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KR100947751B1 - 다가 수막구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신 - Google Patents

다가 수막구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신 Download PDF

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KR100947751B1
KR100947751B1 KR1020037009760A KR20037009760A KR100947751B1 KR 100947751 B1 KR100947751 B1 KR 100947751B1 KR 1020037009760 A KR1020037009760 A KR 1020037009760A KR 20037009760 A KR20037009760 A KR 20037009760A KR 100947751 B1 KR100947751 B1 KR 100947751B1
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리올로버트피
Original Assignee
아벤티스 파스퇴르
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Abstract

본 발명은 병원성 세균 나이제리아 메닌기티디스에 의해 야기되는 수막구균 질환에 대한 광범위한 보호를 제공하는 조합 백신을 기재하고 있다. 백신은 백신의 단일 투여량으로서 제형화된 4개의 별개의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함한다. 나이제리아 메닌기티디스 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y로부터 유래된 정제된 협막 폴리사카라이드는 화학적으로 활성화되어 공유 화학 결합에 의해 캐리어 단백질에 선택적으로 부착되고, 소아 뿐만 아니라 성인에서 각종 엔. 메닌기티디스 균주에 대한 지속적인 면역성을 유발할 수 있는 폴리사카라이드-단백질 접합체를 형성한다.
엔. 메닌기티디스(N. meningitidis), 수막구균, 다가결합백신, 디프테리아 톡소이드, 캐리어 단백질

Description

다가 수막구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신{Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine}
본 출원은 2001년 1월 23일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/263,435호에 대한 이익을 청구한다.
본 발명은 일반적으로 의학 분야 및 보다 특히, 미생물학, 면역학, 백신 및 세균성 병원균에 의한 감염을 면역화에 의해 예방하는 분야에 관한 것이다.
나이제리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)가 전세계에서 세균성 수막염 및 패혈증의 주요 원인이다. 최근 30년 동안에 풍토성 수막구균성 질환의 발생 빈도는 선진국에서는 100,000명당 1명 내지 5명이고 개발 도상국에서는 100,000명당 10명 내지 25명이다[참고문헌: Reido, F.X., et. al. 1995]. 유행기에 수막구균성 질환의 발생 빈도는 1000,000명당 1000명에 이른다. 미국에서는 해마다 세균성 수막염이 약 2,600건에 이르고 개발 도상국에서는 평균적으로 330,000건에 이르고 있다. 치사율은 10 내지 20%이다.
병원성 수막구균은, 당해 유기체의 외막 표면에 부착된 폴리사카라이드 협막으로 둘러싸여져 있다. 13개의 상이한 수막구균 혈청그룹이 협막 폴리사카라이드의 면역학적 특이성을 근거로 동정되었다[참고문헌: Frasch, C.E., et. al. 1985]. 이들 13개의 혈청그룹(serogrouo) 중에서 5개가 대부분의 수막염 질환을 일으키고 이들은 혈청그룹 A, B, C, W135 및 Y를 포함한다. 혈청그룹 A는 대부분의 유행성 질환을 일으킨다. 혈청그룹 B, C 및 Y는 주요 풍토성 질환 및 국지적인 발병을 일으킨다.
사람 비인두-구인두 점막이 나이제리아 메닌기티디스의 유일하게 알려진 천연 보유고이다. 점막 세포의 외부 표면 및 구인두의 상피하 조직 둘다에 콜로니를 형성한다. 수막구균의 보균은 수개월 동안 지속할 수 있다. 수막구균은 직접적인 접촉 또는 공기 소적에 의해 전염된다. 수막구균은 세포내이입의 결과로서 포식 액포를 통해 점막 상피를 통과함에 따라 침입하게 된다. 수막구균의 침입에 대한 숙주 방어는 보체-매개된 용균 작용에 의존한다. 보체-매개된 용균 작용에 관여하는 혈청 항체는 대부분 외부 협막 폴리사카라이드에 대해 유도된다.
수막구균 폴리사카라이드를 주성분으로 하는 백신이 협막 폴리사카라이드에 대한 면역 반응을 유발하는 것으로 보고되어 왔다. 이들 항체는 특정 혈청그룹의 수막구균에 대해 보체-매개된 용균 작용을 할 수 있다. 수막구균 폴리사카라이드 백신이 소아 및 성인에게 있어 효과적인 것으로 밝혀졌지만[참고문헌: Peltola, H., et. al. 1997 and Artenstein, M.S., et. al. 1970] 이의 효능이 유아 및 아동에게 제한되었다[참고문헌: Reingold, A.L., et. al. 1985]. 보다 젊은 집단에서 폴리사카라이드의 연속 투여는 부스터 반응을 약하게 유발하거나 또는 전혀 유발하지 못한다[참고문헌: Goldschneider, I., et. al. 1973 and Gold, R., et. al. 1977]. 수막구균 폴리사카라이드 백신에 의해 유발된 보호 지속 기간은 오랫동안 지속적이지 못하고 성인 및 4세 이상의 어린이에게 있어서 3 내지 5년인 것으로 추정되었다[참고문헌: Brandt, B., et. al. 1975, Kayhty, H., et. al. 1980, and Ceesay, S.J., et. al. 1993]. 1세 내지 4세의 어린이에게 있어서 보호 지속기간은 3년 미만이다[참고문헌: Rein-gold, A.L., et. al. 1985].
폴리사카라이드는 T-헬퍼 임파구에 대한 항원 제공 및 T-헬퍼 임파구의 자극을 위한 전제 조건인 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합할 수 없고, 즉 이들은 T-세포 비의존성 항원이다. 폴리사카라이드는, T-헬퍼 임파구의 도움 없이, 항체 생산을 위해 B 임파구를 자극할 수 있다. T 세포 비의존성 B 임파구의 자극의 결과로서, 이들 항원에 의한 면역화 후에 기억 유도가 없다. 폴리사카라이드 항원은 성인에게서 매우 효과적인 T 세포 비의존성 반응을 유발할 수 있지만, 이들 T 세포 비의존성 반응은 유아 및 아동의 비성숙한 면역 시스템에서는 약하다.
T 세포 비의존성 폴리사카라이드 항원은, 폴리사카라이드가 단백질 분자("캐리어" 또는 "캐리어 단백질")에 공유적으로 부착함으로써 T 세포 의존성 항원으로 전환될 수 있다. 접합체 백신의 폴리사카라이드 성분과 결합하는 B 세포는 접합된 캐리어 단백질의 일부인 펩타이드에 대해 특이적인 헬퍼 T 세포에 의해 활성화될 수 있다. 캐리어 단백질에 대한 T 헬퍼 반응은 폴리사카라이드에 대한 항체 생산을 증강시키는 작용을 한다.
혈청그룹 B 폴리사카라이드는 사람 집단에서 불량한 비면역원성인 것으로 밝혀졌다[참고문헌: Wyle, F.A., et. al. 1972]. 상기 혈청그룹 폴리사카라이드가 단백질에 화학적으로 부착되어도 실험 동물에서 면역 반응을 현저히 변화시키지는 못하였다[참고문헌: Jennings, H,J., et.al. 1981]. 당해 혈청그룹 폴리사카라이드의 면역 반응이 없는 이유는 혈청그룹 B 폴리사카라이드와 폴리시알릴화된 숙주 당단백질(예: 신경 세포 접착 분자) 사이의 구조가 유사하기 때문인 것으로 간주된다.
혈청그룹 C 폴리사카라이드를 주성분으로 하는 수막구균 접합체 백신은 기술된 바 있다. 이러한 일가 백신은 혈청그룹 C에 상응하는 엔. 메닌기티디스의 균주에 존재하는 협막 폴리사카라이드에 대한 강력한 기능성 항체 반응을 유발한다. 이러한 백신은 단지 혈청그룹 C 세균에 의해 야기되는 질병을 예방할 수 있다.
수막구균 폴리사카라이드를 주성분으로 하는 기존의 백신은 아동에게 사용이 제한되고, 성인에게서는 장기간 지속되지 않는다. 수막구균 감염의 위험 상태에서, 소아를 포함하는 모든 그룹에서 장기간 지속되는 보호를 유도할 수 있는 것으로 밝혀진 유일한 수막구균 백신은 엔. 메닌기티디스의 단일 혈청그룹으로부터의 폴리사카라이드를 주성분으로 하며, 다른 혈청그룹들은 감염에 대한 보호를 제공하지 않는다. 따라서, 수막구균 감염의 위험 상태에서 소아 및 성인에서 수막구균성 질환에 대한 광범위한 장기간의 보호를 제공할 수 있는 수막구균 접합체 백신이 요구된다. 본 발명의 다가 수막구균 폴리사카라이드는 엔. 메닌기티디스의 주요 병원성 혈청그룹으로부터의 면역원성 폴리사카라이드가 캐리어 단백질에 접합됨으로써 T-의존성 항원으로 전환되는 백신 제형을 제공함으로써 상기 필요성을 해결한다.
발명의 요약
본 발명은 병원성 나이제리아 메닌기티디스에 의해 유발된 질환 치료를 위한, 수막구균 폴리사카라이드-단백질 접합체의 면역학적 조성물을 제공한다.
본 발명은, 각각의 접합체가 캐리어 단백질에 접합된 엔. 메닌기티디스로부터의 협막 폴리사카라이드를 포함하는 2개 이상의 단백질-폴리사카라이드 접합체를 포함하는 면역학적 조성물을 제공한다.
