KR100608154B1 - 유전자 도입 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 레트로바이러스를 사용하여, 유전자를 표적 세포내로 도입하는 개선된 방법에 관한 것으로서, 여기서 유전자 도입 효율이 개선되고, 표적 세포가 레트로바이러스를 수송체로서 고정화되고 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질에 결합시키고 세척하며; 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 물질로서, 특이적으로 세포를 인식할 수 있는 항체, 라미닌 또는 만노오스-풍부 형 당쇄를 사용하거나; 표적 세포를 전-처리하여 트랜스 페린 수용체를 불활성 시키기거나, 신규한 기능적 그룹을 기능적 물질내로 도입시켜 효율적으로 형질전환되는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 의학, 세포 기술, 유전 공학, 발생 기술 등 각 분야에서 표적 세포내로 유전자 도입 효율을 증가시키고, 표적 세포를 효율적으로 형질도입 시킬 수 있는 방법 및 이와 함께, 관련된 일체의 기술에 관한 것이다.
많은 인간 질병의 기작이 밝혀졌다. 재조합 DNA 기술 및 유전자를 세포내로 도입하는 기술은 급속도로 성장하여 왔다. 이런 환경하에서, 심각한 유전병을 치료하는 체세포 유전자 치료요법에 대한 프로토콜이 최근 발전하고 있다. 더욱 최근에는, 유전병 치료및 AIDS 및 암과 같은 바이러스 감염의 치료에 유전자 치료요법을 적용시키려는 시도가 일고 있다.
지금까지 인간에게 임상 적용으로 연구되어 왔던 대부분의 유전자 치료요법에서, 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 세포내로 도입시켰다. 레트로바이러스 벡터는 관심의 대상인 외부 유전자를 세포내로 효율적으로 도입시키고, 유전자를 그의 염색체 DNA내로 안정하게 통합시킨다. 그러므로, 이는 특히, 장기간 유전자 발현을 요구하는 유전자 치료요법에서 유전자를 도입시키는 바람직한 수단이다. 이런 벡터를 다양하게 변화시켜, 도입된 유전자로 인해 유기체가 악영향을 갖지 않도록 해왔다. 예를 들면, 벡터의 복제 기능을 제거하면 유전자 도입 에 사용되는 벡터는, 무한적으로 감염을 반복(유전자 도입)하는 동안, 세포내에서 복제하지 않는다.
이러한 벡터( 복제-결핍 레트로바이러스 벡터)는 자율적으로 복제할 수 없기 때문에, 바이러스 입자에 싸여있는 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 레트로바이러스-생산 세포(패키징(packaging) 세포)를 사용하여 제조된다. 유전자를 표적 세포내로 효율적으로 도입하는 가장 단순한 방법은 표적 세포를 레트로바이러스-생산 세포와 함께 공생-배양하는 것을 포함한다. 그러나, 이 방법에서 레트로바이러스-생산 세포는 생체내로 이식된 유전자가 도입되는 표적 세포내에서 오염될 수 있다.
최근, 세포외 기질의 성분, 피브로넥틴, 또는 그의 단편의 존재가 리트로바이스를 사용하여 세포내로 유전자를 도입하는 효율을 증가시킨다는 것이 보고 되었다.(J.Clin. Invest., 93:1451-1457(1994)); Blood, 88:855-862 (1996)). 또한, 유전 공학 기술에 의해 생산된 피브로넥틴 단편은 유사한 성상을 갖고 조혈 간세포내로 외부 유전자를 효율적으로 도입하는데 사용될 수 있다는 것이 증명되었다. (WO 95/26200). 레트로바이러스가 피브로넥틴중 헤파린-결합 부위에 결합하는 것은, 피브로넥틴에 의해 유전자 도입의 효율이 증가된다는 것을 증명한다.
또한, WO 97/18318에는, 섬유아세포 성장 인자와 같은 피브로넥틴 이상의 기능적 물질이 유전자 도입 효율을 증가시킨다는 것이 공개되었다. 또한, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질 및 세포에 결합하는 활성을 갖는 또다른 기능적 물질의 혼합물을 사용할 때, 유사한 유전자 도입 효율의 증가가 관찰되었다고 공개공보에 개시되어 있다.
기능적 물질을 사용하는 유전자 도입 방법을 통해, 레트로바이러스-생산 세포와 표적 세포를 공생 배양시키지 않고, 효율적으로 유전자를 도입할 수 있다. 이 방법으로 유전자 도입 효율이 증가한 것은, 기능적 물질의 도움으로, 밀접하게 함께 편재되어 있는 레트로바이러스 및 표적 세포사이의 상호 작용의 기회가 증가했기 때문이라고 여겨진다.
레트로바이러스를 사용한 유전자 도입에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시켜 상기 기재된 바와 같이, 유전자를 도입한다. 그러나, 레트로바이러스를 사용한 유전자 도입의 효율은 실제 임상 적용에 있어서는 여전히 만족스럽지 못하다. 따라서, 감염 효율을 더욱 증가시키는 것이 요구된다.
사용된 바이러스 현탁액(상등액)중의 레트로바이러스의 농도(역가)를 증가시켜 감염 효율 또는 유전자 도입 효율을 증가시킬 수 있다. 그러나, 고역가 바이러스를 생산할 수 있는 바이러스-생산자 세포를 작제하고 설정하는 것은 일반적으로 많은 노동력을 요구한다. 소포상 구내염 바이러스[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8033-8037(1993)]으로부터 얻은 외피 단백질을 사용하는 위(pseudo)-형 바이러스 벡터를 원심분리법에 의해 농축시킬 수 있다. 그러나, 그 농도는 이 벡터에서만 사용 가능하므로, 이는 넓게 사용될 수 없다.
또한, 표적 세포의 순도가 낮아도, 유전자 도입에서 레트로바이러스를 사용한 표적 세포의 특이적 감염은 높은 유전자 도입 효율을 나타낼 수 있다. 그러나, 현재 이 분야에서 편리하고 효율적인 방법은 공지되지 않았다.
상기에서 기재한 바와 같이 상황을 고려하여, 본 발명의 주 목적은 , 유전자 도입 효율이 증가되고, 표적 세포가 효율적으로 형질도입되는, 레트로바이러스를 사용하여 유전자를 표적 세포내로 도입시키는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
이하에서, 본 발명의 다른 목적 및 장점을 첨부된 도면과 관련하여 상세히 설명할 것이다.
도 1은 분자 내에 9개의 만노오스 잔기를 포함하는 고 만노오스형 당쇄의 구조이다.
도 2는 실시예 3에서, 화학적으로 변형된 CH-296을 사용하여 얻은 유전자 도입 효율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 13에서, 바이러스 감염-억제 물질의 제거 효과에 대한 연구에서, 상대적 유전자 도입 효율(%)과 접촉/결합 시간과의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 15에서, 원심분리법을 사용한 레트로바이러스와 기능적 물질의 결합 효과에 대한 연구에서, 상대적 유전자 도입 효율(%)과 각 바이러스-결합 과정사이의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 15에서, 원심분리법 또는 원심분리-감염법을 사용하여 얻은 유전자 도입 효율(%)을 나타내는 그래프이다.
본 발명자는 유전자 도입 효율은, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖고 레트로바이러스와 함께 기질상에 고정화되는 기능적 물질을 레트로바이러스에 접촉 시키고 이어서, 표적 세포를 감염시키기 앞서, 기질을 세척함으로써 증가된다는 것을 밝혀냈다.
본 발명자는 또한, 표적 세포, 라미닌, 라미닌으로부터 유도된 당쇄 또는 고 만노오스형 당쇄에 특이적으로 결합하는, 항체와 같은 기능적 물질의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시켜, 유전자를 관심의 대상인 표적 세포내로 특이적으로 및/또는 효율적으로 도입시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명자는 더욱이, 표적 세포내로 유전자를 도입시키기 전에, 적당히 표적 세포를 전처리하여 유전자 도입 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다.
또한, 본 발명자는 기능적 물질을 화학적으로 변형하여 염기성을 증가시킴으로써 바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 유전자 도입에 대한 효과를 증진시킬 수 있다는 것도 밝혀냈다.
본 발명은, 발명자에 의한, 이들 신규한 밝힘을 기초로 완성되었다.
따라서, 본 발명의 첫번째 태양은;
1)레트로바이러스를 함유하는 용액을 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖고 기질상에 고정화되는 기능적 물질과 접촉시키고;
2)레트로바이러스가 결합된 기질을 세척하며;
3)레트로바이러스가 결합된 기질을 표적 세포와 접촉시키고 배양하는,
것을 포함함을 특징으로하는, 레트로바이러스를 사용하여 유전자를 표적 세포내로 도입하는 방법이다.
제한없이, 상기 단계(1)은 예를 들면, 1시간 이상동안 바람직하게는 3시간 이상동안 수행된다. 또한, 레트로바이러스와 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 접촉 빈도를 물리적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 예로, 제한되는 것은 아니지만, 피브로넥틴, 섬유아세포 성장 인자, 콜라겐 V형, 폴리리신 및 DEAE-덱스트란, 및 그의 단편 및 레트로바이러스에 결합하는 동등한 활성을 지닌 물질을 포함한다. 기능적 물질은 표적 세포에 결합하는 활성을 가질 수 있다. 다르게는, 기능적 물질은 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 또 다른 기능적 물질과 함께 배합하여 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 세포-접착 단백질, 호르몬, 사이토카인, 항체, 당쇄, 탄수화물 및 대사 산물을 포함한다.
예를 들면, 본 발명에서 레트로바이러스-생산 세포의 배양 상등액을 유전자 도입용 레트로바이러스로 사용할 수 있다. 소듐 부티레이트와 같은, 레트로바이러스 생산을 증진시키는 물질의 존재하에서 배양 상등액을 얻을 수 있다.
본 발명의 두번째 태양은 두가지 기능적 물질;
1)레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질; 및
2)표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체
의 존재하에서 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스를 사용하여 표적 세포내로 유전자를 도입하는 방법이다.
본 발명에서 사용되는, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 예는, 제 한되는 것은 아니지만, 표적 세포 표면상의 생물학적 물질을 인식하는 것을 포함한다.
본 발명의 세번째 태양은 두가지 기능적 물질;
1)레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질; 및
2)라미닌, 라미닌 단편, 라미닌으로부터 유래된 당쇄 또는 고 만노오스형 당쇄
의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염킴을 포함하는 것을 특징으로하는, 레트로바이러스를 사용하여 표적 세포내로 유전자를 도입하는 방법이다.
본 발명의 둘째 및 셋째 태양에서 사용할 수 있는, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 피브로넥틴, 섬유아세포 성장 인자, 콜라겐 V형, 폴리리신 및 DEAE-덱스트란, 및 그의 단편 및 레트로바이러스에 결합하는 동등한 활성을 지닌 물질을 포함한다. 기능적 물질은 표적 세포에 결합하는 활성을 가질 수 있다. 또한, 기능적 물질을 적당한 기질상에 고정화시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 네번째 태양은, 표적 세포를 레트로바이러스와 접촉시키기 전에, 철(Fe)을 낮은 농도로 함유하는 배지 중에서 표적 세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로하는 레트로바이러스를 사용하여 유전자를 표적 세포내로 도입하는 방법이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 배양 배지의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 디페록사민을 함유하는 배지를 포함한다. 바람직하게는, 이 방법은 기능적 물질의 존재하에서 수행된다.
