KR100956371B1 - 심근 세포로의 분화를 위한 지방유래 기질 세포의 시험관내 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방유래 기질 세포를 심근 세포로 분화시키는 시험관 내 배양 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 시험관 내에서 지방유래 기질 세포에 TGF-β1을 첨가하여 심근 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 지방유래 기질세포 배양방법 및 그 방법에 의하여 분화된 지방유래 기질 세포 유래의 심근 세포 집단에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 배양 방법 및 심근 세포집단은 심근경색의 치료 방법에 사용할 수 있는 이식 세포치료제로서 ADSCs의 실용성을 높이며, 이와 같은 치료제의 생산에 유용하다. 이식 전 본 방법을 사용하여 ADSCs를 심근세포로 전-분화시키는 것은 심근경색 치료효과를 향상시키는데 유용하다.

지방 유래 기질 세포, 지방 유래 줄기 세포, 심근세포 분화, TGF

Description

심근 세포로의 분화를 위한 지방유래 기질 세포의 시험관 내 배양방법{IN VITRO METHOD OF CULTURING ADIPOSE-DERIVED STROMAL CELLS FOR CARDIOMYOGENIC DIFFERENTIATION}

본 발명은 지방유래 기질 세포를 심근 세포로 분화시키는 시험관 내 배양 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 시험관 내에서 지방유래 기질 세포에 TGF를 첨가하여 심근 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 지방유래 기질세포 배양방법 및 그 방법에 의하여 분화된 지방유래 기질 세포 유래의 심근 세포 집단에 관한 것이다.

줄기세포 이식은 심근경색으로 손상된 심근 조직을 재생시키는 치료법으로 광범위하게 연구되어왔다. 배아줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs), 제대혈 세포, 및 지방 유래 기질 세포(Adipose-derived Stromal cells, ADSCs: '지방유래 줄기세포'라고도 한다)는 심근세포로 분화가능하다(Cho, S. W., et al., 2006, Biochem. Biophys . Res . Commun . 340: 573-582; Li, T. S., et al., 2005, Circulation 111: 2438-2445.; Makino, S., et al., 1999, 103: 697-705.; Orlic, D., et al., 2001, Ann . NY . Acad. Sci. 938: 221-229.; Yamada, Y., et al., 2007, Stem Cells 25: 1326-1333). 허혈성 심근 치료를 목적으로 자기유래 BMMSCs의 임상연구가 가장 활발하게 진행되어왔다. 세포이식은 급성 또는 만성 심근경색 환자의 허혈성 심장의 심박동 및 심 기능을 향상시키는 것으로 나타냈다(Stamm, C., et al., 2003, Lancet 361: 45-46.; Strauer, B. E., et al., 2002, Circulation 106: 1913-1918.; Strauer, B. E., et al., 2005, J. Am . Coll . Cardiol. 46: 1651-1658; Tse, H. F., et al., 2003, Lancet 361: 47-49.; Yamada, Y., et al., 2007, Stem Cells 25: 1326-1333.; Yoo, K. J., et al., Can . J. Surg. (in press). 참조).

ADSCs는 확립된 계열 특이적 인자로 처리하면 시험관 내에서 골형성(osteogenic), 지방(adiogenic), 근조직(myogenic), 및 연골(chondrogenic) 계통으로 분화 가능한 자기재생 줄기 세포를 포함한다(Huang, J. I., et al., 2004, Plast . Reconstr. Surg. 113: 585-594.; Zuk P. A., et al., 2002, Mol. Biol . Cell. 13: 4279-4295. 참조). ADSCs는 다른 종류의 줄기세포에 비해 환자로부터 추출이 용이하고, 임상적으로 적절한 양의 줄기세포를 추출할 수 있는 장점이 있다(Helder, M. N., et al., 2007, Tissue Eng. 13: 1799-1808. 참조). 특히, 줄기세포를 심근 세포로 분화시킨 후에 이식하면 미분화된 줄기세포를 이식하는 것보다 우수한 심근재생과 높은 심 기능 개선을 나타낸다( Li, T. S., et al., 상기 참조). 게다가, 미분화된 줄기세포 이식은 예기치 않은 다른 장기의 세포로 분화를 겪을 수 있다.

