분해 활성이 결핍된 세린 프로테아제 유사 도메인을 가진다. HGF의 절단이 수용체 활성화를 위해 필요하고 수용체 결합을 위해서는 필요하지 않다(참조: HarDnann et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11574, 1992; Lokker et al. , J. Biol. Chem. 268:17145, 1992). HGF는 4개의 추정상 N-당화 위치를 α-서브유닛에 1개, β-서브유닛에 3개 함유한다. HGF는 2개의 독특한 세포 특이적 결합 위치를 가진느데, cMet 수용체에 대해서는 고친화성 (Kd=2×10^-10M) 결합 위치를 가지고 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 대해서는 저친화성(Kd=10^-9M) 결합 위치를 가지며, 이들은 세포 표면과 세포외 기질에 존재한다(참조: Naldini et al., Oncogene 6:501, 1991; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994; Sakata et al., J. Biol. Chem., 272:9457, 1997). NK2(N-말단과 α-서브유닛의 처음 두개의 크링글 도메인을 포함하는 단백질)은 cMet에 대한 결합 및 운동성을 위한 시그날 캐스케이드의 활성화를 위해 충분하지만, 전장길이의 단백질이 미토겐성 반응을 위해 필요하다(참조: Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993). HSPG는 HGF의 N 말단과 상호작용함에 의해 HGF에 결합한다(참조: Aoyama, et al., Biochem. 36:10286, 1997; Sakata, et al. , J. Biol. Chem. 272:9457, 1997). HSPG-HGF 상호작용의 가정되는 역할은 HGF 생체이용성, 생물학적 활성 및 올리고머화의 증강을 포함한다(참조: Bardelli, et al., J. Biotechnol. 37:109,1994; Zioncheck et al., J. Biol. Chem. 270:16871, 1995).

cMet는 클래스 IV 단백질 티로신 키나아제 수용체 패밀리의 일원이다. 전장길이의 cMet 유전자가 클로닝되었고 cMet-원발암유전자로서 확인되었다(참조: Cooper et al., Nature 311:29, 1984; Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987). cMet 수용체는 처음에 단일 사슬, 부분적으로 당화된 전구체, p170^(MET)로서 합성된다(도 1)(참조: Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987; Giordano et al., Nature 339:155, 1989; Giordano et al. , Oncogene 4:1383, 1989; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994). 추가 당화시에, 단백질은 단백질분해적으로 이종이량체 190kDa 성숙 단백질(1385개 아미노산)로 절단되고, 이 단백질은 50kDa α-서브유닛(잔기 1 내지 307)과 145kDa β-서브유닛으로 구성된다. β-서브유닛의 세포질성 티로신 키나아제 도메인은 신호 전달에 관여한다.

수개의 상이한 접근법이 HGF/cMet 상호작용의 길항 분자를 수득하기 위하여 연구되었다: 트렁케이션된 HGF 단백질, 예를 들어 NK1(N 말단 도메인과 크링글 도메인 1; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993), NK2(N 말단 도메인과 크링글 도메인 1 및 2; Chan et al., Science 254:1382, 1991), 및 NK4(N 말단 도메인과 4개의 크링글 도메인; Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000), 항-cMet mAb(Dodge, Master's Thesis, San Francisco State University, 1998), 및 항 HGF mAb(Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, 이는 참조로 본원에 통합된다).

NK1 및 NK2는 HGF가 이의 수용체로 결합하는 것과 효과적으로 경쟁할 수 있지만, 요망되는 순수한 길항제 활성 보다는 시험관내에서 부분적인 효능제 활성을 가지는 것으로 증명되었다(참조: Cioce et al., J. Biol. Chem. 271:13110, 1996; Schwalletal.,J. CellBiol. 133:709, 1996). 보다 최근에, 문헌(Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000)은 NK4가 NK4의 연속 주입에 의해 누드 마우스 모델에서 쥐과동물 폐 종양 LLC의 1차 성장(도 2) 및 전이를 부분적으로 억제할 수 있음을 증명하였다. NK4가 1차 종양의 부분적 성장 억제를 획득하기 위하여 연속적으로 투여되어야 한다는 사실은 NK4 분자의 잠재적으로 짧은 반감기 및/또는 효능 결핍을 나타낸다. NK4와 비교하여, 항체를 사용하는 접근법은 이들의 유리한 약동학 및 훨씬 높은 효능을 가진 항체를 수득할 수 있는 가능성으로부터 이익을 얻을 것이다.

다른 접근법으로서, 도지(Dodge)(Master's Thesis, San Francisco State University, 1998)는 길항적 항-cMet 단클론 항체(mAb)를 생성하였다. 하나의 mAb인 5D5는 ELISA에서 강한 길항 활성을 보였으나, 아마도 막 수용체의 이량체화로 인하여 cMet 발현 BAF-3 세포의 증식 반응을 유도하였다. 문헌(Prat et al., J. Cell Sci. 111:237, 1998)은 또한 이러한 항-cMet mAb의 효능제 활성을 보고하였다. 문헌(Zaccolo et al., Eur. J. hnmunol 27:618, 1997)은 파지 디스플레이 방법을 사용하여 마우스 및 인간 간세포 성장 인자에 대한 인간 Fab 단편을 개발하였다. 이러한 Fab 단편은 단독으로 사용되었을 때에 HGF의 활성에 효과를 가지지 않았다. 항인간 HGF Fab 단편 중 하나가 그러한 Fab 단편 그 자체에 결합하는 항체와 조합되었을 때에, 이는 생물학적 검정에서 HGF의 활성을 실제로 증강시켰다.

문헌(Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001)은 시험관내에서 HGF의 분산 활성을 억제하는 능력에 기초하여 선택된, 3개의 항-HGF mAb의 칵테일(cocktail)의 투여가 이종이식 누드 마우스 모델에서 인간 종양의 성장을 억제할 수 있다는 것을 증명하였다(도 3). 이들은 HGF의 3개의 상이한 결합 위치를 인식하는 3개의 mAb가 생체내에서 HGF의 생활성을 억제하는데 필요하다는 것을 가정하였는데, 두개의 mAb는 HGF가 cMet에 결합하는 것을 억제하였고, 한개의 mAb는 HGF가 헤파린에 결합하는 것을 억제하였다. 그러나, 3개의 신규한 mAb가 조합된 약물을 개발하는 것은 상업상 및 규제상 이유로, 예를 들어 각 항체의 임상 활성이 독립적으로 증명될 필요가 있기 때문에 비현실적이다.

따라서, 시험관내 및 생체내에서 HGF의 생물학적 활성을 차단하는 하나의 단클론 항체가 필요하다. 본 발명은 이러한 필요와 다른 필요를 충족시킨다.

발명의 요약

일 구체예에서, 본 발명은 인간 간세포 성장 인자(HGF)에 대한 중화 mAb를 제공한다. mAb는 HGF가 이의 수용체인 cMet에 결합하고, 마딘-다비(Madin-Darby) 개과 신장 세포와 같은 세포의 분산을 유도하고, 4MBr-5 원숭이 상피 세포 및/또는 간세포 및/또는 HUVEC의 증식을 유도하고, 혈관신생을 유도하는 것을 포함하는 HGF의 생물학적 활성들 중 적어도 하나, 바람직하게는 수개 또는 모든 생물학적 활성을 억제한다. 항-HGF mAb는 하나의 제제로서 사용되는 경우에 이러한 활성을 억제할 수 있다. 바람직한 항-HGF mAb는 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제하고, 가장 바람직하게는 완벽하게 억제한다. 바람직하게는, 본 발명의 mAb는 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 유사 항체 또는 인간 항체이다. 예시적인 항체는 L2G7 및 이의 키메라 및 인간화된 형태이다. 이러한 항체를 생성하는 세포주가 또한 제공된다. 다른 구체예에서, 중화 항-HGF 항체, 예를 들어 키메라 또는 인간화된 L2G7를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 제 3 구체예에서, 약제 조성물은 암 또는 다른 질병을 치료하기 위하여 투여된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 HGF 및 cMet의 개략적인 모델을 도시한다.

도 2는 NK4가 누드 마우스에서 쥐과동물 폐 종양 LLC의 1차 성장을 부분적으로 억제하는 것을 도시하는 그래프에 대한 것이다(Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000). NK4가 누드 마우스에서 s.c.로 종양 이식후 4일째로부터 14일 동안 계속하여 주입되었다.

도 3은 누드 마우스에서 인간 뇌 종양 U-118 세포의 성장을 억제하기 위하여 3개의 항-HGF mAb의 칵테일이 필요하다는 것을 도시하는 그래프에 대한 것이다(Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9S:7443, 2001). U-118 종양 세포는 누드 마우스내로 s.c. 주사되었다. 1일째로부터 항-HGF mAb A-1, -5 및 -7 또는 mAb 7-2 및 -3은 200㎍/주사로 10주 동안 주 당 2회 투여되었다.

도 4는 경쟁적 결합 ELISA를 사용하여 mAb L1H4, L2C7, L2G7의 상대적인 결합 에피토프를 결정하는 것을 도시한다. 플레이트를 재조합 HGF(rHGF)로 코팅하고, 탈지 분유로 블록킹하고, 표지되지 않은 mAb의 100× 과량의 존재하에 부최적(suboptimal) 농도의 바이오티닐화된 mAb와 인큐베이션하였다. 결합된 바이오티닐화 mAb를 HRP-스트렙타비딘의 첨가에 의해 검출하였다.

