KR100859280B1 - 신속 반응형 포도당 센서를 갖는 측정기 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따르면, 액체 샘플 내의 포도당과 같은 분석물의 검출을 위한 일회용 전기화학적 센서는 샘플-수용 캐비티 내에 배치되는 작업(working) 전극 및 기준(reference) 전극과, 상기 샘플-수용 캐비티 내에 및 상기 작업 전극 위에 배치되는 시약층(reagent layer)을 포함한다. 상기 시약층은 분석물의 존재시에 전기화학적 신호를 발생시키기 위한 효소를 적어도 포함한다. 상기 샘플-수용 캐비티는 1.5㎕ 미만의 용적을 가지며, 상기 센서는 10초 이내의 주기로 분석물의 양과 상호관련되는 측정을 제공한다. 상기 센서는 액체 샘플 내의 분석물의 검출을 위한 측정기와 함께 사용된다. 적절한 측정기는 측정기에 삽입된 테스트 스트립에 대한 샘플 적용의 검출 후에 샘플 내의 분석물을 나타내는 전류의 측정을 제어하기 위한 타이밍 회로를 포함한다. 상기 타이밍 회로는 샘플 적용의 검출 후 15초 이내의 시점에서 전류의 측정을 개시한다.

포도당, 전기화학적 센서, 샘플-수용 캐비티, 작업 전극, 기준 전극, 시약층, 효소, 측정기, 테스트 스트립, 타이밍 회로

Description

신속 반응형 포도당 센서를 갖는 측정기{Meter with rapid response glucose sensor}

본 발명은 혈당 레벨을 검사하기 위해 당뇨병 환자에 의해 사용되는 형태의 일회용 전기화학적 포도당 센서에 관한 것이다.

일회용 스트립형 전기화학적 포도당 센서는 지난 10년간 상업적으로 이용되고 있고, 미국특허 제4,711,245호, 제5,708,247호 및 제5,802,551호를 포함하는 다양한 특허에 개시되어 있다. 이들 센서는 효소(enzyme)와 전극(electrode) 사이에서 전하 교환(charge exchange)을 용이하게 하는 레독스 매개체(redox mediator)를 이용한다. 이러한 디바이스는 혈액이 측정기에 주입되지 않고 측정기 자체가 매우 가볍고 간소하다는 사실과 같이 종래의 광학 기술에 비해 현저한 장점들을 제공하지만, 몇가지 단점도 가지고 있다. 전기화학적 테스트 결과는 통상적으로, 샘플 내에 존재하는 다른 전기활성 종(elecroactive species)과 샘플의 산소 함량 및 적혈구용적율(hematocrit)에 의해 영향을 받는다.

전기 활성 종에 의해 간섭을 받는 이유는 매우 간단 명료하다. 용이하게 산화될 수 있는 종에 의해, 판독치를 상승시키는 전류의 증가가 초래된다. 증가된 전류는 전극 표면에서의 직접 산화에 기인하거나 또는 레독스 촉매작용에 의해 발 생한다. 몇몇 제조자들은 배경 삭감(background subtraction)을 달성하기 위해 보조 전극을 사용함으로써 상술한 문제점을 처리하고자 한다. 이러한 접근방식은 유용하지만, 부가의 제조 단계가 추가되고, 비용이 증가하며, 관련 에러에 대한 추가 측정이 필요해지며, 정밀도를 떨어뜨린다. 또한, 간섭물 레독스 촉매반응의 효율이 분석물 농도에 따라 두 전극에서 상이해질 수 있기 때문에, 상기 배경 삭감은 과잉교정(overcorrection)을 초래할 수 있다.

산소 및 적혈구용적율 효과들이 관련된다. 산소는 포도당 산화효소(glucose oxidase)를 위한 천연 공통인자이고, 산소가 존재하는 상태에서는 산소와 레독스 매개체 사이에 치열한 경쟁이 존재하게 되어 신호를 약화시킨다. 유사하게, 헤모글로빈(hemoglobin)은 매우 효과적인 산소 전달 매체이기 때문에, 샘플의 높은 적혈구용적율도 신호를 약화시키게 된다. 혈구(blood cell)가 전극 표면에 닿지 않도록 유지하는 배제 막(exclusion membranes)은 적혈구용적율 효과를 경감시키기 위해 제안되었다(미국특허 제5,658,444호). 이러한 접근방식에서는 부가의 제조 단계가 추가되고, 산소-기반 효과의 일부분에 대해서만 효과적이다.

따라서, 간섭물질의 존재에 의해 받게 되는 영향이 가장 적은 혈액 분석물 레벨에 대한 특히, 포도당에 대한 판독을 제공하는 일회용 전기화학적 디바이스의 필요성이 존재한다.

본 발명에 따르면, 액체 샘플 내의 포도당과 같은 분석물의 검출을 위한 일회용 전기화학적 센서가 제공된다. 상기 센서는 샘플-수용 캐비티 내에 배치되는 작업(working) 전극 및 기준(reference) 전극과, 상기 샘플-수용 캐비티 내에 및 상기 작업 전극 위에 배치되는 시약층(reagent layer)을 포함하고, 상기 시약층은 분석물의 존재시에 전기화학적 신호를 발생시키기 위한 효소를 적어도 포함하고, 상기 샘플-수용 캐비티는 1.5㎕ 미만의 용적을 가지며, 상기 센서는 분석물의 정확하고 정밀한 검출 및 정량화(quantification)로 측정을 이용할 수 있도록, 충분히 양호하게(예를 들어, R² > 0.95) 10초 이내의 주기로 분석물의 양과 상호관련되는 측정을 제공한다.

