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KR101526435B1 - 머루근 추출물을 포함하는 미백용 조성물 - Google Patents

머루근 추출물을 포함하는 미백용 조성물 Download PDF

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KR101526435B1
KR101526435B1 KR1020140169840A KR20140169840A KR101526435B1 KR 101526435 B1 KR101526435 B1 KR 101526435B1 KR 1020140169840 A KR1020140169840 A KR 1020140169840A KR 20140169840 A KR20140169840 A KR 20140169840A KR 101526435 B1 KR101526435 B1 KR 101526435B1
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extract
fraction
whitening
present
skin
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진경숙
오유나
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동의대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 미백용 화장료 조성물, 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 미백용 식품 조성물, 상기 조성물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 완화용 건강기능성 식품, 및 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 조성물은 피부 자극이 없고 세포 독성이 낮은 장점을 보유하면서도 멜라닌의 생성을 저해시키고, 티로시나아제 활성을 억제할 수 있으므로, 피부 미백을 위한 기능성 화장품, 피부 색소 침착 질환을 예방 또는 완화할 수 있는 건강기능성 식품 또는 피부 색소 침착 질환의 치료제로서 유용히 사용할 수 있다.

Description

머루근 추출물을 포함하는 미백용 조성물{Compositions for skin-whitening comprising extract of Vitis amurensis ruprecht}
본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 미백용 화장료 조성물, 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 미백용 식품 조성물, 상기 조성물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 완화용 건강기능성 식품, 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 머루근으로부터 베툴린 산(betulinic acid, BA)을 분리하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 환경공해의 심화와 함께 자외선에 의한 피부손상 등으로 하얀 피부에 대한 선호도가 높아지고 있고 투명 화장으로 보다 맑고 깨끗한 피부를 추구함에 따라 피부미백효과를 얻을 수 있는 방법에 대한 관심이 고조되고 있다. 인간의 피부 색깔은 환경, 인종, 성별 등의 영향을 받으나 일반적으로 갈색의 멜라닌의 함량에 의해 결정된다.
멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라닌 세포의 멜라노좀에서 티로시나제에 의해 산화되어 다이히드록시 페닐알라닌으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 효소적 산화과정 및 비효소적 산화과정을 거쳐 갈색, 흑색의 중합체로 형성된다. 멜라닌 과립을 포함하는 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동하여 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들이 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다.
피부에 멜라닌 색소가 과다 침착되면 원하지 않는 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증후 과색소침착, 광독성 반응 또는 다른 유사한 소형의 고정 색소성 병변을 일으킬 수 있다.
종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone), 아스코르브산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid), 글루타티온(glutathione)과 같은 물질을 사용하여 피부 과색소 침착 또는 멜라닌 과다 생성을 개선하였다. 그러나, 하이드로퀴논은 소정의 미백효과를 발휘하지만 피부자극성이 심하여 배합량을 극소량으로 제한해야 하는 문제점이 있고, 아스코르브산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 조성물은 변색, 변취되는 등의 문제가 발생하며, 코지산은 시간에 따라 광분해가 진행되어 시간이 지나면 제형이 노란색에서 갈색으로 변하는 경향으로 인하여 용액 내에서 불안전하여 조성물의 제조공정이 복잡해지고, 돌연변이 유발 가능, 종양 촉진, 자극성 등과 같은 단점이 있다. 또한, 글루타티온, 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피 흡수에도 문제점이 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장료 조성물의 배합 성분으로 사용하기는 어렵다.
이에 본 발명자들은 인체에 부작용을 일으키지 않으며, 피부 미백 효과가 우수한 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 머루근의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 베툴린 산이 세포에 독성을 일으키지 않는 범위 내에서 기존의 미백제로 알려진 알부틴보다 우수한 티로시나제 활성을 저해 및 멜라닌 생성을 억제 효능이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 미백용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 식품 조성물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 완화용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 머루근으로부터 베툴린 산(betulinic acid, BA)을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "머루(Vitis amurensis ruprecht)"는 갈매나무목 포도과의 덩굴식물로 달고 신맛과 독특한 향을 갖는 자색의 열매가 열리는 식물을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "머루근"은 머루의 뿌리 부위를 의미한다.
