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KR100505908B1 - 조건적 자성 불임을 사용하는 잡종 종자 생산 방법 - Google Patents

조건적 자성 불임을 사용하는 잡종 종자 생산 방법 Download PDF

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KR100505908B1
KR100505908B1 KR19997008020A KR19997008020A KR100505908B1 KR 100505908 B1 KR100505908 B1 KR 100505908B1 KR 19997008020 A KR19997008020 A KR 19997008020A KR 19997008020 A KR19997008020 A KR 19997008020A KR 100505908 B1 KR100505908 B1 KR 100505908B1
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Abstract

본 발명은 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 암호서열에 작동적으로 연결된 자성-선택적 프로모터를 포함하는 조건적 자성 불임 식물을 생성하는 단계; 조건적 자성 불임 식물을 웅성 불임 식물과 사이심기하는 단계;전독소를 조건적 자성 불임 식물에 적용하는 단계 및 잡종 종자를 수득하는 단계를 포함하는, 잡종 종자 생산 방법을 제공한다. 자성 생식 조직에서 전독소의 독소로의 전환의 결과로서, 생존가능한 종자 형성이 조건적 자성 불임 식물에서 방지되고, 화분 생성이 웅성 불임 식물에서 방지됨으로써, 잡종 교잡의 두개의 교배친을 사이삼기하여 더 효율적으로 화분을 전달할 수 있다. 또한, 본 발명에 유용한 발현 카셋트, 당해 발현 카셋트로 형질전환된 식물, 및 신규의 자성-선택적 프로모터가 제공된다.

Description

조건적 자성 불임을 사용하는 잡종 종자 생산 방법{Method of hybrid seed production using conditional female sterility}
본 출원은 1997년 3월 3일 출원된 미국 가출원 제60/039,527호의 귄리를 주장한다.
본 발명은 식물 잡종 종자의 생산에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 자성 생식 기관에서 발현되는 경우, 외인성 전독소(protoxin)의 독소로의 전환을 촉매하는 단백질을 생성시켜, 수정을 무력화시키는 키메라 유전자로 형질전환시킨 식물을 잡종의 제1 교배친(parent)으로서 사용하여 잡종 종자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는, 잡종 종자를 더 효율적으로 생산하는데 있어서의 조건적 웅성-불임 식물과 병용된 조건적 자성-불임 식물의 용도, 본 발명에 유용한 키메라 유전자, 키메라 유전자를 포함하는 유전자이식된 식물, 식물의 자성 생식 조직에서 발현시키기에 유용한 신규한 프로모터가 포함된다.
농작물에서의 잡종강세는, 이의 현저한 수율 개선 효과 때문에, 상당한 주목을 받았다. 상이한 옥수수 종을 교잡함에 따른 생산성의 증가가 19세기 말에 최초로 주목되었고, 이 후 체계적인 유전자 처리방법에 따라 개발되었다. 잡종 옥수수의 유용한 재배 방법은 다수의 근친교배계를 획립하고, 이종교배체를 수득하고, 잡종이 소정 장소에서 더 생산적인지를 측정하는 것이다.
잡종 옥수수의 성공을 계기로, 식물 육종자는 경제적으로 중요한 많은 다른 종에서 잡종강세의 존재 및 중요성에 대해 탐구하기 시작하였다. 일반적으로, 잡종은 비-잡종 변종에 비해 수확량의 증가를 나타낸다. 통상적으로, 잡종은 성장 인자의 사용시 더 효율적이며, 물과 비료와 같은 성장 인자의 경우 단위당 더 많은 수익을 준다. 스트레스하에서, 일반적으로 잡종이 다양한 환경에서 더 안정적인 능력을 갖으므로, 교배친 품종 보다 뛰어나다. 잡종의 경우, 생산이 한결같고, 종종 수확을 용이하게 하고 시장에서의 제품 가치를 증가시키는 성숙도를 지닌다. 또한, 잡종은 다른 방법으로는 병합시키기 관란하거나 불가능한 특징을 병합시킬 수 있다. 이는 특히 종간 잡종체 및 속간 잡종체의 경우 그러하다. 일반적인 연구 결과는, 식물체의 공통 현상인 잡종강세가, 적당한 기술이 고안될 수 있는 경우, 충분히 상업적 이용을 보장할 수 있다는 것이다.
잡종 강세는 수년 동안 식물 및 동물에서 널리 유포된 현상으로서 인식되어 왔다. 현재, 상업용 잡종이 수 많은 농작물, 예를 들면 옥수수, 수수, 사탕수수, 및 해바라기에서 광범위하게 사용되고 있다. 기타 대단위 농작물, 예를 들면 밀, 보리 및 벼는 여전히 주로 근친교배 변종으로서 재배된다. 장래에 상용 잡종을 널리 사용할 수 있는 상기 작물 및 기타 작물에 관한 연구가 수행되고 있지만, 새로운 잡종 농작물 개발의 1차 제한 요소는 이들 농작물에서 경제적으로 잡종 종자를 생산하는 방법이 결여되어 있다는 점이다.
종래에, 대규모 잡종 종자 생산은, 자성 교배친계와 웅성 교배친계를 별도의 열(row) 또는 블록에 심어 이들을 수분시킴으써 달성된다. 자성 교배친계의 열에서 생산된 종자만을 수확한다. 이 종자가 자화수분된 종자로 오염되지 않은 잡종 종자임을 보장하기 위하여, 자성 교배친 식물에 대해 수분 조절 방법을 수행하여, 이들에게서 형성된 종자가 자화-수분(self-pollination)이 아닌 타화-수분(cross-pollination)으로부터 수득된 것임을 확증한다. 일반적으로, 공지된 수분 조절 기작은 기계적, 화학적 또는 유전적 기작이다.
자웅동주 종인 옥수수와 같은 일부 중에서, 자성 교배친로부터의 가임(fertile) 화분의 제거는 수작업에 의한 제웅(emasculation)으로 달성될 수 있다. 이와 같은 가임 화분의 제거는 자성 교배친 집단중의 식물로부터 웅성 꽃(수술)을 뽑거나 절단함으로써 달성된다. 이러한 간단한 방법은, 자화수분을 방지하기 위해 화분이 떨어지기 전에 자성 식물을 기계적으로 웅수절제(detasseling)시킴으로써 자가-수정을 방지한다. 그러나, 대부분의 목적하는 주요 농작물은 동일한 꽃내에 기능적 웅성 및 자성 기관을 지니므로, 제웅이 비현실적이다. 실행가능하다 하더러도, 이러한 형태의 잡종 종자 생산은 매우 노동 집약적이므로, 비용이 많이든다. 잡종 교잡에서 자가-수정을 방지하는데 필수적인 수고스러운 웅수절제를 생략하기 위하여, 웅성-불임을 만들 수 있는 유전적 요소를 일부 종에서 사용해왔다.
자성 교배친에서의 웅성-불임은 핵 유전자 또는 세포질-유전 시스템에 의해 조절될 수 있다. 유전적 웅성-불임은, 불임에 대한 대립유전자가 일반적으로 가임에 대한 대립유전자에 비해 열성인 핵 유전자에 의해 조절된다. 유전적 웅성-불임은 다수 종에서 일어난다. 통상적으로, 이는 웅성-불임을 야기시키는 동형접합성인 단일 열성 유전자에 의해 조절된다. 잡종 종자 생산에 있어 유전적 웅성-불임을 사용하는 육종자는 50% 웅성-불임 및 50% 웅성 가임 개체를 분리하는 표현형상 단일형의 자성계를 개발하였다. 이러한 계에 대한 종자의 분리는, 웅성-불임 유전자에 대해 이형접합성인, 따라서 웅성-가임인 식물에 의해 수분된 웅성-불임 유전자에 대한 동형접합성 식물로부터의 종자를 수확함에 따라 증가된다. 유전적 웅성-불임을 지닌 상용 잡종 종자를 생산하기 위하여, 웅성-가임 자성 식물의 50%를, 이들의 가임성이 확인될 수 있는한 바로, 포장으로부터 솎아내야 한다. 자성 식물로부터 가임 식물을 솎아내는 것과 관련된 노동 때문에, 잡종 종자를 생산하는데 유전적 웅성-불임을 사용하는 것이 크게 제한된다. 상용 잡종 종자를 생산하는데 상기 시스템과 관련된 여러 문제가 있다. 우선, 자성 집단중의 목적하는 웅성-불임 식물로부터 가임 식물을 제거하는 것이 불가능하다. 유전적 웅성-불임 식물은 이들을 웅성-불임 개체와 교배시킴으로써 유지된다. 이러한 교잡으로부터의 F1 식물의 절반이 불임성이지만, 나머지 식물은 가임성일 것이다. 따라서, 자성 집단중의 원치않는 웅성-불임 식물이 화분을 퍼뜨려서 목적하는 웅성 교배친의 효과를 감소시킬 수 있다.
상용 잡종 종자 생산을 위한 세포질 웅성-불임을 성공적으로 사용하기 위해서는, 안정한 웅성-불임 세포질, 적당한 화분 공급원, 및 웅성 교배친로부터의 화분을 웅성-불임성 자성으로 유도하는 효과적인 시스템이 필요하다. 또한, 웅성 불임성의 세포질-유전적 시스템은 단일 교잡 잡종을 생산하는데 3개의 계열을 요구한다: A 계열(웅성-불임), B 계열(웅성-가임 유지체), 및 R 계열(회복 유전자를 지닌 웅성-가임). 세포질-유전적 웅성 불임성을 지닌 생산된 3종의 교잡체는 4개 계열, 즉 하나의 근친교배의 A 및 B 계열, 및 다른 두개의 웅성-가임 근친교배체의 유지 및 생산과 관련이 있다.
또한, 세포질 웅성-불임 T 세포질을 지닌 모든 옥수수 잡종을 심각하게 공격하는 헬민토스포륨 마이디스, 레이스 T[Helminthosporium maydis, Race T]에 의해 발병되는, 남부 옥수수 마름병을 통해, 옥수수-불임 세포질의 단일 공급원을 토대로 하는 잡종 종자 생산 산업의 취약함이 입증되었다. 잡종 옥수수의 경우, 대부분의 종자 생산자는 수작업 또는 기계적 제웅 및 풍식 수분으로 복귀했다.
또한, 잡종 종자는, 생존가능한 화분을 사멸시키거나 이의 형성을 차단하는 화합물을 사용함으로써, 생산될 수 있다. 배우자 모세포(gametocide)로 불리는 이들 화합물을 사용하여 일시적인 웅성-불임을 부여한다. 그러나, 화합물의 비용 및 이용가능성, 및 적용의 신뢰도가 배우자 모세포의 사용을 통한 잡종 종자의 생산을 제한한다.
잡종 종자의 분자생물학적 방법도 또한 기술되어 있다. 이러한 방법에 의하면, 안티-센스 DNA, 및 식물에서의 가임 화분의 생성을 조절할 수 있는 다른 유전자를 함유하는 작제물로 식물을 형질전환시킨다. 이와 같이 재생된 식물은 기능적으로 웅성-불임이고, 웅성-가임 식물로부터의 화분과 교잡하여 잡종 종자를 생산하는데 사용된다. 이러한 시도의 1차적인 결함은, 유전자 조작된 웅성 가임 유전자가 안티-센스이든 또는 RNAse이든 이형접합성 상태로만 유지될 수 밖에 없다는 사실로부터 비롯된다. 이들은 교잡에 의해 동계(isogenic) 웅성 불임 계열로 유지되어야 하는 점에서, 천연의 유전적 웅성 불임체와 근본적으로 동일하다. 이는 면적이 넓고 수확량이 중요한 잡종 교잡 포장에서 가장 중요한 문제이다. 단지 50%만이 웅성 불임인 이형접합 자성 교배친은 화분 공여 웅성 교배친의 다음 열에 심고, 50% 불임 자성 교배친을 제거한다. 이는, 제초제 내성 유전자가 웅성 불임 유전자에 연계될 수 있기 때문에 유전자 조작된 유전적 웅성 불임체에서 더 용이하게 이루지며, 제초제 스프레이를 가임 식물을 제거하는데 사용할 수 있으나, 이는 본 시스템의 에이커당 동일한 수확량을 수득하기 위하여는 자성 교배친 열을 2배 밀도로 심어야 한다. 이는 경쟁으로 인한 약간의 수확량 손실을 가져올 것이다. 또한, 내성 식물은 제초제에 대해 결코 100% 면역성이 아니기 때문에 제초제 스프레이는 수확량 손실을 초래하며, 화합물의 스프레이 비용도 상당하다.
이들 전통적인 잡종 종자 생산 시스템의 단점은 웅성 및 자성 교배친계를 별도의 열 또는 블록으로 심을 필요가 있다는 점이다. 웅성 화분 공여 식물과 자성 화분 수여 식물간의 물리적 거리로 인해, 화분 전달이 덜 효율적이며, 자성 교배친상의 종자의 정착이 불량하며, 화분 공여 식물에 더 많은 경작지를 부여할 필요가 있으며, 경작지의 단위 면적당 잡종 종자의 수확량이 감소한다. 이러한 단점은 특히, 소량의 화분을 방출하며 화분이 바람에 의해 효과적으로 운반되지 않는 농작물 종, 예를 들면 밀에서 심각하다. 종래의 잡종 종자 생산 방법을 밀에 적용하는 경우, 웅성 화분 공여 식물에 경작지의 1/3 또는 2/3를 제공할 필요가 있다[문헌: Johnson and Schmidt, Adv. Agronomy 20: 199-233(1968); Wilson, Plant Breeding Reviews 303-309(1989)]. 이 결과, 잡종 밀 종자 생산의 비용이 너무 과다하여, 잡종 종자 생산 기술 및 입증된 잡종강세를 이용할 수 있음에도 불구하고, 산업적으로 유지할 수 없다.
밀 및 기타 농작물을 위한 더욱 경제적인 잡종 종자 생산 시스템을 달성하기 위하여, 웅성 및 자성 교배친 식물을 서로 더 가깝게 하여 더 효율적으로 화분이 전달되도록 할 필요가 있다. 단지 자성 교배친 식물로부터의 종자가 수확될 수 있도록 별도의 블록 또는 열에 심기 보다는 차라리, 웅성 및 자성 교배친 식물을 동일한 열에 사이심기(interplanting)하여, 식물들이 몇 미터가 아닌 몇 센티미터 떨어지도록 할 필요가 있다. 교배친을 수득하는데 있어 이와 같이 공간상 밀접한 경우 단지 자성 교배친로부터의 종자만을 수확하는 것은 비현실적이기 때문에, 자성 교배친 식물에서 생존가능한 화분이 형성되는 것을 방지함은 물론, 웅성 교배친 식물에서 생존가능한 종자가 형성되는 것을 방지할 필요가 있다.