본 발명은, 각각의 접합체가 캐리어 단백질에 접합된 엔. 메닌기티디스의 상이한 혈청그룹으로부터의 협막 폴리사카라이드를 포함하는 2개 이상의 별개의 단백질-폴리사카라이드 접합체를 포함하는 면역학적 조성물을 제공한다.
본 발명은, 병원성 엔. 메닌기티디스에 의해 유발되는 수막구균 폴리사카라이드-단백질 접합체용 백신을 제공한다. 본 발명은, 각각의 접합체가 캐리어 단백질에 접합된 상이한 협막 폴리사카라이드를 함유하고 각각의 협막 폴리사카라이드가 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y로부터의 협막 폴리사카라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역학적 유효량의 2개 내지 4개의 별개의 단백질-폴리사카라이드 접합체를 포함하는 다가 수막구균 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 병원성 엔. 메닌기티디스로부터 2개 이상의 협막 폴리사카라이드를 정제하는 단계; 정제된 폴리사카라이드를 하나 이상의 캐리어 단백질에 접합시키는 단계 및 상기 접합체들을 조합하여 다가 수막구균 폴리사카라이드-단백질 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 다가 수막구균 폴리사카라이드-단백질 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 면역학적 유효량의 본 발명의 면역학적 조성물을 사람 또는 동물에게 투여함을 포함하여, 엔. 메닌기티디스의 협막 폴리사카라이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 각각의 접합체가 캐리어 단백질에 접합된 상이한 협막 폴리사카라이드를 함유하고 각각의 협막 폴리사카라이드가 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y로부터의 협막 폴리사카라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역학적 유효량의 2개 내지 4개의 별개의 단백질-폴리사카라이드 접합체를 포함하는 다가 수막구균 백신을 제공한다.
본 발명은 면역학적 유효량의 본 발명의 백신을 엔. 메닌기티디스에 의한 감염에 걸리기 쉬운 사람 또는 동물에게 투여함을 포함하여, 이러한 사람 또는 동물을 보호하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 모든 특허, 특허 출원 및 기타 문헌은 전문으로 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명은, 각각의 접합체가 캐리어 단백질에 접합된 협막 폴리사카라이드를 포함하는, 2개 이상의 별개의 단백질-폴리사카라이드 접합체의 면역학적 조성물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 캐리어 단백질(들)에 접합된 2개 이상의 상이한 협막 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 포함한다.
협막 폴리사카라이드는 당해 분야(참조)의 숙련가에게 공지되어 있는 표준 기법으로 제조될 수 있다. 본 발명에서, 엔. 메닌기티디스의 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y로부터 제조된 협막 폴리사카라이드가 바람직하다.
바람직한 양태에서, 이러한 수막구균 혈청그룹 접합체는 별개의 공정으로 제조되어 단일 투여 제형으로 제형화된다. 예를 들면, 엔. 메닌기티디스의 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y로부터의 협막 폴리사카라이드는 별개로 정제된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 정제된 폴리사카라이드는 해중합되어 활성화된 후 캐리어 단백질에 접합된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 엔. 메닌기티디스의 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y의 협막 폴리사카라이드는 약한 산화 조건을 사용하여 부분적으로 해중합된다.
이어서, 폴리사카라이드의 해중합 또는 부분적 해중합은 활성화 단계에 의해 수행될 수 있다. "활성화"란 캐리어 단백질과 반응할 수 있는 화학적 그룹을 제공하도록 폴리사카라이드를 화학적으로 처리함을 의미한다. 바람직한 활성화 방법은 15 내지 30℃에서 약 2시간 동안 pH 5.0 ±0.1로 생리식염수중에 아디프산 디하이드라지드로 처리함을 포함한다. 하나의 활성화 방법은 미국 특허 제5,965,714호에 기재되어 있다.
활성화되면, 이후 협막 폴리사카라이드는 하나 이상의 캐리어 단백질에 접합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 각각의 협막 폴리사카라이드는 단일 캐리어 단백질 종에 개별적으로 접합된다. 바람직한 양태에서, 엔. 메닌기티디스의 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y로부터의 협막 폴리사카라이드는 동일한 캐리어 단백질 종에 각각 개별적으로 접합된다.
캐리어 단백질은 디프테리아 톡소이드, CRM197, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 이. 콜라이(E. coli) LT, 이. 콜라이 ST, 및 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A와 같은 불활성화된 세균성 독소를 포함할 수 있다. 외막 복합체 c(OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴몰리시스(pneumolysis), 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA) 또는 폐렴구균 부착소 단백질(PsaA)과 같은 세균성 외막 단백질이 또한 사용될 수 있다. 오브알부민, 키홀 림피트 헤모시아닌(keyhole limpit hemocyanin; KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 투베르쿨린으로부터 유도된 정제된 단백질(PPD)과 같은 기타 단백질도 또한 캐리어 단백질로서 사용될 수 있다. 캐리어 단백질은 바람직하게는 비독성 및 비반응성이며 충분한 양 및 순도로 수득할 수 있는 단백질이다. 캐리어 단백질은 표준 접합 과정으로 보정될 수 있어야 한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 코리네박테리아 디프테리아(Corynebacteria diphtheriae)의 배양물로부터 정제되고 포름알데하이드를 사용하여 화학적으로 탈독소화된 디프테리아 독소가 캐리어 단백질로서 사용된다.
협막 폴리사카라이드를 캐리어 단백질에 결합시킨 후, 폴리사카라이드-단백질 접합체는 다양한 기법으로 정제될 수 있다(폴리사카라이드-단백질 접합체의 양의 측면에서 농축된). 정제 단계의 하나의 목적은 폴리사카라이드-단백질 접합체로부터 결합되지 않은 폴리사카라이드를 제거하는 것이다. 황산암모늄의 존재하에 한외여과를 포함하는 하나의 정제방법은 미국 특허 제6,146,902호에 기재되어 있다. 대안으로, 접합체는 특히 크기 배제 크로마토그래피, 밀도 구배 원심분리, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 황산암모늄 분별법을 포함하는 임의의 수의 표준 기법으로 반응되지 않은 단백질 및 폴리사카라이드로부터 정제될 수 있다[참고문헌: P.W. Anderson, et. al., (1986), J. Immunol. 137: 1181-1186; H.J. Jennings and C. Lugowski(1981) J. Immunol. 127: 1011-1018].
폴리사카라이드와 캐리어 단백질의 접합 후, 본 발명의 면역학적 조성물은 다양한 폴리사카라이드-단백질 접합체를 조합하여 제조된다. 본 발명의 면역학적 조성물은 하나 이상의 캐리어 단백질(들)에 접합된 2개 이상의 상이한 협막 폴리사카라이드를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태는 디프테리아 톡소이드에 개별적으로 접합된 엔. 메닌기티디스의 혈청그룹 A 및 C로부터의 협막 폴리사카라이드를 포함하는 2가 면역학적 조성물이다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 디프테리아 톡소이드에 개별적으로 접합된 엔. 메닌기티디스의 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y로부터의 협막 폴리사카라이드를 포함하는 4가 면역학적 조성물이다.
캐리어 단백질의 제조 및 용도, 및 각종 잠재적인 접합 공정은 당해 분야 숙련가들에게 익히 공지되어 있다. 당해 숙련가들은 본 발명에 함유된 교시 뿐만 아니라 일반적인 문헌에서 용이하게 입수할 수 있는 정보를 사용하여 본 발명의 접합체를 제조할 수 있다. 또한, 본원에 전문으로 참조로서 인용된 하기의 미국 특허 중의 임의의 하나 또는 모두를 참고할 수 있다: 미국 특허 제4,356,170호, 제4,619,828호, 제5,153,312호, 제5,422,427호 및 제5,445,817호.
본 발명의 면역학적 조성물은 상이한 수막구균 혈청그룹으로부터 개별적으로 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조한 후, 상기 접합체를 조합함으로써 제조된다. 본 발명의 면역학적 조성물은 백신으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 제형은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 하나 이상의 보조제(adjuvant)를 함유할 수 있다. 보조제는 예를 들면, 알루미늄 보조제, 프로인트(Freund) 보조제, BAY, DC-chol, pcpp, 모노포스포릴 지질 A, CpG, QS-21, 콜레라 독소 및 포르밀 메티오닐 펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다[참고문헌: Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, 1995(M.F. Powell and M.J. Newman, eds., Plenum Press, NY)]. 보조제는 바람직하게는 알루미늄 보조제, 예를 들어 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄이다.
하기 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 백신 및 면역학적 조성물은 각종 동물 모델에서 T-의존형 면역 반응을 유발하는 반면, 폴리사카라이드 백신은 T-비의존형 면역 반응을 유발한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 또한 엔. 메닌기티디스 항원에 대한 T-의존형 면역 반응과 관련된 생물학적 경로 및 과정을 연구하기 위한 유용한 연구 도구이다.
사람 또는 동물에게 투여되는 본 발명의 백신의 양 및 투여 방식은, 특정 항원, 보조제(존재하는 경우), 특정 동물 또는 환자의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 약제 및 수의학 분야의 숙련가들에게 익히 공지된 표준 기법에 따라 결정할 수 있다. 본 발명에서 엔. 메닌기티디스에 대한 백신접종용을 위한 유효 투여량을 제공하는 폴리사카라이드-단백질 캐리어의 양은 체중 kg당 약 0.02㎍ 내지 약 5㎍일 수 있다. 본 발명의 바람직한 조성물 및 방법에서 투여량은 체중 kg당 약 0.1㎍ 내지 약 3㎍이다. 예를 들면, 세균이 증식하는 시간이 보다 짧아서 경과된 감염-후 시간이 보다 짧은 경우, 유효 투여량은 보다 적은 양의 항체를 필요로 할 것이다. 유사하게, 유효 투여량은 진단시 세균 로딩량에 의존한다. 치료적 용도를 위해서 일정 일수에 거쳐 투여되는 다중 주사가 고려될 수 있다.