도 5는 직접적인 HGF 결합 ELISA에서 결정된 항-HGF mAb의 rHGF로의 결합을 도시한다. 플레이트를 rHGF를 함유하는 H1-F11 상청액으로 코팅하고, 2% 탈지 분유로 블록킹하고 mAb로 인큐베이션하고 HRP-GαMIgG를 첨가하였다(실시예에서 기술된 바와 같음).

도 6은 항-HGF mAb가 용액에서 rHGF-플래그(Flag)를 포획하는 능력에 관한 것이다. 항-HGF mAb를 염소 항-마우스 IgG 코팅된 ELISA 플레이트상에 포획시켰다. 다음에 플레이트를 2% 탈지 분유로 블록킹하고 rHGF-플래그와 인큐베이션하고, 이어서 HRP-M2 항-플래그 mAb와 인큐베이션하였다(실시예에 기술된 바와 같음).

도 7은 포획 ELISA에서 항-HGF mAb에 의한 rHGF-플래그의 cMet-Fc로의 결합 억제를 도시한다. 염소 항-인간 IgG 코팅된 플레이트상에 포획된 cMet-Fc를 mAb 첨가/비첨가하에 사전 인큐베이션된 HGF-플래그와 인큐베이션하였다. 결합된 rHGF-플래그를 HRP-M2 항-플래그 mAb의 첨가에 의해 검출하였다(실시예에 기술된 바와 같음).

도 8은 항-HGF mAb L2G7에 의한 HGF 유도된 MDCK 분산의 중화를 도시한다. (A) 처리되지 않은 대조군. (B) rHGF+IgG. (C) rHGF+mAb L2G7. MDCK 세포를 10㎍/㎖의 mAb의 존재하에 H1-F11 배양 상청액(∼3㎍/㎖의 HGF)의 1:20 희석액과 인큐베이션하였다. 100×배율로 사진을 찍었다.

도 9는 L2G7 mAb에 의한 Mv 1 LU 세포의 HGF-유도된 증식의 억제를 도시한다. HGF에 대한 mAb의 몰 과량 배수 (fold molar excess)가 가로축에 도시되고, 혼입된 cpm×10^-2가 세로축에 도시되어 있다. 데이터 값을 3벌로 수득하였다.

도 10은 L2G7 mAb 및 대조군 마우스 항체(mIgG)에 의한 HUVEC의 HGF-유도된 증식의 억제를 도시한다. 데이터 값을 3벌로 수득하였다.

도 11은 L2G7 및 L1H4 항체에 의한 HCT 116 결장 종양 세포의 HGF-유도된 증식에 대한 효과를 도시한다. 데이터 값을 3벌로 수득하였다.

도 12는 NIH III 베이지/누드 마우스의 군(n=6)에서 U-118 종양의 성장에 대한 L2G7 mAb 또는 PBS(대조군) 처리 효과를 도시한다. 화살표는 주사가 시작되었을 때를 나타낸다. (A) 종양 크기 대 종양 이식으로부터의 일수. (B) 실험 종결시 종양 질량.

발명의 상세한 설명

본 발명은 중화 항-HGF 단클론 항체, 이를 함유하는 약제 조성물 및 질병의 치료를 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다.

1. 항체

항체는 복잡한 내부 구조를 가지는 매우 크고 복잡한 분자(∼150,000의 분자량 또는 약 1320개 아미노산)이다. 천연 항체 분자는 두개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬을 함유하고 각 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 가진다. 각 경쇄 및 중쇄는 다시 두개의 영역, 즉 표적 항원과 결합하는데 관여하는 가변 ("V") 영역 및 면역계의 다른 성분과 상호작용하는 불변 ("C") 영역으로 구성된다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3차원 공간으로 함께 폴딩되어 항원(예를 들어 세포 표면 상의 수용체)과 결합하는 가변 영역을 형성한다. 각 경쇄 또는 중쇄 가변 영역내에 상보성 결정 영역("CDR")이라 불리는 3개의 짧은 단편(평균 10개 아미노산 길이)이 있다. 항체 가변 도메인의 6개의 CDR(경쇄로부터 3개 및 중쇄로부터 3개)은 3차원 공간으로 함께 폴딩되어 표적 항원상으로 고정되는 실제 항체 결합 위치를 형성한다. CDR의 위치 및 길이는 정확하게 규정되었다. 문헌(Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987). CDR에 함유되지 않은 가변 영역의 부분을 CDR을 위한 환경을 형성하는 프레임워크라고 부른다.

단클론 항체(mAB)는 항체의 단일 분자 종이고, 따라서 항원을 동물(예를 들어 쥐과동물, 토끼 또는 염소)에 주사하고 동물로부터 혈청을 추출함에 의해 생성되는 다클론 항체를 포함하지 않는다. 인간화된 항체는 마우스 항체("제공자 항체", 이는 또한 래트, 햄스터 또는 다른 유사 종일 수 있다)로부터 CDR이 인간 항체("수용자 항체")상에 이식된 유전적으로 조작된 (단클론) 항체이다. 인간화된 항체는 또한 마우스 항체로부터의 완전한 CDR 보다 못한 것으로 제작될 수 있다(참조: Pascalis et al., J. hnmunol. 169:3076, 2002). 따라서, 인간화된 항체는 제공자 항체로부터의 CDR 및 인간 항체로부터의 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역을 가지는 항체이다. 따라서, 통상적으로 인간화된 항체는 (i) 마우스 항체, 예를 들어 L2G7로부터 3개의 CDR을 함유하는 경쇄, 인간 항체로부터의 가변 영역 프레임워크, 및 인간 불변 영역, 및 (ii) 마우스 항체, 예를 들어 L2G7로부터의 3개 CDR을 포함하는 중쇄, 인간 항체로부터의 가변 영역 프레임워크, 및 인간 불변 영역을 포함한다. 또한, 높은 결합 친화도를 보유하기 위하여 두개의 추가의 구조적 요소 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호를 참조할 수 있으며, 이들 각각은 참조로 본원에 통합되고 인간화된 항체의 제작에 대한 상세한 지시를 제공한다.

제 1 구조적 요소에서, 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크가, 많은 공지된 인간 항체 중에서 수용자 항체를 적절하게 선택함에 의해 제공자 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크와 최대 서열 동일성(65% 내지 95%)을 가지도록 선택된다. 서열 동일성은 비교되는 항체 서열이 카바트 넘버링 협정에 따라 정렬되었을 때 결정된다. 제 2 구조적 요소에서, 인간화된 항체를 제작함에 있어, 인간 수용자 항체의 프레임워크 (CDR 밖의)에서 선택된 아미노산은 특정화된 규율에 따라 제공자 항체로부터의 대응되는 아미노산으로 대체된다. 구체적으로, 프레임워크에서 대체되는 아미노산은 CDR과 상호작용하는 이들의 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 대체된 아미노산은 제공자 항체 서열에서 CDR에 인접할 수 있거나, 3차원 공간에서 측정되었을 때 인간화된 항체에서 CDR의 4-6 옹스트롱 내에 있을 수 있다.

키메라 항체는 마우스(또는 다른 설치류) 항체의 가변 영역이 인간 항체의 불변 영역과 조합된 항체이며, 유전자 조작에 의해 이들을 제작하는 것은 공지되어 있다. 이러한 항체는 약 3분의 2가 인간의 것인 동시에 마우스 항체의 결합 특이성을 보유한다. 마우스, 키메라, 인간화된 항체에 존재하는 비인간 서열의 비율은 키메라 항체의 면역원성이 마우스와 인간화된 항체의 중간이라는 것을 제시한다. 마우스 항체에 비해 감소된 면역원성을 지닐 수 있는 다른 타입의 유전적으로 조작된 항체는 파지 디스플레이 방법을 사용하거나(참조: Dower et al., WO91/17271; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, WO92/20791; and Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998, 이들 각각은 본원에 참조로 통합된다), 형질전환 동물을 이용하여 (참조: Lonberg et al., WO93/12227; Kucherlapati WO91/10741, 이는 본원에 참조로 통합된다) 만들어진 인간 항체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간-유사" 항체는 하나 또는 두 사슬 모두의 아미노산 서열의 실질적인 부분 (예를 들어, 약 50% 이상)이 인간 면역글로불린 유전자로부터 유래된 Mab를 의미한다. 이와 같이, 인간-유사 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체를 비제한적으로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "감소된 면역원성" 항체는 인간 환자에 투여되었을 때 마우스 항체 보다 상당히 적은 면역원성을 가지는 것으로 기대되는 것이다. 이러한 항체는 B 세포 또는 T 세포 에피토프에 기여할 수 있는 마우스 항체의 특정 아미노산, 예를 들어 노출된 잔기를 대체함에 의해 만들어진 항체 뿐만 아니라 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체를 포함한다(참조: Padlan, Mol. hnmunol. 28:489, 1991). 본원에 사용된 바와 같이, "유전적으로 조작된" 항체는 유전자가 재조합 DNA 기술의 도움으로 비천연 환경(즉, 마우스 내의 또는 박테리오파지상의 인간 유전자)에서 제작되거나 놓여진 것이고, 따라서 통상적인 하이브리도마 기술로 만들어진 마우스 mAb를 포함하지 않는다.

mAb의 에피토프는 mAb가 결합하는 이의 항원 영역이다. 두개의 항체가 각각 다른 항체가 항원에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우에 동일하거나 중복되는 에피토프에 결합한다. 즉, 1×, 5×, 10×, 20×, 또는 100× 과량의 하나의 항체가 나머지 항체의 결합을, 경쟁하는 항체가 결핍된 대조군에 비하여 경쟁적인 결합 검정에서 측정되었을 때, 50% 이상, 바람직하게는 75%, 90%, 또는 심지어 99% 억제한다(참조: Junghans et al., Cancer Res. 50: 1495, 1990, 이는 참조로 본원에 통합된다). 대안적으로 두개의 항체는, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 나머지 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우에 동일한 에피토프를 가진다. 두개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 나머지 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우에 중복 에피토프를 가진다.