생존가능한 종자의 형성을 방지하는 한가지 방법은 자성-불임 식물을 사용하는 것이다. 천연의 자성 불임성이 여러 농작물에서 보고[문헌: Honma and Phatak, Journal of Heredity 55: 143-145(1964); Sniezdo and Winiarczyk, Protoplasma 187:31-38 (1995); Justus and Meyer, Journal of Heredity 54:167-168(1963); Hanna and Powell, Journal of Heredity 65:247-249(1974); Brown and Bingham, Crop Science 24:1207-1208 (1984)]되었으나, 이들 계열을 유지하는데 문제가 있으며, 이들이 상업적으로 사용되지 않았다. 우성, 자성-불임 유전자를 작제하는 방법이 문헌[EP 412,006 A1(1990); Goldman et al., EMBO Journal 13:2976-2984(1994)]에 기술되어 있으나, 이러한 유전자를 포함하는 자성-불임계의 유지는, 자성-불임성 유전자에 동형접합성인 계를 발생시킬 수 없기 때문에 문제가 있다. 상기 자성-불임성 유전자의 유지 방법 및 잡종 종자 생산에서의 이의 용도가 문헌[EP 402,270(1990)]에 기술되어 있다. 그러나, 이는 자성-불임 웅성 교배친계를 발생시키기 위하여 자성-불임 유전자, 제1 웅성-불임 유전자의 회복 유전자, 제2 웅성-불임 유전자, 및 2개의 제초제 내성 유전자를 일련의 형질전환의 다중 시리즈로 도입할 필요가 있으며, 또한 이는 웅성-불임 자성 교배친계를 발생시키기 위하여 제1 웅성-불임 유전자, 자성-불임 유전자의 회복 유전자 및 하나의 제초제 내성 유전자를 일련의 형질전환의 다중 시리즈로 도입할 필요가 있다. 제초제 처리는 계열 증식의 각 회마다 정확한 유전자형의 선택을 필요로 하고, 잡종 종자를 생산하기 위하여는 경작지를 하나의 제초제로 처리하여 공정의 산물인 바람직하지 않은 유전자형을 제거할 필요가 있다. 비록 상기 시스템이 웅성 및 자성 계열의 사이심기의 경제적 잇점을 제공할 수 있더라도, 이는 상업적으로 사용하기에는 너무 복잡하다.
따라서, 잡종 종자를 생산하기 위한 간단하고 경제적인 방법이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은, 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 암호 서열에 작동적으로 연결된 자성-선택적 프로모터를 포함하는 조건적 자성 불임 식물을 생성하는 단계; 당해 조건적 자성 불임 식물을 웅성 불임 식물과 사이심기하는 단계; 조건적 자성 불임 식물에 전독소를 적용하여 자성 불임성을 유도하는 단계; 및 잡종 종자를 생산하는 단계를 포함하는, 잡종 종자 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 바림직한 태양에서, 당해 식물은 통상적으로 자화-수분되거나 또는 통상적으로 타화-수분된다. 특히 바람직한 태양에서, 당해 식물은 옥수수, 밀, 및 보리로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또한, 본 발명에 의하면, 본 방법에 의해 생산된 잡종 종자가 제공된다.
또한, 본 발명은, 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 암호서열에 작동적으로 연결된 자성-선택적 프로모터를 포함하는 발현 카셋트를 제공한다. 바람직한 태양은 argE 유전자의 암호서열에 작동적으로 연결된 자성-선택적 프로모터를 포함한다. 자성-선택적 프로모터의 바람직한 태양은 B200i4-2 클론, P26 클론 또는 P19 클론으로부터의 프로모터로 이루어진다. 특히 바람직한 태양은 argE 유전자의 암호서열에 작동적으로 연결된 B200i4-2 클론 또는 P19 클론으로부터의 자성-선택적 프로모터를 포함한다. 본 발명에 유용한 암호서열의 추가적 태양은 P450sul 모노옥시게나제 유전자, 및 pehA 유전자로부터 수득된 것이다.
또한, 본 발명에 의하면, 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 암호서열에 작동적으로 연결된 자성-선택적 프로모터를 포함하는 발현 카셋트를 포함하는 식물, 및 이러한 식물의 종자가 제공된다.
본 발명의 또 다른 목적은 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 암호서열에 작동적으로 연결된 자성-선택적 프로모터를 포함하는 식물에서 자성 가임성을 유도하는 방법에서의 전독소의 용도, 및 상기 식물에 전독소를 적용하여 자성 불임을 유도하는 방법에서의 전독소의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 발현되는 경우 전독소의 독소로의 전환을 촉매하여 자성 불임성을 유도하는 자성-선택적 프로모터에 작동적으로 연결된 argE 유전자의 암호 서열을 잡종 종자 생산 방법에 사용하는데 있어서의 용도를 제공하는 것이다.
정의 및 명명법
본원에서 사용된 "자성-생식 조직"이란 용어는 심피 또는 암술기(암술기에 대한 구용어는 '암술'이다)로 이루어진 식물 부분을 의미한다. 식물 꽃의 심피에는 암술머리, 암술대, 씨방, 및 암술머리, 암술대 및 씨방을 포함하는 세포 또는 조직이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. 본원에서 사용된 "자성-선택적" 프로모터란 용어는 식물의 자성 생식 조직의 하나 이상의 세포 또는 조직에서 유일하게 또는 주로 전사 활성을 갖는 프로모터를 의미한다.
본원에서 사용된 "발현 카셋트"란 용어는, 종결 영역에 작동적으로 연결된 아미노산 암호 영역에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는, 식물 세포에서 유전자의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 당해 유전자는 하나 이상의 유전자의 성분이 하나 이상의 다른 유전자 성분의 관점에서 이종성인 키메라성일 수 있다. 당해 유전자는 식물의 유전적 형질전환에 유용한 재조합 형태로 수득되어 왔으나, 천연적으로 존재할 수도 있다.
본원에서 사용된 "전독소(protoxin)"란 용어는 효소의 작용에 의해 활성화되어 식물 세포에 독성이고, 정상적인 성장, 발생 또는 대사 활성을 지연, 억제 또는 방해하기에 충분한 방식으로 식물 세포 기능을 파괴하는 반응 산물을 생성시킬 수 있는 최소 식물독성을 지닌 화합물을 의미한다. 본원에서는 독성 반응 산물은 "독소"로 지칭된다. 본 발명에서, 전독소는 식물의 외부에 적용되는데, 이는 엽면 흡수, 뿌리 흡수, 표적 식물 부분과의 직접적인 접촉, 또는 식물의 일부로부터 다른 부분으로의 전신적 이동을 촉진하는 수단에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 "자성 가임성"이란 식물의 자성 생식 조직이, 기능적 또는 생존가능한 화분과 수분되는 경우, 생존가능한 종자 형성을 유지할 수 있음을 의미한다. 본원에서 사용되는 "조건적 자성 불임성"이란 후속적으로 효소에 의해 활성화되어 독성 반응 산물을 생성시키는 전독소를 외부로부터 적용하는 경우 발생하는 자성 불임성을 의미한다. 본원에서 사용된 "웅성 불임성"이란 식물의 웅성 생식 조직이 생존가능한 또는 기능적인 화분을 생성시킬 수 없는 것을 의미한다.
식물에서의 자성 불임성의 조절
본 발명의 잇점중의 하나는 포장 조건하에서 식물의 생존가능한 종자 형성을 자성 가임성의 조절에 의해 조절함에 있어서의 이의 용도이다. 자성 가임성은, 자성-선택적 프로모터의 조절하에 발현되는 경우 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 키메라성 또는 재조합성 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 전독소가 외부에 적용되는 경우 자성 생식 조직이 생존가능한 종자를 형성시킬 수 없는 유전자이식된 식물을 수득함으로써 조절될 수 있다. 유전자이식된 식물은 자성 불임성에 대해 조건적일 수 있는데, 이는 자성 불임성의 현상이 전독소의 존재에 대해 조건적일 수 있기 때문이다. 자성 생식 조직에서의 전독소의 독소로의 전환은, 자성-선택적 프로모터가 활성인 경우 또는 자성-선택적 프로모터가 활성인 세포 또는 조직에 따라 여러 기작을 통해 생존가능한 종자 형성을 방지할 수 있다. 이들에는 1) 암술이 더 이상 수정을 하기에 경쟁적이지 않도록 정상적인 암술 발생을 방지하고, 2) 전환된 독소에 의해 화분관의 성장을 억제하고, 3) 생존가능한 배우자의 발생을 방지하고, 4) 수정에 이은 종자 발생을 방지하는 방법이 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 1 태양에서, 전독소는 포장 조건하에 유전자이식된 식물에 외부로부터 적용되고, 전독소로부터 독소로의 전환은 자성 생식 조직에서 일어난다. 생존가능한 종자 형성은 자성 생식 조직에서의 독소의 작용에 의해 방해된다.
암호서열 및 본 발명에 유용한 전독소
본 발명에 유용한 암호서열에는 전독소를 독소로 전환시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 임의의 서열이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 이들 암호서열은 동종 또는 이종 기원일 수 있다.
바람직한 태양에서, argE 유전자로부터의 암호서열은 자성-선택적 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 유전자이식된 식물에서 상기 키메라성 유전자가 발현됨으로써, 전독소인 N-아세틸 포스피노트리신(N-아세틸 PPT)의 존재하에 조건적 자성 불임성이 수득된다. argE 유전자의 유전자 산물은 이. 콜리의 N-아세틸-L-오르니틴 데아세틸라제이며, 이는 R1-CO-NH-CH((CH2)-R2)-COOH 유형의 기질을 가수분해시키는데 광범위한 특이성을 지닌다. 이러한 활성의 결과에 따라, argE 유전자 산물은 전독소 아세틸-포스피노트리신의 독소 포스피노트리신(PPT)으로의 전환을 촉매한다[문헌: Kiete et al., The Plant Journal 9: 809-818(1996)].
다른 바람직한 태양에서, P450sul 모노옥시게나제에 대한 유전자로부터의 암호서열, CPY 105A1은 자성-선택적 프로모터에 작동적으로 연결된다. 이의 발현 결과, 설폰아미드 전독소의 존재하에 조건적 자성 불임성이 수득된다. 스트렙토마이세스 그리세울루스(Streptomyces griseolus) P450sul 모노옥시게나제는, 엽록체에 표적화되는 경우, 설폰 우레아 화합물 R7402(2-메틸에틸-2,2-디하이드로-N-[(4,6-디메톡시피리미딘-2-일)아미노카보닐]-1,2-벤조이아오티아졸-7-설폰아미드-1,1-디옥사이드의 N-탈알킬화를 매개하여, 이를 독소로 전환시킨다[문헌: O'Keefe et al. Plant Physiology 105:473-482(1994)].
바람직한 또 다른 태양에서, pehA 유전자의 암호서열이 자성-선택적 프로모터에 작동적으로 연결되고, 이의 발현 결과, 전독소인 글리세릴 글리포세이트의 존재하에서 조건적 자성 불임성이 수득된다. 부르크홀데리아 카리오필리 (Burkholderia caryophili) PG2982 pehA 유전자의 유전자 산물은 전독소 글리세릴 글리포세이트의 독소 글리포세이트로의 전환을 촉매하는 포스포네이트 모노에스테르 하이드롤라제이다[참조문헌: Dotson et al., Plant Journal 10:383-392(1996)].
상기 예는 설명을 위한 것이지 제한을 위한 것은 아니다. 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 임의의 암호서열이, 자성-선택적 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있는 한, 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명에 유용한 프로모터
본 발명을 수행하기 위하여는, 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열이, 식물의 자성 생식 조직에 대해 선택적인 방식으로 이의 발현을 지시하는 5' 조절 서열에 작동적으로 연결되어야 한다. 이의 발현 특이성에 따라, 발현된 효소의 효과는 생존가능한 종자의 형성에 필요한 조직 또는 세포상에만 미칠 것이며, 가임성에 대한 이의 영향 이외에는 식물에 해롭지 않을 것이다.
식물에서 본 발명에 유용한 자성-선택적 프로모터에는 변형된 S13 프로모터와 같은 쌍자엽식물 프로모터[Dzelkalns et al., Plant Cell 5:855(1993)], 담배의 Stig 1 프로모터[Goldman et al., EMBO J. 13:2976-2984(1994)], AGL5 프로모터[Savidge et al., Plant Cell 7:721-733 (1995)], 및 담배 TTS1로부터의 프로모터[Cheung et al., Cell 82:383-393(1995)]가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 상기 프로모터는 모두 시험되어 유전자이식된 식물에서 작용적임이 입증되었다. 단자엽식물-유래된 프로모터에는 옥수수 심피-특이적 ZAG2 유전자의 프로모터가 포함된다[Thiessen et al., Gene 156:155-166 (1995)].
따라서, 자성 선택적 발현을 갖는 당업계에서 공지된 cDNA에 상응하는 프로모터 서열을 포함하는 게놈성 DNA가 분리될 수 있다. 이들에는 아라비도프시스(arabidopsis) Fbp7 및 Fbp11 유전자에 대한 프로모터[Angenent et al., Plant Cell 7: 1569-1582 (1995)] 및 난초 자성-특이적 cDNA O40, O108, O39, O126 및 O141[Nadeau et al., Plant Cell 8:213-239 (1996)]가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
특이 식물 종에 유용한 자성-선택적 유전자는, 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 지성 조직에서 발현된 신규 전사체를 분리함으로써 클로닝될 수 있다. 이는 옥수수 수염 또는 밀 암술과 같은 자성 조직로부터의 RNA를 분리하고, 차별적 디스플레이, PCR 선별 cDNA 공제법, 및 공제적 cDNA 라이브러리 작제법과 같은 기술로 차별적으로 스크리닝하여 자성 조직에서 선택적으로 발현되고, 잎, 뿌리 또는 수술과 같은 식물의 다른 부분에서는 발현되지 않는 cDNA 클론을 분리하는 단계를 포함한다. 이들 클로닝된 cDNA의 조직 특이성은 노던 분석에 의해 확인될 수 있다. 자성 선택적 클론에 대한 프로모터 서열은 게놈성 라이브러리 스크리닝을 위한 프로브로서 분리된 신규 cDNA를 사용함으로써 수득될 수 있다. 자성 조직에서의 발현에 필요한 5' 및 3'조절 서열을 포함하는 게놈성 클론이 분리될 수 있다. 이들 서열을 사용하여 자성-선택적 방식으로 키메라성 유전자를 발현시키기 위한 발현 카셋트를 작제할 수 있다.