본 발명의 다가 접합체는 단일 투여로서 또는 일련의 투여(즉 "부스터(들)")로 투여될 수 있다. 유년기 질환을 예방하기 위해 다른 백신에 대해 현재 권장되는 바와 같이, 예를 들면, 소아는 일생 중의 이른 시기에 단일 투여를 받은 후, 10년까지 부스터 투여로 투여받을 수 있다.
부스터 투여는 초회자극된(primed) B-세포로부터 항체, 즉 기왕(anamnestic) 반응을 생성시킨다. 즉, 다가 접합체 백신은 허용된 폴리사카라이드 백신에 비해 보다 어린 집단에서 높은 주요 기능적 항체 반응(즉, 백신의 단일 투여 이후)을 유발하고, 기왕 반응(즉, 부스터 투여 이후)을 유발할 수 있고, 이는 본 발명의 다가 접합체 백신에 의해 유발된 보호 면역 반응이 오래 지속됨을 입증한다.
본 발명의 조성물은 개구부, 예를 들어 구강, 비내, 항문, 질내, 경구, 위내, 점막(예, 혀(perlingual), 치조, 잇몸, 후각 또는 호흡 점막) 등 투여용 액체 제제, 예를 들어 현탁제, 시럽제 또는 엘릭서제; 및 비경구, 피하, 피내, 근육내, 복강내 또는 정맥내 투여(예, 주사 투여)용 제제, 예를 들어 멸균 현탁제 또는 에멀젼제를 포함할 수 있다. 정맥내 및 비경구 투여가 바람직하다. 이러한 조성물은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 글루코스 등과 혼합될 수 있다. 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 조성물은 목적하는 투여 경로 및 제제에 따라 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 겔화제, 또는 점도 증진제, 방부제, 향미제, 착색제 등을 함유할 수 있다. 본원에 참조로로 인용된 표준 문헌[참고문헌: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 17th edition, 1985]을 참고로 과도한 실험 없이 적절한 제제를 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적으로 액체 제제, 예를 들어, 선택된 pH로 완충될 수 있는 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼 또는 점성 조성물로서 제공된다. 소화관 흡수가 바람직한 경우, 본 발명의 조성물은 서방출되거나 액체 충전물, 예를 들어 젤라틴 피복된 액체를 갖는 "고체" 제제를 포함하는, 환제, 정제, 캡슐제, 캐플릿 등의 "고체" 형태일 수 있고, 젤라틴은 창자로의 전달을 위해 위에서 용해된다. 비강 또는 호흡기(점막) 투여가 바람직한 경우, 당해 조성물은 압착 분무 디스펜서, 펌프 디스펜서 또는 에어로졸 디스펜서에 의해 투여될 수 있는 형태일 수 있다. 에어로졸은 통상적으로 탄화수소에 의해 가압 상태이다. 펌프 디스펜서는 바람직하게는 계량 투여 또는 특정 입자 크기를 갖는 투여로 투여될 수 있다.
액체 제제는 통상적으로 겔, 기타 점성 조성물, 및 고체 조성물보다 제조하기가 더 용이하다. 또한, 액체 조성물은 동물, 소아, 특히 유아, 및 환제, 정제, 캡슐제 등을 삼키기가 곤란할 수 있는 기타 대상에게 특히 주사나 경구 투여하거나, 다중투여 상황에서 다소 더 용이하다. 반면, 점성 조성물은 적합한 점도 범위내에서 제형화되어 보다 장시간 동안 점막, 예를 들어 위 내막 또는 비강 점막과 접촉할 수 있다.
명백하게는, 적합한 담체 및 기타 첨가제는 정확한 투여 경로 및 특정 투여형, 예를 들어 액체 투여형(예, 당해 조성물이 용액제, 현탁제, 겔 또는 또다른 액상형으로 제형화될 수 있는지 여부), 또는 고체 투여형(예, 당해 조성물이 환제, 정제, 캡슐제, 캐플릿, 서방성 형태 또는 액체 충전된 형태로 제형화될 수 있는지 여부)의 특성에 따라 달라질 것이다.
용액제, 현탁제 및 겔은 통상적으로 활성 성분 이외에 다량의 물(바람직하게는, 정제수)을 함유한다. pH 조절제(예, NaOH 등의 염기), 유화제 또는 분산제, 완충제, 방부제, 습윤화제, 젤화제(예, 메틸셀룰로스), 착색제 및/또는 방향제 등의 소량의 기타 성분이 존재할 수도 있다. 당해 조성물은 등장성일 수 있다; 즉 혈액 및 눈물과 동일한 삼투압을 가질 수 있다.
본 발명의 조성물의 목적하는 등장성은 나트륨 타르트레이트, 프로필렌 글리콜 또는 기타 무기 또는 유기 용질을 사용하여 달성할 수 있다. 나트륨 이온을 함유하는 완충제에 있어서 염화나트륨이 특히 바람직하다.
당해 조성물의 점도는 약제학적으로 허용되는 증점제를 사용하여 소정의 수준으로 유지될 수 있다. 용이하고 경제적으로 구입 가능하며 다루기가 쉽기 때문에, 메틸셀룰로스가 바람직하다. 기타 적합한 증점제의 예로는, 크산탄 검, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 카보머 등이 있다. 증점제의 바람직한 농도는 선택된 제제에 따라 다를 수 있다. 선택된 점도를 달성할 수 있는 양을 사용하는 것이 중요하다. 점성 조성물은 통상적으로 이러한 증점제를 부가함으로써 용액으로부터 제조된다.
약제학적으로 허용되는 방부제를 사용하여 당해 조성물의 반감기를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 파라벤, 티메로살, 클로로부탄올 또는 벤즈알코늄 클로라이드를 포함하여 다양한 방부제가 사용될 수도 있으나, 벤질 알콜이 적합할 수 있다. 방부제의 적합한 농도는 선택된 제제에 따라 적절하게 변형시킬 수 있으나, 총량을 기준으로 하여, 0.02% 내지 2%일 것이다.
당해 분야의 숙련가들은 당해 조성물의 성분이 엔. 메닌기티디스 폴리사카라이드-단백질 캐리어 접합체에 대해 화학적으로 불활성이도록 선택되어야 함을 숙지할 것이다.
본 발명은 본 발명 개념의 수개의 바람직한 양태를 보다 상세하게 제시하는 하기의 예시적이고 비제한적인 예를 참조하여 추가로 기재될 것이다. 본 발명의 기타 예는 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 당해 분야의 숙련가들에게 명백할 것이다.
실시예 1
나이제리아 메닌기티디스 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y의 정제된 협막 폴리사카라이드 분말의 제조
조(粗) 페이스트 제제
나이제리아 메닌기티디스 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y의 습윤 냉동 시드 배양액을 각각 해동시키고, 액체 와트슨 쉐르프(Watson Scherp) 배지를 사용하여 회수하며, 뮐러 힌톤(Mueller Hinton) 아가 배지를 함유하는 블레이크(Blake) 용기내에서 이식하였다. 블레이크를 CO2 대기에서 35 내지 37℃로 15 내지 19시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 블레이크 용기로부터 성장물을 꺼내어 와트슨 쉐르프 배지를 함유하는 4L의 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크를 플랫폼 교반기 상에서 35 내지 37℃로 3 내지 7시간 동안 항온배양하였다. 4L 플라스크의 내용물을 와트슨 쉐르프 배지를 함유하는 발효기로 옮겼다. 발효기를, 영양분을 보충하고 소포제를 첨가하여 용존 산소 함량과 pH를 조절하면서 35 내지 37℃로 7 내지 12시간 동안 항온배양하였다. 배양 후, 발효기의 내용물을 500L 탱크로 옮기고, 세타블론(Cetavlon)을 첨가하여 상기 물질을 1시간 동안 혼합하였다. 세타블론 처리된 성장물을 약 15,000 내지 17,000xg에서 시간당 약 30 내지 70리터의 유속으로 원심분리하였다. 조 폴리사카라이드를 제2 세타블론 침전으로 상청액으로부터 침전시켰다. 세타블론을 상청액에 첨가하고, 상기 물질을 실온에서 1시간 이상 혼합하였다. 상기 물질을 1 내지 5℃로 8 내지 12시간 동안 저장하였다. 침전된 폴리사카라이드를 약 45,000 내지 50,000xg에서 분당 300 내지 400ml의 유속으로 원심분리하여 수거하였다. 수거된 페이스트를 추가로 가공할 때까지 -60℃ 이하의 온도에서 저장하였다.
정제된 폴리사카라이드 분말 제제
불활성화된 페이스트를 해동시키고, 블렌더로 옮겼다. 페이스트를 0.9M 염화칼슘과 블렌딩하여 균질한 현탁액을 수득하였다. 상기 현탁액을 약 10,000xg에 서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제1 추출물로서 보풀이 없는 패드를 통해 용기에 따랐다. 0.9M 염화칼슘의 제2 용적을 페이스트에 첨가하고, 블렌딩하여 균질한 현탁액을 수득하였다. 상기 현탁액을 상기와 같이 원심분리하고, 상청액을 제1 추출물로부터의 상청액과 합하였다. 총 4회 추출을 수행하고, 상청액을 모았다. 모아진 추출물을 한외여과 장치인, 10 내지 30kDA MWCO 나선을 사용한 한외여과에 의해 농축시켰다.