줄기세포를 심근 세포로 분화시키는 몇 가지 방법들이 알려져 있다. BMMSCs와 심근세포를 공동 배양하면 BMMSCs가 심근세포로 분화하는 것을 유도한다( Fukuhara, S., et al., 2003, J. Thorac . Cardiovasc . Surg . 125: 1470-1480.; Rangappa, S., et al., 2003, Ann . Thorac . Surg . 75: 775-779. 참조). 5-아자사이티딘(azacytidine)으로 처리하면 BMMSCs(Makino, S., et al., 1999, 103: 697-705. 참조) 및 ADSCS(Rangappa, S., et al., 2003, Ann . Thorac . Surg . 75: 775-779. 참조)이 심근 세포 표현형을 얻는다. 형질전환 성장인자-β1(TGF-β1) 및 TGF-β2는 시험관 내에서 각각 BMMSCs(Li, T. S., et al., 상기 참조) 및 배아 줄기세포( Kuma, D., et al., 2005, Biochem . Biophys . Res . Commun. 332: 135-141. 참조)를 심근 세포로 분화하도록 자극하였다. 래트 배아줄기세포에서 골 형성 단백질-2 또한 심장 유전자 발현을 촉진한다( Menard, C., et al., 2005, Lancet 366: 1005-1012. 참조).

최근 지방 조직세포 내에서 줄기세포가 확인되었다. 이 세포들은 지방유래 기질 세포 또는 지방유래 줄기세포라고 한다. ADSCs는 다른 중간엽 줄기세포와 유사하게, CD29, CD44, CD90 및 D105와 같은 다중 CD 세포표면 표지(marker) 항원을 발현한다(Gronthos, S., et al., 2001, J. Cell . Physiol .. 189:54-63., Miyahara, Y, et al., 2006, Nat . Med. 12: 459-465. 참조). 지방세포, 조골세포, 연골세포, 및 내피 세포를 포함하는 다양한 계통으로 분화할 수 있는 능력에 대해서 ADSCs의 다분화능이 증명되어왔다(Afizah, H., et al., 2007, Tissue Eng. 13: 659-666.; Cao, Y, et al., 2005, Biochem . Biophys . Res . Commun. 332: 370-379.; Halvorsen, Y. D., et al., 2001, Tissue Eng. 7: 729-741.; Zuk P. A., et al., 2001, Tissue Eng. 7: 211-228.; Zuk P. A., et al., 2002, Mol . Biol . cell. 13: 4279-4295. 참조). 자발적인 분화로 인하여 심근세포 특징을 갖는 수축성 있는 세포가 지방 기질 세포를 배양하는 동안 나타나지만, 그 빈도는 매우 낮다(0.02% 내지 0.07%, Cho, S. W., et al., Eur . J. Heart Fail. (in press) 참조).

최근 연구는 심근세포와 공동배양하거나(Fukuhara, S., et al., 2003, J. Thorac. Cardiovasc . Surg . 125: 1470-1480.; Rangappa, S., et al., 2003, Ann . Thorac. Surg . 75: 775-779. 참조) 5-아자사이티딘 처리 하면(Makino, S., et al., 1999, 103: 697-705. 참조) BMMSC를 심근세포로 분화하도록 유도할 수 있다고 보고하였다. 그러나, 상기 공동배양 방법은 심근세포 분화율이 낮게 나타나고(겨우 1.9%), 5-아자사이티딘은 잠재적인 독성이 있으며 비특이적 디메틸화 활성이 있기 때문에(Liu, Y., et al., 2003, Res. 58: 460-468. 참조) 이들 방법들은 임상적으로 유용하지 않을 것임을 시사한다.

TGF-β1은 배아 심장 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Akhurst, R. J., et al., 1990, Development 108: 645-56. 참조). TGF-β1는 마우스 ES 세포에서 심근세포로 분화하도록 유도하는 것으로 밝혀졌다(Behfar, A., et al., 2002, FASEB J. 16: 1558-1566.; Kuma, D., et al., 2005, Biochem . Biophys . Res . Commun. 332: 135-141. 참조). TGF-β1 처리한 CD117-양성 BMMSCs는 트로포닌-I, 트로포닌-T, 코넥신-43, GATA-4, 및 NK_X-2.5와 같은 심근 세포 표지의 발현이 증가되었다 (Li, T. S., et al., 상기).