본 발명에 유용한 다른 조절 요소
발현 카셋트의 5' 조절 영역은 다른 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 유전자이식된 식물에서 유전자 발현을 증가시키는 서열이 다수 발견되었다. 예를 들면, 바이러스로부터 유래된 수 많은 비-해독된 리더 서열이 발현을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 특별히, 담배 모자이크 바이러스(TMV, "W-서열"), 옥수수 백화 반점 바이러스(MCMV: Maize Chlorotic Mottle Virus), 및 자주개자리 모자이크 바이러스(AMV: Alfalfa Mosaic Virus)로부터의 리더 서열이 발현을 증가시키는데 효과적인 것으로 알려졌다[참조문헌: Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15:65-79 (1990)]. 당업계에 공지된 다른 리더에는 다음의 것이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다:
피코르나바이러스(Picornavirus), 예를 들면 EMCV(Encephalomyocarditis) 리더(엔세팔로미오카르디티스 5'비암호화 영역)[참조문헌: Elroy-Stein, O., Fuerst, T.R., and Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130(1989)];
포티바이러스 리더, 예를 들면 TEV(Tobacco Etch Virus)리더[참조문헌: Allison et al., (1986); MDMV(Maize Dwarf Mosaic Virus) 리더[Virology, 154:9-20];
사람 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP) 리더[참조문헌: Macejak, D.G., and Sarnow, P., Nature, 353: 90-94 (1991)];
자주개자리 모자이크 바이러스의 피막 단백질 mRNA(AMV RNA 4)로부터의 비해독된 리더[참조문헌: Jobling, S.A., and Gehrke, L., Nature, 325:622-625 (1987)];
담배 모자이크 바이러스 리더(TMV)[Gallie, D.R. et al., Molecular Biology of RNA, pages 237-256 (1989)]; 및
옥수수 백화 반점 바이러스 리더(MCMV)[참조문헌: Lommel, S.A et al., Virology, 81:382-385 (1991)]. 문헌[Della-Cioppa et al., Plant Physiology, 84:965-968(1987)] 참조.
각종 인트론 서열은, 특히 단자엽식물 세포의 5' 조절 영역에 부가되는 경우 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 옥수수 Adh1 유전자의 인트론은, 옥수수 세포내로 도입되는 경우 동족 프로모터하에서 야생형 유전자의 발현을 상당히 증가시키는 것으로 밝혀졌다[참조문헌: Callis et al., Genes Develop. 1:1183-1200 (1987)].
프로모터외에, 각종 3' 전사 터미네이터도 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 전사 터미네이터는 전사 종결 및 정확한 mRNA 폴리아데닐화에 관여한다. 적당한 전사 터미네이터 및 식물에서 작용하는 것으로 공지된 터미네이터에는 CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 신타제 터미네이터, 완두콩 rbs E9 터미네이터 및 기타 당업계에서 공지된 터미네이터가 포함된다. 이들은 단자엽 및 쌍자엽 식물 둘다에 사용될 수 있다.
식물 형질전환
본 발명의 발현 카셋트는 당업계에서 인정된 여러 방법으로 식물 세포에 도입될 수 있다. 당업자는 형질전환 대상인 식물의 유형(예: 단자엽식물 또는 쌍자엽 식물)에 따라 방법을 선택할 것이다. 식물 세포를 형질전환시키는데 적합한 방법에는 미세주사법[Crossway et al., BioTechniques 4:320-334 (1986)], 전기천공법[Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)], 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환[Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921 (1988)], 직접적인 유전자 전달[Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)] 및 위스콘주 매디슨에 소재하는 Agracetus, Inc. 및 캘리포니아주 에르콜스에 소재하는 BioRad에서 시판하는 장치를 사용하는 충격 입자 가속법[Sanford et al., U.S. Patent 4,945,050; and McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)]이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 문헌[Wessinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477(1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27-37(1987)(양파); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-684 (1988)(대두); McCabe et al., Bio/Technology 6:923-926 (1988)(대두); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740 (1990)(벼); Kelein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309(1988)(옥수수); Klein et al., Bio/Technology 6:559-563 (1988)(옥수수); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1988)(옥수수); Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839(1990)(옥수수); 및 Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)(옥수수); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530(1990)(담배 엽록체); Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200(1993)(옥수수); Shimamoto et al., Nature 338: 274-277(1989)(벼); Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991)(벼); 유럽 특허원 제EP 0 332 581호, Horn et al(새발풀 및 기타 포오이데애(Pooideae); Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)(밀); Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993)(밀); Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, 37-48 (1994)(보리)] 참조.
본 발명의 발현 카셋트를 미세투사체 피폭법(microprojectile bombardment)으로 옥수수에 도입하기 위한 특히 바람직한 양태중의 하나는, 본원에 참조로써 전문이 인용된 미국 특허 제08/008,374호에 기술되어 있다. 또 다른 바람직한 양태는, 본원에 참조로서 전문이 인용된 미국 특허 제5,350,689호 및 유럽 특허원 제EP 0 292 435호에 기술된 바와 같은 옥수수에 대한 원형질체 형질전환 방법이다. 본 발명의 발현 카셋트를 미세투사체 피폭법으로 밀에 도입하기 위한 특히 바람직한 양태중의 하나는, 본원에 참조로써 전문이 인용된 미국 특허 제5,610,042호에 기술되어 있다.
식물의 형질전환은 단일 DNA 분자 또는 다중 DNA 분자(즉, 공동-형질전환)에 의해 이루어질 수 있으며, 이들 기술 모두 본 발명의 발현 카셋트와 함께 사용하기에 적합하다. 다수의 형질전환 벡터가 식물 형질전환에 이용될 수 있으며, 본 발명의 발현 카셋트가 이러한 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환의 표적 종에 따라 달라질 수 있다.
많은 벡터가 아가로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하는 형질전환에 이용가능하다. 이들은 전형적으로 하나 이상의 T-DNA 보더 (border) 서열을 수반하고, pBIN19와 같은 벡터를 포함한다[Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)]. 하나의 바람직한 태양에서, 본 발명의 발현 카셋트는 이원 벡터 pCIB200 또는 pCIB2001에 삽입되어 아가로박테리움과 함께 사용될 수 있다. 아가로박테리움-매개된 형질전환을 위한 벡터 카셋트는 하기 방법으로 작제된다. pTJS75kan은, pTJS75[Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol. 164: 446-455 (1985)]를 NarI로 분해하여 테트라사이클린-내성 유전자를 절제하고, 이어서 NPTII를 수반하는 pUC4K로부터의 AccI 단편을 삽입함으로써 생성될 수 있다[Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)]. 좌우 T-DNA 보더, 식물 선택성 nos/nptII 키메라성 유전자 및 pUC 폴리링커[Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)]를 포함하는 pCIB7의 EcoRV 단편에 XhoI 링커를 연결시키고, XhoI-분해된 단편을 SalI-분해된 pTJS75kan에 클로닝시켜 pCIB200을 생성시킨다[참조문헌: EP 0 332 104, 실시예 19].
pCIB 200은 하기의 특정한 폴리링커 제한 부위를 포함한다: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI 및 SalI. 플라스미드 pCIB2001은 추가적 제한 부위를 폴리링커에 삽입시킴으로써 생성되는 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커내의 특정한 제한 부위는 EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI, 및 StuI이다. pCIB2001은, 이러한 특정한 제한 부위를 포함함은 물론, 식물 및 박테리아 카나마이신 선별성, 아가로박테리움-매개된 형질전환을 위한 좌우 T-DNA 보더, 이.콜리와 다른 숙주간을 이동하기 위한 RK-유래된 trfA 작용성, 및 RK2로부터의 OriT 및 OriV 작용성을 지닌다. pCIB2001 폴리링커는 이들 자신의 조절 시그날을 포함하는 식물 발현 카셋트를 클로닝하는데 적합하다.
아가로박테리움-매개된 형질전환에 유용한 추가적 벡터는, 식물에서의 선별을 위한 카나마이신 내성을 암호화하는 유전자, T-DNA 좌우 보더 서열을 포함하고, 이.콜리와 아가로박테리움 모두에서 복제가능하도록 하는 넓은 숙주 범위의 플라스미드 pRK252로부터의 서열이 도입된 이원 벡터 pCIB 10이다. 이의 작제법은 문헌[Rothestein et al., Gene 53: 153-161(1987)]에 기술되어 있다. 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자가 도입된 각종 pCIB 10 유도체가 작제되었다[Gritz et al., Gene 25: 179-188 (1983)]. 이들 유도체에 의해, 유전자이식된 식물 세포를 단지 하이그로마이신에서만(pCIB 743) 또는 하이그로마이신과 카나마이신 모두에서(pCIB 715, pCIB 717) 선별할 수 있게 되었다.
통상적으로 직접적인 유전자 전달 또는 아가로박테리움-매개된 전달을 사용하는 방법은, 필수적인 것은 아니지만, 항생제(예: 카나마이신, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트) 또는 제초제(예: 포스피노트리신)에 대한 내성을 제공하는 선별 마커를 사용하여 수행된다. 그러나, 식물 형질전환을 위한 선별 마커의 선택은, 상기 내성의 발현 및 이의 생화학적 활성이 조건적 가임성을 생성시키는데 사용되는 독소로 전환되는 전독소의 선택을 방해하지 않는 한, 본 발명에서 중요하지 않다.
특정 식물 종의 경우, 상이한 항생제 또는 제초제 선별 마커가 바람직하다. 형질전환에서 통상적으로 사용되는 선별 마커로는 카나마이신 및 관련 항생제에 내성을 부여하는 nptII 유전자[Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)], 제초제 포스피노트리신에 내성을 부여하는 bar 유전자[White et al., Nucl Acids Res 18:1062 (1990), Spencer et al., Theor Appl Genet 79:625-631 (1990)], 항생제 하이그로마이신에 내성을 부여하는 hph 유전자[Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931), 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr 유전자[Bourouis et al., EMBO J. 2: 1099-1104 (1983)], 탄소원인 만노즈에 의해 선별될 수 있는 만노즈 포스페이트 이소머라제 유전자[EP 530 129, WO 94/20627]가 포함된다.
제초제 바스타(Basta)(또는 포스피노트리신)에 의해 선별될 수 있고 직접적인 유전자 전달 기술에 유용한 벡터중의 하나는 pCIB 3064이다. 이 벡터는 플라스미드 pCIB 246를 기초로 하며, 이는 이. 콜리 GUS 유전자에 작동적으로 융합된 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 전사 터미네이터를 포함하며, 본원에 참조로서 인용된 PCT 공보 제WO 93/07278호에 기술되어 있다. 포스피노트리신에 내성을 부여하는데 유용한 유전자중 하나는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Strepptomyces hygroscopicus)로부터의 bar 유전자이다[Thompson et al., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)]. 이 벡터는 이들 자신의 조절 시그날을 포함하는 식물 발현 카셋트를 클로닝하는데 적합하다. 그러나, bar 유전자가 자성 생식 조직에서 발현되는 경우, 선별 마커로서의 bar의 사용이 본 발명의 작용을 방해할 수 있다는 점에 주의하여야 한다. 이러한 문제는, 형질전환에 사용된 세포 또는 조직에서 발현을 조절하나, 자성 생식 조직에서 bar 유전자를 발현시키지 않는 프로모터를 사용함으로써 극복될 수 있다.
또 다른 형질전환 벡터는 벡터 pGL2[Shimamoto et al., Nature 338, 274-276 (1989)]이며, 이는 35S 프로모터 및 35S 터미네이터 서열에 작동적으로 연결된 스트렙토마이세스 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(hpt)를 포함한다.
추가적 형질전환 벡터는 pSOG35이며, 이는 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 선별 마커로서 이.콜리 유전자 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 이용한다. PCR을 사용하여, 35S 프로모터(~800bp), 옥수수 Adh 1유전자로부터의 인트론 6(~550) 및 pSOG10로부터의 GUS 미해독 리더 서열(18bp)을 증폭한다. 이.콜리 디하이드로폴레이트 리덕타제 제II형 유전자를 암호화하는 250bp 단편을 PCR로 증폭시키고, 이들 두개의 PCR 단편을, pUC 벡터 골격 및 노팔린 신타제 터미네이터를 포함하는 pBI221(Clonetech)로부터의 SacI-PstI 단편과 조합한다. 이들 단편의 조합에 의해, pSOG19가 생성되며, 이는 인트론 6 서열, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 신타제 터미네이터와 함께 융합된 35S 프로모터를 포함한다. pSOG19중의 GUS 리더를 옥수수 백화 반점 바이러스(MCMV)로부터의 리더 서열로 대체하면, 벡터 pSOG35가 생성된다. pSOG19 및 pSOG35는 앰피실린 내성을 위한 pUC-유래된 유전자를 수반하며, 외래 유전자의 클로닝에 이용될 수 있는 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 부위를 지닌다.
조건적 자성 불임을 사용하는 잡종 종자의 생산
자화-수분에 의해 생성된 종자로 오염되지 않은 잡종 종자를 생산하기 위하여, 수분 방법을 조절하여 자성 교배친에 의한 자화-수분을 방지하고 웅성 교배친에 의한 타화-수분이 이루어 지도록 한다. 이는 통상적으로 기계적 방법, 유전적 웅성 불임, 또는 화학적 잡종화제(CHA)에 의해 달성된다. 예를 들면, 옥수수의 경우, 현재 자성(또는 종자) 교배친을 기계적으로 웅수절제하는 방법이 수행되고 있으며, 이는 시간-소모적이고 노동 집약적인 방법이다. 밀의 경우, 기계적 수단으로 불임을 조절하는 것은 종자 생산 규모면에서 비현실적이고, 웅성-불임의 유전자 공급원이 시판되고 있지 않다. 단지 수분 조절에 기인한 잡종 종자 생산법은, 웅성 교배친 식물이 자화-수분에 의한 종자를 생성시킬 수 있기 때문에 웅성 교배친 식물의 블록을 자성 교배친 식물의 블록과 물리적으로 분리시킬 것을 요구한다. 잡종 종자의 생산에서 본 발명의 사용으로 제공되는 잇점은 신뢰도, 사용의 용이성, 및 가장 중요하게는 웅성 및 자성 교배친 식물의 사이심기를 허용함으로써 더 효율적으로 화분을 전달할 수 있고, 더 적은 수의 웅성 교배친 식물을 요구하며, 더 경제적으로 잡종 종자를 생산할 수 있다는 점이다.