본 발명의 다섯번째 태양은, 화학적으로 펩티드 또는 단백질을 변형시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 펩티드 또는 단백질의 레트로바이러스에 결합하는 활성을 증가시키는 방법이다. 화학적 변형의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 디펩티드 또는 단백질의 아미노 산 잔기의 활성화 및 염기성 잔기의 도입을 포함한다. 예를 들면, 아미노 산 잔기의 활성화는 바람직하게는 펩티드 또는 단백질을 수용성 카보디이미드 또는 수용성 카보디이미드 및 디아미노 화합물로, 제한없이 처리하여 수행된다. 이 방법으로 얻은, 화학적으로 변형된 펩티드 또는 단백질은 레트로바이러스를 사용하여 표적 세포내로 유전자를 도입하는데 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자 도입 방법에 재조합 레트로바이러스 벡터를 보통 사용한다. 특히, 바람직하게는, 복제-결핍 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용한다. 그런 벡터의 복제 능력은 제거되었기 때문에, 감염된 세포내에서 자율적으로 복제할 수 없고, 그러므로, 벡터는 비-병원성이다. 벡터는 척추 동물 세포(특히, 포유류 세포)와 같은 숙주 세포내로 침입할 수 있고, 벡터내에 삽입된 외부 유전자를 염색체 DNA내로 안정적으로 통합시킬 수 있다.
본 발명에서, 세포내로 도입시키려는 외부 유전자를 적당한 프로모터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터중의 LTR 프로모터 또는 외부 프로모터의 조절하에서 재조합 레트로바이러스 벡터내로 삽입시켜 사용할 수 있다. 또한, 프로모터와 협력하는 또 다른 조절 요소( 예를 들면, 인핸서 서열 또는 종결자 서열) 및 전사 시작 부위가 외부 유전자의 효율적인 전사를 달성하기 위해 벡터내에 존재할 수 있다. 도입되는 외부 유전자는 자연적으로 생성된 유전자 또는 인공적으로 제조된 유전자일 수 있다. 다르게는, 외부 유전자는, 다른 기원의 DNA분자가 결찰(ligation) 또는 본 분야에서 공지된 다른 수단으로 연결된 것일 수 있다.
레트로바이러스 벡터내로 삽입되려는 외부 유전자로서, 세포내 도입이 요구되는 어느 유전자도 선택할 수 있다. 예를 들면, 치료하려는 질병과 관련된 효소 또는 단백질, 세포내 항체(참조, 예를 들면, WO 94/02610), 성장 인자, 안티센스(antisense) 핵산, 라이보자임(ribozyme), 위-프라이머( false primer) (참조, 예를 들면, WO 90/13641) 또는 유사물을 암호화하는 유전자가 외부 유전자로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 레트로바이러스 벡터는, 유전자가 도입된 세포를 선별할 수 있도록 적당한 표식 유전자를 함유할 수 있다. 예를 들면, 세포에 항생물질에 대한 내성을 갖게하는 약제-내성 유전자 또는 효소 활성을 검출하여 유전자 도입된 세포를 구별할 수 있는 리포터 유전자를 표식 유전자로 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 벡터는 예를 들면, MFG 벡터(ATCC No. 68754), α-SGC 벡터(ATCC No. 68755) 및 LXSN 벡터[BioTechniques, 7:980-990 (1989))]와 같은 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 이하 실시예에서 사용되는, PM5neo 벡터[Exp. Hematol., 23:630-638 (1995)]를 포함하는 레트로바이러스 벡터는 표식 유전자로 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase) 유전자를 함유한다. 따라서, 벡터를 사용하여 유전자가 도입된 세포를, 지수로 G418에 대한 그들의 내성에 근거하여 확인할 수 있다.
이 벡터는, 공지된 패키징(packaging) 세포주 예를 들어, PG13 (AATCC CRL- 10686), PG13/LNc8 (ATCC CRL-10685), PA317 (ATCC CRL-9078), GP+E-86 (ATCC CRL-9642), GP+envAm12 (ATCC CRL-9641) 및 φCRIP [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:64640-6464 (1988)]를 사용하여 패키징된 바이러스 입자로서 제조될 수 있다.
둘베코스 변형 이글즈 배지(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium) 및 이스코프 변형 둘베코스 배지(Iscoves Modified Dulbecco's Medium)과 같은 공지된 배지를 레트로바이러스 벡터를 패키징 세포내로 도입하여 생성된 바이러스-생산 세포를 배양하거나, 또는 표적 세포를 배양하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 배지는 예로 기브코(Gibco)가 시판한다. 유전자가 도입되는 표적 세포의 타입에 따라 또는 다른 목적에 따라 다양한 성분을 이 배지에 가할 수 있다. 예를 들면, 혈청 또는 다양한 사이토카인을 배지에 가해 표적 세포의 성장과 분화를 증진시키거나 억제시킬 수 있다. 예를 들면, 송아지 혈청(CS) 또는 송아지 태아 혈청(FCS)을 혈청으로 사용할 수 있다. 사이토카인은 인터루킨(IL-3, IL-6 등), 콜로니-자극 인자(G-CSF, GM-CSF 등), 간세포 인자(SCF), 에리스로포이에틴(erythropoietin) 및 다양한 세포 성장 인자를 포함한다. 인간으로부터 유래된 많은 사이토카인은 상업적으로 사용가능하다. 목적에 맞는 적당한 활성을 갖는 것을 사이토카인중에서 선별한다. 임의적으로, 사이토카인을 배합하여 사용할 수 있다.
바이러스-생산 세포의 배양 상등액과 같은, 레트로바이러스를 함유하는 샘플을 본 발명의 유전자 도입 방법에 사용한다. 상등액을 제조하는 방법은 특정적인 것으로 제한되지 않는다. 예들 들면, 바이러스-생산 세포 배양중에 소듐 부티레이트를 가하면 상등액중에 생산된 바이러스 입자의 양을 증가시킨다는 것이 공지되어 있다[Human Gene Therapy, 6:1195-1202(1995)]. 이렇게 제조된 고-역가 바이러스 상등액은 본 발명의 유전자 도입 방법을 사용하여 아무 문제없이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능적 물질의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시키는 것을 특징으로한다. 유효량의 이러한 기능적 물질의 존재하에서, 레트로바이러스로 세포를 감염시켜, 유전자 도입된 세포를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한, 바이러스 상등액중의 바이러스 감염-억제 물질은 기능적 물질을 사용하여 쉽게 제거될 수 있다. 또한, 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 공존은 유전자가 매우 특별하게 및/또는 효율적으로 도입되도록 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유효량은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입으로 표적 세포를 형질도입시키는 유효한 양이다. 사용되는 물질 및 표적 세포의 유형에 따라 적정량이 선택된다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 방법으로, 유전자 도입 효율을 측정하여 그 양을 결정할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 표적 세포에 결합하는 활성은 실질적으로 세포에 결합하는 활성 및 용액중의 표적 세포와 접촉을 유지하는 활성을 포함한다. 이 활성은 상기 기재한 바와 같이, 유전자 도입 효율에 대한 기여도를 근거로 측정될 수 있다. 또한, 유전자 도입 효율은 형질도입의 효율을 의미한다.
상기 언급된 기능적 물질은 용액중에 용해되거나 적당한 기질상에 고정되어 사용될 수 있다. 기능적 물질을 고정화시키는 기질은 특정한 것으로 제한되지 않는다. 일반적으로, 세포 배양용 용기 또는 비드 형태의 기질을 사용한다.
바이러스에 결합하는 활성을 갖고 기질상에 고정화되는 기능적 물질을 사용할 때, 하기에서 실시되는 단계를 사용하여, 유전자 도입 효율을 더욱 증가시킬 수 있다.
첫째, 레트로바이러스를 함유하는 액체 샘플(예, 바이러스 상등액)을 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질이 고정된 기질과 접촉시킨다. 기질을 세척한다. 이어, 기질을 직접 표적 세포에 접촉시킨다. 다르게는, 적절한 방법에 의해 기질로부터 용출된 바이러스 입자를 표적 세포에 가한다. 따라서, 유전자를 효율적으로 도입할 수 있다. 사용된, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질은 표적 세포에 결합하는 활성을 갖을 수 있다. 다르게는, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질 및 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질을 배합하여 사용할 수 있다.
레트로바이러스를 함유하는 액체 샘플을, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질이 고정화되어 있는 기질에 접촉시키는 단계를, 예를 들면, 1시간 이상, 바람직하게는 3시간이상, 제약없이 수행한다. 또한, 온도를 포함한 다른 조건은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 이 단계를 실온 또는 37℃에서 수행한다. 바이러스의 안정성등에 따라 약 4℃의 낮은 온도를 사용할 수 있다. 기능적 물질을 고정화시키기위한 기질은 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 세포 배양용 용기가 사용된 경우, 단지 표적 세포를 가하여 유전자 도입 단계를 시작할 수 있다. 예를 들면, 인산완충 식염수 또는 행크스 염수(Hanks' saline), 표적 세포 배양에 사용되는 액체 배지등을 사용하여 기질을 세척할 수 있다.
레트로바이러스와 기능적 물질의 접촉 빈도를 물리적으로 증가시켜, 레트로바이러스가 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질과 더욱 효율적으로 결합할 수 있다. 그런 물리적 수단의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 진탕, 여과 및 원심력의 사용을 포함한다. 레트로바이러스를 함유하는 액체 샘플을 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질이 바닥에 고정화되어있는 원심분리 튜브에 가하고 이어, 원심분리 튜브를 원심분리시키는 방법에 의해, 원심력을 사용하는 것이 구체적으로 예시된다. 레트로바이러스는 원심분리시, 원심력에 의해 원심분리 튜브 바닥위에 침전한다. 따라서, 레트로바이러스와 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 접촉 빈도는 증가하고, 결합 빈도도 증가한다. 상기 언급된 방법에서는, 감염시키기 위해 바이러스를 원심력에 의해 세포위로 침전시키는 방법(WO 95/10619)과 같이, 세포를 물리적 압력하에 두지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 더 높은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
존재시, 유전자 도입에 바람직하지 못한 레트로바이러스를 함유하는 샘플중에 함유된 물질을 상기 기재된 방법에 따라 제거한 후, 유전자 도입을 수행한다. 예를 들면, 본 발명의 방법으로 제거되는 물질은 바이러스 상등액중에 함유된 패키징 세포[Human Gene Therapy, 8:1459-1467(1997); J.Virol., 70:6468-6473(1996)]로부터 유래된 레트로바이러스 감염-억제 물질, 레트로바이러스 생산을 증진시키기 위해 레트로바이러스-생산 세포를 배양하는 동안 가해진 물질, 예를 들면 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-aceate)(TPA) 및 덱사메타손(dexamethasone)[Gene Therapy 2:547-551 (1995)], 및 상기 언급된 바와 같이 소듐 부티레이트를 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 피브로넥틴중의 헤파린-Π 영역, 섬유아세포 성장 인자, 콜라겐 V형, 폴리리신 및 DEAE-덱스트란, 및 이 기능적 물질과 기능적으로 동등한 물질(예, 헤파린- 결합 부위를 갖는 기능적 물질)을 포함한다. 또한, 기능적 물질의 혼합물, 기능적 물질을 함유하는 폴리펩티드, 기능적 물질의 중합체, 기능적 물질의 유도체등을 사용할 수 있다.
기능적 물질의 바이러스에 결합하는 활성은 물질을 화학적으로 변형시킴으로써 증진될 수 있다. 화학적 변형의 예는, 사용된 기능적 물질의 아미노산 잔기의 활성화 및 물질내로 염기성 잔기이 도입을 포함된다. 예를 들면, 레트로바이러스에 결합하는 활성은, 1-에틸-3-디메틸아미노프로필카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride)같은 수용성 카보디이미드로 펩티드 또는 단백질을 구성된 기능적 물질중의 유리 카르복실 그룹을 변형시킴으로써 카복실 그룹을 활성화시켜 증가될 수 있다. 또한, 레트로바이러스에 결합하는 활성은, 그의 활성화된 카르복실 그룹을 사용하여 기능적 물질내로 아미노산과 같은 염기성 잔기를 도입시켜 증가될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 표적 세포에 결합하는 리간드를 갖는 물질을 포함한다. 리간드는 세포-접착 단백질, 호르몬 또는 사이토카인, 세포 표면 항원에 대한 항체, 다당류, 당단백질, 당지질, 당단백질 또는 당지질로부터 유래된 당쇄, 및 표 적 세포의 대사산물을 포함한다. 또한, 기능적 물질을 포함하는 폴리펩티드, 기능적 물질의 중합체, 기능적 물질의 유도체, 기능적 물질의 기능적 동등물 또는 그 유사체를 사용할 수 있다.
