KR100455620B1 - 벽판-특이적 아연 핑거 전사 인자 유전자를 이용한 화분수정률의 감소 방법 - Google Patents
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Abstract
페튜니아로부터 유도된 아연 핑거 전사 인자(ZPT3-2)를 인코딩하는 DNA인 핵산 및 핵산에 실시 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 이용한 웅성 불임 식물을 생산하는 방법이 제공된다. 또한, ZPT3-2 유전자로부터 유도된 프로모터 및 프로모터에 실시 가능하게 연결된 이형적 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 이용한 웅성 불임 식물을 생산하는 방법이 제공된다.
Description
화분 수정률은 농업과 원예의 다양한 면에서 문제점을 일으킨다. 예를 들면, 잡종 번식에 대한 교배의 경우, 자가-수분(self-pollination)은 막대한 노력을 필요로 하는 거세(castration)(수술의 제거)에 의해 피해져야 한다. 종자와 묘목 산업에서는, 잡종 번식으로 얻어진 우수한 품종을 상업적으로 보호하는 관점으로부터 화분 수정률 부족의 특성에 대한 수요가 있다. 그러한 수요에 대처하기 위해,화분 수정률을 조절하는 기술(수분 조절)은 강하게 요구되었다. 통상적으로, 특별한 농작물에 대해, 세포질 웅성 불임의 라인은 잡종 번식에 대해 이용되었으며, 약간의 성과가 얻어졌다. 그러나, 세포질 불임 특성은 종종 질병 저항성 감소 등과 같은 바라지 않은 부작용을 동반한다. 특성이 불안정하고, 종자를 대량 생산하기 어려운 것 등의 또다른 문제점이 있다. 화학 약품으로 처리하여 수정률을 감소시키는 방법이 연구되었으나, 안전성 평가와 이 방법의 메카니즘이 완전히 설명되지 않았으며 따라서 그러한 방법이 아직 실제로 이용되지 않는다. 따라서, 유전자 조작을 이용한 우수한 웅성 불임에 대한 수요가 있다.
벽판(tapetum)은 꽃밥 벽의 가장 안쪽면에 위치하고 스포로제너스 세포(sporogenous cell)(화분 세포)를 둘러싸는 조직이다. 벽판은 화분의 성장에서 필수적인 역할을 한다. 벽판은 화분 세포를 지탱할 뿐 아니라 화분의 성장에 필요한 영양제를 공급하고, 4분자(tetrad)를 포함하는 칼로스(callose) 층을 퇴화시키고, 화분 세포 표면의 엑신(exine) 층을 구성하는 화합물을 공급하는 것 등의 여러 가지 기능을 갖는다. 꽃밥의 성장은 다음 단계들로 나누어진다 : 스포로제너스 세포의 감수분열(meiosis) 후 즉시 4분자 단계 ; 소포자(microspore)가 4분자로부터 방출되는 동안 방출 단계 ; 화분 세포의 증대와 공포화(vacuolation)로 특성화되는 단일핵 단계 ; 유사분열(mitosis)에 의해 성장 세포와 생식 세포로 분화시키는 유사분열 단계 ; 및 그 후의 이핵 단계. 이러한 단계들 후, 꽃밥은 마침내 열개하여 성숙한 화분 그레인들이 방출된다. 벽판의 일부 기능만이 상기-기술된 성장 과정에서 손상되면, 대부분의 정상 화분의 성장은 억제되어, 화분 수정률이 제거되는 것으로 알려져 있다.
상기 기술된 대로, 유전자 조작을 이용한 웅성 불임 기술에 대한 큰 가능성이 있다. 특별하게는, 벽판과 같이 외부에 드러나지 않는 작은 구역에서 특히 발현되는 유전자가 이용될 수 있으면, 식물에게 바라지 않은 특성을 주지 않고 웅성 불임이 이루어질 수 있을 것이라 여겨진다. 벽판에 특이한 프로모터와 프로모터를 포함하는 웅성 불임에 대한 유전자 컨스트럭트의 여러 예들이 보고되었다(Shivanna and Saehney Ed., Pollen biotechnology for crop production and improvement(Cambridge University Press), pp. 237-257, 1997). 그러나, 발현의 높은 조직 및 시간 특이성을 갖는 화분 수정률의 조절에 유용한 신규한 유전자에 대한 수요가 여전히 있다.
최근에, 본 출원의 발명자들은 페튜니아로부터 유도된 신규한 전사 인자, 예를 들면, PEThyZPT3-2(다음부터는 ZPT3-2로 나타냄)를 포함하는 세븐 아연 핑거(ZF) 전사 인자의 cDNA 서열을 명시하였다. 그리고 발명자들은 각 전사 인자가 꽃밥 성장의 다른 단계에서 꽃밥-특이적 방법으로 일시적으로 발현하는 것을 노던 블럿(Northern blot) 분석이 나타냄을 보고하였다(Kobayashi et al., Plant J. 13:571, 1998). 그러나, 식물에서 이러한 전사 인자의 생리적 기능과 작용, 그리고 정확한 발현 사이트와 전사 인자를 인코딩하는 유전자의 메카니즘을 조절하는발현은 명백하게 설명되지 않았다.