상기 센서는 액체 샘플 내의 분석물의 검출을 위한 측정기와 함께 사용된다. 적합한 측정기는 측정기에 삽입된 테스트 스트립에 대한 샘플 적용의 검출 후에 샘플 내의 분석물을 나타내는 전류의 측정을 제어하기 위한 타이밍 회로를 포함하고, 상기 타이밍 회로는 샘플 적용의 검출 후 15초 이내의 시점에서 전류의 측정을 개시한다.

본 발명에 따르면, 액체 샘플 내의 포도당과 같은 분석물의 검출을 위한 일회용 전기화학적 센서는 샘플-수용 캐비티 내에 배치되는 작업(working) 전극 및 기준(reference) 전극과, 상기 샘플-수용 캐비티 내에 및 상기 작업 전극 위에 배치되는 시약층(reagent layer)을 포함한다. 상기 시약층은 분석물의 존재시에 전기화학적 신호를 발생시키기 위한 효소를 적어도 포함한다. 상기 샘플-수용 캐비티는 1.5㎕ 미만의 용적을 가지며, 상기 센서는 10초 이내의 주기로 분석물의 양과 상호관련되는 측정을 제공한다. 상기 센서는 액체 샘플 내의 분석물의 검출을 위한 측정기와 함께 사용된다. 적절한 측정기는 측정기에 삽입된 테스트 스트립에 대한 샘플 적용의 검출 후에 샘플 내의 분석물을 나타내는 전류의 측정을 제어하기 위한 타이밍 회로를 포함한다. 상기 타이밍 회로는 샘플 적용의 검출 후 15초 이내의 시점에서 전류의 측정을 개시한다.

또한, 본 발명에 따라 구성되는 센서에 의하면, 공지된 센서를 사용하여 달성된 시간보다 현저하게 짧은 시간에 테스트 측정이 취해진다. 테스트 시간을 단축시킴으로써, 적혈구용적율 효과는 감소될 수 있다. 상기 센서가 백혈구 및 적혈구와 같은 임의의 혈액 성분에 지연 효과를 나타내는 시약층으로 덮인 전극을 포함하면, 단시간에 전극에 도달하는 유체는 장시간에 전극에 도달하는 유체의 경우보다 현저하게 적은 상기 성분들을 포함하게 된다.

전기화학적 스트립 성능을 개선하기 위한 해결책은 매개성 반응(mediated reaction)이 간섭 반응(interfering reactions)에 비해 유리하도록 스트립을 설계해야 한다는 것이다. 포도당 검출의 경우에, 분석물 특정 반응(analyte specific reaction)은 전극 표면에서 매개체의 산화에 의해 야기되는 환원된 매개체의 효소 발생을 수반하는 매개성 반응이다. 그러므로, 최대 수집 효율을 제공하기 위해 전극 표면과의 근접부에서 상술한 반응이 발생하도록 상기 테스트가 구성되어야 한다.

테스트 중에 발생하는 확산 공정을 고려해야 한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 테스트 스트립에 대한 샘플의 적용을 고려한다. 건조 상태의 테스트 스트립은 효소(enzyme)(E)와 매개체(mediator)(M)를 함유하는 시약층으로 코팅된 전극을 포함한다. 테스트 샘플은 포도당(glucose)(G), 전기화학적 간섭물(electrochemical interferant)(I), 및 헤모글로빈(hemoglobin)(Hb)과 결합할 수 있는 산소(O₂)를 함유한다. 샘플의 적용시에, 전극으로부터 테스트 샘플을 향한 E 및 M의 네트(net ;정미) 확산 유동(flux)과, 전극을 향한 G 및 I의 네트 확산 유동이 존재한다. 그러므로, 샘플 적용 후 매우 짧은 시간동안 대부분의 효소는 전극에 가깝게 유지되고, 포도당과의 반응은 환원된 매개체 분자가 포착될 전극에 충분히 가까이에서 발생될 높은 확률을 갖는다. 시간이 경과하면, 대부분의 효소는 샘플 내로 "깊게" 확산되어 포도당과 반응할 수 있다. 이는 두가지 효과를 갖는다. 먼저, M의 농도는 전극으로부터 더욱 감소되고 O₂의 농도는 전극으로부터 더욱 증가되기 때문에(동일한 반응이기 때문), 환원된 효소가 M보다는 O₂에 의해 산화될 확률이 높다. 환원 된 효소가 M과 반응하더라도, 환원된 M이 검출가능한 신호의 공존 생성에 의해 재산화될 전극으로 다시 확산할 확률은 낮다. 다음으로, 반응 순서는 안쪽으로 확산하는 G를 고갈시키는 효과를 가지므로, 약간의 효율로 검출될 수 있는 전극 근처에 실질적으로 도달하는 G의 양은 감소된다. 물론, 이들 두 인자들은 샘플 내에 산소의 존재시 신호를 감소시킨다.

유사하게, 통상의 간섭물은 전극 표면에 도달시에 존재할 수 있는 환원된 매개체와 함께 산화되는 아스코르빈산, 아세트아미노펜 및 요산(uric acid)과 같이 용이하게 산화되는 물질이다. 이러한 효과는 I가 전극 표면 근처에 존재할 경우에만 발생할 수 있기 때문에, 전극으로의 I의 확산이 발생하기 전의 짧은 시간에 최소가 된다.