식물은 추출 부위에 따라서 각 추출물 또는 이의 분획물의 활성 여부, 활성의 정도, 및 이에 포함되는 구체적인 성분이 상이할 수 있다.
본 발명은 머루(Vitis amurensis ruprecht)의 열매, 꽃, 씨, 줄기, 잎 등의 여러 부위 중에서, 뿌리의 추출물 또는 용매 분획물의 미백 용도를 처음으로 밝힌 것이다. 본 발명의 머루 뿌리의 추출물 또는 용매 분획물은 소량으로도 미백 효과가 우수하다.
또한, 본 발명의 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물에는 미백 활성을 나타내는 베툴린 산(betulinic acid)이 포함된 것일 수 있다.
본 발명에서 머루는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
상기 머루근 추출물은 머루근 또는 그의 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알콜, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득할 수 있다.
구체적으로 머루근 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 세척 및 건조로 이물질이 제거된 머루의 뿌리를 분쇄하여 얻은 머루 건조물을 물, C1~C6의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C1~C4의 알코올로 추출한 추출물일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올로 추출한 추출물일 수 있다. 이때, 추출용매는 머루근의 건조중량의 2 ~ 20 배로 하는 것이 바람직하다. 일례로 머루 뿌리를 분말로 파쇄한 후 추출용기에 넣고 C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올을 넣고 70~80℃에서 추출하여, 알코올 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 추출 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.
한편, 본 발명에서 머루근 추출물의 분획물은 상기 추출물로부터 분획하여 얻을 수 있으며, 분획용매는 그 종류가 제한되지 않는다. 예를 들어, 보다 구체적으로, 상기 머루근 분획물은 머루근 추출물을 물 및 디클로로메탄으로 각각 분획함으로써 물 분획물 및 디클로로메탄 분획물을 각각 얻을 수 있다. 또한, 물 분획물을 다시 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻을 수 있고, 남은 물 분획물을 또 다시 n-부탄올로 분획하여 n-부탄올 분획물을 얻을 수 있다. 본 발명에서 머루근 추출물의 분획물은 바람직하게 물 분획물, 디클로로메탄 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 또는 이의 조합일 수 있다. 보다 바람직하게는, 머루근의 디클로로메탄 분획물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 가장 미백 활성이 우수한 디클로로메탄 분획물로부터 미백 활성의 핵심 작용물질을 찾아내기 위하여, 디클로로메탄 층 분획으로부터 물질 분리를 수행한 결과, 상기 디클로로메탄 분획물에 베툴린 산이 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.
베툴린 산은 5 환성의 트리테르페노이드(pentacyclic triterpenoid)로서, 항종양, 항염증 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 하기의 화학식 1을 가진다.
