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KR100643817B1 - 당화와 발효의 동시 수행을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

당화와 발효의 동시 수행을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR100643817B1
KR100643817B1 KR1020027017722A KR20027017722A KR100643817B1 KR 100643817 B1 KR100643817 B1 KR 100643817B1 KR 1020027017722 A KR1020027017722 A KR 1020027017722A KR 20027017722 A KR20027017722 A KR 20027017722A KR 100643817 B1 KR100643817 B1 KR 100643817B1
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로니 오. 인그램
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유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 상승작용적 분해를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 올리고사카라이드의 상승작용적 분해를 할 수 있는 엔도글루카나제를 코딩하는 1종 이상의 유전자를 함유하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 바람직한 숙주 세포는 에탄올을 생산하고 당화와 발효를 동시에 수행하여 복합 셀룰로스 기질로부터 에탄올을 생산할 수 있다.
Figure 112002042964056-pct00003
엔도글루카나제, 올리고사카라이드, 당화, 발효, 에탄올

Description

당화와 발효의 동시 수행을 위한 방법 및 조성물 {Methods and Compositions for Simultaneous Saccharification and Fermentation}
관련 정보
본원은 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 가출원 번호 제60/214,137호 ("Synergistic Hydrolysis of Carboxymethyl Cellulose and Acid Swollen Cellulose by Two Endoglucanases (EGZ 및 EGY)"이라는 발명의 명칭으로 2002년 6월 26일자로 출원됨) 및 미국 가특허 출원 제60/219,913호 ("Methods and Compositions for Simultaneous Saccharification and Fermentation"이라는 발명의 명칭으로 2001년 7월 21일 출원됨)를 우선권 주장한다. 이 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 참고 문헌은 그의 전문이 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
정부 지원된 연구
이 연구는 미국 농무부, 국립 연구소 (98-35504-6177; 98-35505-6197), 미국 에너지국 기초 에너지 과학부 (DE-FG02-96ER20222) 및 플로리다 대학의 플로리다 농업 실험소로부터 받은 보조금에 의해 일부 지원받았다.
석유 기재 자동차 연료를 식물성 물질로부터 얻은 재생 연료로 대체함으로써 많은 환경 및 사회적 이점을 얻을 수 있다 (Lynd et al., (1991) Science 251:1318-1323; Olson et al., (1996) Enzyme Microb. Technol. 18:1-17; Wyman et al., (1995) Amer. Chem. Soc. Symp. 618:272-290). 매년, 미국에서는 거의 수입된 석유의 전체량에 해당하는 1200억 갤론의 자동차 연료가 소비된다. 재생성 대체 연료로서의 에탄올의 개발은 미국이 수입 오일에 의존하지 않도록 하고, 환경을 개선시키고 또한 새로운 고용을 창출할 수 있다 (Sheehan, (1994) ACS Symposium Series No. 566, ACS Press, pp 1-53).
이론적으로, 자동차 연료용으로 수입된 오일의 문제점에 대한 해결책은 아주 간단한 것으로 보인다. 한정된 자원인 석유를 사용하지 않고, 식물성 물질을 발효시켜 재생가능한 자원인 에탄올을 효율적으로 생산할 수 있다. 사실상, 브라질은 에탄올의 생산 가능성과 20년 초과 동안 주요 자동차 연료로서의 에탄올의 사용을 입증하였다. 마찬가지로, 미국은 매년 12억 갤론 초과의 연료 에탄올을 생산한다. 현재, 연료 에탄올은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)(제트. 모빌리스)를 이용하여 옥수수 전분 또는 사탕수수 시럽으로부터 생산한다. 그러나, 이들 당 공급원 중 어느 것도 석유 기재 자동차 연료의 대체를 실현하는 데 필요한 용량을 공급할 수 없다. 또한, 사탕수수 당 및 옥수수 전분 둘 다는 식품으로서 경쟁적으로 사용되는 비교적 고가의 출발 물질이다.
또한, 이들 당 기질은 식물 내의 전체 탄수화물의 일부 만을 나타낸다. 사실상, 식물 내의 탄수화물의 대부분은 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 펙틴 및 리그닌을 함유하는 복합 구조 중합체인 리그노셀룰로스 형태이다. 리그노셀룰로스는 예를 들면 식물의 줄기, 잎, 껍질, 겉껍질 및 속에서 발견된다. 이들 중합체의 가수분해는 글루코스, 크실로스, 만노스, 갈락토스 및 아라비노스를 비롯한 중성 당의 혼합물을 방출시킨다. 알려지지 않은 천연 유기체는 이들 모든 당을 에탄올로 신속하고 효율적으로 대사시킬 수 있다.
그럼에도 불구하고, 이러한 기질 공급원을 개발하려는 노력으로 걸프 오일 캄파니 (Golf Oil Company)는 효모 기재 공정으로 불리우는 당화와 발효의 동시 수행 (SSF)을 이용하여 셀룰로스로부터 에탄올을 생산하는 방법을 개발하였다 (Gauss et al. (1976) U.S.P.N. 3,990,944호). 진균 셀룰라제 제제 및 효모는 단일 용기의 셀룰로스 기질의 슬러리에 첨가하였다. 에탄올은 셀룰로스 가수분해 중에 동시에 생산하였다. 그러나, 걸프의 SSF 방법은 몇가지 결점을 갖고 있다. 예를 들면, 진균 셀룰라제는 현재까지 대규모 바이오에탄올 공정에 사용하기에는 너무 비용이 많이 드는 것으로 생각되고 있다 (Himmel et al., (1997) Amer. Chem. Soc. pp. 2-45; Ingram et al., (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53:2420-2425; Okamoto et al., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:563-568; Philippidis, G., (1994) Amer. Chem. Soc. pp. 188-217; Saito et al., (1990) J. Ferment. Bioeng. 69:282-286; Sheehan, J., (1994) Amer. Chem. Soc. pp 1-52; Su et al., (1993) Biotechnol. Lett. 15:979-984).
발명의 요약
셀룰로스를 가수분해하는 경제적인 효소적 방법의 개발은 기질 사용의 효능 및 당화와 발효 방법의 경제성을 개선시킬 수 있는 높은 잠재력을 갖는다. 따라서, 복합 당의 효율적인 해중합 후 상기 당의 에탄올로의 신속한 발효에 사용될 수 있는 효소, 바람직하게는 상기 효소를 분비하는 생촉매를 개발하는 것이 매우 이로울 것이다.
에르위니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi)와 같은 일부 미생물은 복합 당을 함유하는 식물 조직의 분해에 매우 효과적인 다수의 히드롤라제 및 리아제 효소를 생산한다. 구체적으로, 이 유기체는 복합 당을 분해하기에 매우 효과적인 효소 조성물로서 구체적인 양으로 사용될 때 작용하는 것으로 밝혀진 2 종의 상이한 엔도글루카나제 활성 (EGY와 EGZ를 비교함)을 나타낸다. 이 효소들은 엔도글루카나제 활성의 원하는 조합을 갖는 조질의 추출물로서 사용될 수 있거나, 바람직하게는 정제된 조성물로서 사용될 수 있다.
더욱이, 생촉매, 바람직하게는 재조합 박테리아, 보다 바람직하게는 에탄올을 생산하는 박테리아를 개조하여 복합 당을 분해하기에 충분한 특정 양으로 1종 이상의 이들 효소 활성을 발현하도록 할 수 있다. 이러한 생촉매는 당화와 발효의 동시 수행 (SSF)으로서 알려진 방법에 의해 복합 당을 충분히 분해한 후 알코올로 발효하기에 적합하다. 상기 엔도글루카나제 조성물 또는 생촉매의 장점은 복합 당의 분해를 위한 추가 진균 셀룰라제의 필요성이 감소되거나 없어진다는 점이다.
본 발명은 복합 당의 분해를 수행하기 위한 엔도글루카나제 활성, 보다 바람직하게는 복합 당의 최적 분해를 위한 특정 비율의 엔도글루카나제 활성의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은 복합 당을 분해하기에 적합한 엔도글루카나제 활성의 최적 발현 및 분비가 달성되도록 개조된 재조합 숙주 세포를 제공한다. 구체적인 예에는 최적 발현을 위한 대리 프로모터의 전사 조절 하에 엔도글루카나제를 발현하는 장내세균, 에세리키아 (Escherichia) 및 클레브시엘라 (Klebsiella)가 포함된다. 또한, 상기 예에는 특정 비로의 최적 발현을 위한 대리 프로모터의 전사 조절 하에 두 가지 상이한 엔도글루카나제 celY 및 celZ를 발현하는 재조합 장내세균도 포함된다.
본 발명은 세포로부터의 엔도글루카나제의 생산 증가 및(또는) 분비를 가능하게 하는 분비 단백질(들)을 포함하도록 하는, 이들 숙주의 추가 변형을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 지모모나스 모빌리스와 같은 효율적인 에탄올 생산자로부터 유래되는 외재 에탄올생산성 유전자를 포함하도록 하는, 이들 숙주의 추가 변형을 제공한다.
따라서, 이들 숙주는 복합 당으로부터의 에탄올의 효율적인 생산을 위해 단독으로 또는 다른 효소 또는 재조합 숙주와 함께 사용될 수 있는 단백질을 고도로 발현시킬 수 있다.
더욱 상세하게는, 제1 측면에서 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제 및 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제를 함유하는 올리고사카라이드의 분해를 위한 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 제1 및 제2 분해 활성은 상기 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해가 상승작용되도록 하는 비율로 존재한다.
제2 측면에서, 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제 및 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제를 올리고사카라이드와 접촉시키는 것을 포함하는, 올리고사카라이드의 분해 방법을 제공하는데, 여기서 상기 제1 및 제2 분해 활성은 상기 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해가 상승작용되도록 하는 비율로 존재한다.
상기 측면들의 한 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제 및 제2 엔도글루카나제와 올리고사카라이드의 접촉은 임의의 순서로 또는 동시에 수행된다.
상기 측면들의 한 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제, 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다는 세포 추출물로부터 유래된다. 세포 추출물은 박테리아 세포, 예를 들어, 제1 엔도글루카나제, 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다를 발현하도록 재조합적으로 개조된 박테리아 세포로부터 유래된다. 관련 실시양태에서, 박테리아 세포는 장내세균과로부터 선택되고, 바람직하게는 에세리키아 또는 클레브시엘라이고, 보다 바람직하게는 celZ에 의해 코딩되는 제1 엔도글루카나제 및 celY에 의해 코딩되는 제2 엔도글루카나제를 함유하고, 상기 celZ 및 celY는 에르위니아 (Erwinia)로부터 유래된다.
상기 측면들의 또다른 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제는 EGZ이고, 제2 엔도글루카나제는 EGY이고, 이들 두 엔도글루카나제의 비는 바람직하게는 약 1:1, 보다 바람직하게는 약 9:1 내지 약 19:1이다.
상기 측면들의 다른 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제, 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다가 정제된다.
상기 측면들의 또다른 실시양태에서, 올리고사카라이드의 분해는 약 1.1 내지 약 2.0, 바람직하게는 약 1.8의 계수만큼 상승작용된다.
상기 측면들의 또다른 실시양태에서, 조성물은 추가 효소, 예를 들어, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-크실라나제, α-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 그의 배합물을 함유한다.
상기 측면들의 관련 실시양태에서, 추가 효소는 진균, 바람직하게는 티. 롱기브랜치아툼 (T. longibranchiatum)으로부터 유래된 글루카나제이다.
상기 측면들의 또다른 관련 실시양태에서, 추가 효소는 에탄올생산성 효소, 바람직하게는, 피루베이트 데카르복실라제 또는 알코올 데히드로게나제와 같은 에탄올생산성 효소이다.
상기 측면들의 또다른 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제 및 제2 엔도글루카나제는 따로 포장되어 있다.
상기 측면들의 또다른 실시양태에서, 조성물은 당화와 발효를 동시에 수행하는 데 사용된다.
상기 측면들의 다른 실시양태에서, 올리고사카라이드는 셀로올리고사카라이드, 리그노셀룰로스, 헤미셀룰로스, 셀룰로스, 펙틴 또는 그들의 임의의 배합물이다.
상기 측면들의 또다른 실시양태에서, 조성물 또는 방법은 수용액 중에서 사용하거나 수행한다.
제3 측면에서, 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제를 코딩하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편; 및 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제를 코딩하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는, 올리고사카라이드의 분해에 적합한 재조합 숙주 세포를 제공하는데, 여기서, 상기 제1 엔도글루카나제 및 제2 엔도글루카나제는 상기 제1 및 제2 분해 활성이 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해가 상승작용되도록 하는 비율로 존재하도록 발현된다.
한 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제, 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다가 분비된다. 관련 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제, 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다는 세포 추출물로부터 유래된다. 세포 추출물은 박테리아 세포, 예컨대, 제1 엔도글루카나제, 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다를 발현하도록 재조합 개조된 박테리아 세포로부터 유래된다. 관련 실시양태에서, 박테리아 세포는 장내세균과로부터 선택되고, 바람직하게는 에세리키아 또는 클레브시엘라이고, 보다 바람직하게는 이. 콜라이 (E. coli) B, 이. 콜라이 DH5α, 또는 클레브시엘라 옥시토카이다.
상기 측면들의 또다른 실시양태에서, 조성물은 추가 효소, 예를 들어, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β- 크실라나제, α-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 그의 배합물을 함유한다.
한 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제는 celZ에 의해 코딩되고, 제2 엔도글루카나제는 celY에 의해 코딩되며, celZ 및 celY는 에르위니아로부터 유래된다.
상기 측면들의 관련 실시양태에서, 추가 효소는 진균, 바람직하게는 티. 롱기브랜치아툼으로부터 유래된 글루카나제이다.
또다른 관련 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제는 EGZ이고, 제2 엔도글루카나제는 EGY이다.
또다른 실시양태에서, 추가 효소는 분비 효소, 바람직하게는 pul 또는 out 유전자 생성물이다.
상기 측면들의 또다른 관련 실시양태에서, 숙주 세포는 에탄올생산성 세포, 예를 들어, 이. 콜라이 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜라이 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜라이 KO12 (ATCC 55125), 이. 콜라이 LY01 (ATCC 11303), 케이. 옥시토카 M5A1 및 케이. 옥시토카 P2 (ATCC 55307)이다.
추가 측면에서, 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제를 코딩하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편; 및 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제를 코딩하는 서열을 포함하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 숙주 세 포를 올리고사카라이드와 접촉시켜 올리고사카라이드의 분해를 상승시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 제1 및 제2 분해 활성이 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해를 상승시키는 비율로 존재하도록 상기 제1 엔도글루카나제 및 제2 엔도글루카나제를 발현하는 것도 제공한다.
상기 측면들의 한 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제, 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다가 분비된다.
또다른 실시양태에서, 상기 방법의 숙주 세포는 에탄올생산성 세포이다.
또다른 실시양태에서, 상기 방법은 수용액 중에서 수행한다.
또다른 실시양태에서, 상기 방법은 당화와 발효를 동시에 수행하는 데 사용된다.
또다른 실시양태에서, 상기 방법은 셀로올리고사카라이드, 리그노셀룰로스, 헤미셀룰로스, 셀룰로스, 펙틴 및 그들의 임의의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고사카라이드의 분해를 포함한다.
제5 측면에서, 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제를 코딩하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편; 및 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제를 코딩하는 서열을 포함하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 숙주 세포에 도입하여 올리고사카라이드의 분해에 적합한 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 제1 및 제2 분해 활성이 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해를 상승시키는 비율로 존재하도록 상기 제1 엔도글루카 나제 및 제2 엔도글루카나제를 발현하는 것도 제공한다.
상기 측면들의 한 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제, 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다가 분비된다.
또다른 실시양태에서, 상기 방법의 숙주 세포는 에탄올생산성 세포이다.
또다른 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제는 celZ에 의해 코딩되고, 제2 엔도글루카나제는 celY에 의해 코딩되며, celZ 및 celY는 에르위니아로부터 유래된다.
또다른 실시양태에서, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편, 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편 또는 이들 둘 다의 대리 프로모터가 지모모나스 모빌리스로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 재조합 숙주세포는 당화와 발효를 동시에 수행하는 데 적합하고, 바람직하게는 에탄올생산성 세포이다.
제6 측면에서, 본 발명은 pLOI2352 (서열 17)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하고, 상기 벡터가 적합하게 삽입되어 있는 숙주 세포를 확인함으로써, 상기 벡터가 삽입된 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 pLOI2306 (서열 12)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하고, 엔도글루카나제를 발현하는 숙주 세포를 확인함으로써, 숙주 세포에서 엔도글루카나제를 발현시키는 방법을 제공한다.
제8측면에서, 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제를 코딩하 며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편; 및 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제를 코딩하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 에탄올생산성 숙주 세포와 올리고사카라이드 공급원을 접촉시킴으로써 올리고사카라이드 공급원으로부터 에탄올을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 제1 및 제2 분해 활성이 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해를 상승시켜 에탄올로 발효되는 분해된 올리고사카라이드를 생성하는 비율로 존재하도록 상기 제1 엔도글루카나제 및 제2 엔도글루카나제를 발현하는 것도 제공한다.
한 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제는 celZ에 의해 코딩되고, 제2 엔도글루카나제는 celY에 의해 코딩되며, celZ 및 celY는 에르위니아로부터 유래된다.
또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 하나 이상의 pul 유전자 또는 out 유전자를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 단편도 함유한다.
또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 장내세균과로부터 선택되고, 바람직하게는 에세리키아 또는 클레브시엘라이고, 보다 바람직하게는 이. 콜라이 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜라이 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜라이 KO12 (ATCC 55125), 이. 콜라이 LY01 (ATCC 11303), 케이. 옥시토카 M5A1 또는 케이. 옥시토카 P2 (ATCC 55307)이다.
또다른 실시양태에서, 상기 방법은 수용액 중에서 수행한다.
또다른 실시양태에서. 올리고사카라이드는 셀로올리고사카라이드, 리그노셀룰로스, 헤미셀룰로스, 셀룰로스, 펙틴 및 그들의 임의의 배합물로 구성되는 군으 로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 이종 폴리뉴클레오티드 단편은 pLOI2352 (서열 17)이거나, pLOI2352 (서열 17)로부터 유래된다.
또다른 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제는 EGZ이고, 제2 엔도글루카나제는 EGY이다.
또다른 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 단편, 제2 폴리뉴클레오티드 단편 또는 이들 둘 다의 대리 프로모터는 지모모나스 모빌리스로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다.
제9 측면에서, 본 발명은 pLOI2311, pLOI1620, pLOI2316, pLOI2317, pLOI2318, pLOI2319, pLOI2320, pLOI2323, pLOI2342, pLOI2348, pLOI2349, pLOI2350, pLOI2352, pLOI2353, pLOI2354, pLOI2355, pLOI2356, pLOI2357, pLOI2358 또는 pLOI2359의 플라스미드 또는 그의 단편의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
제10 측면에서, 본 발명은 pLOI2311, pLOI1620, pLOI2316, pLOI2317, pLOI2318, pLOI2319, pLOI2320, pLOI2323, pLOI2342, pLOI2348, pLOI2349, pLOI2350, pLOI2352, pLOI2353, pLOI2354, pLOI2355, pLOI2356, pLOI2357, pLOI2358 또는 pLOI2359의 플라스미드 또는 그의 단편의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 숙주는 클레브시엘라 옥시토카 균주 P2 (pCPP2006), 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ6 (pCPP2006), 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ21 (pCPP2006) 또는 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ22 (pCPP2006)이다.
제11 측면에서, 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제를 얻고, 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제 활성을 얻고, 올리고사카라이드와 제1 및 제2 엔도글루카나제를 접촉시킴으로써 올리고사카라이드를 분해하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 제1 및 제2 분해 활성은 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해를 상승시키는 비율로 존재한다.
제12 측면에서, 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제 및 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제를 올리고사카라이드와 접촉시킴으로써 올리고사카라이드의 분해를 상승시키는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 제1 및 제2 분해 활성은 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해를 상승시키는 비율로 존재한다.
관련 측면에서, 본 발명은 제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제 및 제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제를 올리고사카라이드와 접촉시킴으로써 올리고사카라이드를 분해하고(하거나) 올리고사카라이드의 분해를 상승시키는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 제1 및 제2 분해 활성은 제1 및 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드의 분해가 점성을 변화시키는, 바람직하게는 예를 들어, 적어도 5 센티포아즈, 10 센티포아즈, 20 센티포아즈, 50 센티포아즈, 100 센티포아즈, 500 센티포아즈, 1000 센티포아즈, 또는 그 이상 만큼 또는 그의 범위 내에서 점성을 감소시키는 비율로 존재한다.
바람직한 실시양태에서, 올리고사카라이드는 셀룰로스, 예를 들어, 비결정질 셀룰로스 또는 결정질 셀룰로스이고, 예를 들어 종이, 펄프 또는 식물 섬유와 같은 공급원으로부터 유래될 수 있다.
제13 측면에서, 본 발명은 제1 엔도글루카나제를 코딩하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편, 및 제2 엔도글루카나제를 코딩하는 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는, 올리고사카라이드의 분해에 적합한 재조합 숙주 세포를 제공한다.
관련 실시양태에서, 숙주 세포는 제1 엔도글루카나제를 코딩하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편 및 제2 엔도글루카나제를 코딩하는 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하기 때문에 올리고사카라이드의 점성을 감소시키기에 적합하다.
한 실시양태에서, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편은 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있고, 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편도 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있다.
또다른 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 바람직하게는 장내세균과로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 에세리키아 또는 클레브시엘라 속으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 제1 엔도글루카나제는 celZ에 의해 코딩되고, 제2 엔도글루카나제는 celY에 의해 코딩되며, celZ 및 celY는 에르위니아로부터 유래된다.
또다른 실시양태에서, 제2 엔도글루카나제는 EGZ이고, 제2 엔도글루카나제는 EGY이다.
제14 측면에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA3468로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 클레브시엘라 옥시토카 균주 P2 (pCPP2006)인 재조합 숙주 균주를 제공한다.
제15 측면에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA3464로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ6 (pCPP2006)인 재조합 숙주 균주를 제공한다.
제16 측면에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA3465로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ21 (pCPP2006)인 재조합 숙주 균주를 제공한다.
제17 측면에서, 본 발명은 기탁 번호 ATCC PTA3467로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ22 (pCPP2006)인 재조합 숙주 균주를 제공한다.
제18 측면에서, 본 발명은 제1 엔도글루카나제를 코딩하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편 및 제2 엔도글루카나제를 코딩하는 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는데, 여기서 제1 엔도글루카나제를 코딩하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 단편, 제2 엔도글루카나제를 코딩하는 제2 이종 폴리뉴클레오티드 단편 또는 이들 둘 다는 폴리사카라이드를 분해할 수 있는 기능적 활성을 공유할 만큼 에르위니아로부터 유래된 celZ 유전자 생성물 또는 celY의 유전자 생성물과의 아미노산 정렬에 있어서 충분한 상동성이 있다.
제19 측면에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포로부터 유래된 추출물 또는 조성물, 예를 들어, 올리고사카라이드와 접촉했을 때 올리고사카라이드를 분해하고(하거나) 올리고사카라이드의 점성을 감소시키는 데 적합한 분비된 폴리펩티드; 세포용해물 또는 브로쓰; 또는 정제된, 반정제된 또는 정제되지 않은 효소 추출물 또는 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.
도 1은 희석산으로 미리 처리되고 2가지의 다른 매질로 보충된 쌀겨 기질을 이용한 에탄올생산성 재조합 숙주 이. 콜라이 KO11에 대한 발효 속도를 나타낸다.
도 2는 혼합된 사무실 폐지를 이용한 에탄올생산성 재조합 숙주 균주 케이. 옥시토카 P2에 대한 당화와 발효의 동시 수행 (SSF) 속도를 나타낸다. SSF로부터의 불용성 잔류물은 후속 발효 과정 중에 결합된 셀룰라제 효소 및 기질의 공급원으로서 재사용된다.
도 3은 선별을 위한 카나마이신 내성 유전자 (kan), 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 감온성 pSC101 복제기점 (Rep(ts)), 및 포스포-베타-글루카나제 (EGZ)를 코딩하는, 프로모터가 없는 폴리사카라제 유전자 celZ의 배향을 나타내는 저카피 프로모터 프로브 벡터인 플라스미드 pLOI2171의 구조를 나타낸다.
도 4는 형질전환된 박테리아 콜로니에 대해 측정된 CMC 지표 플레이트 상의 투명 대역의 크기 (x-축)와 발현된 글루카나제 활성의 양 (y-축) 사이의 높은 상관 관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 대리 프로모터로서 작용하는 pLOI2183 플라스미드 내의 제트. 모빌리스 DNA 단편의 부분 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1)을 나타낸다. 그 완전 서열은 진뱅크 수탁 번호 AF109242 (서열 번호 2)를 부여받았다. 두 전사 개시 부위 (#), -35 및 -10 영역, 샤인-델가르노 부위 (굵은 글씨), 부분 벡터 및 celZ 서열 (소문자) 및 celZ 개시 코돈 (굵게 나타낸 atg)이 표시되어 있다.
도 6은 외부 세포벽과 내부 막 (im) 사이에 위치된 주변 세포질 포합체 (pib) 형태의 글루카나제를 거의 발현시키지 않는 (pUC19; 패널 A), 적당히 발현시키는 (pLOI2164; 패널 B) 및 고도로 발현시키는 (pLOI2307; 패널 C) 상이한 플라스미드를 포함하는 이. 콜라이 DHα세포의 전자 현미경사진을 나타낸다.
도 7은 재조합 숙주의 게놈으로 도입될 수 있고 숙주에 안정한 글루카나제 발현 활성을 부여할 수 있는 유전자 제작물인 celZ 삽입 벡터 pLOI2306을 제작하는 데 사용되는 클로닝 방법의 개략도를 나타낸다.
도 8은 제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터, 이. 크리산테미로부터의 celZ 유전자, 내성 마커 (bla 및 tet) 및 케이. 옥시토카 표적 서열의 위치가 표시된 celZ 삽입 벡터 pLOI2306 (서열 번호 12)의 개략도를 나타낸다.
도 9는 EGY 및 EGZ의 상승작용을 보여주는 그래프이다. 두 효소는 가로안에 기재된 계산된 상승작용을 갖는 동일한 CMCase 활성 (1.5 IU/ml)만큼 희석되었다. 패널 A는 상승작용에 대한 효소 비율의 효과를 나타내는 그래프이다. 상이한 양의 EGY와 EGZ를 배합하여 개별 효소의 기여도를 기준으로 일정한 예측 활성 (0.15 IU/ml)을 유지하였다. 분석물은 35℃에서 1시간 동안 CMC와 인큐베이션하고 끓임 으로써 분석을 종결하였다. X 축 상의 숫자는 EGZ와 EGY의 비율을 나타낸다. 상승작용은 각 막대 위에 기재되어 있다. 패널 B는 EGZ 및 EGY가 단독으로 있을 때, 그리고 함께 (9부의 EGZ + 1부의 EGY) 있을 때 EGZ 및 EGY에 의한 CMC의 가수분해를 나타내는 그래프이다. 모든 분석물은 개별 EGZ 활성과 EGY 활성의 합을 기준으로 동일한 총 활성 (0.15 IU/ml)을 나타내었다. 두 효소의 배합에 대한 상승작용은 각 점 위에 기재되어 있다. 패널 C는 EGZ 및 EGY가 단독으로 있을 때, 그리고 함께 있을 때 EGZ 및 EGY에 의한 산-팽윤 셀룰로스의 가수분해를 나타내는 그래프이다. 9:1의 EGZ 대 EGY의 비를 배합된 효소 반응에 사용하였다. 모든 분석물은 개별 EGZ 활성과 EGY 활성의 합을 기준으로 동일한 총 활성 (0.15 IU/ml)을 나타내었다. 두 효소의 배합에 대한 상승작용은 각 점 위에 기재되어 있다.
도 10은 2종의 복합 당, 즉 산-팽윤 셀룰로스 및 Avicel (등록상표)로부터의 가수분해 생성물에 대한 박막 크로마토그래피 분석을 나타낸다. 대략 1.5 IU 및 25 IU의 CMCase를 산-팽윤 셀룰로스 및 Avicel (등록상표) 각각과 반응시키는 데 사용하였다. Y 축에 대한 약어: G1, 글루코스; G2, 셀로비오스; G3, 셀로트리오스; G4, 셀로테트라오스; G5, 셀로펜타오스. 레인: S, 혼합 셀로올리고사카라이드 표준물; C, 대조구 결핍 효소; Z, EGZ; Y, EGY, 및 Z + Y; EGZ + EGY. 패널 A는 CMCase (1 ㎕ 로딩)와 6 시간 인큐베이션 후 산-팽윤 셀룰로스를 사용한 경우의 결과를 나타낸다. 패널 B는 CMCase (2 ㎕ 로딩)와 6 시간 인큐베이션 후 산-팽윤 셀룰로스를 사용한 경우의 결과를 나타낸다. 패널 C는 CMCase (10 ㎕ 로딩)와 48 시간 인큐베이션 후 Avicel (등록상표)를 사용한 경우의 결과를 나타낸다.
도 11은 EGZ 및 EGY에 의한 셀로올리고사카라이드의 가수분해를 나타내는 TLC 분석을 나타낸다. 각 시험물은 ml 당 대략 0.07 IU의 CMCase (2 시간 인큐베이션, 35℃)를 함유하였다. 약어: S, 혼합된 셀로올리고사카라이드 표준물; G1, 글루코스; G2, 셀로비오스; G3, 셀로트리오스; G4, 셀로테트라오스; G5, 셀로펜타오스. 패널 A는 가수분해 전 기질을 나타내고, 패널 B는 EGY와 인큐베이션한 후 기질을 나타내고, 패널 C는 EGZ와 인큐베이션한 후 기질을 나타내고, 패널 D는 다양한 시간 동안 인큐베이션한 후 (0, 5, 10 및 25) 셀로펜타오스의 EGZ 가수분해를 나타낸다.
도 12는 에르위니아 크리산테미에 의한 비결정질 셀룰로스의 사용을 나타내는 모델이다. 3종의 글루코시다제를 비결정질 셀룰로스의 이화작용에 사용하였다. 이들 중 두 가지 즉, EGY 및 EGZ는 상승작용적 방식으로 함께 작용하는 세포외 엔도글루카나제이다. EGY는 큰 기질 분자를 필요로 하고 이들을 보다 작은 불용성 단편으로 가수분해한다. EGY는 가용성 셀로올리고사카라이드 (2 내지 5개의 글루코실 잔기)를 가수분해하지 않는다. EGZ는 가용성 셀로올리고사카라이드 (셀로펜타오스 및 셀로테트라오스) 및 중간 길이의 비결정질 단편을 용이하게 가수분해하여 셀로비오스 및 셀로트리오스를 생성한다. 셀로비오스 및 셀로트리오스는 포스포에놀피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템에 의한 세포성 섭취 동안 인산화된다. 가수분해는 제3의 효소, 즉 포스포-β-글루코시다제에 의해 세포내에서 완결된다. 생성되는 단량체 생성물 (글루코스 및 글루코스-6-포스페이트)는 해당작용에 의해 대사된다.
도 13은 celY에 대한 프로모터-프로브 벡터의 제작을 도식적으로 나타낸다. 지모모나스 모빌리스의 Sau3AI 단편을 pLOI2317의 BamHI 부위에 라이게이션시켜 celY 코딩 영역 (짙은 구획)에 대한 강한 대리 프로모터를 제공하였다. 지모모나스 모빌리스 DNA 단편 (프로모터 1 및 프로모터 2)은 비어있는 구획으로서 표시되어 있다. 복제기점 및 항생제 내성 유전자는 줄무늬로 나타내었고, 다른 벡터 DNA는 얇은 연결 선으로 나타내었다. 단편 상의 화살표는 전사의 방향을 나타낸다.
도 14는 DH5α(pLOI2323) 내의, celY 프로모터에 대한 전사 개시 부위 및 잠정적 프로모터 영역을 나타낸다.
도 15는 celY 및 celZ를 에탄올생산성 클레브시엘라 옥시토카 P2의 염색체 내로 기능적으로 삽입하기 위한 pLOI2352의 제작을 도식적으로 보여준다. celY 및 celZ에 대한 코딩 영역은 짙은 단편으로서 나타내었다. 프로모터 (프로모터 1 및 프로모터 2)로서 작용하는 지모모나스 모빌리스 DNA의 단편은 비어있는 구획으로서 나타내었다. 복제기점 및 항생제 내성 유전자는 줄무늬로 나타내었고, 다른 벡터 DNA는 얇은 연결 선으로 나타내었다. 단편 상의 화살표는 전사의 방향을 나타낸다. 비어있는 작은 화살표는 flp 리컴비나제에 의해 인식되는 FRT 부위를 나타낸다. FRT 서열은 비대칭이고, 염색체 삽입 후 플라스미드 DNA (복제기점 및 선별 마커)의 결실을 허용하도록 정렬된다.
도 16은 이중 상동 재조합에 의한 celZ의 불활성화를 위한 pLOI2357의 제작을 도식적으로 나타낸다. celY에 대한 코딩 영역은 짙은 구획으로서 나타내었다. 프로모터 (프로모터 1)로서 작용하는 지모모나스 모빌리스 DNA의 단편은 비어있는 구획으로서 나타내었다. 복제기점 및 항생제 내성 유전자는 줄무늬로 나타내었고, 다른 벡터 DNA는 얇은 연결 선으로 나타내었다. 단편 상의 화살표는 전사의 방향을 나타낸다. 비어있는 작은 화살표는 flp 리컴비나제에 의해 인식되는 FRT 부위를 나타낸다.
도 17은 셀로비오사이드의 사용을 보여주는 발효 브로쓰의 박층 크로마토그램의 디지탈 상을 나타낸다. 좌측 패널 (A)은 에르위니아 크리산테미 엔도글루카나제가 없는 모균주인 균주 P2 (pCPP2006)을 나타내는 반면, 우측 패널 (B)은 고도의 CelY 및 CelZ 엔도글루카나제를 분비하는 재조합 균주인 균주 SZ21 (pCPP2006)을 나타낸다. 대략 4 ㎕의 브로쓰를 각 레인에 점찍었고, 표지 G1 내지 G6는 인접한 점들에서 글루코실 잔기의 수를 말한다. 패널 (A 및 B) 둘 다에 대한 레인은 좌측부터 우측까지이고, 1은 발효 초기 (0시간)이고, 2는 발효 10시간 후이고, 3은 발효 36시간 후이다.
도 18은 클레브시엘라 옥시토카 M5A1의 에탄올생산성 유도체에 의한 비결정질 셀룰로스로부터의 에탄올 생산량을 나타내는 그래프이다. 상부 패널 및 중간 패널 (A 및 B)에 나타낸 결과는 3회의 반복 실험 결과로부터의 표준 편차를 포함하고, 바닥 패널 (C)에 기재된 결과는 단일 발효를 나타낸다. 상부 패널 (A)은 6.85 g/L의 비결정질 셀룰로스의 발효 결과를 나타내고, 중간 패널 (B)는 15.33 g/L의 비결정질 셀룰로스의 발효 결과를 나타내고, 바닥 패널 (C)는 28.96 g/L의 비결정질 셀룰로스의 발효 결과를 나타낸다. 균주 P2 (pCPP2006)는 에르위니아 크리산테미 엔도글루카나제 유전자가 없는 모균주이다. 균주 SZ6 (pCPP2006)는 CelZ 엔도 글루카나제를 분비하고, 균주 SZ21 (pCPP2006)는 CelY 및 CelZ 엔도글루카나제를 분비하고, 균주 SZ22 (pCPP2006)는 CelY 엔도글루카나제를 분비한다.