이러한 역학적인 설명으로부터 분명해지는 바와 같이, 간섭물 및 적혈구용적율/산소 레벨의 두 문제점들에 대한 한가지 해결 방안은 측정 시간을 매우 단축시켜야 한다는 것이다. 선택적인 해결 방안은 전극의 표면적이 샘플 용적에 비해 매우 크도록 샘플 용적을 제한하는 것이다. 양호한 구성은 전극 위로 샘플 층을 매우 얇게(예를 들어, < 200μ) 위치시키는 것이다. 샘플 용적을 제한하는데 따른 한가지 이점은 상기 해법이 수력학적(hydrodynamic)으로 보다 신속하게 안정된다는 것이다. 큰 샘플 용적을 사용하면, 샘플 내에서의 대류 효과에 의해 측정시에 노이즈가 생긴다. 박막 형태로 작은 샘플 용적을 유지함으로써 대류 효과가 최소화된다. 이는 작은 샘플 용적을 사용하면 보다 조기에 측정을 완료할 수 있다는 것을 의미한다.

실질적으로, 상기 해법들은 본 발명의 바이오센서와 관련되고, 모두 충족된다. 따라서, 본 발명은 샘플 내의 분석물 양의 전기화학적 측정을 행하는데 적용되고 예를 들어, 이미 공지되어 있는 시스템에서보다 짧은 시간에 혈당 레벨의 정량화(quantification)에 적용되는 일회용 전기화학적 센서 및 관련된 측정기를 제공한다. 본 발명의 센서는 뛰어난 성능을 달성하기 위해 짧은 측정 시간과 작은 샘플 용적 사이의 상승(synergistic) 관계의 장점을 취한다. 작은 샘플 용적은 수력학적 효과의 빠른 안정화로 인해 조기 측정을 허용하고, 그에 따라 짧은 시간에 측정을 촉진한다. 또한, 작은 신호가 장시간 동안 감소되면 신뢰성 있는 판독을 제공할 수 없기 때문에, 작은 샘플 용적도 짧은 시간의 측정을 필요로 한다. 이러한 종류의 구성을 선택함으로써, 매개체가 환원된 효소를 위해 산소와 보다 효과적으로 경합하도록 매개체 농도를 높게 유지해야 한다.

작은 샘플 용적을 이용하는 디바이스를 제공하는 것은 환자의 관점에서 매우 바람직하다. 분석물 농도의 신뢰도있는 측정을 위해 작은 샘플 용적을 이용하는 디바이스가 개발되었다. 이러한 공정의 제 1 부분은 작은 용적의 샘플-수용 캐비티의 한정이다. 이러한 캐비티의 용적은 전극들 사이의 갭의 두께와 전극들의 면적에 의해 한정된다. 임의로 주어진 프린팅 공정에 의해 달성될 수 있는 전극들의 면적에는 에지 한정(definition) 및 프린트 허용오차에 의해 결정되는 하한이 있다. 공지된 전극 프린팅 잉크를 사용할 때 정밀도를 개선하기 위한 한 방식은 본원에 참조로 합체되는 국제특허공보 WO 00/42422호에 개시된 프린팅 방법이다.

전극들의 "면적"이 최소화될 때, 샘플 용적은 전극 표면들 사이의 갭에 의해 추가로 한정된다. 주된 목적은 얇지만 일정한 갭이다. 그러나, 매우 얇은 갭(즉, < 200㎛)을 사용하여 작은 샘플 용적이 달성되면, 반무한(semi-infinite) 확산의 일반적인 조건들이 충족되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 이러한 이유로 확산 층은 전체 갭을 가로질러 연장될 수 있고, 샘플을 현저하게 고갈시킨다. 이러한 상황하에서, 갭 크기를 결정하는 조립 공정의 정밀도의 추가 인자에 의해 디바이스의 정밀도가 좌우된다. 갭 크기의 정밀도가 중요해지는 크기와 측정 시간 사이의 관계는 하기의 수식으로부터 이해될 수 있으며, L은 확산 길이, D는 확산 계수, t는 시간을 나타낸다.

테스트 시간이 15초에서 5초로 감소되면, 확산 길이는

의 인수 만큼 감소된다. 실질적으로 이것이 의미하는 것은 측정 시간을 단축시킴으로써, 갭의 정밀도가 디바이스 정밀도의 실질적인 인자로 되는 제한 조건에 구속됨 없이 갭의 크기를 추가로 감소시킬 수 있다는 것이다. 따라서, 예를 들어, 확산 계수를 10^-5㎠sec^-1 로 가정하면, 5초 테스트는 15초 테스트에 필요한 125㎛에 비해 70㎛ 이상의 갭을 필요로 한다. 이러한 인자들을 고려하면, 본 발명에 따른 센서의 적절한 구성은 1.5㎕ 미만의 용적을 갖는 샘플 수용 캐비티를 구비한다. 갭 크기에 대한 고려사항을 감안하면, 작업 전극은 갭 크기에 대한 작업 전극의 표면적의 비가 약 0.5 내지 100㎜로 되도록 바람직한 크기로 된다는 것을 의미한다. 특히 양호한 구 성에서, 샘플 수용 격실을 0.5 내지 0.8㎕의 용적으로 한정하기 위해, 각각의 전극의 면적은 0.8㎟이고, 갭은 100 내지 150㎛이다.