본 발명을 사용하여 집종 종자를 생산하기 위하여, 자성 선택적 방식으로 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 발현하는 유전자이식된 교배친 식물이 요구된다. 이러한 유전자형을 지닌 유전자이식된 식물을 수득하는 방법은 상기 되어 있다. 본 발명의 키메라 또는 재조합 유전자를 포함하는 유전자이식된 식물을, 통상적인 식물 육종 방법을 사용하여 동형접합성으로 만들 수 있으며 무기한 유지시킬 수 있다.
본 발명에 따른 잡종 종자의 생산에 웅성 불임성인 교배친 식물이 요구된다. 웅성 불임성은 생존가능한 또는 기능적인 화분을 생산하지 못하거나 생산할 수 없다. 웅성 불임성은, 화분을 형성시키지 않거나 또는 화분이 형성되는 경우 화분의 기능적 능력이 결여되도록 유도하는 파쇄로써 얻어진다. 따라서, 화분이 형성되지 않거나, 또는 화분이 형성되더라도, 정상적인 조건하에서는 생존가능하지 않거나 효과적인 수정을 할 수 없다.
잡종 종자 생산에 사용하기 위한 웅성 불임의 많은 공급원이 공지되어 있다[Kaul, Male Sterility in Higher Plants, Springer-Verlag (1998)]. 천연에 존재하는 세포질 웅성 불임 유전자 및 이의 용도가, 옥수수의 경우 문헌[Levings, Science 250:942-947 (1990)]에, 밀의 경우 문헌[Toriyama et al., Jpn. J. Breed. 43:517-524 (1993)]에, 담배의 경우 문헌[Gerstel et al., Genetics 89:157-169 (1978)]에, 호밀의 경우 문헌[Steinborn et al., Theor. Appl. Genet. 85:822-824 (1993)]에, 해바라기의 경우 문헌[Crouziliat et al., Plant Mol. Biol. 16:415-426 (1991)]에, 대두의 경우 문헌[Davis, 미국 특허 제4,763,441호(1988)]에, 브라시카(Brassica)의 경우 문헌[Grelon et al., Mol. Gen. Genet. 243:540-547 (1994)]에, 당근의 경우 문헌[Kitagawa et al., Sex. Plant Reprod. 7:41-50 (1994)]에, 수수의 경우 문헌[Chen et al., Plant Mol. Biol. 28:799-809 (1995)]에, 벼의 경우 문헌[Kadowaki et al., Mol. Gen. Genet. 224:10-16 (1990)]에, 보리의 경우 문헌[Kaul and Singh, Cytobios 66:71-85 (1991)]에 기술되어 있다.
키메라 또는 재조합 웅성 불임 유전자의 작제도 또한 공지되어 있다. 약(anther) 융단 세포에서만 활성인 프로모터로부터 발현되는, β-1,3-글루카나제를 암호화하는 유전자가 유전자이식된 식물에서 웅성 불임을 유발하는 것으로 밝혀졌다[Worrall et al., Plant Cell 4:759-771 (1992)]. 밀로부터의 편집되지 않은 atp9 미토콘드리아 유전자를 암호화하는 유전자가, 유전자이식된 식물에서 구성적(constitutive) CaMV 35S 프로모터로부터 발현되는 경우 웅성 불임을 유발하는 것으로 밝혀졌다[Hernould et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2370-2374 (1993)]. RNAse 효소를 암호화하는 유전자가, 유전자이식된 식물에서 약의 융단 세포내에서만 활성인 프로모터로부터 발현되는 경우 웅성 불임을 유발하는 것으로 밝혀졌다[DeBlock et al., Planta 189:218-225 (1993); EP 344,029; Mariani et al., Nature 347:737-741 (1990)]. 화분 형성에 중요한 유전자에 상보적인 안티센스 RNA의 발현이 유전자이식된 식물에서 웅성 불임을 유발하는 것으로 밝혀졌다[EP 513,884].
당업계에서 익히 공지된 그외의 웅성-특이적 프로모터가 다수 있으며, 이는 키메라성 웅성-불임 유전자의 작제에 이용될 수 있다. 이들로는 화분, 융단조직 또는 약내의 다른 구조에서의 발현을 위한 프로모터 서열이 포함된다. 웅성 특이적 프로모터의 예에는 LAT52 프로모터[Twell et al., Dev. 109:705-13 (1989)], 토마토 A127 프로모터[Dotson et al., Plant J. 10, 383-392 (1996)], 옥수수 Zmg 프로모터[Hamilton et al., Sex. Plant Reprod. 2:208-212 (1989)], 옥수수 CDPK 프로모터[Guerro et al., Mol. Gen Genet. 224:161-168 (1990)], 본원에 참조로서 전문이 인용된 미국 특허 제5,477,002호에 기술된 약-특이적 ant32 및 ant43D 프로모터가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 약-특이적 cDNA에 대한 프로모터 서열은 상응하는 게놈성 DNA 서열을 분리하고, 프로모터 조절 영역을 한정하여, 예를 들면 난초 화분관-특이적 P450[Nadeau et al., Plant Cell 8:213-239 (1996)] 및 아라비도프시스(Arabidopsis)의 Bcp1[Xu et al., Proc. Natl Acad. Sci. 92:2106-2100 (1995)]을 위한 프로모터 서열을 분리함으로써 클로닝될 수 있다. 유사하게, 웅성-특이적인 신규한 유전자를, 각종 기술, 예를 들면 차별적 디스플레이, PCR 선별 cDNA 공제법 및 차별적 cDNA 라이브러리 스크리닝을 이용하여 분리할 수 있다. 일단 동정된, 상응하는 게놈성 서열을 분리하여, 프로모터 영역의 특징을 분석한 후, 이들 서열을 웅성-특이적 방식으로 발현되는 발현 카셋트를 작제하기 위한 프로모터 영역으로서 사용한다.
상기 인공 웅성 불임 유전자의 단점은 이들의 작용이 비조건적이며 우성이라는 점이다. 일단 유전자이식된 식물이 생성되면, 이는 항상 웅성 불임이고, 식물계를 유지하는 것이 곤란하며, 동형접합성인, 전형적인 육종 식물계를 생성시키는 것이 불가능하다.
웅성 불임 표현형이 조건적인 웅성 불임 유전자의 또 다른 범주가 기술되어 있다. 이러한 범주에서는, 웅성 가임이 화학적 전독소의 적용 후에만 파괴된다. 조건적 웅성 불임의 한 예에서, N-아세틸-L-포스피노티리신(전독소)의 L-포스피노트리신(제초제 독소)로의 전환을 촉매하는 N-아세틸-L-오르니틴 데아세틸라제를 암호화하는 유전자가 기술되어 있다[Kriete et al., Plant Journal 9:809-818 (1996); EP 531,716 A2 (1992)]. 약의 융단 세포에서 상기 유전자를 발현하는 유전자이식된 식물은, N-아세틸-L-포스피노트리신 전독소로 처리하는 경우에만 웅성 불임으로 된다. 조건적 웅성 불임의 또 다른 예에서, 설포닐우레아 전독소 R7402의 제초제 독소로의 전환을 촉매하는 박테리아 사이토크롬 P450을 암호화하는 유전자가 기술되어 있다[WO 91/03561; O'Keefe et al., Plant Physiology 105:473-482 (1994)]. 약의 융단 세포에서 상기 유전자를 발현하는 유전자이식된 식물은, R7402 전독소로 처리하는 경우에만 웅성 불임으로 된다. 조건적 웅성 불임의 또 다른 예에서, 전독소 글리세릴 글리포스페이트의 제초제 독소 글리포세이트로의 전환을 촉매화하는 포스포네이트 모노에스테르 하이드롤라제를 암호화하는 유전자가 기술되어 있다[Dotson, et al., Plant J. 10:383-392 (96)]. 약의 융단 세포에서 상기 유전자를 발현하는 유전자이식된 식물은, 글리세롤 글리포세이트 전독소로 처리하는 경우에만 웅성 불임으로 된다.
상기된 또는 당업계에 공지된 웅성 불임의 임의의 공급원이 본 발명에서 사용될 수 있다. 이에는 천연에 존재하는 임의의 웅성 불임 유전자 시스템 또는 목적하는 자성 교배친 계를 키메라 또는 재조합 유전자로 형질전환시킨 것이 포함된다.
본 발명에 따르면, 자성 생식 조직에서 전독소가 독소로 전환된 결과로서, 생존가능한 종자 형성이 조건적 자성 불임 식물(웅성 교배친 식물)에서 방지되고, 화분 형성이 웅성 불임 식물(자성 교배친 식물)에서 방지된다. 잡종 종자를 수득하기 위하여, 웅성 교배친과 자성 교배친의 동형접합성 종자를 경작지에 사이심기하여, 화분 전달이 효율적으로 이루어지도록 한다. 잡종 종자를 생산하기 위하여 본 발명을 사용하는 하나의 예에서, 특정 수단에 의해 자성 교배친이 웅성 불임이 되고, 외부로부터 적용되는 적당한 전독소의 존재하에서 웅성 교배친이 조작에 의해 웅성 불임이 된다. 식물 성장 도중에 적당한 시기에 전독소를 적용한 후, 웅성 교배친(자성 불임) 화분을 자성 교배친(웅성 불임) 배주와 수정시킨 경우에만, 생존가능한 종자가 생성될 것이다. 본 발명을 사용하는 바람지한 양태에서, 전독소의 적용시 웅성-불임이 되도록 자성 교배친을 조작하는 한편, 동일한 전독소의 존재하에서 자성-불임이 되도록 웅성 교배친을 조작한다. 잡종 종자를 생산하기 위하여, 두 개의 교배친 계를 사이심기하고, 식물의 성장 도중 적당한 시기에 전독소를 적용한 경우, 잡종 종자만이 수득된다. 이러한 수단에 의해, 특정한 목적하는 잡종 종자가 생산될 수 있다.
잡종 밀 종자를 생산하기 위하여, 웅성 교배친이 외부에서 적용되는 적당한 전독소의 존재하에서 자성 불임이 되도록 조작하고, 자성 교배친이 동일한 전독소의 존재하에서 웅성 불임이 되도록 조작한다. 유전자이식된 교배친 계 모두가 동형접합성으로 만들어지며, 당업계의 표준적인 방법에 의해 종자가 증식된다. 잡종 종자 생산을 위해, 조작된 웅성 및 자성 교배친의 동형접합성 종자를, 효율적인 수분이 보장되도록 정해진 웅성 대 자성의 비로 사이심기를 한다. 식물 성장 도중 적당한 시기에, 전독소를 경작지에 적용한다. 종자가 성숙한 후, 전체 경작지를 수확하여, 잡종 종자만을 수득한다.
하기 실시예는 본 발명을 수행하는데 사용된 재료와 방법 및 그에 따른 결과를 추가로 기술하며, 이들의 상세한 설명은 청구된 본원 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 않된다
실시예 1: 자성 불임에 대해 조건적인 담배 식물
△S13 프로모터(CaMV 35S 프로모터의 -46번 내지 +8번에 융합된 SLG13 프로모터의 -339번 내지 -79번; Dzelkalns et al. Plant Cell 5: 855-863(1993))을 함유하는 플라스미드 pSH58을 작제하고, 정확한 해독 판독 프레임으로 argE 유전자(서열 3)에 융합시킨다. △S13 프로모터는 자성-선택적 프로모터이다.
argE 유전자는 프라이머 5'-TATCTAGACCAGAGGTGTGTCAACAAATGAA-3'(서열 5) 및 프라이머 5'-CGTCTAGATTGCGGCACTGGAGTTTC-3'(서열 6)을 사용하는 PCR 반응으로 이.콜리(E. coli) 게놈성 DNA로부터 수득된다. 수득된 단편을 pGEM-TA(Strategene)내로 클로닝시키고, 정확한 서열을 확인한다. 일련의 PCR 및 서브클로닝 단계를 사용하여, 식물 해독 콘센서스(consensus) 서열 및 BamHI 부위를 argE 해독 개시 부위의 상부에 PCR 프라이머 5'-CGCGGATCCTAAACAATGAAAAACAAATTACCGCC-3'(서열 7) 및 GCGCCTAGGCGCTTAATGCCAGCAAAAATCC-3'(서열 8)을 사용하여 위치시킨다. 이어서, 이 생성물을 플라스미드 pSH15내의 △S13(블루스크립트 sk내의 △S13 프로모터)의 하부에서 융합하고, nos 전사 터미네이터를 β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자에 3' 방향으로 부가한다. 이어서, 이 △S13-argE-nos 카셋트를 T-DNA 보더(border) 및 작용성 식물 선별 마커인 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 pCIB200내로 EcoR1 단편으로서 연결시킨다. 이 플라스미드를 pSH58로 명명한다.
적절한 제한 효소를 사용하여 정확한 해독 판독 프레임으로 argE 유전자(서열 3)을 Stig1-GUS내의 GUS 유전자[참조: Goldman et al., EMBO J. 13: 2976-2984(1994)]로 대체하는 것을 제외하고는 상기 pSH58과 유사한 방식으로 플라스미드 pFA100을 작제한다. 이어서, STIG1-argE 융합체를 DNA 보더, 3' 종결 서열 및 작용성 식물 선별 마커(예: 카나마이신 내성 유전자)를 함유하는 pCIB200과 같은 벡터내로 연결시킨다. Stig1 프로모터는 자성-선택적 프로모터이다.
담배 잎 디스크를 pSH58을 사용하여 문헌[참조: Horsch et al., Science 227: 1229-1231(1985)]에 기술된 바와 같이 형질전환시킨다. 통합된 전이유전자(transgene)의 존재를 PCR로 확인한다. 자성 조직으로부터 수득한 RNA의 노던 분석을 이용하여 유전자이식된 식물에서 argE 유전자의 조직-특이적 발현을 확인한다. 이들 식물은 자가-수정하며, 조건적 자성 불임의 표현형을 갖는다. T1 종자는 자화-수분후에 수집한다. 또한, pFA100내의 자성 조건적 전이유전자를 유사한 공정을 사용하여 담배내로 도입한다.
실시예 2: 웅성 불임에 대해 조건적인 담배 식물
플라스미드 pSH60을 argE 유전자에 융합된 TA29 프로모터[참조: Kriete et al., Plant J. 9:809-818(1996)]를 사용하여 작제한다. TA29 프로모터를 프라이머 5'-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3'(서열 9) 및 5'-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAA AAAC-3'(서열 10)을 사용하여 담배로부터 클로닝한다. 일련의 서브클로닝 단계에 의해, TA29 단편을 실시예 1에 기술된 바와 같이 식물 콘센서스 해독 서열을 함유하는 argE의 상부에 융합시키고, nos 전사 터미네이터를 3' 방향으로 argE 유전자에 부가한다. TA29-argE-nos 카셋트를 식물 선별인 마커 하이그로마이신을 함유하는 플라스미드 pSGCGF1내의 T-DNA 보더 사이에 클로닝한다. 수득된 플라스미드를 pSH60으로 명명한다.