(발명의 요약)
본 발명의 목적은 식물 특성의 변형, 대표적으로 웅성 불임에 유용한 꽃밥 조직-특이적 유전자를 이용한 유전자 조작 기술을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 페튜니아로부터 이전에 분리되었던 꽃밥-특이적 전사 인자들(ZPT3-2) 중 하나를 페튜니아로 인코딩하는 유전자를 재도입하였다. 그 결과로, 도입된 유전자에 의한 내생적 유전자의 발현이 억제되어 화분의 정상 성장이 억제되어, 화분 수정률이 상당히 감소됨이 발견되었다. 또한, 발명자들은 ZPT3-2 게노믹 유전자의 상류 구역을 분리하여, 프로모터 활성의 조직 특이성을 연구하였다. 그 결과로, 프로모터 활성이 4분자 단계로부터 단일핵 단계까지 벽판에서 조직 및 시간-특이적 방법으로 발현됨이 발견되었다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 완성되었다.
본 발명의 첫 번째 면에 따라, 웅성 불임 식물을 생산하는 방법은 (ⅰ) 서열번호 1에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 포지션 1886까지의 서열을 지닌 DNA, (ⅱ) 스트린전트 조건하에서 염기 서열 (ⅰ)을 지닌 DNA를 하이브리다이즈하고 화분의 성장을 조절하는 전사 인자를 인코딩하는 DNA, 및 (ⅲ) (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 DNA단편 중 어느 것이 되는 핵산 ; 및 핵산에 실시 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하고, 내생적 전사 인자를 인코딩하는 유전자는 스트린전트 조건하에서 핵산을 하이브리다이즈하는, 화분의 성장을 조절하는 내생적 전사 인자를 지닌 식물 세포를 제공하고, 발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하고, 발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생시키고, 및 내생적 전사 인자의 발현이 억제되도록 핵산이 발현된 것에 대해 재생된 식물을 스크린하는 단계들을 포함한다. 방법은 식물을 웅성 불임시키는 방법으로 이용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 핵산은 프로모터에 대해 포워드 방향으로 연결되며, 식물 세포에서 센스 방향으로 전사될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 핵산은 프로모터에 대해 리버스 방향으로 연결되며, 식물 세포에서 안티센스 방향으로 전사될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 식물은 쌍자엽 식물이다. 쌍자엽 식물은 바람직하게는 가지과 식물이며, 더욱 바람직하게는 페튜니아속 식물이다.
하나의 실시태양에서, 발현 카세트는 식물 발현 벡터 내로 통합된다.
본 발명의 첫 번째 면에 따라, 상기-기술된 방법 중 어느 것에 따른 방법에의해 생산된 웅성 불임 식물이 제공된다.
본 발명의 두 번째 면에 따라, 웅성 불임 식물을 생산하는 방법은 (a) 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 포지션 1991까지의 서열을 지닌 DNA와 (b) (a)의 서열 일부를 지니고 꽃밥의 벽판에 특이한 프로모터 활성을 나타내는 DNA 중 어느 것을 포함하는 프로모터 ; 및 프로모터에 실시 가능하게 연결된 이형적 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하고, 발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하고, 및 발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계들을 포함한다. 방법은 식물을 웅성 불임시키는 방법으로 이용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 식물은 쌍자엽 식물이다. 쌍자엽 식물은 바람직하게는 가지과 식물이며, 더욱 바람직하게는 페튜니아속 식물이다.
하나의 실시태양에서, 발현 카세트는 식물 발현 벡터 내로 통합된다.
본 발명의 두 번째 면에 따라, 상기-기술된 방법 중 어느 것에 따른 방법에 의해 생산된 웅성 불임 식물이 또한 제공된다.
본 발명의 세 번째 면에 따라, 프로모터는 다음 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 DNA를 포함한다 : (Ⅰ) 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 포지션 1991까지의서열을 지닌 DNA ; 및 (Ⅱ) (Ⅰ)의 서열 일부를 지니고 꽃밥의 벽판에 특이한 프로모터 활성을 나타내는 DNA.
본 발명의 네 번째 면에 따라, 식물을 웅성 불임시키는 데 유용한 식물 발현 카세트는 프로모터와 프로모터에 실시 가능하게 연결된 이형적 유전자를 포함한다.
(도면의 간단한 설명)
도 1은 ZPT3-2를 인코딩하는 유전자(여기서 또한 간단히 "ZPT3-2 유전자"로 나타냄)의 cDNA 서열 및 대응 아미노산 서열을 나타낸 도식이다. 3개의 아연 핑거 모티프와 DLNL 서열(포지션 411에서 포지션 425까지의 아미노산)은 밑줄로 나타내었다.