도 2는 본 발명의 제 1 실시예에 따른 전기화학적 센서(10)를 도시한다. 전극(11, 12)은 베이스 기판(13)상에 형성된다. 베이스 기판(13)은 스페이서(14, 15) 및 상부 커버(16)와 결합되어 캐비티(17)를 형성하고, 캐비티 내에서는 전기화학적 반응이 발생한다. 예시적인 실시예에서, 전극들은 5㎟의 표면적을 가지며, 캐비티의 용적은 적절하게 1.5㎕ 미만이고, 보다 바람직하게는 1㎕ 미만이며, 가장 바람직하게는 0.5㎕ 미만이다.

도 2에 도시된 형태의 디바이스는 다음과 같이 제조될 수 있다. 전극(11, 12)은 기판(13) 위에 배치된다. 스크린 프린팅이 다양한 재료들에 대해 바람직한 기술일 지라도, 특정 배치 방식은 전극들의 성질에 의해 결정된다. 챔버 내의 샘플에 노출되는 전극의 면적은 전극들 위로 절연 마스크를 배치함으로써 한정된다(국제특허공보 WO 00/42422호 참조). 다음에, 시약층이 배치된다. 이러한 층은 두 전극 모두를 덮을 수 있지만, 작업 전극 위의 면적에만 한정될 수도 있다. 그후, 스페이서(14, 15)는 전극들을 둘러싸는 패턴으로 형성된다. 적합한 실시예에서, 이들 스페이서는 약 150㎛의 건조 높이를 갖는 접착제 층을 프린팅함으로써 형성된다. 이러한 스페이서는 미리형성된 고체 재료를 이용할 필요없이 모세관 갭을 한정하고, 그에 따라 본 발명의 디바이스의 제조가 실질적으로 용이해진다. 최종 단계는 챔버(17; 캐비티)를 완성하기 위해 커버(16)를 적용하는 것이다. 적합한 실시예에서, 커버(16)는 접착제 스페이서(14, 15)에 의해 디바이스에 고정된다.

도 9a 내지 도 9c는 본 발명에 따라 센서를 제조하기 위한 제조 기술의 특정 실시예를 도시한다. 도면에는 하나의 센서가 도시되지만, 일반적으로 하나 이상의 센서가 제조된다는 것이 이해될 것이다. 도 9a는 커버 적층 전의 디바이스의 구조를 도시한다. 이 단계에서, 센서는 기판(명료화를 위해 도시되지 않음)상에 배치되는 두개의 전극(11, 12)을 구비한다. 이들 전극에 대한 전기 접속부는 도시되지 않는다. 예를 들어, 분석물에 대해 적합한 효소를 함유하는 시약 패드(100)는 두 전극 위로 배치된다. 접착 패드(101, 102, 103)는 시약 패드의 세 측부에 배치된다. 그 후, 친수성 필름(예를 들어 3M 9962와 같이, 100μ두께의 계면활성 처리된 광학적으로 투명한 폴리에스테르 필름)의 두 부분(104, 105)이 두 위치에 배치되는데 하나는 접착 패드들(101 및 102)에 걸쳐서 전극들과 시약 패드를 덮고, 다른 하나는 접착 패드(103)의 일부분을 덮어서 커버(116)를 수용하기 위한 일정한 높이의 지지부를 제공한다(도 9b 참조). 이러한 친수성 필름의 이들 부분들의 위치는 두개의 전극 위로 모세관 챔버를 생성한다. 상기 필름의 친수성 코팅은, 모세관 작용에 의해, 생성된 샘플 챔버 내로 테스트 액체의 이동을 촉진한다. 스페이서 또는 필름이 존재하지 않는 위치에 형성된 갭(106)은 테스트 액체가 샘플 챔버 내로 이동할 때 챔버의 후방으로부터 공기를 배출시킨다. 압력 민감성 테이프는 친수성 필름 위로 상부 커버(116)로서 적용된다. 상부 커버(116)는 폴리에스테르 필름으로 적절하게 형성되고, 열융착 접착제 또는 압력 민감성 접착제로 코팅될 수 있다. 최종 단계는 예를 들어, 도 9b의 점선 C-C를 따라 절단함으로써, 적절히 개방된 샘플 챔버를 형성하도록 디바이스를 절단하는 것이다. 도 9c는 C-C 선을 따라 절단 된 후의 디바이스의 단면도이다. 도시된 바와 같이, 샘플 챔버에 대한 모세관 입구(110)는 기판(13), 접착 패드(101, 102) 및 친수성 필름(104)과 상부 커버(116)에 의해 한정된다. 필름(104, 105)은 접착 패드(101, 102)에 의해 지지된다.

도 3은 본 발명의 제 2 실시예에 따른 전기화학적 센서(20)를 도시한다. 전극들(21, 22)은 각각 베이스 기판(23) 및 상부 커버(26)에 형성된다. 베이스 기판(23)은 스페이서(24, 25) 및 상부 커버(26)와 결합되어 캐비티(27)를 형성하고, 캐비티 내에서는 전기화학적 반응이 발생한다. 상기 센서는 베이스 기판(23)과 상부 커버(26) 사이에 예를 들어, 50 내지 200㎛의 작은 용적의 얇은 갭으로 구성된다. 전극들의 표면적은 접혀진 대면형 구성이기 때문에 동일한 크기의 디바이스에 대해 2배일 수 있다는 점에 주목해야 한다.