염화마그네슘을 상기 농축액에 첨가하고, 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.2 내지 7.5로 조절하였다. DNase 및 RNase를 농축물에 첨가하고, 25 내지 28℃로 4시간 동안 혼합하면서 항온배양하였다. 에탄올을 30 내지 50%의 농도로 첨가하였다. 침전된 핵산 및 단백질을 10,000xg에서 2시간 동안 원심분리하여 제거하였다. 상청액을 회수하고, 폴리사카라이드를 에탄올을 80%까지 첨가함으로써 침전시켜 1 내지 5℃에서 밤새 정치시켰다. 알콜을 사이펀으로 빨아 올리고, 침전된 폴리사카라이드를 10,000xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 침전된 폴리사카라이드를 알콜로 세척하였다. 폴리사카라이드를 아세톤으로 세척하고, 10,000xg에서 15 내지 20분 동안 원심분리하였다. 폴리사카라이드를 진공하에 건조시켰다. 초기 폴리사카라이드 분말을 나트륨 아세테이트 용액내에 용해시켰다. 염화마그네슘을 첨가하고, 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 7.2 내지 7.5로 조절하였다. DNase 및 RNase를 상기 용액에 첨가하고, 25 내지 28℃에서 4시간 동안 혼합하면서 항온배양하여 잔류하는 핵산을 제거하였다. 이러한 효소와 함께 항온배양한 후, 나트륨 아세테이트-페놀 용액의 동일 용적을 폴리사카라이드-효소 혼합물에 첨가하고, 플랫폼 교반기상에 1 내지 5℃로 약 30분 동안 위치시켰다. 혼합물을 10,000xg에서 15 내지 20분 동안 원심분리하였다. 상부 수성층을 회수하여 저장하였다. 나트륨 아세테이트-페놀 용액의 동일 용적을 수성층에 첨가하고, 상기와 같이 추출하였다. 총 4회 추출을 수행하여 폴리사카라이드 용액으로부터 단백질과 내독소를 제거하였다. 합한 수성 추출물을 주사용 물로 10배 이하로 희석시키고, 주사용 물의 10배 용적으로 투석여과시켰다. 이러한 투석여과된 폴리사카라이드에 염화칼슘을 첨가하였다. 폴리사카라이드를 1 내지 5℃에서 에탄올을 80%까지 첨가하여 침전시켰다. 알콜 상청액을 버리고, 폴리사카라이드를 10,000xg에서 15분 동안 원심분리함으로써 수거하였다. 정제된 폴리사카라이드를 에탄올로 2회 세척하고, 아세톤으로 1회 세척하였다. 세척된 분말을 진공하에 데시케이터내에서 건조시켰다. 건조된 분말을 접합체로 가공할 때까지 -30℃ 이하에서 저장하였다.
실시예 2
나이제리아 메닌기티디스 혈청그룹 A, C, W135 및 Y의 정제된 협막 폴리사카라이드 분말의 해중합
당해 제조에 사용된 물질은 나이제리아 메닌기티디스 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y(실시예 1에 따라 제조된)로부터의 정제된 협막 폴리사카라이드 분말, 멸균 50mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 6.0, 멸균 1N 염화수소산, 멸균 1N 수산화나트륨, 30% 과산화수소 및 멸균 생리식염수(0.85% 염화나트륨)을 포함한다.
각각의 혈청그룹 폴리사카라이드를 별도 반응으로 해중합하였다. 스테인레스 강 탱크를 정제된 협막 폴리사카라이드 분말 60g 이하로 충전하였다. 멸균 50mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 6.0을 폴리사카라이드에 첨가하여 리터당 폴리사카라이드 2.5g의 농도를 수득하였다. 폴리사카라이드 용액을 1 내지 5℃로 12 내지 24시간 동안 혼합하여 용액이 되게 하였다. 반응 탱크를 열 교환기 장치에 연결하였다. 추가의 50mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 6.0을 첨가하여 리터당 1.25g의 반응 농도로 폴리사카라이드를 희석시켰다. 폴리사카라이드 용액을 55℃ ±0.1까지 가열하였다. 30% 과산화수소의 분취량을 반응 혼합물에 첨가하여 과산화수소 1%의 반응 농도를 수득하였다.
반응의 과정을 시간에 따른 폴리사카라이드의 분자 크기 변화를 주시하면서 모니터하였다. 15 내지 20분마다 반응 혼합물로부터 분취량을 제거하고, HPSEC 칼럼상에 주입하여 폴리사카라이드의 분자 크기를 측정하였다. 폴리사카라이드의 분자 크기가 목적하는 분자 크기에 도달한 경우, 가열 장치의 전원을 끄고, 폴리사카라이드 용액을 빙수욕을 통해 순환시켜 5℃까지 신속하게 냉각시켰다. 반응 탱크를 3000 MWCO 재생된 셀룰로스 카트리지가 장착된 한외여과 장치에 연결시켜 해중합된 폴리사카라이드 용액을 리터당 15g으로 농축시켰다. 농축시킨 해중합된 폴리사카라이드 용액을 멸균 생리식염수(0.85% 염화나트륨)의 10 용적에 대해서 투석여과하였다. 해중합된 폴리사카라이드를 1 내지 5℃에서 다음 가공 단계까지 저장하였다.
해중합된 폴리사카라이드의 분자 크기는 덱스트란 분자 크기 표준을 사용하 고 다각 레이저 광산란에 의하여 측정되는 상표명 "UltahydrogelTM250"으로 시판되는 겔 여과 크로마토그래피 칼럼을 통과시켜 측정하였다. 폴리사카라이드의 양은 문헌[참고문헌: Bartlet, G.R.J.(1959) Journal of Biological Chemistry, 234, pp466-468]의 방법을 사용하여 혈청그룹 A의 인 함량 및 문헌[참고문헌: Svennerholm, L. (1955) Biochimica Biophysica Acta 24, pp604-611]의 방법을 사용하여 혈청그룹 C, W135 및 Y의 시알산 함량을 측정하였다. O-아세틸 함량은 문헌[참고문헌: Hesterin, S.(1949) Journal of Biological Chemistry 180, p249]의 방법으로 측정하였다. 활성의 감소는 문헌[참고문헌: Park, J.T. and Johnson, M.J.(1949) Journal of Biological Chemistry 181, pp149-151]의 방법으로 측정하였다. 해중합된 폴리사카라이드의 구조적 통합은 단백질 1H 및 13C NMR에 의해 측정하였다. 해중합된 폴리사카라이드의 순도는 LAL(내독소) 함량 및 잔류 과산화수소 함량을 측정함으로써 결정하였다.
실시예 3
나이제리아 메닌기티디스 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y의 해중합된 폴리사카라이드의 유도화
당해 제조에 사용된 물질은 나이제리아 메닌기티디스로부터의 과산화수소 해중합된 협막 폴리사카라이드 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y(실시예 2에 따라 제조된), 아디프산 디하이드라지드, 혈청그룹 A만을 위한 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDAC), 나트륨 시안보로하이드라이드, 멸균 1N 염화수소산, 멸균 1N 수산화나트륨, 멸균 1M 염화나트륨 및 멸균 생리식염수(0.85% 염화나트륨)를 포함한다.
각각의 혈청그룹 폴리사카라이드를 별도 반응에서 유도하였다. 스테인레스 강 탱크를 정제된 해중합된 폴리사카라이드로 충전시키고, 멸균 0.85% 생리식염수로 희석시켜 리터당 폴리사카라이드 6g의 최종 반응 농도를 이루었다. 이 용액에 멸균 0.85% 생리식염수중에 용해시킨 아미프산 디하이드라지드의 농축된 분취량을 첨가하여 리터당 1g의 반응 농도를 이루었다. 혈청그룹 A만을 위하여, EDAC를 멸균 0.85% 생리식염수에 용해시킨 농축된 분취량으로서 첨가하여 리터당 1g의 반응 농도를 이루었다. pH를 5.0 ±0.1로 조절하고, 이 pH를 2시간 동안 멸균 1N 염산 및 1N 수산화나트륨을 사용하여 실온(15 내지 30℃)에서 유지시켰다. 2시간 후, 0.85% 생리식염수중에 용해시킨 나트륨 시아노보로하이드라이드의 농축된 분취량을 반응 혼합물에 첨가하여 리터당 2g의 반응 농도를 이루었다. 반응을 실온(15 내지 30℃)에서 44 ±4시간 동안 pH 5.5 ±0.5를 유지시키면서 교반하였다. 반응 기간 후, pH를 6.0 ±0.1로 조절하고, 유도화된 폴리사카라이드를 3000 MWCO 재생된 셀룰로스 카트리지가 장착된 한외여과 장치에 반응 탱크를 연결하여 리터당 12g 폴리사카라이드로 농축시켰다. 농축시킨 유도화된 폴리사카라이드를 1M 염화나트륨의 30 용적에 대하여 투석여과한 다음 0.15M 염화나트륨의 10 용적에 대해서 투석여과하였다. 탱크를 한외여과 장치로 연결하지 않고 1 내지 5℃에서 7일 동안 저장하였다. 탱크를 3000 MWCO 재생된 셀룰로스 카트리지가 장착된 한외여과 장치에 다시 연결시키고, 1M 염화나트륨의 30 용적에 대해서 투석여과한 다음 0.15M 염화나트륨의 10 용적에 대해서 투석여과하였다.