도 2는 ZPT3-2(pBIN-35S-ZPT3-2)의 cDNA 서열의 발현에 이용된 식물 발현 벡터의 구조를 나타낸 구성도이다.
도 3은 ZPT3-2 유전자의 코딩 구역의 상류 서열을 나타낸 도식이다. 전사 개시 사이트는 두꺼운 화살표로 나타내었다(포지션 1721). 번역 개시 코돈(ATG)은 두꺼운 밑줄로 나타내었다.
도 4는 ZPT3-2 유전자(pBIN-ZPT3-2-GUS)에 대한 프로모터를 분석하기 위한 식물 발현 벡터의 구조를 나타낸 구성도이다.
도 5는 야생형 페튜니아의 화분 및 pBIN-35S-ZPT3-2가 도입된 페튜니아의 화분과 같은 생물의 형태를 나타낸 사진이다(240배 확대). 모든 화분은 플라보놀(flavonol)로 착색되었다. 도 5(a) 내지 5(d)는 야생형 페튜니아 싹(bud)의 다른 성장 단계에서 화분을 나타낸 것이다. 도 5(e) 내지 5(h)는 형질전환된 페튜니아 싹의 다른 성장 단계에서 화분을 나타낸 것이다. 도 5(a)와 5(e)는 5 mm의 크기를 지닌 싹의 화분을 나타낸 것이다. 도 5(b)와 5(f)는 35 mm의 크기를 지닌 싹의 화분을 나타낸 것이다. 도 5(c)와 5(g)는 50 mm의 크기를 지닌 싹의 화분을 나타낸 것이다. 도 5(d)와 5(h)는 성숙한 단계에서 화분을 나타낸 것이다.
도 6은 pBIN-ZPT3-2-GUS가 도입된 페튜니아의 GUS-착색된 꽃 기관과 같은 생물의 형태를 나타낸 사진이다. 각 사진은 꽃밥이 4분자 단계인 꽃(싹)에서 얻어졌다. 도 6(a)은 2.5배 확대에서 싹의 외관을 나타낸 것이다. 도 6(b)은 낮은 확대(60배)에서 꽃밥의 횡단면을 나타낸 것이다. 도 6(c)은 높은 확대(280배)에서 꽃밥의 벽판 및 벽판 부근의 횡단면을 나타낸 것이다.
본 발명은 수술의 꽃밥(anther)에서 특히 발현되는 유전자 및 그의 이용에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 꽃밥의 벽판(tapetum)에서 특히 발현되는, 페튜니아(Petunia)로부터 유도된 아연 핑거 전사 인자(ZPT3-2)에 대한 유전자 및 그의 이용에 관한 것이다.
하기에, 본 발명은 더욱 상세히 기술될 것이다.
(ZPT3-2 유전자로부터 유도된 전사 인자)
본 발명의 첫 번째 면에 따라 웅성 불임 식물을 생산하는 방법에서 유용한 핵산은 다음 DNA 중 어느 하나이다 : (ⅰ) 서열번호 1에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 포지션 1886까지의 서열을 지닌 DNA ; (ⅱ) 스트린전트 조건하에서 염기 서열 (ⅰ)을 지닌 DNA로 하이브리다이즈하고, 화분의 성장을 조절하는 전사 인자를 인코딩하는 DNA ; 또는 (ⅲ) 상기-기술된 DNA(예를 들면, (ⅰ) 또는 (ⅱ)) 중 어느 것의 단편인 DNA. 본 발명의 상기-기술된 핵산은 바람직하게는 (ⅰ)의 DNA, 예를 들면, ZPT3-2를 인코딩하는 DNA, 또는 그의 단편, 및 더욱 바람직하게는 (ⅰ)의 DNA이다.
본 명세서에서, "전사 인자"는 유전자의 조절 구역에서 DNA에 결합하여 mRNA의 합성을 조절하는 단백질을 나타낸다. 어떤 타입의 전사 인자는 DNA 결합 도메인에서 아연 핑거 모티프로 불리는 고도로 보존된 아미노산 서열을 지니는 것으로 알려져 있다. ZPT3-2는 444개의 아미노산으로 이루어진 전체-길이 아미노산 서열에서 3개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 전사 인자인 Cys2/His2 타입(EPF 패밀리)의 아연 핑거 단백질, 및 또한, DLNL 서열로 불리는 소수성 구역이다(Kobayashi etal. 상기). ZPT3-2(서열번호 1)를 인코딩하는 cDNA 서열은 대응하는 추정 아미노산 서열(서열번호 2)과 함께 도 1에 나타난다.