한편, TGF-β1은 BMMSC의 골 형성 분화를 유도할 수 있다(Moses, H. L., et al., 1996, Curr . Opin . Genet . Dev. 6: 581-86.; Li, T. S., et al., 상기). 최근 연구는 낮은 농도의 TGF-β1과 함께 배양한 CD117-양성 BMMSC 는 시험관 내에서 알칼라인 포스파타아제 활성을 증가시키지 않고, 높은 농도의 TGF-β1이 조골세포 분화를 유도함을 보였다(Li,T.S.et al.상기). 또한, 한 연구에서는 TGF-β1이 비-민무늬 근세포에서 SM α-액틴 및 SM 22a 와 같은 초기 민무늬 근세포 분화 표지의 발현을 상향조절한다는 것을 보고하였다(Hautmann, M. B., et al., 1999, Arterioscler. Thromb . Vasc . Biol. 19: 2049-2058. 참조).

따라서, 종래의 미분화된 줄기세포를 이식시키는 경우의 문제점을 가지지 않으면서도, 이미 알려진 분화된 세포의 이식에서 오는 상기와 같은 문제점을 가지지 않는 보다 간편하고도 독성이 작고 임상 적용 가능한 심근경색 치료용 세포의 새로운 배양방법 및 세포 분화 방법의 개발이 절실하였다.

본 발명자들은 이식용으로 사용할 수 있는 분화된 심근세포의 공급원으로서 지방 유래 기질 세포(ADSCs)를 사용하는 것의 가능성을 발견하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 시험관 내에서 TGF를 일정기간 동안 처리하여 배양하는 경우 ADSCs가 실용 가능한 수준으로 심근세포로 분화되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

역전사 중합효소반응(RT-PCT), 면역세포화학, 및 유동세포계측 분석 결과는 TGF의 일종인 TGF-β1 처리가 다양한 심근 특이적 표지의 발현을 증대시킨다는 것을 나타냈다. 또한 상기 분화는 TGF-β1 처리기간을 1주에서 2주로 증가시킴에 의하여 향상되었다.

즉, 본 발명의 배양방법에 따라 분화된 세포는 심장 α-액틴, 트로포닌-I, 심장 MHC, 및α-사르코메릭 액틴을 발현하였다(도 2-5). 심장 MHC를 발현하는 ADSCs의 비율이 매우 높다(17%, 도 5).

또한, TGF-β1을 10ng/mL에서 2주 동안 처리하여 배양한 ADSCs는 골 특이적 표지인 오스테오넥틴(osteonectin) 또는 오스테오폰틴(osteopontin)을 발현하지 않았다.

따라서, 본 발명의 한 양태에서는 시험관 내에서 지방유래 기질 세포에 TGF를 첨가하여 심근 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 지방유래 기질세포 배양방법을 제공한다. 심근 세포 분화를 촉진하기 위하여 사용되는 TGF의 양은 1-100 ng/ml이 바람직하다. 더 바람직하게는, 사용되는 TGF의 양은 약 10 ng/ml이다.

상기 TGF는 지방유래 기질세포를 유효 비율의 심근세포로 분화시킬 수 있는 어떤 종류의 TGF일 수 있다. 바람직하게는 TGF는 TGF-β1이다.

본 발명에서 사용될 때 '지방유래 기질세포(Adipose-derived Stromal cells, ADSCs)' 또는 '지방유래 줄기세포'는 지방 조직세포 내에서 확인되는 다분화능을 갖는 세포를 지칭한다. ADSCs는 다른 중간엽 줄기세포와 유사하게, 다양한 CD 세포표면 표지 항원을 발현한다. 지방세포, 조골세포, 연골세포, 및 내피 세포를 포함하는 다양한 계통으로 분화할 수 있는 능력을 갖는다. 따라서, 지방유래 줄기세포를 사용하여 본 발명의 방법과 유사하게 심근 세포 분화를 유도하는 배양방법은 모두 본 발명의 범위에 속한다.