담배 잎 디스크를 문헌[참조: Horsch et al., Science 227:1229-1231(1985)]에 기술된 바와 같이 pSH60을 사용하여 형질전환한다. 통합된 전이유전자의 존재를 PCR로 확인한다. 자성 조직으로부터 수득한 RNA의 노던 분석을 사용하여 유전자이식된 식물에서 argE 유전자의 조직-특이적 발현을 확인한다. 이들 식물은 자가-수정하며, 조건적 웅성 불임의 표현형을 갖는다. T1 종자는 자화-수분후에 수집한다.
또한, 담배 잎 디스크를 문헌[참조: Horsch et al., Science 227:1229-1231(1985)]에 기술된 바와 같이 TA29 프로모터[참조: Kriete et al., Plant J. 9:809-818(1996)]의 조절하에 argE 유전자의 발현 카셋트를 함유하는 pGK73으로 형질전환시킨다. 통합된 전이유전자의 존재를 PCR로 확인한다. 약으로부터 수득한 RNA의 노던 분석을 사용하여 유전자이식된 식물에서 argE 유전자의 조직-특이적 발현을 확인한다. 이들 식물은 자가-수정하며, 조건적 웅성 불임의 표현형을 갖는다. T1 세대의 종자는 자화-수분후에 수집한다.
실시예 3: 형질전환된 담배 식물의 화학적 처리는 조직-특이적 불임을 제공한다
조건적 자성 불임 식물(pFA100으로 형질전환됨) 및 조건적 웅성 불임 식물(pGK73으로 형질전환됨) 모두로 부터 수득한 T1 세대의 종자를 토양에 심는다. 묘종이 충분한 크기로 성장하면, 잎 조직을 PCR로 argE 전이유전자의 존재에 대해 분석한다. PCR 포지티브 식물을 온실로 이식한다. 이들 식물은 외부에서 적용된 전독소의 부재하에서는 완전히 불임성이다. 조건적 자성 불임 식물의 서브셋트 및 조건적 웅성 불임 식물의 서브셋트를 성장기 동안 전독소 아세틸-PPT로 처리한다. 전독소의 독소로의 선택적 전환 결과로서, 처리된 조건적 자성 불임 식물은 웅성 불임으로 되고, 조건적 자성 불임 식물은 자성 불임으로 된다. 미처리된 식물은 완전히 가임성을 유지한다. 처리된 자성 불임 식물의 화분을 수집하고, 이를 사용하여 자성 교배친 식물인 처리된 웅성 불임 식물의 암술에 수분시킨다. 수정이 이루어져, 잡종 종자가 웅성 불임 식물에서 생성된다.
실시예 4: 옥수수의 자성 생식 조직에서 선택적으로 발현되는 신규 유전자의 DNA 클론의 수득
먼저 수염(silk) 특이적 cDNA 단편을 Clontech PCR-선별 cDNA 공제 키트(Clontech cat. #K1804-1)를 사용하여 동정한다. 폴리 A mRNA를 폴리(A) Quick mRNA 분리 키트(Stratagene cat. #200348)에 요약된 공정에 따라 옥수수 근치교배계 CG00526의 성장중인 옥수수 수염, 전체 수술, 잎, 및 뿌리 조직으로부터 분리한다. cDNA를 각 조직의 폴리A mRNA로부터 합성하고, 이 경우에 수염 cDNA에 의해 대표되는 "테스터(tester) cDNA", 및 동일한 양의 수술, 잎 및 뿌리 cDNA로 이루어진 "드라이버(driver) cDNA"로 분류된다. cDNA 공제 및 PCR 증폭을 사용자 매뉴얼에 기술된 바와 같이 수행한다. PCR 산물을 TA-클로닝 벡터인 pCRII(Invitrogen cat. #K2000-01)내로 서브클로닝한다. 각각의 서브클론을 옥수수 수염, 수술, 잎 및 뿌리 조직으로부터의 전체 mRNA 5㎍을 사용하여 노던 블롯으로 조직 특이성에 대해 스크리닝한다. 길이가 145bp인 클론 B200i는 수염 특이적 발현을 나타낸다. B200i 수염 특이적 cDNA 단편을 이용하여 성장중인 수염 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 수염 cDNA 라이브러리를, Stratagene Zap cDNA Gigapack II 골드 클로닝 키트(Stratagene cat. #200402)에 상세히 기술된 공정에 따라 18cm 길이의 수(ear)에서 취한 수염으로부터 분리한 폴리A mRNA를 사용하여 작제한다. B200i 프로브와 하이브리드화하는 클론을 선별하여 서열 분석한다. 크기가 772bp인 클론은 B200i 프로브 서열을 함유한다. 이 클론 B200i4-2를 옥수수 수염, 수술, 잎 및 뿌리 조직으로부터의 폴리A mRNA 1㎍을 함유하는 노던 블롯상의 프로브로서 사용한다. 발현은 수염에서만 검출된다. cDNA 클론 B200i4-2의 서열은 서열 1에 기재되어 있다.
상응하는 게놈성 영역을 분리하기 위해, B200i4-2 cDNA를 프로브로서 사용하여 Mo17 옥수수 게놈성 라이브러리(Stratagene)을 스크리닝한다. B200i4-2 프로브에 강력하게 하이브리드화하는 람다 클론을 분리한다. 서던 블롯 및 제한 맵핑을 사용하여 5' 및 3' 영역을 갖는 각각의 cDNA 서열을 함유하는 게놈성 단편을 동정한다. 약 6.5Kb Bam HI 단편을 포지티브 람다 클론중의 하나로부터 분리하고, Bluescript SK+(Stratagene)내로 서브클로닝하여, sPH64로 명명한다.
5' 및 3' 조절 영역을 함유하는 게놈성 B200i4-2 클론인 pSH64를 서열 분석에 의해 분석한다. 또한, 컴퓨터-스캐닝을 사용하여 추정된 프로모터 요소를 동정한다. 게놈성 클론 pSH64내에 포함된 자성-선택적 유전자의 5' 및 3' 조절 영역의 서열은 서열 11에 기재되어 있다. pSH64 클론은 부다페스트 조약하에 1998년 2월 27일자로 애그리컬쳐럴 리써치 서비스(Agricultural Research Service)(Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A.)에 기탁되었고, 수탁 번호 NRRL B-21920가 부여되었다. 자성 생식 조직에서 선택적 방식으로 발현되는 키메라 유전자를 다음과 같이 작제한다. B200i의 431bp 5' 조절 영역을 프라이머 5'-AAAACTGCAGGAATTCACTGCTGAGGGAGCGA-3'(서열 12) 및 5'-GCGGGATCCTTCTTGCTGTAGTCCTCGACCACG-3'(서열 13)을 사용하여 PCR에 의해 pSH64로부터 증폭시키고, 이를 nos 종결 서열에 융합된 GUS를 함유하는 pSOG10내로 PstI-BamHI 단편으로서 클로닝시킨다. 이어서, B200i-GUS-nos 카셋트를, EcoRI로 분해된 pSH64내로 EcoRI 단편으로서 서브클로닝시키면, 전체 길이의 B200i 조절 영역(서열 11의 뉴클레오타이드 1번 내지 3790번)의 하부에 GUS-nos가 효과적으로 위치된다. 이 플라스미드를 pSH70으로 명명한다.
상술된 바와 같은 pSH70로부터의 B200i 조절 영역을 BS-KS(Stratagene)내로 BglII-BamHI 단편으로서 클로닝시키고, pSH64로부터의 B200i의 3' 조절 영역을 EcoRV 단편(서열 11의 뉴클레오타이드 4427번 내지 6397번)으로서 하부에 부가한다. 이 플라스미드를 pSH73으로 명명한다. 플라스미드 pSH74를, pSH73을 BamHI으로 부분 분해시키고, argE(실시예 1로부터 수득)를 함유하는 DNA 단편내 BamHI 부위에 연결시켜 작제함으로써 B200i의 5' 및 3' 조절 영역 사이에 argE가 효과적으로 위치된다.
실시예 5: 밀의 자성 생식 조직에서 선택적으로 발현되는 신규 유전자의 cDNA 클론의 수득
암술 특이적 cDNA 단편을, 키트 프로토콜에 기술된 바와 같은 Genhunter mRNA 차별적 디스플레이 방법(Genhunter cat. #M502)을 사용하여 UC703 밀로부터 분리한다. 암술 특이적 cDNA 단편을 동정하는데 사용된 프라이머는 AP-18 및 T12 CA이다. 이 단편을 pGEM-TA 클로닝 벡터(Promega cat. #A362A)내로 서브클로닝시키고, 이를 P26으로 명명한다. P26 클론을 밀 암술, 약, 잎 및 뿌리 조직으로부터의 전체 mRNA 5㎍를 함유하는 노던 블롯상의 프로브로서 사용하여, 조직 특이성을 확인한다. 밀 암술 cDNA 라이브러리를, Stratagene Zap cDNA GigaPack II Gold 클로닝 키트(Stratagene cat. #200402)에 요약된 공정에 따라 UC703 밀로부터 분리된 암술을 사용하여 작제한다. P26 프로브와 하이브리드화하는 클론을 선별하여 서열 분석한다. 하나의 클론인 P26-A4는 길이가 881bp이고, 203bp의 P26 서열을 함유한다. 약, 잎 및 뿌리 뿐만 아니라 암술의 4가지 성장기, 즉 A) 수잉기, B) 발아기, C) 성숙기 및 D) 수정기로부터의 전체 mRNA 5㎍을 함유하는 노던 블롯은 881bp의 P26-A4 프로브와 하이브리화된다. 현저한 암술 발현이 암술에서 검출되었고, 뿌리에서는 매우 미약한 발현이 검출되었다.
또한, 제2 암술 특이적 cDNA 단편을 상술된 것과 유사한 공정을 사용하여 UC703 밀로부터 분리한다. 이 단편을 pGEM-TA 클로닝 벡터(Promega cat. #A362A)내로 서브클로닝시키고, P19로 명명한다. P19 클론을 밀 암술, 약, 잎 및 뿌리 조직으로부터의 전체 mRNA 5㎍을 함유하는 노던 블롯상의 프로브로서 사용하여, 조직 특이성을 확인한다. 밀 암술 cDNA 라이브러리를 상술한 바와 같이 작제한다. P19 프로브와 하이브리드화하는 클론을 선별하여 서열 분석한다. 하나의 클론인 P19-QA는 길이가 649bp이고, P19 서열을 함유한다. 약, 잎 및 뿌리 뿐만 아니라 암술의 4가지 성장기, 즉 A) 수잉기, B) 발아기, C) 성숙기 및 D) 수정기로부터의 전체 mRNA 5㎍을 함유하는 노던 블롯은 649bp P19-QA 프로브와 하이브리화된다. 발현은 암술에 대해 선택적인 것으로 입증되었다.
실시예 6: 밀의 자성 생식 조직에서 선택적으로 발현되는 신규 유전자의 게놈성 클론의 수득 및 프로모터 영역의 확인
상응하는 게놈성 영역을 분리하기 위해, P26-A4 cDNA를 프로브로서 사용하여 2주 생의 묘종으로부터 수득된 통상의 UC703 밀 게놈성 라이브러리를 스크리닝한다. 이 라이브러리는 전체 게놈성 DNA를 MboI으로 부분 분해한 후, BamHI-분해된 람다 EMBL3 DNA(Clontech Cat. #CS1013j)를 포함하는 8 내지 22kb 크기의 분획과 연결시킴으로써 작제된다. P26-A4 프로브에 강력하게 하이브리드화하는 람다 클론을 분리한다. 서던 분석 및 제한 맵핑을 사용하여, 5' 및 3' 영역을 지닌 각각의 cDNA 서열을 함유하는 게놈성 단편을 동정한다. 5.5kb XbaI 단편을 포지티브 람다 클론중의 하나로부터 분리하고, Bluescript SK+(Stratagene)내로 서브클로닝한다. 이를 pCIB10302로 명명한다. P26-A4 클론은 부다페스트 조약하에 1997년 1월 21일자로 애그리컬쳐럴 리써치 서비스(Agricultural Research Service)(Patent Culture Collection(NRRL); Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A.)에 기탁되었고, 수탁 번호 NRRL B-21655를 부여받았다.
5' 조절 영역을 포함하는 게놈성 P26-A4 클론인 pCIB10302를 서열 분석에 의해 분석한다. 또한, 컴퓨터-스캐닝을 사용하여 추정된 프로모터 요소를 동정한다. 추가로, 5' 영역을 엔도뉴클레아제 제한 효소로 맵핑하고, 전사 개시 부위를 RACE PCR 및 RNAse 보호 방법으로 측정한다. 게놈성 클론 P26-A4에 포함된 자성-선택적 유전자의 5' 조절 영역의 서열은 서열 2에 기재되어 있다.
상응하는 게놈성 영역을 분리하기 위해, P19 cDNA를 프로브로서 사용하여 실시예 6에 기술된 바와 같이 2주생의 묘종으로부터 수득된 통상의 UC703 밀 게놈성 라이브러리를 스크리닝한다. P19 프로브에 강력하게 하이브리드화하는 람다 클론을 분리한다. 서던 분석 및 제한 맵핑을 사용하여 5' 및 3' 영역을 지닌 각각의 cDNA 서열을 함유하는 게놈성 단편을 동정한다. 약 8Kb XhoI 단편을 포지티브 람다 클론중의 하나로부터 분리하고, Bluescript SK+(Stratagene)내로 서브클로닝하여, 이를 X2-1로서 명명한다.
5' 및 3' 조절 영역을 함유하는 게놈성 P19 클론을 서열 분석에 의해 분석한다. 컴퓨터-스캐닝을 사용하여 추정된 프로모터 요소를 동정한다. 추가로, 엔도뉴클레아제 제한 효소로 5' 및 3' 영역을 맵핑한다. 게놈성 클론 X2-1내에 포함된 자성-선택적 유전자의 5' 조절 영역의 서열은 서열 14에 기재되어 있다. X2-1 클론은 부다페스트 조약하에 1998년 2월 27일자로 애그리컬쳐럴 리써치 서비스(Agricultural Research Service)(Patent Culture Collection(NRRL); Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A.)에 기탁되었고, 수탁 번호 NRRL B-21919를 부여받았다.