본 발명의 전체 범위를 명확하게 이해시키기 위하여, 하기 정의를 제공한다.
I. 정의
본 명세서에 사용된 용어 "재조합 숙주"는 유전자 조작에 적합한, 예를 들면 형질감염될 수 있는, 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 세포를 포함한다. 세포는 미생물이거나 또는 고등 진핵 세포일 수 있다. 상기 용어는 최초 형질감염된 세포의 자손세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 예를 들면 그람-음성 박테리아 세포이며, 이 용어는 에세리키아, 쉬겔라, 시트로박터, 살모넬라, 클레브시엘라, 엔테로박터, 에르위니아, 클루이베라, 세라티아, 세데세아, 모르가넬라, 하프니아, 에드와르드시엘라, 프로비덴시아, 프로테우스 및 예르시니아와 같은 장내세균과의 모든 통성 혐기성 그람-음성 세포를 포함한다. 특히 바람직한 재조합 숙주는 에세리키아 콜라이 또는 클레브시엘라 옥시토카 세포이다.
용어 "비율"은 예정된 배합물 중에서 두 효소의 양 (예컨대, 활성 또는 몰로서 측정됨) 사이의 관계를 포함하는 것이고, 바람직하게는 비율은 천연 발생 비율이 아니고, 보다 바람직하게는 상승작용적 효소 활성을 나타낸다.
용어 "제1 분해 활성을 갖는 제1 엔도글루카나제" 및 "제2 분해 활성을 갖는 제2 엔도글루카나제"는 유래의 출처 (예를 들어, 엔도글루카나제를 발현하는 클론 을 발현하는 천연 발생 균주 또는 유전 변형 균주를 비롯한 숙주 세포 균주), 또는 당업계의 인식 기술을 사용한 생화학적 성질 (예를 들어, 분자량 측정 또는 정제 특성)에 의해 제2의 활성을 갖는 또다른 엔도글루카나제 (예를 들어, 제2의 엔도글루카나제)와 기능적으로 구별될 수 있는 활성을 갖는 엔도글루카나제를 각각 포함하는 것이다. 분해 활성, 예를 들어, 올리고사카라이드의 효소적 가수분해는 올리고사카라이드의 점성 변화를 포함할 수도 있다.
용어 "상승작용", "상승작용적 활성" 및 "상승작용된"은 구별될 수 있는 폴리펩티드들 또는 폴리펩티드 활성 사이의 상호작용을 말하는 것으로, 여기서 폴리펩티드들이 함께 나타내는 총 활성의 효과는 개별 활성의 효과의 합보다 더 높다. 폴리펩티드는 예를 들어, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-크실라나제, α-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 그의 배합물일 수 있다. 폴리펩티드의 활성은 올리고사카라이드의 분해 (예컨대, 가수분해)를 포함하나, 올리고사카라이드의 점성 변화도 포함할 수 있다. 올리고사카라이드의 상승작용적 분해는 바람직하게는 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 또는 1.9, 보다 바람직하게는 약 2.0의 계수 만큼 상승되고, 통상적으로는 1.8의 계수 만큼 상승된다.
용어 "이종 폴리뉴클레오티드 단편"은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 폴리펩 티드의 일부 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 이종 폴리뉴클레오티드 단편은 임의의 공급원, 예를 들면 진핵생물, 원핵생물, 바이러스 또는 합성 폴리뉴클레오티드 단편으로부터 유래될 수 있다.
용어 "폴리사카라제", "셀룰라제" 또는 "글루카나제"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 임의의 결합된 당 잔기, 예를 들면 디사카라이드, 트리사카라이드, 올리고사카라이드, 예를 들면 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 펙틴을 포함하는 복합 당, 예컨대, 셀로올리고사카라이드 및 리그노셀룰로스의 분해 또는 해중합을 촉매 작용할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제 뿐만 아니라, 예컨대, β-글루코시다제, 셀로비오히드롤라제, 엔도-1,4-β-크실라나제, β-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제와 같은 셀룰라제 및 이들 셀룰라제의 혼합물을 포함한다.
용어 "엔도글루카나제"는 전형적으로 중합체성 기질에서 내부 β1-4 글루코실 결합을 가수분해하고 사슬의 말단에 위치한 결합은 선택적으로 가수분해하지 않는 셀룰라제를 포함하는 것이다.
용어 "대리 프로모터"는 본질적으로는 전사 제어하지 않는 원하는 유전자를 전사 제어할 수 있는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대리프로모터의 전사 제어 결과 원하는 유전자의 발현 증가가 일어나게 된다. 바 람직한 실시양태에서, 대리 프로모터는 원하는 유전자의 5'에 놓여진다. 대리 프로모터는 천연 프로모터를 대신하는 데 이용되거나, 또는 천연 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 대리 프로모터는 그가 사용되는 숙주 세포에 내재할 수 있거나 또는 예를 들어, 그가 사용되는 숙주 세포의 외부에 존재하는, 숙주 세포로 도입된 이종 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 박테리아에서 사용하기에 적합한 다른 프로모터에는 예를 들어, lacZ, T7 및 SP6 (예컨대 문헌 (Ausubel et al)을 참조함)이 포함된다.
용어 "올리고사카라이드 공급원", "올리고사카라이드", "복합 셀룰로스", "복합 탄수화물", 복합 당" 및 "폴리사카라이드"는 본질적으로 상호교환가능하게 사용되며 하나 이상의 당 분자를 포함하는 임의의 탄수화물 공급원을 포함한다. 이들 탄수화물은 비가공된 식물성 물질 또는 임의의 가공된 식물성 물질로부터 유래될 수 있다. 그 예로는 나무, 종이, 펄프, 식물 유래의 섬유 또는 하나 이상의 결합된 탄수화물 잔기, 즉 하나의 당 잔기를 포함하는 합성 섬유가 있다. 특별한 올리고사카라이드 공급원 중의 하나는 대부분의 식물성 물질의 건중량의 약 90%를 나타내는 리그노셀룰로스이며, 이 리그노셀룰로스는 탄수화물, 예를 들면 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 펙틴 및 방향족 중합체, 예를 들면 리그닌을 포함한다. 셀룰로스는 리그노셀룰로스의 건중량의 30-50%를 구성하며 셀로비오스 (글루코스의 이량체)의 단독중합체이다. 마찬가지로, 헤미셀룰로스는 리그노셀룰로스의 건중량의 20-50%를 구성하며 아세틸 및 글루쿠로닐 측쇄를 함유하는 펜토오스 (크실로스, 아라비노스)와 헥소오스 (글루코스, 만노스, 갈락토스) 당의 혼합물을 함유하는 복합 중합 체이다. 펙틴은 리그노셀룰로스의 건중량의 1-20%를 구성하며 글루쿠론산의 메틸화 단독중합체이다. 다른 올리고사카라이드 공급원에는 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC), 비결정질 셀룰로스 (예를 들어, 산-팽윤 셀룰로스) 및 셀로올리고사카라이드, 예컨대, 셀로비오스, 셀로트리오스, 셀로테트라오스 및 셀로펜타오스가 포함된다. 셀룰로스, 예를 들어, 비결정질 셀룰로스는 종이 또는 펄프 공급원 (예컨대, 그의 유체 폐기물을 포함함)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 예컨대 농업 부산물, 예컨대, 옥수수 줄기, 대두 가용물 또는 사탕무 펄프로부터 유래될 수 있다. 상기 탄수화물 중합체 중 어느 하나 또는 그의 배합물은 본 발명의 생성물 및 방법에 따른 해중합 및 후속 발효에 의한 에탄올로의 생전환을 위한 잠재적 당 공급원이다.
용어 "유전자(들)" 또는 "폴리뉴클레오티드 단편"은 핵산 분자, 예를 들면 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 비코딩 조절 서열 및 인트론도 포함할 수 있다. 또한, 이 용어들은 기능적 좌위에 위치하는 하나 이상의 유전자, 예를 들면 1종 초과의 유전자 생성물, 예를 들면 분비 폴리펩티드를 코딩하는 에르위니아 및 클레브시엘라 각각의 out 또는 pul 유전자를 포함한다. 또한, 상기 용어들은 선택된 목적을 위한 특정 유전자를 포함한다. 유전자는 숙주 세포에 내인성일 수도 있고, 또는 에피좀 형태로 유지되는 플라스미드 또는 게놈 내에 안정적으로 통합되는 플라스미드로서 숙주 세포 내에 재조합 도입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 단편으로 된 유전자는 탄수화물이 에탄올로 생전환되는 과정의 하나 이상의 단계에 관여한다. 따라서, 상기 용어는 알코올 데히드로게나제, 피루베이트 데카르복실라제, 분비 단백질(들) 또는 폴리사카라제, 예를 들면 엔도글루카나제 또는 엑소글루카나제와 같은 글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-크실라나제, β-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 이들의 조합과 같은 폴리펩티드들을 코딩하는 임의의 유전자를 포함한다.
용어 "당화와 발효의 동시 수행" 또는 "SSF"는 복합 당의 동시적 분해 또는 해중합 및 발효에 의한 상기 당 잔기의 에탄올로의 생전환을 위해 1종 이상의 재조합 숙주, 또는 정제되거나 정제되지 않은 추출물을 비롯한 재조합 숙주의 추출물을 사용하는 것을 포함한다.
용어 "전사 조절"은 전사도로 유전자 발현을 조절하는 능력을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 전사, 따라서 유전자 발현은 원하는 유전자의 코딩 영역의 5' 말단 근처의 대리 프로모터를 치환하거나 또는 부가하여 유전자 발현을 변경시킴으로써 조절한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 전사 조절을 조작하여 예컨대, 원하는 비율로 상기 유전자를 최적으로 발현시킨다. 이 용어는 당분야에서 인식되는 유도성 전사 조절도 포함한다.
용어 "발현"은 적어도 mRNA 생산 수준에서의 유전자의 발현을 포함한다.
용어 "발현 생성물"은 발현된 유전자의 결과 생성물, 예를 들면 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "증가된 발현"은 적어도 증가된 mRNA 생산의 수준, 바람직하게는 폴리 펩티드 발현 수준에서의 유전자 발현의 변경을 포함한다.
용어 "증가된 생산"은 폴리펩티드의 효소 활성 수준에서 발현된 폴리펩티드의 양 또는 그의 배합물의 양이 증가된다는 것을 포함한다.
용어 "활성" 및 "효소 활성"은 상호 교환가능하게 사용되며 바람직한 조건 하에서 생산될 때 선택된 폴리펩티드에 의해 천연적으로 나타나는 임의의 기능적 활성을 포함한다. 엔도글루카나제 (예컨대, EGY 또는 EGZ)의 활성은, 예를 들면 복합 사카라이드를 효소적으로 해중합시키는 폴리펩티드의 능력이다. 전형적으로, 선택된 폴리펩티드의 활성은 생산된 폴리펩티드와 관련된 총 효소 활성을 포함한다. 숙주 세포에 의해 생산되며 효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 세포의 세포내 공간에 위치하거나, 세포에 결합되거나, 세포외 주위로 분비되거나 또는 그의 배합물 상태일 수 있다. 총 활성을 분비된 활성에 비교하여 측정하는 기술은 본 명세서에 기재되어 있으며 당업계에 공지되어 있다.
용어 "분비된"은 폴리펩티드, 예를 들면 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 폴리사카라제가 세포질 주변 공간 또는 세포외 주위로 분비되는 것이 증가한다는 것을 포함한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 천연 분비량을 넘는 증가된 수준으로 분비된다. 더욱 바람직하게는, 용어 "분비된"은 자연 분비도에 비해 10% 이상, 더욱 바람직하게는 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상 만큼 주어진 폴리펩티드의 분비가 증가되는 것을 의미한다.
용어 "분비 폴리펩티드"는 단독으로 또는 다른 폴리펩티드와 함께, 또다른 폴리펩티드가 세포의 세포내 공간으로부터 세포외 주위로 이동되는 것을 용이하게 하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 분비 폴리펩티드(들)은 그람-음성 숙주 세포에 분비 활성을 부여하기에 충분한 필요한 모든 분비 폴리펩티드를 포함한다. 전형적으로, 분비 단백질은 유전공학 기술을 이용하여 한 숙주 세포로부터 단리하여 다른 숙주 세포로 전달될 수 있는 단일 영역 또는 좌위에 코딩되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 분비 폴리펩티드(들)은 분비 활성을 가진 임의의 박테리아 세포로부터 유래된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 분비 폴리펩티드(들)은 타입 II 분비 활성을 갖는 숙주 세포로부터 유래된다. 또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 장내세균과로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 분비 폴리펩티드(들)은 에르위니아 또는 클레브시엘라 각각으로부터 유래된 out 또는 pul 유전자의 1종 이상의 유전자 생성물이다. 또한, 숙련인은 본 명세서에 기재된 out 또는 pul 유전자(들)과 충분한 상동성을 갖는, 관련 숙주로부터 유래된 임의의 분비 단백질(들)이 사용될 수도 있음을 이해할 것이다 (Pugsley et al., (1993) Microbiological Reviews 57:50-108; Lindeberg et al., (1996) Mol. Micro. 20:175-190; Lindeberg et al., (1992) J. of Bacteriology 174:7385-7397; He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1079-1083).
용어 "로부터 유래된"은 표시된 공급원으로부터의 폴리뉴클레오티드 단편의 (전체 또는 부분) 단리 및 표시된 공급원으로부터의 정제를 포함한다. 이 용어는 예를 들면 표시된 폴리뉴클레오티드 공급원과 관련된 서열로부터 또는 상기 서열 기초로 하여 직접 클로닝하거나, PCR 증폭하거나, 또는 인공적으로 합성하는 것을 포함한다.
용어 "에탄올생산성"은 미생물이 탄수화물로부터 에탄올을 1차 발효 생성물로서 생산하는 능력을 포함한다. 이 용어는 천연 발생 에탄올생산성 유기체, 천연발생 또는 유도 돌연변이된 에탄올생산성 유기체 및 유전적으로 변형된 에탄올생산성 유기체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "그람-음성 박테리아"은 당업계에 인정된 이 용어의 정의를 포함한다. 전형적으로, 그람-음성 박테리아는 예를 들면 특히 에세리키아 및 클레브시엘라 종을 포함하는 장내세균과를 포함한다.
용어 "충분히 상동한"은 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 충분한 또는 최소 수의 동일한 또는 동등한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드, 예를 들면 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 함유하여 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통된 구조적 도메인 및(또는) 공통된 기능적 활성을 공유하게 되는 것을 의미한다. 예를 들면, 공통된 구조적 도메인을 공유하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 도메인의 아미노산 서열을 가로질러 약 40% 이상의 상동성, 바람직하게는 50%의 상동성, 더욱 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%의 상동성을 가지며 하나 이상, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개, 더더욱 바람직하게는 4개, 5개 또는 6개의 구조적 도메인을 함유하며, 본 명세서에서 충분히 상동한 것으로 정의된다. 또한, 40% 이상, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%의 상동성을 가지며, 공통된 기능적 활성을 공유하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에 충분히 상동한 것으로 정의된다.
한 실시양태에서, 2 종의 폴리뉴클레오티드 단편, 예를 들면 프로모터들은, 그들이 뉴클레오티드 서열에 있어서의 실질적인 동일성 때문에 실질적으로 동일한 조절 효과를 갖는 경우 "충분히 상동하"다. 전형적으로, "충분히 상동한" 서열은 적어도 원하는 조절과 관련된 것으로 알려진 영역에서 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 동일하다. 더욱 바람직하게는, 5개 이하의 염기가 상이하다. 가장 바람직하게는, 5개 이하의 연속 염기가 상이하다.
2 종의 폴리뉴클레오티드 단편 또는 2 종의 아미노산 서열의 동일성 %를 측정하기 위해서는 서열들을 최적으로 비교될 수 있도록 정렬한다 (예를 들면, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭을 도입할 수 있고 비상동성 서열은 비교할 때 무시될 수 있음). 바람직한 실시양태에서, 비교를 위해 정렬된 기준 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더더욱 바람직하게는 60% 이상, 더더욱 바람직하게는 70%, 80% 또는 90% 이상이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 해당 위치에서 동일하다 (본 명세서에 사용된 바와 같이 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등함). 두 서열 사이의 동일성 %는 갭의 수를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수 및 두 서열의 최적 배열을 위해 도입되어야 하는 각 갭 길이의 함수이다.
서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 %의 측정은 수학적 연산을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 %는 블로솜 (Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하여 GCG 소프트웨어 팩키지 안의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)으로 도입되는 니들만과 운쉬 (Needleman and Wunsch)(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 연산을 사용하여 측정한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 %는 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 40, 50, 60, 70 또는 80의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 팩키지 안의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)을 사용하여 측정한다. 또다른 실시양태에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 %는 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)으로 삽입된 메이어스와 밀러 (E. Meyers and W. Miller)(CABIOS, 4:11-17 (1989))의 연산을 사용하여 측정한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 또한 공개 데이타베이스에 대한 검색을 수행하기 위해, 예를 들면 다른 과의 일원 또는 관련 서열, 예를 들면 프로모터 서열을 찾기 위해 "조회 서열"로서 사용할 수도 있다. 이러한 검색은 알츌 등 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12로 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 폴리펩티드 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3으로 수행할 수 있다. 비교를 위한 갭 정렬을 얻기 위하여, 갭 BLAST를 문헌 (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램 (예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
II. 엔도글루카나제 사이의 상호작용
본 발명은 적어도 부분적으로 엔도글루카나제가 복합 당을 분해하는 데 있어서 상승작용적으로 작용한다는 사실에 기초한 것이다. 본 발명은 또한 부분적으로 에탄올생산성 숙주 세포 (예를 들어, 클레브시엘라 옥시토카 P2)에 의한 두 가지 엔도글루카나제 (예를 들어, EGY 및 EGZ)의 기능적 통합 및 발현이 올리고사카라이드 (예를 들어, 결정질 셀룰로스)의 상승작용적 분해에 영향을 주고 당화와 발효의 동시 수행 (SSF)에 의해 에탄올의 생산을 증가시킨다는 것을 기초로 한다.
한 실시양태에서, 엔도글루카나제는 에르위니아 크리산테미로부터 유래되고 celZ 유전자에 의해 코딩되는 엔도글루카나제 EGZ이다 (Boyer, et al. (1987) Eur. J. Biochem. 162: 311-316). 또다른 실시양태에서, 엔도글루카나제는 에르위니아 크리산테미로부터 유래되고 celY 유전자에 의해 코딩되는 엔도글루카나제 EGY이다 (Guiseppi et al., (1991) Gene 106 : 109-114). 에르위니아 크리산테미의 EGY 및 EGZ는 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC)의 분해에 있어서 높은 활성을 나타내는 엔도글루카나제이고 각각 타입 IV 및 타입 II 분비군에 속한다 (Hueck et al. (1998) Micro and Mol Biol Rev 62: 379-433). EGY 및 EGZ는 기질 범위에서 다르고 CMC 및 비결정질 셀룰로스의 가수분해 동안 상승작용적으로 작용하는데, 이는 최적 셀룰라제 활성에 상기 두 효소가 필요할 수 있다는 것을 나타낸다. 구체적으로, EGZ는 셀로트리오스, 셀로테트라오스, 셀로펜타오스, 비결정질 셀룰로스 및 CMC를 가수분해한다. EGY는 중합체성 기질을 대략 10개의 글루코실 잔기로 구성된 생성물로 가수분해한다.
또다른 실시양태에서, 엔도글루카나제 (예를 들어, EGY 및 EGZ)는 따로 정제되고, 올리고사카라이드 기질의 상승작용적 분해가 일어나도록 하기에 충분한 비율로 병용되고, 이 비율은 본 명세서에 개시된 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 이 분석법은 주어진 두 글루카나제, 예를 들어, 엔도글루카나제 사이의 비율의 결정 및 최적화를 허용한다. 전형적으로, 상기 비율은 약 9 대 1 내지 약 19 대 1이다. 한 실시양태에서, 상기 비율은 약 9 대 1 내지 19 대 1의 EGZ 대 EGY일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 최적 상승작용은 celY 및 celZ를 발현하는 에르위니아 크리산테미 및 SZ21 (클레브시엘라 옥시토카 재조합 균주)에 의해 생산되는 것과 유사한 높은 비율의 EGZ 대 EGY에서 관찰된다 (실시예 4 참조).
또다른 실시양태에서, 엔도글루카나제는 올리고사카라이드 기질과 함께 동시에 사용할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 엔도글루카나제는 올리고사카라이드 기질에 연속적으로 첨가할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, EGZ는 EGY의 첨가에 이은 EGY 활성의 열 불활성화 후에 기질에 연속 첨가할 수 있다. 실시예 3에는 다양한 비율의 엔도글루카나제 (예를 들어, EGY 및 EGZ)의 상승작용적 효과, 엔도글루 카나제 (예를 들어, EGY 및 EGZ)의 연속 첨가 (표 12 참조)의 상승작용적 효과, 및 엔도글루카나제의 상승작용적 활성에 대한 다양한 기질 농도 (표 11)와 인큐베이션 시간의 효과가 상세히 기재되어 있다.
또다른 실시양태에서, 올리고사카라이드의 상승작용적 분해작용은 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0의 계수, 보다 바람직하게는 약 1.8의 계수 만큼 상승된다. 상승작용 계수는 관찰된 분해도를 EGY만 사용한 경우와 EGZ만 사용한 경우의 예측된 기여도의 합으로 나누어 계산한다 (Riedel, et al. (1997) FEMS Microbiol. Lett. 147: 239-243). 한 실시양태에서, 엔도글루카나제는 EGY 및 EGZ이다. EGY 단독의 예측된 기여도는 총 활성의 약 10%이고, EGZ 단독의 예측된 기여도는 총 활성의 약 90%이다.
본 발명의 또다른 측면에서, 1종 이상의 엔도글루카나제가 세포 추출물로부터 유래된다. 세포는 1종 이상의 엔도글루카나제를 생산하도록 재조합 개조할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 2 종의 엔도글루카나제 (예를 들어, EGY 및 EGZ)를 생산하도록 재조합 개조한다. 예를 들어, 세포는 박테리아 세포일 수 있다. 재조합 세포는 하나 이상의 이종 대리 프로모터(들)의 전사 조절 하에 폴리펩티드(들)를 코딩하는 1종 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 단편, 바람직하게는 2종 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 이종 폴리뉴클레오티드 및 대리 프로모터는 플라스미드 기재의 폴리뉴클레오티드 또는 대리 프로모터일 수 있거나 유기체의 게놈 내로 삽입될 수 있다 (실시예에 기재되어 있음). 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 복합 당의 에탄올로의 생전환 또는 그의 한 단계에서 사용하 기 위한 원하는 폴리펩티드의 공급원으로서 사용한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 이종 폴리뉴클레오티드 단편은 숙주에서 천연 발생하는 수준보다 더 높은 수준으로 발현되는 1종 이상의 엔도글루카나제 (예를 들어, EGY 또는 EGZ)를 코딩한다. 한 실시양태에서, 엔도글루카나제는 상이한 재조합 세포로부터 따로 정제한 후 기질 (예를 들어, 올리고사카라이드)을 상승작용적으로 분해하도록 병용한다. 또다른 실시양태에서, 한 재조합 숙주 세포는 2종 이상의 엔도글루카나제를 동시에 생산할 수 있고, 이들 엔도글루카나제는 상승작용적으로 작용하여 기질을 분해할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 재조합 박테리아 숙주 세포는 예를 들어, 클레브시엘라 옥시토카 P2, M5A1의 에탄올생산성 유도체와 같은 에탄올생산성 박테리아이다 (Wood, et al. (1992) Appel Environ. Microbiol. 58: 2103-2110). 한 실시양태에서, 재조합 에탄올생산성 박테리아는 1종 이상의 엔도글루카나제 (예를 들어, EGY 또는 EGZ)를 코딩하는 1종 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 단편 (예를 들어, 에르위니아로부터 유래된 celY 또는 celZ)를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 에탄올생산성 박테리아는 엔도글루카나제를 코딩하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 단편을 함유한다. 예를 들어, 실시예 4에 상세히 기재된 바와 같이, celY 및 celZ는 기능적으로 삽입되어, 에탄올생산성 균주 클레브시엘라 옥시토카 P2로부터 동시에 발현 및 분비되어 올리고사카라이드 기질 (예를 들어, 결정질 셀룰로스)로부터 에탄올을 생산한다.
또다른 실시양태에서, 재조합 숙주는 그람-음성 박테리아이다. 또다른 실시 양태에서, 재조합 숙주는 장내세균과로부터 유래된다. 예를 들어, 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,821,093호의 에탄올생산성 숙주가 적합한 숙주이고, 상기 숙주에는 특히 이. 콜라이 균주 K04 (ATCC 55123), KO11 (ATCC 55124) 및 K012 (ATCC 55125), 및 클레브시엘라 옥시토카 균주 P2 (ATCC 55307)가 포함된다. 또는, 예를 들어, 지모모나스 모빌리스와 같은 효율적인 에탄올 생산자로부터 얻은 에탄올생산성 유전자를 도입함으로써 본 발명의 비-에탄올생산성 숙주를 에탄올생산성 숙주 (상기한 균주와 같은 숙주)로 전환시킬 수 있다. 표준 기술을 사용한 이러한 유형의 유전자 개조는 당을 에탄올로 효율적으로 발효시킬 수 있는 재조합 숙주를 발생시킨다. 또한, LY01 에탄올 내성 균주를 공개된 PCT 국제 출원 WO 98/45425 (이 출원은 본 명세서에 포함되는 것으로 함)에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다 (Yomano et al. (1998) J. of Ind. Micro. & Bio. 20: 132-138).
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 비-에탄올생산성 재조합 숙주, 예를 들어, 이. 콜라이 균주 B, 이. 콜라이 균주 DH5α, 또는 클레브시엘라 옥시토카 균주 M5A1을 사용한다. 이들 균주는 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 1종 이상의 원하는 폴리펩티드, 예를 들어, 엔도글루카나제를 발현시키는 데 사용할 수 있다. 또한, 이들 재조합 숙주는 또다른 바람직한 폴리펩티드, 예를 들어, 다른 엔도글루카나제를 발현하는 또다른 재조합 숙주와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, EGZ를 생산하는 재조합 숙주는 EGY를 생산하는 재조합 숙주와 병용되어 상승작용적 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 비-에탄올생산성 숙주 세포(들)는 에탄올생산성 숙주 세포와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 비-에탄올생산성 숙주(들)을 사 용하여 복합 당의 상승작용적 해중합을 수행한 후 에탄올생산성 숙주를 사용하여 해중합된 당을 발효시킬 수 있다. 따라서, 이들 반응은 예를 들어, 비-에탄올생산성 재조합 숙주와 에탄올생산성 재조합 숙주의 균질 또는 혼합 배양물을 사용하여 연속적으로 또는 동시에 수행할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 당 기질을 에탄올로 발효시키는 1종 이상의 유전자는 플라스미드 상에 제공되거나 숙주 염색체 내에 삽입된다. 보다 바람직하게는, 당 기질을 에탄올로 발효시키는 유전자, 예를 들어, 피루베이트 데카르복실라제 (예를 들어, pdc) 및(또는) 알코올 데히드로게나제 (예를 들어, adh)는 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,821,093호에 기재된 PET 오페론과 같은 인공 오페론을 사용하여 본 발명의 숙주 내에 도입한다. 실제로, 본 발명은 당업계에 공지된 것과 함께 다수의 유전자를 적당한 숙주 내에 도입하기 위한 기술 및 벡터를 제공한다는 것을 알 수 있을 것이다 (Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992), Sambrook, J. et aL, Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Kreig et al., Williams and Wilkins (1984); 이들 문헌들은 본 명세서에 포함되는 것으로 함).
따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 단일 유전자 제작물로부터 필요한 유전자 생성물 (예를 들어, 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 분비 단백질(들), 피루베이트 데카르복실라제, 알코올 데히드로게나제)를 모두 발현시켜 당화와 발효의 동시 수행 (SSF)을 할 수 있다. 예를 들어, 실시예 4에는 시판되는 셀룰라제 (Spezyme (등록상표))를 첨가하면서 에탄올생산성 클레브시엘라 옥시토카에 의해 생산되는 박테리아 셀룰라제 EGY 및 EGZ에 의한 결정질 셀룰라제 (Sigmacell 50)의 당화와 발효의 동시 수행 (SSF)이 상세히 기재되어 있다. 에탄올생산성 클레브시엘라 옥시토카에 의해 생산된 엔도글루카나제 및 시판되는 셀룰라제(Spezyme)는 상승작용적으로 작용하여 결정질 셀룰로스 (Sigmacell 50)로부터 에탄올 생산을 (7 내지 22%) 증가시킨다. 이 유리한 효과는 EGZ와 비교할 때 EGY 활성이 낮다는 사실에도 불구하고 거의 EGY에 기인한 효과이다. EGY를 발현하는 에탄올생산성 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ22의 활성은 EGY 및 EGZ 활성 둘 다를 발현하는 에탄올생산성 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ21의 활성과 거의 동일하였다. EGZ만을 발현하는 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ6은 리터 당 20,000 U를 초과하는 정도의 엔도글루카나제를 생산하는 약간의 이점을 나타내었다.
한 실시양태에서, 올리고사카라이드를 분해하는 데 있어서 상승작용적으로 작용하는 두 가지 엔도글루카나제를 함유하는 조성물은 1종 이상의 다른 효소 활성도 포함한다. 이 추가 활성은 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-크실라나제, α-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 및 그의 배합물로 이루어진 군에서 선택되는 글루카나제 활성일 수 있다. 한 실시양태에서, 이 추가 효소 활성은 진균, 예를 들어, 티. 롱기브랜치아툼으로부터 유래할 수 있다. 티. 롱기브랜치아툼과 같은 진균은 결정질 셀룰로스의 가수분해 동안 엑소글루카나제와 함게 작용하는 것으로 예측되는 다수의 엔도글루카나제 활성을 나타낸다 (Nidetzky, et al. (1995), Synergistic interaction of cellulases from Trichoderma reesei during cellulose degradation p. 90-112. In J. N. Saddler and M. E. Himmel (ed.). Enzymatic degradation of insoluble carbohydrates ACS symposium series 618, American Chemical Society, Washington, D. C.; Tomme, et al. (1995) Adv. Microbiol. Physiol. 37: 1-81 ; Woodward, J. (1991) Bioresource Technol. 36 : 67-75).
EGZ와 대조적으로, EGY는 가용성 셀로비오사이드를 가수분해하지 않고 보다 긴 사슬 기질에 우선적으로 작용하여 엑소글루카나제 활성을 위한 새로운 부위로서 작용할 수 있는 말단을 형성한다. 진균 셀룰라제의 첨가가 없는 경우, EGY 및 EGZ는 상승작용적으로 작용하여 비결정질 셀룰로스를 분해한다. 본질적으로, 리그노셀룰로스성 기질이 진균과 박테리아의 조합에 의해 생산되는 세포외 효소의 혼합물에 의해 해중합된다. 따라서, 에르위니아 크리산테미 효소와 진균 티.리에세이 (T. reesei) 효소의 혼합물은 에탄올로의 생전환 동안 리그노셀룰로스성 기질의 분해작용을 개선시킬 수 있다.
당업계에 공지된 방법을 사용하여 도입된 유전자들의 안정성, 발현, 기능 및 분비를 방해하는 임의의 내재 유전자(들) (예를 들어, 리컴비나제 유전자)에서 돌연변이가 일어나도록 상기 재조합 숙주를 추가로 개조할 수 있다는 것도 알아야 할 것이다. 또한, 본 발명이 본 명세서에 기재된 것과 충분한 상동성이 있는 임의의 조절 요소, 유전자(들) 또는 유전자 생성물, 예를 들어, 폴리펩티드를 포함한다는 것도 알아야 할 것이다.
올리고사카라이드의 효과적인 분해를 위해, 글루카나제 (예를 들어, EGY 또는 EGZ)는 바람직하게는 세포외 주위로 분비된다. 따라서, 본 발명의 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 세포로부터 원하는 폴리펩티드가 용이하게 나오도록 하기 위해 분비 단백질(들)을 발현하도록 개조되었다. 한 실시양태에서, 분비 단백질(들)은 그람 음성 박테리아 세포, 예를 들면 장내세균과로부터의 선택되는 세포로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, 분비 단백질(들)은 에르위니아로부터 유래되며 out 유전자에 의해 코딩된다. 또다른 실시양태에서, 분비 단백질은 클레브시엘라로부터 유래된 pul 유전자이다. 이들 분비 단백질들 중 1 종 이상의 분비 단백질을 도입하는 것은 숙주 세포가 장내세균, 예를 들어 세포벽을 가진 그람 음성 박테리아인 경우 특히 바람직하다. 본 발명의 대표적인 그람 음성 숙주 세포는 장내세균과로부터 유래되며, 예를 들면 에세리키아 및 클레브시엘라를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주에 1종 이상의 분비 단백질을 도입하면 분비되는 단백질, 예를 들면 글루카나제의 분비가 천연 발생 분비도에 비해 증가된다. 바람직하게는, 분비의 증가는 천연 발생 분비도에 비해 10% 이상, 더욱 바람직하게는 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 분비 유전자의 부가는 글루카나제 폴리펩티드가 더 높은 수준으로 생산되도록 한다. 바람직한 실시양태에서, 더 높은 효소 활성을 갖는 분비 유전자의 부가는 글 루카나제 폴리펩티드가 생산되도록 한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 더 높은 수준의 더 높은 효소 활성을 갖는 글루카나제가 생산된다. 바람직하게는, 10% 이상, 더욱 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상의 글루카나제 활성의 증가가 관찰된다. 가장 바람직하게는, 분비 유전자 없는 세포 (예를 들면, 분비 유전자가 결핍되어 있거나 또는 충분한 정도로 발현하지 않는 세포)에 비해, 수배, 예를 들면 약 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000%의 글루카나제 활성의 증가가 얻어진다. 이러한 유전자를 도입하고 원하는 폴리펩티드, 예를 들면 글루카나제의 증가된 생산을 측정하는 기술 및 방법은 실시예에 상세히 설명되어 있다. 다른 동등한 방법은 당 업계의 숙련인에게 공지되어 있다.
EGY 및 EGZ는 상이한 메카니즘에 의해 분비된다. 실시예 4에 기재된 바와 같이, 타입 II 분비 시스템과 함께 사용될 수 있는 플라미드 (pCPP2006) 상에 있는 에르위니아 크리산테미 out 유전자가 도입된 경우, 대략 70%의 EGZ가 세포외 생성물로서 분비되었다 (Hueck, C. J. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 379-433). EGY 활성의 절반이 타입 IV 분비 시스템과 함께 사용될 수 있는 out 유전자의 존재 또는 부재 하에 분비되었다 (상기 문헌 (Hueck, C. J.)).