유도화된 폴리사카라이드의 분자 크기, 폴리사카라이드의 양 및 O-아세틸 함량을 해중합된 폴리사카라이드에 사용된 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 하이드라지드 함량은 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산 방법으로 측정하였다[참고문헌: Snyder, S.L. and Sobocinski, P.Z. (1975) Analytical Biochemistry 64, pp282-288]. 유도화된 폴리사카라이드의 구조적 통합은 양성자 1H 및 13C NMR로 측정하였다. 유도화된 폴리사카라이드의 순도는 결합되지 않은 하이드라지드의 수준, LAL(내독소) 함량, 및 잔류 시아노보로하이드라이드 함량을 측정하여 결정하였다.
실시예 4
캐리어 단백질의 제조
조 디프테리아 톡소이드 단백질의 제조
동결건조된 시드 배양물을 재구성하고, 16 내지 18시간 동안 항온배양하였다. 배양물로부터의 분취량을 성장 배지를 함유하는 0.5ℓ플라스크에 옮기고, 배양 플라스크를 7 내지 9시간 동안 회전 진탕기에서 34.5 내지 36.5℃로 항온배양하였다. 배양 플라스크로부터의 분취량을 성장 배지를 함유하는 4ℓ플라스크에 옮기고, 배양 플라스크를 14 내지 22시간 동안 회전 진탕기에서 34.5 내지 36.5℃로 항온배양하였다. 4ℓ플라스크로부터의 배양물을 사용하여 성장 배지를 함유하는 발효조를 항온배양하였다. 상기 발효기를 70 내지 144시간 동안 34.5 내지 36.5℃로 항온배양하였다. 발효기의 내용물을 심(depth) 필터를 통해 수집 용기 내로 여과하였다. 포름알데하이드 용액의 분취량 37%를 수거물에 부가하여 0.2%의 농도를 이루었다. pH를 7.4 내지 7.6으로 조절하였다. 수거물을 0.2μ필터 카트리지를 통해 멸균 20ℓ용기내로 여과하였다. 용기를 7일 동안 34.5 내지 36.5℃로 항온배양하였다. 포름알데하이드 용액의 분취량 37%를 각각 20ℓ용기에 부가하여 0.4%의 농도를 이루었다. 혼합물의 pH를 7.4 내지 7.6으로 조절하였다. 용기를 진탕기에서 7일 동안 34.5 내지 36.5℃로 항온배양하였다. 포름알데하이드 용액의 분취량 37%를 각각 20ℓ용기에 부가하여 0.5%의 농도를 이루었다. 혼합물의 pH를 7.4 내지 7.6으로 조절하였다. 용기를 8주 동안 34.5 내지 36.5℃로 항온배양하였다. 조 톡소이드를 탈독소화에 대하여 시험하였다. 용기를 시험 기간 동안 1 내지 5℃로 저장하였다.
조 디프테리아 톡소이드 단백질의 정제
조 톡소이드를 실온에서 가온하고, 20ℓ용기의 내용물을 정제 탱크에서 합하였다. 톡소이드의 pH를 7.2 내지 7.4로 조절하고, 목탄을 조 톡소이드에 부가하여 2분 동안 혼합하였다. 목탄 톡소이드 혼합물을 1시간 동안 정치시킨 후, 심 필터 카트리지를 통해 제2 정제 탱크내로 여과하였다. 고체 황산암모늄을 여액에 첨가하여 70%의 포화도를 이루었다. pH를 6.8 내지 7.2로 조절하고, 용액을 16시간 동안 정치시켰다. 침전된 단백질을 여과하여 수거하고, 70% 황산암모늄 포화 용액, pH 7.0으로 세척하였다. 침전물을 멸균 증류수에 용해시키고, 단백질 용액을 스테인레스 강 수집 용기 내로 여과하였다. pH를 6.8 내지 7.2로 조절하고, 황산암모늄을 40%의 포화도로 부가하였다. pH를 7.0 내지 7.2로 조절하고, 용액을 16시간 동안 정치시켰다. 침전물을 여과하여 제거하고 폐기하였다. 황산암모늄을 여액에 60%의 포화도로 부가하고, pH를 7.0 내지 7.2로 조절하였다. 혼합물을 16시간 동안 정치시키고, 침전된 단백질을 여과하여 수거하였다. 침전물을 멸균 증류수중에 용해시키고, 여과하여 용해되지 않은 단백질을 제거하고 다시 0.85% 생리식염수로 투석여과하였다.
정제된 디프테리아 톡소이드 단백질의 농축 및 멸균 여과
단백질 용액을 리터당 15g으로 농축시키고 10,000MWCO 재생 셀룰로스 필터 카트리지를 사용하여 0.85% 생리식염수의 10 용적에 대하여 투석여과하였다. 농축된 단백질 용액을 0.2μ막을 통해 여과하여 멸균시켰다. 단백질 용액을 접합체로 가공할 때까지 1 내지 5℃에서 저장하였다.
단백질 농도를 문헌[참고문헌: Lowry, O.H. et. al (1951) Journal of Biological Chemistry 193, p 265-275]의 방법으로 측정하였다. 단백질 순도를 멸균성, LAL(내독소) 함량 및 잔류 포름알데하이드 함량에 의해 측정하였다.
실시예 5
디프테리아 톡소이드 단백질에 대한 나이제리아 메닌기티디스 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y 폴리사카라이드의 일가 접합체의 제조
당해 제조에 사용된 물질은 나이제리아 메닌기티디스 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y로부터 아디프산 유도된 폴리사카라이드(실시예 3에 따라 제조된), 멸균 디프테리아 톡소이드 단백질(실시예 4에 따라 제조된), EDAC, 황산암모늄, 멸균 1N 염화수소산, 멸균 1N 수산화나트륨 및 멸균 생리식염수(0.85%)를 포함한다.
각각의 혈청그룹 폴리사카라이드 접합체를 별도의 반응으로 제조하였다. 4개의 모든 접합체를 하기 방법으로 제조하였다. 스테인레스 강 탱크에 정제된 아디프산 유도된 폴리사카라이드를 리터당 반응성 하이드라지드 700 내지 1000μmol의 반응 농도로 충전하였고, 정제된 디프테리아 톡소이드 단백질을 리터당 단백질 3.8 내지 4.0g의 반응 농도로 충전하였다. 생리식염수(0.85%)를 사용하여 출발 재료를 목적하는 반응 농도로 희석시키고, pH를 5.0 ±0.1로 조절하였다. EDAC 분취량을 폴리사카라이드 단백질 혼합물에 부가하여 리터당 2.28 내지 2.4g의 반응 농도를 이루었다. 반응 pH를 15 내지 30℃에서 2시간 동안 5.0 ±0.1로 유지시켰다. 2시간 후, 멸균 1N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.0 ±0.1로 조절하고, 반응물을 1 내지 5℃에서 16 내지 20시간 동안 저장하였다.
반응 혼합물을 15 내지 30℃로 가온시키고, 반응 용기를 30,000MWCO 재생 셀룰로스 카트리지가 장착된 한외여과 장치에 연결시켰다. 고체 황산암모늄을 포화 농도의 60%(혈청그룹 A, W-135 및 Y의 경우) 및 포화 농도의 50%(혈청그룹 C의 경우)로 부가하였다. 접합체 반응 혼합물을 60% 황산암모늄 포화 용액(혈청그룹 A, W-135 및 Y)과 50% 황산암모늄 포화 용액(혈청그룹 C의 경우) 20 용적 및 이어서 생리식염수(0.85%) 20 용적으로 투석여과하였다. 투석여과된 접합체를 먼저 1.2μ 및 0.45μ 필터를 함유하는 필터 캡슐을 통해 여과한 다음, 0.22μ 필터를 함유하는 제2 필터 캡슐을 통해 여과하였다.
폴리사카라이드의 양 및 O-아세틸 함량은 해중합되고 유도화된 폴리사카라이드에 사용한 방법과 동일하게 측정하였다. 단백질의 양은 로우리(Lowry) 방법으로 측정하였다. 접합체의 분자 크기는, 공극 용적 마커로서 DNA를 사용하고 전체 용적 마커로서 ATP를 사용하며 참조 마커로서 소 티로글로불린을 사용하는, 상표명 "TSK6000PW"로 시판되는 겔 여과 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 측정하였다. 또한, TKS6000PW 컬럼으로부터 용출된 접합체의 분자 크기는 복각 레이저 광 산란으로 측정하였다. 접합체의 항원 특성은 이중-샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 항-폴리사카라이드 혈청그룹 특이적 항체에 대한 결합으로 측정하였다. 접합체의 순도는 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼을 통한 용출에 의해 결합하지 않은(접합되지 않은) 폴리사카라이드의 양, 모세관 전기영동에 의해 접합되지 않은 단백질의 양, 멸균성, LAL(내독소) 함량, 잔류 EDAC 함량 및 잔류 암모늄 이온 함량을 측정함으로써 결정하였다.
실시예 6
다가 수막구균 A, C, W-135 및 Y 폴리사카라이드 디프테리아 톡소이드 접합체 백신의 제형
당해 제조에 사용된 물질은 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y 폴리사카라이드-디프테리아 톡소이드 접합체(실시예 5에 따라 제조된), 멸균 100mM 인산나트륨 완충된 생리식염수(0.85% 염화나트륨)을 포함한다.