2. 중화 항-HGF 항체

HGF와 결합하는 단클론 항체(mAb)(즉, 항-HGF mAb)는 결합이 HGF의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 억제하는 경우(즉, mAb가 하나의 제제로서 사용되는 경우에) HGF를 중화한다고 하거나 중화성이라고 한다. 중화 항체가 억제할 수 있는 HGF의 생물학적 특성으로는 HGF가 이의 cMet 수용체에 결합하는 능력, 마딘-다비 개과 신장(MDCK) 세포와 같은 특정 세포주의 분산을 야기하는 능력; 간세포, 4MBr-5 원숭이 상피 세포, 및 다양한 인간 종양 세포를 포함하는 특정 세포의 증식을 자극하는 능력(즉, 이들에 대해 미토겐성); 또는 예를 들어 닭 배아 융모막(chorioallantoic membrane)(CAM)에 적용된 경우에 혈관의 유도에 의해 또는 인간 혈관 상피 세포(HUVEC) 증식 또는 관 형성의 자극에 의해 측정되었을 때 혈관신생을 자극하는 능력이 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 인간 HGF, 즉, 수탁 번호 D90334를 가지는 진뱅크 서열에 엔코딩되는 단백질(참조로 통합됨)에 결합한다.

0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 또는 50 ㎍/㎖의 농도에서 본 발명의 중화 mAb는 실시예에 기재된 방법 또는 당 분야에 공지된 방법에 의해 검정되었을 때 HGF의 생물학적 기능(즉, 증식 또는 분산의 자극)을 약 50% 이상, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 또는 심지어 99%, 가장 바람직하게는 약 100% (본질적으로 완전하게) 억제할 것이다. 억제는 활성의 수준이 HGF가 결핍된 음성 대조군에 대한 오차 범위 내에 있는 경우에 완벽하다고 간주된다. 통상적으로 억제의 정도는 사용된 HGF의 양이 충분하여 생물학적 활성을 완전히 자극하거나, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3 또는 10㎍/㎖일 때에 측정된다. 바람직하게는, 적어도 50%, 75%, 90%, 또는 95% 또는 본질적으로 완벽한 억제는 항체 대 HGF의 몰 비가 0.5x, 1x, 2x, 3x, 5x, 또는 10x일 때에 달성될 것이다. 바람직하게는, mAb는 단일 제제로 사용되었을 때 중화성, 즉 생물학적 활성을 억제할 것이나, 가능한 2개의 mAb가 억제를 제공하기 위하여 함께 필요할 것이다. 가장 바람직하게는, mAb는 상기 기술된 생물학적 활성 중 하나가 아니라 수개를 중화할 것이고; 본원에서의 목적을 위하여, 단일 제제로서 사용되었을 때 HGF의 모든 생물학적 활성을 중화하는 항-HGF-mAb는 "완전 중화성"으로 일컬어지며, 이러한 mAb가 가장 바람직하다. 본 발명의 MAb는 바람직하게는 HGF에 특이적일 것인데, 즉, 이들은 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 HGF와 관련된 단백질에 결합하지 않거나 상당히 적은 정도로만 결합할 것이다(즉, 적어도 10배 더 적은 Ka). 바람직한 항체는 HGF에 대한 효능제 활성을 결여한다. 즉, 항체는 HGF를 가지는 세포를 직접 자극함 없이 HGF와 cMet와의 상호작용을 차단한다. 본 발명의 MAb는 통상적으로 적어도 10⁷ M^-1, 바람직하게는 10⁸M^-1 이상, 가장 바람직하게는 10⁹M^-1 이상, 또는 10¹⁰M^-1 이상의 HGF에 대한 결합 친화도(Ka)를 가진다.

본 발명의 MAb는 이들의 천연 사량체 형태로(2개의 경쇄 및 2개의 중쇄) 항-HGF 항체를 포함하고 공지된 이소타입 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 및 이들의 서브타입, 즉, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3 중 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 mAb는 또한 Fv, Fab, 및 F(ab')₂와 같은 항체의 단편; 이기능성 하이브리드 항체(e.q., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987), 단일 쇄 항체(Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); 및 변경된 불변 영역을 지닌 항체 (예: 미국 특허 번호 제5,624,821호)을 포함하는 것을 의미한다. mAb는 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 또는 닭)의 것일 수 있거나, 이들은 유전적으로 조작될 수 있다. 설치류 mAb는 적절한 애쥬번트 중의 HGF로 i.p., i.v., 또는 족저로 다중 면역화하고, 이어서 비장 또는 림프절 세포를 추출하고, 적절한 고정화 세포주와 융합한 후에 HGF에 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택하는 것을 포함하여(실시예 참조) 본 기술분야에 널리 공지된 표준 방법에 의해 제조된다. 상기 언급한 바와 같이 기술 분야에 공지된 방법에 의해 만들어진 키메라 mAb 및 인간화된 mAb는 본 발명의 바람직한 구체예이다. 인간 항체는 예를 들어 파지 디스플레이 또는 형질전환 마우스 방법에 의해 만들어지는 것이 또한 바람직하다(참조: Dower et al., McCafferty et al., Winter, Lonberg et al., Kucherlapati, supra). 보다 일반적으로, 본원에 정의된 인간-유사, 감소된 면역원성, 및 유전적으로 조작된 항체가 모두 바람직하다.

아래에 기술된 중화 항-HGF mAb L1H4, L2C7, 및 L2G7 mAb는 본 발명의 예이고, L2G7이 바람직한 예이다. 이들 mAb 중 어느 하나, 예를 들어 L2G7과 동일하거나 중복되는 에피토프를 가지는 중화 mAb가 다른 예를 제공한다. L2G7의 또는 LGF를 지닌 키메라 또는 인간화된 형태가 특히 바람직한 구체예이다. 본원에 기재된 적어도 하나 또는 바람직하게는 모든 시험관내 또는 생체내 검정에서 HGF에 결합하기 위하여 L2G7과 경쟁하고 HGF를 중화하는 mAb(키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체를 포함)가 또한 바람직하다. 아미노산 서열, 적어도 CDR에서 L2G7과 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 MAb(카바트 협약에 따른 항체 서열 정렬에 의해 결정됨)은 본 발명에 포함된다. 바람직하게는 이러한 항체는 소량의 기능적으로 무의미한 아미노산 치환(즉, 보존적 치환), 결실 또는 삽입에 의해 L2G7과 달라진다. 바람직하게는 이러한 항체는 L2G7의 기능적 특성을 보유한다, 즉, 이러한 항체는 적어도 하나의 및 바람직하게는 모든 본원에 기술된 시험관내 또는 생체내 검정에서 HGF를 중화한다. 보존적 또는 비보존적으로서 아미노산 치환을 분류할 목적으로, 아미노산은 다음과 같이 분류될 수 있다: 그룹 I (소수성 측쇄): 노르루신, met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III (산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V (잔기 영향 측쇄 배향): gly, pro; 및 그룹 VI (방향성 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류의 아미노산 사이의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 일원을 다른 부류의 일원으로 교환하는 것이다.

본 발명의 천연 mAb는 이들의 하이브리도마로부터 생성될 수 있다. 유전적으로 조작된 mAb, 예를 들어 키메라 Ab 또는 인간화된 mAb는 다양한 공지된 방법에 의해 발현될 수 있다. 예를 들어, 이들의 경쇄 및 중쇄 V 영역을 엔코딩하는 유전자는 중복 올리고누클레오티드로부터 합성될 수 있고 이용가능한 C 영역과 함께 필요한 조절 영역, 즉, 프로모터, 인핸서, 폴리 A 영역 등을 제공하는 발현 벡터(인비트로겐사로부터 구입 가능)로 삽입될 수 있다. CMV 프로모터-인핸서의 사용이 바람직하다. 발현 벡터는 다음에 리포펙션(lipofection) 또는 일렉트로포레이션과 같은 다양한 공지 방법을 사용하여 CHO와 같은 다양한 포유류 세포주 또는 Sp2/0 및 NS0를 포함하는 비생성 골수종내로 트랜스펙션되고, 적절한 항생물질 선택에 의해 항체를 생성하는 세포가 선택될 수 있다. 미국 특허 제5,530,101호를 참조할 수 있다. 보다 많은 양의 항체는 세포를 구입가능한 생물반응기에서 성장시킴에 의해 생성될 수 있다.

일단 발현되면, 본 발명의 mAb 또는 다른 항체는 미세여과, 한외여과, 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및, 또는 유기 염료 등에 기초한 다른 형태의 친화성 크로마토그래피와 같은 당분야의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다. 약제 용도로 약 90% 또는 95% 이상의 균질성을 가지는 실질적으로 순수한 항체가 바람직하고 98% 또는 99% 또는 그 이상의 균질성이 가장 바람직하다.