상기 배양방법에 있어, TGF를 첨가하여 지방유래 기질세포를 배양하는 기간은 2일 이상인 것이 바람직하다. 첨가하는 TGF의 분화 유도 특성에 따라 처리기간이 늘어날 수도 줄어들 수도 있다는 것이 당업자에게 자명하다. 분화 유도를 위한 처리기간은 분화 유도 결과를 관찰함에 의하여 최적의 분화를 유도하는 기간을 선택할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서는 시험관 내에서 지방유래 기질 세포에 TGF를 첨가하여 배양함에 의하여 심근 세포로 분화된 지방유래 기질 세포 유래의 심근 세포 집단을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 상기의 본 발명에 따르는 심근 세포 집단을 포함하는 포유동물 동종이식 또는 이종이식용 세포 조성물을 제공한다. 상기 포유동물은 바람직하게는 인간이다.

본 발명에 따르는 배양 방법 및 심근 세포집단은 심근경색의 치료 방법에 사용할 수 있는 이식 세포치료제로서 ADSCs의 실용성을 높이며, 이와 같은 치료제의 생산에 유용하다. 이식 전 본 방법을 사용하여 ADSCs를 심근세포로 전-분화시키는 것은 심근경색 치료효과를 향상시키는데 유용하다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

재료와 방법

세포 분리

ADSC 분리 및 배양을 Miyahara, Y, et al., 2006, Nat . Med. 12: 459-465.에 기재된 바와 같이 수행하였다. 스프라그-돌리 래트(200-250 g, SLC, Tokyo, Japan) 의 서혜부에서 지방조직을 분리하였다. 분리된 지방 조직을 멸균의 인산 완충 식용수(PBS; Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 헹구어 오염물질을 제거하고, 가위로 잘게 다진 후, 타입 1 콜라게나제 용액(0.1 mg/ml, Sigma) 10ml로 1시간 동안 37℃에서 처리하였다. 40 μm 메쉬 필터(Falcon, Bedford, MA)로 여과시키고, 원심분리 후, 분리된 세포를 10%(v/v) 우태혈청(FBS, Gibco BRL), 100 U/mL 페니실린(Gibo BRL), 및 0.1 mg/mL 스트렙토마이신(GiBco BRL)을 첨가한 α-MEM (α-minimal essential medium, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에 공기에 CO₂ 가 5% 분산된 상태에서 37℃로 배양하였다. 세포를 60% 컨풀루언시(confluency)에서 2차 배양 하였다. 심근세포분화를 유도하기 위해, 세포를 10 ng/mL TGF-β1 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)을 첨가하여 2주 동안 배양하였다. TGF-β1을 처리하지 않은 ADSCs를 대조군으로 하였다. 지방 분화를 유도하기 위해, 컨플루언트(confluent) ADSCs를 3%(v/v) FBS, 비오틴(33 μmol/l), 판토텐산(17 μmol/l), 인간 재조합 인슐린(1 μmol/l), 덱사메서손(1 μmol/l), 이소부틸메틸그산틴(0.1875 mmol/l) 및 인도메타산(0.2 mmol/l)을 첨가한 DMEM-Ham's F-12 배지에서 배양하였다. 3일 유도기 후, 상기 세포를 이소부틸메틸크산틴이 포함되지 않고 나머지는 상기와 같은 배지에 배양하였다.

유동세포계측 분석

표면 항원 표현형을 위하여, ADSCs를 PBBS로 헹군 후 마우스 IgG 및 IgM 또는 플루오레세인 이소디오시안산(FITC)- 또는 피코에리스린(PE)-결합 항체 정량을 함유하는 2% (v/v) FBS/PBS 완충액에 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 항체는 CD34-PE, CD-37-PE, CD90-PE (BD Pharmingen, Los Angeles, CA, USA), 및 CD106-FITC(CHEMICON, Temecula, CA, SA)를 사용하였다. 마우스 IgM-FITC(CHEMICON), 마우스 IgG1-PE, IgM-PE, 래트 IgG2B-PE, 및 마우스 IgG-APC (BD Pharmingen)을 이소타입 대조군으로 사용하였다. TGF-β1와 함께 배양된 ADSCs를 유동세포계측 분석을 통해 측정하였다. 세포를 PBS로 헹군 후, 2%(v/v) FBS/PBS 완충액에 5분 동안 인큐베이션하고, 0.01% 나트륨 아지이드(Sigma) PBS에 20분 동안 인큐베이션하고, 항 심장 MHC로 염색 후, 제 2 FITC-결합 항-쥐 IgG 항체로 처리하였다. 상기 표본을 CellQusest software(Becton Dickinson)을 이용하여 Vantage SE 유동세포 계측기(Bectondickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)로 분석하였다.

