KR100813638B1

KR100813638B1 - 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 조성물

Info

Publication number: KR100813638B1
Application number: KR1020060117281A
Authority: KR
Inventors: 박령준; 이갑득; 박용기; 문병식
Original assignee: 박령준
Priority date: 2006-11-25
Filing date: 2006-11-25
Publication date: 2008-03-14
Anticipated expiration: 2026-11-25

Abstract

본 발명은 강화도산 쑥에서 분리한 멜라닌 생성 저해활성 물질을 함유하는 피부 미백 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 강화도산 쑥으로부터 분리하여 얻은 아피게닌(apigenine), 펜둘레틴(penduletin) 또는 간후안게닌(ganhuangenin)이 티로신 저해활성, 멜라닌 생합성 저해활성, 항산화 활성이 우수함을 확인함으로써 강화도산 쑥에서 분리한 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

강화도산 쑥, 멜라닌 생성 저해활성 물질, 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌

Description

아피게닌을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 조성물{Composition composition comprising apigenine}

도 1은 강화도산 쑥을 추출, 분획하는 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 강화도산 쑥으로부터 화학식 1, 2 및 3의 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 것이다.

도 3은 실시예 2 에서 얻은 분획 B를 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 강화도산 쑥 추출물에 대한 티로시나제 저해 활성을 비교한 그래프이다.

도 5는 싸자리 분획물에 대한 티로시나제 저해 활성을 비교한 그래프이다.

도 6은 아피게닌, 펜둘레틴 및 간후안게닌의 티로시나제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 아피게닌, 펜둘레틴 및 간후안게닌의 B16 세포의 멜라닌 생합성 저해 활성을 나타낸 그래프이다.

도 8은 아피게닌, 펜둘레틴 및 간후안게닌의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.

도 9는 아피게닌, 펜둘레틴 및 간후안게닌의 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.

여성의 미용에 있어서 문제의 하나로 흑변의 피부, 기미, 주근깨, 다크서클을 들 수 있고, 이전보다 한층 더 피부의 미백이 중요시되고 있다. 일반적으로, 거뭇한 피부, 기미, 주근깨, 다크서클은 자외선에 의한 자극이나 호르몬 밸런스 이상, 유전적 요소 등에 의해 멜라노사이트가 자극되고, 그래서 생합성된 멜라닌 색소가 피부에 침착하여 발생하는 것으로 간주되고 있다. 종래, 이러한 거뭇한 피부, 기미, 주근깨, 다크서클에 대해서는 L-아스코르빈산 내지는 그 유도체, 하이드로퀴논 유도체, 태반 추출물, 코지산, 아르부틴 등의 멜라닌 생성 억제제를 화장품에 배합하고, 이것을 피부에 도포함으로써 치료ㆍ개선하는 방법이 주로 사용 되어 왔다. 그러나, 이러한 화장품 등의 경우, 발한 등에 의해 유효 성분이 경시적으로 지워져서 효과를 유지할 수 없어 미백 효과가 불충분하였고, 도포한 부분에만 효과가 발휘된다는 등의 문제점이 있었다. 즉, 화장품으로서 사용할 때는 하루에 여러 번 다시 바르거나, 전신의 거뭇함 또는 기미, 주근깨, 다크서클에 대하여 화장품을 전신에 도포하여야만 되므로, 사용자의 부담이나 번거로움이 상당하였다. 또한, 유효 성분 속에는 피부 자극성이 있어 사용이 제한되거나 이상한 냄새를 갖는 것, 침전 응집을 일으켜 안정성이 결여된 것이 있다는 점, 또한 빛이나 열, 땀에 의한 피부 표면의 pH 변동 등 외적인 자극에 의해 분해, 변성되어 효과가 저하한다는 점 등의 문제점도 지적되고 있다. 이러한 화장품이 갖는 문제점을 개선한다는 이유로부터, 경구 섭취하는 미백 식품이나 미백용 의약품도 개발되고 있다. 예를 들어, 이런 종류의 식품에는 비타민 C를 배합한 것이 있는데, 비타민 C는 안정성이 나빠서 미백 효과를 충분히 만족시킬 수 있다고 할 수 없는 문제점이 있었다. 또한, 그 이외에도 코지산류를 첨가하여 이루어진 미백 식품(일본 특허 공개공보 평6-16685호), 착색미 추출물을 함유하는 화장품, 식품 및 입욕제(일본 특허 공개공보 평10-287525호), 이소후라본류를 유효 성분으로 하는 경구 미백제 및 미백용 식품(일본 특허 공개공보 평11-269066호), 프로안트시아니딘 및 글루타치온을 함유하는 미백 식품(일본 특허 공개공보 2000-60482호) 등을 들 수 있는데, 이들은 이제까지의 것으로 충분한 미백 효과를 기대할 수 없었고, 성분에 따라서는 경구 섭취에 의한 예측할 수 없는 부작용 등이 우려되는 것도 있다는 문제점을 가지고 있다. 이러한 실정으로부터, 현재 충분한 미백 효과를 가지며 안정성이 높은 식품 또는 경구 미백제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 천연물질로부터 미백효과가 우수한 물질을 탐색하던 중, 강화도산 쑥으로부터 피부 미백 개선에 탁월한 효과를 가지면서 안정성도 확보된 아피게닌, 펜둘레틴 및 간후안게닌을 분리하였고, 아피게닌, 펜둘레틴 및 간후안게닌 각각이 거뭇한 피부, 기미, 주근깨, 다크서클 등을 예방 또는 회복시킬 수 있는 매우 우수한 미백 효과를 가지는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 아피게닌(apigenine), 펜둘레틴(penduletin) 또는 간후안게닌(ganhuangenin)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 아피게닌(apigenine), 펜둘레틴(penduletin) 또는 간후안게닌(ganhuangenin)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 유효성분으로 함유하는 피부 미백제 또는 기능성 식품을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 강화도산 쑥으로부터 분리된 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌이 멜라닌 생성 억제 기능을 가짐을 확인함으로써 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

