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KR20070001101A - 포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방조직을 이용한 심근 세포의 유도 - Google Patents

포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방조직을 이용한 심근 세포의 유도 Download PDF

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KR20070001101A
KR20070001101A KR1020067014890A KR20067014890A KR20070001101A KR 20070001101 A KR20070001101 A KR 20070001101A KR 1020067014890 A KR1020067014890 A KR 1020067014890A KR 20067014890 A KR20067014890 A KR 20067014890A KR 20070001101 A KR20070001101 A KR 20070001101A
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South Korea
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cardiomyocytes
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adipose tissue
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노부유끼 다까구라
요시히로 야마다
Original Assignee
가나자와 유니버시티 테크놀러지 라이센싱 오가니제이션 엘티디.
도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
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Abstract

본 발명은 포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포를 포유동물의 지방 조직으로부터 단리된 세포 또는 이의 배양 상등액과 함께 배양함으로써, 상기 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포를 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포로 분화 유도하는 기술을 제공한다.
골수 세포, 제대혈 유래 세포, 심근 세포, 조혈 줄기세포

Description

포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방 조직을 이용한 심근 세포의 유도 {INDUCTION OF MYOCARDIAL CELL WITH THE USE OF MAMMALIAN BONE MARROW CELL OR CORD BLOOD-ORIGIN CELL AND FAT TISSUE}
본 발명은 포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방 조직을 이용한 심근 세포의 분화 유도 기술에 관한 것이다.
심근 세포는 성체가 되면 증식이 정지되기 때문에 일단 심근 경색이 발병한 심장 영역에서는 심근 세포의 회복을 기대할 수 없어서, 심장은 재생 불가능한 조직이라고 여겨져 왔다. 그러나, 최근 심장 내에 심근 세포의 전구세포/줄기세포가 존재하고, 이의 분열 또는 심근 세포로의 분화도 종종 관찰되었다 [Beltrami A.P., et al., "Adult Cardiac Stem Cells Are Multipotent and Support Myocardial Regeneration", Cell, Vol.114, p763-776, 2003]. 또한, 심근 세포로 분화가능한 이소성(異所性) 세포를 심근 세포로 분화 유도하는 기술이 개발된다면, 지금까지는 곤란하다고 여겨졌던 심근 경색의 치료가 가능해질 것이다.
태아기의 만능 세포인 배아 줄기세포 (ES 세포, Embryonic Stem cell)는 심근 세포로 쉽게 분화될 수 있다. 그러나, 각 환자의 ES 세포를 제조하는 것은 윤 리적으로 문제가 있으며, 무작위로 제조된 ES 세포로부터 분화된 심근 세포는 면역 거부를 야기하기 때문에, 현재로서는 실제 의료에 ES 세포를 이용하는 것이 불가능하다.
골수 간질에는 다분화능을 갖는 간엽계 줄기세포가 존재하고, 이 간엽계 줄기세포를 이용한 조직 재생에 대해서는 종래부터 많은 보고가 이루어져 왔다. 예를 들어, 골수 유래의 근세포를 이용한 골격근 재생 [Ferrari G. et al., "Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors." Science. 1998, 279(5356):p1528-30], 심장으로의 c-kit-양성 골수 줄기세포 투여에 의한 심기능 개선 [Orlic D, et al., "Bone marrow cells regenerate infracted myocardium", Nature Vol.410, No.5, 2001, p701-705], 골수 유래 세포에 의한 심근 재생 [일본 특허 공표 2002-511094호 공보, WO 01/048151호, 일본 특허 공표 2002-521493호 공보] 등이 알려져 있다. 이러한 간엽계 줄기세포는, 이들 세포에 탈메틸화 효소를 첨가하여 일단 세포를 리셋팅(reset)하면 심근 세포로의 분화가 가능하게 된다는 것도 보고되어 있다 [Makino S. et al., "Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro", The Journal of Clinical Investigation 103:p697-705 (1990)]. 그러나, 이 방법으로 제조된 심근 세포는, 탈메틸화라는 처리가 실시되어 있기 때문에 장래적으로는 기형 발생의 우려가 있는 등, 임상적 응용에 많은 장애가 따른다.