3. 치료적 방법

바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 기술된 항체를 포함하는 약제 제형을 제공한다. 즉, 항체는 질병의 치료를 위한 약제 제조에 사용될 수 있다. 항체의 약제 제형(즉, 의약)은 생리학적으로 허용되는 담체 중에 mAb를, 임의로 부형제 또는 안정화제와 함께, 동결건조 또는 수성 용액의 형태로 함유한다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 적용되는 용량 및 농도에서 수용자에 비독성이고, 인산염, 시트르산염, 또는 아세트산염과 같은 통상 pH 5.0 내지 8.0, 가장 흔하게는 6.0 내지 7.0의 완충액; 등장으로 만드는 염화나트륨, 염화칼륨 등과 같은 염; 항산화제, 보존제, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 폴리소르베이트 80와 같은 친수성 중합체, 아미노산, 탄화수소, 킬레이트화제, 당, 및 당업자에 공지된 다른 표준 성분(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980)을 포함한다. mAb는 통상 1-100㎎/㎖, 예를 들어 10㎎/㎖의 농도로 존재한다.

본 발명의 항체는 통상 요망되지 않는 오염물로부터 실질적으로 순수하다. 이는 항체가 통상 약 50% w/w(중량/중량) 이상 순수하다는 것 뿐만 아니라 간섭 단백질 및 오염물이 실질적으로 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 바람직하게는 항체는 적어도 90%, 95%, 또는 99%w/w 순수하다. 비경구 투여를 위한 약제 조성물은 통상 무균이고, 실질적으로 등장이고, FDA 또는 유사 기관의 우수 제조 실무에 따라 제조된다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 약제 제형에서 항-HGF mAb를 사용하여 질병을 가진 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 약제 제형으로 제조된 mAb는 임의의 적당한 경로, 특히 정맥내 주입 또는 볼루스 주입에 의해 비경구로, 근내로 또는 피하로 환자에 투여될 수 있다. 정맥내 주입은 15분과 같이 적은 시간에 걸쳐 주입되고 보다 종종 30분 동안 또는 1, 2 또는 심지어 3시간에 걸쳐 주입된다. mAb는 또한 질병 위치에 직접 주사되거나 (예를 들어, 종양) 리포좀과 같은 운반 제제로 캡슐화될 수 있다. 주어진 용량은 치료될 질환을 완화시키기에 충분할 것이고 ("치료적 유효량"), 0.1 내지 5㎎/kg 체중, 예를 들어 1, 2, 3, 또는 4㎎/kg일 것이나, 10㎎/kg 또는 심지어 15 또는 20㎎/kg와 같이 높을 수 있다. 고정된 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000㎎이 또한 투여될 수 있거나 용량은 환자의 표면적, 예를 들어 100㎎/m²에 기초할 수 있다. 통상 1 내지 8회 투여 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8회)가 암을 치료하도록 투여되나, 10회, 20회 또는 그 이상의 횟수로 투여될 수 있다. mAb는 예를 들어 1주, 2주, 4주, 8주, 3-6개월 이상 동안 mAb의 반감기에 따라 매일, 주 2회, 매주, 격주로, 매달 또는 다른 간격으로 투여될 수 있다. 장기 투여(chronic administration)와 같은 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 합병증 및 질병의 발병 과정의 중간 병리적 표현형을 포함하는 질병의 증상(생화학적, 조직학적 및/또는 임상학적)을 적어도 부분적으로 정지시키거나 완화시키는 용량 및 간격의 투약 계획이 치료적으로 유효한 투약 계획이다.

본 발명의 약제 조성물은 또한 암의 위험에 있는 환자의 예방에 사용될 수 있다. 이러한 환자는 암에 유전적 감수성을 가지는 환자, 방사선 또는 독소와 같은 발암성 제제에 노출되었던 환자, 이전에 암 치료를 받았고 재발의 위험이 있는 환자를 포함한다. 예방 용량은 질병의 생화학적, 조직학적 및/또는 임상적 증상, 이의 합병증, 및 질병의 발병 과정에서 나타나는 중간 병리적 표현형을 포함하는 질병의 위험을 제거하거나 감소시키거나, 중증도를 완화시키거나, 발병을 지연시키는 데 충분한 양이다. 이러한 목적 중 하나 이상을 달성하기에 유효한 간격 및 양으로 약제 조성물으로 투여하는 것을 예방적으로 유효한 투약계획이라고 한다.

본 발명의 항-HGF mAb를 이용한 치료에 특히 감수성인 질병은 HGF의 상승된 수준과 관련되거나 혈관 신생을 필요로 하는 것으로 의심되거나 공지된 고형 종양, 예를 들어 어린이 및 성인의 난소암, 유방암, 폐암(소세포 또는 비소세포), 결장암, 전립선암, 췌장암, 신장 암, 위암, 간암, 두경부 종양, 흑색종, 육종 및 뇌 종양(즉, 교아세포종)을 포함한다. 치료는 또한 백혈병 또는 림프종을 가지는 환자에 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-HGF mAb는 다른 항암 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어 항-HGF mAb는 종양학 분야의 당업자에게 공지된 임의의 하나 이상의 화학치료적 약물, 예를 들어 택솔(파클리탁셀) 또는 이의 유도체, 카르보플라틴 또는 시스플라틴과 같은 백금 화합물, 독소루비신과 같은 안트로사이클린, 시클로포스파미드와 같은 알킬화제, 5-플루오로우라실과 같은 항-대사물질 또는 에토포시드와 함께 투여될 수 있다. 항-HGF mAb는 표준 화학치료법에서 이러한 제제 중 둘, 셋 또는 그 이상과 조합하여 투여되는데, 예를 들어 유방암 및 난소암에 대하여 택솔 및 카르보플라틴이 함께 투여될 수 있다. 항-HGF mAb와 투여될 수 있는 다른 제제는 HER2 항원에 대한 헤르셉틴^TM, VEGF에 대한 아바스틴^TM, 또는 EGF 수용체에 대한 항체를 포함하는 단클론 항체와 같은 생물제제(biologics), 뿐만 아니라 소분자 항-신생혈관 또는 EGF 수용체 길항제 약물을 포함한다. 또한, 항-HGF mAb는 방사선 치료 또는 외과술과 함께 사용될 수 있다.

항-HGF mAb 항체를 포함하는 치료(예를 들어 표준 화학치료법)는 이러한 종양(예를 들어, 특히 재발되거나 난치성인 경우의, 난소, 유방, 폐, 췌장, 뇌 및 결장 종양)을 가진 환자의 병의 진행이 없는 생존 기간의 정중값 또는 총 생존 기간을 항-HGF mAb가 없는 것을 제외하고는 동일한 치료법(예를 들어 화학요법)에 비하여 30% 또는 40% 이상, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 또는 그 이상 증가시킬 수 있다. 또한, 대안적으로, 항-HGF mAb를 포함하는 치료(예를 들어, 표준 화학요법)은 이러한 종양을 가진 환자의 완전한 반응 속도, 부분적인 반응 속도 또는 객관적인 반응 속도(완전+부분)을 항-HGF mAb를 함유하지 않은 것을 제외하고는 동일한 치료법(예를 들어 화학요법)과 비교하여 30% 또는 40% 이상, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 증가시킬 수 있다. 선택적으로, 치료는 종양 침윤 또는 전이를 억제할 수 있다.

통상적으로 임상 시험(예를 들어 II상, II/III상 또는 III상 시험)에서, 앞서 언급된 환자의 병의 진행이 없는 생존 기간 정중값의 증가 및/또는 화학요법 + 항-HGF mAb로 치료된 환자의 반응 속도는 화학요법 단독 (또는 + 플라시보)을 받는 환자의 대조군에 비하여 예를 들어 p=0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준으로 통계적으로 유의할 것이다. 또한, 완전한 반응 속도 또는 부분적 반응 속도가 국립 암 기관(NCI) 및/또는 식품의약국(FDA)에 의해 마련되거나 용인된 암에 대한 임상 시험에서 공통으로 사용되는 객관적인 범주에 의해 결정된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.

4. 다른 방법

본 발명의 항-HGF mAB는 진단, 예후 및 실험 방법에서 용도를 가진다. 이들은 종양을 가진 환자의 혈류 또는 종양에서 HGF 수준을 측정하는데 사용될 수 있고, 따라서 종양의 치료를 추적하고 안내할 수 있다. 예를 들어 높은 수준의 HGF와 관련된 종양은 항-HGF mAb를 이용한 치료에 특히 감수성일 것이다. 특정 구체예에서, mAb는 ELISA 또는 방사선면역검정에서 사용되어, 예를 들어 종양 생검 표본 또는 혈청 또는 세포 배양물 중의 HGF-분비 세포의 배지 상청액에서 HGF의 수준을 측정할 수 있다. 상이한 에피토프에 결합하는(즉, 결합에 대해 경쟁하지 않는) 두개의 항-HGF mAb의 사용이 HGF를 검출하기 위한 민감한 "샌드위치" ELISA를 개발하는 데 특히 유용할 것이다. 다양한 검정을 위해서, mAb는 형광성 분자, 스핀-표지된 분자, 효소 또는 방사선동위원소로 표지될 수 있고 모든 필요한 시약을 가지는 키트의 형태로 제공되어 HGF 검정을 수행할 수 있다. 다른 용도에서, 항-HGF mAb는 예를 들어 친화성 크로마토그래피에 의해 HGF를 정제하는 데 사용될 것이다.