먼저, 강화도산 쑥(Artemisia Herba of Kang Hwa)을 메탄올 추출하고 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물의 극성 순으로 추출한 추출물 중 활성이 가장 좋은 에틸아세테이트 층의 농축물을 역상 실리카에 충진하여 클로로포름/메탄올 = 50/1 ~ 1/1(v/v)로 용출하여 얻은 물질이 다음과 같은 화학식 1로 나타내는 아피게닌(apigenine), 화학식 2로 나타내는 펜둘레틴(penduletin) 및 화학식 3으로 나타내는 간후안게닌(ganhuangenin)임을 확인하였다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1로 나타내는 아피게닌(apigenine), 화학식 2로 나타내는 펜둘레틴(penduletin) 및 화학식 3으로 나타내는 간후안게닌(ganhuangenin)이 본 발명에서는 미백 효과를 가짐을 밝히고 있다.

한편, 미백 효과란, 자외선 노출, 호르몬 밸런스의 변화, 유전적 프로그램 등의 각종 요인에 의해 발생하는 거뭇한 피부나 기미, 주근깨, 다크서클을 개선 또는 방지하는 효과, 피부를 투명감 있는 아름다운 것으로 하는, 혹은 투명감 있는 아름다운 피부를 유지하는 효과, 피부의 칙칙함을 경감하여 윤기ㆍ팽팽함을 증가시키는 효과 등을 의도하고 있다. 일반적으로, 거뭇한 피부나 기미, 주근깨, 다크서클은 자외선에 의한 자극이나 호르몬 밸런스의 변화 등에 의해 멜라노사이트가 자극되고, 그래서 생합성된 멜라닌 색소가 피부에 침착하여 발생한다고 알려져 있다. 따라서, 멜라닌의 생성을 억제할 수 있다면, 거뭇한 피부나 기미, 주근깨, 다크서클을 예방ㆍ개선하는 것이 가능하다.

상기 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌의 멜라닌 생성 억제 기능을 배양 색소 세포를 사용한 시험법으로 확인하였다. 색소 세포란 멜라닌 생성 기능을 가지는 세포로서, 이 세포는 통상적으로 배양한 경우, 멜라닌 색소가 축적하여 흑 색화된다. 이에 대하여, 이 배양계내에 멜라닌 생성 억제 기능을 가지는 물질을 존재시키면, 멜라닌의 생성이 억제되어 상대적으로 백색화된다. 이 상대 백색화의 정도로부터, 멜라닌 생성 억제 기능을 예상할 수 있다.