이러한 구조를 갖는 디바이스는 본원에 참조로서 합체되는 2000년 3월 28일자로 출원된 미국특허출원 제09/537,599호에 기재된 바와 같은 웹 프린팅 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 도 4에 개략적으로 도시된 형태의 장치를 이용한다. 기판(31)의 가동 웹은 공급 롤(32)상에 제공되고, 기판상으로 상이한 층을 각각 프린트하는 복수의 프린트 스테이션(33, 34, 35) 위로 이송된다. 프린트 스테이션의 개수는 임의의 개수로 될 수 있고, 제조되는 특정 디바이스에 필요한 층의 개수에 의존한다. 연속하는 프린트 스테이션들 사이에서, 웹은 건조기(36, 37, 38)를 통해 양호하게 이송되어, 다음의 배치부위(deposition)로 진행하기 전에 각각의 층을 건조시킨다. 최종 건조기(38)의 통과 후에, 프린트된 웹은 권취 롤(take up roll)에 수집되거나 후처리 장치(39) 내로 직접적으로 도입된다. 이러한 장치 내에 도 3에 도시된 구조를 갖는 디바이스를 조립하기 위해, 평행한 도전성 트랙(71, 72), 시약층(들)(73) 및 절연층(74)이 도 5에 도시된 바와 같이 기판(70)상에 배치된다. 그 후, 상기 기판은 두 개의 도전성 트랙 사이에 배치된 절첩 라인을 따라 접혀서, 두개의 대면형 전극들이 시약층에 의해 분리되는 센서를 구성한다. 전극들이 캐비티 내부의 대향 표면들에 배치되어 있는 전극 구조는 전극들을 분리하는 용액의 박층의 결과로서 용액 저항으로 인한 전압 강하가 낮기 때문에 유리하다.

상술된 본 발명의 각각의 실시예에서, 캐비티는 절연 재료에 의해 한정된다. 이러한 목적에 적합한 절연 재료는 나일론, 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및 폴리비닐클로라이드를 포함한다. 기판으로 사용하기에 적합한 재료는 폴리에스테르 필름, 예를 들어 300μ의 폴리에스테르 필름과, 폴리비닐클로라이드(PVC) 및 폴리카보네이트 등의 다른 절연 기판 재료를 포함한다. 절연 마스크가 형성될 수 있는 특정 폴리에스테르-기반의 프린트가능한 유전체는 ERCON R488-B(HV)-B2 Blue이다. 캐비티 내부에서는, 작업 전극 및 기준 전극이 도전재로 형성된다. 적절한 도전재는 도전성 카본, 골드(금), 플라티늄, 알루미늄 또는 n-타입 SnO₂ 와 같은 도프된 반도체 재료를 포함한다. 양호한 도전성 카본 재료는 ERCON ERC1, ERCON ERC2 및 Acheson Carbon Electrodag 423이다. 이러한 형태의 카본은 에르콘 인크.(Ercon, Inc.; 미국 매사추세츠 월탐 소재), 또는 애치슨 콜로이드(Acheson Colloids; 영국 플라이마우스 프린시즈 락 소재)에 의해 시판되고 있다. 반도체 전극들은 시약층의 효소 또는 다른 성분들의 표면 부착을 허용하도록 기능화될 수 있기 때문에 바 람직할 수 있다. 이는 고정화(immobiliztion)와 관련된 이점을 제공할 뿐만 아니라, 시약과 전극 사이의 직접적인 전자 전달을 허용한다.

전극들은 상이한 재료 또는 동일한 재료로 제조될 수 있다. 전극들이 동일한 조성으로 예를 들어, 카본-전극으로 이루어지는 실시예는 장점을 제공할 수 있다. 특히, 단일 전극 재료를 사용하게 되면 작업 및 기준 전극이 단일 단계로 배치될 수 있고, 그에 따라 제조 공정으로부터 전극 프린트를 제거할 수 있다. 개별적인 프린트 작업 상호 간에 달성될 수 있는 정렬(alignment)(0.5㎜ 이상의 허용오차)에서가 아니라 하나의 스크린상에서의 아트워크(artwork)(약 200㎛의 허용오차)에 의해서만 사이 분리가 결정되기 때문에, 두 개의 전극은 함께 매우 가깝게 프린트될 수 있다. 이는 반응 면적을 보다 작게 만들어서 전극들을 덮는데 필요한 혈액 용적의 감소를 초래한다.

작업 전극은 목표 분석물의 검출에 사용되는 효소 및 매개체를 함유하는 전극 위에 배치된 하나 이상의 시약층을 구비한다. 따라서, 예를 들어, 포도당 센서에 있어서, 시약층(들)은 포도당 산화효소(oxidase)와 같은 효소와, 페리시아나이드(ferricyanide), 메탈로센(metallocene) 화합물, 퀴논(quinones), 페나지늄 염 (phenazinium salts), 레독스 지시약 DCPIP(redox indicator DCPIP), 및 이미다졸-치환 오스뮴(imidazole-substituted osmium) 화합물과 같은 매개체를 포함한다. 시약층은 효소와 매개체를 포함하는 단일 층으로 이루어지거나, 약간의 효소 또는 효소와 매개체를 함유하거나, 약간의 매개체만을 함유하는 복수의 서브층(sub layer)으로 구성될 수 있다.