한편, 간엽계 줄기세포를 이용한 조직 재생시에는 사용될 골수의 양적 한계라는 문제가 있어서, 조직 재생의 재료로서는 보다 풍부한 공급원이 요망되고 있 다. 지방 조직은 쉽게 입수할 수 있는 조직이며, 최근에는 인간 지방 조직으로부터 다분화능을 갖는 세포가 단리되었고 신경 세포로의 분화가 확인되었다 ([Zuk P.A. et al., "Multilineage Cells from Human Adipose Tissue: Implications for Cell-Based Therapies", Tissue Engineering, Vol.7, No.2, 2001, p211-228], [Zuk P.A. et al., "Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells", Molecular Biology of the Cell, Vol.13, p4279-4295, 2002]). 또한, 마우스에서 심근 세포로 분화가능한 근아세포 유래 세포주도 단리되어 있다 [일본 특허 공개 제2003-325169호 공보, 일본 특허 공개 제2003-259863호 공보]. 그러나, 이러한 세포의 사용은, 특수한 세포주이거나 분화 유도에 복잡한 배양 공정을 필요로 하는 등, 모두가 실용적이지 못하다.
본 발명의 목적은 심근 세포의 분화를 시험관내에서 간편하게 유도하는 기술을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 지방 조직 중의 간엽계 세포를 통상의 소혈청-함유 배양액 중에서 심근 세포로 분화 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포를 포유동물의 지방 조직으로부터 단리된 세포 또는 이의 배양 상등액과 함께 배양함으로써 심근 세포로 분화 유도할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명은 포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포를 포유동물의 지방 조직으로부터 단리된 세포 또는 이의 배양 상등액과 함께 배양함으로써, 상기 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포를 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 배양액 중에는 소혈청 이외에도 분화 증식을 촉진시키는 사이토카인을 포함시키는 것이 바람직하다. 이러한 사이토카인의 예로는 EGF, TGF-α, HB-EGF, FGF, HGF 등의 EGF족, TGF-β 등의 TGF-β족, LIF 등의 IL족, VEGF-A 등의 VEGF족, PDGF-AB, PDGF-BB 등의 PDGF족, 에프린(Ephrin) B 등의 에프린족, SCF (Stem Cell Factor, 줄기 세포 인자) 등이 있다.
세포 배양 기간은 특별히 한정되지 않지만, 1일 이상 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 골수 세포는 골수 간질 세포, 특히 간엽계 줄기세포인 것이 바람직하고, 또는 조혈 줄기세포 분획의 세포인 것이 바람직하다. 또한, 제대혈 유래 세포로는 제대혈 중의 단핵구가 바람직하다.
동시배양할 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방 조직으로부터 단리된 세포와의 혼합 비율은 특별히 한정되지 않지만, 0.1:1 내지 1:10 정도인 것이 바람직하다. 특히, 골수 세포의 경우에는 지방 조직으로부터 단리된 세포에 대하여 약 1:4 정도인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기한 어느 한 방법으로 제조되는 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포를 제공한다. 이들 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포가, 이식받을 포유동물에서 유래된 지방 조직이나 골수 세포를 재료로 사용하여 제조된 것이면, 이식 후의 거부 반응의 위험을 예방할 수 있다.
또한, 본 발명은 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포에 피검 물질을 첨가함으로써 상기 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포에 대한 상기 피검 물질의 효과를 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 심근 세포의 약제 감수성 시험 또는 심질환 치료약의 스크리닝에 이용할 수 있다.
본 발명에 따라, 포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방 조직으로부터 간편하게 심근 세포를 얻을 수 있다. 얻어지는 심근 세포는 유전자 조작을 실시하지 않은 것이므로 안전성이 높고, 심근 세포에 특징적인 유전자 발현 양상 또는 표현형 형질을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법으로 얻어지는 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포는 심장 재생용 약제 또는 심근 세포에 작용하는 약제를 평가하는데 이용할 수 있다.
현재, 심근 경색시에 발생된 허혈 영역에서의 혈관 재생 의료는 다량의 골수액으로부터 얻은 혈관 줄기세포의 국소 이식에 의해 실시되고 있다. 골수액 채취는 전신 마취하에 행해지고, 고령자에 있어서는 이러한 기술 자체가 위험스러운 행위이다. 이와는 달리, 지방 조직의 채취는 간단한 피부 국소 마취로도 가능하고, 환자의 생명을 위협하는 위험은 거의 없다. 따라서, 본 발명은 의료 업계의 발전에 크게 기여한다.
도 1은 지방 조직의 배양 결과 (심근 세포로의 분화)를 나타낸다 (A: 배양 개시시, B: 배양 개시후 제7일, C: 배양 개시후 제14일, D: 배양 개시후 제28일).
도 2는 배양 개시후 제14일의 지방 조직의 면역염색 결과를 나타낸다 (A: 항 -근절 액틴(Sarcomeric Actin, SA) 항체, B: 항-심장 액틴(cardiac actin) 항체).
도 3은 유동세포계측시의 분획화 결과 (좌측) 및 분획화 후에 회수한 Lin-음성 β1 인테그린-양성 세포를 시험관내 배양하여 항-SA 항체로 면역염색한 결과 (우측)를 나타낸다.
도 4는 지방 조직으로부터 분화된 세포에서의 유전자 발현 분석 (RT-PCR) 결과를 나타낸다.