도입된 유전자 (예컨대, celY 및 celZ와 같은 엔도글루카나제 코딩 유전자 및 알코올 데히드로게나제 유전자)를 갖는 균주를 스크리닝하는 방법은 통상적이며 알코올 데히드로게나제 (ADH) 또는 글루카나제 (예컨대, EGZ 또는 EGY) 유전자 생성물을 발현하는 세포를 확인할 수 있는 가시 스크린에 의해 용이해질 수 있다. ADH 유전자 생성물은 p-로세아닐린의 류코술폰산 유도체와 반응하여 진한 적색 생성물을 생산하는 아세트알데히드를 생산한다. 따라서, ADH-양성 클론은 쉽게 스크리닝되고 혈액 적색 콜로니로서 확인될 수 있다. 폴리사카라제 (예컨대, EGZ 또는 EGY와 같은 엔도글루카나제) 활성을 스크리닝하는 방법도 아래 및 실시예에 기재된 바와 같은 투명한 가시 표현형을 나타낸다.
두 가지 엔도글루카나제 사이의 상승작용을 스크리닝하는 방법은 실시예에 상세히 기재되어 있다. EGY 및 EGZ는 celY 또는 celZ 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 재조합 숙주 세포로부터 따로 정제할 수 있다. 세포가 없는 배양 브로쓰를 사용하여 세포외 엔도글루카나제 활성을 측정할 수 있다. 초음파에 의해 파괴된 세포를 함유하는 브로쓰를 사용하여 총 활성을 측정할 수 있다. 셀로올리고사카라이드의 가수분해는 박층 크로마토그래피에 의해 분석할 수 있다. 또한, CMC를 기질로 사용하는 엔도글루카나제의 활성은 샘플을 환원 당에 대하여 분석함으로써 시험관내에서 측정할 수 있다. 환원당은 표준물인 글루코스와 3,5-디니트로살리실산 시약을 사용하여 측정할 수 있다. 상승작용은 관찰된 활성을, EGY만을 사용한 경우의 예측된 기여도 (10%)와 EGZ만을 사용한 경우의 예측된 기여도 (90%)의 합으로 나누어 계산한다.
별법으로, 재조합 숙주 세포는 두 가지 엔도글루카나제를 포함하는 플라스미드로 형질전환시켜 두 가지 엔도글루카나제를 동시에 생산할 수 있다. 상승작용은 상술한 바와 같이 측정할 수 있다. 당화와 발효의 동시 수행 (SSF)은 기질로부터의 에탄올 생산을 관찰하기 위해 수행할 수 있다 (실시예 4에 기재됨). 시판되는 셀룰라제가 첨가된 SSF 실험에서, 1종 이상의 에르위니아 크리산테미 엔도글루카나제를 함유하는 클레브시엘라 옥시토카 재조합체 중 2종이 에르위니아 크리산테미 엔도글루카나제가 없는 클레브시엘라 옥시토카 모균주보다 더 많은 에탄올을 생산하였다. 이들 두 균주도 첨가량의 대략 1/3의 시판되는 셀룰라제 (재조합 효모의 경우 500 FPU/g의 셀룰라제 대 18 FPU/g의 셀룰라제)를 사용한 가장 좋은 효모 SSF 실험 (Cho, et al. (1999) J. Microbiol. Biotechnol. 9: 340-345)과 동일한 수준의 에탄올을 생산하였다.
예를 들어 PET 오페론을 발현하는 재조합 박테리아는 전형적으로 산성이 아닌 중성 발효 생성물의 생산으로 인해 비변형된 모 유기체 보다 액체 배양액에서 더 높은 세포 밀도로 생장한다 (Ingram et al., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:397-404). 에탄올생산성 클론은 플레이트 상에서 효모 처럼 보이는 큰 콜로니로서 용이하게 식별된다. 이러한 특징은 새로운 균주의 제작 과정에 아주 유용하며 새로운 제작물의 유용성의 예비 표시를 제공할 수 있다. 에탄올 생산 가능성의 신속한 평가는 알데히드 지표 플레이트 상의 적색 반점 발생 속도를 시험함으로써 이루어질 수도 있다 (Conway et al., (1987) J. Bacteriol. 169:2591-2597). 전형적으로, 에탄올로의 당 전환에 효율적인 것으로 입증된 균주는 옮겨진 지 수 분 내에 알데히드 지표 플레이트 상의 적색 반점의 형성에 의해 인식될 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서, 단일 숙주 세포는 에탄올생산성 숙주 세포, 즉 숙주 세포가 복합 당을 분해하고 분해된 당을 에탄올로 발효시키기에 충분한 두 가지 글루카나제, 바람직하게는 엔도글루카나제, 가장 바람직하게는 2가 지 이상의 엔도글루카나제를 생산하고 분비하는 능력을 갖도록 천연적으로 발생하거나 인공적으로 도입 또는 강화된 (예를 들면, 다른 종 또는 균주로부터의 대리 프로모터 및(또는) 유전자를 사용함) 필요한 모든 유전자를 갖는다. 따라서, 이러한 숙주는 당화와 발효의 동시 수행에 적합하다.
또한, 본 발명은 천연 이. 콜라이 발효 경로가 산성 및 중성 생성물 (함량 순서로)의 혼합물: 락트산, 수소 + 이산화탄소 (포르메이트로부터 얻음), 아세트산, 에탄올 및 숙시네이트의 혼합물)을 생산한다는 것을 고려한다. 그러나, 제트. 모빌리스 PDC (피루베이트 데카르복실라제)는 임의의 경쟁 이. 콜라이 효소 보다 피루베이트에 대해 더 낮은 Km을 갖는다. 고활성의 PDC를 발현시킴으로써 탄소 흐름은 락트산 및 아세틸-CoA로부터 아세틸알데히드 및 에탄올로 효과적으로 방향이 바뀐다. 소량의 숙시네이트는 푸마레이트 리덕타제 유전자 (frd)를 결실시킴으로써 제거할 수 있다 (Ingram et al., (1991) 미국 특허 제5,000,000호; Ohta et al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900). 다른 경쟁 경로를 완전히 제거하기 위해 추가의 돌연변이 (예를 들면, pfl 또는 ldh 유전자의 돌연변이)를 일으킬 수 있다 (Ingram et al., (1991) 미국 특허 제5,000,000호). 도입된 유전자 (플라스미드를 기재로 하거나 또는 게놈 내로 삽입됨)의 안정성을 손상시킬 수 있는 효소 (예를 들면, recA와 같은 리콤비나제)를 제거하기 위한 추가의 돌연변이가 도입되거나, 특정 백그라운드로부터 선택되거나 또는 상기 백그라운드에 대해 선별될 수도 있다.
또한, 단백질 또는 전체 대사 경로를 코딩하는 유전자를 단일 조작가능한 제 작물 내로 형질전환시키는 데 있어서 본 발명에 의해 부여된 능력이 아주 유용함은 당 업계의 숙련인이라면 쉽게 알 수 있을 것이다. 이러한 면에서, 예를 들면 다른 유전자좌로부터의 유전자가 염색체 상에 놓여진 각종 상황에 본 발명을 적용하는 것이 예상된다. 이것은 단일 프로모터 또는 별개의 프로모터의 조절 하에서 멀티-시스트론 카세트가 사용될 수 있음을 의미한다.
에탄올을 생산하며 본 발명의 방법에 따른 추가의 개선에 적합한 예시적인 이. 콜라이 균주에는 예를 들면 KO4, KO11 및 KO12 균주, 및 LY01 균주, 이. 콜라이 균주 KO11의 에탄올 내성 돌연변이체가 포함된다. 이상적으로, 이들 균주는 환경적 스트레스에 견디고, 에탄올을 생산하고 폴리사카라제(들)을 분비하도록 개조될 수 있는 이. 콜라이 균주 ATCC 11303으로부터 유래될 수 있다. 또한, 최근의 PCR 연구는 ATCC 11303 균주가 이. 콜라이의 병원성과 관련있는 것으로 알려진 모든 유전자가 결핍된 것임을 확인하였다 (Kuhnert et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:703-709).
본 발명에 따른 개선에 바람직한 다른 에탄올생산성 숙주는 많은 다양한 리그노셀룰로스 재료 및 다른 기질로부터 헤미셀룰로스 가수분해물을 발효시킬 수 있는 이. 콜라이 KO11 균주이다 (Asghari et al., (1996) J. Ind. Microbiol. 16:42-47; Barbosa et al., (1992) Current Microbiol. 28:279-282; Beall et al., (1991) Biotechnol. Bioeng. 38:296-303; Beall et al., (1992) Biotechnol. Lett. 14:857-862; Hahn-Hagerdal et al., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:62-72; Moniruzzaman et al., (1996) Biotechnol. Lett. 18:955-990; Moniruzzaman et al., (1998) Biotechnol. Lett. 20:943-947; Grohmann et al., (1994) Biotechnol. Lett. 16:281-286; Guimaraes et al., (1992) Biotechnol. Bioeng. 40:41-45; Guimaraes et al., (1992) Biotechnol. Lett. 14:415-420; Moniruzzaman et al., (1997) J. Bacteriol. 179:1880-1886). 도 1에는 이 균주에 대한 생전환의 반응속도가 기재되어 있다. 특히, 이 균주는 쌀겨로부터 얻은 헤미셀룰로스 가수분해물 (펜토오스 당 58.5 g/L 및 헥소오스 당 37 g/L을 함유함)을 에탄올로 신속하게 발효시킬 수 있다 (Moniruzzaman et al., (1998) Biotechnol. Lett. 20: 943-947). 이 균주는 48 내지 72 시간 내에, 이상적인 조건 하에서는 24시간 내에 헤미셀룰로스 가수분해물의 발효를 완결시킬 수 있다는 것도 밝혀졌다.
본 발명의 또다른 바람직한 숙주 세포는 클레브시엘라 박테리아이다. 특히, 클레브시엘라 옥시토카가 바람직한데, 그 이유는 이 장내세균이 이. 콜라이 처럼 더욱 복잡한 당의 구성성분인 단량체 당을 대사시키는 타고난 능력을 갖고 있기 때문이다. 또한, 케이. 옥시토카는 셀룰로스의 효소적 가수분해로부터 얻은 가용성 중간체인 셀로비오스 및 셀로트리오스를 운반하고 대사할 수 있는 추가의 이점을 갖는다 (Lai et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 63:355-363; Moniruzzaman et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4633-4637; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110). 본 발명은 PET 오페론 내에 코딩된 제트. 모빌리스 pdc 및 adhB 유전자를 갖는 케이. 옥시토카, 예를 들면 균주 M5A1의 유전자 개조된 에탄올생산성 유도체를 제공한다 (본 명세서 및 미국 특허 제5,821,093호 (Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)에 기재됨).
따라서, 형성된 유기체 균주 P2는 단량체 당으로부터 또한 라피노오스, 스타키오스, 수크로스, 셀로비오스, 셀로트리오스, 크실로비오스, 크실로트리오스, 말토오스 등을 비롯한 각종 사카라이드로부터 효율적으로 에탄올을 생산한다 (Burchhardt et al., (1992) Appl. Environ. Microl. 58:1128-1133; Moniruzzaman et al., (1997) Appl. Environ. Microl. 63:4633-4637; Moniruzzaman et al., (1997) J. Bacteriol. 179:1880-1886; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110). 이 균주는 1종 이상의 폴리사카라제를 발현하고 분비하도록 본 발명의 방법에 따라 더 변형시킬 수 있다. 따라서, 이 균주는 SSF 방법에서 복합 사카라이드의 생전환에 사용하기에 적합하다 (Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538; Doran et al., (1994) Biotechnol. Bioeng. 44:240-247; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microl. 58:2103-2110). 특히, 이 에탄올생산성 P2 균주를 사용하면 보충 셀로비아제를 첨가시킬 필요가 없으며, 이것은 상업적 진균 셀룰라제의 안정한 요소 중 적어도 하나이다 (Grohmann, (1994) Biotechnol. Lett. 16:281-286).
이종 유전자 발현에 사용하기에 적합한 프로모터의 스크린
한 실시양태에서, 본 발명의 대리 프로모터가 이종 유전자, 예를 들면 폴리사카라제 (예컨대, 엔도글루카나제)의 발현을 개선시키는 데 사용되긴 하지만, 본 발명이 임의의 원하는 유전자 생성물의 발현을 상승시키는 데 적합한 대리 프로모터를 스크리닝할 수 있게 한다는 것도 알 수 있을 것이다. 일반적으로, 본 발명의 스크리닝 방법은 실시예 1에 기재되고 도 3에 도시된, 후보 프로모터 단편이 리포터 유전자에 용이하게 라이게이션되고 작동가능하게 연결되도록 하는 클로닝 벡터를 사용한다. 한 실시양태에서, 글루카나제를 코딩하는 celZ 유전자는, 플라스미드를 가진 세포가 특정 배지 (CMC 플레이트) 상에서 생장될 때 이 효소 (글루카나제)의 발현으로 인해 강한 비색 변화가 일어나기 때문에 편리한 리포터 유전자로서 사용된다. 따라서, 후보 프로모터, 예를 들면 벡터에 "샷건 (shotgun)" 클로닝되고 작동가능하게 연결될 수 있는 특정 프로모터 서열 또는 랜덤 서열을 숙주 세포 내에 도입할 수 있고 CMC 플레이트 상의 표현형 글루카나제-매개 비색 변화에 의해 입증되는 바와 같은 증가된 유전자 발현을 나타내는 생성 콜로니를 가시적으로 스크리닝할 수 있다. 그후에, 목적하는 표현형을 갖는 콜로니는 형질전환 DNA를 생산하도록 처리하고 프로모터는 적절한 프라이머를 사용하여 시퀀싱한다 (더 상세한 내용은 실시예 1 참조).
CMC 플레이트 상의 글루카나제-매개 비색 변화와 효소의 발현도 사이의 높은 상관관계는 후보 프로모터의 강도의 우수한 지표이다 (도 4). 그러므로, 본 발명의 방법은 후보 대리 프로모터의 강도의 등급을 정하기 위한 신속한 육안 시험을 제공한다. 따라서, 확인된 특정 대리 프로모터는 이 검정법을 이용하여 특정 유전자 생성물에 필요한 원하는 발현도에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들면, 단순히 최고 발현도가 요망된다면, 최대 비색 변화를 나타내는 후보 프로모터가 선택할 수 있다. 예를 들어 발현될 목적 생성물이 고농도에서 독성이거나 또는 다른 생성물과 동등한 농도로 발현되어야 하는 이유로 보다 낮은 수준의 발현이 요망되는 경 우, 보다 약한 대리 프로모터를 기재된 바와 같이 확인하고, 선택하고 사용할 수 있다.
플라스미드 pLOI2311은 lac 프로모터의 조절 하에 celY를 코딩하는 영역을 포함하고, pLOI2316은 엔도글루카나제 표시 플레이트에 의해 측정된 바와 같이 lac 프로모터로부터 celY를 발현하도록 배향된 클론으로서 확인하였다. 천연 프로모터를 lac 프로모터로 대체하면 이 플라스미드를 포함하는 재조합 이. 콜라이에 의한 celY의 발현이 증가되었다. 또한, 에탄올생산성 클레브시엘라 옥시토카 P2 균주와 같은 산업적으로 이용되는 균주에서 이종 유전자의 발현과 관련된 문제점을 최소화하기 위해, 기능 분석을 이용하여 지모모나스 모빌리스 DNA의 무작위 단편들로부터 조절되지 않는 프로모터를 단리하였다. 이 방법을 이용하여, 이종 단편으로서 지모모나스 모빌리스의 Sau3AI 단편을 포함하는 플라스미드 (pLOI2323)를 제작하였다 (실시예 4 및 도 13과 14 참조). 또한, 고도의 EGZ는 플라스미드 pLOI1620을 포함하는 이. 콜라이에 의해 생산되었다. 이 플라스미드의 제작 및 이종 프로모터의 선택에 관한 보다 상세한 내용은 실시예 3 및 4를 참조한다.
실시예 4에는 대리 프로모터가 있는 celY, celZ 삽입 벡터 (pLOI2352)의 제작이 기재되어 있다 (도 15 참조). 이 플라스미드의 안정성을 확보하기 위해, 하이브리드 유전가를 염색체 내에 삽입하고, FLP 리컴비나제 시스템 (Martinez Morales, et al. (1999) J Bacteriol. 181: 7143-7148)을 사용하여 제작에 사용된 항생제 내성 마커를 결실시킴으로써 추가 유전적 변형을 용이하게 하였다.
III. 사용 방법
복합 사카라이드의 분해 또는 해중합
한 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 복합 당, 예를 들면 리그노셀룰로스 또는 올리고사카라이드를 더 작은 당 잔기로 분해 또는 해중합시키는 데 사용된다. 이를 위해, 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 1종 이상의 폴리사카라제, 예를 들면 EGY 및 EGZ와 같은 엔도글루카나제를 발현시키며, 이들 폴리사카라제는 생산자 유기체로부터 자연적으로 유리될 수 있다. 또한, 폴리사카라제는 세포를 물리적으로 파괴시킴으로써 생산자 세포로부터 유리시킨다. 세포를 물리적으로 (예를 들면, 전단, 초음파), 효소적으로 (예를 들면, 리소자임) 또는 화학적으로 파괴시키는 각종 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일단 원하는 폴리펩티드가 내부 세포 공간으로부터 유리되면, 상기 폴리펩티드는 복합 사카라이드 기질을 생전환되는 보다 작은 당 잔기로 분해시키는 데 사용할 수 있다. 유리된 폴리사카라제는 당 업계에 공지된 표준 생화학적 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 또한, 유리된 폴리사카라제는 다른 세포 성분으로부터 정제되거나 또는 단리될 필요가 없으며 당 기질에 직접 적용할 수 있다.
따라서, 당업자는 1종 이상의 폴리사카라제를 그들의 활성에 대해 선별할 수 있고, 복합 당의 분해에 있어서 최적화된 활성, 바람직하게는 상승작용적 활성을 갖는 조성물을 제제화할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 조성물은 예를 들어, 복합 당의 최적 분해를 제공하는 비율로 1종 이상의 엔도글루카나제와 혼합된 비정제된, 반정제된 또는 정제된 엔도글루카나제의 형태를 취할 수 있다. 또한, 각 효소는 복합 당의 최적 분해를 달성하기 위해 사용, 즉 바람직한 순서 및(또는) 비율로 혼합되거나 적용하기 위한 설명서와 함께 개별적으로 제형화할 수 있다.
다른 실시양태에서, 폴리사카라제가 생장 배지로 분비되도록 1종 이상의 폴리사카라제 및 분비 단백질(들)을 동시 발현하는 숙주 세포를 사용한다. 이는 숙주 세포로부터 폴리사카라제를 유리하기 위해 필요한 상기 단계를 불필요하게 한다. 이러한 유형의 숙주를 사용할 때, 이 숙주는 올리고사카라이드를 함유하는 수용액 중에서 직접 사용할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 올리고사카라이드의 상승적 분해작용이 일어나기에 충분한 비율로 하나 이상의 폴리사카라제를 발현하도록 디자인하거나 또는 다른 폴리사카라제를 발현하는 또다른 숙주와 혼합된다. 예를 들어, 한 숙주 세포가 이종 엔도글루카나제 (예컨대, EGY)를 발현할 수 있는 동안 다른 숙주 세포는 또다른 엔도글루카나제 (예컨대, EGZ)를 발현할 수 있고, 이들 숙주 세포가 배합되어 올리고사카라이드의 분해작용에서 상승작용적 활성을 나타내는 불균질 배양물을 형성할 수 있다. 또한, 바람직한 실시양태에서, 단일 숙주 균주는 상기 모든 폴리사카라제를 생산하도록 개조한다. 어느 경우든, 올리고사카라이드에 적용하기 위한 원하는 폴리사카라제를 고도로 발현하는 재조합 숙주(들)의 배양물이 생성된다. 필요시에, 이 혼합물은 추가의 셀룰라제, 예를 들어 진균 셀룰라제와 같은 외재 셀룰라제와 배합할 수 있다. 그후에, 이 혼합물은 복합 기질을 분해하는 데 사용한다. 또한, 복합 당 기질을 첨가하기 전에, 폴리사카라제(들)은 표준 생화학적 기술을 이용하여 세포 및(또는) 배지로부터 정제하여 당 기질을 해중합시키기 위한 순수한 효소 공급원으로서 사용한다.
본 발명의 에탄올생산성 박테리아 균주는 단백질의 부적합한 폴딩 기회가 더 적기 때문에 (예를 들어, 부적절한 이황화 결합 형성으로 인해) 혐기적 조건 하에서 (예를 들면, 산소 부재 하에서) 재조합 단백질을 생산할 수 있는 우수한 숙주라는 것을 당 업계의 숙련인이라면 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 숙주 및 배양 조건은 잠재적으로 생물학적 활성 생성물을 더 많이 회수하게 한다.
복합 사카라이드의 발효
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 특성을 가진 숙주 세포 또한 에탄올을 생산하는 것이다. 따라서, 이러한 숙주 세포는 복합 사카라이드를 모노사카라이드로 상승작용적으로 분해 또는 해중합시키는 데 사용할 수 있다. 이어서, 상기 세포는 발효에 의해 보다 더 작은 당을 에탄올로 대사시킬 수 있다. 복합 사카라이드가 보다 더 작은 당 잔기로 해중합된 후 발효되는 이 과정은 당화와 발효의 동시 수행 (SSF)으로 불린다.
전형적으로, 생산자 숙주 세포 균주의 최적 생장 속도를 촉진시키기 위한 최적 pH와 온도, 및 배양물에 의해 생산되는 효소에 대한 촉매 작용 조건을 제공하는 발효 조건을 선택한다 (Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538). 예를 들면, 클레브시엘라, 예를 들어 P2 균주의 경우, 최적의 조건은 35-37 ℃ 및 pH 5.0-pH 5.4인 것으로 측정되었다. 이러한 조건 하에서, 외부로부터 첨가된 진균 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제 조차도 장기간 동안 아주 안정하고 계속 작용한다. 다른 조건들은 실시예에서 논의된다. 또한, 본 발명의 주어진 발효 반응을 최적화하기 위해 당 업계에 공지된 기술을 이용하는 통상적인 실험 만이 필요하 다는 것은 당 업계의 숙련인이라면 이해할 것이다.
현재, 리그노셀룰로스와 같은 복합 사카라이드의 전환은 아주 복잡한 다단계 공정이다. 예를 들면, 리그노셀룰로스는 먼저 산 가수분해를 이용하여 분해 또는 해중합되어야 한다. 그 다음에, 고체로부터 액체를 분리시키는 단계가 이어지고, 그 후 이 생성을 세척하고 해독하여 (첨가된 셀룰라제를 사용하여) 더 해중합시킬 수 있는 셀룰로스를 수득하고, 마지막으로 적합한 에탄올생산성 숙주 세포에 의해 발효시킨다. 대조적으로, 옥수수의 발효는 아밀라제가 본질적으로 1단계 공정에서 에탄올생산성 숙주에 의한 즉석 생전환을 위해 옥수수 전분을 분해시키는 데 사용될 수 있다는 점에서 훨씬 더 간단하다.
따라서, 본 발명의 재조합 숙주 및 방법이 유사하게 더 간단하고 더 효율적인 리그노셀룰로스의 발효 방법을 사용할 수 있게한다는 것은 당 업계의 숙련자라면 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 산 가수분해를 전혀 이용하지 않는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 숙주는 다음의 이점을 갖는다: 1) 펜토오스와 헥소오스의 동시 발효 효과; 2) 독소에 대한 내성; 3) 복합 사카라이드 해중합을 위한 효소의 생산; 및 4) 환경 스트레스에 대한 내성. 따라서, 리그노셀룰로스를 해중합시키는 복잡성은 본 발명의 개선된 생촉매를 사용하여 단순화시킬 수 있다. 사실상, 본 발명의 바람직한 한 실시양태에서, 반응은 단일 반응 용기에서 산 가수분해의 부재하에, 예를 들면 SSF 방법으로서 수행할 수 있다.
에탄올로 생전환될 수 있는 기질
본 발명의 한 이점은 지금까지 충분히 활용되지 않은 사카라이드 공급원을 사용하는 능력이다. 따라서, 본 발명의 숙주 세포 및 방법을 사용하여 많은 복합 사카라이드 기질을 해중합 후 발효를 위한 출발 공급원으로서 사용할 수 있다. 이상적으로, 재사용가능한 자원을 SSF 방법에 사용할 수 있다. 혼합된 사무실 폐지가 바람직한 기질이며 (Brooks et al., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625; Ingram et al., (1995) 미국 특허 제5,424,202호), 이 폐지는 산 예비처리된 사탕수수 찌끼 (Doran et al., (1994) Biotech. Bioeng. 44:240-247) 또는 고도로 정제된 결정질 셀룰로스 (Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538) 보다 훨씬 더 쉽게 분해된다. 글루카나제 (엔도글루카나제 및 엑소글루카나제 둘 다)는 셀룰로스 결합 도메인을 함유하고, 이들 효소는 원심분리를 이용하여 분해되지 않은 셀룰로스 성분을 모음으로써 후속 발효에서 용이하게 재사용할 수 있다 (Brooks et al., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625). 이 잔기를 출발물질로서 결합 효소와 함께 첨가할 때, 에탄올 수율 (단위 기질 당 수율)은 진균 효소 사용량이 60% 감소되면서 이론치 수율의 80% 이상으로 증가되었다 (도 2). 이러한 방법은 정제된 셀룰로스를 사용할 때 잘 수행되지만, 재사용 단계의 수는 더 높은 리그닌 함량을 갖는 기질로 제한될 수 있다. 본 발명의 영역 내에 드는 다른 기질 공급원은 임의 유형의 가공 또는 비가공된 식물성 물질, 예를 들면 베어낸 풀, 껍질, 속, 줄기, 잎, 섬유, 펄프, 삼, 톱밥, 신문지 등을 포함한다.
본 발명은 제한하는 것으로 간주되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명된다.
실시예 1
올리고사카라이드를 에탄올로 발효시키기에 적합한 재조합 에세리키아 숙주의 제조 방법
이 실시예에는, 올리고사카라이드를 에탄올로 발효시키기에 적합한 에세리키아 숙주를 개발하고 사용하는 방법이 기재되어 있다. 특히, 폴리사카라제 (예를 들면 글루카나제)의 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있는 강한 프로모터가 확인되었다. 또한, 에르위니아 크리산테미로부터의 유전자를 사용하여 폴리사카라제 분비를 용이하게 함으로써 원하는 폴리사카라제 활성을 방출시키기 위한 세포 파괴가 필요없게 된다.
이 실시예 전반에 걸쳐, 달리 명시하지 않는 한 하기 재료 및 방법을 사용하였다.
재료 및 방법
유기체 및 배양 조건
이 실시예에 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드는 하기 표 1에 기재되어 있다.
플라스미드를 제작하기 위해, 숙주 세포 이. 콜라이 DH5α를 사용하였다. 폴리사카라제 (예를 들면, 글루카나제)를 코딩하는 특정 유전자는 에르위니아 크리산테미 P86021로부터 유래된 celZ 유전자였다 (Beall, (1995) Ph.D. Dissertation, University of Florida; Wood et al., (1997) Biotech. Bioeng. 55:547-555). 분비를 개선시키는 데 사용된 특정 유전자는 이. 크리산테미 EC16으로부터 유래된 out 유전자였다 (He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1079-1083).
전형적으로, 숙주 세포 배양물을 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) 브로쓰 (LB)(10 g L-1 디프코 (Difco)(등록상표) 트립톤, 5 g L-1 디프코 (등록상표) 효모 추출물, 5 g L-1 염화 나트륨) 중에서 또는 루리아 한천 (한천 15 g L-1로 보충된 LB) 상에서 생장시켰다. 글루카나제 celZ 활성 (EGZ)을 갖는 숙주 세포를 스크리닝하기 위하여, CMC-플레이트 (카르복시메틸 셀룰로스 (3 g L-1)를 함유하는 루리아 한천 플레이트)를 사용하였다 (Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-112). 경우에 따라, 항생물질 암피실린 (50 ㎎ L-1), 스펙티노마이신 (100 g L-1), 카나마이신 (50 g L-1)을 배지에 첨가하여 내성 마커를 함유하는 재조합 또는 삽입 숙주 세포를 선별하였다. 온도 조절 pSC101 복제기점을 가진 플라스미드를 함유하는 제작물 (Posfai et al., (1997) J. Bacteriol. 179:4426-4428)은 30 ℃에서 생장시키고, 달리 명시하지 않으면 pUC 기재 플라스미드를 함유하는 제작물은 37 ℃에서 생장시켰다.
사용된 균주 및 플라스미드
균주/플라스미드 설명 공급원/참조문헌
균주
제트. 모빌리스 CP4 원영양균성 Osman et al., (1985) J. Bact. 164:173-180
이. 콜라이 균주 DH5α lacZ M15 rec4 Bethesda Research Laboratory
이. 콜라이 균주 B 원영양균성 ATCC 11303
이. 콜라이 균주 HB 101 recA lacY recA ATCC 37159
플라스미드
pUC19 bla 클로닝 벡터 New England Biolabs
pST76-K kan 저카피수. 감온성
pRK2013 kan 이동 헬퍼 플라스미드 (mob-) ATCC
pCPP2006 이. 크리산테미 EC16으로부터의 완전 out 유전자를 갖는 Sp' 약 40 kbp 플라스미드 He et al., (1991) P.N.A.S. 88:1079-1083
pLOI1620 bla celZ Beall et al., (1995) Ph.D. Disseration, U. of Florida
pLOI2164 BamHI 부위가 제거된 pLOI1620 (클레나우) 본문 참조
pLOI2170 pUC19로 클로닝된 pLOI2164로부터의 NdeI- HindIII 단편 (프로모터없는 celZ) 본문 참조
pLOI2171 pST76-K로 클로닝된 pLOI2170으로부터의 BamHI-SphI 단편 (프로모터없는 celZ) 본문 참조
pLOI2173 pST76-K로 클로닝된 pLOI2164로부터의 EcoRI- SphI 단편 (천연 프로모터를 가진 celZ) 본문 참조
pLOI2174 pLOI2171로 클로닝된 EcoRI-BamHI 단편 (gap 프로모터) 본문 참조
pLOI2175 pLOI2171로 클로닝된 EcoRI-BamHI 단편 (eno 프로모터) 본문 참조
pLOI2177 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2178 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2179 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2180 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2181 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2182 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2183 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2184 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2196 PstI 부위에서 pUC19로 융합된 pLOI2177 본문 참조
pLOI2197 PstI 부위에서 pUC19로 융합된 pLOI2180 본문 참조
pLOI2198 PstI 부위에서 pUC19로 융합된 pLOI2182 본문 참조
pLOI2199 PstI 부위에서 pUC19로 융합된 pLOI2183 본문 참조
pLOI2307 pUC19로 클로닝된 pLOI2183으로부터의 EcoRI- SphI 단편 본문 참조

유전적 방법
모든 플라스미드 제작시에 표준 기술을 이용하였다 (Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. C.S.H.L., Cold Spring Harbor, N.Y.). 소규모 플라스미드 단리를 수행하기 위하여, TELF 절차를 수행하였다. 대규모 플라스미드 단리를 위하여, 프로메가 (등록상표) 위자드 키트 (Wizard Kit)를 사용하였다. 겔로부터 DNA 단편을 단리하기 위하여, 퀴아겐 (Qiagen)(등록상표)으로부터의 퀴아퀵 (Qiaquick)(등록상표) 겔 추출 키트 (Gel Extraction Kit)를 사용하였다. 이. 콜라이 및 제트. 모빌리스로부터 염색체 DNA를 단리하기 위하여, 커팅 (Cutting )과 요마노 (Yomano)의 방법을 이용하였다 (Cutting et al., (1990) Genetic analysis, pp. 61-74, In, Molecular biological methods for Bacillus, John Wiley & Sons, Inc.; Yomano et al., (1993) J. Bacteriol. 175:3926-3933).
본 명세서에 기재된 2가지의 당분해 유전자 프로모터 (예를 들면, gap 및 eno)를 단리하기 위해, 이. 콜라이 DH5α로부터 정제된 염색체 DNA를 하기 프라이머 쌍: gap 프로모터, 5'-CGAATTCCTGCCGAAGTTTATTAGCCA-3' (서열 번호 3) 및 5'-AAGGATCCTTCCACCAGCTATTTGTTAGTGA-3' (서열 번호 4); eno 프로모터, 5'-AGAATTCTGCCAGTTGGTTGACGATAG-3' (서열 번호 5) 및 5'-CAGGATCCCCTCAAGTCACTAGTTAAACTG-3' (서열 번호 6)을 사용한 이들 핵산의 PCR (폴 리머라제 연쇄 반응) 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. 이. 크리산테미 (pCPP2006)로부터 유래된 분비 단백질을 코딩하는 out 유전자를, pRK2013을 사용하여 이. 콜라이에 접합시켜 이동성을 부여하였다 (Figurski et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:1648-1652; Murata et al., (1990) J. Bacteriol. 172:2970-2978).
각종 원하는 DNA의 서열을 확인하기 위하여, 형광 프라이머를 사용한 디데옥시 시퀀싱 방법을 LI-COR 모델 4000-L DNA 시퀀서 상에서 수행하였다. T7 프라이머 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (서열 번호 7))를 사용하여 pST76-K 기재 플라스미드를 한 방향으로 시퀀싱하였다. 전방향 프라이머 (5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3' (서열 번호 8)) 또는 역방향 프로모터 (5'-TAACAATTTCACACAGGA-3' (서열 번호 9))를 사용하여 pUC18- 및 pUC19-기재 플라스미드를 두 방향으로 시퀀싱화하였다. 시퀀싱 방법의 연장 반응은 퍼킨 엘머 진앰프 (Perkin Elmer GeneAmp)(등록상표) PCR 9600 및 세퀴텀 롱-리드 시퀀싱 키트-LC (SequiTherm Long-Read Sequencing Kit-LC)(등록상표)를 사용하여 수행하였다. 그 다음, 얻은 서열은 위스콘신 제니틱 컴퓨터 그룹 (Wisconsin Genetic Computer Group)(GCG) 소프트웨어 팩키지를 사용하여 분석하였다 (Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Rev. 12:387-395).
상기 프로모터에서의 전사 개시의 시작 부위를 확인하기 위하여, 표준 기술을 이용하여 프라이머 연장 분석을 수행하였다. 특히, 프로모터 영역은 퀴아젠 (Qiagen) RNeasy (등록상표) 키트를 사용하여 후기 기하급수 생장 주기에 있는 세포로부터 단리된 celZ 유전자 RNA 내의 상응하는 프라이머 부위를 찾아 전사 개시 부위를 맵핑함으로써 확인하였다. 요약하면, 세포를 0.2M 수크로스를 함유하는 TE (트리스-HCl, EDTA) 중의 리소자임 (400 ㎍/㎖)으로 처리하고 세포용해 전에 25 ℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 유리된 RNA를 에탄올 침전시키고 이어서 프로메가 (등록상표) AMV 역전사효소 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM 스퍼마딘, 10 mM DTT) 20 ㎕에 용해시켰다. 그 후에, 엘아이-코르 인크. (LI-Cor Inc.)로부터 구입한 IRD41-표지된 프라이머 (5'-GACTGGATGGTTATCCGAATAAGAGAGAGG-3' (서열 번호 10))를 첨가하고, 샘플을 80 ℃에서 5분 동안 변성시키고, 55 ℃에서 1시간 동안 어닐링시키고 알코올 침전에 의해 정제하였다. 어닐링된 샘플을 500 μM dNTPs 및 10 유닛의 AMV 역전사효소를 함유하는 AMV 역전사효소 완충액 19 ㎕에 용해시키고, 연장을 위해 인큐베이션시켰다 (42 ℃에서 1시간). 생성물을 DNase가 없는 RNase A 0.5 ㎍/㎖로 처리하고, 침전시키고, 로딩 완충액에 용해시키고, LI-COR 모델 4000-L DNA 시퀀서를 사용하여 얻은 평행 디데옥시 프로모터 서열과 비교하였다.