본 명세서에서, 핵산 또는 DNA의 "단편"은 단편이 식물 내로 도입되고 적절한 방법으로 발현될 때 식물에서 내생적 전사 인자의 발현을 억제할 수 있는 단편을 나타낸다. 이 단편은 DNA에서 아연 핑거 모티프를 인코딩하는 구역보다는 상기-기술된 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 DNA 구역으로부터 선택된다. 단편은 적어도 약 40 염기 또는 그 이상, 바람직하게는 약 50 염기 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 약 70 염기 또는 그 이상, 및 더더욱 바람직하게는 약 100 염기 또는 그 이상의 길이를 지닌다.
본 명세서에서, 하이브리다이제이션에 대한 "스트린전트 조건"은 특별한 염기 서열(예를 들면, 페튜니아로부터 유도된 ZPT3-2를 인코딩하는 DNA) 및 특별한 염기 서열과 높은 레벨의 상동성을 지닌 또다른 염기 서열(예를 들면, 페튜니아보다는 식물에 존재하는 ZPT3-2의 상동물을 인코딩하는 DNA)의 더블-스트랜드 올리고뉴클레오타이드의 형성에 충분한 조건으로 의도된다. 본 발명에 적용된 스트린전트 조건의 대표적인 예는 다음과 같다 : 하이브리다이제이션은 1M NaCl, 1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트,32P-표지된 프로브 DNA(1 ×107cpm) 및 50 ㎍/ml 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 60℃에서 16시간 동안 수행되며, 60℃에서 30분 동안2×SSC/1% SDS로 2번 세척된다.
본 발명에서, 알려진 전사 인자의 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열의 보존된 구역에 대응하는 디제너레이트(degenerate) 프라이머 페어는 ZPT3-2를 인코딩하는 DNA, 및 화분의 성장을 억제하기 위해 스트린전트 조건하에서 DNA를 하이브리다이즈하는 전사 인자를 인코딩하는 DNA를 분리하기 위해 이용될 수 있다. PCR은 식물의 cDNA 또는 게노믹 DNA와 함께 이 프라이머 페어를 주형으로 이용하여 수행되며, 그 후에, 결과로 생기는 증폭된 DNA 단편은 동일한 식물의 cDNA 또는 게노믹 라이브러리가 스크린 될 수 있도록 프로브로 이용된다. 그러한 프라이머 페어의 예로써, 5'-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3'(서열번호 4), 및 3'-RTGNCCNCCNARNGCYTG-5'(서열번호 5)의 조합이 예증된다(N은 이노신을 나타내며, R은 G 또는 A를 나타내며, Y는 C 또는 T를 나타낸다). 상기-기술된 프라이머 서열은 ZPT3-2의 아연 핑거 모티프에 포함된 아미노산 서열 QALGGH에 각각 대응한다.
따라서, 본 발명에 적용된 스트린전트 하이브리다이제이션 조건은 또한 PCR에 이용될 수 있다. 대표적인 예에서, 상기-기술된 디제너레이트 프라이머(서열번호 4와 5)가 이용될 수 있다. 이 경우에, PCR 반응 조건은 다음이 될 수 있다 : 94℃에서 5분 동안 변성 ; 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 30 사이클 ; 및 최종적으로 72℃에서 7분 동안 배양.
PCR은 상업적으로 이용 가능한 키트와 장치에 대한 제조업자의 지시, 또는 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 기초하여 수행될 수 있다. 유전자 라이브러리를 제조하는 방법, 유전자를 클로닝하는 방법 등은 또한 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)을 참고하라. 결과로 생기는 유전자의 염기 서열은 당 분야에서 알려진 뉴클레오타이드 시퀀싱 분석 방법으로, 또는 상업적으로 이용 가능한 자동 시퀀서에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서, 전사 인자에 의한 "화분의 성장 조절"은 대표적으로 이 전사 인자의 발현이 억제될 때 화분의 형태 또는 기능에 중요한 변화가 관찰됨을 의미한다. 대표적으로, 본 발명의 전사 인자를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써, 바람직하게는 약 60% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 약 75% 또는 그 이상, 및 더더욱 바람직하게는 약 90% 또는 그 이상의 화분 세포가 성숙되기 전에 죽게된다. 노던 블럿 방법으로 측정된 mRNA의 양이 야생형 대조군 식물에 비교하여 약 10분의 1 또는 그 이하일 때, 전사 인자의 발현은 억제되는 것으로 판단된다.
상기와 같이 스크린에 의해 분리되고 확인된 유전자에 의해 인코딩된 전사 인자가 화분의 성장을 조절할 수 있거나 없는지는 본 명세서의 요약에 따라 형질전환된 식물을 생산하여 식물 화분의 특성을 관찰하여 확인될 수 있다.