도 5는 지방 조직으로부터 분화된 세포에서의 핵내 전사 유전자 분석 (RT-PCR) 결과를 나타낸다.
도 6은 지방 조직 유래 세포와 골수 세포와의 동시배양 결과를 나타낸다(A: 지방 조직 유래 세포와 골수 세포와의 동시배양 결과, B: 골수 세포의 단독 배양 결과).
도 7은 지방 조직 유래 세포와 동시배양하는 골수 유래의 세포수 (횡축: 세포수)를 변화시켰을 때 얻어지는 심근 세포의 콜로니 수 (종축: 콜로니 수/웰) 변화를 나타내는 막대 그래프이다. 여기서 각 막대의 상부는 골수 유래 세포로부터 얻어진 심근 세포의 콜로니 수를 나타내고, 각 막대의 하부는 심근 조직으로부터 얻어진 심근 세포의 콜로니 수를 나타낸다.
도 8은 인간 지방 조직을 심근 세포로 분화 유도한 결과를 나타낸다. A: 항-SA 항체에 의한 면역염색 결과 (상측: 화살표는 심근 세포를 나타냄. 하측: 음성 대조군). B: 부착된 세포의 총 개수에 대한 SA-양성 세포의 비율(％) (우측: PDGF-AB 첨가, 좌측: PDGF-AB 무첨가).
도 9는 인간 제대혈 중의 단핵구 (hCBMNC)를 심근 세포로 분화 유도한 결과를 나타낸다. A: hCBMNC (하부)와 마우스 지방 조직 (상부)을 세포 배양 삽입물 (화살표로 표시함)로 격리시키는 동시배양 방법. B: 항-SA 항체를 사용한 면역염색 결과 (우측: 동시배양, 좌측: hCBMNC만 단독 배양). C: 부착된 세포의 총 개수에 대한 SA-양성 세포의 비율(％) (우측: 동시배양, 좌측: hCBMNC만 단독 배양).
본 명세서는, 본원의 우선권인 일본 특허 출원 제2003-429088호의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.
< 발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
1. 지방 조직으로부터 단리된 세포를 심근 세포로 분화시키는 방법
지방 조직 중의 간엽계 세포를 통상의 소혈청-함유 배양액 중에서 심근 세포로 분화 유도할 수 있다.
1.1. 지방 조직으로부터 단리된 세포
본 발명의 방법에 사용되는 지방 조직은 포유동물 유래인 것이면 특별히 한정되지 않는다. 즉, 포유동물의 태아, 신생아 또는 성체의 임의의 부위에서 얻은 지방 조직을 사용할 수 있다. 세포는, 예를 들어 입체 현미경하에서 정확하게 지방 조직만을 회수하고, 여기에 기계적 처리 및(또는) 콜라게나제 처리 또는 디스파제 처리 등의 효소 처리를 실시함으로써 개개의 단일 세포로서 단리할 수 있다.
이와 같이 하여 지방 조직으로부터 단리된 세포 중에는 지방 세포, 지방 전구세포 및 체성 줄기세포 등이 포함되며, 본 발명에 사용되는 지방 조직 유래의 세포에도 이러한 세포가 포함되어 있을 수 있다. 이들 세포는 Lin-음성, c-Kit-음성 내지 약한 양성, 및 β1 인테그린-양성인 것으로 확인되었다.
1.2. 배양 조건
단리된 세포의 배양액으로는, DMEM 배양액, MEM 배양액, α-MEM 배양액, RPMI 배양액, DMEM/F12 배양액 등과 같이 포유동물의 지방 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배양액에 적절량의 소혈청을 첨가하여 제조한 것을 사용한다. 소혈청의 첨가량은 특별히 한정되지 않으며, 세포의 기원이나 유형에 따라 적절하게 결정된다. 소혈청은 바람직하게는 0％ 내지 20％, 더욱 바람직하게는 5％ 내지 10％ 정도의 양으로 첨가할 수 있다. 소혈청 대신에 뉴트리도마(Nutridoma) (베링거(Behringer) 제조), 인간 혈청 등을 사용할 수도 있다.
배양은 시판되는 배양 디쉬를 사용하여 2차원적으로 행한다. 온도 또는 CO2 등의 조건은 사용할 세포의 성질에 따라 적절하게 결정되지만, 일반적으로는 4 내지 6％ CO2와 33 내지 37℃인 것이 바람직하고, 특히 5％ CO2와 37℃ 정도인 것이 바람직하다. 세포 배양 기간도 특별히 한정되지 않으며, 필요로 하는 심근 세포의 발현이 관찰될 때까지 적절한 배지 교환을 행하면서 배양을 유지할 수 있다. 본 발명의 발명자들의 실험 결과에 따르면, 배양 개시후 제3일부터는 박동(beating)하는 심근 세포가 관찰되었고, 이와 동시에 구형의 심근 전구세포 (심근 줄기세포)의 증식이 개시되었다.
배양 동안에는 배양액에 세포의 분화 및 증식을 촉진시키는 사이토카인을 적절하게 첨가할 수도 있다. 이러한 사이토카인의 예로는 EGF, TGF-α, HB-EGF, FGF, HGF 등의 EGF족, TGF-β 등의 TGF-β족, LIF 등의 IL족, VEGF-A 등의 VEGF족, PDGF-AB, PDGF-BB 등의 PDGF족, 에프린 B 등의 에프린족, SCF (Stem Cell Factor, 줄기 세포 인자) 등이 있다. 특히, LIF, HB-EGF, PDGF가 바람직하다.
사이토카인의 첨가량은, 사용할 사이토카인 또는 세포의 성질에 따라 적절하게 결정된다. 마우스 지방 조직으로부터 단리된 세포를 사용하는 경우, LIF는 1000 U/㎖ 내지 5000 U/㎖ 정도, HB-EGF는 100 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖ 정도로 첨가할 수 있지만, 그 첨가량이 상기한 범위로 한정되는 것은 아니다.
2. 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포의 심근 세포로의 분화 유도
골수 세포 또는 제대혈 유래 세포에 포유동물의 지방 조직으로부터 단리된 세포 또는 이의 배양 상등액을 첨가하여 소혈청-함유 배양액 중에서 배양함으로써, 상기 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포를 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포로 분화 유도할 수 있다.
2.1. 지방 조직으로부터 단리된 세포 또는 이의 배양 상등액
상기 방법에서, 지방 조직으로부터의 세포 단리는 상술한 항목 1에 따라 행할 수 있다. 배양 상등액으로는, 단리된 지방 조직 유래 세포를 상술한 항목 1과 동일한 조건하에 적절한 기간 동안 배양하여 얻어지는 배양물의 상등액을 사용할 수 있다. 배양 기간은 특별히 한정되지 않지만, 1일 이상 배양한 배양물의 상등액을 사용하는 것이 바람직하다.