폴리사카라제 활성
celZ 유전자의 발현으로 얻은 폴리사카라제 활성 (예를 들면, 글루카나제 활성)의 양을 측정하기 위하여, 콩고 레드 (Congo Red) 방법을 이용하였다 (Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-112). 특히, 선택된 클론을 격자 CMC 플레이트로 옮기고, 30 ℃에서 18시간 동안 인큐베이션한 후 염색하고, 글루카나제를 발현하는 재조합 숙주 세포는 적색 배경 위에 황색 대역을 형성하였다. 따라 서, 이들 비색 대역의 직경은 celZ 발현의 상대적 측정치로서 기록하였다.
또한, 글루카나제 활성 (EGZ)은 기질로서 카르복시메틸 셀룰로스를 사용하여 측정하였다. 이 시험에서, 무세포 배양액 브로쓰 (세포외 활성) 또는 초음파로 처리된 세포를 함유하는 브로쓰 (총 활성)의 적절한 희석액을 카르복시메틸 셀룰로스 (20 g L-1)가 함유된 50 mM 시트레이트 완충액 (pH 5.2) 중에서 35 ℃에서 분석하였다. 3-4 ㎖ 샘플의 최적 효소 방출 조건은 세포 파괴기 (Model W-220F, Heat-System-Ultrasonics Inc.; Plainview, NY)를 사용하여 전체 출력에서 각 1초 동안 4 펄스인 것으로 측정되었다. 분석의 효소 반응을 중지시키기 위해, 샘플을 비등수 조에서 10분 동안 가열하였다. 글루카나제에 의해 효소적으로 유리된 환원 당을 측정하기 위하여, 기준 물질로서 글루코스를 사용하여 디니트로살리실산 시약을 사용하였다 (Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-112). 효소 활성의 양 (IU)은 분 당 방출된 환원 당 μmols로서 또는 2회 이상의 측정치의 평균으로부터 얻은 총 활성의 백분율로서 표시하였다.
초미세구조 분석
각종 재조합 숙주 세포의 초미세구조를 확인하기 위하여, 루리아 한천 플레이트으로부터 얻은 새로운 콜로니를 0.2 M 소듐 카코딜레이트 완충액 (pH 7) 중의 2% 글루타르알데히드 중에서 고정시키고, 이어서 1% 오스뮴 테트록시드 중에서 인큐베이션시킨 후 증류수 중의 1% 우라닐 아세테이트 중에서 인큐베이션시킴으로써 분석용으로 준비하였다. 샘플을 에탄올에서 탈수시키고, 스푸르 (Spurr's) 플라스 틱에 포매시키고, 초박 단편을 제조하고 Zeiss(등록상표) EM-IOCA 전자현미경을 사용하여 조사하였다 (Spur (1969) J. Ultrastruct. Res. 26:31).
리포터 유전자로서 celZ 을 사용한 저카피 프로모터 프로브 벡터의 제작
강한 프로모터의 단리를 용이하게 하기 위해, 프로모터가 없는 celZ 유전자 바로 앞에 BamHI 부위 및 pSC101 복제기점이 있는 저카피 벡터를 제작하였다 (pLOI2171). 따라서, 프로모터가 없는 상기 플라스미드를 음성 대조구로 사용하였다. 플라스미드 pLOI1620은 celZ의 공급원으로서 사용하였고 연속되는 lac와 celZ 프로모터로부터 발현되는 pUC18 유도체이다. 이 플라스미드 내의 BamHI 부위를 분해 및 클레나우 처리에 의해 제거하였다 (pLOI2164). celZ 유전자는 클레나우 처리 후에 프로모터가 없는 NdeI 단편으로서 단리하였다. 생성되는 블런트 단편을 HindIII로 절단하여 하류 DNA를 제거하고 pUC19 (HindIII에서 HincII 방향)에 라이게이션시켜 pLOI2170을 형성하였다. 이 플라스미드에서, celZ는 lacZ 전사 방향과 반대로 배향되고 약하게만 발현되었다. celZ를 함유하는 pLOI2170로부터의 BamHI (아미노 말단)-SphI (카르복실 말단) 단편을 감온성 복제기점을 갖는 저카피 벡터인 pST76-K의 상응 부위로 클로닝시켜 pLOI2171을 형성하였다 (도 3). 이 벡터 내의 celZ의 발현은 아주 낮아서, 강한 후보 프로모터에 대한 프로브로서 용이하게 사용할 수 있다.
2 종의 이. 콜라이 당분해 프로모터 ( gap 및 eno )로부터의 celZ 발현의 분석
이. 콜라이 내의 당 분해 유전자를 유도하는 2가지의 예시적인 프로모터 (gap 및 eno)를, 글루카나제를 코딩하는 이종 celZ 유전자의 발현을 유도하는 그의 능력에 대해 조사하였다. 이. 콜라이 DH5α균주로부터의 염색체 DNA는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 gap 및 eno 프로모터 영역을 증폭시키기 위한 주형으로서 사용하였다. 각각 약 400 bp의 생성 단편을 EcoRI 및 BamHI으로 절단하고 pLOI2171 내의 프로모터 없는 celZ 유전자 앞의 대응 부위에 클로닝시켜 pLOI2174 (gap 프로모터) 및 pLOI2175 (eno 프로모터)를 생성하였다. 대조구로서, 완전한 celZ 유전자 및 천연 이. 크리산테미 프로모터를 함유하는 pLOI2164로부터의 EcoRI-SphI 단편을 pST76-K의 상응 부위에 클로닝시켜 pLOI2173을 생성하였다. 이들 세 플라스미드를 이. 콜라이 균주 B 및 DH5α에 형질전환시키고 글루카나제 활성 (EGZ)을 비교하였다. 두 이. 콜라이 균주의 경우, CMC 플레이트 상에서 글루카나제 활성은 천연 이. 크리산테미 프로모터를 함유하는 pLOI2173가 사용된 경우보다 이. 콜라이 당분해 프로모터가 사용된 경우에 더 낮았다 (표 2). 추정 활성은 각 대역의 반경의 제곱과 관련있고 (Fick's Law of diffusion), 당분해 프로모터 (pLOI2174 및 pLOI2175)에 의한 EGZ 생산은 천연 프로모터 제작물 (pLOI2373)에서 보다 33 내지 65% 더 낮은 것으로 평가되었다. 따라서, 고도의 celZ 유전자 발현을 유도하기 위한 다른 후보 프로모터를 조사하였다.
이종 유전자 발현을 위한 프로모터로서 사용하기에 적합한 랜덤 DNA 단편의 확인 및 클로닝
제트. 모빌리스로부터 유래된 랜덤 단편은 이. 콜라이에서의 이종 유전자의 고도의 발현을 위한 대리 프로모터의 효과적인 공급원일 수 있다 (Conway et al., (1987) J. Bacteriol. 169:2327-2335; Ingram et al., (1988) Appl. Environ. Micro. 54:397-404). 따라서, 에르위니아 celZ 발현을 위한 대리 프로모터를 찾기 위하여, 제트. 모빌리스 염색체 DNA를 Sau3AI로 광범위하게 절단하고 생성된 단편을 BamHI 부위에서 pLOI2171에 라이게이션시키고 이. 콜라이 DH5α로 형질전환시켜 잠재적인 후보 프로모터의 라이브러리를 만들었다. 이. 콜라이에서 celZ 유전자 발현을 유도할 수 있는 탁월한 후보 프로모터를 신속히 찾기 위하여, 하기 생물학적 스크린을 사용하였다. 다양한 랜덤 후보 프로모터를 갖는 celZ 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 격자 CMC 플레이트에 옮기고 인큐베이션 후에 글루카나제 활성에 대해 염색하였다 (표 2). 시험된 18,000개의 클론 중 대략 20%는 CMC 양성이었다. 대조구 pLOI2173 보다 더 큰 대역을 형성한 75개의 클론은 또다른 균주 이. 콜라이 B를 사용하여 더 조사하였다.
CMC 인디케이터 플레이트를 사용한 이. 콜라이에서의 celZ 발현에 대한 프로모터 강도의 평가
이. 콜라이 DH5α숙주 이. 콜라이 B 숙주
플라스미드 플라스미드의 수a CMC 대역 직경 (㎜)b 천연 프로모터의 % (100*R2 x/R2 c)c 플라스미드의 수 CMC 대역 직경 (㎜) 천연 프로모터의 % (100*R2 x/R2 c)
pLOI2171 (프로모터없음) pLOI2173 (천연 프로모터) 1 1 0 5.0 -- 100 -- 1 -- 4.5 -- 100
pLOI2174 (gap 프로모터) pLOI2175 (eno 프로모터) 1 1 4.0 3.0 77 43 1 1 3.5 2.8 60 35
제트. 모빌리스 프로모터 I군 II군 III군 5 14 56 13.0 9.0-11.0 6.0-9.0 676 324-484 144-324 4 17 54 10.8-11.3 9.0-10.5 5.0-8.8 570-625 445-545 125-375
a 활성의 범위를 나타내는 클론의 수 b 3개의 CMC 절단 대역으로부터의 직경의 평균 크기 c R2 x는 시험 플라스미드에 의한 투명 대역의 반경의 제곱: R2 c는 대조구 (pLOI2173)에 대한 투명 대역의 반경의 제곱
따라서, 선택된 후보 프로모터에 대한 프로모터 강도는 2가지의 다른 균주에서 확인하였으며, 이때 일반적으로 DH5α의 재조합체가 균주 B의 재조합체 보다 더 큰 대역 (예를 들면, 더 많은 글루카나제)를 형성하였다. 그러나, 각 숙주에서의 상대적인 프로모터 강도는 대부분의 클론에서 유사하였다. CMC 플레이트를 사용한 대역 크기에 의해 측정되는 이러한 글루카나제 생산의 분석을 기초로, 4개의 클론은 원래의 이. 크리산테미 celZ 유전자를 갖는 제작물 (pLOI2173) 보다 대략 6배 더 높은 정도로, 그리고 이. 콜라이 당분해 프로모터 중 어느 것보다 10배 더 높은 정도로 celZ를 발현시키는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 및 유사하게 강한 후보 프로모터는 추가의 연구를 위해 선별하였다.
글루카나제의 생산 및 분비
pST76-K의 플라스미드 유도체 (pLOI2177 내지 pLOI2184) 8종을 상기 스크린 으로부터 선택하고 (그룹 I 및 그룹 II (표 2) 참조) 이. 콜라이 균주 B에서의 총 글루카나제 활성에 대해 분석하였다 (표 3). CMC 플레이트 상에 최대 대역을 만드는 4개의 플라스미드도 최대 글루카나제 활성을 갖는 것으로 확인되었다 (pLOI2177, pLOI2180, pLOI2182 및 pLOI2183). 활성은 비변형된 celZ (pLOI2173)의 것 보다 대략 6배 더 높았으며, 이는 CMC 플레이트 상의 투명 대역 반경의 제곱을 사용한 본 발명자의 추정치와 잘 일치한다. 도 4는 분비 단백질을 코딩하는 out 유전자를 첨가하고 또한 첨가하지 않고 각종 다양한 프로모터를 함유하는 균주 B에 대한 시험관내 효소 분석과 CMC 플레이트 분석으로부터의 활성 추정치의 비교를 나타낸다. 약간 분산되긴 하였지만, 상대 활성을 평가하기 위한 플레이트 방법을 검증하는 직접적인 관계를 분명하게 알 수 있다. 고카피 플라스미드인 pUC18에서의 최초 제작물도 비교에 포함시켰다 (pLOI2164). 연속되는 lac와 celZ 프로모터가 있는 이 제작물은 대리 프로모터가 있는 저카피 플라스미드 (pLOI2177, pLOI2182 및 pLOI2183)보다 더 낮은 EGZ 활성을 나타내었다. 따라서, 글루카나제의 celZ 발현을 더더욱 증가시키기 위하여, celZ 및 가장 효과적인 대리 프로모터를 함유하는 DNA 단편을 pLOI2183으로부터 (EcoRI-SphI 단편으로서) 단리하고 lac 프로모터 (pLOI2307)와 반대 방향으로 전사되는 pUC19에 삽입하였다. 따라서, 상기의 강한 대리 프로모터는 고카피 플라스미드에 삽입될 때 글루카나제 활성을 2배까지 더 증가시켰다.
글루카나제 분비 증가의 조작
상기 결과를 더 개선시켜 celZ에 의해 코딩된 글루카나제의 발현을 증가시키 기 위해, 상기 숙주 세포를 분비가 증가되도록 개조하였다. 이. 크리산테미 EC16으로부터 유래된 분비 단백질을 코딩하는 유전자 (예, out 유전자)를, out 유전자를 함유하는, 히 (He et al.)의 문헌에 기재된 바와 같은 플라스미드 (pCPP2006)를 사용하여 글루카나제의 분비를 개선시키는 데 사용하였다 (He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:1079-1083). 이. 콜라이 B에서의 EGZ의 분비 증가를 조사하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
이. 콜라이 B에서의 EGZ 생산용 프로모터와 분비용 프로모터의 비교
플라스미드a 분비 유전자 없음 분비 유전자 있음 (pCPP2006)
총 활성 (IU/L)b 세포외c(%) 총 활성 (IU/L) 세포외c(%)
pLOI2173 620 17 1,100 43
pLOI2177 3,700 10 5,500 44
pLOI2178 2,200 9 3,500 49
pLOI2179 2,000 10 3,000 50
pLOI2180 2,900 8 6,300 39
pLOI2181 1,800 11 4,100 46
pLOI2182 3,500 7 6,600 38
pLOI2183 3,400 7 6,900 39
pLOI2184 2,100 12 2,400 39
pLOI2164 3,200 20 6,900 74
pLOI2307 6,600 28 13,000 60
a 플라스미드 pLOI2173 및 pLOI2164는 celZ 천연 프로모터를 함유하며; pLOI2307은 pLOI2183으로부터의 강한 프로모터를 함유한다. 플라스미드 pLOI2164 및 pLOI2307은 pUC 기재 플라스미드 (고카피수)이다. 다른 모든 플라스미드는 pST76-K의 유도체이다 (저카피수). b 글루카나제 활성은 30 ℃에서 16시간의 생장 후에 측정하였다. c 세포외 활성 (분비 또는 방출됨)
저 카피 플라스미드를 갖는 재조합 숙주는 추가의 이종 분비 단백질 (플라스미드 pCPP2006에 의해 코딩되는 out 단백질) 없이 (16시간의 생장 후) 세포외적으로 총 EGZ의 7-17% 만을 생산하였다. 동일한 프로모터를 함유하는 저 카피 pST76 기재 플라스미드보다 고카피 pUC 기재 플라스미드를 갖는 세포외 브로쓰 주위 숙주 세포에서 더 많은 비율 (20-28%)의 EGZ가 발견되었다. 그러나, 어느 경우에서든 분비 단백질을 코딩하는 out 유전자의 도입은 (예를 들면, pCPP2006) 총 발현도를 2배까지 증가시켰으며 세포외 효소의 비율을 대략 4배까지 증가시켰다 (38-74%). 7,800 IU/L이 무세포 상등액에서 발견되는, 최대 활성 13,000 IU/L의 총 글루카나제는 강한 대리 프로모터에 의해 유도되는 celZ를 코딩하는 pLOI2307 및 out 분비 단백질을 코딩하는 pCPP2006 둘 다를 갖는 균주 B에 의해 생산되었다.
특정 조건 (pH 7, 37 ℃) 하에서 순수한 EGZ 효소에 대한 비활성은 419 IU라는 것이 보고되었으며 (Py et al., (1991) Protein Engineering 4:325-333), 이러한 조건 하에서 생산된 EGZ는 상기 조건 (pH 5.2 시트레이트 완충액, 35 ℃) 하에서 보다 25% 이상 더 높은 활성을 나타내는 것으로 측정되었다. 따라서, pH 5.2 (35 ℃)에서 순수한 효소에 대해 316 IU의 비활성을 추정할 때, 이. 콜라이 B의 배양물 (pLOI2307 및 pCPP2006, 예를 들면 글루카나제 및 분비 단백질을 코딩하는 플라스미드를 함유함)은 리터 당 대략 41 mg의 활성 EGZ를 생산하거나 또는 총 숙주 세포 단백질의 4-6%가 활성 글루카나제였다.
제트. 모빌리스로부터 유래된 가장 강한 프로모터의 서열 분석
4개의 최강 대리 프로모터 (pLOI2177, pLOI2180, pLOI2182 및 pLOI2183)의 서열을 확인하였다. 이 과정을 용이하게 하기 위하여, 각각을 PstI 부위에서 pUC19와 연결시켰다. 결과 플라스미드, pLOI2196, pLOI2197, pLOI2198 및 pLOI2199를 고 카피 수로 생산하였으며 (ColEI 복제기점) M13 및 T7 시퀀싱 프라이 머를 사용하여 양 방향으로 시퀀싱할 수 있었다. 4개의 모든 플라스미드는 제트. 모빌리스 DNA의 동일한 단편을 함유하였으며 매우 유사한 플라스미드였다. 각각은 길이가 1417 bp였고 4개의 내부 Sau3AI 부위를 함유하였다. 각 단편의 DNA 및 해독된 단백질 서열 (6개의 리딩 프레임)을 현 데이타 베이스와 비교하였다. 하나의 단편 (281 bp 내부 단편) 만이 Blast 검색에서 높은 일치도를 나타내었으며 (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), 이 단편은 세포막의 생합성에 작용하는 것으로 제안된 제트. 모빌리스 hpnB 유전자의 일부와 DNA 서열이 99% 동일하였다 (Reipen et al., (1995) Microbiology 141:155-161). 프라이머 연장 분석은 celZ가 있는 Sau3AI/BamHI 접합 부위로부터 67 bp 만큼 상류에 있는 단일 메이저 개시 부위 및 이보다 더 상류에 있는 제2 마이너 개시 부위를 확인시켜주었다 (도 5). -10 및 -35 영역 내의 서열을 이. 콜라이 시그마 인자에 대한 보존 서열과 비교하였다 (Wang et al., (1989) J. Bacteriol. 180:5626-5631; Wise et al., (1996) J. Bacteriol. 178:2785-2793). 우세 프로모터 영역 (총 개시 부위의 대략 85%)은 시그마70 프로모터와 유사하고 제2 프로모터 부위는 시그마38 프로모터와 유사한 것으로 나타났다.
글루카나제를 생산하는 재조합 숙주 세포의 현미경 분석
재조합체와 모 유기체 사이의 세포 형태의 차이는 광학 현미경에 의해 거의 관찰되지 않았다. 그러나, 전자 현미경으로 작은 극성 봉입체가 다량의 글루카나 제를 발현하는 균주 B (pLOI2164)의 주변 세포질에서 분명하게 보였으며, 이 봉입체는 EGZ를 함유하는 것으로 추정되었다 (도 6). 2배 더 높은 글루카나제 활성을 나타내는 균주 B (pLOI2307)에서 봉입체는 훨씬 더 컸고 총 세포 부피의 20% 까지를 점유하였다. 이들 극성 봉입체의 큰 크기는 글루카나제 활성 측정치가 총 EGZ 생산을 과소 평가할 수 있음을 암시한다. 전형적으로, 극성 봉입체는 주변 세포질 공간으로부터의 단백질의 분비 증가를 가능하게 하는 out 분비 단백질을 코딩하는 제작물도 갖는 숙주 세포에서 더 작았다. 예상된 바와 같이, 주변 세포질 봉입체는 글루카나제를 생산하지 않는 음성 대조구 균주 B (pUC19)에서는 전혀 보이지 않았다.
실시예 2
올리고사카라이드를 에탄올로 발효시키기에 적합한 재조합 클레브시엘라 숙주
이 실시예에는, 올리고사카라이드를 해중합시키고 에탄올로 발효시키기 위한 생촉매로서 사용하기에 적합한 재조합 클레브시엘라 숙주를 기재하였다.
달리 명시하지 않으면, 다음 재료 및 방법을 이 실시예 전체에서 사용하였다.
재료 및 방법
박테리아, 플라스미드 및 배양 조건
이 예시에 사용된 균주 및 플라스미드를 하기 표 4에 요약하였다.
사용된 균주 및 플라스미드
균주/플라스미드 특성 공급원/참조문헌
균주
지모모나스 모빌리스 CP4 원영양균성 Ingram et al. (1988) Appl. Environ. Micro. 54:397-404
에세리키아 콜라이
DH5α lacZ M15 recA Bethesda Research Laboratory
HB 101 recA lacY recA ATCC 37159
클레브시엘라 옥시토카
M5A1 원영양균성 Wood et al. (1992) Appl. Environ. Micro. 58:2103-2110
P2 pfl::pdc adhB cat Wood et al. (1992) Appl. Environ. Micro. 58:2103-2110
SZ1 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ2 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ3 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ4 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ5 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ6 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ7 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ8 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ9 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
SZ10 pfl::pdc adhB cat; 삽입된 celZ;tet 본문 참조
플라스미드
pUC19 bla 클로닝 벡터 New England Biolab
pBR322 bla tet 클로닝 벡터 New England Biolab
pLOI1620 bla celZ Wood et al. (1997) Biotech. Bioeng. 55:547-555
pRK2013 kan 이동 헬퍼 플라스미드 (mob-) ATCC
pCPP2006 이. 크리산테미 EC16으로부터의 out 유전자를 함유하는 Spr, 40 kbp 단편 He et al. (1991) P.N.A.S.88:1079-1083
pST76-K 감온성 pSC101 복제기점을 함유하는 kan 저카피 벡터 Posfai et al. (1997) J. Bact. 179:4426- 4428
pLOI2164 bla celZ (pLOI1620으로부터 BamHI 제거됨) 본문 참조
pLOI2173 kan celZ (천연 celZ 프로모터 본문 참조
pLOI2177 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2178 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2179 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2180 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2181 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2182 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2183 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2184 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
균주/플라스미드 특성 공급원/참조문헌
pLOI2185 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2186 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2187 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2188 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2189 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2190 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2191 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2192 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2193 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2194 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2301 pUC19의 NdeI 부위에 삽입된 AscI 링커 본문 참조
pLOI2302 pLOI2301의 SapI 부위에 삽입된 AscI 링커 본문 참조
pLOI2303 클레나우 처리 후에 pLOI2302의 PstI 부위에 삽입된 pBR322로부터의 AvaI-EcoRI 단편 본문 참조
pLOI2305 pLOI2303의 SmaI 부위로 클로닝된 케이. 옥시토카 M5A1 게놈 DNA의 EcoRI DNA 단편 (약 2.5 kb) 본문 참조
pLOI2306 pLOI2305의 EcoRI 부위로 클로닝된 pLOI2183으로 부터의 EcoRI-SphI 단편 본문 참조
이. 콜라이 및 케이. 옥시토카 M5A1을 배양하는 데 사용되는 배양 조건은 전형적으로 리터 당 10 g 디프코 (Difco)(등록상표) 트립톤, 5 g 효모 추출물 및 5 g 염화나트륨을 함유하는 루리아-베르타니 브로쓰 (LB) 또는 별법으로 루리아 한천 (한천 15 g으로 보충된 LB)을 사용하였다 (Sambrook, et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, C.S.H.L., Cold Spring Harbor, N.Y.).
선별 조건 하에서 박테리아 콜로니를 스크리닝하기 위하여, CMC-플레이트 (카르복시메틸 셀룰로스 3 g L-1를 함유하는 루리아 한천 플레이트)을 사용하여 주어진 박테리아 균주에 의해 발현되는 글루카나제 활성도를 측정하였다 (Wood et al., (1988) Enzymology, 160:87-112). 에탄올생산성 균주를 배양하기 위하여, 글루코스를 고체 배지 (20 g L-1) 및 브로쓰 (50 g L-1)에 첨가하였다. 글루카나제 활성을 측정할 때, 생장 배지 내의 글루코스를 비환원당인 소르비톨 (50 g L-1)로 대체하였다. 전기천공에 의해 핵산을 도입하기 위한 준비시 각종 균주 또는 배양물을 배양하기 위하여, 변형된 SOS 배지 (예를 들면, 20 g L-1 디프코 (등록상표) 트립톤, 5 g L-1 디프코 (등록상표) 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2 및 50 g L-1 글루코스)를 사용하였다. 항생물질 내성 마커를 함유하는 재조합 숙주의 선별을 위해 적절할 때, 항생물질 암피실린 (50 ㎎ L-1), 스펙티노마이신 (100 ㎎ L-1), 카나마이신 (50 ㎎ L-1), 테트라사이클린 (6 또는 12 ㎎ L-1 ) 및 클로람페니콜 (40, 200 또는 600 ㎎ L-1)을 첨가하였다. 달리 명시하지 않으면, 배양액은 37 ℃에서 생장시켰다. 에탄올생산성 균주 및 감온성 pSC101 복제기점을 갖는 플라스미드를 함유하는 균주는 30 ℃에서 생장시켰다.
유전적 방법
플라스미드 제작, 클로닝 및 형질전환을 위하여, 표준 방법 및 이. 콜라이 DH5α 숙주를 사용하였다 (Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, C.S.H.L., Cold Spring Harbor, N.Y.). celZ 삽입 벡터, pLOI2306의 제작을 도 7에 나타낸 바와 같이 수행하였다. pLOI2306으로부터 얻은 복제기점이 없는 환형 DNA 단편을 하기 조건: 3.8 - 4.0 msec의 측정된 시간 상수에서 2.5 kV 및 25 μF를 사용하는 바이오-라드 진 펄서를 사용하여 에탄올생산성 케이. 옥시토카 P2 내로 전기천공시켰다 (Comaduran et al. (1998) Biotechnol. Lett. 20:489-493). pRK2013을 사용하여 이. 크리산테미 EC16 분비 시스템 (pCPP2006)을 케이. 옥시토카에 접합시켜 이동성을 부여하였다 (Murata et al. (1990) J. Bacteriol. 172:2970-2978). 소규모 및 대규모 플라스미드 단리를 각각 TELT 방법 및 프로메가 위자드 키트를 사용하여 수행하였다. 퀴아겐 (Qiagen)(등록상표)으로부터의 퀴아퀵 (Qiaquick)(등록상표) 겔 추출 키트 (Gel Extraction Kit)를 사용하여 겔로부터 DNA 단편을 단리하였다. 케이. 옥시토카 M5A1 및 제트. 모빌리스 CP4로부터의 염색체 DNA를 커팅과 요마노의 문헌에 기재된 바와 같이 단리하였다 (실시예 1 참조). 원하는 DNAs를 LI-COR 모델 4000-L DNA 시퀀서를 사용하여 시퀀싱하였다 (Wood et al. (1997) Biotech. Bioeng. 55:547-555).
celZ 의 염색체 삽입
celZ의 염색체 삽입을 위해 이. 콜라이에 대해 이미 기재된 방법 (Hamilton et al., (1989) J. Bacteriol. 171:4617-4622)을 이용한 온도 조절 플라스미드 (pLOI2183)에 의한 선별, 및 기능적 복제기점이 없는 환형 DNA 단편의 직접적 삽입을 이용하는 2가지 방법을 이용하였다. 이 동일한 방법을 이. 콜라이 B (Ohta K. et al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900) 및 케이. 옥시토카 M5A1 (Wood et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 57:2103-2110)에서의 에탄올 경로를 코딩하는 제트. 모빌리스 유전자의 염색체 삽입에 사용하였다. 전형적으로, 환 형 DNA를 바이오-라드 진 펄서를 사용하여 전기천공에 의해 P2로 형질전환시켰다. 다음에, 형질전환체를 테트라사이클린 (6 ㎎ L-1)을 함유하는 고체 배지 상에서 선별하고 CMC 플레이트 상에서 생장시켜 글루카나제 활성도를 측정하였다.
글루카나제 활성
다양한 시험 프로모터의 조절 하에 celZ 유전자 생성물 (즉, 글루카나제)의 발현에 의한 글루카나제 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 CMC 플레이트를 염색하여 평가하였다. 이 비색 분석 결과 글루카나제 활성을 나타내는 황색 대역이 형성되었고 대역의 직경을 celZ 폴리펩티드 발현의 상대적 측정치로서 사용하였다. 황색의 최대 대역을 나타낸 클론을 기질로서 카르복시메틸 셀룰로스 (50 mM 시트레이트 완충액, pH 5.2에 용해된 20 g L-1)를 사용하여 35 ℃에서의 글루카나제 활성에 대해 더 평가하였다 (Wood et al. (1988) Methods in Enzymology 160:87-112). 세포내 글루카나제의 양을 측정하기 위하여, 4초 동안 초음파 (모델 W-290F 세포 파괴기, Heat System-Ultrasonics.; Plainview, NY)로 처리하여 배양물로부터 효소 활성을 방출시켰다. 발현된 글루카나제 활성의 양을 측정하고, 본 명세서에서 분 당 μmol (IU)의 방출된 환원당으로서 나타내었다. 환원당은 글루코스 표준물을 사용하여 문헌 (Wood et al. (1988) Methods in Enzymology 160:87-112)에 기재된 바와 같이 측정하였다.
기질 해중합
추가로, 각종 숙주 세포에 의해 나타나는 글루카나제 활성의 양을 측정하기 위하여, 다양한 탄수화물 기질 (50 mM 시트레이트 완충액, pH 5.2에 현탁된 20 g L-1)을 각종 세포 추출물과 함께 인큐베이션시켰다. 한 예에서, 산 팽윤된 및 볼밀 분쇄된 셀룰로스를 포함하는 시험 기질을 우드의 문헌 (Wood et al. (1998) Methods in Enzymology 160:87-112)에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다. 전형적인 폴리사카라제 추출물 (즉, 케이. 옥시토카 SZ6 (pCPP2006)으로부터의 EGZ (글루카나제))은 비환원당인 소르비톨로 보충된 LB에서 30 ℃에서 16시간 동안 상기 숙주 세포를 배양함으로써 제조하였다. 무세포 브로쓰의 희석액을 기질에 첨가하고 35 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션시켰다. 몇 방울의 클로로포름을 첨가하여 인큐베이션 중에 우발적인 오염물의 생장을 억제하였다. 샘플을 인큐베이션 전과 후에 제거하여 DNS 방법에 의해 환원당을 측정하였다 (Wood et al. (1988) Methods in Enzymology 160:87-112 참조). 중합도 (DP)는 중합체에 존재하는 총 계산된 당 잔기를 환원 말단의 수로 나눔으로써 평가하였다.
발효 조건
탄수화물 50 g L-1로 보충된 루리아 브로쓰 100 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 플라스크에서 발효를 수행하였다. 시험 탄수화물을 따로 멸균시키고 냉각 후에 첨가하였다. 기질 변화를 최소화하기 위하여, 산 팽윤 셀룰로스, 볼밀 분쇄 셀룰로스 및 크실란은 고온고압멸균하지 않았다. 항생물질 클로람페니콜 (200 ㎎ L-1)을 첨가하여 오염 유기체의 생장을 억제하였다. 플라스크를 24시간 브로쓰 배양액 (50 g L-1 글루코스)으로 접종시키고 (10% v/v) 24 내지 96시간 동안 교반시키면서 (100 rpm) 35 ℃에서 인큐베이션시켰다. 배양물을 모니터하기 위하여, 샘플을 날마다 얻어 가스 크로마토그래피에 의해 에탄올 농도를 측정하였다 (Dombek et al. (1986) Appl. Environ. Microbiol. 52:975-981).
대리 프로모터의 단리 및 확인 방법
클레브시엘라 및 다른 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 위한 대리 프로모터로서 작용하는 제트. 모빌리스의 랜덤 단편을 찾기 위하여, 후보 프로모터의 효율적인 클로닝을 위한 벡터를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제작하였다 (Ingram et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:397-404 참조).
다음에, Sau3AI으로 절단된 제트. 모빌리스 DNA 단편을 pLOI2171의 BamHI 부위에 라이게이션시켜 잠재적 프로모터의 라이브러리를 형성하였다. 이 플라스미드를 초기 스크리닝을 위해 이. 콜라이 DH5α내로 형질전환시켰다. CMC 플레이트 상에서 개별적으로 시험된 18,000개의 콜로니 중에서, 75개의 클론은 대조구 (pLOI2173)보다 더 큰 황색 대역을 형성하였다. 그 후에, 이러한 75개의 클론으로부터의 플라스미드를 케이. 옥시토카 M5A1 내로 형질전환시키고, 다시 시험하여 제2의 숙주에서 celZ이 고도로 발현된다는 것을 밝혀냈다.
폴리사카라제를 생산하기 위한 재조합 클레브시엘라 숙주
celZ 발현을 나타내는 CMC 플레이트 상의 최대 대역을 형성한 고발현 클론 (pLOI2177 내지 pLOI2194)을 LB 브로쓰에서 생장시키고 글루카나제 활성에 대해 분석하였다 (표 5).
케이. 옥시토카 M5A1에서의celZ 발현 및 분비를 위한 프로모터의 평가
플라스미드a 분비 유전자 없음 분비 유전자 있음 (pCPP2006)
총 활성(IU L-1)b 분비된 활성(IU L-1) 총 활성(IU L-1) 분비된 활성(IU L-1)
pLOI2173 2,450 465 3,190 1,530
pLOI2177 19,700 3,150 32,500 13,300
pLOI2178 15,500 2,320 21,300 11,500
pLOI2179 15,400 2,310 21,400 12,000
pLOI2180 21,400 3,210 30,800 13,600
pLOI2181 15,600 2,490 21,000 11,800
pLOI2182 19,600 3,130 31,100 14,000
pLOI2183 20,700 3,320 32,000 14,000
pLOI2184 15,500 2,480 21,200 11,900
pLOI2185 15,100 2,420 24,600 11,500
pLOI2186 17,000 2,380 25,700 13,400
pLOI2187 15,800 2,210 24,500 12,200
pLOI2188 18,200 2,180 25,600 12,000
pLOI2189 14,800 2,360 27,100 12,700
pLOI2190 16,100 2,410 26,500 12,500
pLOI2191 15,800 2,210 25,000 12,400
pLOI2192 15,100 1,810 24,900 12,500
pLOI2193 16,700 2,010 24,600 12,800
pLOI2194 15,400 2,770 21,500 11,900
a pLOI2173은 천연 프로모터가 있는 celZ 유전자를 함유하며, 나머지는 대리 프로모터로서 작용하는 제트. 모빌리스 DNA 단편이 있는 celZ 유전자를 함유한다. b 글루카나제 (CMCase) 활성은 30 ℃에서 16시간의 생장 후에 측정하였다.
이들 플라스미드가 갖는 천연 celZ 프로모터를 함유하는 대조구 플라스미드 (pLOI2173)가 갖는 활성보다 8배 까지 더 높았다. 최대 대역을 형성한 4개의 플라스미드 (pLOI2177, pLOI2180, pLOI2182 및 pLOI2183) 또한 최대 총 글루카나제 활성 (약 30,000 IU L-1)을 나타내었다. 이들 플라스미드 중 하나인 pLOI2183을 염색체 삽입을 위해 선택하였다.