RT - PCR

RT-PCR 분석을 Hong, K. H., et al., 2005, J. Microbiol . Biotechnol . 15: 823-830.에 기재된 바와 같이 수행하였다. 모든 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, Ca, USA)을 이용하여 야생 래트의 심장, ADSCs, 및 조골세포(osteoblast)에서 분리하였다. 피검물을 클로로포름 200 ㎕에 용해시키고 1 ㎖의 TRI zol 시약으로 균질시키고, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하였다. RNA 펠렛을 70 % (v/v) 에탄올로 헹구고, 건조시킨 후, RNase가 없는 물에 용해시켰다. SuperScript^TMII 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 순수 RNA 5 ㎕로 역전사반응을 수행하였다. 합성된 cDNA를 하기 표 1에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 변성(94℃, 30초), 어닐링(60℃, 30초), 및 연장(72℃, 60초)을 30회 72℃에서 5분간 최종 연장하여 PCR을 수행하였다. PCR 생산물을 2%(w/v) 브롬화 에티듐 염색으로 아가로스 겔에 전기영동으로 가시화 하고 겔 다큐멘테이션 시스템(Gel Doc 1000, Bio-Red Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 분석하였다. GAPDH를 "하우스키핑(housekeeping)" mRNA 대조군으로 사용하였다.

표적	서열	참고문헌
심장 α-액틴	S:5'-ACTCTATGTGTAGGTGACGAGGC-3' AS:5'-GACGTTATGAGTCACACCGTCG-3'	Zwadlo C.등, 상기
트로포닌 I	S:5'-ATCTCCGCCTCCAGAAAACT-3' AS:5'-CAGTAGTGCCTGCATCATGG-3'	Zwadlo C.등, 상기
오스테오넥틴	S:5'-GTG CCG AGA GTT CCC AGC ATC ATG-3' AS:5'-ATT CCT CCA GGG CAA TGT ACT TGT-3'	Park,M.S.등, 상기
오스테오캘신	S:5'-ATG TGC CCT CCT GGT TCA TTT CTT-3' AS:5'-GTG GTC CGC TAG CTC GTC ACA ATT-3'	Park,M.S.등, 상기
GAPDH	S:5'-CCTCCTCATTGACCTCAACTAC-3' AS:5'-CATGGTGGTGAAGACGCCAG-3'	Zhang F.B.등, 상기

면역 형광 염색

면역 형광 염색을 Kim,H.C. et al., 2006, J. Microbiol. Biotechnol에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, ADSCs를 2% 파라포름알데히드(Sigme)에 15분간 실온에서 고정시켰다. ADSCs를 항체 항 심장 MHC(Santa Cruz Biotechnology Inc.) 및 근절 α-액티닌(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 염색 후 시아닌-결합 항-염소 IgG 또는 제 2 항-마우스 IgG항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)로 처리하였다. ADSCs 또한 민무늬근(SM) α-액틴에 대한 항체(DAKO, Carpinteria, CA)로 염색 후 FITC-결합 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)로 처리하였다. 상기 면역 형광 염색 표본을 공초점 현미경(LSM510, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 분석하였다. 4-6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 Vectashield 봉입제(mounting medium)를 사용하여 세포 핵을 염색하였다.

알칼라인 포스파타아제 및 oil red -O 염색

래트 ADSCs 및 지방세포를 10%(v/v) 포름알데히드 완충액에 1시간 동안 고정시키고, 60%(v/v) 오일 레드-O(Sigma) 용액으로 증류수에서 10분간 염색하였다. 그 후, 세포를 증류수로 세척하여 잔류 오일-레드-O 용액으로 제거하고 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 골형성분화를 측정하기 위하여, 래트 ADSCs 및 조골세포를 시중급검정 키트(Sigma)로 ALP에 대하여 염색하였다(Song, H. B., et al., 2006, J. Microbiol. Biotechnol . 16: 37-45. 참조).