실시예 7: 자성 생식 조직에서 선택적 방식으로 발현되는 키메라 유전자의 작제
플라스미드 pFA200은 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 하기 성분: 1) 상술된 바와 같은 P26 조절 영역(뉴클레오타이드 1번 내지 3987번), 2) argE의 개방형 판독 프레임의 ATG를 해독 개시 부위(뉴클레오타이드 3987번에 있는 ATG)와 동일 프레임으로 융합하기 위해 적절한 제한 부위로 유전자 조작함으로써 P26의 상부 조절 영역이 argE와 융합된 argE 유전자를 함유하는 DNA 단편, 및 3) 식물에서 작용성인 3' 종결 서열을 함유하는 벡터를, 당업계에서 공지된 표준 방법을 사용하여 작동적으로 연결시켜 작제한다. P26 프로모터의 조절하에 argE가 발현되는 경우 식물의 자성 생식 조직에서 argE 유전자 산물이 선택적으로 발현될 것이다.
Pst I으로 절단한 P19 5' 조절 영역(서열 14의 뉴클레오타이드 1번 내지 1093번), X2-1 플라스미드에서 P19 서열의 바로 위상부에서 발견되는 제한 효소 부위 및 P19의 ATG에 있는 NcoI(서열 14의 뉴클레오타이드 1088번)를 PstI 및 NcoI으로 절단된 pSOG15(pSOG15는 GUS 유전자 및 nos 터미네이터를 포함하며, GUS 유전자의 5'에 PstI 부위 및 GUS 유전자의 ATG에 Nco I이 존재한다)에 연결시킨다. 이 플라스미드를 pXB1로서 명명한다.
플라스미드 p19arg는 하기 성분: 즉 1) 상술된 바와 같은 P19 조절 영역, 2) argE의 개방형 판독 프레임의 ATG를 P19 단편의 해독 개시 부위(서열 14의 1090번에 있는 ATG)와 동일 프레임으로 융합하기 위해 적절한 제한 부위로 유전자 조작함으로써 P19의 상부 조절 영역이 argE와 융합된 argE 유전자를 함유하는 DNA 단편 및, 3) 식물에서 작용성인 3' 종결 서열을 함유하는 벡터를, 당업계에서 공지된 표준 방법을 사용하여 작동적으로 연결시켜 작제한다. P19 프로모터의 조절하에 argE가 발현되는 경우 식물의 자성 생식 조직에서 argE 유전자 산물이 선택적으로 발현될 것이다.
자성 생식 조직에서 유전자의 일시적 발현은 온전한 조직으로의 전달에 의해 측정된다. 밀의 꽃 조직(암술 및 약)을 15% 말토즈를 함유하는 무라시게 및 스쿠그(Murashige and Skoog) 배지상에 플레이팅한다. pXB1 또는 pSH70의 DNA를 표준 공정을 사용하여 ㎛ 크기의 금 입자상에 침전시킨다. 표적당 20개의 암술 및 약을 갖는 2개의 표적 플레이트에 1100psi의 파열압을 사용하여 DuPont BiolisticsR 헬륨 장치로 2 또는 3회 슈팅(shooting)한다. 이 플레이트에 캐리어 스테이지와 표적 사이에 위치한 80메쉬 스크린을 이용하여 슈팅한다. 표적물을 피폭후에 16시간 동안 26℃의 암실에 방치한 후, 조직을 2 내지 24시간 동안 37℃에서 GUS 발생 혼합물(0.05M 인산나트륨 200ml(pH 7) 중의 X-gluc 100mg)로 옮긴다. pXB1 및 pSH70내의 GUS 유전자는 암술에서 GUS 활성을 나타낸다. 옥수수 수염 조직내로의 pSH70의 일시적 형질전환 검정물을 통해, 자성 조직에서 GUS가 발현됨이 입증된다.
실시예 8: 자성-선택적 방식으로 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 단백질을 암호화하는 키메라 유전자를 사용한 밀의 형질전환
유전자형 UC703의 미성숙 배(길이 0.75 내지 1.0mm)를 3mg/l의 2,4-D 및 3% 수크로즈를 함유하는 무라시게 및 스쿠그 배지에 플레이팅한다. 약 4시간 후, 동일한 성분을 함유하는 아가로즈의 여과지-지지된 슬랩(slab)을 덮은, 15% 말토즈, 3% 수크로즈 및 3mg/l의 2,4-D를 포함하는 무라시게 및 스쿠그 배지를 함유하는 플레이트상에 배를 배 축면부 아래로 플레이팅한다. 배를 2 내지 3시간 동안 원형질분리한 후 피폭시킨다.
pFA200 및 pSOG35의 DNA를 표준 공정을 사용하여 ㎛ 크기의 금 입자상에 침전시킨다. 표적당 20개의 배를 함유하는 4개의 표적 플레이트에 1100psi의 파열압을 사용하여 DuPont BiolisticsR 헬륨 장치로 2회 슈팅한다. 이 플레이트에 캐리어 스테이지 및 표적 사이에 위치한 80메쉬 스크린을 이용하여 슈팅한다. 표적물을 피폭후에 24시간 동안 26℃에서 암실에 방치한 후, 배를 함유하는 슬랩을, 3mg/l의 2,4-D 및 3% 수크로즈를 포함하는 무라시게 및 스쿠그 배지를 함유하는 플레이트상에 놓는다. 각각의 배를 슬랩으로부터 제거하고, 추가로 48시간 후 동일한 조성의 신선한 배지상에 직접 위치시킨다.
유전자 전달후 약 6주 경과하여, 반응하는 조직을 3주 동안 0.2mg/l의 메토트렉세이트와 함께 3mg/l의 2,4-D 및 3% 수크로즈를 함유하는 무라시게 및 스쿠그 배지상에 위치시킨다. 이어서, 조직을 1mg/l의 제아틴 리보사이드 및 1mg/l의 메토트렉세이트를 포함하는 무라시게 및 스쿠그 배지로 이루어진 재생 배지상에 위치시킨다. 2주 후, 재생하는 묘종을 ½ 농도의 무라시게 및 스쿠그 염, 2% 수크로즈, 1mg/l의 NAA 및 4 또는 8mg/l의 메토트렉세이트를 함유하는 멸균 용기(일명 GA7이라 불리운다)에 넣는다.
또다른 예에 있어서, 유전자형 UC703의 미성숙 배(길이 0.75 내지 1.0mm)를 상술한 바와 같이 처리하는데, 단 2mg/l의 2,4-D를 함유하는 무라시게 및 스쿠그 배지가 사용된다. 약 4시간 후, 동일한 성분을 함유하는 아가로즈의 여과지-지지된 슬랩을 덮은, 15% 말토즈, 3% 수크로즈 및 2mg/l의 2,4-D을 포함하는 무라시게 및 스쿠그 배지를 함유하는 플레이트상에 배를 배 축면부 아래로 플레이팅한다. 배를 2 내지 3시간 동안 원형질분리한 후 피폭시킨다.
하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 작동적으로 연결된 옥수수 우비퀴틴 프로모터를 함유하는 pUbi-Hyg와 함께 pFA200, pSH74 또는 p19arg의 DNA를 표준 공정을 사용하여 ㎛ 크기의 금 입자상에 침전시킨다. 표적당 20개의 배를 함유하는 4개의 표적 플레이트에 1100psi의 파열압을 사용하여 DuPont BiolisticsR 헬륨 장치로 2회 슈팅한다. 이 플레이트에 캐리어 스테이지 및 표적 사이에 위치한 80메쉬 스크린을 이용하여 슈팅한다. 표적을 피폭후 24시간 동안 26℃의 암실에 방치한 후, 배를 함유하는 슬랩을 2mg/l의 2,4-D 및 3% 수크로즈를 포함하는 무라시게 및 스쿠그 배지를 함유하는 플레이트상에 놓는다.
유전자 전달후 약 3주 경과하여, 반응하는 조직을 3mg/l의 2,4-D 및 3% 수크로즈를 함유하는 무라시게 및 스쿠그 배지상에 위치시킨다. 이어서, 조직을 3% 수크로즈, 5mg/l의 GA3, 1mg/l의 NAA 및 20mg/l의 하이그로마이신을 포함하는 무라시게 및 스쿠그 배지로 이루어진 재생 배지상에 위치시킨다. 2주 후, 재생하는 조직을 3% 수크로즈와 20mg/l의 하이그로마이신을 포함하는 무라시게 및 스쿠그 배지로 이루어진 배지로 옮긴다. 2주 후, 재생하는 묘종을 ½ 농도의 무라시게 및 스쿠그 염, 2% 수크로즈, 1mg/l의 NAA 및 20mg/l의 하이그로마이신을 포함하는 멸균 용기(일명 "GA7"이라 불리운다)에 넣는다.
DNA를 형질전환으로부터 유도된 식물의 잎 조직으로부터 추출하고, PCR을 dhfr 또는 hyg 선별 유전자, 및 argE 유전자의 존재하에 수행한다. PCR 포지티브 식물을 온실로 옮겨 번식시킨다. 개화하는 동안, 각각의 유전자이식된 식물로부터 암술을 수집하고, 이 조직으로부터 RNA를 수득한다. argE의 발현을 노던 블롯으로 확인한다. 식물을 자가-수정시켜, 종자를 수집한다.
실시예 9: 웅성 생식 조직에서 선택적인 방식으로 발현되는 키메라 유전자의 작제
플라스미드 pGK73을 출발점으로서 사용한다. TA29-argE-3' 종결 서열을 아그로박테리움 형질전환 벡터로부터 카셋트로서 제거하고, 적절한 제한 효소를 사용하여 pBluescript KS+내로 연결시킨다. 수득된 플라스미드를 pMA200으로 명명한다.
약 특이적 프로모터인 B6을, pSGB6g1로부터의 EcoRI-NheI 단편으로서 서브클로닝된 3kb 게놈성 클론을 함유하는 플라스미드 pSGBNE1으로부터 작제한다[참조: 미국 특허 제5,470,359호]. 1558bp ApaI I/XbaI 단편을 Sma I 부위에서 Bluescript(KS)내로 평활 클로닝한다. areE 유전자와의 해독 융합물을 실시예 2에 이미 기술된 바와 같이 작제한다. 수득된 플라스미드를 pSH68로 명명한다.
화분 특이적 프로모터 Zmg, 즉 Zmg13의 1kb HindIII-PpuMI 단편[참조: Hamilton et al. Sexual Plant Reproduction 2, 208-212(1989)]을 HindIII-SmaI 단편으로서 bluescript내의 pCIB391로부터 클로닝한다. nos 전사 종결 영역을 BamHI-XbaI 단편으로서 부가한다. 이어서, BamHI 단편으로서의 argE에 대한 암호 서열(실시예 1로부터 수득)을 BamHI 부위에 연결시키면, Zmg 프로모터와 nos 종결 서열 사이에 argE가 효과적으로 위치된다. 이 플라스미드를 Zmgarg로 명명한다.
실시예 10: 웅성 선택적 방식으로 발현하는 키메라 유전자를 사용한 밀의 형질전환
하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 작동적으로 연결된 옥수수 우비퀴틴 프로모터를 함유하는 플라스미드 pUBi-Hyg, 및 pMA200 또는 pSH68 또는 pZmgarg를 실시예 8에 기술된 바와 같이 밀의 미성숙 배의 형질전환을 위한 재조합 서열로서 사용한다. 식물을 재생시키고, PCR을 사용하여 argE 전이유전자의 존재를 확인한다. 유전자이식된 식물을 온실로 옮긴다. 개화하는 동안, 약을 수집하고, 이 조직으로부터 RNA를 수득하며, argE 발현을 노던 블롯에 의해 확인한다. 식물은 자가-수정시켜, 종자를 수집한다.
실시예 11: 자성 선택적 방식으로 전독소의 독소로의 전환을 촉매화하는 단백질을 암호화하는 키메라 유전자를 사용한 옥수수의 형질전환
유형 I 캘러스를 표준 배양 기술을 사용하여 유전자형 CG00526의 미성숙 접합성 배로부터 수득한다. 유전자 전달을 위해, 소형 칼날로 절단하고 18% 수크로즈를 함유하는 표준 배양 배지로 3회 세척함으로써 약 300mg의 유형 I 캘러스를 수득한 후 이를, 즉시 18% 수크로즈를 함유하는 반고체 배양 배지에 다시 놓는다. 약 4시간 후, PDS-1000/He Biolistic 장치(제조원: BioRad)를 사용하여 조직을 피폭시킨다. pSOG35와 함께 하기 플라스미드: pFA200, pSH74 또는 p19arg중의 하나를 BioRad로부터의 표준 프로토콜을 사용하여 1㎛ 금 입자상에 침전시킨다. 유전자 전달후 약 16시간 경과하여, 캘러스를 2% 수크로즈와 2mg/L의 메토트렉세이트를 함유하는 표준 배양 배지로 옮긴다. 캘러스를 8주 동안 선별하면서 아배양하고, 이어서 생존하여 성장하는 캘러스를 식물 생산을 위해 표준 재생 배지로 옮긴다. 식물을 수득하고, 각 경우의 번호를 매긴다. 각 경우로부터의 식물을 argE 유전자의 존재에 대해 PCR로 분석하고, PCR 포지티브 식물을 온실로 옮긴다. 개화하는 동안, 수(ear)를 수집하고, RNA를 이 조직으로부터 수득하며, argE의 발현을 노던 블롯에 의해 확인한다.
다른 한편으로, 유전자이식된 옥수수 식물은 미성숙 배의 미세투사체 피폭에 의해 수득된다. 유전자형 CG00526의 수(ear)가 자화-수분되어, 미성숙 접합성 배가 약 10일 후에 수득된다. 약 840개의 미성숙 접합성 배는 배형성 캘러스의 형성을 유도 및 유지할 수 있는 배지를 함유하는 14개의 상이한 표적 플레이트중에서 나눈다. 미성숙 접합성 배를 12%의 수크로즈를 함유하는 동일한 배지로 즉시 옮긴다. 5시간 후, 미성숙 접합성 배를 BioRad사의 PDS-1000/He 장치를 사용하여 pSOG35와 함께 pFA200, pSH74 또는 p19arg로 피폭시킨다. 플라스미드를 상술된 바와 같이 실질적으로 BioRad사의 공개된 공정에 따라 1㎛의 금 입자상에 침전시킨다. 이 입자를 파열압 1550psi의 헬륨을 사용하여 전달한다. 각각의 표적 플레이트에 플라스미드 및 금 입자 제제를 2회 슈팅한다. 유전자를 전달하는 당일에 선별제인 메토트렉세이트 2mg/L를 적용하고, 약 1개월 까지 증가시킨다. 이렇게 수득된 배형성 캘러스는 선별제 메토트렉세이트의 존재하에 재생된다. 식물을 수득하고, 각 경우의 번호를 매긴다. 각 결과로부터의 식물을 argE 유전자의 존재에 대해 PCR로 분석하고, PCR 포지티브 식물을 온실로 옮긴다. 개화하는 동안, 수(ear)를 수집하고, 이 조직으로부터 RNA를 수득하며, argE의 발현을 노던 블롯에 의해 확인한다.