특이적으로 표적 세포에 결합하는 항체는, 유전자를 특정 세포내로 특이적으로 및 효율적으로 도입하는데에 특히 유용하다. 본 발명에서 사용 가능한 항체는, 특정한 것으로 제한되지 않는다. 유전자가 도입되는 표적 세포상에서 발현되는 항원에 대한 항체를 용도에 맞게 적당히 선택할 수 있다. 공지된 방법에 따라, 그러한 항체를 생산할 수 있다. 다르게는, 또한 현재 상업적으로 사용 가능한 항체를 사용할 수 있다. 세포 특이성과 같은 요구되는 성상에 따라, 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체일 수 있다. 또한, 항체 또는 인간화된 항체, Fab 단편, 또는 단쇄 항체와 같이, 공지된 기술에 의해 변형된 항체의 유도체를 사용할 수 있다.
다양한 세포상의 각 백혈구 항원(또한, CD 항원으로 공지된)의 발현이 상세히 연구되어 왔다. 따라서, 본 발명의 유전자 도입 방법에서, 관심의 대상이 되는표적 세포상에서 발현되는 CD 항원을 인식하는 항체를 선별하고, 이를 사용하여 높은 특이성으로 유전자를 표적 세포내로 도입시킬수 있다. 예를 들면, 유전자 도입은 항CD4항체를 사용하여 헬퍼 T 세포(helper T cell)로, 또는 항 -CD34항체를 사용하여 조혈 간세포로 지향될 수 있다.
또한, 당단백질, 라미닌을, 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 물질로 사용하여 조혈세포같은 다양한 표적 세포내로 유전자를 효율적으로 도입시킬 수 있다. 본 발명에서 사용되는 라미닌은 쥐 또는 인간으로부터 유래될 수 있고, 또는 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 한, 그의 단편일 수 있다. 하기 실시예에서 기재되는 바와 같이, 라미닌의 당쇄는 라미닌을 사용한 유전자 도입에서 중요한 역할을 한다. 그러므로, 공지된 방법에 따라 라미닌으로부터 방출된 당 쇄를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서, 라미닌과 같이, 고 만노오스형 N-연결 당 쇄를 갖는 당단백질 또는 그로부터 방출된 또는 화학적으로 합성된 당 쇄를 사용할 수 있다. 또한, 상기 언급된 당쇄가 부착된 단백질등과 같은 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖고 부착된 당쇄가 갖는 기능적 물질을 유전자 도입에 바람직하게 사용할 수 있다.
분자중 1 내지 20 만노오스 잔기를 갖는 한, 상기 언급된 고 만노오스형 당 쇄는 특정한 것으로 제한되지 않는다. 비-환원적 말단에 만노오스 잔기를 갖는 것을 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용할 수 있다. 당쇄가 생물학적 분자(예를 들면, 단당, 올리고당, 다당, 아미노산, 펩티드,단백질 또는 지질) 또는 합성된 거대분자와 같은 인공 물질과 같은 또다른 적절한 분자에 부착되어 사용될 수 있다.
유기체로부터 유래된 대표적인 고 만노오스형 당쇄를 (만노오스)n-(GlucNAc)2로 표시되는 구조를 갖는 것에 의해 예시된다[Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 43:2631-2639(1998)]. 예를 들면, 상기에 기재된 구조를 갖고 분자중에 9개의 만노오스 잔기를 함유하는 당쇄, (만노오스)9-(GlucNAc)2 를 본 발명의 유전자 도입 방법에서 제약없이 바람직하게 사용할 수 있다(이 당쇄의 구조는 도 1에 표시 된다).
상기 기술된 기능적 물질을 자연적으로 생성된 물질로부터 얻을 수 있거나, 인공적(예를 들면, 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성 기술)으로 제조할 수 있거나, 자연적으로 생성된 물질과 인공적으로 제조된 물질을 조합시켜 제조할 수 있다. 또한, 레트로바이러스-결합 부위를 갖는 기능적 물질과 그 표적 세포-결합 부위를 갖는 또다른 기능적 물질의 혼합물을 WO 97/18318에 기술된 바와 같이, 기능적 물질을 사용하여 유전자를 도입하는데 사용할 수 있다. 다르게는, 단일 분자중에 레트로바이러스-결합 부위 및 표적 세포-결합 부위를 갖는 기능적 물질을 사용할 수 있다. 그와 자연적으로 관련된 다른 단백질이 실질적으로 없는 기능적 물질을 사용할 수 없다. 또한, 기능적 물질 또는 기능적 물질의 조합물을 표적 세포, 세포 성장 인자 및 그 유사물을 배양하는대 사용된 배지와 함께 조합시켜 유전자 도입용 키트(kit)를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는, 피브로넥틴 또는 그의 단편을 예를 들면, 문헌[J, Biol. Chem., 256:7277(1981); J.Cell. Biol., 102:449(1986)] 또는 [J. Cell. Biol., 105:489(1987)]에 기술된 방법에 따라, 자연적으로 생성된 물질로부터 실질적으로 순수한 형태로 제조할 수 있다. 피브로넥틴 또는 그의 단편을 미국 특허 제 5,198,423호에 기재된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 특별히, 하기 실시예 및 그들 얻는 방법에서 사용되는, CH-296, H-271, H-296 및 CH-271을 포함하는 재조합 폴리펩티드와 같은, 레트로바이러스-결합 부위이고 헤파린-Ⅱ 영역을 포함하는 피브로넥틴 단편이 상기 특허공보에 상세히 기술되어 있다. 이 단편을 공보에 기술된 바와 같이 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-초메 1-3소재의 National Institute of Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry에 수탁번호 FERM P-10721 (H-296)(원기탁일자 : 1989, 5, 12), FERM BP-2799 (CH-271)(원기탁일자: 1989, 5, 12), FERM BP-2800 (CH-296)(원기탁일자: 1989, 5, 12),및 FERM BP-2264 (H-271)(원기탁일자: 1989, 1, 30)하에서 기탁된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)균주를 배양하여 얻을 수 있다.
또한, 전형적으로 이 단편으로부터 유래될 수 있는 단편은 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)균주에 잠복된 플라스미드를 변형시켜 제조될 수 있다. 상기 기재된 피브로넥틴 단편중, H-296은 VLA-4에 결합하는 폴리펩티드 부위를 갖고, CH-271은 VLA-5에 결합하는 폴리펩티드 부위를 갖고, CH-296은 그 둘 모두를 갖는다[Nature Medicine, 2:876-882(1996)]
기능적 물질의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시켜, 유전자 도입된 세포를 효율적으로 얻을 수 있다. 레트로바이러스에 의한 감염은 통상적 방법, 예를 들면, 37℃에서 5% 이산화탄소하에서 배양함으로써 수행될 수 있다. 표적 세포 또는 목적에 따라 이 조건 및 배양 시간은 적절히 변화될 수 있다.
G0기에서, 표적 세포는 레트로바이러스로 감염되지 않는다. 그러므로, 전-자극시켜 세포를 세포 주기로 리드하는 것이 바람직하다. 이 목적을 위해, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시키기 이전에, 표적 세포에 적절한 성장 인자의 존재하에서 표적 세포를 배양한다. 예를 들면, 인터루킨-3, 인터루킨-6 및 간세포 인자와 같은 다양한 사이토카인을 사용하여 유전자 도입을 시키기위해 골수 세포 및 조혈 간세포를 전-자극시킨다.
세포 표면상의 수용체가 레트로바이러스로 세포를 감염시키는 것과 연관됨이 공지되어 있다. 염기성 아미노산 수송체 및 인산염 수송체가 각각 포식성 바이러스 및 암포트로픽(amphotrophic) 바이러스의 수용체로서 기능한다고 공지되어 있다[Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 93:11407-11413(1996)]. 염기성 아미노산 또는 인산염, 또는 그의 염 또는 전구체의 농도가 감소된 배지중에서 세포를 전-처리하여 표적 세포를 바이러스 감염에 민감하게 제작하여 발현 또는 수송체의 대사 전환을 활성화 시킬수 있다.
놀랍게도, 본 발명자는 바이러스 감염과 관련성은 공지되지 않은 트랜스페린(transferrin) 수용체의 활성화는 또한 레트로바이러스 감염 효율 또는 유전자 도입 효율을 증가시킨다는 것을 밝혀냈다. 트랜스페린 수용체를 어떤 제한없이, 제한된 농도의 철(Fe)을 함유하는 배지에서 표적 세포를 처리하여, 활성화시킬 수 있다. 예를 들면, 디페록사민을 가하여 철이 킬레이트(chelate)된 배지를 사용할 수 있다.
바람직하게는, 트랜스페린 활성화를 사용한 유전자 도입은 또한 상기에 기재된 바와 같이, 기능적 물질의 존재하에서 수행된다.
본 발명의 방법으로 유전자 도입에 표적 세포내로 사용될 수 있는 세포의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 간세포, 조혈 세포, 비-접착 저-밀도 단핵 세포, 접착 세포, 골수 세포, 조혈 간세포, 말초 혈액 간세포, 탯줄 혈액 세포, 태아 조혈 간세포, 배형성 간세포, 배세포, 원시 생식 세포, 난모세포, 난원세포, 난자, 정모 세포, 정자, CD34+ 세포, c-키트+ 세포, 다능 조혈 간세포, 단일 조혈 간세포, 적혈구간세포, 림프 모세포, 성숙 혈액 세포, 림프구, B 세포, T 세포, 섬유아세포, 신경모세포, 신경세포, 내피세포, 혈관내피세포, 간세포, 근원세포, 골격근세포, 민무늬근 세포, 암세포, 골수종 세포, 백혈구 세포등을 포함한다. 본 발명의 방법에서는, 혈액 및 골수 세포는 상대적으로 얻기 용이하고, 배양 및 유지 기술이 설정되어 있기 때문에, 바람직하게는 혈액 및 골수로부터 사용가능한 조혈 세포를 사용한다. 특별히, 도입된 유전자 발현이 장기간으로 예정될 경우, 조혈 간세포, CD34-양성 세포, c-키트-양성 세포 및 다능 조혈 간세포와 같은 혈액 간세포가 표적 세포로 적당하다.
예를 들면, 조혈 간세포를 표적 세포로 사용하는 유전자 치료요법은 하기 과정에 의해 수행된다.
첫째, 골수 조직, 말초 혈액 및 탯줄 혈액과 같은 조혈 간세포를 포함하는 물질을 공여자로부터 모은다. 이런한 물질을 유전자 도입 과정에서 직접적으로 사용한다. 그러나, 조혈 간세포를 함유하는 단핵 세포 분획은 일반적으로 밀도구배 원심분리법 및 그 유사법으로 제조되고, 조혈 간세포는 CD34 및/또는 c-키트와 같은 세포 표면 표식 분자를 사용하여 추가로 정제한다. 조혈 간세포를 함유하는 물질을 필요한 경우, 적당한 세포 성장 인자를 사용하여 전-자극 된 후, 관심의 대상이 되는 유전자가 본 발명의 방법에 따라 삽입된 재조합 벡터로 감염시킨다. 이렇게 얻어진 유전자 도입 세포를 예를 들면, 정맥내 투여로 수용체내로 이식시킬 수 있다. 수용자 그 자체가 바람직하게는 공여자일지라도 동종간의 이식도 수행될 수 있다. 예를 들면, 탯줄 혈액이 재료로 사용될 경우, 동종간의 이식이 수행된다.
표적 세포로 조혈 간세포를 사용하는 일부의 유전자 치료요법은 환자의 결핍 또는 비정상적 유전자를 보완하는 것이다(예, ADA 결핍 또는 Gaucher's 질병에 대한 유전자 치료요법). 또한, 약 내성 유전자를 조혈 간세포내로 도입시켜, 예를 들면, 암 또는 백혈병 치료에 사용되는 화학적 치료제에 기인한 조혈 세포의 손상을 제거할 수 있다.