실시예 1: 지방유래 기질세포의 특성 확인

세포들의 부착성에 기초하여 ADSCs를 래트의 지방 조직에서 분리시키고, 일반 줄기세포 표면 마커(도 1)에 대하여 유동세포계측을 통해 측정하였다. 첫 계대 후, 많은 ADSCs는 CD90을 발현하였고, 적은 일부는 CD105를 발현하였는데, 이들은 중간엽 세포 표면 마커이다. 이와는 대조적으로, 세포의 대다수는 CD34, 조혈 또는 혈관모세포 표면 마커, 및 간충 세포 표면 마커인 CD73에 대하여 음성이다. 이 결과들은 종래의 연구결과와 비슷하다(Cao, Y, et al., 2005, Biochem . Biophys . Res . Commun. 332: 370-379.; Gronthos, S., et al., 2001, J. Cell . Physiol .. 189:54-63.; Lee, R. H., et al., 2004, Cell Physiol . Biochem. 14: 311-24.; Miyahara, Y, et al., 2006, Nat . Med. 12: 459-465. 참조).

실시예 2: 지방 유래 기질세포의 심근세포로 분화 유도

( 실시예 2-1) 지방 유래 기질세포의 심근세포 분화 유도 및 그 확인

TGF-β1처리한 ADSCs은, TGF-β1처리하지 않은 ADSCs에서는 없는 심장 특이적 유전자 발현을 나타내었다. RT-PCR 분석은 TGF-β1처리하여 배양한 ADSCs에서 심장 α-액틴 및 트로포닌(troponin)-I을 포함하는 몇몇 심장 유전자 발현을 보였지만, TGF-β1 처리하지 않고 배양한 ADSCs에서는 발현을 보이지 않았다(도 2). ADSCs에 TGF-β1처리하고 2주 동안 배양 후 트로포닌-I 발현이 관찰되었다.

면역 형광 염색 및 유동세포계측 결과에서 TGF-β1 처리하여 배양한 ADSCs에서 심장 특이적 마커의 발현을 보였다. TGF-β1처리하여 2주 동안 배양된 ADSCs의 적은 일부는 심장 특이적 마커인 심장 MHC 및α-사르코메릭 액틴(sarcomeric actin)에 대하여 양성으로 염색되었다(도 3C, 4C). TGF-β1 처리하지 않고 배양한 ADSCs 또는 TGF-β1과 함께 일주일 동안만 배양한 ADSCs는 심장 마커에 대하여 염색되지 않았다(도 3A, B, 4A, B). 유동세포계측 분석결과는 심장 MHC-양성 세포의 비율이 TGF-β1와 함께 배양한 시간에 따라 증가된다는 것과 TGF-β1을 처리하지 않은 ADSCs에서는 심장 MHC-양성 세포의 비율이 무시할만한 정도라는 것을 보여준다(도 5). TGF-β1과 함께 배양하였을 때 심장 MHC를 발현하는 ADSCs가 73-배 증가하였다.

( 실시예 2-2) 지방유래 기질 세포의 지방세포로 분화 여부 확인

TGF-β1과 함께 배양하는 것이 ADSCs를 지방세포로 분화시키는지 여부를 측정하기 위하여, 배양된 ADSCs를 지방세포 특이적 염색인, 오일 레드-O로 염색하였다. TGF-β1처리 또는 처리하지 않은 ADSCs는 오일 레드-O에 의해 염색되지 않았다(도 6A, B, C). 대조적으로, 지방세포 분화 배지와 함께 배양된 ADSCs는 지방세포에서 지질 방울을 보이고, 오일 레드-O로 염색되었다(도 6D).

( 실시예 2-3) 지방유래 기질 세포의 뼈 세포로의 분화 여부 확인

TGF-β1과 함께 배양하는 것이 ADSCs가 조골세포로 분화하도록 유도하는지 여부를 측정하기 위하여, TGF-β1과 함께 배양한 ADSCs에서 ALP 생산물 및 조골세포-특이 유전자 발현과 조골세포를 비교하였다. TGF-β1과 함께 배양된 ADSCs는 ALP에 대하여 염색 되지 않는 반면, 조골세포는 ALP에 대하여 양성으로 염색되었다(도 7A-D). RT-PCR 분석결과는 TGF-β1과 함께 배양한 ADSCs가 오스테오넥틴(osteonectin) 또는 오스테오캘신(osteocalcin)을 발현하지 않음을 보였는데(도 7E), 이는 역시 이러한 배양 조건에서 골 형성 분화하지 않음을 시사한다.