Figure 112014116699731-pat00001
본 발명에서 "미백"이란 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 포괄하여 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 미백은 머루근 추출물 또는 분획물에 의하여 피부에서 형성되는 멜라닌의 합성을 억제하는 수단에 의하여 수행되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
멜라닌은 피부, 머리카락, 눈동자 등 생물체에 널리 분포되어 있는 색소 성분으로 인체 표피층의 멜라닌 세포(melanocyte) 내의 멜라노좀(melanosome)에서 합성되는데, 티로시나아제(tyrosinase) 효소에 의해 티로신(tyrosine)을 시발 물질로 하여 DOPA(3,4-dihydroxy-phenylalanine) 또는 DOPA 퀴논으로 변환되는 산화 및 중합 반응으로 멜라닌이 생합성 된다. 생합성된 멜라닌은 자외선과 같은 피부자극에 대해 저항력을 높여주지만, 과도한 멜라닌 합성은 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 색소 침착을 일으키기 때문에 티로시나아제 활성 측정은 피부 미백효과를 나타내는 하나의 중요한 지표로 받아들여지고 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물이 세포에 독성을 일으키지 않는 범위 내에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 티로시나아제의 발현 및 활성을 저해시킬 수 있음을 확인하였다.특히, 머루근 추출물의 디클로로메탄 분획물이α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성 및 티로시나아제의 발현을 현저하게 감소시킬 수 있는 가장 우수한 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
또한, 상기 디클로로메탄 분획물로부터 분리한 베툴린 산의 미백 활성을 분석한 결과 유의적인 멜라닌 생성 억제능을 보였으며 이는 티로시나아제를 비롯한 멜라닌 생성에 중요한 역할을 담당하는 단백질들의 발현 저해를 통해 일어남을 확인하였다. 또한 머루근 유래 베툴린 산의 미백 활성은 PI3K/Akt 및 MEK/ERK pathway를 통해 일어남을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 머루근 메탄올 추출물이 높은 항산화능과 미백활성을 보유함을 확인하였으며 그 주된 활성 물질로 베툴린 산을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 머루근 추출물, 이의 용매 분획물, 또는 이로부터 분리된 베툴린산을 포함하는 조성물은 피부에 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하는데 도움을 주는 기능을 가질 수 있으며, 피부에 멜라닌 색소가 과다 침착하는 것을 방지하여 피부 색소 침착 질환의 발생을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다.
상기 피부 색소 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증(cyanic melasma), 칼슘 길항제와 같은 약물 사용 후의 과다색소침착, 조직경화치료법(sclerotherapy)에 따른 후유증, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착, 광독성 반응 또는 다른 유사한 소형의 고정 색소성 병변 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에서 상기 머루근 추출물, 이의 용매 분획물, 또는 이로부터 분리된 베툴린산은 0.001 내지 200㎍/ml로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 100㎍/ml으로 포함될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 급성 또는 만성 보습제(예를 들면 습윤제, 밀폐제, 및 피부의 자연 보습 기전에 영향을 미치는 제제 포함), 산화 방지제, UVA 및/또는 UVB 보호 기능을 갖는 자외선 차단제, 연화제, 자극방지제, 비타민, 미량 금속, 항균제, 식물성 추출물, 향료, 및/또는 염료 및 색 성분과 같은 다른 유익한 제제 및 화합물들을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 계면활성제의 상용성 혼합물일 수 있다. 계면활성제는 또한 조성물의 pH에 따라 음이온 또는 양이온의 특성을 갖는 양성(ampholytic) 또는 양쪽성(amphoteric) 계면활성제일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 하이드로트로프(hydrotrope)를 포함할 수 있다. 하이드로트로프는 다른 화합물의 물 용해성을 증진시키는 능력을 갖는 화합물이다. 하이드로트로프의 특정 예는 나트륨 큐멘 설포네이트, 암모늄 큐멘 설포네이트, 암모늄 크실렌 설포네이트, 칼륨 톨루엔 설포네이트, 나트륨 톨루엔 설포네이트, 나트륨 크실렌 설포네이트, 톨루엔 술폰산 및 크실렌 술폰산을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 유용한 하이드로트로프는 나트륨 폴리나프탈렌 설포네이트, 나트륨 폴리스티렌 설포네이트, 나트륨 메틸 나프탈렌 설포네이트, 나트륨 캠퍼 설포네이트, 및 디나트륨 숙시네이트를 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 증점제 또는 겔화제를 포함할 수 있다. 증점제 또는 겔화제는 예를 들어 폴리머 또는 코폴리머 불포화 카르복시산 또는 불포화 에스테르, 폴리사카라이드 유도체, 검, 콜로이드성 실리케이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 그의 유도체, 폴리비닐피롤리돈 및 그의 유도체, 폴리아크릴아미드 및 그의 유도체, 폴리아크릴로니트릴, 친수성 실리카겔 또는 그의 혼합물일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 미백용 식품 조성물을 제공한다.