멸균 100 내지 500mM 인산나트륨 완충된 생리식염수의 분취량을 스테인레스 강 벌크 탱크에서 생리식염수(0.85%)에 부가하여 10mM 인산나트륨의 최종 백신 농도를 수득하였다. 2 내지 4개의 멸균 일가 수막구균 폴리사카라이드-디프테리아 톡소이드 접합체 각각의 분취액을 10mM 멸균 인산나트륨 생리식염수를 함유하는 벌크 탱크에 부가하여 완충액 ml당 각각 혈청그룹 폴리사카라이드 8㎍의 최종 농도를 수득하였다. 제형화된 4가 접합체를 혼합하고, 제2 벌크 탱크내로 0.2㎛ 필터를 통해 여과하였다.
다가 제형에 존재하는 각각의 혈청그룹 폴리사카라이드의 양은 펄스화 전류측정(pulsed amperometric) 검출과 함께 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 폴리사카라이드 성분 분석으로 측정하였다. 단백질의 양은 로우리 방법으로 측정하였다. 백신의 pH를 pH 측정기에 연결된 조합 전극을 사용하여 측정하였다. 다가 접합체 백신의 항원 특성은 이중-샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 항-폴리사카라이드 혈청그룹 특이적 항체에 대한 결합으로 측정하였다. 다가 접합체 백신의 면역원성은 백신에 존재하는 각각의 접합체가 동물 모델에서 초회 및 부스터 항-폴리사카라이드 IgG 면역 반응 모두를 유발하는 능력을 측정하였다. 다가 접합체 백신의 순도는 펄스화 전류측정 검출과 함께 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 결합하지 않은(접합되지 않은) 폴리사카라이드의 양, 멸균성, LAL(내독소) 함량, 발열원성 함량 및 일반 안전성을 측정함으로써 결정하였다.
실시예 7
수산화알루미늄 보조된 다가 수막구균 폴리사카라이드 디프테리아 톡소이드 단백질 접합체의 제조
수산화알루미늄에 흡착된 접합체의 제조. 당해 제조에 사용된 물질은 실시예 5에 기재된 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y 폴리사카라이드-디프테리아 톡소이드 접합체 제제, 멸균 생리식염수(0.85% 염화나트륨), 및 생리식염수(0.85% 염화나트륨) 중의 멸균 수산화알루미늄을 포함한다.
멸균된 일가 수막구균 폴리사카라이드 디프테리아 톡소이드 접합체 각각의 분취액을 생리식염수를 함유하는 벌크 탱크에 부가하여 완충액 1ml당 각각의 혈청그룹 폴리사카라이드 8㎍의 최종 농도를 수득하였다. 생리식염수(0.85% 염화나트륨)중의 멸균 수산화알루미늄 분취액을 다가 접합체 백신에 부가하여 백신 1ml당 알루미늄 이온 0.44mg의 최종 농도를 이루었다.
실시예 8
인산알루미늄-보조된 접합체의 제조
당해 제조에 사용된 물질은 실시예 5에 기재된 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y 폴리사카라이드-디프테리아 톡소이드 접합체 제제, 멸균 생리식염수(0.85% 염화나트륨) 및 생리식염수(0.85% 염화나트륨)중의 멸균 인산알루미늄을 포함한다.
멸균 일가 수막구균 폴리사카라이드-디프테리아 톡소이드 접합체 각각의 분취액을 생리식염수를 함유하는 벌크 탱크에 부가하여 완충액 1ml당 각각의 혈청그룹 폴리사카라이드 8㎍의 최종 농도를 수득하였다. 생리식염수(0.85% 염화나트륨)중의 멸균 인산알루미늄의 분취액을 다가 접합체 백신에 부가하여 백신 1ml당 알루미늄 이온 0.44mg의 최종 농도를 이루었다.
실시예 9
4가 접합체 백신의 면역원성
4가 접합체 백신을 임상 평가 전에 작은 실험실 동물에서 면역 반응을 유발하는 이의 능력에 대해 연구하였다. 마우스, 랫트 및 래빗을 사용하여 폴리사카라이드 백신에 대한 접합체 백신의 면역원성을 연구하였다. 이들 동물 모델은 이들의 면역 반응 패턴에 의해 접합체 백신을 상응하는 폴리사카라이드와 구별할 수 있기 때문에 유용하다. 접합체 백신은 이들 모델에서 T-의존형 면역 반응을 유발하는 반면, 폴리사카라이드 백신은 T-비의존형 면역 반응을 유발한다.
마우스 면역원성 연구에서, 사람 투여량의 1/4 내지 1/6로 투여하기 위해서 접합체를 생리식염수(0.85% 염화나트륨)로 희석하였다. 마우스에게 접합체 또는 폴리사카라이드의 백신의 1 또는 2용량을 투여하고, 혈액 샘플을 백신 접종 2주 후에 취하였다. 한 그룹의 마우스는 면역되지 않은 대조군으로서 사용하였다. 혈청그룹 폴리사카라이드 각각에 대한 항체를 ELISA법으로 측정하였다. 혈청 샘플을 ELISA 미세역가 플레이트 웰에 결합시킨 과량의 각각의 협막 폴리사카라이드와 함께 항온배양하였다. 메틸화된 사람 혈청 알부민을 사용하여 각각의 혈청그룹 폴리사카라이드를 미세역가 웰에 결합시켰다. 배양후, 미세역가 웰을 완충액으로 세척하고, 2차 항체-효소 접합체를 항-수막구균 폴리사카라이드 항체에 결합시킨 항체-폴리사카라이드 복합체에 부가하였다. 미세역가 플레이트를 세척하고, 화학 기질을 폴리사카라이드-수막구균 항체-2차 항체-효소 접합체에 부가하였다. 효소는 화학 기질의 일부분을 가수분해하여 색을 형성시켰다. 색 형성량은 미세역가 웰에 결합된 폴리사카라이드-수막구균 항체-2차 항체-효소 접합체의 양에 비례한다. 각각의 혈청그룹에 대한 참조 항혈청과 비교하여 백신의 효능을 측정하였고, 이는 4개의 파라미터 피트를 사용하는 평행선 계산에 의해 동일한 미세역가 플레이트에서 측정된다. 마우스 참조 항혈청은 각각의 혈청그룹 접합체 백신의 3개 용량으로 개별적으로 면역처리된 마우스의 동일한 종에서 생성되었다. 마우스 참조 항혈청은 광학 밀도 1.0을 수득하는 희석도의 역함수를 기준으로 역가가 부여되었다.
4가 접합체 백신(액상 및 수산화알루미늄 제형 둘 다) 또는 상응하는 4가 폴리사카라이드 백신을 2회 용량으로 접종한 스위스-웹스터 마우스에서 이루어진 각각의 혈청그룹에 대한 항-폴리사카라이드 IgG 역가의 개요가 표 1에 제시되어 있다. IgG 역가는 10마리의 마우스 세트로부터 모인 혈청에서 측정하였다. 10마리 마우스 2세트를 사용하여 각 백신 제형에 대한 면역 반응을 측정하였다. 두 가지 세트 모두 1일째에 백신접종하였다. 15일째(백신접종한지 2주후), 제1 세트의 10마리 마우스로부터 혈액 표본을 채취하고, 제2 세트의 10마리 마우스에게는 15일째에 제2 용량의 백신을 접종하였다. 2주 경과한 29일째에, 제2 세트의 10마리 마우스 및 면역처리되지 않은 대조군로부터 혈액 표본을 채취하였다. 모든 항체를 동시에 역가측정하는데, 즉, 15일째 혈액 표본과 29일째 혈액 표본을 면역처리되지 않은 대조군 및 마우스 표준 혈청과 함께 동시에 분석하였다.
4가 접합체 또는 폴리사카라이드를 접종한 스위스-웹스터 마우스로부터 모은 혈청에 대한 항-폴리사카라이드 IgG 역가
백신 그룹 용량 ㎍ ps 항-Men A 항-Men C 항-Men W135 항-Men Y
D15 D29 D15 D29 D15 D29 D15 D29
접합체 (보조제 없음) 0.25 131 2640 250 1510 1350 6100 5660 4830
접합체 (보조제 없음) 0.50 171 6220 416 2050 849 26000 5980 112000
접합체 (보조제 없음) 1.0 249 4500 525 2740 1450 16600 11300 59100
접합체 (수산화 알루미늄) 0.25 2920 4500 1010 2980 2300 33700 11600 124000
접합체 (수산화 알루미늄) 0.50 5800 9550 2280 1010 4810 71900 26400 330000
접합체 (수산화 알루미늄) 1.0 6210 9350 2630 12800 7870 94000 32700 302000
폴리사카라이드 (보조제 없음) 1.0 136 173 184 205 612 608 4470 3910
면역처리되지 않음 n.a. - 110 - 145 - 623 - 777
4가 접합체 백신(보조제가 없는 것 및 수산화알루미늄을 보조제를 갖는 것 둘 다)은 이러한 마우스 모델에서 강력한 항-폴리사카라이드 IgG 면역 반응을 나타낼 수 있다. 수산화알루미늄 보조제는 4가지 혈청그룹 폴리사카라이드 접합체 각각에 대해 초회 반응 및 부스터 반응 모두를 향상시키는 역할을 한다. 4가 폴리사카라이드 백신은 이러한 마우스 모델에서 면역처리되지 않은 대조군에 비해 혈청그룹 A, C 및 W135에 대해서는 무시해도 좋을 정도의 면역 반응을 나타내는 반면, 혈청그룹 Y에는 상당한 면역 반응을 나타내지만 부스터 반응은 나타내지 않는다. 4가 폴리사카라이드 백신은 이러한 모델에서 4가지 혈청그룹 모두에 대해 부스터 반응을 유발하지 않는다. 이러한 모델은 각각의 혈청그룹 접합체 백신에 대한 부스터 반응 패턴 및 면역 반응의 크기 모두에 의해 폴리사카라이드 백신 및 접합체 백신을 용이하게 구분할 수 있다.