상기 시험법의 결과로, 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌이 공지의 미백제인 알부틴, 하이드로 퀴논(Hydroquinone)과 비교하여 볼 때, 우수한 멜라닌 생성 억제 기능을 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명은 상기 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌 외에 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 유도체 역시 피부 미백 기능을 가짐을 포함한다.

또한, 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 약학적으로 허용되는 적당한 염이나 유도체의 형태로 함으로써, 수용성 또는 유용성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 취급성, 품질, 미백 효과를 향상시킨 제품을 설정할 수 있다.

따라서, 본 발명은 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 그 특징이 있다.

상기 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 유효성분으로 포함하는 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 일반적인 의약품, 의약외품 및 기능성 식품 등의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙 틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다. 또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용제, 주사제 등의 제형을 의미한다.

상기 화합물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎/㎏(몸무게)/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고 1일 유효투입량은 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.

또한, 여기에서, 기능성 식품으로서는 과자, 가공식품, 조합 유지, 유제품, 음료 등의 각종 식품을 들 수 있고, 형상ㆍ성상도 특별히 제한되지 않아 고체 형상, 반고체 형상, 겔 형상, 액체 형상, 분말 형상 등 어느 것이라도 된다.

또한, 본 발명의 식품으로서 음료 등의 수계 식품, 예를 들어 청량음료도 얻을 수 있다. 특히, 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌의 일부 또는 전부를 그 생리적으로 허용가능한 염 또는 그 특정 유도체의 상태로 하여, 본래 대체로 유용성을 나타내는 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌의 수용성을 향상시킬 수 있으므로 바람직하다.

또한, 본 발명의 조성물은 의약품으로 섭취할 수도 있고, 원료로서 식품에 배합할 수도 있다.

여기에서, 유효성분으로서 함유한다라는 것은, 그 미백 효과 등을 발휘할 정도로 함유한다는 것이지만, 그 함량은 특별히 제한되지 않고 섭취의 빈도, 섭취량, 사용의 목적에 따라 적절히 조정하면 된다. 예를 들어, 직접 경구 섭취하는 경우에는 비교적 저농도가 좋고, 음식물의 원료 등에 사용하는 경우는 고농도가 바람직하다.

본 발명의 기능성 식품에 있어서, 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌의 함량은 특별히 제한받지 않고, 전술한 대로 함유하는 유효성분의 종류, 음식물의 종류, 섭취량, 섭취의 빈도, 섭취하는 사람의 체중, 성별 등에 의해서 적절하게 조정하면 되고, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 0.1 ∼ 50 중량%, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 30 중량%이다.

본 발명의 기능성 식품은 상기 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 함유하기 때문에, 이들이 가지는 여러 가지 효과를 가지지만, 특히 피부의 미백 효과, 항산화 효과를 가지는 것을 특징으로 한다. 음식물이기 때문에 용이하게 계속적인 섭취가 가능하며, 적합한 효과를 기대할 수 있다.

또한, 본 발명의 기능성 식품은 기능의 향상, 특히 미백 효과의 상승적인 향상, 미백 효과의 보조, 항산화 효과, 흡수성의 향상 등을 목적으로 하여, 다른 생리적 활성 성분 등을 배합할 수 있다. 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 상승적인 효과를 기대할 수 있는 다른 경구 미백 성분, 간접적으로 미백 효과로의 기여가 있는 항산화 성분, 체내에서의 흡수성을 향상시켜 효과의 효율을 올리기 위한 유성 성분, 영양 강화를 위한 각종 비타민류, 미네랄류, 아미노산류 등을 들 수 있 다.

상기 각 성분은 사용 목적에 따라서 적절하게 설계, 배합할 수 있다. 흡수성이나 작용효과의 종류에 따라서 미백 효과를 상승, 보완하거나 사용형태로서 바람직한 양태로 할 수 있다.