종양 백신 치료요법을 암 유전자 치료요법으로서 연구하고 있다. 이 치료요법에서, 사이토카인에 대한 유전자를 암 세포에 도입하고, 암세포의 증식 능력을 제거하고 이어, 세포를 환자의 몸에 되돌려 놓아, 종양 면역성을 증진시킨다[Human Gene Therapy, 5:153-164(1994)]. 또한, 유전자 치료요법을 사용하여 AIDS를 치료하려는 시도가 있다. 이 경우에, 다음 과정이 고려된다. 이 과정에서 복제 또는 HIV의 유전자 발현을 방해하는 핵산 분자(예, 안티센스 핵산 또는 라이보자임)를 암호화하는 유전자를 AIDS의 원인제인 HIV로 감염된 T 세포에 도입한다[J.Virol., 69:4045-4052(1995)].
상기에서 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명을 사용하여 유전자를 표적 세포에 매우 효율적으로 매우 특이적으로 도입할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 특수한 장비 또는 기구를 요하지 않고 다양한 레트로바이러스 벡터 및 표적 세포에 효과적이다.
하기 실시예는 본 발명을 좀 더 상세히 설명하나, 그의 범위를 제한하는 것은 아니 다.
실시예 1
피브로넥틴으로부터 유래된 폴리펩타이드의 제조.
인간 피브로넥틴으로부터 유래된 폴리펩타이드, H-271를 미국 특허 제 5,198,423호 기재된 방법에 따라, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유하는 재조합 플라스미드 pHD101를 함유하는, Escherichia coli HB101/pHD101 (FERM BP-2264)로부터 제조하였다.
인간 피브로넥틴으로부터 유래된 폴리펩타이드, H-296을 상기 언급된 공개문헌에서 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유하는 재조합 플라스미드 pHD102를 함유하는, Escherichia coli HB101/pHD102 (FERM BP-10721)로부터 제조하였다.
폴리펩타이드 CH-271은 하기와 같이 제조되었다.
간단히, Escherichia coli HB101/pHD101 (FERM BP-2799)을 상기 언급된 공개에서 기재된 바와 같이 배양하였다. CH-271을 배양체로부터 얻었다.
폴리펩타이드 CH-296은 하기와 같이 제조되었다.
간단히, Escherichia coli HB101/pHD102 (FERM BP-2800)을 상기 언급된 공개에서 기재된 바와 같이 배양하였다. CH-296을 배양체로부터 얻었다.
폴리펩타이드 C-274는 하기와 같이 제조되었다.
간단히, Escherichia coli JM109/pTF7221(FERM BP-1915)를 미국 특허 제 5,102,988호 기재된 방법에 따라 배양하였다. C-274를 배양체로부터 얻었다.
레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는, 콜라겐 타입 V, ColV로부터 유래된 폴리펩타이드를 국제출원 제 97/18318호에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
실시예 2
레트로바이러스 벡터의 제작 및 레트로바이러스 상등액의 제조.
레트로바이러스 플라스미드, PM5neo 벡터를 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자[Exp. Hematol.,23:630-638(1995)]를 함유하고, GP+E-86세포(ATCC CRL-9642)내로 도입시켰다. 세포를 10% 소 태아 혈청(FCS; Gibco제), 50단위/㎖의 페니실린 및 50㎍/㎖의 스트렙토마이신( 두가지 모두 Gibco)을 함유하는, 둘베코스 변형 이글즈 배지(Dulvecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM; Bio Whittaker)에서 배양시켰다. 이하 과정에서 사용되는 DMEM 모두는 상기 언급된 항생 물질을 함유하였다. 10% FCS를 함유하는 4ml의 DMEM을, 상기 언급된 생산 세포가 세미-콘플루언스(semi- confluence)로 성장되어 있는 플레이트( 세포 배양을 위한 10- cm 젤라틴으로 코팅된 디쉬, Iwaki Glass제)에 가하고, 밤새도록 배양한 후, 이어 상등액을 모아, PM5neo 바이러스를 함유하는 상등액을 제조하였다. 이와 같이 모아진 배양 상등액을 0.45- 마이크로 필터(밀리포어)에 통과시켜 여과함으로써 바이러스 상등액 저장액을 제조하고, 이를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
바이러스 상등액을 상기 기재된 과정에 따라 하기 세포들로부터 제조하였다. 레트로바이러스 플라스미드 pLEIN(클론테크; 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자 및 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 유전자)가 도입된 포식성 패키징(packaging) BOSC23세포[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8392-8396(1993)) ; 및 암포트로픽 패킹 φCRIP 세포[ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6460-6464(1988). 이하에서, 상대적으로 BOSC23 세포로 제조된 바이러스는 Eco-EGFP로, φCRIP 세포로 제조된 바이러스는 Ampho-EGFP로 언급한다.
또한, 상기 언급된 과정에 따라, 레트로바이러스 플라스미드, TKNeo 벡터[J. Exp. Med., 178;529-536(1993)](GP+EnvAm12 세포(ATCC CRL-9641)( 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자를 함유함)로부터 바이러스 상등액을 제조하였다. FCS 대신에 10% 소 태아 혈청(CSL Gibco)을 함유하는 DMEM을 사용하였다.
네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자를 NTH/3T3 세포내로 도입하는 효율을 지수로 사용한 표준 방법(J. Virol., 62:1120-1124(1988)]에 따라 바이러스 상등액의 역가를 측정하였다. 1㎖ 상등액(cfu/ml)에 함유된 감염 입자 수를 계산하였다. 이하 실험에서, 첨가되는 바이러스 상등액의 양을 계산된 값, 예를 들면, 상등액의 역가를 기준으로 결정하였다.
실시예 3
레트로바이러스와 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 제조 및 그의 활성의 측정.
80㎍/ml의 H-271, H-296, C-274, CH-271, CH-296, ColV, 인간 기초 섬유아세포 성장 요소(human basic fibloblast)(bFGF; Progen), 테나신(tenascin)(Gibco) 또는 표피 성장 인자(epidermal growth factor)(EGF; Takara Shuzo)의 용액 50㎕ 또는 2% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma) 50㎕를 세포 배양용 96-웰 비-처리 마이크로플레이트(Falcon)의 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 방치하고, 이어 인산 완충 식염수(PBS; Roman Kogyo)로 두번 세척하였다. 다르게는, 플레이트를 상기에서 기재한 바와 같이 처리한 후, 4mg/ml의 순수한 무균수에 1-에틸-3-디메틸아미노프로필카보디이미드 하이드로클로라이드(Sigma) 용액 0.1ml을 각 웰에 분배하였다. 반응을 37℃에서 2시간동안 진행시켰다. 플레이트를 순수한 물로 완전하게 세척하여 카보디이미드- 처리된 플레이트를 제조하였다. 바이러스 감염 실험을 수행할 때까지, 이 플레이트를 4℃에서 방치하였다.
104의 쥐 백혈병 L1210 세포(ATCC CCL-219)을, 10% FCS, 50 단위/ml의 페니실린 및 50㎍/ml의 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지(Bio Whittaker)에서 배양시키고, 이와 50㎕의 PM5neo 바이러스 상등액(104 cfu/ml)를 마이크로플레이트의 웰에 가하였다. 플레이트를 24시간동안 배양시킨 후, 배지를 0.75mg/ml의 최종 농도로 G418(Gibco)를 함유하는 동등한 배지로 교환하고, 이어 추가로 플레이트를 48시간동안 배양하였다. S. Kim et al.[Gene Therapy, 3:1018-1020(1996)]에 기재된 방법에 따라, Premix WST-1 시약(Takara shuzo제)을 사용하여 현상되는 색을 450nm에서의 흡수도로 측정하여 부분 변형하여 G418-내성 세포를 평가하였다. 배양한 후, WST-1 시약의 10㎕/100㎕ 배양균을 웰에 가하고, 플레이트를 37℃에서 추가로 4시간동안 배양하였다. 이어, 마이크로플레이트 리더를 사용하여, 450nm 및 650nm에서의 흡수도를 측정하고, 그 차이 (450nm-650nm)를 계산하였다. 카보디이미드 처리없이 2%의 BSA로 코팅된 플레이트를 사용하여 얻은 값을 기본값으로 정의하였다. 3회의 연구를 통해 얻은 결과를 표 1에 요약한다.
표 1
(평균 ±표준편차)
표 1에서 나타나는 바와 같이, 유전자 도입 효율의 증가는, 바이러스, 예를 들면, H-271, H-296, CH-271, CH-296, ColV 및 bFGF에 결합하는 활성을 갖는, 공지된 기능적 물질에서 관찰되었다. 또한, 바이러스에 결합하는 활성을 갖고 있지 않는 C-274, 테나신, EGF 및 BSA을 사용하지 않고, 카보디이미드를 처리하였을 때, G418-내성 세포의 출현은 증가하였다.
다음으로, 하기 실험을 수행하기 위해 CH-296을, 기능적 물질로 사용하였다.
0.5ml의 40㎍/ml CH-296을 세포 배양용 24-웰 비-처리 마이크로플레이트(Falcon)의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 배양하고, 이어 PBS(pH 5.8)로 세척하였다. 에틸렌디아민(ethylenediamine)[NH2(CH2)2NH2; Nacalai Tesquel], 트리메틸렌디아민(trimethylenediamine)[NH2(CH2)3NH2; Nacalai Tesquel] 또는 푸트레 스신(putrescine)[CH2(CH2)4NH2; Nacalai Tesquel]를 함유하는, PBS(pH 5.8)중의 10mg/ml 1-에틸-3-디메틸아미노프로필카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride)(Sigma) 용액 625㎕를 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 이 과정에서 아미노 그룹을 카보디이미드를 매개로 하여 CH-296 분자의 카복실 그룹에 도입시켰다. 플레이트를 PBS로 세번 세척하고, 2% 글라이신/PBS로 이어서, 2% BSA/PBS로 차단시켰다.
레트로바이러스 벡터 플라스미드 pLEIN가 도입된 GP+E86 세포를 10% CS를 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 이어, 상등액을 배양액으로부터 모았다. 상등액을 희석시켜 제조된, 적정된 농도 1X105 cfu/ml의 바이러스 상등액 0.5ml을 플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 4시간동안 배양하였다. 1X104 NIH/3T3 세포를 추가로 웰에 가하였다. 플레이트를 이틀동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 세포 분리 완충액(cell detachment buffer)(Bio Whittaker)으로 모으고 세척하였다. FACSVantage(Becton Dickinson)을 사용하여, 488nm의 여기파장 및 515-545nm의 방출 파장에서 유동 세포계수법으로 EGFP-발현 세포를 분석하였다. 바이러스가 플레이트에 결합하는 능력을 유전자의 세포 도입 효율로 표시하였다. 결과를 도 2에 표시한다.
도 2에서와 같이, 아미노 그룹을 도입하는데 사용된 디아미노 화합물의 농도가 증가함에 따라서 바이러스의 결합능력도 증가했다. 비처리 CH-296을 사용하여, 관찰된 능력과 비교하여, 푸트레신, 트리메틸렌디아민 또는 에틸렌디아민을 2mM의 농도에서 반응에 사용하였을 때 바이러스의 결합 능력이 약 2배정도 증가했음이 관찰되었다.
실시예 4
라미닌의 유전자 도입 효율을 증진시키는 효과.
쥐 라미닌(Gibco) 또는 인간 라미닌(Takara Shuza)을 유전자 도입 실험을 수행하기 위해 바이러스 결합 활성을 갖는 기능적 물질과 조합하는데 사용하였다. 이 실험에 사용되는 세포 배양용 24-웰 비처리 마이크로플레이트(Falcon)를 하기 두 방법에 따라 기능적 물질로 코팅하였다.
칵테일 방법(cocktail method) : 두 가지 기능적 물질의 혼합물을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 방치하였다. 플레이트를 37℃에서 20분동안 2% BSA로 차단키고 이어, PBS로 세척하였다.