본 발명에 따라, 화분의 성장을 조절하는 전사 인자를 인코딩하는 DNA 또는 그의 단편은 식물 세포에서 DNA의 그것과 동일하거나 상동인 염기 서열을 지닌 내생적 유전자의 발현을 억제하기 위해 이용될 수 있다. 그러한 타겟 내생적 유전자는 또한 화분의 성장을 조절하는 전사 인자이다. 본 발명의 방법에 따라, 식물은 바람직하게는 화분의 성장을 조절하는 내생적 전사 인자보다는 유전자의 발현을 실질적으로 억제하지 않고, 내생적 전사 인자의 발현만 선택적으로 억제하여 웅성 불임된다.
다른 말로는, 본 발명의 발현 억제 기술이 적용된 식물 세포는 화분의 성장을 조절하는 내생적 전사 인자를 지닌 식물 세포이다. 이 내생적 전사 인자를 인코딩하는 유전자는 스트린전트 조건하에서 상기-기술된 ZPT3-2 또는 ZPT3-2 상동물을 인코딩하는 DNA와 하이브리다이즈하는 유전자로 정의된다. "스트린전트 조건"의 정의는 ZPT3-2 상동물의 명세서에 관하여 기술된 것과 동일하다. 상기-기술된 방법으로 웅성 불임시킬 수 있는 식물은 바람직하게는 ZPT3-2 유전자가 분리된 페튜니아에 계통 발생적으로, 밀접하게 관련된 식물이거나, 상기-기술된 ZPT3-2 상동물을 인코딩하는 유전자가 분리된 식물이지만, 본 발명은 이에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. "계통 발생적으로, 밀접하게 관련된 식물"은 대표적으로 동일한 목(order)으로 분류된, 바람직하게는 동일한 과(family)로 분류된, 더욱 바람직하게는 동일한 속(genus)으로 분류된, 및 더더욱 바람직하게는 동일한 종(species)으로 분류된 식물을 의미한다. 벽판은 꽃밥의 가장 안쪽 층에 존재하고 실질적으로모든 종자 식물(spermatophyte)에 공유되는 화분의 성장에서 필수적인 기능을 지닌다. 이 점을 고려해보면, ZPT3-2의 그것에 동일하거나 유사한 기능을 지닌 전사 인자가 다른 식물에 광범위하게 존재할 수 있음이 쉽게 이해될 수 있다.
내생적 유전자의 발현을 억제하는 기술로, 코서프레션(cosuppression)과 안티센스 기술이 대표적으로 이용될 수 있다. 코서프레션에 관해서는, 재조합 유전자가 식물 세포로 도입되면, 유전자 그 자체와 그 유전자의 일부에 상동인 서열을 포함하는 내생적 유전자의 발현이 억제된다. 코서프레션이 이용되면, 본 발명에 따른 발현 카세트는 프로모터에 대해 포워드 방향으로 연결된 형태에서 전사 인자를 인코딩하는 DNA 또는 그의 단편을 포함한다. 전사 인자를 인코딩하는 DNA 또는 그의 단편이 발현 카세트로써 식물 세포 내로 도입된 후, DNA 또는 그의 단편은 프로모터의 조절하에서 센스 방향으로 전사될 수 있다. 도입된 DNA의 작용에 기인하여, 타겟된 유전자 발현을 억제하는 것이 가능하다. 코서프레션은 약간의 형질전환된 식물 개체에서 관찰될 수 있으나, 대부분, 코서프레션은 다른 개체에서는 충분히 일어나지 않는다. 따라서, 전형적으로, 유전자 발현이 의도된 방법으로 억제된 개체는 일상적인 절차로 스크린된다.
안티센스는 재조합 유전자가 식물 세포로 도입되면, 내생적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 번역이 억제되도록 도입된 유전자의 전사된 산물(mRNA)이 내생적 유전자의 전사된 산물(mRNA)의 상보적 서열과 하이브리드를 형성함을 의미한다.안티센스가 이용되면, 본 발명의 발현 카세트는 프로모터에 대해 리버스 방향으로 연결된 형태에서 전사 인자를 인코딩하는 DNA 또는 그의 단편을 포함한다. 전사 인자를 인코딩하는 DNA 또는 그의 단편이 발현 카세트로써 식물 세포 내로 도입된 후, DNA 또는 그의 단편은 프로모터의 조절하에서 안티센스 방향으로 전사될 수 있다. 안티센스 전사의 작용에 기인하여, 타겟된 유전자의 발현을 억제하는 것이 가능하다.
(ZPT3-2 유전자로부터 유도된 프로모터)
발명의 두 번째 면에 따라 변형된 특성을 지닌 식물을 생산하는 방법에서 유용한 프로모터는 (a) 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 포지션 1991까지의 서열을 지닌 DNA ; 및 (b) (a)의 서열 일부를 지니고 꽃밥의 벽판에 특이한 프로모터 활성을 나타내는 DNA 중 어느 것을 포함하는 프로모터이다. 본 발명의 상기-기술된 프로모터는 바람직하게는 (a)의 프로모터, 예를 들면, ZPT3-2 유전자에 대한 프로모터이다.