폴리사카라제 유전자의 염색체 삽입
원하는 폴리사카라제 유전자를 적합한 숙주 세포, 예를 들면 클레브시엘라 P2 균주로 안정하게 도입하기 위하여, 모든 복제 기능은 없지만 삽입을 위한 상동 성 DNA 단편, 대리 프로모터가 있는 celZ 유전자 및 선별 마커를 함유하는 DNA 단편의 단리가 용이하도록 신규 벡터 (pLOI2306)를 제작하였다 (도 7). 폴리링커 영역을 플랭킹하는, 클레나우 처리된 NdeI 및 SapI 부위에 링커 (GGCGCGCC; 서열 번호 11)를 삽입하여 두 개의 AscI 부위를 pUC19에 도입함으로써 pLOI2302를 생성하였다. pBR322로부터의 tet 내성 마커 유전자를 함유하는 평체 단편 (EcoRI 및 AvaI에 의한 절단에 이어서 클레나우 처리)을 pLOI2302의 PstI 부위 (PstI에 의한 절단에 이어서 클레나우 처리)에 클로닝하여 pLOI2303을 생성하였다. 이 플라스미드 pLOI2303의 SmaI 부위에 케이. 옥시토카 M5A1 염색체 DNA의 블런트 단편 (EcoRI로 절단하고 클레나우 처리로 블런트 말단을 만듬)을 라이게이션시켜 pLOI2305를 생성하였다. pLOI2183으로부터의 celZ 유전자 및 대리 제트. 모빌리스 프로모터를 함유하는 EcoRI-SphI 단편 (클레나우 처리됨)을 pLOI2305의 EcoRI 부위 (EcoRI, 클레나우 처리)에 라이게인션시켜 pLOI2306을 생성하였다. AscI에 의한 pLOI2306의 절단은 두 개의 단편을 생성하였으며, 그 중 더 큰 것은 대리 프로모터가 있는 celZ 유전자, tet 유전자 및 상동성 재조합을 위한 염색체 DNA 단편을 함유하였다. 이보다 더 큰 단편 (10 kbp)을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고, 자기 라이게이션시켜 환형화하고, 클레브시엘라 균주 P2 내로 전기천공시킨 후 테트라사이클린 내성에 대한 선별 조건 하에 생장시켰다. 형성된 21개의 테트라사이클린 내성 콜로니를 정제하고 글루카나제 활성에 대해 CMC 플레이트 상에서 시험하였다. 모든 것은 양성이었으며, 그 중 큰 대역은 celZ 유전자 생성물의 기능적 발현을 나타낸다.
DH5α를 플라스미드 DNA 시료로 형질전환시키고 겔 전기영동에 의해 분리하여 재조합 균주를 생산하는 데 사용되는 클론을 원치않는 플라스미드의 존재에 대해 시험하였다. 시험된 12개의 클론으로부터 어떠한 형질전환체도 얻어지지 않았다. 그러나, 이들 균주 중 2개는 celZ를 함유할 수 있는 큰 플라스미드 밴드를 함유하는 것으로 발견되었으며 이들은 폐기되었다. 큰 플라스미드를 갖는 두 균주는 T7 및 M13 프라이머로 시퀀싱될 수 있는 DNA를 함유하였으며, 이는 다중카피 플라스미드의 존재를 확인시켜 주는 것이다. 남은 10개의 균주는 삽입된 celZ 유전자를 함유하며 어느 프라이머로도 시퀀싱할 수 없었다.
새로운 벡터 pLOI2306의 구조적 특징은 도 8에 개략적으로 나타나 있으며, 각종 코딩 영역 (즉, 유전자 celZ, bla 및 tet의 코딩 영역)을 포함하는 벡터의 뉴클레오티드 서열은 서열 목록의 서열 번호 12에 기재되어 있다. celZ 유전자 (이. 크리산테미로부터 얻음)의 비코딩 서열 하류를 나타내는 뉴클레오티드 염기쌍 3282-4281, 및 케이. 옥시토카 M5A1로부터 얻은 비코딩 표적 서열의 일부를 나타내는 염기쌍 9476-11544는 표준 기술을 이용하여 시퀀싱하기 위해 남겨두었다 (Sambrook, J. et al., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)). 예를 들면, pLOI2306 플라스미드 중 시퀀싱되지 않은 상기 영역들 중 어느 하나 위에 있는 충분한 플랭킹 서열을 제공하여 이들 공지된 서열에 상응하는 시퀀싱 프라이머를 합성하고 주형으로서 pLOI2306 플라스미드를 사용하여 표준 시퀀싱 반응을 수행하는 데 사용할 수 있다.
별법으로, 시퀀싱되지 않은 이들 영역은 주형으로서 사용하기 위한 pLOI2306 플라스미드의 부재하에서도 확인될 수 있음을 당 업계의 숙련인은 이해할 것이다. 예를 들어, 남아있는 celZ 서열은 이. 크리산테미 서열을 포함하는 라이브러리로부터 celZ 함유 클론을 단리하기 위한 프로브, 및 단리된 클론을 표준 DNA 시퀀싱 반응을 사용하여 시퀀싱하기 위한 프라이머를 합성하기 위해 본 명세서에 제공된 서열 (예를 들면, 서열 번호 12의 뉴클레오티드 1452-2735)을 이용하여 확인할 수 있다. 마찬가지로, 남아있는 표적 서열은 각각 케이. 옥시토카 M5A1 EcoRI 단편 (예를 들면, 적절한 크기의 것)을 포함하는 라이브러리로부터 표적 서열을 함유하는 클론을 단리하기 위한 프로브, 및 단리된 클론을 표준 DNA 시퀀싱 반응을 사용하여 시퀀싱하기 위한 프라이머를 합성하기 위해 본 명세서에 제공된 서열 (예를 들면, 서열 번호 12의 뉴클레오티드 8426-9475)을 이용하여 확인할 수 있다 (케이. 옥시토카 M5A1의 공급원은 표준 기술을 이용하여 임의의 플라스미드가 없는 회복된 ATCC 68564일 것임). 당 업계의 숙련인은 또한 박테리아의 cDNA 또는 게놈 서열을 나타내는 라이브러리의 제조, 및 이러한 라이브러리 (예를 들면, cDNA 또는 게놈 라이브러리)로부터의 원하는 핵산 단편을 단리하는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 혼성화 기술 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 통상적으로 수행되며 이들 모든 기술이 당 업계에서 일반적이라는 것을 인식할 것이다 (Sambrook, J. et al., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Ed. 1984); and PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor) 참조).
대리 프로모터 및 삽입된 또는 플라스미드 기재 제작물을 사용한 이종 유전자의 발현
10 종의 삽입 균주 (SZ1-SZ10)를 LB 소르비톨 브로쓰에서의 글루카나제 생산에 대해 조사하였다 (표 6). 모두가 5,000-7,000 IUL-1의 활성 효소를 생산하였다. 이는 본래의 celZ 프로모터를 함유하는 플라스미드 pLOI2173으로부터 발현된 활성의 2배를 나타내지만, 삽입된 균주는 제트. 모빌리스의 동일한 대리 프로모터를 함유하는 P2 (pLOI2183)에 의해 얻어지는 글루카나제 활성의 1/3만을 나타내었다 (표 5). 삽입시 글루카나제 발현의 감소는 카피 수의 감소에 의한 것일 수 있다 (즉, 다중 카피 플라스미드 대 단일 삽입된 카피).
글루카나제 EGZ의 분비
케이. 옥시토카는 에르위니아 크리산테미에서 펙테이트 리아제 및 글루카나제 (EGZ)를 분비하는 out 유전자에 의해 코딩된 분비 시스템과 유사한, 플루라나제 분비를 위한 천연 타입 II 분비 시스템 (Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-108)을 함유한다 (Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-108) (Barras et al. (1994) Annu. Rev. Phytopathol. 32:201-234; He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 1079-1083). 타입 II 분비 시스템은 전형적으로 매우 특이적이고 이종 단백질의 경우에는 잘 작동되지 않는다 (He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 1079-1083; Py et al. (1991) FEMS Microbiol. Lett. 79:315-322; Sauvonnet et al. (1996) Mol. Microbiol. 22:1-7). 따라서, 예상된 바와 같이, 재조합 celZ는 숙주로서 M5A1 (표 5) 또는 P2 (표 6)를 사용한 세포 결합 생성물로서 주로 발현되었다. 총 재조합 EGZ 활성의 약 1/4 (12-26%)이 브로쓰에서 회수되었다. 이. 콜라이 DH5α의 경우, 총 세포외 EGZ의 약 8-12%가 존재하였다. 따라서, 케이. 옥시토카에서의 천연 분비 시스템은 재조합 EGZ의 부분 분비를 용이하게 할 수 있다.
목적하는 생성물의 분비를 더 개선시키기 위하여, 이. 크리산테미 EC16으로부터의 타입 II 분비 유전자 (out 유전자)를 도입하여 (예를 들면, pCPP2006을 사용함) 케이. 옥시토카의 에탄올생산성 균주에서 균주 P86021로부터 얻은 재조합 EGZ의 분비를 용이하게 하였다. celZ를 갖는 플라스미드를 함유하는 대부분의 균주의 경우, out 유전자의 추가는 세포외 EGZ를 5배 증가시키고 총 글루카나제 활성을 2배 증가시켰다. 삽입된 celZ를 갖는 균주의 경우, out 유전자의 추가는 세포외 EGZ를 10배 증가시키고 총 글루카나제 활성을 4배 증가시켰다. 둘 다의 경우에서, out 유전자는 총 글루카나제 활성의 대략 절반의 분비만을 용이하게 하였다. out 유전자의 추가에 의해 이루어지는 EGZ 활성의 증가는 플라스미드 및 삽입된 celZ 제작물에서 분비된 생성물의 폴딩을 개선시킬 수 있다. pUC 기재 유도체의 경우 관찰되는 보다 적은 증가는 플라스미드 적재, 및 고카피 플라스미드 상의 bla 유전자로부터 주변 세포질 β-락타마제가 생산되는 과정 동안 분비 수단에 대한 경쟁에 기인한 것일 수 있다.
가장 잘 삽입된 균주 P2를 확인하기 위해 두 가지 기준, 즉 고농도의 클로람페니콜 (고도의 상류 pdc 및 adhB 유전자의 발현을 위한 마커)을 함유하는 고체 배지 상에서의 생장 및 out 유전자에 의한 글루카나제의 효과적인 분비를 이용하였다. 추가의 연구를 위해 2종의 재조합 균주, SZ2 및 SZ6을 선별하였다. 두 가지 모두 총 세포 단백질의 약 5%에 상응하는 24,000 IU-1의 글루카나제 활성을 나타내었다 (Py et al. (1991) Protein Engin. 4:325-333).
기질 해중합
재조합 EGZ의 기질 해중합은 CMC 공급원에 적용될 때 우수한 것으로 확인되었다 (표 7). 산 팽윤 셀룰로스에 적용될 때, 글루카나제의 활성은 CMC 활성에 대해 측정된 활성의 10% 미만이었다. 폴리사카라제가 아비셀 (등록상표) 또는 크실란에 적용될 때, 활성은 거의 관찰되지 않았다. 그러나, 밤새 분해되도록 두었을 때, EGZ 폴리사카라제는 모든 기질에 대해 평균 중합체 길이의 측정가능한 감소가 일어나게 하였다. CMC 및 산 팽윤 셀룰로스는 7개의 당 잔기로 된 평균 길이로 해중합되었다. 이들 7개의 당 잔기로 된 셀룰로스 중합체는 약한 가용성을 나타내며, 이상적으로는 효율적인 대사를 위해 더 분해시킬 수 있다 (Wood et al. (1992) Appl Environ. Microbiol. 58:2103-2110). 볼밀 분쇄 셀룰로스 및 아비셀의 평균 사슬 길이는 원래 길이의 ⅓로 감소되었고, 크실란 중합체 당 단일 절단 미만이 관 찰되었다.
삽입된celZ를 함유하는 에탄올생산성 케이. 옥시토카로부터의 배양 생장, 글루카나제 생산 및 분비의 비교
균주 고체 배지 상에서의 성장 (600 ㎎ L-1 CM) 글루카나제 생산 및 분비 (IU L-1)
분비 시스템 없음 분비 시스템 추가 (pCPP2006)
총 활성 분비된 활성 총 활성 분비된 활성
P2 ++++ 0 0 0 0
SZ1 ++ 6,140 1,600 26,100 14,300
SZ2 ++++ 6,460 1,160 23,700 11,400
SZ3 +++ 5,260 1,320 18,400 8,440
SZ4 +++ 7,120 1,070 23,200 9,990
SZ5 + 6,000 1,080 29,300 15,500
SZ6 ++++ 7,620 1,520 24,300 11,900
SZ7 + 6,650 1,330 28,800 15,500
SZ8 +++ 7,120 854 28,700 14,900
SZ9 ++ 7,530 1,130 26,700 12,800
SZ10 +++ 4,940 939 17,000 6,600
글루카나제 (CMCase) 활성은 30 ℃에서 16시간의 생장 후 측정하였다.
균주 SZ6 (pCPP2006)의 무세포 브로쓰로부터의 EGZ에 의한 각종 기질의 해중합
기질 효소 활성 (IU/L) 평가된 중합도
분해 전 분해 후
카르복시메틸 셀룰로스 13,175 224 7
산 팽윤 셀룰로스 893 87 7
볼밀 분쇄 셀룰로스 200 97 28
아비셀 41 104 35
오트 스펠츠로부터의 크실란 157 110 78
균주 SZ6 (pCPP2006)은 분비된 EGZ의 공급원으로서 16시간 동안 LB-소르비톨 브로쓰에서 생장하였다.
생촉매의 당화 및 발효 능력
균주 P2에 도입된 celZ 및 out 유전자는 형성된 생체 촉매의 발효 능력을 감소시키지 않아야 유용하게 사용될 수 있다. 글루코스 및 셀로비오스를 사용하여 비교를 수행하였다 (표 8). 모든 균주는 이들 당을 발효시키는 능력 면에서 동등하였으며, 이는 celZ의 삽입 또는 pCPP2006의 도입이 해로운 효과를 나타내지 않음을 의미한다. 또한, 이들 균주는 산 팽윤 셀룰로스를 에탄올로 직접 전환시키는 능력에 대해 조사하였다. 활성이 가장 높은 제작물 SZ6 (pCPP2006)은 비결정질 셀룰로스로부터 소량 (3.9 g L-1)의 에탄올을 생산하였다. 모든 균주의 접종시에 초기에는 대략 1.5 g L-1의 에탄올이 존재하였다. 이것은 SZ6 (pCPP2006)을 제외하고는 모든 균주의 경우에 시간에 따라 0까지 감소되었다. 따라서, SZ6 (pCPP2006)에서 관찰된 3.9 g L-1의 에탄올 생산은 총 에탄올 생산의 과소평가를 나타낼 수 있다. 그러나, 이는 기껏해야 존재하는 중합체의 일부 만의 전환을 나타낸다. 산 팽윤 셀룰로스의 EGZ 가수분해에 의해 저농도의 글루코스, 셀로비오스 및 셀로트리오스가 생산되고 발효되는 것으로 생각된다. 이 화합물은 케이. 옥시토카에서 천연 포스포에놀피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템에 의해 대사될 수 있다 (Ohta K et al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900; Wood et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110).
각종 기질 (50 g L-1)을 사용하는,out 유전자 및 삽입된celZ를 함유하는 균주 SZ6 (pCPP2006)에 의한 에탄올 생산
균주 에탄올 생산 (g L-1)
글루코스 셀로비오스 산 팽윤된 셀룰로스
P2 22.9 22.7 0
P2 (pCPP2006) 22.6 21.3 0
SZ6 21.5 19.7 0
SZ6 (pCPP2006) 22.7 21.2 3.9
접종 시의 초기 에탄올 농도는 모든 배양물의 경우 약 1.5 g L-1이었다. 기질로서 산 팽윤 셀룰로스를 사용한 경우, 이 농도는 SZ6 (pCPP2006)을 제외한 모든 균주에 대해 72시간의 접종 후에 0까지 감소하였다.
실시예 3
에르위니아 크리산테미 ( Erwinia chrysanthemi )로부터의 2가지 엔도글루카나제 (EGZ 및 EGY)에 의한 카르복시메틸 셀룰로스 및 산-팽윤 셀룰로스의 상승적 가수분해
이 실시예는 재조합 이. 콜라이에 의한 엔도글루카나제 EGY 및 EGZ의 생산 및 이들 엔도글루카나제에 의한 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC) 및 산-팽윤 셀룰로스의 상승적 가수분해를 기술한다.
이 실시예에서, 달리 명시하지 않는 한 하기 재료 및 방법을 사용한다.
재료 및 방법
박테리아, 플라스미드 및 배양 조건
이 연구에 사용된 박테리아 종 및 플라스미드는 하기 표 9에 기재되어 있다.
사용된 종 및 플라스미드
종/플라스미드 설명 참고문헌/공급원
종
에세리키아 콜라이
DH5α lacZ M15 recA Bethesda Research Laboratory
B 독립영양성 (Prototrophic) ATCC11303
HB101 recA lacY recA ATCC37159
TOP10F' 이 종은 F 에피좀으로부터의lac 리프레서 (lacIq 유전자)를 발현시킨다 Invitrogen
플라스미드
pCR2.1-TOPO TOPO(등록상표) TA 클로닝 벡터, Apr, Kmr Invitrogen
pRK2013 Kmr 이동성 헬퍼 플라스미드 (mob +) ATCC
pCPP2006 이. 크리산테미 (E. chrysanthemi) EC16으로부터의 완전한out 유전자를 운반하는 Spr, 약 40 kbp 플라스미드 He, et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:1079-1083
pLOI1620 이. 크리산테미 P86021로부터의 Apr,celZ 유전자 및 그의 네가티브 프로모터 Beall, et al. (1993) J. Indust. Microbiol. 11:151-155
pMH18 이. 크리산테미 3937로부터의 Apr,celY 유전자 및 그의 네가티브 프로모터 Guiseppi, et al (1991) Gene 106:109-114
pLOI2311 pCR2.1-TOPO 벡터내에 클로닝되고lac 프로모터로부터의 발현을 위해 배향된celY 유전자 (네가티브 프로머터 없음) 텍스트 참조

플라스미드 제조를 위한 숙주로서 에세리키아 콜라이 DH5α및 TOPO10F'를 사용하였다. celZ 유전자를 이. 크리산테미 P86021으로부터 클로닝하였다 (Beall, et al. (1993) J. Indust. Microbiol. 11:151-155). celY 유전자를 문헌 (Guiseppi et al. (1991) Gene 106:109-114)에 따라 이. 크리산테미 3937로부터 클로닝하였다. out 유전자를 문헌 (He et al. (1991) Proc. Acad. Sci. USA 88:1079-1083)에 따라 이. 크리산테미 EC16으로부터 클로닝하였다.
이. 콜라이 배양물을 37 ℃에서 리터 당 디프코 (Difco, 등록상표) 트립톤 10 g, 디프코 (등록상표) 효모 추출물 5 g, 및 염화나트륨 5 g을 포함하는 루리아 베르타니 브로쓰 (LB) 중에서 또는 아가 (1.5％)를 포함하는 고상 LB 배지에서 배양하였다. 콩고 레드 방법 (Wood, et al. (1989) Biochem. J. 260:37-43)을 이용하여 엔도글루카나제 생산에 대하여 클론을 스크리닝하였다. 낮은 점도의 CMC (0.3％)를 포함하는 LB 아가를 보충하여 지표 플레이트를 제조하였다. 선별을 위해 암피실린 (50 ㎍/ml), 카나마이신 (50 ㎍/ml) 및 스펙티노마이신 (100 ㎍/ml)을 적절히 첨가하였다.
유전적 방법
플라스미드 제조 및 분석을 위해 표준 방법을 이용하였다 (Ausubel, et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons, Inc). 프라이머 쌍으로 N-말단 5'CTGTTCCGTTACCAACAC3' (서열 13), C-말단 5'GTGAATGGGATCACGAGT3' (서열 14)과 함께 주형으로서 pMH18을 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 celY의 코딩 영역을 증폭시켰다. 이동을 위해 pRK2013을 사용하여 컨쥬게이션으로 이. 크리산테미 out 유전자 (pCPP2006)를 전달하였다 (Zhou, et al. (1999) B. Appl. Environ. Microbiol. 65:2439-2445). LI-COR 모델 4000-L DNA 서열분석기 및 형광성 프라이머를 사용하여 디데옥시 방법에 의해 DNA를 시퀀싱하였다.
효소 분석
기질로서 CMC를 사용하여 시험관내에서 엔도글루카나제 활성을 결정하였다. 세포-무함유 배양 브로쓰 (세포외 활성) 또는 초음파에 의해 파열된 세포를 함유하는 브로쓰 (총 활성)의 적절한 희석물을 35 ℃에서 낮은 점도의 CMC (리터 당 20 g)를 포함하는 50 mM 시트르산 완충액 (pH 5.2) 중에서 분석하였다. 끓는 물의 조에서 10분 동안 가열하여 반응을 종결시켰다. 표준물로서 글루코스와 함께 3,5-디니트로살리실산 시약을 사용하여 환원당을 측정하였다 (Wood, et al. (1988) Methods Enzymology 160:87-112). 효소 활성 (CMCase)은 분당 방출된 환원당 (IU)의 μmol로서 표현되었다. 결과는 2회 이상의 측정치의 평균이다.
상승작용
DH5α(pLOI1620 + pCPP2006) 및 DH5α(pLOI2311)의 정체기 배양물을 초음파처리하고, 각각 EGZ 및 EGY의 공급원으로서 문헌 (Zhou, et al. (1999), supra)에 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 필요에 따라 이들을 희석하여 동등한 CMCase 활성을 제공하였다. EGZ와 EGY의 혼합물을 35 ℃에서 CMC (20 g/L) 또는 산-팽윤 셀룰로스 (리터 당 20 g)를 포함하는 50 mM 시트르산 완충액 (pH 5.2) 중에서 상승작용에 대하여 시험하였다. 아비셀 (Avicel, 등록상표) (리터 당 20 g)을 사용하는 시험의 경우, 효소 제제를 미리 희석하지 않고 혼합하였다. 산-팽윤 셀룰로스 및 아비셀 (등록상표)의 가수분해된 샘플을 원심분리 (10,000 ×g, 5 분)하여 불용성 물질을 제거한 다음, 환원당을 측정하였다.
EGZ 및 EGY를 순차적으로 첨가한 효과를 또한 조사하였다. 단일 효소를 사용하여 4시간 동안 기질을 가수분해하고, 이어서 20분 동안 비등시켜 실활화하였다. 냉각 후에, 두번째 효소를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 두가지 효소를 함께 (4시간), 그리고 각 효소를 단독으로 (4시간) 사용하여 대조 실험을 수행하였다. 환원당에 대하여 샘플을 분석하였다. 몇몇 경우, 박막 크로 마토그래피에 의해 생성물을 분석하였다.
관찰된 효소 활성을 EGY 단독 및 EGZ 단독으로부터의 예상 기여도의 합으로 나누어 효소 혼합물에 대한 상승작용의 정도를 계산하였다 (Riedel, et al. (1997) FEMS Microbiol. Lett. 147:239-243).
셀로올리고사카라이드의 가수분해
셀로비오스, 셀로트리오스, 셀로테트라오스, 셀로펜타오스, 산-팽윤 셀룰로스 (Wood, et al. (1988), supra) 및 아비셀 (등록상표)로부터의 가수분해 생성물을 박막 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 이들 분석에서, 1％ 기질 15 ㎕를 조 효소 (0.07 IU) 45 ㎕와 함께 혼합하고, 35 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 끓는 물의 조에서 가열하여 종결시켰다. 가수분해물을 왓맨 (Whatman) 250 ㎛ 실리카-겔 150A 플레이트상에 스폿팅하고, 문헌 (Kim, (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61:959-965)에 기재된 용매계를 사용하여 대략 4시간 동안 전개시켰다. 부피로서, 이 용매는 클로로포름 6부, 아세트산 7부 및 물 1부를 포함하였다. 6.5 mM N-(1-나프틸)에틸렌디아민 디하이드로클로라이드를 분부하고, 100 ℃에서 대략 10분 동안 가열하여 당을 시각화하였다 (Bounias, (1980) Anal. Biochem. 106:291-295).
재료 및 화학물질
트립톤 및 효모 추출물은 디프코 (Detroit, Michigan)사 제품이다. 항생제, 낮은 점도의 CMC, 셀로비오스, 셀로트리오스 및 셀로테트라오스는 시그마 케미칼 컴퍼니 (St. Louis, Missouri)사로부터 입수하였다. 셀로펜타오스는 V-Lab (Covington, Louisiana)으로부터 입수하였다. 아비셀 (등록상표)은 플루카 케미카 (Fluka Chemika; Buchs, Switzerland)사로부터 구입하였다.
재조합 이. 콜라이에 의한 EGY 및 EGZ의 생산
천연 이. 크리산테미 3937 및 플라스미드 pMH18을 보유하는 재조합 이. 콜라이에 의해 낮은 수준의 EGY 활성을 생성하였다 (Boyer, et al. (1987) Eur. J Biochem. 162:311-316; Guiseppi, et al., supra). 이. 콜라이에서 높은 카피수의 플라스미드로부터의 적은 발현은 프로모터 기능 및 celY 활성자 단백질에 대한 추정의 요건으로 인한 것이었다 (Guiseppi, et al., supra). 상승작용에 대한 조사를 위해 더 높은 수준의 EGY를 생산하는 새로운 클론을 제조하였다. 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 EGY 코딩 영역 (프로모터 없음)을 증폭시키고, pCR2.1-TOPO에서 lac 프로모터 뒤쪽에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드인 pLOI2311은 CMCase 지표 플레이트상에서 강한 양성을 나타내었다. 천연 프로모터를 lac 프로모터로 대체한 결과, celY 발현이 165 IU/L에서 1800 IU/L까지 대략 10배 증가하였다 (하기 표 10 참조).
이. 콜라이 DH5α에서celY 및 celZ의 발현 및 분비에 대한 이. 크리산테미out 유전자의 효과
out 유전자 부재 out 유전자 존재 (pCCP2006)
발현된 효소 프로모터 배양 (시간) 세포외 CMCasea (리터 당 IU) 총 CMCase (리터 당 IU) 겉보기 분비 (％) 세포외 CMCasea (리터 당 IU) 총 CMCase (리터 당 IU) 겉보기 분비 (％)
EGY 천연 프로모터 (pMH18) 24 136 165 82 136 180 76
lac 프로모터 (pLOI2311) 8 208 266 78 ndb Nd nd
16 1,420 1,590 90 nd Nd nd
24 1,650 1,800 90 1,360 1,510 90
EGZ 천연 +lac 프로모터 (pLOI1620) 8 130 1,320 10 6,710 74,600 90
16 1,200 9,030 13 13,400 19,700 68
24 1,800 12,500 14 23,600 36,800 64
a 배양 상청액에서 분비 또는 방출된 CMCase 활성 b 약자: nd, 측정되지 않음

세포외 환경에서 대략 90％의 EGY 활성이 나타났다. celZ의 발현은 비교를 위해 포함시켰다 (표 10 참조). 플라스미드 pLOI1620을 보유하는 이. 콜라이에 의해 높은 수준의 EGZ가 생성되었다. 문헌 (Zhou, et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2439-2445)에 이미 보고된 바와 같이, 이. 크리산테미 out 유전자 (pCPP2006)의 첨가에 의해 세포외 EGZ 및 총 EGZ 활성이 추가로 증가하였다. 그러나 EGZ와는 다르게, EGY 활성은 out 유전자의 존재에 의해 영향받지 않았다. 24-시간 배양물로부터 최대 EGY 및 EGZ 활성을 얻었다. pLOI2311 또는 pLOI1620 및 pCPP2006 (out 유전자)을 포함하는 DH5α의 파열된 배양물로부터의 상청액을 각각 EGY 및 EGZ의 공급원으로서 추가의 조사를 위해 사용하였다.
기질로서 CMC를 사용한 EGY와 EGZ의 상승작용
EGY와 EGZ의 연합 작용을 조사하는 초기의 연구는 단일 배양 시간 동안 CMC (리터 당 20 g)을 사용하여 수행하였다 (도 9). EGY 및 EGZ를 포함하는 파열된 세포 시료를 동등한 활성 (CMCase)으로 희석시키고, 다른 비율로 배합하여 각 활성의 일정한 합을 유지하였다. EGY 및 EGZ를 대조구으로 각각 시험하였다. EGY 및 EGZ의 모든 혼합물은 분석된 각 효소 단독보다 상당히 더 높았으며, 이는 상승적 상호작용을 나타낸다. 상승 효과는 EGZ의 비율에 따라 증가하였다. 최대 상승작용 (1.42)은 EGZ 대 EGY의 활성 비율 9 대 1, 및 19 대 1에서 관찰되었다.
추가의 실험에서 각각 기질로서 CMC를 사용하고, EGZ 대 EGY의 활성 비율을 9 대 1로 이용하여 인큐베이션 시간의 효과를 조사하였다 (도 9). EGZ 및 EGY 단독을 대조구으로 포함시켰다. EGZ와 EGY 조합의 상승 효과는 가수분해 속도 및 정도에서의 증가로서 뚜렷하게 분명하였다. 계산된 상승작용은 인큐베이션 시간에 따라 증가하였다. 인큐베이션 말기 (4시간)에, 혼합 효소 시료에서 환원당의 농도는 각 EGZ 및 EGY 활성의 산술적 합에 의해 예상된 것보다 1.8배 더 높았다 (즉, 상승적 활성).
상승작용에 대한 기질 (CMC) 농도의 효과
EGZ와 EGY의 사이에서 상승작용에 대한 기질 농도의 효과를 또한 연구하였다 (하기 표 11 참조). 리터 당 2.5 g에서 리터 당 20 g으로의 CMC 농도의 증가는 관찰된 상승작용을 1.12에서 1.89로 증가시켰다. EGZ와 EGY의 비 (specific) 활성 및 1.89의 최대 상승작용을 기준으로, 이들 조합에 대한 효소 턴오버 속도는 정제된 EGY 단독보다 8배, 정제된 EGZ 단독보다 1.5배 더 높았다.
상승작용에 대한 기질 농도의 효과
CMC 기질 (g/L) 방출된 환원당 (μmole/ml)a 상승작용a,c
EGZ(10)b EGY(10)b EGZ(9)+EGY(1)b
20 3.98 ±0.04 3.83 ±0.04 7.51 ±0.07 1.89 ±0.02
10 4.53 ±0.01 2.91 ±0.07 5.38 ±0.04 1.25 ±0.01
5.0 2.87 ±0.01 1.18 ±0.04 2.92 ±0.04 1.08 ±0.02
2.5 1.42 ±0.01 0.50 ±0.04 1.49 ±0.01 1.12 ±0.01
a 평균 ±표준 편차 b EGZ와 EGY는 동등한 CMCase 활성으로 희석하였다. 반응물 (0.15 IU/ml)은 EGZ 9부 및 EGY 1부를 포함하였다. 대조구으로, EGZ (0.15 IU/ml) 및 EGY (0.15 IU/ml)를 각각 개별적으로 시험하였다. c 관찰된 활성을 EGY 단독 (10％) + EGZ 단독 (90％)으로부터의 예상 기여도의 합으로 나누어 상승작용을 계산하였다.

EGY는 기질 농도에 대하여 EGZ보다 더 감응성이었다. CMC 농도의 증가는 EGY의 경우 환원당 생성물을 8배 증가시켰지만, EGZ의 경우 단지 3배만을 증가시켰다. 표 11에서 데이타의 이중 역수 그래프를 기준으로, 리터 당 104, 12 및 38 g의 겉보기 Km 값이 EGY, EGZ, 및 이들 두 효소의 조합 (EGZ 9부 + EGY 1부)의 각각에 대하여 평가되었다. EGY에 대한 겉보기 Km 값이 더 높은 것은 기질 분자가 더 길어야 하는 요건과 일치한다.
CMC 가수분해 정도는 또한 가수분해 생성물의 대략적인 크기를 결정하여 조사하였다. CMC (리터 당 1.25 g)를 EGY, EGZ, 및 이들 두 효소의 조합 (EGZ 9부 + EGY 1부)과 함께 인큐베이션하였다 (4 시간, 0.75 IU CMCase/ml). 환원당 분석을 기초로 인큐베이션 이전 (250 글루코실 단위) 및 이후에 쇄 길이를 평가하였다. 평균 쇄 길이는 상기 3가지 효소 시료 모두에서 실질적으로 감소하였다. EGZ는 쇄 길이를 감소시키는데 있어서 EGY보다 더 효과적이었으며, 각각 글루코실 잔기 3.6 대 10.7이었다. 두 효소의 조합은 상승작용을 일으켰다. 두 효소를 사용한 동시 적 가수분해는 가수분해 생성물의 평균 크기를 2.3 글루코실 잔기로 감소시켰으며, EGZ 단독보다 36％ 더 적었고, EGY 단독보다는 79％ 더 적었다. 이러한 결과는 EGZ가 큰 CMC 중합체와 작은 사카라이드 모두를 쉽게 가수분해한다는 것을 확인시켜 준다. EGY의 작용은 보다 제한적이며, 10을 초과하는 글루코실 단위를 갖는 큰 중합체를 주로 가수분해하는 것으로 보인다.
EGZ 및 EGY를 사용한 CMC의 순차적 및 동시적 가수분해
EGZ 또는 EGY 엔도글루카나제 각각을 사용한 순차적 가수분해의 효과를 두 효소 혼합물의 동시적 가수분해의 결과와 비교하여 EGZ와 EGY 사이의 상승작용의 메카니즘을 추가로 조사하였다 (하기 표 12 참조). 또한, 두 효소의 동시 작용에 대한 상승작용을 관찰하였다. EGZ를 첫번째 효소로 사용하고, 이어서 EGY를 사용하여 분해 (EGZ의 가열-실활화 이후)하는 것과 같이 CMC를 순차적으로 가수분해ㅎ는 경우, 상승작용은 관찰되지 않았다. 대조적으로, 먼저 EGY로 CMC를 처리한 다음, EGZ로 처리 (EGY의 가열-실활화 이후)하는 경우, 최대 상승작용이 유지되었다. 이러한 결과는 EGY 및 EGZ의 독립 활성에 의해 상승작용이 달성될 수 있음을 암시한다. EGY에 의한 기질의 효소적 변형은 EGZ에 의한 이후의 가수분해 속도 및 정도를 증가시켰다. 이러한 결과는 EGY와 EGZ가 상당히 다르게 기능한다는 증거를 추가로 제공한다. EGY는 큰 중합체의 쇄 길이를 주로 감소시키는 것으로 보이지만, EGZ는 보다 무작위적으로 작용하여 큰 기질 분자 및 작은 기질 분자 모두를 가수분해하는 것으로 보인다.