도 1은 래트 지방 조직에서 분리하고 첫 계대 후 배양한 ADSCs의 면역 표현형을 유동세포 계측 결과로 나타낸 그래프이다. 세포 표면 항원(녹색 또는 붉은색은 각각 제 2 FITC-또는 PE-결합 항체)

도 2는 TGF-β1 처리하여 1 또는 2주 배양하거나 TGF-β1 처리하지 않은 ADSCs의 심장 특이 유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. GAPDH를 하우스키핑 mRNA 대조군으로 사용하였다. M: 100bp DNA 분자량마커, 레인 1: TGF-β1 처리하지 않고 배양한 ADSCs, 레인 2: TGF-β1를 1주일 동안 처리하여 배양한 ADSCs, 레인 3: TGF-β1처리하여 2주 동안 배양한 ADSCs, 레인 4: 래트 심장.

도 3은 TGF-β1을 처리하지 않거나(A), TGF-β1를 1 주 동안(B) 또는 2 주 동안(C) 처리하여 배양한 ADSCs에서 심장 MHC면역세포화학 염색 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 붉은색은 심장 MHC-포지티브 세포를 나타내며 푸른색은 세포핵을 나타낸다. 눈금자는 100μm이다.

도 4는 TGF-β1을 처리하지 않고(A) 배양하거나 또는 TGF-β1를 1주 동안(B) 또는 2 주 동안(C) 처리하여 배양한 ADSCs에서α-사르코메릭 액틴에 대한 면역세포화학 염색 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 녹색은 α-사르코메릭 액틴-포지티브 세포를 나타내며 푸른색은 세포핵을 나타낸다. 눈금자는 100μm를 나타낸다.

도 5는 TGF-β1을 처리하지 않고(A) 배양하거나 또는 TGF-β1를 1주 동안(B) 또는 2 주 동안(C) 처리하여 배양한 ADSCs에서 심장 MHC 발현에 대한 유동 세포 계 측 다이아그램이다. 검정 선은 이소 타입 대조군을 나타낸다. 상기 자료는 평균 ± 표준편차로 심장 MHC-양성 세포의 백분율를 나타낸다.

도 6은 TGF-β1을 처리하지 않고(A) 배양하거나 또는 TGF-β1를 1주 동안(B) 또는 2 주 동안(C) 처리하여 배양한 ADSCs 및 래트 지방세포(D)의 오일 레드-O 염색 결과를 나타내는 현미경 사진이다. (A<B<C) ADSCs는 오일 레드-O에 의해 염색되지 않았다. (D) 세포질에 지방방울을 포함하는 지방세포는 오일 레드-O에의해 양성으로 염색되었다. 눈금자는 100 ㎛를 나타낸다.

도 7은 TGF-β1을 처리하지 않고(A) 배양하거나 또는 TGF-β1를 1주 동안(B) 또는 2 주 동안(C) 처리하여 배양한 ADSCs 및 래트 조골세포(D)의 ALP 염색 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 래트 조골세포만 ALP에 대하여 양성으로 염색되었다. 눈금자는 200μm을 나타낸다. 도 7의 (E)는 TGF-β1과 함께 1주 또는 2주 동안 또는 TGF-β1처리하지 않고 배양한 ADSCs에서 골형성 유전자 발현에 대한 PR-PCR 분석 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. GAPDH를 하우스키핑 mRNA 대조군으로 사용하였다. 레인 1: TGF-β1 처리하지 않고 배양한 ADSCs. 레인 2: TGF-β1를 1주 동안 처리하여 배양한 ADSCs. 레인 3: TGF-β1 2주 동안 처리하여 배양한 ADSCs. 레인 4: 래트 조골세포.

Claims (6)

1. 시험관 내에서 지방유래 기질 세포에 심근분화를 촉진하는 TGF-β1을 첨가하여 심근 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 지방유래 기질세포 배양방법.
2. 제 1 항에 있어서, TGF-β1의 양은 1-100 ng/ml인 것을 특징으로 하는 지방유래 기질세포 배양방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, TGF-β1을 첨가하여 배양하는 기간은 2일 이상인 것을 특징으로 하는 배양 방법.
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