1. 항-HGF mAb의 생성

인간 HGF에 결합하여 이의 활성을 차단하는 mAb를 생성시키기 위해, 먼저 재조합 인간 HGF (rHGF)를 포유류 발현 시스템에서 생성시켰다. 재조합 인간 HGF (rHGF) 또는 rHGF-Flag 펩티드 (HGF의 c-말단에 부착된 Flag의 8개 아미노산 잔기)를 엔코딩하는 cDNA를 pIND-유도성 발현 벡터에서 작제하였다 (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:3346, 1996). 그 후, 이러한 cDNA를 퓨진(Fugene) 트랜스펙션 시약 (Roche)을 사용하여 EcR-293 인간 신장 섬유모세포 (Invitrogen)내로 트랜스펙션시켰다. 각각 HGF 및 HGF-Flag를 분비하는 안정한 세포주인 H1-F11 및 24.1를 600㎍/ml의 G418 및 400㎍/ml의 제오신(Zeocin) (Invitrogen)의 존재하에서 선택하였다. H1-F11 및 24.1을 글루타민 및 항생제를 함유하는 무혈청 DMEM에서 4일 내지 5일간 4μM의 포나스테론(Ponasterone) A (Invitrogen)로 처리함으로써 HGF 및 HGF-Flag를 분비하도록 유도시켰다. 응집체를 4℃에서 15,000rpm에서 30분간 원심분리에 의해 제거하고, 배양 상층액으로 분비된 HGF를 MW 50,000 컷오프(cutoff) 필터 [아미콘 센트리프렙(amicon Centriprep) YM-50 필터에 이은 마이크로콘(microcon) YM-50 필터 (Millipore)]를 지닌 막 한외여과 카트리지를 사용하여 약 100배 농축시켰다. 이렇게 농축된 H1F11 배양 상층액은 약 100㎍/ml의 HGF 및 약 120㎍/ml의 우혈청 알부민을 함유한다.

Balb/c 마우스를 MPL-TDM (Ribi Immunochem. Research)에 재현탁된 1 내지 2㎍의 정제된 rHGF (Pepro Tech) 또는 1 내지 2㎍의 rHGF 및 1 내지 2㎍의 BSA (농축된 H1-F11 배양 상층액)로 1주일 간격으로 각각의 뒷발 패드(pad)에 10회 넘게 면역화시켰다. 최종 부스트(boost) 후 3일째에, 슬와부(popliteal) 림프절 세포를 35% 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 뮤린 골수종 세포인 P3X63AgU.1 (ATCC CRL1597)과 융합시켰다. 하이브리도마를 문헌 [Chuntharapai and Kim, J. Immunol. 163:766, 1997; 이는 본원에 참조로 포함되어 있음]에 기재된 바와 같이 HAT 배지에서 선택하였다. 융합 후 10일째에, 하이브리도마 배양 상층액을 직접 HGF 결합 ELISA 뿐만 아니라 HGF-Flag 포획 ELISA에서 스크리닝하였다. 후자의 검정을 사용함으로써 직접 HGF 결합 ELISA를 사용하여 선택된 항-HGF mAb의 특이성을 추가로 확인하고, 용액상에서 HGF에 결합할 수 있는 mAb를 선택하였다. 그 후, 선택된 mAb의 차단 활성을 문헌 [Jeffers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14417, 1998]에 기재된 바와 같이 HGF-Flag/cMet-Fc 결합 ELISA 및 MDCK 분산(scatter) 검정으로 측정하였다. 선택된 하이브리도마를 제한 희석 기술을 이용하여 2회 클로닝하였다. mAb의 이소타입을 이소타입분석 키트 (Zymed)를 사용하여 결정하였다. 선택된 mAb의 복수(ascites)를 생성시키고, 이뮤노퓨어(ImmunoPure) (A/G) IgG 정제 키트 (Pierce)를 사용하여 정제하였다. 또한, 바이오티닐화된 mAb를 피어스(Pierce)에 의해 제공된 지시사항에 따라 EZ-설포-NHS-LC-바이오틴을 사용하여 제조하였다. 본원에 언급된 각각의 검정은 하기에 보다 상세히 설명된다. 직접 HGF 결합 ELISA를 위해, 미세역가 플레이트 (Maxisorb; Nunc)를 1:2 비의 HGF/PBS로 PBS에 희석된 50㎕/웰의 rHGF 함유 H-F11 배양 상층액으로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 세척한 후, 비특이적 결합 부위를 실온(RT)에서 1시간 동안 2% 탈지유(skim milk)를 함유하는 PBS를 사용하여 차단시켰다. 플레이트를 세척한 후, 50㎕/웰의 정제된 mAb 또는 하이브리도마 배양 상층액을 1시간 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 세척한 후, 플레이트를 50㎕/웰의 1㎕/ml의 HRP-염소 항-마우스 IgG (HRP-GαMIgG, Cappel)와 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 결합된 HRP-GαMIgG를 테트라메틸벤지딘 기질 (Sigma)를 첨가하여 검출하였다. 반응을 1N H₂SO₄를 첨가하여 중지시킨 후, 플레이트를 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 판독하였다. 세척을 세척 완충액 (0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS)으로 3회 수행하였다.

HGF-Flag 포획 ELISA를 위해, 미세역가 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중의 50㎕/웰의 2㎕/ml의 마우스 IgG의 Fc 부분에 특이적인 염소 항체 (GαMIgG-Fc)로 코팅시키고, 실온에서 1시간 동안 2% 탈지유를 사용하여 차단시켰다. 세척 후, 플레이트를 50㎕/웰의 정제된 mAb 또는 하이브리도마 배양 상층액과 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 플레이트를 50㎕/웰의 rHGF-Flag 함유 24.1 세포 배양 상층액과 인큐베이션시켰다. 세척 후, 플레이트를 15㎍/ml의 뮤린 IgG의 존재하에서 50㎕/웰의 HRP-M2 항-Flag mAb (Invitrogen)와 인큐베이션시켰다. 결합된 HRP-항-Flag M2를 상기 기재된 바와 같이 기질을 첨가하여 검출하였다. 세척을 세척 완충액으로 3회 수행하였다.

상기 기재된 바와 같이 Balb/c 마우스를 농축된 H1-F11 배양 상층액 중의 rHGF로 면역화시킴으로써 생성된 하이브리도마로부터 수득된 L1H4, L2C7 및 L2G7로 명명되는 3개 이상의 mAb는 직접 rHGF 결합 ELISA 및 HGF-Flag 포획 ELISA 둘 모두 에서 결합을 나타내었고, 추가의 실험을 위해 선택되었다. 그 후, 이러한 하이브리도마를 2회 클로닝하고, 복수를 표준 방법에 의해 마우스에서 생성시키고, mAb를 단백질 G/A 컬럼을 사용하여 정제하였다. 이들의 이소타입을 이소타입분석 키트 (Zymed Lab)를 사용하여 결정하였다. L2G7 하이브리도마를 2003년 4월 29일에 부다페스트 조약에 따라 ATCC 번호 PTA-5162로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108)에 기탁하였다. 이러한 기탁물은 기탁 기관에서 보존될 것이고, 가장 최근의 샘플 분양 요청이 기탁 기관에 의해 접수된 후 5년 이상의 기간 동안, 수탁일 후에 30년 이상의 기간 동안, 또는 관련 특허의 존속기간 동안 (이 중에서 늦은 때) 변이, 생존불능(nonviability) 또는 파괴시에 대체될 것이다. 이러한 세포주의 공중에 대한 이용가능성에 관한 모든 제한은 본원의 특허결정시 취소불가능하게 없어질 것이다.

시험관내에서 HGF를 중화시키고/거나 생체내에서 종양 성장을 억제 (예를 들어, 완전히 억제)하는 본원에 기재된 요망되는 특성을 지닌 하나의 아키타입(archtype) 항-인간-HGF mAb, 예를 들어 L2G7이 단리된 경우, 당 분야에 공지된 방법에 의해 유사한 특성을 지닌 다른 mAb를 생성시키는 것은 간단하다. 예를 들어, 마우스를 상기 기재된 바와 같이 HGF로 면역화시키고, 하이브리도마를 생성시키고, 생성된 mAb를 HGF에 결합하는 것에 대해 아키타입 mAb와 경합하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 또한, 본원에 참조로 포함되어 있는 제스퍼스(Jespers) 등의 문헌 [Biotechnology 12:899, 1994]에 기재된 방법을 사용하여 동일한 에피토프를 지녀서 아카타입 mAb, 예를 들어 L2G7과 유사한 특성을 지니는 mAb를 선택하도록 할 수 있다. 파지 디스플레이를 사용하는 경우, 먼저 아키타입 항체의 중쇄를 (바람직하게는 인간) 경쇄의 레퍼토리와 쌍을 형성하게 하여 HGF-결합 mAb를 선택한 후, 새로운 경쇄를 (바람직하게는 인간) 중쇄의 레퍼토리와 쌍을 형성하게 하여 아키타입 mAb와 동일한 에피토프를 지닌 (바람직하게는 인간) HGF-결합 mAb를 선택한다.

2. 시험관내에서의 항-HGF mAb의 특성화

항체의 결합 에피토프를, 100배 과량의 표지화되지 않은 mAb를 HGF 결합 ELISA에서 동일하거나 또 다른 바이오티닐화된 mAb의 결합과 경합시키기 위해 사용하는 경합 결합 ELISA에 의해 부분적으로 특성화하였다. 도 4는 항-HGF mAb, L1H4 및 L2G7의 결합이 단지 이들 자체에 의해 억제됨을 도시하며, 이는 이들이 독특한 에피토프를 인식함을 암시한다. L2C7의 결합은 L1H4가 아니라 L2G7에 의해 억제되었다. 이는 L2C7 에피토프가 L1H4의 에피토프가 아닌 L2G7의 에피토프와 오버랩됨을 암시한다. 그러나, L2C7은 L2G7의 결합을 억제할 수 없는데, 이는 L2C7 및 L2G7 에피토프가 오버랩되지만 구별되는 것이고/이거나 L2C7의 친화성이 L2G7의 친화성 보다 훨씬 낮음을 암시한다. L1H4, L2C7 및 L2G7의 에피토프는 각각 A, B 및 C로 명명된다.