본 발명의 디바이스는 짧은 시간 간격으로 사용하고자 하는 것이기 때문에, 전극들의 중요한 특징은 신속하게 수화할 수 있는 것이다. 수화 속도는 시약층의 조성에 의해 결정된다. 본원에 참조로서 합체되는 미국특허 제5,708,247호 및 국제특허공보 WO 00/42422호에 기재된 형태의 실리카-기반의 시약층을 이용하는 전극 시스템은 신속한 습윤 및 수화를 허용하므로, 본 발명의 센서에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 센서의 전극들의 시약층에 가장 적합한 재료는 전극 표면과의 접촉을 유지하고 전극 근처에 시약을 유지하는 겔을 형성하도록 신속하게 수화되는 재료이다. 시약층이 수화 이후에 신속하게 분산되면, 시약(특히 효소 시약)은 샘플 내의 분석물 농도를 반영하는 신호의 전개에 가장 유리한 위치의 전극 표면 근처에서 신속하게 소실된다.

시약층은 분석물 농도를 반영하는 신호의 발생에 즉각적인 관여가 가능한 형태의 매개체를 포함해야만 한다. 이는 효소에 의해 산화되는 포도당과 같은 분석물의 경우에, 매개체가 신속하게 용해되어 산화된 형태로 존재해야만 한다는 것을 의미한다. 메디센스(Medisense)에 의해 QID^TM 및 EXACTECH^TM 의 상표명으로 시판되고 있는 포도당 스트립에서, 매개체는 실제로 환원된 형태로 존재하고, 포도당 검사 반응에서 관여될 수 있기 전에 제위치에서 산화되어야만 한다. 이는 스트립의 반응 시간을 제한하고, 짧은 테스트 시간에는 사용할 수 없게 만든다.

기준 전극의 경우에, 전극은 신속하게 수화되어야 할 필요가 있고, 수화와 관련하여 순간적으로 즉, 200 msec 이내로 작업 전극에 의해 요구되는 전류를 제공할 수 있을 정도로 신속하게 안정화될 수 있다. 종래의 실버/실버 클로라이드 기 준 전극은 충분히 신속하게 안정화될 수 없다. 한편, 페리-페로시아나이드(ferri-ferrocyanide) 기준 전극은 매우 신속하게 평형을 유지하도록 이루어질 수 있다. 이러한 디자인에서는 신속하게 용해 및 분산되는 매개체를 함유하는 층이 사용된다. 본 발명의 특정 실시예에서, 카본 잉크 전극은 매개체로서 포타슘 페리시아나이드를 함유하는 시약층과 함께 사용된다. 포도당 산화효소는 조성의 친수성을 증가시키기 위해 추가되는 폴리머를 갖는 하이드록시 에틸셀룰로오스-실리카(hydroxy ethylcellulose-silica) 베이스 내의 효소로서 사용된다. 이러한 시스템은 매우 큰 표면적을 가지며 신속하게 습윤된다.

작업 전극 및 기준 전극에 부가하여, 본 발명의 디바이스는 제 3 전극을 포함하도록 구성될 수 있다. 제 3 전극은 배경 반응(background reactions)을 보상하도록 되어 있는 더미(dummy) 전극이거나, 또는 종래의 세가지 전극 시스템으로 이루어진 상대(counter) 전극일 수 있다. 제 3 전극은 또한 상기와 동일한 작업 전극일 수 있다.

상술된 본 발명의 실시예들에 있어서, 모든 층들은 신속하게 용해 또는 수화된다. 상기 산화된 매개체의 신속한 용해 또는 적어도 수화가 간섭물 소모에 대해서는 문제되지 않고 이러한 필요조건의 달성을 보조할 수 있지만, 가장 유리한 위치의 전극에 가까운 영역으로부터 멀리 효소를 용이하게 확산시키기 때문에, 효소를 함유하는 층에 대해서는 전체적으로 양호한 특징은 아니다. 그러므로, 두가지 양태를 조합한 양호한 구성이 도 6에 도시된다. 본 발명의 이러한 실시예에서, 센서(60)는 하부 기판(63), 스페이서(64, 65) 및 상부 커버(66)로 형성되는 캐비 티(67)를 구비한다. 두 개의 카본 전극(61, 62)은 캐비티(67) 내부의 하부 기판(63)상에 배치된다. 전극(62)은 효소 및 매개체를 함유하는 상대적으로 얇은(예를 들어, 5㎛) 점성 겔 층(68)으로 코팅된다. 그 후, 두 개의 전극(61, 62)은 매개체는 함유하지만 효소는 함유하지 않는 상대적으로 두꺼운(예를 들어, 25㎛) 분산 층(69)으로 코팅된다.

본 발명의 다른 실시예에서, 두 개의 개별 층은 간섭물의 효과를 추가로 감소시키도록 구성된다. 간섭물의 화학적 소비를 이용하는 한 방식은 과도하게 산화된 매개체를 외부에 갖는 시약층을 제공하는 것이다. 특히 유용한 구성에서, 전극은 효소와 매개체를 함유하는 얇은 시약층으로 코팅되고, 이후에 매개체만을 함유하는 두꺼운 층으로 코팅된다. 양 층은 확산을 제한하지만 전류를 운반할 수 있도록 신속하게 수화되는 매트릭스로 배치된다. 얇은 층에만 효소를 한정함으로써, 효소는 대부분 전극 근처에 가깝게 유지되므로 상술된 기생(parasitic) 반응은 중요하지 않게 된다. 두꺼운 외부 매개체 층은 내향 확산 간섭물에 대한 장벽(barrier)을 제공하고 확산을 제한하는 매트릭스로 인해 소망 위치에 유지된다. 임의의 제 3 층은 신속하게 수화되는 분산가능 매트릭스로 매개체를 함유하는 제 1 및 제 2 층의 외부에 포함될 수 있다. 샘플 용적을 작게 유지함으로써, 샘플 내의 간섭물의 전체 양이 최소로 유지되고, 재구성부상의 산화된 매개체의 농도가 높으므로, 매개체는 간섭물을 효과적으로 제거한다. 명백하게 시간이 경과하면, 매개체가 샘플 내로 확산하여 간섭이 보다 현저해질 때, 매개체의 국부적인 농도는 떨어진다. 경험에 의하면, 1㎕ 미만, 양호하게는 0.5㎕ 미만의 샘플 용적이 이상적 이다.