ZPT3-2 유전자에 대한 프로모터 구역으로부터 조직-특이적 발현 활성에 필수적이지 않은 서열을 제거하여 얻어진, 벽판에 특이한 프로모터 활성을 지닌 서열은 본 발명의 범위 내에 있다. 그러한 서열은 일반적으로 이용되는 방법에 따라 프로모터 삭제 실험을 수행하여 얻어질 수 있다. 간단히, ZPT3-2 유전자의 다양한프로모터 구역 삭제 돌연변이(예를 들면, ZPT3-2 유전자의 5' 상류 면으로부터 프로모터 구역을 다양한 길이로 삭제하여 얻어진 돌연변이)를 융합하여 얻어진 플라스미드, 및 적절한 리포터 유전자(예를 들면, GUS 유전자)는 삭제 돌연변이의 조직-특이적 프로모터 활성을 측정하는 데 이용될 수 있어서, 활성에 필수적인 구역을 확인할 수 있다.
프로모터 활성에 필수적인 구역이 확인되면, 프로모터 발현 활성의 크기가 증가되도록 구역 내 또는 구역에 인접한 서열이 변형되는 것이 가능하다. 변이체가 벽판에 특이한 프로모터 활성을 나타내는 한 그렇게-얻어진 변이체 또한 본 발명 내에 있다.
본 발명에서, "벽판에 특이한 프로모터 활성을 나타내는"은 자연-발생 식물 또는 프로모터가 발현 카세트로써 도입되어 프로모터가 임의의 구조 유전자에 연결된 식물에서 유전자 발현을 지시하는 DNA의 전사를 개시하는 프로모터의 능력이 벽판에서 특히 나타남을 의미한다. 여기서, "특이한"은 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물의 꽃의 모든 다른 조직(화분, 꽃실, 화주, 꽃잎, 꽃받침 등)에서보다 더 높음을 의미한다. 상기-기술된 특이한 프로모터는 바람직하게는 꽃의 모든 다른 조직과 동일한 식물의 꽃보다는 다른 부분(뿌리, 잎, 줄기 등)에서의 발현 활성보다 더 높은, 벽판에서 발현 활성을 지닌다. 더욱 바람직하게는, 특이한 프로모터는 꽃의 모든 다른 조직과 동일한 식물의 꽃보다는 다른 부분에서 실질적으로 활성을 나타내지 않는다. 발현 활성의 크기는 일반적으로 이용되는 방법에 따라 벽판에서의 프로모터의 발현 레벨을 다른 꽃 조직에서 동일한 프로모터의 발현 활성과 비교하여 평가될 수 있다. 프로모터의 발현 레벨은 전형적으로 프로모터의 조절하에서 발현되는 유전자 산물의 생산량에 의해 결정된다.
상기-기술된 특이한 프로모터를 이용하여 식물을 웅성 불임시키는 것은 유전자가 도입된 형질전환된 식물에서 프로모터의 조절하에서 본 발명의 프로모터에 실시 가능하게 연결된 어느 이형적 유전자의 벽판-특이적 발현의 결과로 이루어질 수 있다. 다수의 조직-특이적 프로모터에서, 조직-특이성은 종 사이에서 보존되는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 프로모터가 폭넓은 종류의 식물 종에 적용될 수 있음이 쉽게 이해된다.
예를 들면, 본 발명의 프로모터는 알려진 cDNA를 프로브로 이용하여 식물의 게노믹 라이브러리를 스크린하고, 대응하는 게노믹 클론으로부터 코딩 구역의 상류 서열을 분리하여 얻어질 수 있다. cDNA의 예로는, 페튜니아로부터 유도된 전사 인자인, 상기-기술된 ZPT3-2의 cDNA가 예증된다.
본 발명의 프로모터는 자연으로부터 분리된 것에 제한되지 않지만, 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 합성된 폴리뉴클레오타이드는 상기 기술된 프로모터 서열 또는 그의 활성 구역을 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법으로 합성하거나 변형하여 얻어질 수 있다.
(발현 카세트와 발현 벡터의 컨스트럭션)
본 발명의 전사 인자를 인코딩하는 DNA는 발현 카세트로써 식물 세포 내로 도입될 수 있는데, 여기서 DNA는 알려진 유전자 재조합 기술로, 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 적절한 프로모터에 실시 가능하게 연결된다. 동일하게, 본 발명의 벽판-특이적 프로모터는 바라는 이형적 유전자에 프로모터가 실시 가능하게 연결된 발현 카세트로써 식물 세포 내로 도입될 수 있다.
상기-기술된 전사 인자에 연결될 수 있는 "프로모터"는 구성적 프로모터, 조직-특이적 프로모터 및 유도 가능한 프로모터 중 어느 것을 포함하는, 식물에서 발현하는 어느 프로모터를 의미한다.