EGZ 및 EGY에 의한 CMC의 순차적 및 동시적 가수분해
효소 (상대 비율)a 방출된 환원당 측정치 (μmole/ml)b EGY 및 EGZ의 산술 합으로부터의 예상 활성 (μmole/ml)c 상승작용b,d
EGZ(10)+EGY(0) 4.65 ±0.08 4.65 1.00 ±0.02
EGZ(0)+EGY(10) 4.14 ±0.04 4.14 1.00 ±0.01
EGZ(9)+EGY(1) (동시적) 8.28 ±0.08 4.60 1.80 ±0.02
EGZ(9), 이후 EGY(1) (순차적) 4.86 ±0.23 4.60 1.06 ±0.05
EGY(1), 이후 EGZ(9) (순차적) 8.75 ±0.14 4.60 1.90 ±0.03
a EGZ 및 EGY를 동등한 CMCase 활성으로 희석하였다. EGZ 9부 및 EGY 1부를 사용하여 동시적 및 순차적 가수분해 반응 (0.15 IU/ml)을 조사하였다. 순차적 가수분해 실험에서, 첫번째 효소를 기질과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였으며, 20분 동안 비등시켜 실활화하였다. 냉각 후에, 두번째 효소를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 반응을 비등시켜 종결하였다. b 평균 ±표준 편차 (3회 실험) c 각 EGY 및 EGZ 활성의 계산된 합 d 관찰된 활성을 EGY 단독 (10％) + EGZ 단독 (90％)으로부터의 예상 기여도의 합으로 나누어 상승작용을 계산하였다.

산-팽윤 셀룰로스 및 결정질 셀룰로스에 대한 상승작용
기질로서 산-팽윤 셀룰로스를 사용하고, CMCase 활성을 기준으로 9 대 1의 EGZ:EGY 비율을 이용하여 잠재적인 상승작용을 조사하였다 (도 9). 산-팽윤 셀룰로스에 대한 EGZ와 EGY의 활성은 CMC에 대한 것보다 더 낮기 때문에 (Boyer, et al. (1987) Eur. J Biochezn. 162:311-316), 효소 로딩량 (1.5 IU) 및 인큐베이션 시간을 증가시켰다. 산-팽윤 셀룰로스를 사용하여 각각 분석하는 경우, EGY는 EGZ 활성의 대략 1/3이었다. 그러나, 이들 두 효소의 조합은 모든 시점에서 각 활성의 예상된 산술적 합보다 상당히 더 활성이 있었다. 상승작용의 정도는 36시간의 인큐베이션 기간 동안 본질적으로 일정하였다 (1.36 ±0.17).
박막 크로마토그래피에 의해 산-팽윤 셀룰로스로부터의 가수분해 (6시간) 생성물을 분석하였다 (도 10). EGY 단독과 인큐베이션한 후에, 가용성 사카라이드는 관찰되지 않았다. 셀로비오스 및 셀로트리오스는 EGZ 단독, 및 EGY와 EGZ의 조합에 의한 가수분해로부터의 주요 생성물이었다. 두 효소의 조합으로, 높은 생성물 수준이 상승작용을 확인시켜주는 어두운 큰 반점으로서 분명하였다.
또한, 고도의 결정질 셀룰로스인 아비셀 (등록상표)을 사용하여 EGZ와 EGY의 상승작용을 조사하였다 (도 10). 소량의 셀로비오스 및 셀로트리오스가 EGZ 단독, 및 EGY와 EGZ의 혼합물에 의한 가수분해 생성물로서 관찰되었다. 아비셀 (등록상표)과의 낮은 활성으로 인해, 박막 플레이트상에서 생성물을 시각화하는데는 많은 로딩량 (10 ㎕)이 필요하였다. 이러한 부가적인 염은 표준물과 비교하여 올리고사카라이드 생성물의 상대적인 이동을 증가시켰음을 유의한다. EGY 단독에 의해서는 셀로올리고사카라이드 반점이 관찰되지 않았다. 또한, EGY와 EGZ의 조합에 의한 상승작용은 분명하였다. EGZ 단독보다는 조합된 활성에 의해 셀로비오스, 셀로트리오스 및 셀로테트라오스에 상응하는 더 크고 더 진한 반점이 관찰되었다. 기질로서 아비셀 (등록상표)을 사용하는 경우의 낮은 활성 및 비교적 적은 수준의 생생물은 아비셀 (등록상표)의 결정질 영역보다는 비결정질 영역의 가수분해와 일치하였다. 이러한 결과는 EGZ와 EGY의 상승작용이 CMC와 같은 모델 기질에 제한되지 않음을 암시한다. 상승적 가수분해는 또한 산-팽윤 셀룰로스, 및 아비셀 (등록상표)의 비결정질 영역에서 관찰되었다.
셀로올리고사카라이드의 가수분해
가용성 셀로올리고사카라이드 (셀로비오스, 셀로트리오스, 셀로테트라오스 및 셀로펜타오스)를 사용하여 EGZ 및 EGY의 기질 특이성을 추가로 조사하였다. 박막 크로마토그래피에 의해 가수분해 생성물을 분석하였다 (도 11). 셀로비오스는 EGY, EGZ, 또는 이들 효소의 배합물에 의해 가수분해되지 않았다. 셀로올리고사카라이드 중 어느 것도 EGY 단독에 의해 가수분해되지 않았다 (도 11, 패널 B). 대조적으로, EGZ는 셀로테트라오스 및 셀로펜타오스를 가수분해하였지만, 셀로트리오스는 가수분해하지 않았다 (도 11, 패널 C). EGZ에 의한 셀로테트라오스의 가수분해 생성물은 주로 셀로비오스였으며, 셀로트리오스 및 글루코스의 양은 더 적었다. 기질로서 셀로펜타오스를 사용하는 경우, EGZ는 대략 동량의 셀로비오스 및 셀로트리오스를 생성하였으며, 이는 두번째 또는 세번째 글리코시드 결합에 대한 우선적인 공격을 나타낸다. 셀로펜타오스와 EGZ의 인큐베이션 동안의 여러 시점에서 샘플을 조사하여 이를 추가로 확인하였다 (도 11, 패널 D). 셀로비오스와 셀로트리오스는 인큐베이션 동안 점차적으로 축적되었으며, 셀로펜타오스는 상응하게 감소하였다. 따라서 큰 기질에 대한 EGY의 요건과는 달리, EGZ는 4개 이상의 글루코실 단위를 포함하는 가용성 셀로올리고사카라이드를 가수분해한다.
실시예 4
에탄올생산성 크렙시엘라 옥시토카 P2에서 에르위니아 크리산테미 엔도글루카나제 EGY ( celY ) 및 EGZ ( celZ )의 삽입, 발현 및 세포외 분비
이 실시예에서, 이. 크리산테미로부터의 celY 및 celZ 모두의 케이. 옥시토카 P2 염색체내로의 기능적 삽입이 기재되어 있다. 또한, 당화와 발효의 동시 수 행을 이용하는, 셀룰로스의 에탄올로의 발효 동안 재조합 EGY 및 EGZ와 진균 셀룰라제 (스페자임 (Spezyme) CE (등록상표)) 사이의 상승작용이 기재되어 있다.
이 실시예에서, 달리 언급되지 않는다면 하기 재료 및 방법이 이용되었다.
재료 및 방법
박테리아, 플라스미드 및 배양 조건
이 실시예에 사용된 종 및 플라스미드는 하기 표 13에 기재되어 있다.
종 및 플라스미드
종/플라스미드 설명 공급원/참고문헌
이. 콜라이 종
DH5α lacZ M15 recA Bethesda Research Laboratory
TOP10F' hsdR mcrA lacZ△M15endA recA; F'tet lacI Invitrogen
HB101 recA lacY ATCC37159
S17-1 thi pro recA hsdR RP4-2-tet::Mu aphA:Tn7λpir De Lorenzo, et al. (1990) J. Bacteriol. 172:6568-6572
지. 모빌리스 ( Z. mobilis ) 종
CP4 독립영양성 Ingram, et al. (1999) Biotechnol. Prog. 15:855-866
케이. 옥시토카 종
M5A1 독립영양성 Wood, et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110.
P2 pfl::pdc adhB cat Wood, et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110.
SZ6 pfl::pdc adhB cat;삽입된 celZ tet
SZ12 pfl::pdc adhB cat;삽입된 celZ celY kan 텍스트 참조
SZ21 pfl::pdc adhB cat;삽입된 celZ celY 텍스트 참조
SZ22 pfl::pdc adhB cat;삽입된 celY celZ::aac 텍스트 참조
플라스미드
pUC18 bla 클로닝 벡터 New England Biolabs
pUC19 bla클로닝 벡터 New England Biolabs
pCR2.1-TOPO TA 클로닝 벡터,bla kan Invitrogen
pMH18 이. 크리산테미 3937로부터의bla celY Guiseppi, et al. (1991) Gene 106:109-114.
pHPΩ45aaac 아프라마이신 유전자의bla aac 공급원 Blondelet-Rouault, et al. (1997) Gene 190:315-317
pBR322 bla tet 클로닝 벡터 New England Biolabs
pRK2013 kan, 이동성 플라스미드 ATCC
pCPP2006 이. 크리산테미 EC16으로부터의out 유전자를 포함하는 spm, 약 40 kbp 단편 He, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1079-1083
pFT-A flp 리컴비나제 유전자 및 온도 조절성 pSC101 복제기점을 포함하는, bla 낮은 카피수의 벡터 Martinez-Morales, et al. (1999) J. Bacteriol. 181:7143-7148.
pLOI2224 조절성 R6K 복제기점 및 2개의 FRT 부위를 포함하는,kan삽입 벡터 Martinez-Morales, et al. (1999) J. Bacteriol. 181:7143-7148.
<표 13 연속>
Figure 112002042964056-pct00001
Figure 112002042964056-pct00002
플라스미드 제조 동안 숙주로서 에세리키아 콜라이 DH5α및 TOPO10F'을 사용하였다. celZ 유전자, celY 유전자 및 out 유전자를 실시예 3에 기재된 바와 같이 클로닝하였다.
이. 콜라이 배양물을 37 ℃에서 리터 당 디프코 (Difco, 등록상표) 트립톤 10 g, 디프코 (등록상표) 효모 추출물 5 g, 및 염화나트륨 5 g을 포함하는 루리아-베르타니 브로쓰 (LB), 또는 아가 (1.5％)를 포함하는 고상 LB 배지에서 배양하였다. 에탄올생산성 종의 배양에 사용되는 브로쓰 (5％ 글루코스 또는 소르비톨) 및 고상 배지 (2％ 글루코스)중에 당을 항상 포함시켰다. 콩고 레드 방법 (Wood et al. (1988) Methods Enzymology 160:87-112)을 이용하여 엔도글루카나제 생산에 대 하여 클론을 스크리닝하였다. 0.3％의 낮은 점도의 카르복시 메틸 셀룰로스 (CMC)를 LB 아가에 보충하여 엔도클루카나제 지표 플레이트를 제조하였다. 암피실린 (50 ㎍/ml), 아프라마이신 (100 ㎍/ml), 카나마이신 (50 ㎍/ml), 클로람페니콜 (40 ㎍/ml) 및 스펙티노마이신 (100 ㎍/ml)을 선별을 위해 사용하였다. 케이. 옥시토가의 에탄올생산성 종을, 30 ℃에서 글루코스 (2％) 및 클로람페니콜 (600 ㎍/ml)을 포함하는 고상 LB 배지상에서 유지하였다.
유전적 방법
표준 방법에 의해 플라스미드를 제조, 분석 및 시퀀싱하였다. 프라이머 쌍으로 N-말단 5'CTGTTCCGTTACCAACAC3' (서열 13), C-말단 5'GTGAATGGGATCACGAGT3' (서열 14)과 함께 주형으로서 pMH18을 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 celY의 리보좀-결합 부위 및 프로모터 결실 코딩 영역을 증폭시켰다. 이동을 위해 pRK2013을 사용하여 컨쥬게이션으로 이. 크리산테미 out 유전자 (pCPP2006)를 전달하였다. 디데옥시 방법, 및 형광성 프라이머를 사용하는 LI-COR 모델 4000-L DNA 서열분석기를 이용하여 제조를 확인하였다. 바이오-라드 (Bio-Rad) 유전자 펄서 (Pulser, 등록상표)를 사용하는 전기천공에 의해 이. 크리산테미 celY 및 celZ 유전자를 케이. 옥시토카 P2내에 도입하였다. 문헌 (Martinez-Morales, et al. (1999) J. Bacteriology 181:7143-7148, 및 Zhou, et al. (1999) Indust. Microbiol. Biotechnol. 22:600-607)에 기재된 바와 같이, 카나마이신 (50 mg/리터)을 포함하는 고상 배지에서 재조합체를 선별하였다.
프라이머 연장 분석
IRD41-표지된 형광성 프라이머를 사용하여 코딩 영역내에서 전사 개시 부위를 맵핑하여 프로모터 영역을 확인하였다: celY의 경우 5'-ACCATCAGCATCAACGCCCAACAACG-3' (서열 15), 및 celZ의 경우 5'-GACTGGATGGTTATCCGAATAAGAGAGAGG-3' (서열 16). 연장 생성물을 로딩 완충액 중에 용해시키고, LI-COR 모델 4000-L DNA 서열분석기 (Lincoln, Nebraska)를 사용하여 평행한 디데옥시 서열과 비교하였다.
효소 분석
실시예 3에 기재된 바와 같이 엔도글루카나제 활성을 측정하였다.
발효
브로쓰 200 ml을 포함하는, 격벽이 없는 500 ml 들이 플라스크에서 당화와 발효의 동시 수행 (SSF) 테스트를 수행하였다. 플라스크에 고무 마개를 장치하고, 18 게이지 바늘로 배기시켰다. 35 ℃ (120 rpm)에서 10％ 시그마셀 (Sigmacell) 50 (결정질 셀룰로스)을 포함하는 LB 배지에서 발효를 수행하였다. 5％ 글루코스를 포함하는 LB에서 접종물을 12시간 동안 배양하였다. 원심분리에 의해 세포를 수획하여 LB중에 재현탁시켰다. 세포 16 mg (건조 중량)의 초기 밀도를 제공하도록 각 플라스크를 접종하였다.
재료 및 화학물질
트립톤 및 효모 추출물은 디프코 (Detroit, Michigan)사 제품이었다. 항생제, 낮은 점도의 CMC, 및 시그마셀 50 (등록상표)은 시그마 케미칼 컴퍼니 (St. Louis, Missouri)사로부터 입수하였다. IRD41-표지된 형광성 프라이머는 리-코르, 인크 (LI-COR, Inc.; Lincoln, Nebraska)사로부터 구입하였다.
celY에 대한 프로모터-프로브 벡터의 제조
이. 크리산테미로부터의 celY 유전자는 이. 콜라이에서 그의 천연 프로모터로부터 적게 발현된다 (문헌 (Guiseppi, et al (1991) Gene 106:109-114)을 참조한다). 따라서 발현을 증가시키기 위해, celY를 리포터로 사용하여 다음과 같이 프로모터-프로브 벡터를 제조하였다 (도 13 참조). 주형으로서 pMH18을 사용하는 PCR에 의해 리보좀-결합 부위를 갖는, 프로모터 무함유 celY 코딩 영역 (1.2 kbp)을 증폭시키고, 토포아이소머라제 벡터 PCR2.1-TOPO내에 랜덤하게 삽입하였다. 엔도글루카나제 지표 플레이트를 사용하여 celY의 기능적 발현을 확인하였다. lac 프로모터로부터 celY를 발현시키도록 배향된 클론을 선별하고, pLOI2311 (5.2 kbp)으로 지칭하였다. 프로모터 무함유 celY 유전자를 포함하는 EcoRI 단편을 pLOI2311으로부터 단리하였다. 클레나우 폴리머라제를 사용하여 이 단편의 말단을 블런트로 만든 다음, pUC18의 HincII 부위내에 라이게이션하였다. lac 프로모터로부터 celY를 발현시키도록 배향된 클론을 선별하고 (3.9 kbp), 엔도글루카나제 지표 플레이트를 사용하여 발현을 확인하였다 (pLOI2316). EcoRI 및 HindIII를 사용하여 pLOI2316로부터 프로모터 무함유 celY 유전자를 1.2 kbp 단편으로서 단리하고, pLOI2302 (pUC19 유도체)의 상응하는 부위내에 삽입하여 celY 유전자의 방향을 역전시켰다. 예상된 바와 같이, 생성된 구조물 DH5α(pLOI2317)는 프로모터의 결여로 인해 엔도글루카나제 지표 플레이트상에서 활성이 없었다. 프로모터 영역을 포함하는 DNA 단편의 삽입을 촉진시키기 위해, 플라스미드 pLOI2317 (3.9 kbp)은 celY 유전자의 인접 상류에 있는, 폴리링커 영역내의 BamHI 부위를 포함한다 (도 13 참조).
이. 콜라이 DH5α에서 celY의 발현이 증가되는 플라스미드의 제조
지. 모빌리스 염색체 DNA의 Sau3A1 단편을 사용하여, 케이. 옥시토카에서 천연 조절 메카니즘의 영향을 받지 않거나, 케이. 옥시토카 염색체내로의 삽입을 방해하는 이종 프로모터를 제공하였다 (Zhou, et al. (1999) J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 22:600-607). 0.5-1.5 kbp의 단편을 단리하고, pLOI2317의 BamHI 부위내에 랜덤하게 라이게이션하여 대용 프로모터의 라이브러리를 형성시켰다 (도 13 참조). 엔도글루카나제 지표 플레이트에서 대략 75,000개의 콜로니를 스크리닝하였다. 클론의 1/3은 celY를 활발하게 생성하였다. 가장 활성이 있는 100개의 콜로니를 대역 크기로 확인하고, 정제하고, 재시험하였다. 가장 큰 활성 대역을 갖는 30개의 클론을 LB에서 밤새 배양하고, CMCase 활성에 대하여 분석하였다. 가장 활성이 있는 5개가 하기 표 14에 기재되어 있으며, 본래의 클론인 pMH18보다 대략 7배 더 높은 활성을 나타내었다. 추가의 조사를 위해 플라스미드 pLOI2323을 선별하였다.
대용 프로모터로서 지. 모빌리스 염색체 DNA의Sau3A1 절단 생성물을 사용하는 단편을 이용하는, DH5α에서celY의 발현
celY 또는celZ를 발현시키는 플라스미드 엔도글루카나제 활성 (IU/L)
세포외 총 세포외％
pMH18 (천연celY 프로모터) 151 184 82
pLOI2317 (프로모터 무함유celY 벡터) 0 0 0
대용 프로모터로부터 발현된celY
pLOI2318 1,123 1,257 89
pLOI2319 888 1,023 87
pLOI2320 1,023 1,056 97
pLOI2323 1,257 1,291 97
pLOI2342 1,224 1,257 97
pLOI2349(celZ) 3,414 16,234 21
모든 플라스미드는 pUC 유도체이다. 37 ℃에서 대략 16시간 동안 배양시킨 배양물을 사용하여 엔도글루카나제 활성을 측정하였다.

pLOI2323에서 지. 모빌리스 Sau3A1 단편 (937 bp)을 양 방향으로 시퀀싱하였다 (젠뱅크 (GenBank) 승인 번호 AF305919). 데이타베이스 비교를 토대로, 이 단편은 2가지 종류, 즉 이미 시퀀싱된 영역에 상응하는, 지. 모빌리스 염색체로부터의 882 bp 단편, 및 벡터로부터의 55 bp 단편으로부터 유도되는 것으로 보인다. 번역된 서열의 블라스트 (BLAST) 검색 (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)은 공지된 유전자에 대한 동일성을 나타내지 않았다. 4군데의 전사 개시 부위가 DH5α(pLOI2323)에서 3가지 다른 시그마 인자 δ32, δ38 및 δ70을 포함하는 프라이머 연장 분석에 의해 확인되었다 (도 14 참조). 강도의 차이가 2배 적음에도 불구하고, 가장 강력한 개시 부위의 상류에 있는 서열은 δ32 (rpoH) 열 충격 프로모터에 대해 컨센서스인 것과 유사하였다 (Wang, et al. (1998) J. Bacteriology 180:5626-5631; Wise, et al. (1996) J. Bacteriology 178:2785-2793).
celY 및 celZ를 케이. 옥시토카 P2의 염색체내로 삽입시킨 벡터의 제조
플라스미드 pLOI2307 (7.2 kbp)을 제조하고, 이를 사용하여 재조합 이. 콜라이 DH5α(문헌 (Zhou, et al. (1999) B. Appl. Environ. Microbiol. 65:2439-2445) 참조) 및 케이 옥시토카 M5A1 (문헌 (Zhou, et al. (1999) Indust. Microbiol. Biotechnol. 22:600-607) 참조)에서 대용 지. 모빌리스 프로모터로부터 celZ를 높은 수준으로 발현시켰다. 이러한 하이브리드 celZ 유전자 및 프로모터 (4.5 kbp)의 서브클로닝을 촉진시키기 위해, EcoRI 링커를 pLOI2307의 T4 폴리머라제-처리된 SphI 부위내에 삽입하여 편리한 절단 (pLOI2349)을 위한 플랭킹 EcoRI 부위를 제공하였다. celY 및 celZ를 포함하는 플라스미드를 제조하기에 앞서, EcoRI-절단된 케이. 옥시토카 M5A1 염색체 DNA의 랜덤 3 kbp 단편을, celY (및 대용 프로모터)를 포함하는 pLOI2323내에 삽입하여 상동 재조합을 위한 가이드 역할을 하도록 하였다 (pLOI2348; 8 kbp). 이러한 3 kbp M5A1 단편이 부분적으로 시퀀싱되었으며, 완전한 M5A1 glgP 유전자를 코딩하는 것으로 보인다. pLOI2348 (8 kbp)에서, 플랭킹 AscI 부위는 M5A1 glgP 유전자, 지. 모빌리스 대용 프로모터 및 이. 크리산테미 celY를 포함하는 단일한 5.5 kbp 단편의 절단을 허용하였다.
도 15는 pLOI2349, pLOI2224 및 pLOI2348으로부터 celY, celZ 삽입 벡터의 제조에 대한 요약이다. 대용 프로모터 및 가이드 단편을 포함하는 재조합 celY 및 celZ 유전자를 숙주로서 이. 콜라이 S17-1을 사용하여 코어 삽입 벡터인 pLOI2224 (Martinez-Moralez, et al., supra)내에 순차적으로 삽입하여 pLOI2352 (12 kbp)를 생성시켰다. celZ를 포함하는 pLOI2349로부터의 4.5 kbp EcoRI 단편을, EcoRI 부위를 이용하여 pLOI2224내에 삽입하여 pLOI2350 (6.4 kbp)을 제조하였다. celY를 포함하는 pLOI2348로부터의 5.5 kbp AscI 단편을 pLOI2350의 AscI 부위내에 삽입하여 pLOI2352 (12 kbp)를 제조하였다. cel 유전자를 포함하는 단편을, 대용 프로모터로부터의 발현이 달라지도록 배향시켰다. 생성된 벡터는 DH5α또는 M5A1에서 작용하지 않는 R6K 복제기점을 포함하였다. pLOI2352에서 2군데의 FRT 부위는 삽입 이후에 카나마이신 유전자 및 복제기점의 제거를 촉진시킨다 (Martinez-Moralez, et al., supra).
celY 및 celZ의 케이. 옥시토카 P2 염색체내로의 기능적 삽입
전기천공에 의해 플라스미드 pLOI2352를 P2내에 도입한 다음, 카나마이신 내성에 대하여 선별하였다. 콜로니 약 150개를 수획하였으며, 이들 모두는 엔도글루카나제 지표 플레이트상에서 양성이었다. 가장 큰 활성 대역을 갖는 10개의 클론을 정제하고, 브로쓰중에서 배양하고, 엔도글루카나제 활성에 대하여 분석하였다. 이들은 5 내지 6 IU/ml의 엔도글루카나제 활성을 나타내었다. 추가 연구를 위해 하나의 클론을 선택하였으며, SZ12로 지칭하였다.
암피실린에 대한 케이. 옥시토카의 자연적인 내성으로 인해, flp 리컴비나제를 포함하는 pFT-A 플라스미드에 추가의 항생제 내성 마커 (tet)를 추가하여 선별을 용이하게 하였다. 테트라사이클린 유전자를 pBR322로부터 1.4 kbp의 EcoRI 내지 AvaI 단편으로 단리하였다. 클레나우 폴리머라제로 처리한 다음, 이 단편을 pFT-A의 클레나우-처리된 ClaI 부위에 라이게이션하여 pLOI2353 (7.0 kbp)를 제조 하였다. 이 플라스미드는 암피실린 및 테트라사이클린 둘 다에 대한 내성, 테트라사이클린 프로모터의 조절하에 있는 FLP 리컴비나제 (flp), 및 온도-조절 pSC101 복제기점을 코딩한다.
플라스미드 pLOI2353로 SZ12를 형질전환시키고, 30 ℃에서 플레이팅하여 테트라사이클린 내성에 대하여 선별하였다. 테트라사이클린의 존재는 또한 flp 발현을 유도하였으며, 이는 염색체로 삽입된 pLOI2353로부터 카나마이신 유전자 및 R6K 복제기점을 결실시켰다. 시험된 307개의 테트라사이클린-내성 콜로니 중에서, 99％를 넘는 콜로니들이 엔도글루카나제 유전자의 발현을 유지하였으며, 카나마이신에 대하여 민감성을 나타내었다. 클론을 정제하고, 브로쓰에서 배양하고, 엔도글루카나제 활성에 대하여 분석하였다. 이들은 모두 유사하였으며, 그 중 하나가 SZ21 (pLOI2353)으로 지칭되었다. 37 ℃에서 밤새 배양하여 SZ21으로부터 헬퍼 플라스미드를 제거하였다.
celZ 넉아웃 돌연변이의 제조
SZ21에서 기능성 celY의 존재를 확인하기 위해, 플라스미드 pLOI2357을 사용하는 이중의 상동 재조합에 의해, 염색체로 삽입된 celZ의 넉아웃 돌연변이체를 제조하였다 (도 16). 플라스미드 pUC19를 SmaI 및 HindIII로 절단하고, 클레나우 폴리머라제로 처리하고, 자가-라이게이션시켜 많은 폴리링커 부위 (pLOI2354)를 제거하였다. 나머지 EcoRI 부위를 이용하여 pLOI2349로부터의 프로모터 및 celZ 유전자를 포함하는 4.5 kbp EcoRI 단편을 삽입하여 pLOI2355 (7.2 kbp)를 제조하였다. 이어서 아프라마이신 내성 유전자 (aac)를 포함하는 pHPΩ45aac로부터의 1.8 kbp SmaI 단편을 celZ의 중앙 영역내에 라이게이션하고, 작은 내부의 PstI 단편을 대체하여 (T4 폴리머라제로 블런팅한 다음) pLOI2356 (9.0 kbp)를 제조하였다. 이 플라스미드로부터의 6.3 kbp EcoRI 단편을 단리하고 코어 삽입 벡터 pLOI2224내에 삽입하여 pLOI2357 (8.2 kbp)를 제조하였다. 이 플라스미드는 아프라마이신 내성 유전자가 사이에 위치하는 celZ 유전자 이외에 조절성 R6K 복제기점 및 카나마이신 내성 유전자를 포함한다.
플라스미드 pLOI2357을 SZ21내에 전기천공하여 넣고, 아프라마이신에 대하여 선별하였다. 약 10％의 재조합체가 아프라마이신 내성 및 카나마이신 민감성을 나타내었으며, 이는 이중의 상동 재조합 반응을 나타낸다. 이러한 클론은 지표 플레이트상에서 낮은 수준의 엔도글루카나제 생성을 나타내었다 (하기 표 15 참조). 이중 하나를 선별하여 SZ22로 지칭하였다. 파마시아 페이스트 겔 시스템 (Pharmacia Phast Gel system)을 이용하는 SDS-PAGE에 의해 SZ22에서 EGZ의 감소 및 EGY의 보유를 확인하였다.
M5A1 및 P2에서 통상적인, 세포 배양물중의 세포 응집물은 삽입된 유전자 또는 플라스미드로부터의 celZ의 기능적 발현에 의해 제거되었다는 것을 유의하는 것은 흥미로운 일이다. 응집물은 celY 단독의 기능적 발현에 의해서는 영향받지 않았다.
케이. 옥시토카 SZ21에서의 전사 개시
SZ21에서 celY 및 celZ의 프라이머 연장 분석은 DH5α에서 관찰된 것과 유사하였다. 단일한 주요 전사 개시가, 동일한 프로모터 단편을 포함하는 DH5α(pLOI2183)의 가장 현저한 개시 부위에 정확하게 일치하는 celZ에 대하여 확인되었다 (Zhou, et al. (1999) J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 22:600-607; Zhou, et al. (1999) B. Appl. Environ. Microbiol. 65:2439-2445). 이러한 부위로부터 인접한 상류의 DNA는 σ70 프로모터에 대한 인식 서열과 유사하다 (Wang, et al, supra and Wise, et al., supra). DH5α(pLOI2323)에서 관찰된 바와 같이 (도 14 참조), celY의 프라이머 연장 분석은 SZ21에서 추정의 여러 전사 개시 부위의 존재를 암시하였다. DH5α(pLOI2323)내의 개시 부위와 동일한 영역에 위치함에도 불구하고, 모든 밴드는 거의 동일한 강도를 나타내었다.
케이. 옥시토카 P2의 유도체에서 EGY 및 EGZ의 세포외 분비에 대한 이. 크리산테미 out 유전자 (pCPP2006)의 효과
표 7은 에탄올생산성 케이. 옥시토카 P2의 셀룰로스분해 유도체에 의해 나타낸 엔도글루카나제 활성에 대한 요약이다. 종 SZ6 (Zhou, et al., (1999) J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 22:600-607)은 SZ21을 제조하기 위해 사용된 동일한 프로모터 단편을 갖는, 염색체에 삽입된 하이브리드 celZ 유전자를 포함한다. SZ21에서 두 엔도글루카나제 유전자의 존재에도 불구하고, 세포외 및 총 엔도글루카나제 활성은 SZ6에서보다 이 종에서 13％ 더 낮았다. SZ21에 의해 생성된 엔도글루카나제 활성의 대부분은 celZ로 인한 것일 수 있다. SZ21의 celZ 돌연변이체인 SZ22는 기능성 celY 및 celZ 유전자를 포함하는 모체에 의해 생성된 엔도글루카나제의 11％만을 발현시켰다. 기능성 celZ를 포함하는 종 SZ6 및 SZ21에서, 엔도 글루카나제 활성 (주로 EGZ)의 대부분은 세포와 관련되었다. 기능성 celY 단독을 포함하는 종 SZ22에서, 엔도글루카나제 활성의 절반은 세포외에 있었다.
케이. 옥시토카 P2의 유도체에 의한 엔도글루카나제 생산에 있어서out 유전자 (pCPP2006)의 효과
종 CMC 대역 (mm) OD550 CMCase 활성 (IU/L)a
세포외 총 분비 (％)
P2 0 10.5 0 0 0
SZ6 8.5 11.0 1,920 8,800 22
SZ21 6.7 11.0 1,620 7,800 21
SZ22 2.0 10.0 480 879 55
P2 (pCPP2006) 0 10.0 0 0 0
SZ6 (pCPP2006) 10.8 9.6 13,800 22,300 62
SZ21 (pCPP2006) 11.5 10.2 20,100 26,900 75
스페자임 CE (등록상표) (10 ml/리터)b - - - 27,000 -
스페자임 CP (등록상표) (10 ml/리터)b - - - 33,400 -
a 30 ℃에서 24시간 동안 5％ 소르비톨을 포함하는 LB에서 배양시킨 배양물을 사용하여 엔도글루카나제 활성을 측정하였다. b 발효 실험에 사용된 가장 높은 스페자임 (등록상표) 수준과 동등한 희석물 (표 4)

out 유전자 (pCPP2006)를 재조합 이. 콜라이, 및 celZ를 보유하는 케이. 옥시토카 M5A1에 첨가하는 것은 celZ의 기능적 발현, 및 세포외 환경으로 분비되는 EGZ의 비율을 크게 증가시킬 수 있다 (Zhou, et al., (1999) J Indust. Microbiol. Biotechnol. 22:600-607; Zhou, et al. (1999) B. Appl. Environ. Microbiol. 65:2439-2445). 이와 동일한 효과가 celZ 및 celY를 포함하는 에탄올생산성 케이. 옥시토카 SZ21에 대하여 관찰되었다 (표 14 참조). out 유전자를 SZ22 (실활성 celZ)에 첨가하는 것은 celY의 기능적 발현 또는 EGY의 분비 정도에 대하여 영향을 주지 않았다. 이러한 celZ 돌연변이체인 SZ22 (pCPP2006)는 기능적 celY 및 celZ 유전자를 포함하는 SZ21 (pCPP2006)에 의해 생성된 총 엔도클로카나제 활성 (EGY)의 3％만을 나타내었다. out 유전자를 갖는 SZ21에 의해 제조되는 분비된 엔도글루카나제는 SZ6 (EGZ) 및 SZ22 (EGY)에서 동일한 각 프로모터로부터 발현된 각 활성의 합보다 실질적으로 더 높았으며, 이는 이들 두 효소 사이의 상승작용과 일치한다. 이 분석에서, 상승작용은 SZ21 (pCPP2006)에 의해 생성된 세포외 효소의 조합에 대하여 각 활성 (SZ6 (pCPP2006) 및 SZ22 (pCPP2006))의 산술적 합의 1.4배로 평가되었다.
셀룰로스의 에탄올로의 발효 동안 재조합 이. 크리산테미 엔도글루카나제 (EGZ 및 EGY) 및 진균 셀룰라제 (스페자임 CE (등록상표)) 사이의 상승작용
pH 조절 없이 플라스크내에서 SSF 테스트를 이용하여, 고도의 결정질 기질인 시그마셀 50 (등록상표)으로부터의 에탄올 생산에 대하여 생촉매에 의해 제조된 진균 셀룰라제 (스페자임 (등록상표)) 및 셀룰라제 효소의 조합된 효과를 평가하였다. 결과는 하기 표 16에 나타나 있다.
최대 에탄올 생산
종 제넨코르 (Genencor) 스페자임 (등록상표) 발효a)
유형 첨가 (ml/리터) N 에탄올 ±SD (g/리터)b) 대조％ ±SD
P2(pCPP2006) 없음 0 3 0.23 ±0.01 100 ±2.0
SZ6(pCPP2006) 없음 0 3 0.28 ±0.02* 124 ±8.5
SZ21(pCPP2006) 없음 0 3 0.26 ±0.02* 116 ±8.5
SZ22(pCPP2006) 없음 0 3 0.24 ±0.01 107 ±1.0
P2(pCPP2006) CE 5.0 6 13.7 ±0.3 100 ±2.0
SZ6(pCPP2006) CE 5.0 6 13.8 ±0.3 101 ±2.4
SZ21(pCPP2006) CE 5.0 6 16.0 ±0.5** 117 ±3.5
SZ22(pCPP2006) CE 5.0 6 15.2 ±0.3** 112 ±1.5
P2(pCPP2006) CE 10.0 6 20.7 ±0.5 100 ±2.1
SZ6(pCPP2006) CE 10.0 6 21.2 ±0.1 103.4 ±0.4
SZ21(pCPP2006) CE 10.0 6 24.6 ±0.5** 121 ±2.3
SZ22(pCPP2006) CE 10.0 6 25.2 ±1.1** 122 ±5.0
P2(pCPP2006) CP 5.0 6 15.2 ±0.3 100 ±1.7
SZ21(pCPP2006) CP 5.0 6 17.8 ±0.4** 116 ±2.2
P2(pCPP2006) CP 10.0 6 25.3 ±0.7 100 ±2.6
SZ21(pCPP2006) CP 10.0 6 27.2 ±0.3** 107 ±1.2
a) 첨가된 셀룰로스 (100 g/리터) 또는 스페자임 (등록상표)이 없는 배양물은 에탄올 0.22 ±0.01 g/리터를 생성하였다. 스페자임 (등록상표)은 약 100 FPU/ml을 포함하였다. 스페자임 (등록상표) 5 ml 및 10 ml의 첨가는 각각 5 FPU/g 및 10 FPU/g 셀룰로스에 상응한다. b) 스튜던트 t-테스트는 각 스페자임 (등록상표) 희석물에서 각 P2 대조구에 비해 에탄올 생성에 있어서 상당한 차이가 있음을 나타낸다. 0.001 이하의 P 값은**로 나타내었다. 0.05 이하의 P 값은*으로 나타내었다.