전-코팅 방법(pre-coating method): 바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 용액을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 방치하였다. 용액을 제거하였다. 라미닌 용액을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간동안 배양하고, 이어 2% BSA로 차단키고 이어, PBS로 세척하였다.
0.5ml의 기능적 물질 용액을 사용하여 각 웰을 코팅하였다.
105 의 L1210 세포 및 0.5ml의 Eco-EGFP 바이러스 상등액(105 cfu/ml)을 웰에 가하였다. 플레이트를 24시간동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 세포 분리 완충액(Bio Whittaker)으로 모으고 세척하였다. FACSVantage(Becton Dickinson)을 사용하여, 488nm의 여기파장 및 515-545nm의 방출파장에서 유동 세포계수법으로 EGFP-발현 세포를 분석하였다. 유전자 도입 효율(전체 세포에 대한 EGFP-발현비)을 계산하였다. 실험 결과를 표 2 내지 5에 나타낸다.
표2
유전자 도입 효율을 %로 나타낸다.
표 3
플레이트를 칵테일 방법에 따라 코팅했다.
유전자 도입 효율을 %로 나타낸다.
표4
플레이트를 칵테일 방법에 따라 코팅했다.
유전자 도입 효율을 %로 나타낸다.
표 5
플레이트를 칵테일 방법에 따라 코팅했다.
유전자 도입 효율을 %로 나타낸다.
표 2 및 3에 나타나는 바와 같이, 유전자 도입을 위해 레트로바이러스를 사용하여, 바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질과 조합하는데 쥐 혹은 인간 라미닌을 사용할 때, 유전자는 고정화방법과는 상관없이 매우 효율적으로 표적 세포내로 도입되었음이 증명되었다. 칵테일 방법에 따라 CH-296 혹은 CH-271 및 라미닌으로 코팅된 플래이트를 사용하여 유전자 도입 효율을 조사하였다. 표 4 및 5에서 나타내는 바와 같이, 최적 비율은 CH-296/쥐 라미닌에 대해 8:1( 예를 들면, 80 ㎍/ml:10 ㎍/ml) 및 CH-271/쥐 라미닌에 대해 16 : 1( 예를 들면, 80㎍/ml: 5㎍/ml)임이 밝혀졌다. 라미닌을 첨가하지 않은 유전자 도입의 효율을 비교해 본 결과, 유전자 도입 효율은 CH-296의 경우 2.6배 및 CH-271의 경우 5.1배 증가하였다.
실시예 5
라미닌을 사용한 쥐 씨-키트-양성 골수 세포(c-kit-positive-bone marrow cells)내로 유전자 도입
쥐 씨-키트-양성 골수 세포를 하기와 같이 제조하였다. 6-8주령 C3H/He 암컷 쥐(Japan SLC)의 대퇴부로부터 얻은 골수세포를 Ficoll-Hypaque(1.0875 g/ml, Pharmacia)을 사용하여 원심분리기에 적용하여 저밀도 단핵세포를 포함하는 분획을 제조하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 적혈구를 Ery-Lysis 완충액(155ml NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA pH7.4)을 사용하여 용균시키고, 세포를 PBS를 다시 사용하여 세척하였다. 항-쥐 CD117 항체(Pharmingen)의 1㎍/107 세포를 생성된 골수 세포에 가하였다. 혼합물을 얼음위에서 30분동안 반응시켰다. 세포를 5mM EDTA 및 0.5% BSA를 포함하는 PBS로 세척하고, 이어 동일한 완충액에서 현탁시켰다. 마이크로비드(Miltenyl Biotec)로 접합된 이차 항체의 20㎕/107세포를 그 세포에 가하였다. 혼합물을 4℃에서 30분동안 반응시켰다. 세포를 다시 위 언급된 완충액으로 세척하고 그 완충액중에 다시 현탁시켰다. 마이크로비드에 결합된 세포를 MACS 시스템(Miltenyi Biotec)를 사용하여 모아 씨-키트-양성 세포를 수득하였다.
바이러스 감염 전에, 쥐 씨-키트-양성 골수 세포를 러스키 방법(Luskey et al.)에 따라 전-자극시켰다. [Blood, 80:396-402(1992)] 간단히 말해, 세포를 20% FCS, 20 ng/ml의 재조합 쥐 인터루킨-3(Genzyme), 50ng/ml의 재조합 쥐 인터루킨-6(Genzyme), 100ng/ml의 재조합 쥐 간세포 인자(Genzyme), 50단위/ml의 페니실린 및 50㎍/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM(Bio Whittaker)에서 37℃에서 이 틀동안 5% 이산화탄소하에서 배양시켰다.
칵테일 방법에 따라 다양한 농도의 쥐 라미닌 및 80㎍/ml의 CH-271을 포함하는 혼합물을 사용하여 세포 배양용 24-웰 비처리된 마이크로플레이트를 코팅시켰다. 플레이트를 2% BSA로 30분동안 차단시키고 이어 ,PBS로 세척하였다. CH-271 대신에 대조군 플레이트를 사용하여 2% BSA로 제조하였다. 바이러스 감염을 위해 105의 씨-키트-양성 골수 세포 및 0.5ml의 Eco-EGFP 바이러스 상등액(105 cfu/ml)을 마이크로플레이트의 각 웰에 가하였다. 48시간동안 배양한 후, 0.5ml의 새 배지를 웰에 가하고, 플레이트를 추가로 24시간동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 세포 부착 완충액를 사용하여 모으고 세척하였다. 유전자 도입 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 계산하였다. 2회의 실험으로부터 얻은 결과를 표 6 및 7에 나타낸다.
표6
유전자 도입 효율을 %로 나타낸다.
표7
유전자 도입 효율을 %로 나타낸다.
표 6 및 7에서 나타내는 바와 같이, 칵테일 방법에 따라, 쥐 라미닌 및 바 이러스, CH-271에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질로 코팅된 플레이트중에 레트로바이러스로 씨-키트-양성 골수 세포를 감염시킬 때, 유전자 도입 효율을 증진시키는 강한 효과가 관찰되었음이 증명되었다. 라미닌과 결합한 CH-271을 사용하였을때, CH-271만을 사용할 때보다 유전자 도입 효율은 최대로 5.7배만큼 증가하였다.
또한, 107 cfu/ml의 역가에 Eco-EGFP 바이러스를 사용하여,상기 기재된 것과 동일한 과정를 수행하였다. 얻은 최소 유전자 도입 효율을 표 8에 나타낸다. 이는 또한, 이 경우에 있어, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질을 사용하는 유전자 도입 효율은 결합시 라미닌을 사용함으로써 증가됨이 증명되었다.
표8
유전자 도입 효율성을 %로 나타낸다.
실시예 6
라미닌을 사용한, 쥐 지라 세포로부터 유래된 CD3-양성 T-세포내로의 유전자 도입.
쥐 지라 세포로부터 얻은 CD3-양성 T 세포를 하기와 같이 제조하였다. 6-8주령 C3H/He 암컷 쥐의 지라로부터 세포를 얻었다. 세포를 100-㎛ 메쉬(Falcon)에 통과시켜 잔류물을 제거하였다. 결과 세포를 10% FCS를 포함하는 Hanks' balanced 염 용액(HBSS, Bio Whittaker)으로 세척하고, 적혈구를 Ery-Lysis 완충액으로 용균 시키고, 이어 세포를 다시 HBSS로 세척하였다. 결과 세포를 30-㎛ 매쉬(Miltenyi Biotec)에 통과시켜 잔류물을 제거하고 이어 CD3-양성 T 세포(R&D 시스템)를 농축시키기 위해 칼럼을 사용하여 정제하였다. 바이러스 감염 실험에 사용된 쥐 CD3-양성 T 세포를 하기와 같이 전-자극시켰다. 세포를 전-자극 시키기 위해, 항-쥐 CD3항체 및 항-쥐 CD28 항체(모두 1㎍/mg, Pharmingen)이 고정되어 있는 페트리 디시에서 배양하였다. 이 페트리 디시는 10% FCS, 50단위/ml의 페니실린 및 50㎍/ml의 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지(Bio Whittaker)을 포함하였다. 세포를 5% 이산화탄소하에서 37℃에서 이틀동안 배양하였다.
실시예 5에서 기술한 바와 같이, 20㎍/ml의 쥐 라미닌 및 80㎍/ml의 CH-296을 함유하는 혼합물로 24-웰 마이크로플레이트를 코팅시켰다. 105의 CD-양성 T 세포 및 0.5ml Eco-EGFP 바이러스 상등액(105 cfu/ml)을 3시간동안 마이크로플레이트의 각 웰에 가하여 바이러스 감염시켰다. 이에, 10% FCS, 500단위/ml의 재조합 쥐 인터루킨-1α(Genzyme), 10ng/ml의 재조합 쥐 인터루킨-2(Genzyme), 50단위/ml의 페니실린 및 50㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지를 가하였다. 48시간동안 배양을 지속시켰다. 배양 후, 세포를 세포 접착 완충액으로 모으고, 세척하였다. 유전자 도입 효율을 실시예 4에서 기술한 바와 같이, 계산하였다. 결과는 표 9에 나타낸다.
표 9
유전자 도입 효율은 %로 나타낸다.
표 9에서 나타난 바와 같이, 쥐 CD3 양성 T 세포내로의 유전자 도입 효율은 라미닌의 공존으로 증가되었다.
실시예 7
유전자 도입에서 라미닌 분자의 당쇄와의 관련.
실시예 5에서 기재한 바와 같이, 5㎍/ml 쥐 라미닌 및 80㎍/ml CH-271을 함유하는 50㎕/웰의 혼합물을 사용하여 96-웰 마이크로플레이트를 코팅하였다. 유전자 도입 효율에 대한, 당쇄을 끊는 활성을 갖는 다양한 효소의 처리 효과를 조사하였다.
플레이트를 하기의 효소로 처리하였다. 50mM 시트레이트(citrate)-인산 완충액(pH 5.0)중의 500 mU/ml O-글리카나아제(o-glycanase)(엔도-α-N-아세틸 갈라토스아미네이즈(endo-α-N-acetylgalactosaminidase), Seikagaku Corp.), 500 mU/ml 엔도 글리코시다아제 H(endoglycosidase H)(엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 H(endo-β-N-acetylglucosaminidase H, Seikagaku Corp.), 250mU/ml 엔도-β-갈락토시다아제(endo-β-galactosidase)(Seikagaku Corp.) 및 2 mU/ml α-만노시다아제(α-mannosidase)(Seikagaku Corp.)를 함유하는 효소 용액을 제조하였다. 100 mM 트리스-하이드로클로라이드(tris-hydrochloride) 완충액(pH 8.6)중 의 250mU/ml 글리코펩티다아제 F(glycopeptidase F)(펩티드 : N- 글라이코시다아제 F, Takara Shuza)를 함유하는 효소 용액을 제조하였다. 50㎕의 각각의 효소 용액을 각 웰에 분배하고 37℃에서 20시간동안 반응시켰다. 이어, 플레이트를 PBS로 세번 세척하고 바이러스 감염 실험에 사용하였다.
10% FCS, 50단위/ml 페니실린 및 50㎕/ml 스트렙토마이신로 보충된 RPMI 1640 배지에서 자란 104의 쥐 백혈병 L1210 세포 및 50㎕의 PM5neo바이러스 상등액 (104cfu/ml)을 마이크로플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 24시간동안 배양하였다. 최종 농도 0.75 mh/ml의 G418( Gibco)를 함유하는 동일한 배지로 배지를 교환하였다. 플리이트를 추가로 48시간동안 더 배양하였다. G418-내성 세포를 실시예 3에서 기재한 바와 같이, 분석하였다. 결과를 표 10에서 표시한다. 표 10은 3회의 실험을 통해 얻은 결과를 요약한다.