보조제가 없는 4가 접합체 백신 형태를 건강한 젊은 성인 및 건강한 소아를 대상으로 하여 안전성과 면역원성에 대해 임상학적으로 연구하였다. 성인을 대상으로 한 연구에서는, 피검자에게 폴리사카라이드로서 각각의 4가지 접합체 4㎍을 함유하도록 제형화시킨 백신을 단일 용량으로 접종하였다. 접종 직전 및 접종 28일 후 혈액 표본을 채취하였다. 혈청그룹 접합체 각각에 대한 항체는 항-폴리사카라이드 IgG의 양을 정량하는 ELISA 측정법에 의해 측정하였다. ELISA법은 IgG 항체가 마우스 혈청중에 존재하는 경우에 이의 양을 측정하는데 사용되는 방법과 상당히 유사하다.
요약하자면, 메틸화된 사람 혈청 알부민을 갖는 플레이트에 결합된 과량의 수막구균 폴리사카라이드로 피복된 ELISA 미세역가 웰 속에 혈청 샘플을 항온배양하였다. 결합된 항체의 양을 퍼옥시다제-표지된 마우스 항-사람 IgG 특이적 모노클로날 항체와의 반응에 의해 측정하였다. 퍼옥시다제 기질을 사용한 후속적 반응으로 발색 생성물이 생성되고, 이를 분광법으로 측정하였다. 수득한 발색단의 광학 밀도는 미세역가 플레이트상의 수막구균 폴리사카라이드에 결합되어 있는 혈청중의 IgG 항체의 양과 상관성이 있다. 항체의 양은 4-파라미터 기호 논리학 곡선법(4-parameter logistic curve method)을 사용하여 지정값을 갖는 사람 참조 혈청(CDC 1922)과 비교함으로써 계산하였다. 또한, 항체를 혈청그룹 특이적 세균을 용해시키는 능력에 대해 측정하였다. 혈청 샘플을 먼저 열-불활성화시켜 보체를 파괴한다. 혈청 샘플을 멸균 96-웰 미세역가 플레이트에서 2배 희석시킨다. 혈청 희석액에 어린 래빗의 보체와 함께 혈청그룹 특이적 세균을 부가하여 항온배양하였다. 항온배양 후, 아가 오버레이(agar overlay) 배지를 혈청/보체/세균 혼합물에 부가하였다. 아가 오버레이를 경화시킨 다음 5% 이산화탄소와 함께 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 웰에 존재하는 세균 콜로니를 계수하였다. 역수 혈청 희석법에 의해 종결점 역가를 측정한 결과, 보체 대조군 웰의 평균에 비해 치사율이 50% 이상 높았다.
표 2에, 투여 용량당 폴리사카라이드 4㎍으로 제형화된 4가 접합체 백신으로 접종되기 전과 후의 성인 혈청에서 각각의 혈청 그룹에 대한 항-폴리사카라이드 평균 IgG 농도 및 평균 혈청 살균성 항체(SBA) 역가의 요약이 제시되어 있다. 모두 4개의 혈청그룹 접합체에 대한 면역 반응은 만족스러웠고, 즉 IgG 항체 및 작용성 살균성 항체 반응 모두에서 인가된 폴리사카라이드 백신에 의해 달성되는 면역 반응에 필적한다. 당해 백신은 이러한 연령 그룹에서 안전한 것으로 밝혀졌고, 이러한 안전 프로파일은 인가된 폴리사카라이드 백신의 안전성과 유사한 것으로 밝혀졌다.
투여 용량당 폴리사카라이드 4㎍로 제형화된 4가 수막구균 접합체 백신으로 접종된 젊고 건강한 성인에 대한 항-폴리사카라이드 IgG GMC(그룹 평균 농도) 및 혈청 살균성 항체 GMT(그룹 평균 역가)
혈청그룹에 의한 면역 반응 N전/N후 IgG GMC(㎍/㎖)[95% Cl] SBA GMT[95% Cl]
전 후 전 후
A 28/28 3.3 [2.3-4.8] 38.4 [22.2-66.4] 487 [231-1027] 6720 [4666-15428]
C 28/28 0.4 [0.2-0.7] 5.5 [3.0-10.1] 16.4 [7.1-37.7] 1560 [800-4042]
W-135 28/28 0.6 [0.3-1.0] 5.8 [2.9-11.7] 10.0 [5.9-16.9] 609 [250-1481]
Y 28/28 1.3 [0.7-2.5] 6.8 [3.2-14.6] 19.0 [8.0-41.2] 390 [143-1061]
보다 어린 연령의 그룹, 2세 미만의 소아에서 당해 폴리사카라이드 백신에 대한 면역 반응은 약하고 면역성은 1년 후 약화되는 것으로 추정되었다. 12개월 내지 15개월된 소아에게 투여 용량당 각각의 혈청그룹 폴리사카라이드 4㎍이 제형화된 4가 접합체 백신을 단일 투여량으로 투여하고, 1차 투여 2개월 후 4가 접합체 백신의 2차 투여량을 투여하였다. 혈액 표본을 제1 백신 접종 및 제2 백신 접종 전과 2차 백신접종 1개월 후에 채취하였다. 4개의 혈청그룹 접합체에 대한 항체 반응은 표 3에 요약되어 있다. 각각의 혈청그룹에 대해, IgG 항체 및 작용성-살균성 항체에 대한 부스터 반응이 4가 접합체의 2차 투여 후 관찰되었다. 접합체 백신에 의해 유발된 IgG 항체의 농도는 당해 연령 그룹에 대해 인가된 폴리사카라이드에 의해 유발된 농도에 필적한다; 혈청그룹 C 폴리사카라이드에 대한 IgG 항체 3.64㎍/ml(2.96-4.49)의 6주후 반응. 그러나, 당해 접합체 백신에 의해 유도된 살균성 항체의 농도는 당해 연령 그룹에 대해 인가된 폴리사카라이드 백신에 의해 일반적으로 유도되는 수준보다 훨씬 높다; 6주후 SBA 역가 7.2(5.0-10.4). 보다 어린 집단에서 IgG 항체와 살균성 항체가 이와 같이 불일치하는 이유는 보다 어린 집단에서 훨씬 높은 비율의 저친화력 항체를 유도하는 폴리사카라이드에 기인하는 것으로 간주된다. 반대로, 당해 접합체는 훨씬 높은 비율의 고친화력 항체를 유도하는 것으로 보인다. 고친화력 항체는 살균성 활성에 기인하는 것으로 간주된다.
투여 용량당 폴리사카라이드 4㎍로 제형화된 4가 수막구균 접합체 백신 2회 투여량을 접종한 건강한 어린 소아(1살 내지 2살)에 대한 항-폴리사카라이드 IgG GMC(그룹 평균 농도) 및 혈청 살균성 항체 GMT(그룹 평균 역가)
혈청그룹에 의한 면역 반응 N1/N2/N3 IgG GMC(㎍/㎖)[95% Cl] SBA GMT[95% Cl]
제1 투여전 제2 투여전 제2 투여후 제1 투여전 제2 투여전 제2 투여후
A 8/8/8 0.2 [0.1-0.4] 2.1 [0.9-4.8] 4.4 [2.1-9.1] 8.7 [1.4-55.1] 1328 [179-9871] 3158 [1857-5371]
C 8/8/8 0.2 [0.0-0.7] 1.0 [0.3-3.1] 1.5 [0.6-3.6] 6.7 [2.0-23.0] 117 [37.7-365] 304 [128-721]
W-135 8/8/8 0.1 [0.1-0.2] 0.6 [0.2-1.9] 1.5 [0.8-3.1] 6.2 [2.2-17.2] 22.6 [2.8-185] 430 [172-1076]
Y 8/8/8 0.3 [0.2-0.4] 1.2 [0.5-2.8] 4.5 [2.7-7.6] 5.7 [3.7-8.8] 98.7 [20.4-478] 304 [101-920]
인가된 폴리사카라이드 백신에 비해 보다 어린 집단에서 고작용성 항체 반응을 유발하는 4가 접합체 백신의 능력 이외에, 4가 접합체 백신은 기왕 반응을 유발할 수 있고, 이는 본 발명의 4가 접합체 백신에 의해 유발되는 보호 작용이 오래 지속된다는 것을 입증한다. 4가 접합체 백신 개발시, 2가 AC 접합체 제형에 대한 연구가 먼저 수행되었다. 당해 백신은 현재 인가된 1가 C 접합체보다 광범위한 보호 범위를 제공하지만, 혈청그룹 W135 및 Y에 의해 야기되는 질환에 대해서는 보호하지 않는다.