본 발명에 따라 구성되는 센서에 의하면, 공지된 센서를 사용하여 달성된 시간보다 현저하게 짧은 시간에 테스트 측정이 취해진다. 테스트 시간을 단축시킴으로써, 적혈구용적율 효과는 감소될 수 있다. 상기 센서가 백혈구 및 적혈구와 같은 임의의 혈액 성분에 지연 효과를 나타내는 시약층으로 덮인 전극을 포함하면, 단시간에 전극에 도달하는 유체는 장시간에 전극에 도달하는 유체의 경우보다 현저하게 적은 상기 성분들을 포함하게 된다.

도 7은 테스트 시간에 대한 계수의 상호관계를 도시한다. 극도로 짧은 테스트 시간에는, 시스템이 아직 안정화되지 않았기 때문에 상호관계가 불충분하다. 매우 긴 테스트 시간에도, 상호관계는 열화를 개시한다. 테스트 시간을 짧게 함으로써 간섭을 제한하게 되면, 테스트는 점선으로 지시된 구간에서 적절하게 수행되고, 상기 구간은 후술되는 센서에 대해서는 10초 미만, 양호하게는 5초 근처가 된다. 본 발명의 일회용 센서는 이러한 시간 구역 내에서 포도당의 정확한 측정을 제공하기 위해 테스트 측정기와 함께 작동한다. 따라서, 상기 센서는 단시간에 정확하고 신뢰도 있는 정보를 제공하는 신호를 생성하도록 구성되며, 내부에 상기 센서가 삽입되는 측정기는 상기 시간동안 정보를 수집하도록 되어 있다.

도 8은 본 발명에 따른 예시적인 휴대용 측정기의 외형도를 도시한다. 종래의 측정기와 유사하게, 본 발명의 측정기는 결과를 표시하기 위한 디스플레이(82)를 갖는 하우징(81)과, 일회용 센서를 삽입하기 위한 슬롯(83)을 구비한다. 저장 결과와, 보정 체크 등의 소환을 포함하는 측정기의 작업을 위해 버튼(85) 및/또는 스위치가 포함될 수 있다. 본 발명의 측정기가 종래의 측정기와 다른 점은 하우징 내부의 전자제품에 있다. 종래의 측정기에서, 혈액 방울과 같은 액체 샘플을 하우징 내의 일회용 센서에 첨가하게 되면, 혈액이 용해되어 판독을 취하는 측정 사이클이 개시된다. 상기 사이클의 개시는 바람직한 방법은 아니지만 사용자가 버튼을 누름으로써 개시될 수도 있다. 측정기 내의 마이크로프로세서는 통상적으로, 간섭을 체크하기 위해 주기적으로(예를 들어, 0.5초 마다) "슬립(sleep)" 모드 및 "웨이크 업(wakes up)" 모드로 된다. 간섭 플래그가 스트립이 측정기에 삽입되었거나 시동 버튼이 눌렸다는 것을 나타내는 것으로 설정된 것을 프로그램이 검출하면, 상기 프로그램은 RUN 모드로 진입한다. 이러한 모드에서, 통상적으로 전위는 스트립에 적용되며 마이크로프로세서는 스트립에 의해 유도된 임의의 전류 레벨을 지시하는 펄스-폭 모니터의 출력(듀티 사이클; duty cycle)을 감시한다. 샘플이 스트립에 적용되면, 스트립은 이미 분극 전위(polarization potential)이기 때문에 전류가 흐른다. 이러한 시동 전류의 검출은 타이밍 순서를 개시한다. 타이밍은 마이크로프로세서에 의해 제어된다. 작동 기능을 위한(즉, 측정을 실행하기 위한) 4 ㎒ 클럭과, OFF 모드에서 시간을 유지하는 32 ㎒ 클럭과 같은 두개의 크리스탈이 존재한다. 타이밍 공정을 개시하면, 상기 적용 전위는 (1) 일정한 레벨로 유지되거나, (2) 소정의 프로파일로 변경될 수 있다. 어떤 경우에든 전류는 소정 시간 이후에 샘플 내의 분석물 양을 평가하기 위해 측정된다. 예로서, 샘플 적용이 t=0 에서 검출되고, 적용 전위가 스트립이 개방 회로일 때 2 sec간 제거된 후, 동일한 전위가 다시 적용되는 시스템 내에서 도 7에 도시된 데이터가 수집되었다. 전류는 다수의 시점에서 측정되었고, 전류와 분석물 농도의 상호관계는 각각의 시점마다 결정되었다.

본 기술 분야에 공지된 시판중인 측정기에서, 측정 사이클은 샘플의 검출 후에 20 내지 60초에서 전류를 측정하도록 설정되었다. 그러나, 본 발명의 신속 반응형 스트립에 사용하도록 되어 있는 본 발명의 측정기에서, 측정 사이클은 샘플의 검출 후 15초 이내의 시점에서 전류를 측정하도록 설정되며, 양호하게는 샘플의 검출 후 5초 내지 10초의 시점에서 전류를 측정하도록 설정된다.