표 10
표 10에서 나타나는 바와 같이, CH-271이 라미닌과 함께 사용되었을 때, CH-271만을 사용한 경우와 비교하면, G-418-내성세포의 출현은 증가하였다. 라미닌으로 코팅된 플레이트를, 엔도글라이코시다아제 H(endoglycosidase)로 처리한 결과, 라미닌의 유전자 도입 촉진 효과는 완전히 사라졌다. 또한, 플레이트를 α-만노시다아제(α-manosidase) 또는 글라이코펩티다아제 F(glycopeptidase F)로 처리한 결과, 어느 정도 유전자 도입 효율은 감소하였다. 라미닌 분자의 당쇄에 관한 기록[Biochim. Biophysi. Acta, 883:112- 126(1986)]에 따르면, 라미닌 분자의 대부분의 당쇄은 아스파라긴에 결합된 N-연결 당쇄이다. N-연결 당쇄의 43개의 분자는 라미닌 분자에 결합되어 있다. 엔도글라이코시다아제 H를 처리할 경우, 당쇄들중에의 고 만노오스형 아스파라긴(asparagine)-N- 연결 당쇄는 떨어진다. α-만노시다아제를 처리하였을 때, 유전자 도입 효율이 감소되었다는 사실은 라미닌 분자의 당쇄이 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다. 이런 당쇄은 α1-2- 및/또는 α1-6- 결합된 만노오스를 포함하는 구조를 갖고 있고, (만노오스)9-(GluNAc)2-Asn 및/또는 (만노오스)6-(GluNAc)2-Ans인, α-만노시다아제에 의해 절단된다. 상기에서 기재된 바와 같이, 라미닌의 유전자 도입 촉진 효과는 라미닌 분자의 당쇄, 특히, 고 만노오스형 당쇄에 의한 것임이 증명되었다.
유전자 도입에서 (만노오스)9-(GluNAc)2-Asn이 관련되어 있음이 하기 실험을 통해 확인되었다.
락토즈가 고정되어 있는 Sepharose CL-2B(Pharmacia)를 사용하여, 탈지방 콩 가루(sigma)로부터 제조된 1g의 콩 응집소를 가열 변성시키고, 이어, 10mM 칼슘 클로라이드를 포함하는 20ml의 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.2)중의 20mg 액티나아제 E(Actinase E)(Kaken Pharmaceutical)로 37℃에서 2시간동안 분해시켰다. 열로 효소를 불활성화시킨 후, Sephadex G-15 (50ml) 칼럼 및 Sephadex G-25(150ml) 칼럼을 사용하여 혼합물을 크로마토그래피 처리하여 (만노오스)9-(GluNAc)2-Asn를 정제하였다. 도 1은 아스파라긴 잔기가 제거된 (만노오스)9-(GluNAc)2-Asn를 설명한다.
CH-271 및 (만노오스)9-(GluNAc)2-Asn이 공유 결합으로 고정되어 있는 마이크로플레이트를 제조하였다. 간단히 말해, 96-웰 카보플레이트 (ELISA 카보-형 플레이트)(Sumito Bakelite)를 4mg/ml의 수용성 카보디이미드 용액을 사용하여 37℃에서 2시간동안 활성화시키고 이어, 무균수로 세번 세척하였다. 2% BSA 또는 80㎍/mg CH-271 및 다양한 농도의 (만노오스)9-(GluNAc)2-Asn을 함유하는 용액의 50㎕ 각각을 활성화된 96-웰 카보플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간동안 고정반응 시켰다. 플레이트를 0.2%의 글라이신(glycine) 용액을 사용하여 4℃에서 15시간동안 차단시키고, 이어, 하기 유전자 도입 실험에 사용하였다.
103의 L1210 세포 및 0.1ml Eco-EGFP 바이러스 상등액(106 cfu/ml)을 마이크로플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 48시간동안 배양한 후, FCS, 페니실린, 및 스트렙토마이신을 포함하는 0.1ml의 새 RPMI 1640 배지를 웰에 가하였다. 플레이트를 24시간동안 추가로 배양시켰다. 세포를 모으고 세척하였다. 유전자 도입 효율을 실시예 4에서 기재된 바와 같이 계산하였다. 두 개의 별개 실험을 통해 얻은 최소 결과를 표 11에 나타낸다.
표 11
유전자 도입 효율은 %로 나타난다.
표 11에서 나타나는 바와 같이, (만노오스)9-(GluNAc)2-Asn 및 CH-271이 고정되어 있는 웰 중의 유전자 도입 효율은 사용된 당쇄의 농도에 따라 증가되었다. 그러므로, 라미닌 분자와 같은 구조를 같는 당쇄이 유전자 도입 효율을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8
항-CD4 분자 항체를 사용한 CD4-양성 세포에 대한 특이적 유전자 도입.
실시예 4에서 기재된 바와 같이, 세포 배양용 24-웰 비-처리 마이크로플레이트를 1㎍/ml의 항-쥐 CD4 모노클로날 항체 또는 항-쥐 CD44 모노클로날 항체( Pharmingen으로부터 얻은) 및 80㎍/ml의 H-271, CH-271 또는 CH-296의 배합물로 코팅시켰다. H-271를 전코팅 방법에 따라 코팅시키는 반면, CH-271 및 CH-296을 칵테일 방법에 따라 코팅시켰다.
0.5ml Eco-EGFP 바이러스 상등액(107 cfu/ml)를 마이크로플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 32℃에서 3시간동안 배양하고, 이어, 10% FCS, 50단위/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640으로 세척하였다. 실시예 6에서 기재된 바와 같이, 제조되고 전-자극된 쥐 지라 세포로부터 유래된 105의 CD3-양성 T 세포 를 웰에 3시간동안 가하여 바이러스 감염시켰다. 그 후, 10% FCS, 500 개의 재조합 쥐 인터루킨-1α, 10ng/ml의 재조합 쥐 인터루킨-2, 50 단위/ml 페니실린 및 50㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640 배지를 웰에 가하였다. 플레이트를 추가로 48시간동안 배양하였다. 배양한 후, 세포를 세포 접착 완충액를 사용하여 모으고, 세척한 후, 피코에리트린(phycoerythrin)(PE;Pharmingen) 및 프로피늄 요오드(propinium iodide)(PI;Sigma)로 표식된 항-쥐 CD4 모노클로날 항체(Pharmingen)로 염색시켰다. 이들 세포에 488nm의 여기파장과 515-545nm 또는 562-588nm의 방출파장에서 FACSVantage 를 사용하여, 유동 세포계수법을 수행하여 생존적 세포에서의 CD4 항원 발현 및 EGFP 발현을 이차원으로 분석하였다. CD4-양성 T 세포및 CD4-음성 세포에서의 유전자 도입의 효율을 계산하였다. 결과를 표 12에 나타낸다. 표12는 4회 실험으로부터 얻은 결과를 요약한 것이다.
표12
(평균 ±표준 편차)
표 12에 나타난 바와 같이, 모노클로날 항체 및 파이브로넥틴 단편으로 코팅된 플레이트중에서 레트로바이러스가 감염될 경우, 쥐 지라 세포로부터 유래된 CD3-양성 T 세포의 유전자 도입 효율을 증진시키는 효과가 관찰되었다.
항-CD4 모노클로날 항체 및 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질의 배합물을 사용하여 바이러스를 감염시킬 경우, CD4-음성 세포보다 CD4-양성 세포내로 유전자 도입 효율이 높게 나타난다. 예를 들면, 항-CD4 모노클로날 항체 및 H-271의 배합물을 사용한 경우 CD4-양성 세포내 유전자 도입 효율이 매우 높았고(약 60 %) 반면, CD4-음성 세포내 유전자 도입 효율은 단지 20%정도였다. CH-271 또는 CH-276을 피브로넥틴 단편으로 사용할 경우에도, 비슷한 결과를 관찰할 수 있었다.
한편으로, CD44 항체는 CD4-양성 세포 및 CD4-음성 세포 모두에서 98%이상 발현되었다. 그러므로, 위 상기된 바와 같이, 항-CD44 모노클로날 항체를 레트로바이러스 감염에 사용할 때, 세포내의 CD4 항원의 발현과는 관계없이 유전자 도입 효율은 증가될 것으로 예측되었다. 표 12의 결과로 예측을 확인한다.
실시예 9
항-CD8a 모노클로날 항체를 사용한 CD8-양성 세포에 대한 특이적 유전자 도입.
H-271만을 제외하고 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질을 사용하여 실시예 8에서 기재된 바와 같이 실험을 수행하고, 항체로서 항-쥐 CD8a 모노클로날 항체(Pharmingen) 및 항-쥐 CD44 모노클로날 항체(Pharmigen)를 사용하였다. 피코에리트린(PE; Pharmongen)으로 표식된 항-쥐 CD8a 모노클로날 항체를 사용하여 CD8-양성 및 CD8-음성 세포를 검출하였다. 결과는 표 13에 나타낸다. 표 13은 2회의 실험으로부터 얻은 결과를 요약한다.
표 13
(평균 ±표준 편차)
표13에 나타난 바와 같이, 항-CD8a 모노클로날 항체 및 피브로넥틴 단편의 배합체를 사용했을 때, 쥐 지라 세포로부터 얻은 CD3-양성 T 세포내로 유전자 도입 효율이 증가되었음이 관찰되었다.
실시예 8에서 관찰된 바와 같이, 항-CD8a 모노클로날 항체를 사용할 때, 항체에 의해 인식되는 CD8 항원을 발현시키는 세포내로의 높은 유전자 도입 효율을 관찰하였다. 한편, CD8-양성 세포 및 CD8-음성 세포 모두에서 98%이상 발현되는, CD44에 대한 모노클로날 항체를 사용할 때, CD8-양성 세포 및 CD8-음성 세포사이의 유전자 도입 효율의 차이는 없었다.
실시예 8 및 실시예 9의 실험 결과는 매우 중요하다. 이 결과는, 표적 세포및 바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질에 결합하는 항체의 혼합물(칵테일)를 사용하여 표적 세포를 포함하는 세포 집단이 중요한 유전자를 함유하는 레트로바이러스로, 코팅된 배양 용기에서 감염시킬 경우, 중요한 유전자를 특이적으 로 표적 세포내로 도입할 수 있음을 증명한다.
실시예 10
항체를 사용한 세포-특이적 유전자 도입.
실시예 4에서 기재한 바와 같이, 칵테일 방법에 따라 80㎍/ml CH-271 및 1㎍/ml의 다양한 세포 표면 항원(항-CD4, 항-CD8, 항-CD44, 항-CD49c, 항-CD49d 및 항-CD49e 항체; 모두 Pharmingem사에)에 대한 모노클론날 항체 하나를 사용하여, 세포 배양용 24-웰 비-처리 마이크로플레이트를 코팅시켰다.
K562(인간 만성 골수 백혈병 세포,ATCC CCL-243), HSB-2(인간 급성 림프아구 백혈병 세포, CCRF-HSB-2, ATCC CCL-120.1), MOLT-3(인간 급성 림프아구 백혈병 세포, ATCC CRL-1552) 및 TF-1(인간 적백혈병 세포, ATCC CRL-2003)을 표적 세포로 사용하였다. 표식된 각각의 모노클로날 항체를 사용하여 이 세포상에서 FACS 분석을 수행하고, 항체에 상응하는 항원의 발현을 결정하였다.
0.5ml 암포-EGFP 바이러스 상등액을 (1X106 cfu/ml)을 마이크로플레이트의 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 32℃에서 3시간동안 배양하고, 이어 10% FSC, 50 단위/ml 페니실린 및 50㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지로 세척하였다. 1ml 배지중에 현탁된 각 세포의 1X105을 웰에 가하여 바이러스 감염시켰다. 추가로 3일동안 더 배양시킨 후, 세포를 세포 접착 완충액를 사용하여 모으고 세척하였다. 유전자 도입 효율을, 실시예 4에서 기재된 유동 세포계수법에 따라 계산하였다.
결과는 표 14에 나타난다. 3회의 별개 실험을 통해 얻은 최소 결과를 나타낸다.