"구성적 프로모터"는 식물 세포 내부 또는 외부에서 자극에 상관없이 어떤 레벨에서 구조적 유전자의 원인이 되는 프로모터를 나타낸다. 이형적 유전자가 식물의 다른 조직 또는 기관에서 발현되고 식물에게 바라는 특성이 주어지지 않으면, 구성적 프로모터의 이용은 간단하고 바람직하다. 그러한 구성적 프로모터의 예로는, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터(P35S) 및 노팔린 합성효소(Tnos)에 대한 프로모터가 예증되지만, 구성적 프로모터가 이들에 한정되는것은 아니다.
본 발명에서, "조직-특이적 프로모터"는 적어도 벽판을 포함하는 꽃밥의 조직에서 특히 발현되는 구조적 유전자의 원인이 되는 프로모터를 나타낸다. 그러한 조직-특이적 프로모터는 본 발명의 ZPT3-2 유전자로부터 유도된 프로모터, 게다가, 꽃밥-특이적 발현 활성을 지닌 다른 알려진 프로모터를 포함한다. 따라서, 벽판-특이적 프로모터를 포함하는 자연-발생 ZPT3-2 유전자의 발현 카세트와 다른 조절적 요소와 선택적으로 결합된 전사 인자를 인코딩하는 서열의 이용은 본 발명 내에 있다.
"유도 가능한 프로모터"는 화학 약품, 물리적 스트레스 등과 같은 특별한 자극의 존재시 발현되는 구조적 유전자의 원인이 되고, 자극의 부재시 발현 활성을 나타내지 않는 프로모터를 나타낸다. 그러한 유도 가능한 프로모터의 예로는, 옥신에 의해 유도될 수 있는 글루타싸이온 S-트랜스퍼라제(GST) 프로모터(van der Kop, D. A. et al., Plant Mol. Biol., 39:979, 1999)가 예증되지만, 유도 가능한 프로모터는 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "발현 카세트" 또는 "식물 발현 카세트"는 본 발명의 전사 인자를 인코딩하는 DNA와 DNA에 실시 가능하게(예를 들면, DNA의 발현을 조절할 수 있는 그러한 방법으로) 연결된 식물 발현 프로모터를 포함하는 핵산 서열,및 본 발명의 벽판-특이적 프로모터와 프로모터에 실시 가능하게(예를 들면, 인-프레임) 연결된 이형적 유전자를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다.
상기-기술된 벽판-특이적 프로모터에 연결될 수 있는 "이형적 유전자"는 ZPT3-2 유전자보다는 페튜니아의 내생적 유전자, 페튜니아가 아닌 식물에서의 내생적 유전자, 또는 식물에 외생적 유전자(예를 들면, 동물, 곤충, 박테리아 및 진균으로부터 유도된 유전자) 중 어느 것을 나타내는데, 그러한 유전자 산물의 발현은 벽판에서 바래진다. 본 발명에서 그러한 이형적 유전자의 바람직한 예는 세포 파괴적 유전자 산물을 인코딩하는 유전자이며 그의 발현은 화분의 성장을 억제한다. 그러한 유전자의 예로는, 바나제(barnase) 유전자(Beals, T. P. and Goldberg, R. B., Plant Cell, 9:1527, 1997)가 예증되지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
"식물 발현 벡터"는 발현 카세트 및, 게다가, 조절적 요소가 숙주 식물 세포에서 작동될 수 있는 방법으로 카세트에 연결된 다양한 조절적 요소를 포함하는 핵산을 나타낸다. 바람직하게는, 그러한 식물 발현 벡터는 종결자, 약물-저항성 유전자 및 인핸서를 포함할 수 있다. 이용된 식물 발현 벡터의 타입 및 조절적 요소의 타입이 숙주 세포에 따라 변할 수 있다는 것은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에서 이용된 식물 발현 벡터는 T-DNA 구역을 더욱 지닐 수 있다. T-DNA 구역은 특히 아그로박테리움이 식물을 형질전환하는 데 이용될 때 유전자 도입의 효율성을 증가시킨다.
"종결자"는 유전자의 단백질을 인코딩하는 구역의 하류에 위치하고 DNA가 mRNA 내로 전사될 때 전사의 종결 및 폴리 A 서열의 첨가에 관여하는 서열이다. 종결자가 mRNA의 안정성에 기여하고, 유전자 발현의 양에 영향을 미치는 것은 알려져 있다. 그러한 종결자의 예로는, 노팔린 합성효소 유전자(Tnos)에 대한 종결자 및 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 종결자가 예증되지만, 종결자가 이들에 한정되는 것은 아니다.
"약물-저항성 유전자"는 바람직하게는 형질전환된 식물의 선택을 용이하게 하는 것이다. 카나마이신(kanamycin) 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPTⅡ) 유전자 및 하이그로마이신(hygromycin) 저항성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 바람직하게 이용될 수 있으나, 약물-저항성 유전자가 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물 발현 벡터는 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 식물 발현 벡터는, 예를 들면, 바람직하게는 pBI-타입 벡터 또는 pUC-타입 벡터를 이용하여 구조되지만, 식물 발현 벡터가 이들에 한정되는 것은 아니다.