스페자임 (등록상표)의 부재하에 모든 종에서 매우 적은 수준의 에탄올이 생산됨에도 불구하고, 기능적 celZ 유전자를 포함하는 종 SZ6 (pCPP2006) 및 SZ21 (pCPP2006)은 기능적 celY 유전자만을 포함하는 종 SZ22 (pCPP2006) 및 엔도글루카나제 유전자가 결여된 종 P2 (pCPP2006)보다 더 높은 수준의 에탄올 (p ≤ 0.05)을 생성하였다. 스페자임 (등록상표) 및 시그마셀 50 (등록상표) 둘 다의 부재하에, 모든 종은 에탄올 0.22 g/L을 생성하였다. 시그마셀 50과 함께 인큐베이션하는 동 안 SZ6 (pCPP2006) 및 SZ21 (pCPP2006)에 의해 제조된 에탄올의 추가적인 증가는 EGZ에 의한 기질 중 적은 비율의 비결정질 셀룰로스의 가수분해로 인한 것이다 (Zhou, et al. (1999) J of Industrial Microbiol. Biotechnol. 22:600-607; Zhou, et al. (1999) B. Appl. Environ. Microbiol. 65:2439-2445; Zhou, S., et al. (2000) J. Bacteriol. 182:5676-5682). EGY에 의한 비결정질 셀룰로스의 분해는, 너무 커서 추가의 가수분해 없이는 운반 및 대사될 수 없는 사카라이드를 생성한다 (Zhou, S., et al. (2000) J. Bacteriol. 182:5676-5682).
스페자임 CE (등록상표) 및 스페자임 CP (등록상표)는 시판되는 엔도글루카나제, 엑소글루카나제 및 셀로비아제 활성의 최적의 조합을 포함한다 (Beguin, et al. (1994) FEMS Microbiol. Rev. 13:25-58; Boyer, et al. (1987) Eur. J. Biochem. 162: 311-316; Nieves, et al. (1998) World Journal of Microbiology and Biotechnology 14:310-314; Ohmiya, et al. (1997) Biotechnol. Genetic Eng. Rev. 14:365-414). 이러한 최적화에도 불구하고, 엔도글루카나제 생산성 생촉매 2가지, SZ21 (pCPP2006) 및 SZ22 (pCPP2006)를 포함하는, 스페자임 (등록상표) 보충된 발효물은 엔도글루카나제 유전자가 결여된 대조구 P2 (pCPP2006)보다 에탄올을 상당히 더 높은 수준으로 생산하였다. 스페자임 (등록상표) 및 SZ21 (pCPP2006) 및 SZ22 (pCPP2006)의 조합은 에탄올 생산 측면에서 이들 각각 (p < 0.005)에 의해 개별적으로 생산된 에탄올의 합보다 20％까지 더 높은 상승작용을 나타내었다. 상승작용은 스페자임 CE (등록상표) 및 스페자임 CP (등록상표)의 희석물 모두에 대하여 관찰되었다. 이러한 상승 효과는 EGY가 SZ22 (pCPP2006)에 의해 생성되는 유일 한 엔도글루카나제이기 때문에 주로 EGY로 인할 것일 수 있다. EGZ만을 생성하는 SZ6 (pCPP2006)의 경우 상승작용은 관찰되지 않았다.
실시예 5
보충 셀룰라제 없이 재조합 클레브시엘라 옥시토카 SZ21에 의한 에탄올로의 비결정질 셀룰로스의 당화와 발효의 동시 수행
본 실시예에서, 지모모나스 모빌리스로부터 유래된, 에탄올을 생산하는 염색체 삽입 유전자 (pdc, adhB), 및 에르위니아 크리산테미로부터 유래된 엔도글루카나제 유전자 (celY, celZ)를 함유하는 클레브시엘라 옥시토카 M5A1의 유도체가 발효 과정 동안 20,000 U/L를 넘는 엔도글루카나제 활성을 나타내는 것으로 입증되었다. 구체적으로, 이 균주는 셀로비오스 및 셀로트리오스를 대사시키는 그의 천연 능력과 함께 다른 유기체로부터 유래된 셀룰라제 효소의 첨가 없이도 비결정질 셀룰로스를 에탄올 (이론적 수율 58-76%)로 발효시키는 것으로 입증되었다.
본 실시예에서는 달리 명시하지 않는 한 하기 재료 및 방법을 사용하였다.
재료 및 방법
박테리아, 플라스미드 및 배양 조건
클레브시엘라 옥시토카 M5A1의 에탄올생산성 유도체 4종을 본 연구에 사용하였다. 균주 P2는 지모모나스 모빌리스로부터 유래된, 에탄올을 생산하는 염색체 삽입 pdc 및 adhB 유전자를 함유한다 (Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58: 2103-2110). 이 균주는 에르위니아 크리산테미로부터 유래된 고도로 발현되는 염색체 삽입 엔도글루카나제 유전자를 함유하는 3종의 균주에 대한 모 유기체이었다. 균주 SZ6는 celZ만을, 균주 SZ22는 celY만을, SZ21는 celY 및 celZ을 함유한다. 엔도글루카나제 CelZ의 충분한 분비를 위해서는 추가 유전자 (대략 15 개의 out 유전자)가 필요하였고 (He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1079-1083; Pugsley et al., (1997) Gene 192: 13-19), 이들 추가 유전자는 플라스미드 pCPP2006에 의해 공급되었다. 일관성을 위해, 이 플라스미드를 모든 균주에 삽입하였다. 탄수화물을 함유하는 루리아 브로쓰 (리터당: 10 g 효모 추출물, 5 g 트립톤, 5 g NaCl) 중에서 재조합 클레브시엘라 옥시토카 균주를 배양하였다. 플라스미드 pCPP2006을 유지하기 위해 스펙티노마이신 (100 mg/L)을 포함시켰다. 시드 배양물 (5% 글루코스, 12-16 시간) 및 발효물은 35℃에서 인큐베이션하였고 (120 rpm), 22 게이지 바늘을 사용하여 내보냈다.
엔도글루카나제 활성의 분석
환원당을 측정하는 동안 방해를 최소화하기 위해, 5% 소르비톨이 함유된 루리아 브로쓰 중에서 24시간 동안 배양시킨 배양물에 대해 총 글루카나제 활성 (CelY 및 CelZ)을 측정하였다 (Zhou et al. (2000) J. Bacteriol. 182: 5676-5682). 브로쓰 중의 세포 현탁액을 단기간 초음파 처리하여 결합된 효소를 유리시켰다. 50 mM 소듐 시트레이트 완충액 (pH 5.2) 중에서 카르복시메틸 셀룰로스를 기질(2%)로 사용하여 희석액을 35℃에서 분석하였다. 가열하여 (10분, 100℃) 반응을 종결시켰다. 활성은 글루코스를 표준물로 사용하여 환원당(U)을 분당 μmol로 표현하였다.
셀로비오사이드의 박층 크로마토그래피 (TLC) 분석
셀로비오사이드는 와트만 LK5 실리카 겔 플레이트 (Cat. No. 4855-620)를 사용하여 분리하였다. 플레이트를 용매 (6부의 클로로포름, 7부의 아세트산 및 1부의 물) 중에서 현상하고, 공기 중에서 건조하고, 상기 용매 중에서 다시 현상하였다. 6.5 mM의 N-(l-나프틸)에틸렌디아민 디히드로클로라이드로 분무하고 100℃에서 10분 동안 가열하여 사카라이드를 관찰하였다 (Zhou et al. supra).
미세결정질 셀룰로스로부터의 셀로비오사이드의 제조
페레이라 (Pereira) 등의 방법 (1998)을 토대로 셀룰로스를 셀로비오사이드로 전환시켰다. 시그마셀 타입 50 셀룰로스 (100 g; Cat. No. S-5504)를 400 g의 72% H2SO4 (w/w)에 서서히 첨가하고 18시간 동안 교반하면서 22℃에서 가수분해하였다. 분해된 슬러리는 2.5 리터의 냉각 에탄올 (100%)에 서서히 첨가함으로써 침전시키고, 원심분리하고, 펠렛을 1 리터의 냉각 에탄올로 2회 세척하였다. 펠렛을 100 ml의 물에 용해시키고, pH를 pH 6으로 조절하고, 5000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 불용성 섬유를 제거하였다. 셀로비오사이드를 함유하는 상등액을 건조하고 분석하였다.
셀로비오사이드의 HPLC 분석
굴절률 모니터 및 디지탈 적분 회로망이 장착된 워터 HPLC를 사용하여 셀로비오사이드를 분석하였다. 이동상이 증류수 (0.6 ml/분)인 BioRad HPX-42A 컬럼을 사용하여 65℃에서 분리를 수행하였다.
셀로비오사이드의 발효
초기 발효에는 시그마 케미칼 캄파니로부터 구입한 셀로비오사이드 (Cat. No. C-8071)를 사용하였다. 일반적으로 1.5-ml 마이크로원심분리 튜브 중에서 시드 배양물 (112.5 ㎕)를 37.5 ㎕의 4% 셀로비오사이드와 혼합하고, 36시간 동안 (35℃ 및 1200 rpm) 인큐베이션하였다. 샘플 (각각 50 ㎕: 0 시간, 10시간 및 36시간)을 가열하여 (100℃, 10 분) 효소를 불활성화시키고 원심분리하여 (10,000 x g, 5분) 세포 데브리스를 제거하였다. 이어서, 분석을 위해 상당액 (4 ㎕)을 TLC 플레이트 상에 점찍었다.
황산 가수분해에 의해 제조된 실험용 셀로비오사이드 샘플을 사용하여 소규모 발효 (50 ml 플라스크, 5 ml의 브로쓰 부피)를 유사한 방식으로 수행하였다. 셀로비오사이드 (7개 미만의 글루코실 잔기를 갖는 사카라이드의 경우 총 6 g/L)를 루리아 브로쓰 중에서 여과 멸균하였다. 시드 배양물 (건조 중량 0.33 g/L)로부터 얻은 펠렛 형태의 세포 (5,000 x g, 10분)로 플라스크를 접종하여 시드 배지 중의 글루코스로부터 생산된 에탄올을 제거하였다. 가스 크로마토그래피에 의해 에탄올의 함량을 측정하기 위해 샘플을 초기에 얻은 다음에 24시간 간격으로 얻었다 (Beall et al. (1991) Biotechnol Bioeng. 38 : 296-303).
비결정질 셀룰로스의 제조
인산-팽윤 셀룰로스를 우드 (Wood, 1998)에 의해 기재된 방법의 변법으로 제조하였다. 대략 20 g의 아비셀 (Avicel) (Cat. No. PH105, Fluka Chemika)을 500 ml의 85% H3PO4에 서서히 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하고, 4 리터의 빙냉수에 붓 고, 교반하지 않으면서 30분 동안 놓아 두었다. 상부 액체층을 제거한 후, 4 리터의 냉각수를 첨가하고, 철처히 혼합하고, 물로 5회, 1% NaHC03로 1회, 다시 물로 5회 반복하였다 (최종 pH 6-7). 셀룰로스 현탁액을 원심분리하여 (5000 x g, 20분)하여 농축시키고, 발효를 위한 기질로 사용하였다. 이 점성 현탁액은 결정질 셀룰로스와 비결정질 셀룰로스의 혼합물을 함유하였다.
인산-팽윤 셀룰로스에 존재하는 비결정질 셀룰로스의 비율은 CelY 및 CelZ 엔도글루카나제로의 반복 절단을 통해 추정하였다. SZ21 (pCPP2006)의 24-시간 배양물을 단기간 초음파처리하고, 원심분리하고 (5,000 x g, 10 분), 상등액을 엔도글루카나제 (∼ 20 U/ml))의 공급원으로 사용하였다. 대략 1 g의 점성, 산-팽윤 셀룰로스를 중량이 측정된 6개의 원심분리 튜브 각각에 넣었다. 두 개는 대조구 (효소 없음)로 사용하였고, 초기 건조 중량 및 수분 함량을 측정하기 위해 건조하였다. 엔도글루카나제 (9 ml)를 4개의 튜브에 첨가하고, 이들을 35℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 클로로포름 (2 방울)을 각 튜브에 첨가하여 미생물 생장을 지연시켰다. 원심분리 (5,000 x g, 20 분) 후, 새로운 효소 시료를 사용하여 72시간에 걸쳐 총 6회의 연속 처리가 이루어지도록 상기 과정을 반복하였다. 튜브를 다양한 시점에서 꺼내 원심분리하고, 증류수로 1회 세척하여 가용성 생성물 및 염을 제거하고, 70℃에서 일정한 중량까지 건조하였다. 비결정질 셀룰로스는 엔도글루카나제 분해로 인한 건조물의 감소로서 계산하였다.
비결정질 셀룰로스의 발효
산 팽윤 셀룰로스 (40 g, 멸균되지 않은 것)를 125-ml 플라스크 중에서 루리아 브로쓰의 10 X 농축물 5 ml 및 시드 배양물 5 ml (0.33 mg/L의 세포 건조 중량)와 혼합하였다. 스펙티노마이신 (100 ㎍/ml) 및 클로람페니콜 (40 ㎍/ml) 둘 다를 첨가하여 오염을 막았다. 어플리케이터 스틱 (applicator stick)을 사용하여 점성 혼합물을 초기에 혼합한 후, 35℃에서 인큐베이션하였다. 높은 초기 점성 때문에, 플라스크를 처음 2시간 동안 200 rpm에서 혼합한 후 120 rpm에서 혼합하였다. 가스 크로마토그래피로 에탄올을 측정하였다 (Beall et al. (1991) Biotechnol. Bioeng 38 : 296-303).
점성
10-ml 수직 유리 피펫을 통한 유속을 조절함으로써 산-팽윤 셀룰로스 시료의 점성을 22℃에서 측정하였다. 글리세롤 용액을 표준물로 사용하였다. 발효 브로쓰의 경우 2초 내지 75초의 유동 시간이 관찰되었는데, 이는 각각 1 내지 1,300 센티포아즈의 점성에 상응한다.
결과
클레브시엘라 옥시토카의 에탄올생산성 유도체에 의해 나타나는 엔도글루카나제 활성의 비교
에르위니아 크리산테미로부터 유래된 엔도글루카나제 유전자를 함유하는 에탄올생산성 균주는 글루코스 발현 과정 동안 실질적인 수준의 활성을 나타내었다. 최대 활성은 celZ 및 celY 둘다를 함유하는 균주 SZ21 (pCPP2006)에 의해 나타났다 (배양물 1 ml 당 29.3 ±1.6 U). celZ만을 함유하는 균주 SZ6 (pCPP2006)는 배양 물 1 ml 당 22.5 ±1.7 U의 활성을 나타내었고, celY만을 함유하는 균주 SZ22 (pCPP2006) (균주 SZ21의 celZ이 결실된 것)은 배양물 1 ml 당 1.0 ±0.1 U의 활성을 나타내었다. 대략 60%의 활성이 각 균주로부터 나타났고, 이 수치는 세포와 관련되어 있고, 상기 활성은 약한 초음파처리에 의해 쉽게 유리되었다. 모균주 P2 (pCPP2006)에서는 엔도글루카나제 활성이 검출되지 않았다.
셀로비오사이드의 분석
박층 크로마토그래피 및 HPLC에 의해 셀로비오사이드의 함량을 분석하였다. 시그마 케미칼 캄파니로부터 구입한 셀로비오사이드 시료와 본 발명자들의 실험실에서 제조한 셀로비오사이드 시료는 유사하였다. 두 박층 크로마토그램 (도 17, 패널 A와 B)의 레인 1은 발효 초기에 시그마 제품의 대표적인 분리 패턴을 보여준다. 소량의 글루코스와 셀로비오스가 중간량의 셀로트리오스와 셀로헥사오스, 및 대량의 셀로테트라오스와 셀로펜타오스와 함께 존재하였다. 그러나, 가장 강한 구역은 기시점에 남아 있었다. 이 구역은 6개를 초과하는 잔기를 갖는 셀로비오사이드 및 특징규명되지 않은 다른 화합물을 함유하였다.
HPLC 분석도 박층 크로마토그램과 일치하였다. 시그마 제품은 3% 글루코스, 3% 셀로비오스, 13% 셀로트리오스, 25% 셀로테트라오스, 22% 셀로펜타오스 및 9% 셀로헥사오스를 함유하였다. 피크 면적을 기초로 할 때, 대략 25%의 사카라이드가 6개보다 더 많은 잔기를 가졌다. 본 발명자들의 실험실에서 제조한 셀로비오사이드는 7% 글루코스, 6% 셀로비오스, 10% 셀로트리오스, 15% 셀로테트라오스, 12% 셀로펜타오스, 19% 셀로헥사오스 및 6개보다 많은 글루코실 잔기를 갖는 30%의 사카 라이드를 함유하였다.
셀로비오사이드의 발효
도 17은 균주 P2 (pCPP2006) 및 균주 SZ21 (pCPP2006) (엔도글루카나제 CelY 및 CelZ 둘 다를 분비하는 유도체)에 의한 셀로비오사이드(Sigma Chemical Company)의 발효를 비교하는 박층 크로마토그램을 보여준다. 균주 P2에 의한 글루코스, 셀로비오스 및 셀로트리오스의 활용이 확인되었고 이는 특히 36 시간 후에 분명하였다. 그러나, 이 균주는 더 이상 셀로비오사이드를 대사시킬 수 없었다. 반대로, 균주 SZ21은 사실상 모든 분리된 셀로비오사이드 및 출발 물질의 일부를 분해하고 대사시켰다. 이는 10시간 후 SZ21 발효물에서의 셀로비오스 및 셀로트리오스의 함량은 처음에 존재했던 함량보다 수배 더 높았다는 사실과 관련되어 있다. 이 증가는 분비된 CelY 및 CelZ에 의한 보다 긴 셀로비오사이드의 가수분해로 인한 것이다.
분비된 엔도글루카나제의 효과도 실험실에서 제조한 셀로비오사이드로부터의 에탄올 생산 동안 조사하였다 (표 17). 낮은 기질 농도 때문에 낮은 수준의 에탄올만이 생산된다 할지라도, CelZ 엔도글루카나제의 효과는 명백히 자명하다. 모균주 P2 (pCPP2006) 및 균주 SZ22 (pCPP2006; CelY만을 함유함)은 CelZ를 분비하는 두 균주인 SZ6 (pCPP2006; CelZ만을 함유함) 및 SZ21 (pCPP2006; CelY 및 CelZ를 함유함)가 생산하는 에탄올의 절반을 생산하였다. 엔도글루카나제 CelY는 셀로비오사이드를 기질로 사용한다는 이점을 갖지 않았는데, 이는 장쇄 기질을 필요로 하지 않는다는 것과 일치하였다.
에탄올 수율은 7개 미만의 글루코실 잔기를 함유하는 셀로비오사이드를 기준으로 측정하였다 (표 17). 엔도글루카나제 CelZ를 생산하는 두 종의 균주에서 평균 62%의 이론적 수율이 관찰되었다. 보다 더 높은 수율 (90%를 넘는 수율)은 균주 P2에 의한 100 g/L 셀로비오스의 발효 과정 동안 미리 측정하였다 (Wood & Ingram 1992). 낮은 농도의 셀로비오사이드에서 관찰된 보다 낮은 수율은 부분적으로는 증발에 의한 손실 및 보다 많은 비율의 탄소가 세포 생장에 유용되는 것 때문인 것으로 생각된다.
인산 팽윤 셀룰로스의 비결정질 셀룰로스 함량
산 팽윤 셀룰로스는 셀룰로스 리본 사이의 광범위한 수소 결합으로 인해 산의 제거 과정 및 저장 과정 동안 부분적으로 재결정화한다. 에르위니아 크리산테미 CelY 및 CelZ는 비결정질 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 가수분해하지만, 결정질 셀룰로스는 가수분해할 수 없다. 엔도글루카나제 가수분해에 대한 결정질 셀룰로스의 이러한 내성을 이용하여, 불용성 물질 (건조 중량)이 손실되었을 때 비결정질으로 남아 있는 세척된 산-팽윤 셀룰로스의 비율을 평가하였다. 비결정질 셀룰로스 샘플은 신선한 엔도글루카나제 시료 (∼20 U/ml)와 함께 반복해서 인큐베이션하였다. 초기 12시간 처리 후, 28%의 건조 중량이 용해되었다. 연속 4회의 처리 후, 43%가 용해되었고 마지막 2회의 처리 동안 일정하게 유지되었다. 43%라는 이 값은 비결정질 상태로 남아 있는 셀룰로스 비율의 추정치를 나타낸다. 비결정질 셀룰로스의 실제 비율은 다소 더 낮을 수 있는데, 이는 상기 추정치가 원심분리 및 세척 과정 동안 일어날 수 있는 결정질 셀룰로스의 손실도 포함하기 때 문이다.
비결정질 셀룰로스의 발효
고수준의 엔도글루카나제의 기능적 발현은 클레브시엘라 옥시토카 P2의 2종의 유도체에 의한 비결정질 셀룰로스의 에탄올로의 직접적 전환을 허용하기에 충분하다 (표 17; 도 18). 3가지 비결정질 셀룰로스 농도를 시험한 결과는 유사하였다.
가장 높은 수준은 CelY 엔도글루카나제와 CelZ 엔도글루카나제를 함께 분비하는 균주 SZ21 (pCPP2006)에 의해 생산되었다. 보다 낮은 수준의 에탄올은 CelZ만을 분비하는 균주 SZ6 (pCPP2006)에 의해 생산되었다. 소량의 에탄올은 모균주 P2 (pCPP2006; 엔도글루카나제를 분비하지 않음) 및 CelY만을 분비하는 균주 SZ22 (pCPP2006)에 의해 시드 배지 중의 잔류 글루코스로부터 생산되었다. CelY와 CelZ의 조합 효과는 CelY만의 효능이 없을지라도 에탄올 생산 및 에탄올 수율에 대해 상승작용을 나타내는 것으로 생각된다. 균주 SZ21 (pCPP2006; 두 효소를 모두 분비함)에 대한 에탄올 수율은 이론적인 최대치의 58% 내지 76%이었다. 에탄올 생산에 대한 이 상승작용적 효과는 기질 특이성의 차이로 인해 증가된 가수분해 때문에 나타날 수 있다.
비결정질 셀룰로스의 발효 과정 동안의 점성 변화
엔도글루카나제-분비 균주에 의한 비결정질 셀룰로스의 발현 과정 동안 현저한 점성 변화가 관찰되었다 (도 18). 순수한 글리세롤의 점성과 거의 유사한 점성으로부터 물의 점성과 가까운 점성까지 감소되는 가장 큰 점성 감소는 SZ6 (pCPP2006 ; CelZ만을 분비함) 및 SZ21 (pCPP2006; CelY 및 CelZ을 분비함)의 경우 처음 2시간의 인큐베이션 동안 분명히 나타났다. SZ22 (pCPP2006; CelY만을 분비함)에서는 보다 덜 현저한 변화가 관찰되었고, 대조구로 사용된 모 균주 P2 (pCPP2006)에서는 어떠한 변화도 나타나지 않았다. 점성의 변화는 12시간 후 본질적으로 완결되었다.
점성의 차이는 표 17에서 실험 4에 대한 발효 말기에서 정량하였다 (도 18, 패널 C). 점성의 차이는 3차수의 크기 정도 만큼 변화하였다. 엔도글루카나제를 생산하지 않는 P2 (pCPP2006)의 경우 최대치의 최종 점성 (1,300 센티포아즈)가 관찰되었다. 엔도글루카나제 CelY만에 의한 가수분해로 인해 SZ22 (pCPP2006)를 사용한 발효 과정 동안 점성이 절반 (500 센티포아즈)만큼 감소하였다. 발효 말기, CelZ를 분비하는 두 균주로부터 얻은 브로쓰의 점성은 물의 점성과 본질적으로 동일하였다 (SZ21 (pCPP2006; CelY 및 CelZ)의 경우 1 센티포아즈이고, SZ6 (pCPP2006; CelZ 단독)의 경우 2 센티포아즈임). 분명하게는, CelZ 단독은 CelY 단독보다 더 효과적이었다. 두 효소가 에탄올의 생성시 (표 17; 도 18) 및 당화 과정 동안 상승적으로 작용한다 할지라도, 발효 말기 (96시간 후)에 비교할 경우 CelY와 CelZ의 생성 때문에 얻어지는 다른 이점은 없었다.
요컨대, 예를 들어, 클레브시엘라 옥시토카 균주 SZ21을 사용한 이 결과는 보충 효소 없이 셀로비오사이드 및 비결정질 셀룰로스를 에탄올로 직접 생전환시키기에 충분한 셀룰라제 효소를 생산하고자 하는 목표를 향해 전진하였음을 입증한다. 이 균주에 의해 생산되는 엔도글루카네제의 수준은 에탄올 발효 동안 효모 및 다른 박테리아의 개조된 균주에 대해 이미 보고되어 있는 수준보다 10배 넘은 수준 만큼 더 높다 (Brestic-Goachet et al. 1989, Cho et al. 1999, Cho & Yoo 1999, Misawa et al. 1988, Su et al. 1993, Van Rensburg et al. 1996,1998). 게다가, 균주 SZ21에 의해 생산되는 엔도글루카나제의 수준은 대략적으로 시판되는 셀룰라제 농축물에 존재하는 엔도글루카나제 활성의 1%에 해당한다 (Nieves et al. 1998, Tomme et al. 1995, Wilson et al. 1997).
비결정질 셀룰로스의 가수분해에 있어서 균주 SZ21의 효과는 에르위니아 크리산테미로부터 유래되고 상승작용적으로 작용하는 두 가지 엔도글루카나제 효소의 조합으로부터 발생된다 (Guiseppi et al. 1991, Zhou & Ingram 2000). 게다가, 이들 분비된 효소들은 셀로비오스 및 셀로트리오스의 효율적인 섭취와 대사를 제공하는 클레브시엘라 옥시토카에서 포스포트랜스퍼라제 시스템과 함게 작용한다 (Wood & Ingram 1992, Lai et al. 1997).
셀로비오사이드 및 비결정질 셀룰로스로부터의 에탄올 생산
실험 균주 기질 기질 ((g/L)(a) N 에탄올(b) (g/리터) 이론적 수율%(c)
1 P2 (pCPP2006) 셀로비오사이드(d) 6.0 2 1.06 33
1 SZ6 (pCPP2006) 셀로비오사이드 6.0 2 2.04 63
1 SZ21 (pCPP2006) 셀로비오사이드 6.0 2 2.02 62
1 SZ22 (pCPP2006) 셀로비오사이드 6.0 2 0.93 26
2 P2 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 6.85 3 1.77 ±0.06 0
2 SZ6 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 6.85 3 3.97 ±0.12** 57
2 SZ21 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 6.85 3 4.67 ±0.06** 76
2 SZ22 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 6.85 3 1.80 ±0.01 0
3 P2 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 15.34 3 1.85 ±0.01 0
3 SZ6 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 15.34 3 6.07 ±0.18** 49
3 SZ21 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 15.34 3 7.84 ±0.35** 70
3 SZ22 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 15.34 3 1.92 ±0.02 0
4(e) P2 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 28.96 1 1.90 0
4 SZ6 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 28.96 1 10.1** 51
4 SZ21 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 28.96 1 11.3** 58
4 SZ22 (pCPP2006) 비결정질 셀룰로스 28.96 1 1.80 0
a는 원심분리하여 에탄올의 공급원인 시드 브로쓰를 제거함으로써 셀로비오사이드를 위한 접종물을 모았다. 평균 1.85 g/L의 에탄올을 사용된 시드 브로쓰 중에서 잔류 당으로부터 생산하여 3개의 비결정질 셀룰로스 발효물을 접종하였다.
b **는 값이 에르위니아 크리산테미의 엔도글루카나제를 코딩하는 유전자를 갖지 않는 대조 균주 (P2)의 값과는 상당히 다름을 나타낸다 (p < 0.001).
c 수율은 셀로비오스 1 그램 당 0.54 g의 에탄올, 및 비결정질 셀룰로스 1 그램 당 0.56 g의 에탄올로 추정되는 이론적 최대치의 퍼센트로서 계산한다. 비결정질 셀룰로스의 경우 수율은 접종물 중의 당으로부터 생성되는 에탄올을 뺀 후 계 산된다.
d 셀로비오사이드 (g/L)는 글루코스와, 7개 미만의 글루코실 잔기를 함유하는 셀로비오사이드의 합을 나타낸다.
e 실험 2 및 3에서 최대 편차 계수는 평균값의 4.5%이었다. 유사한 편차 계수 (측정된 값의 5%)를 추정함으로써 실험 3에 대한 유의성도 예상하였다.