표14
유전자 도입 효율(Transfer eff.)은, 각 세포에 대한 항체를 첨가하지 않은 경우의 유전자 도입 효율을 100%로 가정하여, 상대적인 값으로 나타낸다.
CD 항원 발현 비(CD ag exp. ratio)는 하기에서와 같이, FACS 측정에서 양성 세포(%)의 비로 표현된다.
-: 10% 또는 이하; +/-: 10-30%; +: 30-60%; ++: 60-90%; +++: 90% 또는 이상.
표 14에 나타난 바와 같이, 항체 발현 비는, 바이러스 결합 물질로서 CH-271이 사용되고 세포 결합 물질로서 세포상의 항원에 대한 항체가 사용되는 칵테일 방법을 사용하는 유전자 도입의 효율과 관련되어 있었다.
또한, CH-271 대신에 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질로서 80㎍/ml 폴리리신을 사용하여 유전자 도입 실험 수행하였다. 사용된 모노클로날 항체 및 세포와 다른 실험 조건은 상기 기재된 바와 같았다. 결과를 표 15에 나타낸다. 3회의 별개 실험을 통해 얻은 최소 결과를 나타낸다.
표15
유전자 도입 효율은, 각 세포에 대한 항체를 첨가하지 않은 경우의 유전자 도입 효율를 100%로 가정하여, 상대적인 값으로 나타낸다.
CD 항원 발현 비(CD ag exp. ratio)는 하기에서와 같이, FACS 측정에서 양 성 세포(%)의 비로 표현된다.
-: 10% 또는 이하; +/-: 10-30%; +: 30-60%; ++: 60-90%; +++: 90% 또는 이상.
표 15에서 나타나는 바와 같이, 항체 발현 비는, 바이러스- 결합 물질로서 폴리리신이 사용되고, 세포 결합 물질로서 세포상의 항원에 대한 항체가 사용되는 칵테일 방법을 사용하는 유전자 도입의 효율과 관련되어 있다.
상기 기재된 바와 같이, 두개의 연속된 실험 결과는, 세포 결합 물질로 표적 세포에서 발현되는 항원을 특별히 인식하는 항체를 사용한 칵테일 방법에 따라 유 전자를 도입함으로써 유전자를 특이적으로 중요한 표적 세포내로 도입시킬 수 있음을 증명한다.
실시예 11
디페록사민을 포함하는 배지에서 전-배양된 표적 세포내로의 유전자 도입,
감염 실험전 하루동안, 10% FSC, 50단위/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640배지에서 배양된 인간 골수 백혈병 HL-60 세포(ATCC CCL-240)를 다양한 농도의 디페록사민(Sigma)을 함유하는 동일한 배지에 도입시켰다. 세포를 5% 이산화탄소하에서 37℃에서 20시간동안 배양하였다. 세포를, 사용시 디페록사민이 없는 새 배지로 세척하고 2X105 세포/ml에서 현탁시켜 하기 감염 실험에 사용되도록 하였다.
80㎍/ml CH-271 0.5ml을 24-웰 비-처리 마이프로플레이트의 각각의 웰에 가하여 세포 배양하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 방치하고, 2% BSA를 사용하여 30분동안 차단시키고 PBS로 세척하였다. 0.5ml Ampho-EGFP 바이러스 상등액(106 cfu/ml)을 마이프로플레이트의 웰에 가하였다. 플레이트를 32℃에서 3시간동안 배양하고 10% FCS, 50 단위/ml 페니실린 및 50㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지로 세척하였다. 105의 전-배양된 HL-60 세포를 웰에 가했다. 플레이트를 48시간동안 배양하였다. 10% FCS, 50단위/ml 페니실린 및 50㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지 0.5ml을 웰에 가하였다. 플레이트를 24시간동안 추가로 배양하였다. 그 이후로, 실시예 4에서 기재된 바와 같이, 유전자 도입 효율을 결정하였다. 결과를 표 16 및 17에 나타낸다.
표16
표17
표 16 및 17에 나타난 바와 같이, 20시간동안 디페록사민으로 세포를 전-처리한 결과, HL-60 세포에서도 유전자 도입 효율은 증가되었다. 유전자는, 단지 CH-271만을 사용해도 매우 낮은 효율를 갖는 HL-60세포내로 도입된다는 것이 공지되었다.
실시예 12
배양 상등액중의 바이러스 감염-억제 물질의 존재 검출.
실시예 2에서 제조된 TKNeo 바이러스 상등액을 DMEM, NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)의 배양 상등액 또는 φCRIP 세포의 배양 상등액을 312.5 cfu/ml의 농도로 희석시켜 하기 실험과정에 사용되도록 하였다.
세포 배양을 위해 0.5ml의 32㎍/ml CH-296을 세포 배양용 24-웰 비-처리 마 이크로플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간동안 방치하고, 2% BSA로 30분동안 차단한 후, PBS로 세척하였다. 상기 언급된 바이러스 상등액 1ml 및 2X 104 NIH/3T3 세포를 플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 이어 세포를 0.75mg/ml G418을 함유하는 선택 배지에서 10일동안 배양시켰다. G418이 없는 배지에서 형성된 클론의 수에 대한 G418-내성 클론 수의 비를 유전자 도입 효율로 정의하였다. 그 결과를 표 18에 나타낸다.
표 18
표 18에 나타나는 바와 같이, DMEM에 의한 희석을 이용한 유전자 도입 효율과 비교하여, NIH/3T3 세포의 배양 상등액 또는 φCRIP 세포의 배양 상등액으로 바이러스를 희석시켰을 때 유전자 도입 효율는 1/5 또는 그 이하로 감소하였다. NIH/3T3 세포는 φ CRIP 세포 및 GP+EmvAm12 세포와 같은 많은 세포주의 모 균주(Parent strains)이고, 이는 이 실험에 사용되는 TKNeo 바이러스 벡터에 대한 생산 세포를 형성하는데 사용된다. 레트로바이러스 감염을 저해하는 활성이 이 세포의 배양 상등액에서 발견된다는 사실은, 비슷한 세포를 사용하여 준비된 바이러스 상등액 또한 저해 물질을 포함한다는 것을 제안하다.
실시예 13
바이러스 상등액중의 바이러스 감염-억제 물질의 제거,
하기 실험은, 실시예 12에서 발견된 바이러스 감염-억제 물질을 제거하기 위해 수행된다. 실시예 2에서 제조된 , TKNeo 바이러스 상등액을 φCRIP 세포의 배양 상등액으로 5000cfu/ml로 희석시켰다. 레트로바이러스를 함유하는 샘플로 사용하기 위해 희석된 상등액을 두번 더 DMEM으로 희석시켰다.
1ml 바이러스 상등액을, 실시예 11에 기재된 바와 같이, CH-296으로 코팅된 플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 1 내지 5시간동안 배양하여 바이러스 입자를 CH-296과 접촉시키고 결합시켰다. 이어 플레이트를 PBS로 세 번 세척하였다. 2X104 NIH/3T3 세포를 포함하는 1ml DMEM를 각 웰에 가하였다. 대조군으로, 위 언급된 바이러스 상등액 1ml중에서 2X104 NIH/3T3 세포를 현탁시키고 이어, CH-296으로 코팅된 플레이트에 즉시 도입시켰다. 이들 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하여 바이러스를 세포에 감염시켰다. 감염 후, 세포를 0.75mg/ml G4518을 포함하는 선택 배지에서 10일동안 배양하고, 형성된 클론의 수를 세었다. G418이 없는 배지에서 형성된 클론의 수에 대한 G418-내성 클론 수의 비를 유전자 도입 효율로 정의하였따. 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에서 나타난 바와 같이, 바이러스 입자가 플레이트로 코팅된 CH-296과 접하고 결합하였을 때, 대조군의 효율보다 높은 유전자 도입 효율를 나타내는 것이 관찰되었다. 그러므로, 바이러스 상등액중의 바이러스 감염을 저해하는 활성은 하기에 기재하는 과정을 거쳐 제거될 수 있다고 증명되었다.
실시예 14
바이러스 상등액중의 소듐 부티레이트의 제거
레트로바이러스 벡터 프라스미드 pLEIN을 φCRIP 세포에 도입시켜 얻은 재조합 레트로바이러스-생산 세포를 10% CS를 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 세포가 10cm 플레이트에서 세미-콘플루언스(semi-confluence) 성장하였을 때, 배지를 10% FCS를 포함하는 7ml RPMI 1640 또는 5mM 소듐 부티레이트(Nacalai Tesque) 및 10% FCS를 포함하는 7ml RPMI 1640 로 교환하였다. 세포를 24시간동안 배양한 후, 상등액을 0.45㎛의 필터로 여과하여 바이러스 상등액을 수득하였다. 바이러스 상등액의 역가를 실시예 2에서 기재된 바와 같이 결정하였다. 소듐 부티레이트가 존재하지 않는 바이러스의 상등액의 농도는 3.3X104 cfu/ml, 반면, 5mM 소듐 부티레이트를 포함하는 바이러스 상등액의 농도는 2 X 106cfu/ml이었다.
소듐 부티레이트는 세포 주기를 정지시켜 세포 성장을 억제하고 분화를 유도하는 활성을 갖고 있다. 그러므로, 감염된 세포에 악영향을 줄 수 있다. 바이러스 상등액중에 함유된 소듐 부티레이트를 하기와 같이 제거했다.
HL-60 세포를 표적 세포로 사용하였다. 상기 언급된 0.5ml의 바이러스 상등액을, 실시예 12에서 기재된 바와 같이, CH-296으로 코팅된 플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간동안 배양시켜, 바이러스 입자를 CH-296과 접촉시키고 결합시켰다. 배양 후, 플레이트를 PBS로 세번 세척하였다. 10% FCS로 보충되고 5X 104 HL-60세포를 포함하는 0.5ml의 RPMI 1640 배지를 웰에 가하였다. 대 조군으로, 5X 104 HL-60세포를 상기 언급된 바이러스 상등액 0.5ml중에서 현탁시키고, 이어 CH-296으로 코팅된 플레이트에 즉시 가하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새도록 배양시켜 바이러스가 세포를 감염시키도록 하였다. 배양 후, 10% FCS를 함유하는 1ml RPMI 1640 배지를 웰에 가하였다. 플레이트를 추가로 48시간동안 배양하였다. 이어, 세포 수를 세었다. 또한, 실시예 4에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법에 따라 검출하여 유전자 도입 효율를 분석하였다. 결과를 표 19에 나타낸다.
표 19
표 19에 나타난 바와 같이, 소듐 부티레이트를 가하여 제조한 바이러스 상등액을 사용하였을 때, 대조군보다 높은 유전자 도입 효율를 관찰하였고, 바이러스 제조시 소듐 부티레이트의 유효성을 확인하였다. 그러나, 소듐 부티레이트를 포함하는 상등액을 사용한 경우, 관찰된 세포 수는, 소듐 부티레이트가 존재하지 않는 상등액을 사용한 경우의 1/4 또는 그 이하였다. 한편으로, 세포 성장 억제는, 소듐 부티레이트를 포함하는 상등액을 사용한 대조군에서는 관찰되었지만, 바이러스 입자가 앞서 CH-296으로 코팅된 플레이트에 접촉 및 결합한 경우, 세포 성장 억제는 관찰되지 않았다. 유전자 도입 효율는 감소하기보다는 증가되었다. 그러므로, 소듐 부티레이트 없이도, 세척후 CH-296으로 바이러스를 접촉시킴으로써 높은 유전자 도 입 효율을 얻을 수 있음이 증명되었다.
다음으로, DEAE-덱스트란을 비슷한 실험을 수행하기 위해 사용하였다.