본 발명의 식품에 대하여 하기에 구체예를 열거하지만, 본 발명은 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 음식물이란 그 형태 등에 대해서 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 통상의 형태 이외에, 유동식품, 경장영양식품, 건강식품, 유소아 식품 등의 형태를 취할 수 있다. 특히, 계속적인 섭취라는 면에서는 쌀밥이나 각종 조미료, 조합 유지나 마가린, 쇼트닝, 마요네즈, 드레싱 등의 유지 가공품이 바람직하다고 할 수 있다. 또한, 형상ㆍ성상도 특별히 제한받지 않고, 고체 형상, 반고체 형상, 겔 형상, 액체 형상, 분말 형상 등 어떤 것이라도 좋다.

본 발명의 식품을 섭취하여, 피부의 미백 효과, 항산화 효과를 가지는 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 체내에 흡수함으로써 효과를 가져온다. 음식물이라는 형태이기 때문에, 화장료와 같은 노력도 필요 없고, 계속적으로 섭취할 수 있으므로 바람직하다.

즉, 본 발명의 조성물을 섭취함으로써 그 미백 효과를 발현하는 것으로, 거뭇한 피부나 기미, 주근깨, 다크서클을 개선 혹은 방지하여, 투명감 있는 아름다운 피부로 유지하는데 크게 기여할 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이 들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 쑥 추출물의 제조

강화군 길상면 선두리 애전부락에서 채취한 싸자리를 건조하여 잘게 자른 후 분쇄기로 600× g에서 15분 동안 분쇄한 다음 70% 메탄올을 시료 량의 10배 가량 넣고 실온에서 48시간 동안 침지시킨 후 3회 반복하여 추출물 95 g을 얻었다. 이 추출물을 헥센, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물의 극성 순으로 추출한 다음 여액을 감압 농축 시킨 후, 동결 건조하여 헥센 분획 10.2 g, EtOAc 분획 12.5 g 및 n-부탄올 분획 20.5 g을 각각 얻었다[도 1].

실시예 2: 멜라닌 생성 저해활성 물질의 분리

싸자리의 메탄올 추출물을 도 2의 방법에 따라 분리하여 얻은 EtOAc 추출물 12.5 g을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 이때 용매조건은 클로로포름/메탄올 = 50/1 ~ 1/1(v/v)이다. 분리한 분획들은 TLC(Thin Layer Chromatography)을 사용하여 Rf값이 유사한 것을 모아 4개의 분획으로 분리하였다. 이들 분획 중에서 티로시나제(tyrosinase) 저해활성 및 B16 세포에 대한 저해활성이 가장 높은 한 개의 분획을 얻었다. 이 분획으로부터 분리된 활성 분획(Fr. 3)을 다시 다공정 수지를 통하여 분자 크기에 따라 물질을 분리할 수 있는 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리한 분획을 Rf값이 유사한 것끼리 모아 3개의 분획을 얻었다. 이때 전개용매는 클로로포름/메탄올 = 1/1을 사용하였다. 이 분획 중 활성이 가장 좋은 B 분획을 ODS-AM HPLC 컬럼(Eclipse XDB-C18 9.4mm × 25cm, Flow rate : 0.7ml/min, UV 220nm)을 사용하여 분리한 결과 3종류의 성분, 즉 화합물 1은 15.4 mg, 화합물 2 은 12.4 mg 및 화합물 3은 25.3 mg을 각각 얻었다[도 3].

실시예 3: 화합물 구조 규명

(1) 화합물 1의 구조 규명

EtOAc 분획에서 분리한 화합물 1은 노란색 분말로 FeCl₃와 Mg-HCl의 정색반응에서 양성을 나타내었다. IR 스펙스럼에서 3330 cm^-1(OH), 1650 cm^-1(α,β-unsaturated ketone), 1610 cm^-1, 1580 cm^-1(aromatic C=C)의 흡수대의 진동모드를 나타냄에 따라 플라보노이드(flavonoid) 화합물로 추정할 수 있었다.

yellow needles (CHCl₃-MeOH) ; m.p. 343 ~ 344 ℃ ;

IR υ_max(KBr) cm^-1 : 3330, 1650, 1580

EI/MS m/z(70eV) : 270 [M]⁺, 269, 242, 153, 121 ;

¹H NMR (600 MHz, CD₃OD, δ ppm) : δ7.91(2H, d, J=8.4Hz, H-2', 6'), 7.20(2H, d, J=8.4Hz, H-3', 5'), 6.90(1H, s, H-3), 6.81(1H, s, H-8), 6.74(1H, s, H-6).

¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD, δ ppm) : δ182.6(C-4), 165.8(C-7), 164.4(C-2), 161.6(C-5), 162.6(C-4'), 158.4(C-9), 128.9(C-2', 6'), 122.2(C-1'), 116.8(C-3', 5'), 104.9(C-10), 103.9(C-3), 100.0(C-6), 94.9(C-8).

따라서, 화합물 1은 이미 알려진 아피게닌(Apigenine, 4',5,7- trihydroxyflavone)과 동일한 구조임을 확인하였다.

(2) 화합물 2의 구조 규명

EtOAc 분획에서 분리한 화합물 2는 노란색 분말로 FeCl₃/CH₃OH에 의한 정색반응에서는 청녹색, Mg-HCl에 의한 반응에서는 황적색을 나타내어 이 화합물이 플라보노이드 화합물임을 알 수 있었다. MP는 255℃, EI-MS로 측정한 분자량은 346으로 이 화합물은 C₁₇H₁₄O₇의 분자식을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다. UV 스펙트럼은 266 nm와 340 nm에서 피크가 나타났으며, 266 nm에서 최대흡수 파장을 보였다.

yellow amorphous powder (CHCl₃-MeOH) ; m.p. 250 ~ 255 ℃ ;

IR υ_max(KBr) cm^-1 : 3470, 3094, 1658, 1616

EI/MS m/z(70eV) : 346 [M]⁺, 316, 167, 139 ;

¹H NMR (600 MHz, CD₃OD, δ ppm) : δ6.29(1H, s, H-3), 6.30(1H, s, H-6), 6.56(1H, d, J=8.0Hz, H-3'), 6.68(1H, d, J=8.0Hz, H-4'), 3.81(3H, s, OCH₃), 3.86(3H, s, OCH₃).

¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD, δ ppm) : δ181.8(C-4), 161.3(C-2), 156.1(C-9), 156.4(C-5), 150.0(C-7), 141.9(C-5'), 147.9(C-2'), 127.1(C-8), 114.1(C-1'), 145.6(C-6'), 118.8(C-4'), 110.9(C-3'), 103.4(C-10), 103.3(C-3), 98.1(C-6), 59.6(OCH_3,C-7'), 60.1(OCH_3,C-8').

따라서, 화합물 2 역시 이미 알려진 간후안게닌(Ganhuangenin, 2',5,5',7-tetrahydroxy-6',8-dimethoxy flavone)의 구조임을 확인하였다.

(3) 화합물 3의 구조 규명

EtOAc 분획에서 분리한 화합물 3은 노란색 분말로 FeCl₃/CH₃OH와 Mg-HCl에 의한 정색반응을 통해 플라보노이드 화합물임을 예상할 수 있었다. MP는 170℃, EI-MS로 측정한 결과 분자량은 344로서 이 화합물은 C₁₈H₁₆O₇의 분자식을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다. UV 스펙트럼은 278 nm와 330 nm에서 피크가 나타났으며, 278 nm에서 최대흡수 파장을 보였다.

yellow amorphous powder (CHCl₃-MeOH) ; m.p. 169 ~ 170 ℃ ;

IR υ_max(KBr) cm^-1 : 3400, 3000,1658, 1612, 1582

EI/MS m/z(70eV) : 344 [M]⁺, 329, 326, 301, 195 ;

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃, δ ppm) : δ7.70(1H, dd, J=2.3, 2.2, 8.3Hz H-6'), 7.68(1H, d, J=8.3Hz, H-2'), 6.95(1H, d, J=8.3Hz H-5'), 6.43(1H, d, J=8.3Hz, H-8), 6.33(1H, d, J=8.3Hz, H-6,), 3.97(3H, s, OCH₃). 3.86(3H, s, OCH₃), 3.85(3H, s, OCH₃).