3개의 항-HGF mAb의 상대적 결합 능력을 rHGF가 먼저 플레이트에 결합되는 직접 HGF 결합 ELISA에서 정제된 항체를 사용하여 측정하였다. 이러한 검정에서, L2C7 및 L2G7은 L1H4 보다 더 잘 결합하였다 (도 5). 용액중에서 rHGF-Flag와 결합하는 mAb의 능력을 HGF-Flag 포획 ELISA를 사용하여 또한 측정하였다. 모든 3개 의 mAb는 용액상에서 rHGF-Flag를 포획할 수 있지만, mAb L2G7이 다른 것들 보다 효과적이었다 (도 6). 이러한 결과는 mAb L2G7이 3개의 mAb 중에서 HGF에 대해 가장 높은 결합 친화성을 지님을 암시한다.

HGF의 생물학적 활성 중의 하나는 이것의 수용체인 cMet에 결합하는 능력이며, 따라서 HGF가 cMET에 결합하는 것을 억제하는 항-HGF mAb의 능력을 검정하였다. 이러한 검정을 위해, 인간 섬유모세포 293 세포를 pDisplay 발현 벡터 (Invitrogen) 중에서 마크(Mark) 등의 문헌 [J. Biol. Chem. 267:26166, 1992]에 기재된 바와 같이 인간 IgG1의 Fc 부분 (잔기 216 내지 446)과 결합된 cMet의 잔기 1-929 ECD를 엔코딩하는 cDNA로 트랜스펙션시킴으로써 먼저 cMet-Fc를 생성시켰다. 미세역가 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중의 50㎕/웰의 2㎍/ml의 인간 IgG의 Fc 부분에 특이적인 염소 항체 (GαHIgG-Fc)로 코팅시키고, 2% BSA를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 세척한 후, cMet-Fc cDNA로 트랜스펙션된 293의 배양 상층액 50㎕를 각각의 웰에 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 다양한 농도의 mAb와 사전 인큐베이션된 50㎕/웰의 rHGF-Flag 함유 24.1 세포 상층액을 각각의 웰에 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후, 플레이트를 50㎕/웰의 HRP-M2 항-Flag mAb (Invitrogen)와 인큐베이션시켰다. 결합된 HRP-항-Flag M2를 상기 기재된 바와 같이 기질을 첨가하여 검출하였다. 세척을 세척 완충액으로 3회 수행하였다.

이러한 HGF-Flag/cMet-Fc 결합 억제 검정에서, 모든 3개의 mAb는 어느 정도의 억제를 나타내었지만, Ig 대조 항체는 그렇지 못했다 (도 7). 1㎍/ml 이상의 mAb L2G7 및 50㎍/ml의 mAb L1H4는 rHGF-Flag가 cMet-Fc에 결합하는 것을 완전히 제거하였고, 50㎍/ml의 mAb L2C7은 단지 85% 억제를 나타내었다. 그러므로, mAb L2G7은 rHGF-Flag와 cMet-Fc의 상호작용 (그 결과로써, 아마도 HGF와 이의 수용체 cMet의 상호작용)을 억제하는 데에 있어서 다른 항체 보다 훨씬 더 효능이 있었고, 이는 HGF에 대한 이의 추정적으로 높은 친화성과 일치한다.

cMet-Fc/HGF-Flag 결합 ELISA에 사용된 수용체 단백질이 가용성 수용체 단백질이므로, 이의 입체형태는 천연 막 결합된 수용체의 입체형태와 상이할 수 있다. 또한, HGF는 cMet 이외에 HSPG에 결합하고, HSPG-HGF 상호작용은 다양한 HGF 활성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, HGF와 가용성 cMet의 상호작용을 차단하는 mAb는 반드시 세포상에서의 HGF 생체활성을 중화시키는 능력을 지니는 것은 아닐 수 있다. 따라서, 선택된 생물학적 시스템에서 mAb의 차단 활성을 추가로 확인하는 것이 중요하다. HGF는 효능있는 분산 인자인 것으로 공지되어 있다. 따라서, 항-HGF mAb의 중화 활성은 또한 문헌 [Jeffers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14417, 1998]에 기재된 바와 같이 마딘-다비(Madin-Darby) 개과동물 신장 (ATCC로부터 수득된 MDCK 세포)을 사용하여 측정하였다. 5% FCS가 보충된 DMEM에서 성장된 MDCK 세포를 5% FCS가 함유된 DMEM중에서 mAb와 함께 또는 mAb 없이 소정 농도의 rHGF의 존재하에서 10³ 세포/100㎕/웰로 플레이팅하였다. 37℃에서 5% CO₂에서 2일 인큐베이션한 후, 세포를 PBS에서 세척하고, 실온에서 10분간 2% 포름알데히드에서 고정시켰다. PBS에서 세척한 후, 세포를 실온에서 10분간 50% 에탄올 중의 0.5% 크리스탈 바이올렛 (v/v)으로 염색하였다. 분산 활성을 현미경 검사에 의해 측정하였다.

상기 기재된 HGF를 분비하는 H1-F11 클론의 배양 상층액을 분산 검정에서 HGF의 공급원으로서 사용하였다. H1-F11 배양 상층액의 1:80만큼 작은 희석액이 MDCK 세포의 분산 및 성장을 유도하였다. 그러나, 분산 검정은 H1-F11 배양 상층액의 1:20 희석액 (약 3㎍/ml)을 사용하여 수행하였다. 1:5 몰비의 HGF/mAb에서도 mAb L2G7은 MDCK의 HGF 유도된 분산을 단독으로 억제하였고 (도 8), 이는 mAb L2G7이 실제로 중화 mAb임을 결정적으로 나타낸다. 또한, 20㎍/ml 이상의 mAb L1H4는 HGF에 의해 유도된 MDCK의 분산을 중화시킬 수 있고, 20㎍/ml의 mAb L2C7은 단지 부분적인 중화 활성을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).

상기 검정에서 측정된 3개의 항-HGF 항체의 다양한 특성을 하기 표 1에 요약하였다.

표 1. HGF에 대한 mAb의 특성화

mAb	이소타입	결합 에피토프	HGF/cMet-Fc 결합 차단	MDCK 분산 차단
L1H4	G1, κ	A	약한 차단	+
L2C7	G2b, κ	B	부분적 차단	+/-
L2G7	G2a, κ	C	강한 차단	+++

HGF는 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 헤파린 결합 성장 인자 패밀리의 일원이다. 또한, HGF는 플라스미노겐과 약 40%의 전체 서열 유사성을 지니며 (Nakamura et al., Nature. 342:440, 1989), 대식구 자극 단백질과 유사한 도메인 구조를 공유한다 (MSF, Wang et al., Scand. J. Immunol. 56:545, 2002). 따라서, 항-HGF 항체의 결합 특이성이 측정되어야 한다. 항-HGF mAb가 이러한 HGF 관련 단백질 (R&D 시스템즈(systems)로부터 입수가능함)에 결합하는 것은 상기 기재된 HGF에 대한 직접 결합 ELISA와 유사한 직접 결합 ELISA를 이용하여 검정된다. mAb L2G7, mAb L2C7 및 mAb L1H4는 이들 단백질과 유의 수준으로 결합하지 않으며, 이는 HGF에 대한 이들의 특이성을 입증한다.

3. HGF의 종양-촉진 생물학적 활성을 억제하는 항-HGF MAb의 능력

HGF는 특정 사람 종양의 성장 및 침입성에서 역할을 담당할 수 있도록 하는 다수의 생물학적 활성을 지닌다. HGF의 그러한 한 활성은 간세포 및 다른 상피 세포에 대한 강력한 미토겐으로서의 활성이다 (Rubin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:415, 1991). 따라서, 항-HGF mAb의 중화 활성을 추가로 입증하기 위하여, 4MBr-5 원숭이 상피 세포(ATCC) 또는 래트 간세포의 HGF-유도된 증식에 대한 mAb의 효과를 측정한다. 간세포를 문헌[Garrison and Haynes, J. Biol. Chem. 269:4264, 1985]에 개시된 방법에 따라 분리한다. 세포를 5% FCS를 함유하는 DMEM에 5 x 10⁴ 세포/ml의 농도로 재현탁시키고, 다양한 농도의 mAb를 지니는 소정 농도의 HGF로 자극한다. 5% CO₂ 중 37℃에서 2½일 동안 인큐베이션시킨 후, 세포 증식의 레벨을 ³H-티미딘을 첨가하여 4시간 동안 측정한다. 세포를 자동화 세포 수확기를 이용하여 수확하고 혼입된 ³H-티미딘의 레벨을 섬광 계수기상에서 측정한다. 충분한 농도에서, mAb L2G7은 세포의 HGF-유도된 증식을 대부분 또는 완전히 억제할 수 있고, mAb L2C7 및 L1H4는 적어도 부분적으로 증식을 억제할 수 있다. 이러한 항체는 또한 다른 상피 세포주의 HGF-유도된 증식을 억제할 수 있다.