PBS중의 10mg/ml의 농도에서 DEAE-덱스트란(Sigma)을 용해시켰다. 용액을 0.22㎛ 필터에 여과하여 멸균시키고 플레이트를 코팅시키는데 사용하였다. 10 부피 PBS 및 1 부피 DEAE-덱스트란 용액을 혼합하여 얻은 혼합물 1.1ml을 세포 배양용 6-웰 비-처리 플레이트(Iwaki Glass)의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 배양하였다. DEAE-덱스트란 용액을 플레이트에서 제거하였다. 2 ml의 2% BSA 용액을 웰에 가하고 30분동안 처리하였다. 플레이트를 2ml/웰의 PBS로 세 번 세척하였다. 대조군으로, PBS를 DEAE- 덱스트란 용액을 대신하여 사용한 것을 제외하고, 동등한 방법을 수행하여 플레이트를 제조하였다.
상기 기재된 바와 같이, 소듐 부티레이트를 가하는 방법에 따라, 레트로바이러스 벡터 플라스미드 pLEIN을 GP+E86세포[ J.Virol.,62:1120-1124(1988)]에 도입시켜 얻은 재조합 레트로바이러스-생산 세포를 사용하여 바이러스 상등액을 제조하였다. 10% CS를 함유하는 20 부피 DMEM으로 1 부피 바이러스 상등액을 희석시켜 얻은 1ml 바이러스 희석액( 1.6 X106cfu/ml)을 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간동안 배양시키고, 이어, 2ml/웰의 PBS로 세번 세척하였다. 5X104 NIH/3T3 세포를 웰에 가하였다. 플레이트를 5% 이산화탄소하에서 37℃에서 3일동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 트립신으로 처리하고 모았다. EGFP-발현 세포를, 실시예 4에서 기재된 바와 같이, 유동 세포계수법에 따라 분석하여, 유전자 도입 효율을 결 정하였다. 결과를 표20에 나타낸다.
표20
유전자 도입 효율을 전체 세포에 대한 EGFP-양성 세포의 비로 표시한다.
표20에서 나타나는 바와 같이, DEAE-덱스트란은 또한 레트로바이러스에 결합하는 활성을 지니고 있고, 본 발명의 유전자 도입 방법에 사용될 수 있음이 증명되었다.
실시예 15
원심분리법을 사용한 기능적 물질과 레트로바이러스의 결합
네오바이신-내성 유전자[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,84:2150-2154(1987)]를 포함하는 레트로바이러스 플라스미드, DOL 벡터가 도입된 φCRIP 세포를 10% CS, 50단위/ml 페니실린 및 50㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM중에서 배양하였다. DOL 바이러스 상등액을 하기와 같이 제조하였다. 생산 세포가 세미-콘플루언스로 자란 10-cm 배지를 10% CS를 포함하는 5ml DMEM으로 교환하였다. 24시간 후, 상등액을 모으고 0.45㎛ 필터(Millipore)로 여과시켰다. 바이러스 상등액의 역가는 8.7X105 cfu/ml이었다.
레트로바이러스로 감염된 세포에 사용된 원심 분리기 튜브(50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브, Falcon)를 하기와 같이 CH-296으로 코팅시켰다. 간단히 말해, 40 ㎍/ml CH-296을 함유하는 3ml PBS를 원심분리 튜브의 바닥에 천천히 침전시켰다. 튜브를 4℃에서 16시간동안 수직으로 방치시켜 배양시켰다. CH-296 용액을 2% BSA를 함유하는 3.5ml PBS로 교환하였다. 튜브를 추가로 상온에서 배양하고 이어, 5ml 행크스 발란스 염 용액(HBSS, Gibco)으로 세척하였다.
DOL 레트로바이러스를 하기와 같이, CH-296으로 코팅된 원심분리기 튜브의 밑바닥에 결합시켰다. 간단히 말해, 5ml 비-희석된 DOL 바이러스 상등액, 또는 그의 10배 또는 100배 희석액을 원심분리 튜브중에서 침전시켰다. 튜브를 2900Xg로 25℃에서 3시간동안 원심분리시켜 레트로바이러스가 CH-296에 결합되도록 하였다. 비교하기위해, 상기에 언급된 바이러스 상등액을 6-웰 비-처리 플레이트에 가하였다. 40㎍/ml CH-296을 함유하는 PBS를 사용하여, CH-296으로 코팅된 세포 배양용 6-웰 비-처리 플레이트(Falcon)에 가하여 8㎍/cm2 의 밀도를 얻었다. 플레이트를 37℃에서 4시간동안 방치시켜 결합시키고 하기 과정에 사용하였다.
원심분리법에 의해, 레트로바이러스가 결합된 CH-296으로 코팅된 원심분리 튜브를 사용하여 NIH/3T3 세포내로 유전자 도입을 수행하였다. 간단히 말해, CH-296으로 코팅되고, 이중에서 바이러스 상등액의 일련의 희석액이 원심 분리되는 원심분리 튜브에서 1X105 NIH/3T3 세포를 침전시켰다. 튜브를 37℃에서 3시간동안 배양하였다(이하에서, 원심분리법으로 언급됨) 다르게는, 상기 언급된 마이크로플레이트를 동등한 조건하에서 배양하였다(이하에서 결합 방법으로 언급됨). 대조군으로, 바이러스 상등액 및 NIH/3T3 세포의 혼합물을 CH-296으로 코팅된 마이크로플 레이트에 가하고, 플레이트를 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 모았다. 모아진 세포의 유전자 도입 효율는 실시예 13에서 기재한 바와 같이 결정하였다. 결과를 도 4에 도시한다. 도 4에서, 수평축은 바이러스 상등액의 희석비율을 표시하고 수직축은 유전자 도입 효율을 표시한다. 흰 막대, 음영 막대, 검은 막대는 상등액 방법, 결합 방법 및 원심분리법을 통해 얻은 결과를 나타낸다.
도4에서 나타나는 바와 같이, 원심분리법을 사용한, 유전자 도입의 효율이 통상적인 상등액 방법 및 바이러스 감염에 앞서, 자발적으로 CH-296에 흡수되는 방법(결합 방법)을 사용한 경우보다 높았다. 따라서, 많은 바이러스 입자는 원심력에 의해 바이러스를 침전시킴으로써 용기의 바닥에 존재하는 CH-296에 결합한다는 것이 증명되었다. 특히, 희석된 바이러스가 사용될 때, 원심분리에 의한 효율은 현저하였다.
또한, 바이러스 원심분리 또는 방치(결합)를 사용하여 바이러스를 결합시킨 후 모은 바이러스 상등액의 역가를 측정하였다. 결과를 표21에 나타낸다.
표21
표21에 나타난 바와 같이, 방치한경우, 결합전에 모아진 상등액은 상등액 농도의 약 80 내지 90%를 가졌다. 한편으로, 원심분리에 의해 결합시킨 후,상등액 의 농도는 결합전 상등액의 1/10 또는 그 이하였다. 이 결과는 더많은 바이러스 입자가 원심력에 의해 CH-296에 결합된다는 것을 증명하였다. 원심 분리법 후 원심 분리 튜브를 세척하는데 사용한 PBS는 약 2%의 최초 바이러스를 함유한다. 또한 세척 단계의 존재여부와는 관계없이 거의 동일한 유전자 도입 효율이 관찰되었다. 이 결과는 원심분리가 사용되었을 때, 바이러스 입자는 CH-296에 견고하게 결합된다는 것을 제안한다.
또한, 세포가 원심분리되는 동안 바이러스에 감염되는 방법에 의한 유전자 도입 효율과 원심분리 방법에 의한 유전자 도입 효율을 비교하였다. 원심분리 방법을 통한 NIH/3T3 세포내로의 유전자 도입 효율를 원심분리-감염 방법, 이 방법에서 바이러스는 원심력에 의해, 감염하기위해 세포위로 응결된다(참조 WO 95/10619). 실시예 14에서 기재된 바와 같이, GP+E86을 사용하여 제조된 바이러스상등액을 희석시켜 제조된 5ml 바이러스 상등액을 사용하여, 1X105 cfu/ml NIH/3T3 세포의 배양 상등액을 비교하였다. 간단히 말해, 유전자 도입을 하기와 같이 수행하였다. 상기 언급된 바이러스 상등액을 CH-296으로 코팅된 원심분리기 튜브에 가하였다. 튜브를 30℃, 2900Xg에서 4시간동안 원심분리시키고, 이어 PBS로 세척하였다. 이어, 세포를 37℃에서 4시간동안 튜브에 가하여 감염시켰다(원심분리법). 세포를 CH-296으로 코팅된 원심 분리기 튜브에 가하고, 2시간동안 배양시켰다. 바이러스 상등액을 튜브에 가하였다. 튜브를 30℃에서 2900xg로 4시간동안 원심분리시켜 감염시켰다(원심 분리-감염 방법). 이 방법에서, 원심분리 튜브는 상기에 기재 된 바와 같이, CH-296에 의해 코팅되고, 1X105 NIH/3T3 세포를 유전자 도입에 사용하였다. 감염시킨 수, 세포를 다시 60-mm 플레이트로 코팅하고, 이어 2일동안 배양하였다. EGFP유전자 도입의 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이, 유동 세포계수법에 따라 결정된다. 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5에서 나타나는 바와 같이, 원심분리법에 의한 유전자 도입 효율이 원심분리-감염방법보다 높다는 것이 증명되었다. 이는 바이러스 상등액중의 감염-억제 물질이 세척으로 제거되었기 때문으로 여겨진다.
Claims (26)
1)레트로바이러스를 함유하는 용액을 기질상에 고정화된, 피브로넥틴, 섬유아 세포 성장 인자, 콜라겐 V형, 폴리리신 및 DEAE-덱스트란으로 구성된 그룹에서 선택된 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가진 기능적 물질과 접촉시키고;
2)레트로바이러스가 결합된 기질을 세척하며;
3)레트로바이러스가 결합된 기질을 표적 세포와 접촉시키고 배양하는,
것을 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스를 사용하여 유전자를 표적 세포내로 도입하는 방법.
제 1항에 있어서, 레트로바이러스를 함유하는 용액을, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖고 기질에 고정화되는 기능적 물질과 3시간이상동안 접촉시키는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 레트로바이러스와 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질 사이의 결합 빈도를 단계(1)에서 물리적으로 증가시키는 방법.
제 3항에 있어서, 레트로바이러스를 원심력에 의해, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖고 기질에 고정화되는 기능적 물질위에 침전시켜 단계(1)을 수행하는 방법,
삭제
제 1항에 있어서, 상기 기능적 물질이 세포-접착 단백질, 호르몬, 사이토카인, 항체, 당쇄, 탄수화물 및 대사 산물로 구성된 그룹에서 선택된 표적 세포 결합 사이트를 가지는 방법.
제 1항에 있어서, 레트로바이스가 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질 및 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 또다른 기능적 물질이 고정화되는 기질을 사용하는 방법.
제 7항에 있어서, 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질이 세포-접착 단백질, 호르몬, 사이토카인, 항체, 당쇄, 탄수화물 및 대사 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 1항에 있어서, 세포 배양용 용기 또는 미립자 기질(particulate substrate)이 기질로서 사용되는 방법.
제 1항에 있어서, 레트로바이러스를 함유하는 용액이 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 덱사메타손 및 소듐 부티레이트로 구성된 그룹에서 선택된 물질의 존재하에서 수득된 레트로바이러스-생산 세포의 배양 상등액인 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체가 기질상에 추가적으로 고정화된, 레트로바이러스를 사용하여 유전자를 표적 세포내로 도입하는 방법.
제 12항에 있어서, 항체가 표적 세포 표면상의 생물학적 물질을 인식하는 방법.
제 1항에 있어서, 라미닌, 라미닌 단편, 라미닌으로부터 유래된 당쇄 또는 고 만노오스형 당쇄가 기질상에 추가적으로 고정화된, 레트로바이러스를 사용하여 유전자를 표적 세포내로 도입하는 방법.
삭제
제 12항 또는 제 14항에 있어서, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 갖는 기능적 물질이 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 방법.
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제 12항 또는 제 14항에 있어서, 세포 배양용 용기 또는 미립자 기질(particulate substrate)을 기질로서 사용하는 방법.
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