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃, δ ppm) : δ155.5(C-2), 139.0(C-3), 178.6(C-4), 161.7(C-5), 97.8(C-6), 165.2(C-7), 92.8(C-8), 156.5(C-9), 107.5(C-10), 124.3(C-1'), 122.5(C-2'), 145.4(C-3'), 155.5(C-4'), 110.3(C-5'), 114.3(C-6'), 60.1(7'-OMe), 56.0(8'-OMe), 55.8(9'-OMe).

따라서, 화합물 3은 이미 보고된 펜둘레틴(Penduletin, 4',5-dihydroxy-3,6,7-trimethoxy flavone)의 구조임을 확인하였다.

실시예 4: 강화도산 쑥에 대한 티로시나제 저해 활성

강화에서 자생하는 싸자리(Ssajary), 사자발쑥(Sajabalssuk) 및 싸주아리(Ssajuary)에 대해서 멜라닌 생합성에 관한 티로시나제의 저해활성을 조사하기 위해 96 웰 플레이트에 티로신 용액(tyrosine solution) 40 ㎕와 티로시나제 10 ㎕을 넣은 다음, 시료 10 ㎕로 처리하여 초기 값을 측정하고 37 ℃에서 12분 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 490 nm에서 DOPA 크롬의 양을 측정하였다. 측정한 결과 시료 농도 50 ㎍/㎖에서 사자발쑥 27%, 싸 주아리 35% 그리고 싸자리 76%의 저해활성을 보였다. 이 중에서 싸자리가 가장 높은 티로시나제 저해활성을 나타내었다[도 4].

실시예 5: 싸자리 분획물에 대한 티로시나제 저해 활성

티로시나제의 저해활성이 가장 높은 싸자리를 70% 메탄올로 48시간동안 침지시켜 추출한 다음, 증발 농축시킨 액기스를 헥센 층, EtOAc 층, n-부탄올 층 및 물 층의 순으로 각각 추출하여 분획을 얻었다. 티로시나제에 대한 저해 활성은 Ishihara 등(1991)의 방법[Ishihara, Y., M. Oka, M. Takemura, K. Yomita, M. Hatori, H. Yamamoto, H. Kamei, T. Miyaki, M. Komish and T. Oki. "Melanostain, a new melanin synthesis inhibitor." Journal of Antibiotics 1991; 44: 25~32.]을 인용 변형하여 각 분획별 티로시나제의 저해활성을 조사한 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 보는 바와 같이 시료 농도 50 ㎍/㎖에서 헥센 층은 57%, EtOAc 층은 58%, n-부탄올 층은 46% 및 물 층은 27%의 저해활성을 보였다. 여러 분획 중에서 EtOAc 층에서 티로시나제 저해활성이 가장 높았다. 그러나, 헥센 층, n-부탄올 층 및 물 층에서도 상당히 높은 저해 활성이 나타나는 것으로 보아, 모든 층에서 유효성분들이 다량 존재함을 예측할 수 있었다.

실시예 6: 멜라닌 생성 저해 활성 측정

(1) 티로시나제 저해 활성 측정

머쉬룸 티로시나제에 대한 저해활성은 Ishihara 등의 방법[Ishihara, Y., M. Oka, M. Takemura, K. Yomita, M. Hatori, H. Yamamoto, H. Kamei, T. Miyaki, M. Komish and T. Oki. "Melanostain, a new melanin synthesis inhibitor." Journal of Antibiotics 1991; 44: 25~32.]을 변형하여 사용하였다. 즉, 96 웰 플레이트(SPL, Korea)에 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.5) 140 ㎕, 1.5 mM 티로신 용액 40 ㎕와 2100 unit/㎕ 머쉬룸 티로시나제(pH 6.5) 10 ㎕을 넣은 후, 샘플을 10 ㎕ 처리하여 초기 값을 측정하고 37 ℃에서 12분 반응 시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 생성되는 DOPA 크롬의 양을 490 nm에서 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 다음 수학식 1에 의하여 계산하였으며, IC₅₀은 저해물질 효소 활성의 50%를 저해하는 샘플 농도를 환산하였다.