상기 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 미백용 식품 조성물은 피부에 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하는데 도움을 주는 기능을 가질 수 있으며, 피부에 멜라닌 색소가 과다 침착하는 것을 방지하여 피부 색소 침착 질환의 발생을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 미백용 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물 이외에도 미백 활성에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명에서 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 식품 조성물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 완화용 건강기능성 식품을 제공한다. 본 발명에서 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 5 ~ 10중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 피부 색소 침착 질환을 예방 또는 치료한다는 것은 머루근 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물을 과다 색소 침착된 피부에 적용함으로써, 피부에 멜라닌 색소가 침착되는 것을 예방하는 것에 그치지 않고 더 나아가 피부에 이미 침착된 멜라닌을 제거하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 피부 색소 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증(cyanic melasma), 칼슘 길항제와 같은 약물 사용 후의 과다색소침착, 조직경화치료법(sclerotherapy)에 따른 후유증, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착, 광독성 반응 또는 다른 유사한 소형의 고정 색소성 병변 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 미백 효과를 가진다고 알려진 약학 조성물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가하여, 약제학적 단위 투여형으로 제형화할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물에서 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물은 약학적으로 유효한 양으로 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 상기 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물은 조성물에 0.001 내지 200㎍/ml로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.001 내지 100㎍/ml으로 포함될 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하여 피부 색소 침착 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 제공한다.
상기 개체는 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체로서, 인간뿐만 아니라 피부 색소 침착 질환 및 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 적용 횟수는 처방, 필요 또는 원하는 바에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 레이저 등의 외과적 방법과 병행하여 처방될 수도 있다. 또한, 깁스, 붕대, 드레싱, 거즈 패드, 및 유사한 품목에 혼입될 수도 있다.
본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 머루근을 물, C1~C4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물을 물 또는 비극성 유기 용매를 이용하여 분획물을 얻는 단계; 및 상기 분획물을 분리, 정제하는 단계를 포함하는, 머루근으로부터 베툴린 산(betulinic acid, BA)을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 머루근 추출물 또는 분획물에서 미백 활성을 갖는 베툴린 산을 최초로 분리하였다.
구체적으로, 머루근을 물, C1~C4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 머루근을 메탄올로 추출하여 메탄올 추출물을 얻을 수 있다.
또한, 상기 단계에서 얻어진 머루근 추출물을 물 또는 비극성 유기 용매를 이용하여 분획물을 얻는 단계를 포함한다. 상기 비극성 유기 용매로는 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매일 수 있으며, 바람직하게는 디클로로메탄이다.
상기와 같이 얻어진 비극성 용매 분획물, 즉 비극성 용매 가용층에 대해 크로마토그래피를 1회 이상 순차적으로 수행함으로써 활성 성분을 분리할 수 있으며, 크로마토그래의 컬럼의 종류와 전개 용매는 다양하게 조절될 수 있다.
본 발명의 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 조성물은 피부 자극이 없고 세포 독성이 낮은 장점을 보유하면서도 멜라닌의 생성을 저해시키고, 티로시나아제 활성을 억제할 수 있으므로, 피부 미백을 위한 기능성 화장품, 피부 색소 침착 질환을 예방 또는 완화할 수 있는 건강기능성 식품 또는 피부 색소 침착 질환의 치료제로서 유용히 사용할 수 있다.
도 1은 머루근 추출물, 이의 용매 분획물, 및 이로부터 분리된 화합물의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 머루근 메탄올 추출물 및 이의 용매 분획물이 B16F10 세포의 독성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 α-MSH에 의해 유도된 세포의 멜라닌 생성에 머루근 메탄올 추출물 및 이의 용매 분획물이 미치는 영향을 나타낸 것이다(M: 메탄올 추출물, C: 디클로로메탄 분획물; E: 에틸아세테이트 분획물; B: n-부탄올 분획물; A: 양성 대조군으로서 사용한 알부틴).