본 발명은 하기의 비제한적인 예들을 참조로 추가로 설명된다.

제 1 예

본 발명에 따른 신속 반응형 포도당 센서는 도 9a 내지 도 9c에 도시된 순서로 하기와 같은 재료로 준비된다.

기판: 폴리에스테르 필름

카본 잉크 조성: 에르콘(Ercon) 도전성 카본

시약층 조성물: 후술됨

접착제: 물(water)-기반의 아크릴 코폴리머 접착제(Apollo 접착제)

친수성 필름: 3M 100μ친수성 필름 9962

상부 커버: 압력 민감성 접착제로 코팅된 폴리에스테르 스트립(테이프 특성)

상기 시약층은 다음과 같은 조성으로 이루어진다. 100 mM 수성 트리소듐 시트레이트(trisodium citrate) 100㎖가 1 M 구연산(citric acid)의 추가에 의해 pH5 로 조절되었다. 이것에, 5g의 하이드록시에틸셀룰로오스(HEC), 1g의 폴리비닐 알 콜, 1g의 PVP-VA S-630 폴리(비닐피롤리돈 비닐 아세테이트) 및 0.5㎖의 DC 1500 다우 코닝(Dow Corning) 거품 억제제(anti-foam)가 첨가되고, 균질화(homogenization)에 의해 혼합되었다. 상기 혼합물은 공기 방울(기포)이 분산하도록 밤새(overnight) 보존한 후, 코팅 조성물의 조성을 위한 원액(stock solution)으로서 사용되었다. 7.5g의 Cab-o-Sil TS610은 전체량의 약 4/5가 첨가될 때까지 HEC 용액에 수동으로 점진적으로 첨가되었다. 잔여량은 균질화에 의한 혼합에 의해 첨가되었다. 그후, 혼합물은 12시간동안 교반되었다. 그 후, 11g의 포타슘 페리시아나이드가 첨가되어 완전히 용해될 때까지 균질화에 의해 혼합되었다. 마지막으로, 2.8g의 포도당 산화효소 표본(250 Units/mg)이 첨가된 후 상기 용액 내로 완전히 혼합되었다. 최종 조성물은 프린팅을 위해 준비되거나, 냉장 상태로 보관될 수 있다.

상기 센서는 테스트 표준 포도당 용액과, 센서에 포도당을 첨가한 후에 상이한 시기에 측정된 전류에 사용되었다. 실제 포도당 농도와 측정된 포도당 농도 사이의 상관계수는 각각의 시간 간격에 대해 결정되었다. 도 7은 결과를 도시한다. 도시된 바와 같이, 상관계수는 포도당을 센서에 첨가한 후에 5초 정도 경과하여 최대 및 최고값이 달성되었다.

제 2 예

본 발명에 따른 신속 반응형 포도당 센서는 제 1 예에서와 마찬가지로 준비되었다. 이러한 센서는 상이한 농도의 포도당을 노출시킨 후 5초 경과시에 전류량을 결정하기 위해 사용되었다. 비교를 위해, 메디센스(Medisense) QID 포도당 센 서가 동일 조건하에서 실험되었다. 도 10은 이러한 실험 결과를 도식적으로 나타낸다. 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 신속 반응형 센서의 라인균일성(linearity)은 매우 양호하다(R² = 0.999). 5초 경과시의 QID 센서의 라인균일성은 양호하지 않았다(R² = 0.863).

도 1은 일회용 전극 근처에서 반응물 종(reactant species)의 확산 운동을 도시하는 도면.

도 2는 본 발명의 제 1 실시예에 따른 바이오센서(biosensor)의 단면도.

도 3은 본 발명의 제 2 실시예에 따른 바이오센서의 단면도.

도 4는 대면형(face-to-face) 센서 디바이스의 웹(web) 프린팅 장치를 도시하는 도면.

도 5a 및 도 5b는 부분적으로 도시된 대면형 센서 디바이스를 도시하는 도면.

도 6은 본 발명에 따른 센서의 단면도.

도 7은 계수 대 테스트 시간의 상호관계를 도시하는 도면.

도 8은 본 발명에 따른 측정기의 외형도.

도 9a 내지 도 9c는 본 발명에 따른 센서의 구조도.

도 10은 시판 중인 스트립과 본 발명에 따른 신속 반응형 스트립과의 비교도.

Claims (4)

1. 하우징(81),

   결과를 표시하기 위한 디스플레이(82),

   액체 샘플 내의 분석물의 검출 또는 정량화(quantification)를 위해 일회용 전기화학적 센서를 삽입하기 위한 슬롯(83), 및

   상기 센서가 측정기에 삽입될 때에 상기 센서에 대한 샘플 적용의 검출 후에 상기 샘플 내의 분석물을 나타내는 전류의 측정을 제어하기 위한 타이밍 회로를 포함하는 측정기에 있어서,

   상기 타이밍 회로는 상기 샘플 적용의 검출 후 15초 이내의 시점에서 전류의 측정을 개시하는 것을 특징으로 하는 측정기.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 타이밍 회로는 샘플 적용의 검출 후 10초 이내의 시점에서 전류의 측정을 개시하는 측정기.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 타이밍 회로는 샘플 적용의 검출 후 5초 이내의 시점에서 전류의 측정을 개시하는 측정기.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정기는 타이밍 회로가 내장된 휴대용 하우징을 포함하고, 상기 하우징은 센서를 수용하기 위한 개구를 구비하는 측정기.

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