A : 저해제를 넣은 것의 반응 전 흡광도

B : 저해제를 넣은 것의 반응 후 흡광도

C : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 전 흡광도

D : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도

싸자리에서 분리된 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴의 티로시나제 저해 활성 결과는 도 6과 같다. 50 ㎍/ml 농도에서 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴과 양성대조군인 알부틴(Arbutin)에 대해서 저해 활성을 비교 조사한 결과, 알부틴 보다 아피게닌은 3.7배, 펜둘레틴은 2배 높은 멜라닌 생합성 저해활성을 보였고, 간후안게닌은 0.7배 낮은 멜라닌 생합성 저해활성을 보였다. 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴에 대한 IC₅₀을 조사해보면 아피게닌은 20 ㎍/ml, 간후안게닌은 81.3 ㎍/ml, 펜둘레틴은 45 ㎍/ml을 나타내었다. 대조구로 사용된 알부틴에 대한 IC₅₀은 71.4 ㎍/ml이다.

(2) B16 세포의 멜라닌 생합성 저해활성 측정

멜라민-a 세포의 멜라닌 생합성 저해활성을 측정하기 위해 다음과 같이 하였다.

멜라민-a 세포 1×10⁵ cells/ml의 농도를 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL)을 포함하는 DMEM 배지에 현탁하였다. 현탁세포 1 ml을 24 웰 플레이트(Falcon, Becton Dickinson)에 넣고 5% CO₂ - 95% 공기조건으로 37 ℃에서 세포부착을 위해 24시간 배양하였다. 세포가 안정화되면 새로운 배지로 교환하며 시료를 농도별로 3일 동안 동일하게 처리한 후 24시간 후에 생성된 멜라닌을 1.0N NaOH에 용해하여 400 nm에서 흡광도를 측정하였다.

B16 세포의 멜라닌 생합성 저해 활성 측정의 실험구로 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴을 사용하였으며 양성대조군으로서 알부틴 및 하이드로 퀴논(Hydroquinone)을 사용하였다. 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴의 B16 세포 멜라닌 생합성 저해활성 결과는 도 7과 같다. 도 7에서 보는 바와 같이, 50 ㎍/ml 농도에서 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴의 저해활성과 알부틴을 비교 조 사한 결과, 간후안게닌은 66.7%, 펜둘레틴은 42% 저해활성이 감소하고, 아피게닌은 17%의 멜라닌 생합성 저해활성이 증가하였다. 그러나, 하이드로 퀴논(Hydroquinone)와 비교하여 보면 모든 실험구의 멜라닌 생합성 저해활성이 증가하였다. 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴에 대한 IC₅₀ 값은 아피게닌은 40.7 ㎍/ml, 간후안게닌은 81.7 ㎍/ml 그리고 펜둘레틴은 69.1 ㎍/ml를 보였고, 알부틴은 49.1 ㎍/ml, 하이드로 퀴논(Hydroquinone)은 120 ㎍/ml을 나타내었다.

이상의 결과에서 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴은 피부 미백에 우수한 효과를 가짐이 입증되어 미백과 관련된 의약품, 식품, 화장품으로서 개발 가능성이 있다고 사료된다.

실시예 7: 항산화 활성

(1) ABTS 라디칼 소거활성

ABTS 라디칼 소거활성은 항산화제에 의해 항산화 활성을 쉽게 측정할 수 있는 방법 중 하나이다. 이러한 방법은 여러 항산화 활성과 상관관계를 나타내므로 항산화제 검색에 널리 사용되고 있다.

ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)]를 물에 녹인 후 14 mM로 하였다. ABTS 라디칼은 ABTS 용액과 4.9 mM 포타슘 퍼술페이트(potassium persulfate)를 암 조건 하에서 24시간 방치하면 충분한 라디칼이 생성된다. 96 웰 플레이트에 50 ㎕의 H₂O, 140 ㎕의 ABTS radical(A 734 nm=0.8), 10 ㎕ 샘플을 혼합하여 7분간 반응시킨 후, 반응액을 흡광도 734 nm에서 ELISA 리더를 사용하여 측정하였다. 대조구로는 BHA, 트롤록스(Trolox)를 사용하였다.

아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴의 ABTS 라디칼 소거활성은 도 8에 나타내었다. 도 8에서와 같이 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴은 기존의 항산화제인 BHA와 트롤록스 보다 약 2 ~ 3배 높은 활성을 보였다. ABTS 라디칼 소거활성 ED₅₀은 각각 0.7, 0.8 그리고 0.9 ㎍/㎖의 농도를 가지며, 농도에 비례하여 활성이 증가함을 알 수 있었다. 대조구인 BHA와 트롤록스의 ED₅₀은 2.03 ㎍/㎖, 2.94 ㎍/㎖이다.