2.2. 골수 세포
상기 방법에 사용되는 골수 세포는 포유동물 유래인 것이면 특별히 한정되지 않는다. 즉, 포유동물의 태아, 신생아 또는 성체의 골수에서 유래된 임의의 세포를 사용할 수 있지만, 골수 간질 세포, 특히 간엽계 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하고, 또는 조혈 줄기세포 분획의 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 포유동물로부터의 이들 골수 세포의 채취는 통상의 방법에 따라 행해진다. 골수 세포로는 초대 배양 세포를 사용하는 것이 바람직하지만, 동결 보존된 골수 세포를 사용할 수도 있다.
골수 세포와 지방 조직은 동일 종에서 유래된 것이 바람직하다. 즉, 마우스 골수 세포에는 마우스 지방 조직 유래의 세포를 사용하고, 래트 골수 세포에는 래트 지방 조직 유래의 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
2.3. 제대혈 유래 세포
상기 방법에 사용되는 제대혈 유래 세포는 포유동물 유래인 것이면 특별히 한정되지 않지만, 제대혈 중의 단핵구가 바람직하다. 제대혈로부터의 세포 채취는 통상의 방법에 따라 행해진다. 또한, 전술한 항목에서 언급한 것과 마찬가지로 제대혈 유래 세포와 지방 조직은 동일 종에서 유래된 것이 바람직하다.
2.4. 배양 조건
세포의 배양액으로는, DMEM 배양액, MEM 배양액, α-MEM 배양액, RPMI 배양액, DMEM/F12 배양액 등과 같이 포유동물의 지방 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배양액에 적절량의 소혈청을 첨가하여 제조한 것을 사용한다. 소혈청의 첨가량은 특별히 한정되지 않으며, 세포의 기원이나 유형에 따라 적절하게 결정된다. 소혈청은 바람직하게는 0％ 내지 20％, 더욱 바람직하게는 5％ 내지 10％ 정도의 양으 로 첨가한다. 소혈청 대신에 뉴트리도마 (베링거 제조), 인간 혈청 등을 사용할 수도 있다.
배양은 지방 조직으로부터 단리된 세포를 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포에 첨가하고 시판되는 배양 디쉬를 사용하여 2차원적으로 동시배양하거나, 또는 지방 조직으로부터 단리된 세포의 액성 인자가 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포의 액성 인자와 상호 소통할 수 있는 조건하에서 동시배양하여 수행한다. 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방 조직으로부터 단리된 세포와의 혼합비 (세포수의 비)는 0.1:1 내지 1:10인 것이 바람직하고, 골수 세포의 경우에는 1:4 정도인 것이 특히 바람직하다.
지방 조직 유래 세포의 배양 상등액을 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포에 첨가하는 경우에는, 상기한 바와 같이 적절한 기간, 즉 1일 이상 배양한 세포의 배양 상등액을 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포에 첨가하여 2차원적으로 동시배양한다. 배양 상등액의 첨가량은 특별히 한정되지 않으며, 사용하는 세포의 유형에 따라 적절하게 조정되지만, 마우스 골수 세포의 경우에는 지방 조직 유래 세포를 상기 골수 세포의 1 내지 10배, 바람직하게는 4배 수로 배양하여 얻어지는 배양 상등액을 사용하는 것이 바람직하다.
온도 또는 CO2 등의 조건은 사용할 세포의 성질에 따라 적절하게 결정되지만, 일반적으로 4 내지 6％ CO2와 33 내지 37％인 것이 바람직하고, 특히 5％ CO2와 37％ 정도인 것이 바람직하다. 배양 기간도 특별히 한정되지 않으며, 필요로 하는 심근 세포의 발현이 관찰될 때까지 적절한 배지 교환을 행하면서 배양을 유지할 수 있다. 본 발명의 발명자들의 실험 결과에 따르면, 배양 개시후 제7일부터는 박동하는 심근 세포가 관찰되었고, 이와 동시에 구형의 심근 전구세포 (심근 줄기세포)의 증식이 개시되었다. 또한, 배양 개시후 1 내지 2주 동안에는 심근 세포라고 추정되는 20 내지 60개 정도의 콜로니가 생성되었다.
배양 동안에는 배양액에 세포의 분화 및 증식을 촉진시키는 사이토카인을 적절하게 첨가할 수도 있다. 이러한 사이토카인의 예로는 EGF, TGF-α, HB-EGF, FGF, HGF 등의 EGF족, TGF-β 등의 TGF-β족, LIF 등의 IL족, VEGF-A 등의 VEGF족, PDGF-AB, PDGF-BB 등의 PDGF족, 에프린 B 등의 에프린족, SCF (Stem Cell Factor, 줄기 세포 인자) 등이 있다. 특히, LIF, HB-EGF, PDGF가 바람직하다.
사이토카인의 첨가량은, 사용할 사이토카인 또는 세포의 성질에 따라 적절하게 결정된다. 마우스 지방 조직으로부터 단리된 세포를 사용하는 경우, LIF는 1000 U/㎖ 내지 5000 U/㎖ 정도, HB-EGF는 100 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖ 정도, PDGF-AB는 1 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖ 정도로 첨가할 수 있지만, 그 첨가량이 상기한 범위로 한정되는 것은 아니다.
3. 지방 조직, 골수 세포, 제대혈 유래 세포로부터 분화 유도된 심근 세포
본 발명은 상기한 어느 한 방법으로 제조되는 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포를 제공한다. 여기서의 심근 전구세포는, 심근 세포로 분화하는 능력을 갖춘 세포를 말하며 심근 줄기세포를 포함한다.