도 4는 머루근의 CH2Cl2 층 분획물의 미백 활성 분석을 나타낸 것으로서, (A)는 멜라닌 함유량을,(B)는 세포의 티로시나아제 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 α-MSH에 의해 유도된 세포의 티로시나아제 활성에 머루근 메탄올 추출물 및 이의 용매 분획물이 미치는 영향을 나타낸 것이다(M: 메탄올 추출물, C: 디클로로메탄 분획물; E: 에틸아세테이트 분획물; B: n-부탄올 분획물; A: 양성 대조군으로서 사용한 알부틴).
도 6은 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 티로시나아제 단백질의 발현양에 머루근 메탄올 추출물 및 이의 용매 분획물이 미치는 영향을 나타낸 것이다(M: 메탄올 추출물, C: 디클로로메탄 분획물; E: 에틸아세테이트 분획물; B: n-부탄올 분획물; A: 양성 대조군으로서 사용한 알부틴).
도 7은 머루근 유래 분리 화합물인 베툴린 산(BA)의 미백 활성을 나타낸 것으로서, 구체적으로는 B16F10 멜라닌 세포에서 α-MSH로 유도된 멜라닌 생성에 미치는 영향 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 유래 분리 화합물 베툴린 산의 미백 활성을 나타낸 것으로서, 구체적으로는 B16F10 멜라닌 세포에서 IBMX로 유도한 멜라닌 생성에 미치는 영향 분석 결과를 나타낸 것이다. (A)는 멜라닌 함량을 나타낸 것이고, (B)는 세포의 티로시나아제 활성을 나타낸 것이고, (C)는 티로시나아제 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 베툴린 산의 미백 활성 기전을 분석한 것으로서, (A)는 멜라닌 생성반응 관련 단백질 발현을, (B)는 전사인자 CREB의 단백질 발현 및 인산화를 (C)는 상위 신호전달인자인 MEK/ERK와 PI3K/Akt의 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블롯 혼성화 반응 결과로 나타낸 것이다.
도 10은 MEK/ERK 및 PI3K/Akt 신호 전달 경로에 특이적인 억제제 처리에 의한 멜라닌 함량 및 세포의 티로시나아제 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 MEK/ERK 및 PI3K/Akt 신호 전달 경로에 특이적인 억제제 처리에 의한 멜라닌 생성 반응 관련 단백질의 발현 변화를 분석한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 머루근 추출물, 이의 용매 분획물 , 및 분리 화합물의 제조
머루근 5 kg을 측량하여 분말로 파쇄한 후 메탄올을 이용하여 추출하였다. 시료의 5배의 메탄올 용매를 가한 후 75℃에서 3회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 여과 후 감압 농축기로 농축한 후 동결건조 (FDU-2100, EYELA, Japan)하였다. 용매 분획은 감압 농축한 농축액을 물 (H2O) 층과 디클로로메탄(dichloromethane, CH2Cl2, C)층으로 분획하고, 물 층은 다시 에틸아세테이트(ethylacetate, EtOAc, E)층과 물 층으로 분리하였다. 남은 물 층은 또 다시 n-부탄올(n-butanol, n-BuOH, B)층과 물 층으로 분획하여 각각의 분획을 감압 농축하였다. 머루근의 메탄올 추출물과 이의 용매 분획물의 분획 과정은 도 1에 나타내었다.
또한, 머루근이 보유한 미백 활성의 핵심 작용 물질을 찾아내기 위해, 도 1과 같이 머루근 추출물의 CH2Cl2 층 분획물을 n-hexane : EtOAc [10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1 (v/v)] 및 MeOH 순으로 용출시켜 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 수행하여 분획물(fraction, Fr.) 1~4를 얻었다. 그 중 Fr. 3을 위와 같은 용매 순으로 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 Fr. 1~6을 얻었다. 그 중 Fr. 3으로부터 NMR을 통해 베툴린 산(betulinic acid)의 존재를 확인하고 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)으로 부터 표준품을 구입하여 표준품과 분리 화합물의 동일성을 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 통해 확인한 후, 베툴린 산이 보유한 미백 활성 유무를 분석하였다.