2가 AC 폴리사카라이드 백신 대 2가 AC 접합체 백신에 대한 면역 반응을 비교하는 임상 연구가 유아 대상으로 수행되었다. 이 연구에서, 세번째 유아 그룹이 대조군으로서 작용하는 것으로 기록하고, 이들에게 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 b 접합체를 투여하였다. 3개 백신 그룹 모두에게 동일한 소아 백신을 투여하였다. 2가 AC 접합체 그룹에게 6, 10 및 14주에 접합체 백신 3회 투여량(1회 투여당 폴리사카라이드 4㎍)을 투여하였다. 2가 AC 폴리사카라이드 그룹에 10 및 14주에 2가 AC 폴리사카라이드 백신 2회 투여량(1회 투여당 폴리사카라이드 50㎍)을 투여하였다. 헤모필루스 인플루엔자 타입 b 접합체 그룹에 6, 10 및 14주에 접합체 백신 3회 투여량을 투여하였다. 혈액 표본을 백신 접종 6주전 및 백신 접종 18주, 4주 후에 채취하였다. 소아가 11 내지 12개월인 경우, 혈액 표본을 채취하고, 2가 AC 접합체 또는 2가 AC 폴리사카라이드 백신을 투여한 소아에게 추가 용량의 AC 폴리사카라이드를 투여하였다. 부스터 용량의 폴리사카라이드는 적용 대상이 기왕 반응을 유발하는지의 여부를 평가하기 위해서이다.
이 연구 결과, 1차 및 폴리사카라이드 부스터 면역 반응의 결과가 IgG 항체 반응에 대해서는 표 4에, SBA 항체 반응에 대해서는 표 5에 제시되어 있다. 일련의 1차 후의 IgG 항체 반응은 폴리사카라이드 및 접합체 백신 모두에 대해 대략적으로 동일하다. 그러나, 접합체 백신접종된 피검자의 살균성 항체 반응은 폴리사카라이드 백신접종된 피검자의 경우보다 훨씬 높다. 1세 연령의 피검자에서 관찰된 바와 같이, 폴리사카라이드로의 유아의 백신접종은 매우 적은 작용성-세균성 항체를 유발한다. 폴리사카라이드 백신에 대해 유아에 의해 유발되는 항체는 아마도 저친화력의 항체인 반면, 접합체 백신은 고친화력 항체를 유발하므로, 세균성 항체의 훨씬 높은 역가를 설명한다. 일련의 1차 백신 접종에서 접합체 백신을 투여한 피검자에서 폴리사카라이드 백신의 부스터 용량에 의해 유발되는 고수준의 작용성 항체는 이들 피검자가 기억 또는 T-세포 의존성 항체 반응에 대해 초회감작되었다는 것을 나타냈다. 일련의 1차 백신 접종에서 폴리사카라이드 백신을 수용한 피검자는 T-세포 의존성 반응의 지표인 폴리사카라이드 부스터 투여에 대한 적절한 반응을 유발하였다.
11 내지 12개월 월령에 제공된 2가 AC 폴리사카라이드를 갖는 1차 일련의 면역화(6, 10 및 14주) 및 부스터 백신 접종의 전후에 혈청 그룹 A 및 C에 대한 유아에서의 항-폴리사카라이드 IgG GMC(그룹 평균 농도)
백신 그룹에 의한 면역 반응 1차 백신 접종 GMC[95% Cl] PS 부스터 백신 접종 GMC[95% Cl]
N 전 후 N 전 후
혈청그룸 A:
AC 접합체 34 3.4 [2.2-5.4] 5.8 [4.3-8.0] 31 0.2 [0.1-0.3] 7.0 [4.0-12.0]
AC 폴리사카라이드 35 3.0 [1.7-5.3] 5.5 [4.1-7.3] 30 0.9 [0.5-1.4] 3.1 [2.0-4.7]
HIB 접합체 36 3.2 [2.2-4.5] 0.6 [0.4-0.8] NA NA NA
혈청그룹 C:
AC 접합체 31 1.6 [0.9-2.8] 2.8 [2.0-3.9] 31 0.1 [0.1-0.2] 8.1 [4.5-14.5]
AC 폴리사카라이드 35 2.3 [1.4-3.9] 5.3 [3.8-7.4] 30 0.6 [0.3-1.0] 2.8 [1.7-4.7]
HIB 접합체 36 2.0 [1.2-3.5] 0.5 [0.3-0.7] NA NA NA
11 내지 12개월 월령에 제공된 2가 AC 폴리사카라이드를 갖는 1차 일련의 면역화(6, 10 및 14주) 및 부스터 백신 접종의 전후에 혈청 그룹 A 및 C에 대한 유아에서의 SBA 항체 GMT(그룹 평균 역가)
백신 그룹에 의한 면역 반응 1차 백신 접종 GMT[95% Cl] PS 부스터 백신 접종 GMT[95% Cl]
N 전 후 N 전 후
혈청그룹 A:
AC 접합체 34 11.8 [7.2-19.3] 177 [101-312] 24 10.1 [5.6-18.0] 373 [162-853]
AC 폴리사카라이드 32 14.7 [8.5-25.4] 7.0 [4.7-10.5] 26 6.1 [3.9-9.5] 24.1 [11-53]
HIB 접합체 35 11.2 [6.8-18.3] 6.7 [4.3-10.5] NA NA NA
혈청그룹 C:
AC 접합체 34 50.8 [24-107] 189 [128-278] 27 4.6 [3.6-5.6] 287 [96.2-858]
AC 폴리사카라이드 32 62.7 [29-131] 25.4 [14.4-44.6] 26 4.1 [3.9-4.3] 14.4 [7.9-26.1]
HIB 접합체 36 45.3 [21.9-133] 7.3 [4.7-11.3] NA NA NA
본 발명이 젊은 집단에서의 수막구균 질환에 대한 개선된 보호 및 혈청그룹 A, C, W-135 및 Y에 대한 광범위한 보호를 제공한다는 잇점 이외에, 4가 접합체가 캐리어 단백질에 대한 항체 반응을 유발함으로써 기타 병원균에 대한 보호를 제공할 수 있다. 디프테리아 톡소이드 접합체를 사용하는 4가 접합체 백신이 유아에게 투여되는 경우, 이들 피검자는 또한 통상의 소아 면역을 수용하였다. 따라서, 이들 피검자에서 디프테리아 톡소이드에 대한 항체 반응에 있어서의 명백한 개선이 없다. 그러나, 디프테리아 톡소이드 접합체를 동시적인 디프테리아 톡소이드 함유 백신을 받은적 없는 피검자에게 투여하는 경우, 디프테리아 톡소이드에 대한 강한 부스터 반응이 관찰되었다. 이들 피검자들은 2, 3 및 4개월 월령에서 DTP의 3회 투여를 받았었다. 이러한 연구에서, 피검자는 2세 및 3세에 2가 AC 접합체의 단일 투여 또는 2가 AC 폴리사카라이드 백신의 단일 투여를 받았었다. 혈액 표본을 백신 접종시 및 백신 접종 30일 후 채취하였다. 2가 AC 접합체는 캐리어 단백질로서 디프테리아 톡소이드를 사용하였다.
2개의 백신 그룹에서 디프테리아 톡소이드의 면역 반응은 표 6에 제시되어 있다. 폴리사카라이드는 예상한 바와 같이 이들 피검자에서 항-디프테리아 면역 반응을 자극하지 않지만, 강한 항-디프테리아 면역 반응은 AC 접합체를 받은 피검자에서 관찰되었다. 따라서, 수막구균 접합체 백신은 캐리어 단백질에 대한 면역 반응을 자극하여 디프테리아 톡소이드가 캐리어 단백질로서 사용되는 경우, 코리네박테리아 디프테리아에 의해 유발된 질환에 대해 보호한다는 부가의 잇점을 제공할 것이다.
투여량당 폴리사카라이드로서 4㎍에서 제형화된 2가 AC 디프테리아 톡소이드 접합체 백신 또는 투여량당 폴리사카라이드로서 50㎍에서 제형화된 2가 AC 폴리사카라이드 백신으로 백신 접종한 젊은 건강한 소아에서 ELISA GMT(그룹 평균 역가)에 의한 항-디프테리아 항체(IU/mL)
백신 그룹에 의한 면역 반응 N전/N후 항-디프테리아 항체(ELISA-IU/㎖)[95% Cl]
전 후
AC 접합체 104/103 0.047 [0.036-0.060] 21.2 [11.6-38.6]
AC 폴리사카라이드 103/102 0.059 [0.045-0.076] 0.059 [0.045-0.077]
참고문헌
Figure 112003026958568-pct00001

Claims (26)

  1. 4개의 별개로 독립적으로 제조된 단백질-협막 폴리사카라이드 접합체의 조합물을 포함하며, 이때 제1 접합체는 디프테리아 톡소이드인 캐리어 단백질에 접합된 혈청그룹 W-135의 정제된 엔. 메닌기티디스 (N. meningitidis) 협막 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 접합체는 디프테리아 톡소이드인 캐리어 단백질에 접합된 혈청그룹 Y의 정제된 엔. 메닌기티디스 협막 폴리사카라이드를 포함하고, 제3 접합체는 디프테리아 톡소이드인 캐리어 단백질에 접합된 혈청그룹 A의 정제된 엔. 메닌기티디스 협막 폴리사카라이드를 포함하고, 제4 접합체는 디프테리아 톡소이드인 캐리어 단백질에 접합된 혈청그룹 C의 정제된 엔. 메닌기티디스 협막 폴리사카라이드를 포함하는, 사람에게서 상기 폴리사카라이드 각각에 대해 면역반응을 유도할 수 있는 면역학적 조성물.
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  17. 제1항에 있어서, 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는 면역학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 보조제가 알루미늄 보조제를 포함하는 면역학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 알루미늄 보조제가 수산화알루미늄인 면역학적 조성물.
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  24. 제1항에 있어서, 멸균 액제로서 제형화되는 면역학적 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 방부제를 추가로 포함하는 면역학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 방부제가 벤질 알콜, 파라벤, 티메로살, 클로로부탄올 및 벤즈알코늄 클로라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역학적 조성물.
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