이들 세포는 그의 기원이 되는 세포와는 달리, 심근 세포에 특징적인 형태적 특성, 단백질 발현, 유전자 발현을 나타낸다. 예를 들어, 심근 세포는 전자 현미경하에서 미토콘드리아가 풍부하고 ANP 과립을 함유하며 Z대를 갖는 것으로 관찰되고, 도립 현미경하에서는 박동하는 방추형 세포이며 서서히 모여서 시트를 형성하고 동조하여(synchronization) 박동하는 세포로서 관찰된다. 또한, 심근 전구세포는 심근세포보다도 더 둥근 구형의 세포이고 서서히 방추형이 되며 박동하는 세포로서 관찰된다. 한편, 단백질 발현에 있어서는 심근 세포에 특징적인 근절 액틴 (Sr-1 (α-Sarcomeric Muscular Actin)) 및 심장 액틴의 발현이 관찰되고, 유전자 발현에 있어서는 심근 세포에 특징적인 α,β-MHC, MLC-2v, BNP의 발현 또는 전사 인자 GATA-4 또는 NKX2.5의 발현이 관찰된다. 이러한 특징에 비추어, 분화 유도된 세포가 심근 세포 또는 심근 전구세포인 것을 확인할 수 있다.
4. 지방 조직, 골수 세포, 제대혈 유래 세포로부터 분화 유도된 심근 세포의 용도
4.1. 재생 의료에서의 응용
본 발명에서 지방 조직, 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포로부터 얻어지는 심근 세포 및 심근 전구세포는, 전자 현미경하에서 각각 심근 세포 및 심근 전구세포의 일반적인 특징을 갖고, 유전자 또는 단백질 발현 양상에 있어서도 심근 세포 및 심근 전구세포의 경우와 일치한다. 따라서, 이들 심근 전구세포 또는 심근 세포를 심근 경색의 래트 모델에 이식하면, 이식된 숙주 중에서 숙주의 심근 세포와 동조하여 기능하는 심근 세포가 된다. 특히, 재료가 되는 지방 조직, 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포로서, 이식해야 할 포유동물 개체로부터 얻은 것을 사용하 면, 상기 포유동물에서 거부 반응을 야기하지 않으면서 이식가능한 심근 전구세포 또는 심근 세포를 얻을 수 있다. 즉, 본 발명의 방법으로 얻어지는 심근 전구세포 또는 심근 세포는 심장 재생에 적절하게 사용될 수 있다.
현재, 심근 경색시에 발생된 허혈 영역에서의 혈관 재생 의료는 다량의 골수액으로부터 얻은 혈관 줄기세포의 국소 이식에 의해 실시되고 있다. 골수액 채취는 전신 마취하에 행해지고, 고령자에 있어서는 이러한 기술 자체가 위험스러운 행위이다. 이와는 달리, 지방 조직의 채취는 간단한 피부 국소 마취로도 가능하고, 환자의 생명을 위협하는 위험은 거의 없다. 또한, 지방 조직은 풍부하게 존재하는 재료이다. 따라서, 본 발명에 의한 심장 재생 기술은 의료 업계의 발전에 크게 기여한다.
4.2. 스크리닝계에서의 응용
본 발명에서 지방 조직, 골수 세포, 제대혈 유래 세포로부터 얻어지는 심근 세포 및 심근 전구세포는, 전자 현미경하에는 각각 심근 세포 및 심근 전구세포의 일반적인 특징을 갖고, 유전자 또는 단백질 발현에 있어서도 심근 세포 및 심근 전구세포의 경우와 일치한다. 따라서, 이들 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포에 피검 물질을 첨가하여 배양할 때 발생하는 표현형의 변화 (형태 또는 단백질 발현에서의 변화) 또는 유전형 변화 (유전자 발현에서의 변화)를 첨가하지 않은 경우와 비교함으로써, 해당 피검 물질에 대한 심근 세포의 감수성 또는 해당 피검 물질의 심근 세포에 대한 효과를 평가할 수 있다. 이러한 평가계는 약제 감수성 시험 또는 심질환 치료약의 스크리닝에 이용할 수 있다.
실시예 1: 지방 조직으로부터의 심근 세포의 분화
마우스 및 래트의 경부 또는 복부의 지방 조직 약 1.5 ㎖를 안과 수술용 가위로 미세하게 절단하고, 37℃에서 15 분 동안 1 ㎖의 디스파제액 중에 침지시켜 세포를 유화(loosening)시켰다. 이어서, 세포를 40 미크론의 나일론 메쉬에 통과시켜서 1×106개/㎖의 밀도로 파종한 후, DMEM + 10％ FCS의 배지를 사용하여 5％ CO2, 37℃에서 24웰 배양 디쉬 (직경 약 1.3 cm)에서 2차원 배양하였다.
마우스 지방 세포의 배양 결과를 도 1에 도시하였다. 배양 개시후 제3일부터는 박동하는 심근 세포 형태의 세포가 관찰되었고, 이와 동시에 구형의 심근 전구세포/줄기세포 형태의 세포의 증식 개시가 관찰되었다. 심근 세포는, 입체 현미경하에서는 미토콘드리아가 풍부하고 ANP 과립을 함유하며 Z대를 갖는 것으로 식별할 수 있고, 도립 현미경하에서는 박동하는 방추형 세포라는 형태적 특징 등으로 식별할 수 있다. 배양 개시후 약 제1주에는 방추형 세포가 나타났고, 배양 개시후 제2주 내지 제3주에는 시트 구조가 관찰되었다. 배양 개시후 제1주에는 1개 웰 당 심근 세포라고 추정되는 200 내지 300개 정도의 콜로니 (집단)가 관찰되었다.
실시예 2: 면역염색
실시예 1에서 얻어진 세포가 심근 세포의 특징을 구비하는지를 확인하기 위해서, 형광 표지한 항-근절 액틴 (Sr-1 (α-Sarcomeric Muscular Actin)) 항체 (다코(DAKO) 제조) 및 항-심장 액틴 (엠비엘(MBL) 제조)을 사용한 면역염색을 행하였 다. 근절 액틴 및 심장 액틴은 둘다 심근 세포에 특징적인 발현이 관찰되는 단백질이다.
면역염색은 실시예 1에서와 동일한 방식으로 마우스 지방 조직 세포를 14일 동안 배양한 후에 여기에 1 ㎍/㎖의 항체를 첨가함으로써 행하였다. 결과를 도 2에 도시하였다. 도 2로부터 명백한 바와 같이, 배양 후의 세포는 녹색으로 형광 표지되었고, 이에 따라 근절 액틴 및 심장 액틴에 양성임이 확인되었다.
지방 조직을 실시예 1에서와 동일한 방식으로 분산시켜서 Lin 항체 (CD4, CD8, Gr-1, Mac-1, TER119 항체를 혼화한 것으로서, 성숙한 혈액 세포를 인식할 수 있는 조합임. 모두가 파르밍겐(Pharmingen) 제조), c-Kit 항체 (파르밍겐 제조) 또는 β1 인테그린 항체 (파르밍겐 제조)로 염색하였고, 유동세포계측법에 의한 형광 세포 자동 분류 장치 (에픽스 아르트라(Epics Artra), 쿨터(Coulter) 제조)로 세포를 분획화하여 회수하고, 얻어진 세포 각각 104개씩을 10％ 소혈청-함유 DMEM 배양액과 혼화하고, 24웰 배양 디쉬에서 실시예 1에서와 동일한 방식으로 배양하였다. 그 결과, 실시예 1에서와 동일한 근절 액틴-양성의 심근 세포가, Lin-음성이고 c-Kit-음성 내지 약한 양성이거나, 또는 Lin-음성이고 β1 인테그린-양성인 세포 (도 3에 도시한 세포 집단)로부터 효율적으로 발생하는 것이 확인되었다 (도 3).