예를 들어, 밍크 폐 Mv 1 Lu 세포의 HGF-유도된 증식에 대한 L2G7의 억제 활성을 측정하였다 (Borset et al., J. Immunol. Methods 189:59, 1996). 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 성장한 세포를 EDTA/트리신으로 처리하여 수확한다. 세척 후, 세포를 소정 농도 (50 ng/ml)의 HGF +/- 다양한 농도의 mAb를 지니는 무혈청 DMEM에 5 x 10⁴ 세포/ml의 농도로 재현탁시킨다. 5% CO₂ 중 37℃에서 1일 동안 인큐베이션시킨 후, 세포 증식의 레벨을 1μCi의 ³H-티미딘을 추가로 24시간 동안 첨가시켜 측정한다. 세포를 자동화 세포 수확기를 이용하여 유리-섬유 필터 위에 수확하고, 혼입된 ³H-티미딘의 레벨을 섬광 계수기상에서 측정한다. 도 9는 100배 더 높은 몰 농도의 L2G7 mAb의 첨가가 Mv 1 Lu 세포의 증식 반응을 완전히 억제하였음을 나타낸다. 실제로, L2G7은 HGF에 대해 심지어 3배 몰 비에서 완전한 억제를 나타낸 반면, 대조군 IgG는 100배 몰 과량에서조차 억제를 나타내지 않았다.

HGF는 또한 효능 있는 혈관형성 인자로서 보고되었으며 (Bussolino et al., J. Cell Biol. 119:629, 1992; Cherrington et al., Adv. Cancer Res. 79:1, 2000), 혈관형성, 즉, 신규한 혈관의 형성은 종양의 성장에 필수적인 것으로 여겨진다. 따라서, HGF의 혈관형성 특성을 억제하는 항-HGF mAb의 능력은 하기 세 가지 검정에서 나타난다: (i) 사람 혈관 내피 세포(HUVEC)의 증식, (ii) HUVEC의 관 형성, 및 (iii) 닭 배아 융모막요막 (CAM) 상에서 신규한 혈관의 발달. HGF가 혈관형성에서 VEGF와 상승작용을 하는 것으로 나타났기 때문에 (Xin et al., Am. J. Pathol. 158:1111, 2001), 상기 검정들은 VEGF의 존재 및 부재하에 수행될 수 있다.

HUVEC 증식 검정을 변형을 가하며 공지된 바와 같이 수행한다 (Conn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1323, 1990). 클로네틱스(Clonetics)로부터 수득한 HUVEC 세포를 클로네틱스가 제공하는 10% FCS 및 내피 세포 성장 보충물을 함유하는 내피 성장 배지 (EBM-2)에서 성장시킨다. 4 내지 7 계대의 세포를 본 연구에 이용하는 것이 바람직하다. 세포를 항생제, 10 mM HEPES 및 10% FCS를 함유하는 배지-199 (검정 배지)에서 10⁵ 세포/ml가 되도록 재현탁시킨다. HUVEC 세포 (50 ㎕/웰)를 다양한 농도의 항-HGF mAb와 함께 적합한 농도의 HGF를 함유하는 마이크로역가 웰에 1시간 동안 37℃에서 첨가한다. 세포를 5% CO₂ 중 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 세포 증식의 레벨을 ³H-티미딘을 4시간 동안 혼입시켜 측정한다. 충분한 농도에서, mAb L2G7은 HUVEC의 HGF-유도된 증식을 대부분 또는 완전히 억제할 것이고, mAb L2C7 및 L1H4는 적어도 부분적으로 증식을 억제할 수 있다.

대안적으로, 세포 증식의 레벨을 널리 공지된 비색 MTT 검정에 의해 측정할 수 있다. HUVEC (10⁴ 세포/100 ㎕/웰)를 무혈청 배지에서 24시간 동안 성장시킨 다음, 다양한 농도의 mAb L2G7과 함께 100 ㎕의 50 ng/ml HGF (부최적량으로 미리 결정됨)를 이용하여 72시간 동안 인큐베이션한다. MTT 용액 (5 mg/ml)을 각 웰 (20 ㎕/200 ㎕ 배지)에 4시간 동안 첨가한다. 이후, 100 ㎕ 배지/웰을 제거하고, 100 ㎕/웰의 산화된 이소프로필 알코올 (이소프로필 중 0.04N HCl)과 혼합시킨다. 플레이트를 560 nm에서 ELISA 리더 상에서 판독한다. 최대 반응%를 하기와 같이 산출한다: [HGF의 OD + mAB 처리된 세포 - 비처리된 세포의 OD]/[HGF 처리된 세포의 OD - 비처리된 세포의 OD] x 100. 도 10은 심지어 2배 몰 과량의 L2G7 mAB가 HGF에 반응하여 HUVEC의 증식을 대부분 차단함을 나타낸다.

내피관 검정을 문헌[Matsumura et al., J. Immunol. 158:3408, 2001; Xin et al., Am. J. Pathol. 158:1111, 2001]에 본질적으로 개시된 대로 수행한다. 4-7 계대의 HUVEC (클로네틱스)를 10% FBS 및 내피 세포 성장 보충물이 추가된 클로네틱스 EGM 배지에서 성장시킨다. 플레이트를 제조자의 지시에 따라 37℃에서 30분 동안 마트리겔 (Matrigel, BD Biosciences)로 코팅하고, 세포를 HGF 및 다양한 농도의 항-HGF mAb를 지니는 1 x 기본 배지에 3 x 10⁶ 세포/ml로서 시딩한다. 관 형성을 저-출력 (10x) 배율에서 현미경으로 평가한다. 충분한 농도에서, mAb L2G7은 HGF-유도된 내피관 형성을 대부분 또는 완전히 억제할 것이고, mAb L2C7 및 L1H4는 적어도 부분적으로 이를 억제할 수 있다.

닭 배아 융모막 (CAM) 검정을 문헌[Kim et al., Nature 362:841, 1992]에 본질적으로 개시된 대로 수행한다. 3일령의 닭 배아를 이들의 쉘(shell)로부터 분리하고 37℃에서 5% CO₂ 중 페트리 디시에서 성장시킨다. 7일 후에, 다양한 농도의 항-HGF mAb와 함께 HGF를 함유하는 건조된 메틸셀룰로오스 디스크를 CAM 위에 쌓는다. 메틸셀룰로오스 디스크는 PBS 중 5 ㎕의 1.5% 메틸셀룰로오스를 mAb와 함께 미리 인큐베이션된 5 ㎕의 HGF와 혼합시킴에 의해 제조된다. 3일 후 메틸셀룰로오스 디스크 주위에서 혈관의 발달을 조사한다. 충분한 농도에서, mAb L2G7은 상기 혈관 형성을 대부분 또는 완전히 억제할 것이고, mAb L2C7 및 L1H4는 적어도 부분적으로 억제할 수 있다.

HGF는 또한 종양 성장을 촉진시키는 것으로 보고되어 있다 (Comoglio and Trusolino, J. Clin. Invest. 109-857, 2002). 상기 활성을 억제하는 항-HGF 항체의 능력은 2단계로 나타난다. 먼저, HGF가 종양 세포 중 몇몇에 대한 오토크린 성장 인자일 수 있으므로, 다수의 종양 세포주를, HGF를 분비하고 HGF와 반응하여 증식하는 이들의 능력에 대해 조사한다. 상기 세포주는 HGF 및 cMet를 발현하는 것으로 공지된 사람 종양 세포주의 패널을 포함한다 (Koochekpour et al., Cancer Res. 57:5391, 1997; Wang et al., J. Cell Biol. 153:1023, 2001). 시험하려는 특정 세포주로는 U-118 신경아교종, HCT116 결장 암종, A549 폐 암종 및 A431 편평세포(epidermoid) 암종 세포가 있으며, 이들 모두는 ATCC로부터 이용가능하다. 일단 그러한 종양 세포주를 동정하면, 상기 세포의 HGF에 대한 증식 반응에 대한 항-HGF mAb의 효과를 상기 기술된 것과 유사한 방법을 이용하여 측정한다. 충분한 농도에서, mAb L2G7은 다수의 상기 세포주 또는 상기 세포주 모두의 HGF-유도된 증식을 대부분 또는 완전히 억제할 것이고, mAb L2C7 및 L1H4는 적어도 부분적으로 증식을 억제할 수 있다.

예를 들어, 사람 HCT116 종양 세포를 200 ㎕의 DMEM 및 5% FCS에서 5 x 10³ 세포/웰로 96-웰 마이크로역가 플레이트에 시딩한다. 5% CO₂ 중 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 PBS로 세척하고 무혈청 DMEM에서 48시간 동안 인큐베이션시킨다. 이후, 세포를 DMEM 중 100 ng/ml의 HGF +/- 20 ㎍/ml의 mAb와 함께 추가로 20시간 동안 인큐베이션한다. 대조군으로서, DMEM 단독 또는 DMEM 및 10% FCS에서 성장시킨 세포가 포함된다. 인큐베이션의 종료시에, 세포 증식의 레벨을 ³H-티미딘을 4시간 동안 혼입시켜 측정한다. 3회 수행된 상기 실험의 결과를 도 11에 도시한다. HGF는 HCT116 세포의 보통의 증식을 유도하였고, 이것은 L2G7 항체의 첨가에 의해 완전히 억제되었다 (덜 유효한 L1H4 항체에 의해서는 그렇지 않음).