등가 사항
당 업계의 숙련인은 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가 사항을 통상적인 실험을 이용하여 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가 사항은 다음 청구의 범위에 포함된다. 또한, 미국 특허 제5,821,093호, 5,482,846호, 5,424,202호, 5,028,539호, 5,000,000호, 5,487,989호, 5,554,520호 및 5,162,516호에 기재된 임의의 많은 유전자 제작물, 숙주 세포 및 방법은 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있으며 그 전문이 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> BC International <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR SIMULTANEOUS SACCHARIFICATION AND FERMENTATION <130> BCI-024CPPC <140> <141> <150> 60/214,137 <151> 2000-06-26 <150> 60/219,913 <151> 2000-07-21 <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> Zymomonas mobilis <220> <223> promoter <400> 1 ctttttcggc atgagcaacc aacattttca aggtatcatc ctgatgcgca atatcggcat 60 cggttagcca taaccatttt acctgtccgg cggccttaat accttgatca gatggttcgt 120 ggtgttgtta ccttgccgaa gggcaccggt aaaaatgttc gcgtcggtgt tttcgcccgt 180 ggcccgaaag ctgaagaagc taaagctgct ggtgcagaag ttgtcggcgc agaagacctg 240 atggaagcca ttcagggcgg cagcattgat ttcgatcgtg atgcccttta tactgaaatt 300 gccttgcgct gccataatga agcagcctcc ggtgttttgg cagatttaag cgctgcctga 360 ttttcgtgat cctctagagt ctatgaaatg gagattcatt tatgcctctc tcttattcgg 420 ataaccatcc agtcatccgc aagcttggcc 450 <210> 2 <211> 1509 <212> DNA <213> Zymomonas mobilis <220> <223> expression vector <400> 2 gatcaaccgg caatttatcc acggcatcaa attcgatctg tcttttcccg tatcattggc 60 aataccggca ttctgattac aggccgtgtt ttgaatgcgg tatgcagttt tgtctatgtc 120 gcatggacat cccagacatt gggattgaac ctgtttggtg tcatgctttt gattacgact 180 tttgctaccc tgatttcgga tattacccgt tttcagtcat ggcaaacctt gctgcattac 240 ggttcaaaag cttttcagga aaaagatttt aaccaatttg atgatgtcct tgccttttgc 300 atcagagccg atttttttag tgcggcgata ggtatgttgg tagggttagg cggtatcttg 360 attttaggca cttcaagatt gggatggcct gccgaggtca agccagatgc cttgctttgt 420 atgctgatta tactttttat gaatatcggc tggtccaacc gggatgttgc ggctgtgtaa 480 ccgctttaaa ctggtcacta tttatgagtt tattacgacc tgcgtcagaa ccggaggttg 540 tggcattggt tattggcttc atatgccttt ggggtatttt ttgtttatat ggtgcctgac 600 gcaattcacg ctttttgtca cctgtagtta cgctggcatt tatctctttc accaatatac 660 ggagcgagca tttccgataa gaaaaatatt tcagagaaaa acgcccgttg aagggatgtg 720 gaaattcact ttaagcgtca gttttaatga aatcctagac tccattttcc agcagggtgg 780 cacccttgct attggtagct cactgggggc tggggaagcc gctgtctatc gggtcgcgcg 840 ccagattagt aacggtttat ccaaaccagc acagatgatg atcggctaac atgcatccac 900 cggcagcacc ggccgtttta tgcttgggat tattgatatg ccgaaaagga tacaacatct 960 ggaagaaaaa gacgaaggcc ggaataagcg cccattctgc aaaattgtta caacttagtc 1020 gcgccatcag ggaatgaaaa atcaatccgt ctttttcggc atgagcaacc aacattttca 1080 aggtatcatc ctgatgcgca atatcggcat cggttagcca taaccatttt acctgtccgg 1140 cggccttaat accttgatca gatggttcgt ggtgttgtta ccttgccgaa gggcaccggt 1200 aaaaatgttc gcgtcggtgt tttcgcccgt ggcccgaaag ctgaagaagc taaagctgct 1260 ggtgcagaag ttgtcggcgc agaagacctg atggaagcca ttcagggcgg cagcattgat 1320 ttcgatcgtg atgcccttta tactgaaatt gccttgcgct gccataatga agcagcctcc 1380 ggtgttttgg cagatttaag cgctgcctga ttttcgtgat cctctagagt ctatgaaatg 1440 gagattcatt tatgcctctc tcttattcgg ataaccatcc agtcatccgc aagcttggcc 1500 gtaatccat 1509 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 cgaattcctg ccgaagttta ttagcca 27 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 aaggatcctt 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<400> 11 ggcgcgcc 8 <210> 12 <211> 11544 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:vector <220> <223> all occurrences of n to be sequenced <220> <223> nucleotide positions 1-1451 ecodes promoter <220> <223> nucleotide positions 1452-2735 encodes celZ gene <220> <223> nucleotide positions 4916-5776 encodes bla gene <220> <223> nucleotide positions 7061-8251 encodes tet gene <220> <223> nucleotide positions 9476-11544 encodes target sequence from K. oxytoca <220> <221> CDS <222> (1452)..(2735) <220> <221> CDS <222> (4916)..(5776) <220> <221> CDS <222> (7061)..(8251) <400> 12 gatcaaccgg caatttatcc acggcatcaa attcgatctg tcttttcccg tatcattggc 60 aataccggca ttctgattac aggccgtgtt ttgaatgcgg tatgcagttt tgtctatgtc 120 gcatggacat cccagacatt gggattgaac ctgtttggtg tcatgctttt gattacgact 180 tttgctaccc tgatttcgga tattacccgt tttcagtcat ggcaaacctt gctgcattac 240 ggttcaaaag cttttcagga aaaagatttt aaccaatttg atgatgtcct tgccttttgc 300 atcagagccg atttttttag tgcggcgata ggtatgttgg tagggttagg cggtatcttg 360 attttaggca cttcaagatt gggatggcct gccgaggtca agccagatgc cttgctttgt 420 atgctgatta tactttttat gaatatcggc tggtccaacc gggatgttgc ggctgtgtaa 480 ccgctttaaa ctggtcacta tttatgagtt tattacgacc tgcgtcagaa ccggaggttg 540 tggcattggt tattggcttc atatgccttt ggggtatttt ttgtttatat ggtgcctgac 600 gcaattcacg ctttttgtca cctgtagtta cgctggcatt tatctctttc accaatatac 660 ggagcgagca tttccgataa gaaaaatatt tcagagaaaa acgcccgttg aagggatgtg 720 gaaattcact ttaagcgtca gttttaatga aatcctagac tccattttcc agcagggtgg 780 cacccttgct attggtagct cactgggggc tggggaagcc gctgtctatc gggtcgcgcg 840 ccagattagt aacggtttat ccaaaccagc acagatgatg atcggctaac atgcatccac 900 cggcagcacc ggccgtttta tgcttgggat tattgatatg ccgaaaagga tacaacatct 960 ggaagaaaaa gacgaaggcc ggaataagcg cccattctgc aaaattgtta caacttagtc 1020 gcgccatcag ggaatgaaaa atcaatccgt ctttttcggc atgagcaacc aacattttca 1080 aggtatcatc ctgatgcgca atatcggcat cggttagcca taaccatttt acctgtccgg 1140 cggccttaat accttgatca gatggttcgt ggtgttgtta ccttgccgaa gggcaccggt 1200 aaaaatgttc gcgtcggtgt tttcgcccgt ggcccgaaag ctgaagaagc taaagctgct 1260 ggtgcagaag ttgtcggcgc agaagacctg atggaagcca ttcagggcgg cagcattgat 1320 ttcgatcgtg atgcccttta tactgaaatt gccttgcgct gccataatga agcagcctcc 1380 ggtgttttgg cagatttaag cgctgcctga ttttcgtgat cctctagagt ctatgaaatg 1440 gagattcatt t atg cct ctc tct tat tcg gat aac cat cca gtc atc gat 1490 Met Pro Leu Ser Tyr Ser Asp Asn His Pro Val Ile Asp 1 5 10 agc caa aaa cac gcc cca cgt aaa aaa ctg ttt cta tct tgt gcc tgt 1538 Ser Gln Lys His Ala Pro Arg Lys Lys Leu Phe Leu Ser Cys Ala Cys 15 20 25 tta gga tta agc ctt gcc tgc ctt tcc agt aat gcc tgg gcg agt gtt 1586 Leu Gly Leu Ser Leu Ala Cys Leu Ser Ser Asn Ala Trp Ala Ser Val 30 35 40 45 gag ccg tta tcc gtt agc ggc aat aaa atc tac gca ggt gaa aaa gcc 1634 Glu Pro Leu Ser Val Ser Gly Asn Lys Ile Tyr Ala Gly Glu Lys Ala 50 55 60 aaa agt ttt gcc ggc aac agc tta ttc tgg agt aat aat ggt tgg ggt 1682 Lys Ser Phe Ala Gly Asn Ser Leu Phe Trp Ser Asn Asn 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2690 Thr Lys Gly Thr Cys Ile Pro Gln Thr Gly Thr Leu His Pro Phe Arg 400 405 410 gca gcg att cct cct ggg cac agg ttg gta gct gta act aat tga 2735 Ala Ala Ile Pro Pro Gly His Arg Leu Val Ala Val Thr Asn 415 420 425 ttaatctttt cacccccaaa ataacagggc tgcgattgca gcctgatacg caacattcca 2795 ttacttaatt gcgttcaaaa gcgcccaaat ccggtgcgct gccttgtaac taatatgatt 2855 tctctttcgt acccgcgtta atcagctttg agttagccga cagacggaac agcgaggttg 2915 ccggcaacgt gccgtcatta tcacgagata cggtagccag cgaggtgtcc aggctgacga 2975 atcggacgcg gaagccgctg tccgtatcca tgagttgact cgcatccgca ttactgaccg 3035 ttgcagaagc agacagagac acgttgttgc ggaagtaatg tttctgtcct gactggacgt 3095 tgctcccgaa agcataatta atgccgtttt tatatgacgt gttatttatt accgtacgcc 3155 gccgcgttat tgttctggtc aaaacctttg ctcacgttgc caaacgcgac gcaacgggta 3215 atgcgatgat tgccgaccgc tggttcctcc cagtttgaac ccgttggcat tgccggcgaa 3275 cgcgctnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3335 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3395 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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngatc ctctagagtc 4295 gacctgcagg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 4355 tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 4415 ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat 4475 gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcataggcg cgcctatggt 4535 gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 4595 cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 4655 tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 4715 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 4775 cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 4835 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 4895 aatattgaaa aaggaagagt atg agt att caa cat ttc cgt gtc gcc ctt att 4948 Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile 1 10 ccc ttt ttt gcg gca ttt tgc ctt cct gtt ttt gct cac cca gaa acg 4996 Pro Phe Phe Ala Ala Phe Cys 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ggc ttg gtt atg ccg gta ctg ccg ggc ctc ttg cgg gat atc gtc 7168 Ile Gly Leu Val Met Pro Val Leu Pro Gly Leu Leu Arg Asp Ile Val 30 cat tcc gac agc atc gcc agt cac tat ggc gtg ctg cta gcg cta tat 7216 His Ser Asp Ser Ile Ala Ser His Tyr Gly Val Leu Leu Ala Leu Tyr 40 50 gcg ttg atg caa ttt cta tgc gca ccc gtt ctc gga gca ctg tcc gac 7264 Ala Leu Met Gln Phe Leu Cys Ala Pro Val Leu Gly Ala Leu Ser Asp 60 cgc ttt ggc cgc cgc cca gtc ctg ctc gct tcg cta ctt gga gcc act 7312 Arg Phe Gly Arg Arg Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Thr 70 80 atc gac tac gcg atc atg gcg acc aca ccc gtc ctg tgg atc ctc tac 7360 Ile Asp Tyr Ala Ile Met Ala Thr Thr Pro Val Leu Trp Ile Leu Tyr 90 100 gcc gga cgc atc gtg gcc ggc atc acc ggc gcc aca ggt gcg gtt gct 7408 Ala Gly Arg Ile Val Ala Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala Val Ala 110 ggc gcc tat atc gcc gac atc acc gat ggg gaa gat cgg gct cgc cac 7456 Gly Ala Tyr Ile Ala Asp Ile Thr Asp Gly Glu Asp Arg Ala Arg His 120 130 ttc ggg ctc atg agc gct tgt ttc ggc gtg ggt atg gtg gca ggc ccc 7504 Phe Gly Leu Met Ser Ala Cys Phe Gly Val Gly Met Val Ala Gly Pro 140 gtg gcc ggg gga ctg ttg ggc gcc atc tcc ttg cat gca cca ttc ctt 7552 Val Ala Gly Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ser Leu His Ala Pro Phe Leu 150 160 gcg gcg gcg gtg ctc aac ggc ctc aac cta cta ctg ggc tgc ttc cta 7600 Ala Ala Ala Val Leu Asn Gly Leu Asn Leu Leu Leu Gly Cys Phe Leu 170 180 atg cag gag tcg cat aag gga gag cgt cga ccg atg ccc ttg aga gcc 7648 Met Gln Glu Ser His Lys Gly Glu Arg Arg Pro Met Pro Leu Arg Ala 190 ttc aac cca gtc agc tcc ttc cgg tgg gcg cgg ggc atg act atc gtc 7696 Phe Asn Pro Val Ser Ser Phe Arg Trp Ala Arg Gly Met Thr Ile Val 200 210 gcc gca ctt atg act gtc ttc ttt atc atg caa ctc gta gga cag gtg 7744 Ala Ala Leu Met Thr Val Phe Phe Ile Met Gln Leu Val Gly Gln Val 220 ccg gca gcg ctc tgg gtc att ttc ggc gag gac cgc ttt cgc tgg agc 7792 Pro Ala Ala Leu Trp Val Ile Phe Gly Glu Asp Arg Phe Arg Trp Ser 230 240 gcg acg atg atc ggc ctg tcg ctt gcg gta ttc gga atc ttg cac 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Ala Ser Ala Ser Thr Trp Asn Gly Leu Ala Trp Ile 260 270 gta ggc gcc gcc cta tac ctt gtc tgc ctc ccc gcg ttg cgt cgc ggt 8224 Val Gly Ala Ala Leu Tyr Leu Val Cys Leu Pro Ala Leu Arg Arg Gly 280 gca tgg agc cgg gcc acc tcg acc tga atggaagccg gcggcacctc 8271 Ala Trp Ser Arg Ala Thr Ser Thr 290 gctaacggat tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag aactgtgaat 8331 gcgcaaacca acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag cagccgcacg 8391 cggcgcatct cggggtcgac tctagaggat ccccgcaacg ctgtcagcgc tttccagtta 8451 aacggctcca acgtcgccat aggtaattcc tcgcccggcc atacgatcgg gcaggtgccg 8511 ttggctatcg ccgtcgcctg actcatcaca ctatcttccg ctgcatcgcg aagggttttg 8571 accacttctt ccatctctcc gtgcgccgga tgccatgctc acgtacgcgg cttatcagat 8631 agtcgggcag gccgtcgttc cagcccaatg aggggaagct ggcgtggagc gatgccagca 8691 cctgctcctc aacaccgtaa tggccggcgg cgaacaggca ttcggcggta agcgcttcca 8751 gccctttaat catcacgctg cggcacatct tgatagccga cacgctgcca acgtggttac 8811 caccatagcg ggcgttacat ccaagcgtgg tgagtaattc agcaattgcc tctgcctgtg 8871 gtccccccgt caacagcggc gttcggagtg cccctggggg gaccggcgcc atcaccgcta 8931 catcgacata agcgccgggc ttaaagcatt tggcagcctg acgcttggtc tgcggggcga 8991 cggagttaag gtcaagaaaa tactgcgtgt cggtcatcag cggtgcagct tgtgaggcga 9051 catccagggc ggatcccgcg gtgacggtgg aaaatatgag ttcggcacct gtcaacgcgt 9111 cagccaggga gattgccgcc cgcacgcctc cccgatgcgc cttcgttatc atcgcatcgc 9171 gctcaggacc ttgcagcttg caatcccaga cggtgactgg gttcactttt gccagtgcat 9231 ccgcaagaat gccacctgct tcaccataac ctataaacgt tattgtcgtc ataacagctc 9291 cttacgcggc cacacgtcgg ccggaatgca aacgtcgccc gcgaacagaa gtcgcgccgt 9351 acgcagcaga ccgcagcctg ccaactgccc attatcatca agccggagcg ccacgctgaa 9411 ttgggtaccg agctccgaat tgggtaccga gctcgaatta attcgagctc ggtacccggg 9471 gatcnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9531 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9591 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9651 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9711 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9771 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9831 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9891 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9951 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10011 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10071 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10131 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10191 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10251 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10311 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10371 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10431 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10491 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10551 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10611 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10671 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10731 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10791 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10851 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10911 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10971 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11031 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11091 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11151 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11211 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11271 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11331 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11391 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11451 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11511 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 11544 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 13 ctgttccgtt accaacac 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 14 gtgaatggga tcacgagt 18 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 15 accatcagca tcaacgccca acaacg 26 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 16 gactggatgg ttatccgaat aagagagagg 30 <210> 17 <211> 11772 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <220> <223> unsequenced Erwinia DNA fragment from nucleotide position 1143 to 144 <220> <223> P1 promoter region for celZ from nucleotide position 4424 to 2974 <220> <223> guide fragment for integration from nucleotide position 4677 to 7573 <220> <223> sequenced partial guide fragment from nucleotide position 4677 to 5752 <220> <223> unsequenced partial guide fragment from nucleotide position 5753 to 7573 <220> <223> P2 promoter region for celY from nucleotide position 7585 to 8576 <220> <223> R6K-Y ori from nucleotide position 10388 to 10763 <220> <223> FRTF lipase-binding sequence from nucleotide position 16 to 50 <220> <223> FRTFlipase-binding sequence from nucleotide position 10058 to 10092 <220> <223> ce1Z gene product is encoded by the complement of nucleotides 2973 to 1690 <220> <223> celY gene product is encoded by the nucleotides 8576 to 9574 <220> <223> kanamicin-resistance gene product is encoded by the complement of nucleotides 11621 to 10827 <400> 17 atcgatgaat tgatccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaattgtcga 60 caagcttgat 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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 960 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1080 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1140 nnnagcgcgt tcgccggcaa tgccaacggg ttcaaactgg gaggaaccag cggtcggcaa 1200 tcatcgcatt acccgttgcg tcgcgtttgg caacgtgagc aaaggttttg accagaacaa 1260 taacgcggcg gcgtacggta ataaataaca cgtcatataa aaacggcatt aattatgctt 1320 tcgggagcaa cgtccagtca ggacagaaac attacttccg caacaacgtg tctctgtctg 1380 cttctgcaac ggtcagtaat gcggatgcga gtcaactcat ggatacggac agcggcttcc 1440 gcgtccgatt cgtcagcctg gacacctcgc tggctaccgt atctcgtgat aatgacggca 1500 cgttgccggc aacctcgctg ttccgtctgt cggctaactc aaagctgatt aacgcgggta 1560 cgaaagagaa atcatattag ttacaaggca gcgcaccgga tttgggcgct tttgaacgca 1620 attaagtaat ggaatgttgc gtatcaggct gcaatcgcag ccctgttatt ttgggggtga 1680 aaagattaat caattagtta cagctaccaa cctgtgccca ggaggaatcg ctgcccggaa 1740 cggatgaagt gtaccagttt gcggtataca ggttcccttt gtagacgatc gattggcctg 1800 cttcgttatg agtcgctgcc ggcccgccca gtctttgcta acccagttgg ggtaaacgtt 1860 ggcattgcag caatcagcgg tttgccggtg tgtcggttgt ggtcggttcg tcaacggtgg 1920 tgccatggtg gtatcggttg actgatcggt tgttgtactg gcggcgctgc ccgctttata 1980 tggccagctt tgaatgatcg attttactat tttacccgac tcggtcaggt ttttagagtc 2040 cggataatag gttgatgccc cttcgctttt atcatttaac gcccagtttg cgttgctgat 2100 gttgttgtca cgcatgaacg ttacccaggc gtcggtatct gtctggttca ctccgccatt 2160 gccgtccgcg ttaacggcgc cccactcggt gacgaaaagc gcaataccgt tatttaacgc 2220 ctggcgggct ttagtgcgta atgactcacc atgggttccc gcgtagaaat gcagcgtata 2280 ggcgatattc ttggcgttga ttggatcgcg cgacgcttca tcaacgtttt gcgaccaact 2340 gggcgtaccg acaataatca ggttatccgg gtcaatggcg cgaatggcgg aaatcacggc 2400 ttcggcataa ggtttaatgg tattgctcca tgaaacctga agcggctcgt tgtagatttc 2460 ataaatgaca ttcggcttgt tgccatattt gcgcgccatt tcctggaaga agcgaatggc 2520 ttcactgcga ttgttttctg cagaatgtga gtgccagtca ataatcacat acatatcgtt 2580 ggcgattgcg gcatccacca ctctttcaac tttggccttg ttgccagccg ggtcctgcag 2640 ataaccaccg ctttcctgaa cgcccatagc ggcgcgaaca atgctggatt tccagtcttt 2700 tttcagcgac gcaacggtat cggctgtgta gaatttttcc ccaccccaac cattattact 2760 ccagaataag ctgttgccgg caaaactttt ggctttttca cctgcgtaga ttttattgcc 2820 gctaacggat aacggctcaa cactcgccca ggcattactg gaaaggcagg caaggcttaa 2880 tcctaaacag gcacaagata gaaacagttt tttacgtggg gcgtgttttt ggctatcgat 2940 gactggatgg ttatccgaat aagagagagg cataaatgaa tctccatttc atagactcta 3000 gaggatcacg aaaatcaggc agcgcttaaa tctgccaaaa caccggaggc tgcttcatta 3060 tggcagcgca aggcaatttc agtataaagg gcatcacgat cgaaatcaat gctgccgccc 3120 tgaatggctt ccatcaggtc ttctgcgccg acaacttctg caccagcagc tttagcttct 3180 tcagctttcg ggccacgggc gaaaacaccg acgcgaacat ttttaccggt gcccttcggc 3240 aaggtaacaa caccacgaac catctgatca aggtattaag gccgccggac aggtaaaatg 3300 gttatggcta accgatgccg atattgcgca tcaggatgat accttgaaaa tgttggttgc 3360 tcatgccgaa aaagacggat tgatttttca ttccctgatg gcgcgactaa gttgtaacaa 3420 ttttgcagaa tgggcgctta ttccggcctt cgtctttttc ttccagatgt tgtatccttt 3480 tcggcatatc aataatccca agcataaaac ggccggtgct gccggtggat gcatgttagc 3540 cgatcatcat ctgtgctggt ttggataaac cgttactaat ctggcgcgcg acccgataga 3600 cagcggcttc cccagccccc agtgagctac caatagcaag ggtgccaccc tgctggaaaa 3660 tggagtctag gatttcatta aaactgacgc ttaaagtgaa tttccacatc ccttcaacgg 3720 gcgtttttct ctgaaatatt tttcttatcg gaaatgctcg ctccgtatat tggtgaaaga 3780 gataaatgcc agcgtaacta caggtgacaa aaagcgtgaa ttgcgtcagg caccatataa 3840 acaaaaaata ccccaaaggc atatgaagcc aataaccaat gccacaacct ccggttctga 3900 cgcaggtcgt aataaactca taaatagtga ccagtttaaa gcggttacac agccgcaaca 3960 tcccggttgg accagccgat attcataaaa agtataatca gcatacaaag caaggcatct 4020 ggcttgacct cggcaggcca tcccaatctt gaagtgccta aaatcaagat accgcctaac 4080 cctaccaaca tacctatcgc cgcactaaaa aaatcggctc tgatgcaaaa ggcaaggaca 4140 tcatcaaatt ggttaaaatc tttttcctga aaagcttttg aaccgtaatg cagcaaggtt 4200 tgccatgact gaaaacgggt aatatccgaa atcagggtag caaaagtcgt aatcaaaagc 4260 atgacaccaa acaggttcaa tcccaatgtc tgggatgtcc atgcgacata gacaaaactg 4320 cataccgcat tcaaaacacg gcctgtaatc agaatgccgg tattgccaat gatacgggaa 4380 aagacagatc gaatttgatg ccgtggataa attgccggtt gatcgatccc cgggtaccga 4440 gctcgaattc cgagcttggc gcgcctatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 4500 gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat 4560 cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 4620 taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat 4680 tccatcaacg cttgctgtaa ccaggagcca aagctatgaa tgtacctttt agctactcgt 4740 cacccaccct gagcgttgag gcgttaaagc actctattgc ttataagctg atgtttatca 4800 tcggcaaaga cccggctatc gctaacaagc atgaatggct caacgccacg ctgttcgccg 4860 ttcgcgatcg tatggttgag cgctggctgc gctcaaaccg cgcgcacgtc tctcaggaag 4920 ttcgccaggt ttactacctg tcgatggaat ttttgattgg ccgtacgttg tccaacgcgc 4980 tgttatcgct cggcatttat gaggatgtga acagcgcgct ggaagagatg gggctgaacc 5040 ttgaagaatt aattgatgaa gaaaacgacc cgggcttagg caacggcggt cttggtcgtc 5100 tggcggcctg cttcctcgat tcgcttgcgg cgctggggtt accgggccgc ggctacggta 5160 ttcgctacga ctacgggatg tttaagcaga atatcgtcga tgggcggcag aaagaatccc 5220 cggattactg gctggaatac ggtaacccgt gggagttcga gcgccataat acgcgctaca 5280 aagtgcgctt cggcggacgc attcagcagg aaggtaaata ctcccgctgg gtggagaccg 5340 aagagattat tgccgaagcc tatgaccaga ttatccctgg cttcgacacc gacgccacca 5400 acacgctgcg cctgtggagc gcccaggcca gcagcgagat taacctcggt aaattcaacc 5460 agggcgacta cttcgcggcg gtggaagata aaaaccattc cgagaacgtg tcgcgggtac 5520 tctatccgga tgactcgacc tattcaggac gcgagctgcg cctgcggcag gagtacttcc 5580 tcgtttcggc gacggtgcag gacatcctca gccgccacta ccagctgcat aaaacctacg 5640 ccaacctggc ggacaaaatc gcgattcatc tcaacgacac gaacccggtg ctgtcgattc 5700 cggagctgat gcgcctgctg attgacgagc ataagatcag ctgggatgag ggnnnnnnnn 5760 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5820 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5880 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5940 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6000 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6060 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6420 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6480 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6540 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6600 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6660 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6720 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6780 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6840 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6900 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6960 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7020 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7080 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7140 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7200 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7260 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7320 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7380 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7440 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7500 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 7560 nnnnnnngaa ttcgagctcg gtacccgggg atcgacataa ccgataggtc ctgcattgat 7620 ggactgaaag gtttcgacgg cggttgtgtg ggttttgctt gcccatctgg cggcatgaat 7680 agtgtcattc atgacgatcc agttcgatat tcaacagacc gtctttgtaa tcggcaccga 7740 caattttgat caataaagcg tttgacctga tgcatgaggg taaatccatt cgttcggttg 7800 ttcttttctg attacctgtc ctgttaacct gtggatatag aaggtcggtt caatgagtag 7860 tattctgacg catctgacaa ttggttccaa tgacctgaag aaggcgcgca tcttttatga 7920 tgctgttttg gaaccgttgg gtatcaaact tattcgcgag gtcgaaggac agcgttttgc 7980 ctatggtaaa gacggcgaag aaggacgcat catcattgta aagcctatta atggtgaagc 8040 cgctaccgct ggaaatggta tcactatcgg tttggcagcg ccttctgatg aagctgtcga 8100 tgctttttat aaagcaggct tggctaatgg cggtaaggat gccggagaac cggggcctcg 8160 tccggctgct aataattctc ggggtgccta tttatatgac cctgaaggca ataaaatctg 8220 cgctttcaat tttaaataag atttctttgg tgcagggtta ttcaaaatag ccctgcattt 8280 tcagtattat agcggccatt atggcttttg ccttgataaa aaatttatca gggctgtttt 8340 tcgtgatgaa tatttttgat ttttcaagaa aagcctgata tcttccaaca tctttctttg 8400 tatataaatg gagcgagcta tggcgcgcgt aactgtcgaa gactgtatcg ataaagttca 8460 taatcgtttc gatttgatcc tctagagtca acctgcttgt tactcgtgat cccattcaca 8520 agggcgaatt aattcgccct tctgttccgt taccaacact tgagccggag gcataatggg 8580 aaagccaatg tggcgttgtt gggcgttgat gctgatggtg tggttcagtg cgtcggctac 8640 ggcggcgaac ggctgggaaa tctataaaag ccgtttcatg accacggacg ggcgcattca 8700 ggataccggc aataagaatg tcagccacac cgaaggtcag ggattcgcca tgctgatggc 8760 ggtgcattac gatgaccgca tcgcgttcga taacctgtgg aactggacgc aaagccacct 8820 gcggaacacg accagcggct tgttctactg gcgttacgat ccgtcggcgg ccaatccggt 8880 ggtggataag aacaacgcct cggatggcga tgtgctgatt gcctgggcgt tgttaaaagc 8940 gggaaataag tggcaggaca accgttacct gcaggcgtcg gacagcatcc agaaagcgat 9000 catcgccagc aatatcattc agtttgcggg ccgcaccgtg atgttgcccg gcgcctatgg 9060 tttcaacaag aacagctatg tgatccttaa cccgtcgtat ttcctgttcc cggcctggcg 9120 cgactttgct aaccgcagcc atcttcaggt gtggcggcaa ctgattgacg acagcctgtc 9180 attggtcgga gaaatgcgtt tcggtcaggt cgggctgccg acggactggg cggcgctgaa 9240 cgcggatggc tcgatggcgc cggcgacggc ctggccgtcg cgtttcagtt acgacgccat 9300 tcgtatcccg ctgtatttgt actggtatga cgccaaaacc acggcgctgg tgccgttcca 9360 gctgtactgg cgtaactatc cccgcctgac gacgccggcc tgggttgatg tgctgagcag 9420 taacaccgcg acttacaata tgcagggcgg tttgctggcg gtgcgcgacc tgacgatggg 9480 caacctcgac gggctcagcg atctgccagg cgcatcggaa gattactact cgtcgagcct 9540 gcgcctgctg gtgatgttgg cgcgcggtaa ataaccttat tcttgcggta cacatggcga 9600 ggacgatgtc cttgccattt tccccacttt tatccctctg aatggcgtgt ttttcacgct 9660 ttgttaacct gcttgttact cgtgatccca ttcacaaggg cgaattgacc tgcaggcatg 9720 caagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 9780 ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 9840 gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 9900 gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 9960 cttccgctgg cgcgccaggt cgactctaga ggatccccgg ggaagatctt ccggaagatc 10020 ttcccgagct cgaattaatt ccgcgatgaa ttgatcccgg aagttcctat tctctagaaa 10080 gtataggaac tcgaattggt cgacaagcta gcttgcatgc aagcttgtat tctatagtgt 10140 cacctaaatc gtatgtgtat gatacataag gttatgtatt aattgtagcc gcgttctaac 10200 gacaatatgt acaagcctaa ttgtgtagca tctggcttac tgaagcagac cctatcatct 10260 ctctcgtaaa ctgccgtcag agtcggtttg gttggacgaa ccttctgagt ttctggtaac 10320 gccgttccgc accccggaaa tggtcagcga accaatcagc agggtcatcg ctagcccatg 10380 gctaattctg tcagccgtta agtgttcctg tgtcactgaa aattgctttg agaggctcta 10440 agggcttctc agtgcgttac atccctggct tgttgtccac aaccgttaaa ccttaaaagc 10500 tttaaaagcc ttatatattc ttttttttct tataaaactt aaaaccttag aggctattta 10560 agttgctgat ttatattaat tttattgttc aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga 10620 gagcttagta cgttagccat gagagcttag tacgttagcc atgagggttt agttcgttaa 10680 acatgagagc ttagtacgtt aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga gagcttagta 10740 cgtactatca acaggttgaa ctgcggatct tgcggccgca aaaattaaaa atgaagtttt 10800 gacggtatcg aaccccagag tcccgctcag aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg 10860 atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg 10920 ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc 10980 acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc cattttccac catgatattc 11040 ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc cgtcgggcat ccgcgccttg 11100 agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga 11160 tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga tgcgatgttt cgcttggtgg 11220 tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg 11280 gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc 11340 aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg 11400 cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtctt ggagttcatt cagggcaccg 11460 gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg 11520 gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa 11580 gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatca tgcgaaacga tcctcatcct 11640 gtctcttgat ccactagatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 11700 catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 11760 agtgccacct gc 11772

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  86. pLOI2352 (서열 17)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
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  111. 제1 분해 활성을 가지며 에르위니아 (Erwinia) 유래의 celZ에 의해 코딩되는 제1 엔도글루카나제를 코딩하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제1 이종 폴리뉴클레오티드, 및
    제2 분해 활성을 가지며 에르위니아 유래의 celY에 의해 코딩되는 제2 엔도글루카나제를 코딩하며 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는 제2 이종 폴리뉴클레오티드
    를, 상기 제1 분해 활성:제2 분해 활성의 비율이 9:1 내지 19:1의 범위로 존재하도록 포함하여 상기 제1 엔도글루카나제와 제2 엔도글루카나제에 의한 올리고사카라이드 분해작용을 상승시키며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드와 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 상기 대리 프로모터가 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
  112. 제111항에 있어서, 상기 분해작용이 1.1배 내지 2.0배 범위만큼 상승되는 것인 벡터.
  113. 제112항에 있어서, 상기 배수가 1.8배인 벡터.
  114. 제86항 및 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  115. 제114항에 있어서, 상기 제1 엔도글루카나제, 상기 제2 엔도글루카나제 또는 이들 둘 다가 분비되는 것인 재조합 숙주 세포.
  116. 제114항에 있어서, 박테리아 세포인 재조합 숙주 세포.
  117. 제116항에 있어서, 상기 박테리아 세포가 장내세균과 (Enterobacteriaceae)로부터 선택되는 것인 재조합 숙주 세포.
  118. 제117항에 있어서, 에세리키아 (Escherichia) 또는 클레브시엘라 (Klebsiella)인 재조합 숙주 세포.
  119. 제118항에 있어서, 이. 콜라이 (E. coli) B, 이. 콜라이 DH5α, 및 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca)로 구성되는 군에서 선택되는 재조합 숙주 세포.
  120. 제114항에 있어서, 추가 효소를 발현하는 유전자를 더 포함하는 재조합 숙주 세포.
  121. 제120항에 있어서, 상기 추가 효소가 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-크실라나제, α-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 재조합 숙주 세포.
  122. 제120항에 있어서, 상기 추가 효소가 에탄올생산성 효소인 재조합 숙주 세포.
  123. 제122항에 있어서, 상기 효소가 피루베이트 데카르복실라제 및 알코올 데히드로게나제로 구성되는 군에서 선택되는 에탄올생산성 효소인 재조합 숙주 세포.
  124. 제120항에 있어서, 상기 추가 효소가 분비 효소인 재조합 숙주 세포.
  125. 제124항에 있어서, 상기 분비 효소가 클레브시엘라 유래의 pul 또는 에르위니아 유래의 out 유전자 생성물인 재조합 숙주 세포.
  126. 제114항에 있어서, 에탄올생산성 세포인 재조합 숙주 세포.
  127. 제126항에 있어서, 이. 콜라이 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜라이 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜라이 KO12 (ATCC 55125), 이. 콜라이 LY01 (ATCC 11303) 및 클레브시엘라 옥시토카 P2 (ATCC 55307)로 구성되는 군에서 선택되는 재조합 숙주 세포.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7537826B2 (en) 1999-06-22 2009-05-26 Xyleco, Inc. Cellulosic and lignocellulosic materials and compositions and composites made therefrom
DK1581617T3 (da) * 2002-02-08 2011-05-16 Danisco Us Inc Fremgangsmåder til fremstilling af slut-produkter fra kulstof-substrater
US7504245B2 (en) * 2003-10-03 2009-03-17 Fcstone Carbon, Llc Biomass conversion to alcohol using ultrasonic energy
WO2005100582A2 (en) 2004-03-25 2005-10-27 Novozymes Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides
WO2006016596A1 (ja) * 2004-08-12 2006-02-16 Oji Paper Co., Ltd. リグノセルロース材料からの繊維成分の製造およびその利用
US20150328347A1 (en) 2005-03-24 2015-11-19 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
US7708214B2 (en) 2005-08-24 2010-05-04 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
JP5437631B2 (ja) * 2005-07-01 2014-03-12 ザ ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インク エタノール産生のための組み換えホスト細胞及び培地
KR100725021B1 (ko) * 2006-02-16 2007-06-07 주식회사 마크로젠 일차 대사산물의 대량 생산 방법, 대량 생산 균주 및 이의제조 방법
WO2008008793A2 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 Dyadic International Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
MY157916A (en) 2006-07-21 2016-08-15 Xyleco Inc Conversion system for biomass
JP2010514448A (ja) 2006-12-28 2010-05-06 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド アシアリル化免疫グロブリンを生成するための方法およびベクター
BRPI0810375A2 (pt) * 2007-04-19 2014-10-29 Mascoma Corp Pré-tratamento termoquímico combinado e refino de biomassa lignocelulósica
KR20100029088A (ko) 2007-05-31 2010-03-15 노보자임스 인코포레이티드 셀룰로오스성 물질의 분해를 위한 조성물
CA2737544A1 (en) 2008-09-18 2010-03-25 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and compositions for degrading pectin
CA2739451A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Mascoma Corporation Production of pure lignin from lignocellulosic biomass
DK2361311T3 (en) * 2008-11-21 2017-04-24 Lallemand Hungary Liquidity Man Llc MAKE EXPRESSIVE CELLULASES FOR SIMULTANEOUS INSURANCE AND ACTION BY CELLULOSE
CN102471764B (zh) * 2009-07-03 2014-07-09 明治制果药业株式会社 包含源自两种不同的微生物的内切葡聚糖酶的纤维素酶调制物
CN107287250A (zh) * 2009-12-23 2017-10-24 丹尼斯科美国公司 提高同步糖化发酵反应效率的方法
WO2011100571A1 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Bp Corporation North America Inc. Bacteria capable of using cellobiose and methods of use thereof
PL3401410T3 (pl) 2010-06-26 2021-11-29 Virdia, Llc Sposoby wytwarzania mieszanek cukrów
IL206678A0 (en) 2010-06-28 2010-12-30 Hcl Cleantech Ltd A method for the production of fermentable sugars
IL207945A0 (en) 2010-09-02 2010-12-30 Robert Jansen Method for the production of carbohydrates
GB2524906B8 (en) 2011-04-07 2016-12-07 Virdia Ltd Lignocellulose conversion processes and products
US9617608B2 (en) 2011-10-10 2017-04-11 Virdia, Inc. Sugar compositions
US20130167837A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Renmatix, Inc. Compositions comprising c5 and c6 monosaccharides
GB2535435B (en) 2012-05-03 2016-12-07 Virdia Inc Methods for treating lignocellulosic materials
KR101448209B1 (ko) * 2012-09-05 2014-10-08 한국생명공학연구원 신규 당화효소 생성 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법
CN104769116A (zh) 2012-11-09 2015-07-08 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
WO2014072390A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2014160402A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Mascoma Corporation Co-conversion of carbohydrates to fermentation products in a single fermentation step
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
AU2015254648B2 (en) 2014-04-30 2018-11-08 Versalis S.P.A. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016054792A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Cathay R&D Center Co., Ltd. Expression of recombinant tetracycline efflux pumps for the production of lysine or lysine-derived products, and methods and applications thereof
BR112017012813B1 (pt) 2014-12-19 2023-03-28 Dsm Ip Assets B.V Processo para a preparação de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico
EP3242871B1 (en) 2015-01-07 2019-11-06 Virdia, Inc. Methods for extracting and converting hemicellulose sugars
CN104673857A (zh) * 2015-02-13 2015-06-03 山东大学 一种葡萄糖耐受的纤维寡糖酶的应用
WO2016191503A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Virdia, Inc. Integrated methods for treating lignocellulosic material

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5839517B2 (ja) * 1974-09-20 1983-08-30 カブシキガイシヤ バイオリサ−チセンタ− セルロ−スカラ アルコ−ルオセイゾウスル ホウホウ
US5162516A (en) * 1988-05-31 1992-11-10 University Of Florida Cloning and sequencing of the alcohol dehydrogenase II gene from Zymomonas mobilis
US5487989A (en) * 1988-08-31 1996-01-30 Bioenergy International, L.C. Ethanol production by recombinant hosts
US5424202A (en) * 1988-08-31 1995-06-13 The University Of Florida Ethanol production by recombinant hosts
US5028539A (en) * 1988-08-31 1991-07-02 The University Of Florida Ethanol production using engineered mutant E. coli
US5554520A (en) * 1988-08-31 1996-09-10 Bioenergy International, L.C. Ethanol production by recombinant hosts
US5482846A (en) * 1988-08-31 1996-01-09 University Of Florida Ethanol production in Gram-positive microbes
US5000000A (en) * 1988-08-31 1991-03-19 University Of Florida Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
US5821093A (en) * 1988-08-31 1998-10-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
WO1998045425A1 (en) 1997-04-07 1998-10-15 University Of Florida Research Foundation, Inc. DEVELOPMENT OF HIGH-ETHANOL RESISTANT $i(ESCHERICHIA COLI)
CN100335639C (zh) * 1999-05-26 2007-09-05 佛罗里达大学研究基金会 适用于同时糖化和发酵的重组宿主

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