실시예 3: 유전자 발현 분석
실시예 1에서 얻어진 세포가 심근 세포인지를 확인하기 위해서, RT-PCR에 의 한 유전자 발현 분석을 행하였다. 우선, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 마우스 지방 조직 유래 세포를 14일 동안 배양한 후에 RNeasy 미니 키트(RNeasy Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen) 제조)을 사용하여 전체 RNA를 추출하고, PCR 키트 (클론테크(Clontech) 제조)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 이어서, 어드밴티지 폴리머라제 믹스(Advantage polymerase Mix) (클론테크 제조)를 이용하고 이하에 나타내는 α,β-MHC, α-골격 A, α-심장 A, MLC-2a, 2v, BNP 검출용 PCR 프라이머를 사용한 RT-PCR을 행하였다:
α-MHC-S: 5'-tgt ctg ctc tcc acc ggg aaa atc t-3' (서열 1)
α-MHC-AS: 5'-cat ggc caa ttc ttg act ccc atg a-3' (서열 2)
β-MHC-S: 5'-aac cca ccc aag ttc gac aag atc g-3' (서열 3)
β-MHC-AS: 5'-cca act ttc ctg ttg ccc caa aat g-3' (서열 4)
α-골격 A-S: 5'-gga gat tgt gcg cga cat caa aga g-3' (서열 5)
α-골격 A-AS: 5'-tgg tga tcc aca tct gct gga agg t-3' (서열 6)
α-심장 A-S: 5'-gac cac cgc ttt ggt gtg tga caa t-3' (서열 7)
α-심장 A-AS: 5'-gcc aga atc cag aac aat gcc tgt g-3' (서열 8)
MLC-2a-S: 5'-agc agg cac aac gtg gct ctt cta a-3' (서열 9)
MLC-2a-AS: 5'-cct ggg tca tga gaa gct gct tga a-3' (서열 10)
MLC-2v-S: 5'-atg gca cct ttg ttt gcc aag aag c-3' (서열 11)
MLC-2v-AS: 5'-ccc tcg gga tca aac acc ttg aat g-3' (서열 12)
BNP-S: 5'-aaa agt cgg agg aaa tgg ccc aga g-3' (서열 13)
BNP-AS: 5'-tgc ctg agg gga aat gct cag aac t-3' (서열 14)
(S: 센스 프라이머, AS: 안티센스 프라이머)
결과를 도 4에 도시하였다. 도면 중의 각 레인이 나타내는 것은 다음과 같다: 1 - 채취 직후의 지방 조직, 2 - 배양 후의 세포, 3 - 마우스 심장 유래의 심근 세포, 4 - 물. 도 4로부터 명백한 바와 같이, 배양 후의 세포에서는 심근 세포에 특이적인 α,β-MHC, α-골격 A, α-심장 A, MLC-2v, BNP의 발현이 관찰되었다.
실시예 4: 핵내 전사 인자의 분석
이어서, 심근 세포에 특이적인 핵내 전사 인자인 GATA-4, 및 NKX2.5 유전자의 발현 분석을 행하였다. 분석은 실시예 3에 기재한 방법에 따라 cDNA를 얻은 후에 이하에 나타내는 GATA-4, 및 NKX2.5 검출용 PCR 프라이머를 사용한 RT-PCR로 행하였다:
Nkx2.5-S: 5'-tct ggt tcc aga acc gtc gct aca a-3' (서열 15)
NkX2.5-AS: 5'-atc gcc ctt ctc cta aag gtg gga gt-3' (서열 16)
GATA4-S: 5'-gag tgt gtc aat tgt ggg gcc atg t-3' (서열 17)
GATA4-AS: 5'-tgc tgc tag tgg cat tgc tgg agt t-3' (서열 18)
(S: 센스 프라이머, AS: 안티센스 프라이머)
결과를 도 5에 도시하였다. 도면 중의 각 레인이 나타내는 것은 다음과 같다: 1 - 채취 직후의 지방 조직, 2 - 배양 후의 세포, 3 - 마우스 심장 유래의 심근 세포, 4 - 물. 도 5로부터 명백한 바와 같이, 배양 후의 세포에서는 심근 세포에 특이적인 전사 인자인 GATA-4, 및 NKX2.5 유전자의 발현이 확인되었다.
실시예 5: 배양 조건의 최적화 (지방 조직으로부터 심근 세포로의 분화)
DMEM + 10％ FCS의 배양액에 각각 LIF (Leukemia Inhibitory Factor, 백혈병 억제 인자) 2000 U/㎖, HB-EGF 0.5 ㎍/㎖, LIF 2000 U/㎖ + HB-EGF 0.5 ㎍/㎖를 첨가하고, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 배양을 행하였다. 배양 후의 세포를 α-근절 액틴 및 심장 액틴에 대한 항체를 사용하여 실시예 2에서와 동일한 방식으로 면역염색하고, 형광 현미경 (1×70, 올림푸스(Olympus))을 사용하여 그 형광 강도로부터 심근 세포의 발현수를 미첨가 경우와 비교 평가하였다 (각각 4개씩의 샘플).
그 결과, LIF 단독으로는 심근 세포 분화 촉진 경향이 있긴 해도 첨가하지 않는 경우와의 유의차는 관찰되지 않았다. 한편, HB-EGF 단독으로는 첨가하지 않는 경우와 비교하여 p < 0.05의 유의차로 심근 세포로의 분화가 촉진되었다. 또한, LIF + HB-EGF에서는 p < 0.05의 유의차로 심근 세포로의 분화가 가장 크게 촉진되었다.
실시예 6: 심근 경색 래트 모델로의 이식 실험
수컷 SD 래트 (N = 19)에서 동맥 결찰에 의해 심근 경색을 유도하여 심근 경색 래트 모델을 제조하였다. 실시예 1에서의 절차에 따라 래트 지방 조직 유래의 세포를 단리하고, 10％ FCS-함유 DMEM 배양액 중에서 배양하여 지방 조직 유래의 심근 세포를 얻었다. 얻어진 지방 조직 유래의 심근 세포를 심근 경색 래트 모델 (N = 9)의 심근 경색단에 주입하고 (2×106개/㎖ 농도의 세포를 0.1 ㎖씩 5개 영역 에 주입) 이것을 시험군으로 하였다. 또한, 비교군 및 대조군으로서는, 각각 PBS를 주입한 심근 경색 래트 모델 (N = 10) 및 경색 처치를 실시하지 않은 가장(假裝)-수술한(sham-operated) 래트 (N = 6)를 준비하였다. 주입 후 제28일에 각각의 군에 대해서 심기능 개선을 심초음파 검사로 분석한 결과, PBS를 주입한 비교군에서는 정상 래트의 약 1/5 수준까지의 심기능 저하가 관찰되었지만, 지방 조직 유래 심근 세포를 주입한 시험군에서는 정상 래트의 약 4/5 수준까지의 심기능 저하만이 관찰되었다.