실시예 2: 생체 외 티로시나아제 억제 활성 측정을 통한 머루근 추출물 및 용매 분획물의 미백 효능 분석
머루근 추출물 및 이의 용매 분획물의 티로시나아제(tyrosinase) 효소 활성 억제 효과를 확인하기 위해, 머쉬룸 티로시나아제 억제 분석(mushroom tyrosinase inhibition assay) 방법을 이용하였다. 1 mM L-티로신(L-tyrosine), 50 mM 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer) (pH 6.5), 그리고 증류수를 10:10:9의 비율로 혼합한 반응 혼합액 170 ㎕에 10 ㎕의 시료와 20 ㎕의 머쉬룸 티로시나아제 수용액 (1000 units/mL)을 첨가한 반응액을 25℃에서 30분간 배양하였다. 그런 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 490 nm에서 생성된 도파크롬(dopachrome)의 양을 흡광도로 측정하였다. 양성 대조군으로는 티로시나아제 효소 활성 억제 물질로 알려진 코직 산(kojic acid)을 사용하였다. 티로시나아제 효소 활성 억제의 백분율 공식은 다음과 같았다.
티로시나아제 활성 억제 효과(%) ={1-(A-B)/C}×100
(A: 샘플 흡광도, B: 색상 대조군 흡광도, C: 대조군 흡광도)
상기 공식을 통해 계산된 머루근 메탄올 추출물 및 이의 용매 분획물의 티로시나아제 효소 활성 저해능은 하기 표 1과 같았다.
DPPH (IC50 , ㎍/mL) Tyrosinase (IC50, ㎍/mL)
머루근 메탄올 추출물 23.50 148.11
CH2Cl2 분획물 41.00 258.19
에틸아세테이트 분획물 24.99 32.15
n-부탄올 분획물 13.25 97.65
물 분획물 42.32 ND
아스코르브산 3.65 NA
코직산 NA 25.70
IC50 값이 추출물의 경우 148.11 ㎍/mL으로 나타났고 C, E, B 층은 각각 258.19, 32.15, 97.65 ㎍/mL으로 나타나 양성대조군으로 사용한 코직산 (25.70 ㎍/mL)에 비해서는 다소 높은 수치를 보였으나 비교적 높은 효소 활성 저해능을 보였다.
실시예 3: 머루근 추출물 및 이의 용매 분획물의 세포 독성 유무 분석
마우스 멜라닌세포인 B16F10을 American Type Tissue Collection (ATCC)로부터 구입하여 10% 우태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다.
머루근 추출물 및 이의 용매 분획물의 미백 활성 분석 수행 전, 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 WST 분석법을 이용하여 독성 평가 실험을 수행하였다.
머루근 메탄올 추출물 및 이의 용매 분획물이 B16F10 세포 생존율에 미치는 영향을 살펴본 결과, 도 2에 제시한 바와 같이 메탄올 추출물의 경우 100 ㎍/mL 이하에서는 심한 세포독성을 유발하지 않는 것으로 나타났다. 용매 분획물의 경우 C 층과 B 층은 100 ㎍/mL 이하에서는 세포독성을 유발하지 않았으나 E 층의 경우 50 ㎍/mL이상에서 독성을 나타내었다. 물 층은 세포독성을 유발하지 않았다. 상기 결과를 바탕으로, 이후의 실험은 세포 독성이 없는 농도에서 수행하였다.
실시예 4: 머루근 추출물 및 용매 분획물이 흑생종 세포( melanoma cell )의 멜라닌 합성에 미치는 영향
마우스 멜라닌세포인 B16F10에 200 nM의 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성반응(melanogenesis)을 유도하고, 머루근 추출물 및 이의 용매 분획물에 의한 미백 활성을 분석하였다.