실시예 12: 웅성 선택적-특이적 방식으로 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 단백질을 암호화하는 키메라 유전자를 사용한 옥수수의 형질전환
플라스미드 pMA200, pSH68 또는 pZmgarg 및 pSOG35를 실시예 11에 기술된 바와 같이 옥수수 미성숙 배의 형질전환을 위한 재조합 서열로서 사용한다. 식물을 재생하고, PCR을 사용하여 argE 전이유전자의 존재를 확인한다. 유전자이식된 식물을 온실로 옮긴다. 개화하는 동안, 수술을 수집하고, 이 조직으로부터 RNA를 수득하며, argE 발현을 노던 블롯에 의해 확인한다. 식물을 자가 수정시켜, 종자를 수집한다.
실시예 13: 자성 선택적 방식으로 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 단백질을 암호화하는 보리의 형질전환
크기가 약 1.5 내지 2.5mm인 미성숙 배를 갖는 보리 스파이크(spike)(참조: Golden Promise)을 수확하고, 표면을 10분 동안 15%(v/v) 표백제(5.25% 나트륨 하이포클로라이트)로 멸균시키며, 멸균수로 5회 세정한다. 미성숙 배를 어린 영과로부터 절개해 내고, 수직으로 이등분한다. 이들을 30g/L의 말토즈, 1mg/L의 티아민-HCl, 0.25g/L의 마이오-이노시톨, 1g/L의 카세인 하이드롤리세이트, 0.69g/L의 프롤린, 2.5mg/L의 디캄바가 보충된 무라시게 및 스쿠그 염기성 염을 함유하는 캘러스 유도 배지[참조: Wan and Lemaux, Plant Physiology 104: 37-48(1994)]상에 플레이팅하고, 3.5g/L의 PhytagelR(Sigma)로 고형화시킨다.
배 피폭을 위해, 배를 암실에서 24 내지 28℃로 1 내지 3일 동안 배반면 상부에서 배양한다. 형질전환시키는 당일에 배를 페트리 디쉬(100×15mm)의 중심에 위치시켜 환을 형성한다. pUbi-hyg와 함께 플라스미드 pFA200, pSH74 또는 p19arg로부터의 DNA를 DuPont Biolistic Particle Delivery System 매뉴얼에 따라 0.6 또는 1.0㎛의 금 입자(Bio-Rad)상에 침전시킨다. 배의 각 플레이트에 1100psi의 파열압을 사용하여 DuPont PDS-1000 헬륨 건(gun)으로 1회 슈팅한다. 피폭 후, 배를 신선한 캘러스 유도 배지의 배반면 하부로 옮긴다. 피폭후 3일 내지 7일 경과하여, 배를 선별 배지(캘러스 유도 배지 + 10mg/L의 하이그로마이신)로 옮겨 약 14일 동안 방치한다. 유도된 캘러스를 작은 조각으로 분쇄하고, 별도로 유지한다. 후속적인 2차 배양시, 캘러스를 20mg/L의 하이그로마이신을 함유하는 신선한 선별 배지로 약 21 내지 28일마다 옮긴다. 2 내지 3번의 2차 배양 후, 생존하는 캘러스를 식물 재생을 위해 1 내지 3mg/L의 6-벤질-아미노푸린 및 10 내지 20mg/L의 하이그로마이신이 보충된 FHG 배지[참조: Hunter, Ph.D. thesis, Wye College, University of London, Ashform, Kent, 1988]로 옮긴다. 식물을 형광 조명하에 23 내지 25℃에서 재생시킨다. 발생한 녹색의 싹/묘종을 25×100mm 페트리 디쉬중의 무라시게 및 스쿠그 염기성 염-기제된, 호르몬 비함유 배지로 옮긴다. 식물이 2 내지 3cm의 크기에 도달하는 경우, 이들을 추가로 성장시키기 위해 Magenta GA7 용기로 옮긴다.
캘러스 피폭을 위해, 배를 암실에서 24 내지 28℃로 10일 이상 동안 배반면 하부에서 배양한다. 형질전환시키는 당일에 배양된 배로부터의 배형성 캘러스를 소형 조각으로 절단하고, 페트리 디쉬의 중심에 위치시킨다. DNA 전달 및 후속의 식물 재생 단계는 배 피폭에서 기술된 바와 동일하다.
식물을 전이유전자의 존재에 대해 PCR로 분석하고, 포지티브 식물을 온실로 옮긴다. 개화하는 동안, 암술을 수집하고, 이 조직으로부터 RNA를 수득한다. argE 유전자의 발현을 노던 분석에 의해 확인한다. 식물을 자가-수정시켜, 종자를 수확한다.
실시예 14: 웅성 선택적 방식으로 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 단백질을 암호화하는 키메라 유전자를 사용한 보리의 형질전환
플라스미드 pMA200, pSH68 또는 pZMgarg 및 pUbi-Hyg를 실시예 13에 기술된 바와 같은 보리 미성숙 배 및 캘러스의 형질전환을 위한 재조합 서열로서 사용한다. 식물을 재생시키고, PCR을 사용하여 argE 전이유전자의 존재를 확인한다. 유전자이식된 식물을 온실로 옮긴다. 개화하는 동안, 약을 수집하고, 이 조직으로부터 RNA를 수득하며, argE 발현을 노던 분석에 의해 확인한다. 식물을 자가-수정시켜, 종자를 수집한다.
실시예 15: 형질전환된 식물의 화학적 처리는 조건적 불임을 제공한다.
pFA200, pSH74 또는 p19arg(조건적 자성 불임을 제공함)으로 형질전환된 식물 및 pMA200, pSH68 또는 pZmgarg(조건적 웅성 불임을 제공함)으로 형질전환된 식물의 T1 세대의 종자를 토양에 심는다. 묘종이 충분한 크기로 성장하면, 잎 조직을 argE 전이유전자에 대해 PCR로 분석한다. PCR 포지티브 식물을 온실로 옮긴다. 이들 식물은 완전히 가임성이다. pFA200, pSH74 또는 p19arg를 함유하는 식물의 서브셋트 및 pMA200, pSH68 또는 pZmarg를 함유하는 서브셋트를 성장기 동안에 전독소 아세틸-PPT로 처리한다. pMA200, pSH68 또는 pZmgarg로 형질전환된 식물(동형접합체는 화분 프로모터 작제물 Zmgarg에 요구된다)은 웅성 생식 조직에서 아세틸-PPT의 PPT로의 전환 결과로서 웅성 불임이 된다. pFA200, pSH74 또는 p19arg로 형질전환된 식물은 자성 생식 조직에서 아세틸-PPT의 PPT로의 전환 결과로서 자성 불임이 된다. pFA200, pSH74 또는 p19arg, 및 pMA200, pSH68 또는 pZmgarg로 형질전환된 미처리 식물은 완전히 가임성이다.
실시예 16: 자성 생식 조직에서 전독소를 독소로 전환시키는 유전자이식된 식물을 사용한 밀의 잡종 종자 생산
pFA200, pSH74 또는 p19arg(조건적 자성 불임을 제공함) 및 pMA200, pSH68 또는 pZmgarg(조건적 웅성 불임을 제공함)으로 형질전환시킨 실시예 8 및 10의 유전자이식된 밀 식물을 각각의 전이유전자에 대한 식물계 동형접합체로서 육종하고, 종자를 표준 실습법으로 증식시킨다. pFA200, pSH74 또는 p19arg를 함유하는 식물, 및 pMA200, pSH68 또는 pZmgarg를 함유하는 식물로부터의 동형접합성 종자를 효율적인 화분 전달을 보장하기에 충분한 웅성 대 자성 교배친의 비율로 사이심기한다. 식물 성장중의 적절한 시기에, 전독소 아세틸-PPT를 포장에 적용한다. 종자가 성숙한 후, 전체 경작지를 수확하여 잡종 종자만을 수득한다.
본 명세서에 언급된 모든 공개공보 및 특허원은 본 발명과 관련되는 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 공개공보 및 특허원은 개개의 공개공보 또는 특허 원이 참조로서 인용된다는 것을 구체적 및 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 본원에서 참조로서 인용된다.
상기 본 발명은 이해를 명료히 하기 위해 설명 및 예시의 측면에서 상세하게 기술되었으나, 첨부된 청구의 범위내에서 특정한 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다.
<110> NOVARTIS AG <120> Method of hybrid seed production using conditional female sterili ty <130> 5-1998-060300-2 <150> PCT/US 60/039,527 <151> 1997-03-03 <160> 14 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 772 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Single, linear, desc="cDNA sequence for female-preferential transc ript designated B200i4-2" <400> 1 gtcctacgtg gtcgaggact acagcaagaa atgggggtct acaagtctgc agttctgctt 60 ggtgtggttt tggcctcagt ccttctcggc ttcctggacg ttgtgtacgc aagggagctc 120 actgaagcca atggctctgg agtgaagaat aatgtgaagc ctgcaggaga gcctgggctc 180 aaggatgaga agtggtttgg tggtggatac aagcatggtg gagggtatgg aaacaaccag 240 ccaggatacg gtggcggagg aaacagccaa cctggatacg gcggcggagg aaacagtcag 300 cccggatacg gtggaggata caagcgccat caccctggtg gcggctacgg gtctggacaa 360 ggagggcctg gatgtggatg tggaggaggg tatggaggtg gcaatggtag tcctgggtac 420 ggcgatgaca atggtggtgg cagtggcact ggtggcggaa atggcaatgc tggtgggtac 480 ggaggaggag gaggcggcgg ttatggaggc ggctacggca gtggtagtgg tacagcacca 540 ggaggcggat atcatggcgg tggtggtgca 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aaacgataag atggggtgtc tggggtaata tgaacgaaca atattccgca ttgcgtagta 1990 atgtcagtat gctcggcaaa gtgctgggag aaaccatcaa ggatgcgttg ggagaacaca 2050 ttcttgaacg cgtagaaact 2070 <210> 4 <211> 384 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> linear <400> 4 Met Lys Asn Lys Leu Pro Pro Phe Ile Glu Ile Tyr Arg Ala Leu Ile 1 5 10 15 Ala Thr Pro Ser Ile Ser Ala Thr Glu Glu Ala Leu Asp Gln Ser Asn 20 25 30 Ala Asp Leu Ile Thr Leu Leu Ala Asp Trp Phe Lys Asp Leu Gly Phe 35 40 45 Asn Val Glu Val Gln Pro Val Pro Gly Thr Arg Asn Lys Phe Asn Met 50 55 60 Leu Ala Ser Ile Gly Gln Gly Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Gly His 65 70 75 80 Thr Asp Thr Val Pro Phe Asp Asp Gly Arg Trp Thr Arg Asp Pro Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Glu His Asp Gly Lys Leu Tyr Gly Leu Gly Thr Ala Asp 100 105 110 Met Lys Gly Phe Phe Ala Phe Ile Leu Asp Ala Leu Arg Asp Val Asp 115 120 125 Val Thr Lys Leu Lys Lys Pro Leu Tyr Ile Leu Ala Thr Ala Asp Glu 130 135 140 Glu Thr Ser Met Ala Gly Ala Arg Tyr Phe Ala Glu Thr Thr Ala Leu 145 150 155 160 Arg Pro Asp 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<222> (1)..(3790) <223> Identification Method: Experimental, /function= "5' Regulatory Reg ion of B200i4-2", /evidence= Experimental <220> <221> misc_signal <222> (4427)..(6397) <223> Identification Method: Experimental, /function= "3' Regulatory Reg ion for B200i4-2", /evidence= Experimental <220> <221> misc_feature <222> (3789)..(3791) <223> function= "ATG translation start" <220> <221> misc_feature <222> (4402)..(4404) <223> function= "translation stop" <400> 11 ggatccttag atctttaggt gcacgttagt tactggaaat gtaaacacaa caggaatagg 60 tgaagcgaca atggacaaca catgacgact ctcaagtggt tacctcaaac agccaaagca 120 caattttcga tgcaagaact agatgcaaag agctactaac aaagcgactc ttgtagaatg 180 aactaggtac aatagaagta aaaaacatgg ccaaaatttg cggcatcctt ttgcaatgca 240 accaaacgct ttgtagtttg caacattgtt gaagtcattg aagatcattc aggagtacgc 300 atagctctgg cccacctagc tgtcaagcct agggtagcga aaaacaggtg ttaggtaaga 360 gtattcgtta ctaaggtgtt gtttggttca accacaaaag aggcaacact aattaggaat 420 agctgctcct ggtatctgtt atgatgcaat gatcatcggt ttttgtttgg ttgcaaccaa 480 tgtgagcagt gaaatagcgt ggcattgaat catagctaga tgggagcatt aatgattttt 540 cacaagcctg tatcagatgt cactgtgatc gattgcagcc tattgcaacc aaatttaaag 600 ttatgataac agataccgat gtaaactaat cacttcccta aatcgtcaaa ccaaacatta 660 cataaagttg ataggatcaa tgtaattaaa aagtacatgt cacggaatat ttatagaggg 720 ctcaccttat tccatataca aagtcaaaaa taccacttaa ctttttttac aattattcat 780 ttatataagg ataatccggt aattttatct tacatatata ttccatactt cttttgggca 840 cacaatcttc atcagaggct ttgcttcctg tgaagtgaac caatctatct tctttcgctt 900 ctaactttgt ttcacgcctc gcaaagtgaa ccgatttgcc tccgttcatt tctgacttca 960 cttcacattc tacaaagtga acgagtctgt ctccatttac ttctaactta gctttacttt 1020 ctgcaaagtg aaccgatctt tcgtcgttca cttttggttt tacttcatgt tctataaagt 1080 gcactaatgc gtctttgttc acttcttgct tgcttctaat gaagatgatc ctaaaaataa 1140 atatcaaata aatacaaaaa tagttgttaa tcaactttcg aaacgtaagg gattgcattt 1200 gtccgaggcc aaatccctaa caacaacccc tagtgggcaa aagcctcctc tgaaggtacg 1260 aatcctttga aattatgatt tggaccagag gtaaaatgtt 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caaagcccta aaccttggcc 2160 cctactcggg cgccggctaa tcagtcatac acatcgattt accggctttg gggagtggct 2220 aatcggtaat cctggcagat atatcatttt atttcttttt tttgtatttt tttaaacttc 2280 catattttta gtttgaaatc cgttgcgtat tttgaaattt ggtttcagca gaaagtcttc 2340 aaataatcca tagtatttat acaaaaattg gcatcaaaag tttttagaat ttacaaaatt 2400 caaattcaaa accggtgata cggtggagcc gtccgccatc gataacaggc tagccggatt 2460 tatcaatcgg cttcgtgacc attgatcgga gctcgctcgc atgcaggaag taaatacaat 2520 gcatggatca caaactaaac tatgtgccaa gactcaacat gtgtaacatc attcttgttg 2580 agcatatgat aatttacttg tcataacaaa ataaagaata gagcaaaatc cactttggtc 2640 ctctttggca tggctcttta ggcggctcca gctcagactc attatgaagc cctatcaaat 2700 agtaaaaaaa cggctccttg tccagagccc tccaagagct atagccgttt tattgttggg 2760 acccaaagca caaaaaacgt agcttctact ggctcctaca tttttctcat acgtcattcc 2820 aaaagaaata cataataagt tgttttgcca aacaaattgc aaaatggctc cggctccgct 2880 agagaagcta aggagataaa agaaacagag ccgaaactgt tttcagagga gccagagccc 2940 tgctaagggc ttgttcggtt ataccaatcc agaaggggat tggaggagat taaatgacta 3000 ggaggggatt taatcccctc caatctcctt ctgaattggt ataaccgaac atgccctaaa 3060 ggaggccttt gtatgcttca tcttagagag gaatcgaata aaagtcgtgt gctacttgtt 3120 ttcgccgtta attcctcgtg gctagcttgt gccattgcat ccattgatcc atagtggtgg 3180 taaattaaca tgctacatct tttattgtgt catcctgtgg tcaccagtgg tctgagagaa 3240 gtggaattta ttgtgccagc atagttaaaa gacctgttat tcgactacac