(2) 수퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical) 소거활성

광반응으로 발생된 자유 라디칼의 소거활성 물질을 탐색하는 검색법으로 리보폴라빈(riboflavin)에 빛을 조사하면 리보폴라빈의 감광반응(photosensitized reaction)에 의하여 리보폴라빈 라디칼이 생성된다. 이것은 다시 산소에 전자를 전달하여 수퍼옥사이드 라디칼을 생성하게 된다. 활성 산소 발생계로서 리보폴라빈/빛을 이용하고 활성산소 검정계 NBT(nitroblue tetrazolium)을 이용하여 자유 라디칼 소거활성을 측정하였다. 96 웰 플레이트에 리보폴라빈과 NBT 용액을 3:2의 비율로 섞은 후 리보폴라빈과 NBT 혼합액 150 ㎕에 시료 10 ㎕를 처리하여 7분간 광반응을 실시하였다. 반응 전과 후의 값을 570 nm에서 ELISA 리더로 측정하여 대조구인 BHA, 트롤록스와 비교하였다.

아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴의 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 기존의 항산화제로 잘 알려진 BHA와 트롤록스에 비해 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이 3종의 화합물은 앞에서 설명한 ABTS 라디칼 소거활성에서도 높은 활성을 나타내었다. 아피게닌, 간후안게닌은 BHA 보다 약 2배 정도의 높은 활성을 보인 반면, 펜둘레틴은 0.7배 낮은 활성을 나타내었다. 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴을 기준물질인 트롤록스와 비교한 결과 3종 화합물 모두 100배 이상의 높은 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성 ED₅₀은 아피게닌은 0.4 ㎍/㎖, 간후안게닌은 0.4 ㎍/㎖ 및 펜둘레틴은 1.4 ㎍/㎖를 나타내었으며 대조구인 BHA의 ED₅₀은 1.08 ㎍/㎖, 트롤록스의 ED₅₀은 100 ㎍/㎖이다.

이상의 결과에서 아피게닌, 간후안게닌 및 펜둘레틴은 항산화 활성이 우수하므로 항산화 관련된 의약품, 식품, 화장품으로서 개발 가능성이 있다고 사료된다.

실시예 7: 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 다음과 같이 실시하였다.

군당 2 마리씩의 동물에 아피게닌, 펜둘레틴 및 간후안게닌을 각각 주사용 증류수에 용해시켜 1 g/kg/㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생 화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 아피게닌, 펜둘레틴 및 간후안게닌 각각은 모든 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량(LD₅₀)은 500 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

제조예 1: 정제의 제조

아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

유효성분 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제조예 2: 연고제의 제조

본 발명의 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

유효성분 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량.

제조예 3: 주사제의 제조

본 발명의 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

유효성분 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트륨 25 mg, 주사용 물 2974 mg

제조예 4: 화장료의 제조

본 발명의 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 이용하여 다음과 같은 조성으로 에센스를 제조하였다.

[조성]

유효성분 10.0 mg, 글리세린 3.0 mg, EDTA 0.05 mg, 벤조페논-9 0.04 mg, 카르복시비닐 폴리머 0.2 mg, 트리에탄올아민 0.18 mg, 옥시도테세스-25 0.6 mg, 글리세릴모노스테아레이트 1.0 mg, 방부제 0.01 mg, 향료 0.01 mg, 정제수 잔량

제조예 5: 음료 제조

본 발명에 따른 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌을 식품, 화장품 또는 경구용 제제로서 섭취할 수 있으므로, 결과적으로 피부에 대한 미백 효과를 적합하게 향유할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 아피게닌, 펜둘레틴 또는 간후안게닌은 천연에서 얻을 수 있기 때문에, 그 사용에 있어서 안심할 수 있다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.

[화학식 1]
제 1 항에 있어서, 상기 아피게닌은 강화도산 쑥으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 조성물.
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다음 화학식 1로 표시되는 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백제.

[화학식 1]
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