구체적으로, 1×105 개의 B16F10 세포를 D100 세포 배양 디쉬에 분주한 후, 하루 동안 배양하였다. 시료 처리 후 배양 세포를 1× 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 씻어준 다음, 10% 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 포함된 1 N 수산화나트륨(NaOH)을 처리하여 80℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 그런 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 합성한 멜라닌 용액을 이용하여 스탠다드 곡선을 그린 후, 측정값을 대입하여 멜라닌 생성량을 계산하였다. 양성 대조군으로는 미백 활성 보유 물질로 잘 알려진 알부틴(arbutin)을 사용하였으며, 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.
그 결과, 도 3에 제시된 바와 같이, 추출물 및 모든 용매 분획물이 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 특히 C 층의 경우 양성대조군인 알부틴보다 높은 활성을 나타내었다. 머루근 추출물 및 분획물의 활성을 알부틴과 같은 농도로 상호 비교하였을 때, 단일 물질인 알부틴에 비해 다소 낮거나 유사함을 보여 머루근 추출물 및 분획물이 매우 높은 미백 활성을 가짐을 시사하였다.
또한, 상기 결과에서 가장 높은 미백 활성을 보인 머루근 추출물 C층 (CH2Cl2 층) 분획물의 미백 활성을 멜라닌(melanin) 생성 억제능과 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해능을 통해 분석한 결과, 50, 75, 100 μg/mL의 시료 처리에 의해 농도의존적으로 멜라닌 생성이 억제됨을 확인하였으며 이는 시료가 보유한 티로시나아제 활성 저해능에서 기인함을 확인하였다(도 4)
실시예 5: 머루근 추출물 및 용매 분획물이 흑생종 세포의 티로시나아제 활성에 미치는 영향
실시예 4에서 수행한 멜라닌 측정과 같은 방식으로, 세포에 시료를 처리한 후 배양 세포를 1× PBS로 씻어준 다음, 1% (w/v) 트리톤 X-100, 0.1 mM PMSF, 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer)이 포함된 용해 완충액(lysis buffer)을 처리하였다. 그런 다음 얼음에서 30분간 배양한 후, 원심분리하여 세포 용해물을 준비하였다. 브래드포드 방법(Bradford method)으로 단백질을 정량한 후, 96-웰 플레이트에 50 ㎍의 단백질을 분주하고 2 mg/mL의 L-DOPA를 첨가한 후, 405 nm에서 한 시간 동안 배양하면서 매 10분 간격으로 도파크롬(dopachrome)의 생성량을 측정하였다.
머루근 메탄올 추출물이 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 세포의 티로시나아제 활성에 미치는 영향은 도 5에 제시된 바와 같이, 머루근 추출물 및 모든 용매 분획물이 α-MSH에 의해 유도된 세포의 티로시나아제 활성을 유의적으로 감소시켰다. 이러한 결과는 앞선 멜라닌 함량의 결과와 일치됨을 보여 머루근에 의한 멜라닌 생성 저해능이 티로시나아제 활성 저해 유도에 의한 것임을 시사하였다.
실시예 6: 머루근 추출물과 용매 분획물이 티로시나아제 단백질의 발현에 미치는 영향
상기 살펴본 도 3 내지 5의 결과를 통해, 머루근 추출물 및 이의 용매 분획물에 의한 멜라닌 합성 저해가 티로시나아제 효소 활성 억제에서 기인할 것으로 판단됨에 따라, 머루근 추출물 및 이의 용매 분획물이 멜라닌 합성에 핵심적인 역할을 담당하는 티로시나아제 단백질의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯 혼성화 반응(Western blot hybridization)으로 분석하였다.