상기 기술된 모든 검정에서, 각 항-HGF 항체는 HGF의 다른 길항제 없이 단독으로 사용되는 경우, 즉 단일 제제인 경우, 활성을 중화시키거나 억제할 것이나, 다른 항-HGF 항체 또는 다른 활성제와 함께 항체를 투여함에 의해 추가 효과 또는 상승 효과가 달성될 수 있다.

4. 생체내에서 종양 성장을 억제하는 항-HGF mAb의 능력

사람 종양 성장을 억제하는 항-HGF 항체의 능력은 면역결핍 마우스 또는 래트와 같은 다른 설취류 이종이식 모델에서 입증된다. 예시적이나 제한적이지 않은, 사용될 수 있는 마우스의 면역결핍 계통(strain)의 예로는 CD-1 누드, Nu/Nu, Balb/c 누드, NIH-III (NIH-bg-nu-xid BR)와 같은 누드 마우스; Fox Chase SCID (C.B-17 SCID), Fox Chase outbred SCID 및 SICD Beige와 같은 scid 마우스; RAG 효소가 결핍된 마우스; 뿐만 아니라 누드 래트가 있다. 실험을 앞서 기술된 대로 수행한다 (Kim et al., Nature 362:841, 1992, 본원에 참조로서 포함된다). 완전 DMEM 배지에서 성장시킨 사람 종양 세포를 HBSS에서 수확한다. 암컷 면역결핍, 예컨대 가슴샘없는 누드 마우스 (4-6 주령)의 등쪽(dorsal) 영역에 0.2 ml의 HBSS 중 통상적으로 5 x 10⁶ 세포를 s.c. 주사한다. 종양 크기가 50 내지 100 mm³에 도달하면, 마우스를 무작위로 분류하고 적합한 양의 항-HGF 및 대조군 mAb (통상적으로 0.1 내지 1.0 mg, 예컨대 0.5 mg)를 예컨대 1, 2, 3 또는 4주 또는 실험 지속기간 동안 예컨대 0.1 ml의 부피로 매주 1회, 2회 또는 3회 i.p. 투여한다. 종양 크기는 두 치수 [길이(a) 및 너비(b)]를 측정함에 의해 통상적으로 1주일에 2회 측정된다. 종양 부피는 V = ab²/2에 따라 산출되며, 평균 종양 부피±SEM으로 표시된다. 각 처리군의 마우스의 수는 3마리 이상이며, 보다 종종 5 내지 10마리, 예컨대 7마리이다. 예컨대 스튜던트 t 시험을 이용하여 통계적 분석을 수행할 수 있다. 상기 실험의 변형에서, 항체의 투여는 종양 세포의 주사와 동시에 또는 직후에 개시된다. 항체의 효과는 또한 마우스의 생존 연장 또는 마우스 생존율의 증가에 의해 측정될 수 있다.

HGF를 분비하거나 이와 반응하는 것으로 공지된 다양한 종양 세포주, 예를 들어 U118 사람 교아세포종 세포 및/또는 HCT116 사람 결장 종양 세포가 별개의 실험에 사용된다. 단일 제제로서 사용될 때, 본 발명의 바람직한 항체, 예컨대 사람-유사 및 감소된-면역원성 항체 및 L2G7 항체 및 이의 키메라 및 사람화된 형태 및 L2G7과 동일한 에피토프를 지니는 항체가 종양 성장을 25% 이상, 가능하게는 40% 또는 50%, 및 75% 또는 90% 이상까지도 억제하거나, 심지어 얼마간의 기간 이후 종양 성장을 완전히 억제하거나 종양 퇴행 또는 소멸을 야기할 것이다. 이러한 억제는 NIH III Beige/누드와 같은 하나 이상의 마우스 계통에서 적어도 U118과 같은 종양 세포주에 대해 일어날 것이나, 바람직하게는 주사된 항체에 대해 중화 항체 반응을 생성하지 않는 하나 이상의 면역결핍 마우스 계통에서 시험하는 경우, 심지어 특정 (예컨대, 신경아교종) 또는 임의 유형의 HGF-발현 종양 세포주 중 2개, 3개, 수개, 다수, 또는 본질적으로 모두에서 일어날 것이다. 이종이식 모델 중 하나 이상에서 몇몇 바람직한 항체를 이용한 치료는 이러한 치료가 없었다면 종양의 성장으로 인해 죽거나 희생시킬 필요가 있었던 마우스의 50%, 75%, 90% 또는 심지어 본질적으로 모든 마우스의 무기한 생존을 초래한다.

예를 들어, 상기 실험은 FCS를 지니는 DMEM 배지에서 성장되고 HBSS에서 수확된 U-118 교아세포종 세포를 이용하여 수행되었다. 암컷 NIH III Beige/누드 마우스 (4-6 주령)의 등쪽 영역에 0.2 ml의 HBSS 중 10⁶ 세포를 s.c. 주사한다. 종양 크기가 ~50 mm³에 도달하면, 마우스를 각 그룹이 6마리 마우스로 구성된 2개의 그룹으로 무작위로 분류하고 200 ㎍의 L2G7 mAb (처리군) 또는 PBS (대조군)를 0.1 ml의 부피로 1주일에 2회 i.p. 제공한다. 종양 크기를 상기 기술된 대로 1주일에 2회 측정한다. 실험 종료시에, 종양을 절제하여 칭량한다. 도 12는 L2G7을 이용한 치료가 종양 성장을 완전히 억제하였음을 나타낸다.

유사한 종양 억제 실험을 문헌[Ashkenize et al., J. Clin. Invest. 104:155, 1999]에 기술된 대로, 종양 유형이 반응성일 것으로 예상되는 5-FU (5-플루오로우라실) 또는 CPT-11 (캄프토사르)와 같은 하나 이상의 화학치료제와 조합하여 항-HGF 항체를 투여함에 의해 수행한다. 항체와 화학치료제의 조합은 단독의 작용제 보다 큰 종양 성장의 억제를 제공할 수 있다. 효과는 상가적이거나 상승적일 수 있으며, 성장을 예컨대 80% 또는 90% 이상 강하게 억제하거나, 심지어 종양 퇴행 또는 소멸을 야기할 수 있다. 또한 항-HGF 항체는 또 다른 성장 또는 혈관형성 인자에 대한 항체, 예를 들어 항-VEGF와 조합하여 투여될 수 있고, 상가적이거나 상승적인 성장 억제 및/또는 종양 퇴행 또는 소멸이 예상된다.

본 발명은 제시된 바람직한 구체예를 참조로 기술되었으나, 본 발명을 벗어나지 않으며 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다. 본문으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본 발명의 임의의 단계, 엘리먼트, 구체예, 특징 또는 측면이 다르게 이용될 수 있다.

인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원의 전체 내용이, 개개의 각 공개문헌, 특허 및 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로서 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 지적된 것 처럼, 모든 목적을 위해 동일한 한도까지 본원에 참조로서 포함된다.

Claims

인간 간세포 성장 인자(HGF)에 결합하는 것에 대해 하이브리도마 ATCC 번호 PTA-5162에 의해 생성된 항체 L2G7과 경합하며, 단일 제제(single agent)로서 상기 HGF를 중화시키고 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제하는, 키메라, 인간화된 또는 인간 단클론 항체(mAb).
제 1 항에 있어서, 키메라임을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 1 항에 있어서, 인간화됨을 특징으로 하는 단클론 항체.
삭제
제 1 항에 있어서, HGF가 cMet에 결합하는 것을 50% 이상 억제함을 특징으로 하는 단클론 항체.
삭제
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제 1 항에 있어서, HGF-유도된 혈관신생을 억제함을 특징으로 하는 단클론 항체.
삭제
삭제
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제 1 항에 있어서, Fab 또는 F(ab')₂ 단편 또는 단일 쇄 항체임을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 1 항에 있어서, 10⁸ M^-1 이상의 결합 친화도로 HGF에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 단클론 항체.
키메라 또는 인간화된 L2G7 mAb로서, L2G7이 하이브리도마 ATCC 번호 PTA-5162에 의해 생성된 마우스 항체인, 키메라 또는 인간화된 L2G7 mAb.
삭제
제 1 항의 단클론 항체를 생성하는 세포주.
제 1 항의 단클론 항체를 포함하는, 암 치료용 약제 조성물.
삭제
제 17 항에 있어서, 상기 암이 교아세포종(glioblastoma)임을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 단클론 항체가 키메라 또는 인간화된 L2G7 mAb임을 특징으로 하는 약제 조성물.
ATCC 번호 PTA-5162로서 수탁된 L2G7 하이브리도마.
제 17항에 있어서, 상기 단클론 항체가 생리적으로 허용되는 담체 중에 1 내지 100 mg/ml의 농도로 포함되고, 상기 단클론 항체는, 인간 간세포 성장 인자(HGF)에 결합하는 것에 대해 하이브리도마 ATCC 번호 PTA-5162에 의해 생성된 항체 L2G7과 경합하며, 단일 제제로서 상기 HGF를 중화시키고 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제하는, 약제 조성물.
0.1 내지 20 mg/kg의 투여량으로 환자의 암을 치료하기 위한 약제 조성물로서, 상기 약제 조성물이 단클론 항체(mAb)를 포함하고, 이러한 단클론 항체가, 인간 간세포 성장 인자(HGF)에 결합하는 것에 대해 하이브리도마 ATCC 번호 PTA-5162에 의해 생성된 항체 L2G7과 경합하며, 단일 제제로서 상기 HGF를 중화시키고 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제하는, 약제 조성물.