실시예 7: 지방 조직 유래 세포와 골수 유래 세포의 동시배양
실시예 1에 따라 단리한 마우스 지방 조직의 세포 1×106개를 PKH67 녹색 형광 세포 링커 키트(Green Fluorescent Cell Linker Kit) (시그마(SIGMA) 제조)로 형광 표지한 골수 세포 1×105개/㎖와 혼합하여 DMEM + 10％ FCS의 배양액 1 ㎖ 중에 혼화한 후, 24웰 배양 디쉬 (직경 약 1.3 cm)에서 배양하였다. 비교물로서, PKH67로 형광 표지한 골수 세포를 동일 조건하에서 단독 배양하였다.
결과를 도 6에 도시하였다. 심근 조직 유래 세포와 동시배양을 행한 골수 세포에서는, 배양 개시후 1 내지 2주 동안에 심근 세포라고 추정되는 20 내지 60개 정도의 콜로니가 생성되었다. 이 심근 세포 콜로니에는 PKH67로 형광 표지된 골수 유래의 세포가 포함되어 있었다 (도 6A). 한편, 단독 배양한 골수 세포에서는, 심근 세포로의 분화가 관찰되지 않았다 (도 6B).
실시예 8: 동시배양 조건의 최적화
1×106개의 지방 조직 유래 세포와 동시배양하는 골수 유래 세포의 수를 5×104개, 1×105개, 2.5×105개, 5×105개, 1×106개로 변화시키고 이에 의한 영향을 검토하였다. 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7로부터 명백한 바와 같이, 2.5×105개의 골수 세포와 혼합한 경우, 즉 지방 조직 유래 세포:골수 세포 = 4:1의 비율로 동시배양한 경우에서 PKH67로 형광 표지된 골수 세포 유래 심근 세포가 가장 많이 얻어졌다.
실시예 9: 골수 세포의 분화에 영향을 주는 인자
이어서, 골수 세포의 분화에 영향을 주는 인자를 조사하기 위해서, 지방 조직 유래의 세포와 골수 세포를 0.4 미크론의 세공을 갖는 막 (세포 배양 삽입물, 팔콘(FALCON) 제조)으로 격리시켰다는 점을 제외하고는 실시예 8에서와 동일한 방식으로 하여 배양하였다. 그 결과, 세포 사이의 부착이 억제되었고, 액성 성분만이 상호 소통하는 조건하에서 골수 세포가 심근 세포로 분화되는 것이 관찰되었다. 이는 지방 조직의 심근 세포로의 분화 배양계에서 얻어지는 배양 상등액 중에, 골수 세포를 심근 세포로 분화 유도하는 액성 분자가 포함되어 있음을 의미한다.
실시예 10: 인간 지방 조직으로부터 심근 세포로의 분화
인간 심장의 대동맥 주위 및 대망부(大網部)에 존재하는 지방 조직으로부터 세포를 단리하여 37℃에서 30 분 동안 5 ㎖의 디스파제액 중에 침지시켜 세포를 유화시킨 후에, 이 세포를 40 미크론의 나일론 메쉬에 통과시켰다. 상기 세포를 1× 106개/㎖의 밀도로 DMEM + 10％ FCS의 배지에 파종하고, 5％ CO2, 37℃에서 24웰 배양 디쉬 (직경 약 1.3 cm)에서 2차원 배양을 행하였다.
배양 2주 후의 세포에 항-근절 액틴 (SA) 항체를 사용한 면역염색을 행하였다. 음성 대조군로서는 2차 항체인 항-마우스 면역 글로블린만을 사용하여 동일한 방식으로 염색하였다. 그 결과, 인간 지방 조직으로부터 SA-양성 심근 세포로의 분화가 확인되었다 (도 8A 상측).
또한, PDGF-AB (인비트로젠(Invitrogen) 제조) 10 ng/㎖를 첨가하여 동일한 방식으로 2주 동안 배양하고, 형광 현미경 (×20)하에서 무작위로 5개 영역을 택하여 부착된 세포의 총 개수에 대한 SA-양성 세포의 수를 구하고, 첨가하지 않은 경우와 비교하였다 (도 8C). 그 결과, PDGF-AB를 첨가하지 않은 경우에는, 부착된 세포 전체 중의 약 1％가 SA-양성인 반면, PDGF-AB를 첨가한 경우에는 SA-양성 심근 세포가 이보다 약 2배 많은 것으로 확인되었다.
실시예 11: 마우스 지방 조직과 인간 제대혈의 동시배양에 의한, 제대혈 유래 세포의 심근 세포로의 분화
피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus)를 이용하여 인간 제대혈 (CB)로부터 단핵구 분획만을 분리하였다. 실시예 1의 절차에 따라 마우스 지방 조직으로부터 세포를 분리하였다. 도 9A에 도시한 바와 같이, 인간 제대혈 유래 단핵구 세포 (hCBMNC) 1×106개/㎖와 마우스 지방 조직 유래 세포 (BATDC) 2×105개/㎖를 0.4 미크론의 세공을 갖는 막 (세포 배양 삽입물, 팔콘 제조)으로 격리시키고, 분리 동시 배양을 행하였다. 배양 조건은 DMEM + 10％ FCS의 배지를 사용하고, 5％ CO2, 37℃에서 2차원 배양을 행하였다. 대조군으로서, hCBMNC 1×1O6개/㎖만을 동일한 조건하에서 24웰 배양 디쉬를 사용하여 배양하였다.
배양 2주 후의 세포에 항-근절 액틴 (SA) 항체를 사용한 면역염색을 행하였다. 그 결과, hCBMNC에서 SA-양성 심근 세포로의 분화가 관찰되었지만 (도 9B, 우측), hCBMNC만을 단독 배양한 경우에는 심근 세포로의 분화가 관찰되지 않았다 (도 9B, 좌측). 또한, 형광 현미경 (×20)하에서 무작위로 5개 영역을 택하여 부착된 세포의 총 개수에 대한 SA-양성 세포수를 구하였더니, 동시배양인 경우에는 부착된 세포 전체 중의 약 1％가 SA-양성 심근 세포인 것으로 확인되었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
본 발명으로 얻어지는 심근 세포 및 심근 전구세포는 표현형 형질과 유전형 형질 모두에서 심근 세포의 경우와 일치한다. 따라서, 이들 세포는 심장 영역의 재생 의료에 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 심근 세포의 약제 감수성 평가 또는 심질환 치료약의 스크리닝 등에도 사용할 수 있다.
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Claims (11)