tagcaatatg 3300 tactactgta ggggtactat atttcacata agtaggcagt ctaattctag ctcttattct 3360 aaacgtcatt gaattcactg ctgagggagc gatgggcaac aatgaattgt catgctcgct 3420 ttcaacaaca catgtagctc ctctggtagt agattacgag agtgtttggt ttatagagac 3480 taatttttaa tttatctatt ttattttaat aatttagaga ctaaaataga ataaaatgga 3540 ggaacaaacc aaacaccctt taaatgcccg atcggctcca attttttgga tagtagtact 3600 ccagtaataa cagttatgct gggtgcctgg gttgccaacc gctcatcagt gcacttattt 3660 ttggtatagc catggaagct tgtacagctt gcagccatgc tttcccggct tctctataaa 3720 atgcaggcac tgcatttcca tattctcaac ggccccaagg gtccacgtag tcgaggacta 3780 cagcaagaaa tgggggtcaa caagtctgca gttctgcttg gtgtggtttt ggtctcagtc 3840 cttctcttcc tggacgttgt gtacgcaagg gagctcactg aagccaatgg ttgctaatcc 3900 gtctctctcc ctgctttgtg tgttctgcac tactgttaac attagtgcat gaattaacta 3960 gaaccatttt aaagaaggta tatctttttg tgcttcattc tttcttcatg caggctctgg 4020 agtgaagaat aatgtgaagc ctgcaggaga gcctgggctc aaggatgaga agtggtttgg 4080 tggtggatac aagcatggtg gagggtatgg aaacaaccag ccaggatacg gtggcggagg 4140 aaacagccaa cctggatacg gcggcggagg aaacagtcag cccggatacg gtggaggata 4200 caagcgccat caccctggtg gcggctacgg gtctggacaa ggagggcctg gatgtggatg 4260 tggaggaggg tatggaggtg gcaatggtag tcctgggtac ggcgatgaca atggtggtgg 4320 cattggcact ggtggcggaa atggcaatgc tggtgggtac ggaggaggag gcggcggtta 4380 tggaggcggc tacggcagtg gtagtggtac agcaccagga ggcggatatc atggcggtgg 4440 tggtgcacaa cgctacgctg ggcagaacta gcaagaacaa ccccttatgc tagtttatgt 4500 taaataaacg atccattgtt catgtgactg agcaatttaa gcagtgaagg atcttgactc 4560 gtgttatttg tgttaccata tgtattgatt gttttatgtt taagatgaat gtacaccgct 4620 atttgtatgt cgaactcgtt gcatggagat gaaaaaaaaa ggcacaaaaa catcagcaaa 4680 ccatgctttc cttccggtcg accagatttg ggctgatatt tattgagtaa aaaaaattct 4740 atctctggga gattgtttca agtaaaagct agagcgtgac attttgtagc ggaaaattgg 4800 aacgaaaaca tgtccaacgt cgaaattatt gtatatattc taatggatat atataacgta 4860 atcagaagga aaattgtttc caagtcattt tttcacaatg caacagtcaa acatggatgc 4920 ggcgagcgaa ggatgcaggt gggttcccct gccgctccaa atcctataga gccctcctaa 4980 agactcccct aaaattagat cttatgtttc tcattatgtg ttttaagatt ttcattattc 5040 atggatgttt cgatataaga ctattttgaa ttatcatatt tgtctattgt gagtcgttta 5100 ggccccgttt ggttctatta gtcttaggat gtgtcacacc cggatttaag ggacaaataa 5160 gcaagggtga acttttacaa tgttagagtg tatagagata aatgtcataa taatattaga 5220 gtacttttac aatgcggaag tcttacaaaa taaaagataa acataaaatg aactaaaatc 5280 catctttggc gccaataagt caactgaaag acgccatcta aatcagatcg aactcctcgt 5340 tgtgtggctc ctcttgaacc accggtcctt ctcctgtggg gggtgtgaga cagcaagggt 5400 gagctcacac atgatcatag ctcaacaagt tgtggagaaa ccagtgagca tgaattcaac 5460 aatggtggga gctcatgtta tgtgtaaggc tgataaacaa taagggttaa agctgaacat 5520 tgcttttaat aagttggtca aaattttatt agtagttact aaatgtaagt gcataccaaa 5580 ccataataga aataatagaa caaaattaat aaatgatctc atacaatgca aatgacaaat 5640 tgagtttaag ttccataatt taatcctgcg agagtcctga gttgctcatg accgtgagct 5700 cggctagtat accagtttta cactctgcag aggttgtacc ctgtacccat aagtcatgtt 5760 acccatctgc caagggatcg cgactcccat acacctctac caaggaagcg aggcagggca 5820 atactacgag gcctttacaa agttccacta gcttccgaaa acccgctaca gtttatggga 5880 agagcactta caagaatccc ccgtctgatc gcaattgcag caaaatcaac ccgaaaacct 5940 ccttgcatgc aactccccta ctgcccttgc ccctttcggg taaggtagtc ttccactagc 6000 tttcctaatt agttagccaa ggggtctcat tcctccctta tggtggcacg tgtttctcaa 6060 gttaagctcc atgttccaat taacattaat gatgttgaca tgaacataaa taaaataaca 6120 aataattgga acatggatat aatgatatat taacccaaaa ccatgtgaag caatagcaaa 6180 actacccaag tgattcaggg gtaacaaggt aaagagttaa acagtctagg gtgacctatt 6240 cggtcccatc agaattaaac ctatgcatga ataagtgata ttaaagaaca ttattgggta 6300 taaaagtggt caagggcaca acttgccttc aatgagctcc tactcaacaa cttctatctg 6360 ctgggcacca ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataccgtcga 6420 cctcgagggg gggcccggta cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac aattcactgg 6480 ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 6540 gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcg 6596 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, desc= "primer for B200i" <400> 12 aaaactgcag gaattcactg ctgagggagc ga 32 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, desc= "primer for B200i" <400> 13 gcgggatcct tcttgctgta gtcctcgacc acg 33 <210> 14 <211> 1093 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genomic DNA <220> <221> misc_feature <222> (1090)..(1092) <223> Identification Method: Experimental, /function= "ATG translation start", /evidence= Experimental <220> <221> promoter <222> (1)..(1093) <223> Identification Method: Experimental, /function= "5' Regulatory Re gion of P19", /evidence= Experimental <400> 14 ctcgaggatc aatttaaaat gaaaacggaa aaagtgtaaa agctggtcca gaaaaataag 60 gtccgaagct tccaaaaacc gggacgagcg cctcccacga aagtgcatta cgtgggccgg 120 caaaactacc ctagcaaaga atgacctgaa cctaagcgat gtctcaaatc tcgatgccac 180 gagcaatcaa ggcgatgcct tcagaaggaa aacaacgccg tgacacacaa gctttgcata 240 ttcatgagag aagaccaaaa taacagtacg tgcctcattg cttattttgt ttcctcatat 300 aacagtacgt gcagttcaac ccaggtgtat atgtgtatcc cgccacttct atcgttagga 360 aagactataa atacatccat tcatctacgt atctctcacg ctctttactt ttggcttgca 420 ataataatac gaccaaagag actagcgcac cacaatacta catataccca tgctgataat 480 catacacccg tcaattctag ctgtgtccag gtcgaagtaa cagacgggaa catcacggtg 540 gtgatgcaag agactagcgc gtttggacgc ttcgcatcac ctacctttgg atgcctcgca 600 tgaatcaagt cgtgtcgtcc gctagcttcc gcctaccacc cacggagcag agccagcgag 660 caactaacac cggccaacta tccactggag ttgaatgcag gacgtccaag gtgtgcccgt 720 caaccattct gctgaccgta gtcatggcga gctggtgcag ttcagtgcat gctctaggtc 780 tagggtagag tgttcaacgg attgttacag cggccgtggg cgattcatta gacggctccc 840 cgcaggtggg gtgttcatta tcccctgcat ctttctttaa tcgctcacct gctcggtcgg 900 cggcgatggc cgcgtacgct ccctacgtgt cgccgcatgg catgcacatg gccggctcgg 960 gccacggcgg tgcgtggcca gctataaata ccccagccgg gagctcctag atccatctcc 1020 acacaactac cagtacactc cactcccatc acacacacgg acacacctgc aagagcgaga 1080 gcgtgagcca tgg 1093

Claims (42)

  1. (a) argE 유전자의 암호서열, P450sul 모노옥시게나제 유전자의 암호서열 및 pehA 유전자의 암호서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 전독소(protoxin)의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 암호서열에 작동적으로 연결된, 수탁번호 NRRL B-21920의 pSH64 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 11의 뉴클레오티드 1 내지 1390번으로 이루어진 프로모터, 수탁번호 NRRL B-21655의 pCIB10302 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 및 수탁번호 NRRL B-21919의 X2-1 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 14의 뉴클레오티드 1 내지 1093번으로 이루어진 프로모터로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 자성-선택적 프로모터를 포함하는 조건적 자성 불임 식물을 생산하는 단계;
    (b) 조건적 자성 불임 식물을 웅성 불임 식물과 사이심기하는 단계;
    (c) 전독소를 조건적 자성 불임 식물에 적용하여 자성 불임성을 유도하는 단계; 및
    (d) 잡종 종자를 생산하는 단계를 포함하는, 잡종 종자의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 식물이 일반 자화-수분 식물인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 식물이 일반 타화-수분 식물인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 일반 자화-수분 식물이 밀인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 일반 자화-수분 식물이 보리인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 일반 타화-수분 식물이 옥수수인 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 자성-선택적 프로모터가 수탁번호 NRRL B-21920의 pSH64 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 11의 뉴클레오티드 1 내지 1390번으로 이루어진 프로모터인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 자성-선택적 프로모터가 수탁번호 NRRL B-21655의 pCIB10302 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 자성-선택적 프로모터가 수탁번호 NRRL B-21919의 X2-1 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 14의 뉴클레오티드 1 내지 1093번으로 이루어진 프로모터인 방법.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 암호서열이 argE 유전자의 암호서열인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 전독소가 아세틸-포스피노트리신인 방법.
  14. 삭제
  15. argE 유전자의 암호서열, P450sul 모노옥시게나제 유전자의 암호서열 및 pehA 유전자의 암호서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 전독소의 독소로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 암호서열에 작동적으로 연결된, 수탁번호 NRRL B-21920의 pSH64 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 11의 뉴클레오티드 1 내지 1390번으로 이루어진 프로모터, 수탁번호 NRRL B-21655의 pCIB10302 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 및 수탁번호 NRRL B-21919의 X2-1 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 14의 뉴클레오티드 1 내지 1093번으로 이루어진 프로모터로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 자성-선택적 프로모터를 포함하는 발현 카셋트.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제15항에 있어서, 암호서열이 argE 유전자의 암호서열인 발현 카셋트.
  19. 제15항에 있어서, 암호서열이 P450sul 모노옥시게나제 유전자의 암호서열인 발현 카셋트.
  20. 제15항에 있어서, 암호서열이 pehA 유전자의 암호서열인 발현 카셋트.
  21. 삭제
  22. 제15항에 있어서, 자성-선택적 프로모터가 수탁번호 NRRL B-21920의 pSH64 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 11의 뉴클레오티드 1 내지 1390번으로 이루어지며, 암호서열이 argE 유전자의 암호 서열인 발현 카셋트.
  23. 제15항에 있어서, 자성-선택적 프로모터가 수탁번호 NRRL B-21655의 pCIB10302 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 암호서열이 argE 유전자의 암호 서열인 발현 카셋트.
  24. 제15항에 있어서, 자성-선택적 프로모터가 수탁번호 NRRL B-21919의 X2-1 클론으로부터 분리가능하고 서열번호 14의 뉴클레오티드 1 내지 1093번으로 이루어지며, 암호서열이 argE 유전자의 암호 서열인 발현 카셋트.
  25. 서열번호 11의 뉴클레오티드 1 내지 1390번으로 이루어진, 수탁번호 NRRL B-21920의 게놈성 pSH64 클론으로부터 분리가능한 자성-선택적 프로모터.
  26. 삭제
  27. 서열번호 2에 기재된 서열로 이루어진, 수탁번호 NRRL B-21655의 게놈성 pCIB10302 클론으로부터 분리가능한 자성-선택적 프로모터.
  28. 삭제
  29. 서열번호 14의 뉴클레오티드 1 내지 1093번으로 이루어진, 수탁번호 NRRL B-21919의 게놈성 X2-1 클론으로부터 분리가능한 자성-선택적 프로모터.
  30. 삭제
  31. 제15항의 발현 카셋트를 포함하는 식물 세포.
  32. 제18항의 발현 카셋트를 포함하는 식물 세포.
  33. 삭제
  34. 제22항의 발현 카셋트를 포함하는 식물 세포.
  35. 제23항의 발현 카셋트를 포함하는 식물 세포.
  36. 제24항의 발현 카셋트를 포함하는 식물 세포.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
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