구체적으로, 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 단백질을 추출하여 브래드포드 분석(Bradford assay)으로 단백질 농도를 결정한 후, 50 ㎍의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 블롯팅한 대상 단백질의 항체와 혼성화시켰다. 막을 세척한 후 HRP가 태그된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 화학발광 탐지 시스템(chemiluminescence detection system)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
그 결과 도 6에 제시된 바와 같이 α-MSH에 의해 유도된 티로시나아제 단백질의 발현이 머루근 추출물 및 이의 용매 분획물의 처리에 의해 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과는 본 발명의 머루근 추출물 및 용매 분획물이 효과적으로 티로시나아제 발현을 억제하며, 결과적으로 멜라닌 합성을 저해하여 미백 효과 뿐 아니라, 멜라닌 침착에 의해 발생되는 질병을 치료할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7: 머루근으로부터 분리한 베툴린 산( betulinic acid , BA )의 미백 활성 분석
실시예 4에서 수행한 멜라닌 측정과 같은 방식으로 머루근 추출물의 CH2Cl2 층 용매 분획물로부터 분리한 화합물인 베툴린 산의 미백 활성을 분석하였다. 그 결과, 10, 50, 100 μg/mL의 시료 처리에 의해 농도의존적으로 멜라닌 생성이 억제됨을 확인하였으며 그 정도는 양성 대조군으로 사용한 알부틴(arbutin, A) 보다 더 높게 나타났다(도 7).
실시예 8: 머루근 유래 베툴린 산의 활성 기전 분석
머루근에서 분리한 화합물인 베툴린 산의 미백활성 기전 분석을 위해 IBMX로 멜라닌 생성을 유도하면서 베툴린 산에 의한 멜라닌 생성 억제능을 분석하였다. 그 결과 10, 50, 100 μg/mL의 시료 처리에 의해 농도의존적으로 멜라닌 생성이 억제됨을 확인하였으며 그 정도는 양성 대조군으로 사용한 알부틴 (A) 보다 더 높게 나타났으며 이러한 베툴린 산의 활성은 티로시나아제 단백질 발현 저해 및 세포 티로시나아제 활성(cellular tyrosinase activity) 저해능에서 기인함을 확인하였다(도 8).
베툴린 산의 미백 활성 기전을 좀더 자세히 알아보기 위해, 멜라닌 생성의 각 단계에 작용하는 효소인 티로시나아제와 TRP-1, TRP-2, 그리고 멜라닌 세포(melanocyte)에 특이적인 전사 인자로서 멜라닌 생성 효소의 발현을 조절하는 MITF, MITF의 프로모터(promoter)에 존재하는 CREB 결합 부위에 결합하여 MITF의 발현을 유도하는 CREB의 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯 혼성화 반응(Western blot hybridization)으로 분석하였다. 그 결과, 베툴린 산의 처리에 의해 모든 대상 단백질의 발현이 농도의존적으로 유의적으로 억제됨을 보였으며 이와 같은 베툴린 산에 의한 미백 활성 기작의 상위 신호 전달기전으로는 MEK/ERK 및 PI3K/Akt pathway가 작용하는 것으로 나타났다(도 9).
베툴린 산에 의한 미백 활성의 상위기작을 분석하기 위해 MEK/ERK 및 PI3K/Akt의 특이적 억제제인 PD98059와 LY294002를 각각 처리한 후 시료처리에 의한 멜라닌 생성 억제능과 세포의 티로시나아제 활성의 변화를 분석하였다. 각 신호전달기작을 막는 특이적 저해제를 처리한 결과, 시료 처리에 의한 멜라닌 생성 억제능, 티로시나아제 활성 저해능, 그리고 멜라닌 생성반응(melanogenesis) 관련 단백질의 발현저해능이 유의적으로 감소됨을 보여 베툴린 산에 의한 미백 활성이 MEK/ERK 및 PI3K/Akt 신호전달기전에 의해 조절됨을 확인할 수 있었다(도 10,11).

Claims (1)

  1. 머루근을 물, C1~C4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계;
    상기 추출물을 디클로로메탄으로 분획하여 디클로로메탄 분획물을 얻는 단계; 및
    상기 분획물을 분리, 정제하는 단계를 포함하는,
    머루근으로부터 베툴린 산(betulinic acid, BA)을 분리하는 방법.



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