  1. 포유동물의 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포를 포유동물의 지방 조직으로부터 단리된 세포 또는 이의 배양 상등액과 함께 배양함으로써, 상기 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포를 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 소혈청 또는 인간 혈청 또는 이의 임의의 대체물을 함유하는 배양액을 사용하여 1일 이상 배양하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양액에 1종 이상의 사이토카인을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 사이토카인이 EGF, TGF-α, HB-EGF, FGF 및 HGF 등의 EGF족, TGF-β 등의 TGF-β족, LIF 등의 IL족, VEGF-A 등의 VEGF족, PDGF-AB 및 PDGF-BB 등의 PDGF족, 에프린(Ephrin) B 등의 에프린족 및 SCF (Stem Cell Factor, 줄기 세포 인자)에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 세포가 간엽계 줄기세포 또는 조혈 줄기세포인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제대혈 유래 세포가 단핵구인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 세포 또는 제대혈 유래 세포와 지방 조직으로부터 단리된 세포와의 혼합 비율이 0.1:1 내지 1:10인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어지는 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포가 근절 액틴(sarcomeric actin)-양성 세포인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포.
  10. 제9항에 있어서, 포유동물 성체에 이식가능한 것을 특징으로 하는 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포.
  11. 제9항 또는 제10항의 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포에 피검 물질을 첨가함으로써 심근 전구세포 및(또는) 심근 세포에 대한 상기 피검 물질의 효과를 평가하는 방법.
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Patent event code: PJ02011S01I

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

Decision date: 20080325

Appeal identifier: 2008101000566

Request date: 20080125

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PN2301 Change of applicant

Patent event date: 20080215

Comment text: Notification of Change of Applicant

Patent event code: PN23011R01D

AMND Amendment
PB0901 Examination by re-examination before a trial

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20080225

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event date: 20080125

Patent event code: PB09011R01I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20070827

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20060724

Patent event code: PB09011R02I

B701 Decision to grant
PB0701 Decision of registration after re-examination before a trial

Patent event date: 20080325

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PB07012S01D

Patent event date: 20080304

Comment text: Transfer of Trial File for Re-examination before a Trial

Patent event code: PB07011S01I

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Comment text: Registration of Establishment

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