(형질전환된 식물의 생산)
이렇게-구조된 발현 카세트, 또는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터는 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 바라는 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 도입된 발현 카세트는 식물 세포의 DNA 내로 통합되도록 존재한다. 식물 세포의 DNA는 염색체뿐만 아니라 식물 세포에 포함된 다양한 세포 기관(예를 들면, 미토콘드리아 및 엽록체)에 포함된 DNA를 포함함을 주목해야 한다.
본 명세서에서, 용어 "식물"은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 중 어느 것을 포함한다. 바람직한 식물은 쌍자엽 식물이다. 쌍자엽 식물은 고생화피식물아강(Archichlamiidae) 및 합판화아강(Sympetalidae) 중 어느 것을 포함한다. 바람직한 아강은 합판화아강이다. 합판화아강은 용담목(Gentianales), 가지목(Solanales), 광대수염목(Lamiales), 칼리트리칼레스(Callitrichales), 질경이목(Plantaginales), 초롱꽃목(Campanulales), 능소화목(Scrophulariales), 루비알레스(Rubiales), 산토끼꽃목(Dipsacales) 및 아스테랄레스(Asterales) 중 어느 것을 포함한다. 바람직한 목은 가지목이다. 가지목은 가지과(Solanaceae), 하이드로필라세(Hydrophyllaceae), 꽃고비과(Polemoinaceae), 새삼과(Cuscutaceae) 및 메꽃과(Convolvulaceae) 중 어느 것을 포함한다. 바람직한 과는 가지과이다. 가지과는 페튜니아속, 가시독말풀속(Datura), 담배속(Nicotiana), 가지속(Solanum), 토마토속(Lycopersicon), 고추속(Capsicum), 꽈리속(Physalis), 라이시움(Lycium) 등을 포함한다. 바람직한 속은 페튜니아속, 가시독말풀속 및 담배속이고, 더욱 바람직하게는 페튜니아속이다. 페튜니아속은 다음 종들을 포함한다 : 페튜니아 하이브리다(P. hybrida), 페튜니아 악실라리스(P. axillaris), 페튜니아 인플라타(P. inflata), 페튜니아 비올라세(P. violacea) 등. 바람직한 종은 페튜니아 하이브리다이다. "식물"은 꽃 식물(phanerogamic plant) 및 특정화되지 않은 경우 식물로부터 얻어진 종자를 의미한다.
"식물 세포"의 예로는, 꽃, 잎, 뿌리 등과 같은 식물 기관의 각 조직의 세포, 캘러스(callus) 및 현탁 배양 세포가 예증된다.
식물 세포 내로 식물 발현 벡터를 도입하기 위해, 아그로박테리움을 이용한 간접적 방법 및 세포 내로 직접 도입하는 방법과 같은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법이 이용될 수 있다. 그러한 아그로박테리움을 이용한 간접적 방법으로는, 예를 들면, Nagel et al.의 방법(FEMS Microbiol. Lett., 67:325 (1990))이 이용될 수 있다. 이 방법에서, 초기에, 아그로박테리움은 식물 발현 벡터를 이용하여 형질전환되고(예를 들면, 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해), 그 후 형질전환된 아그로박테리움은 잎 디스크(leaf disk) 방법 등과 같은 잘 알려진 방법으로 식물 세포 내로 도입된다. 식물 발현 벡터를 세포 내로 직접 도입하는 방법으로는, 일렉트로포레이션 방법, 입자 총(particle gun), 인산칼슘 방법, 폴리에틸렌 글리콜 방법 등이 예증된다. 이러한 방법은 당 분야에서 잘 알려져 있다. 형질전환되는 식물에 적당한 방법은 당 분야의 숙련자에 의해 적절하게 선택될 수있다.
식물 발현 벡터가 도입된 세포는 예를 들면 카나마이신 저항성 등과 같은 약물 저항성을 위해 스크린된다. 선택된 세포는 일반적으로 이용되는 방법을 이용하여 식물로 재생될 수 있다.
도입된 식물 발현 벡터가 재생된 식물에서 효과적인지 아닌지는 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 기술로 확인될 수 있다. 예를 들면, 내생적 유전자 발현의 억제가 의도되는 경우에, 그러한 확인은 노던 블럿 분석으로 전사의 레벨을 측정하여 수행될 수 있다. 이 방법에서, 내생적 전사 인자의 발현이 억제되는 바라는 형질전환된 식물이 선택될 수 있다. 조직-특이적 프로모터를 이용한 이형적 유전자의 발현을 위해서, 이형적 유전자의 발현은 일반적으로 타겟 조직으로부터 추출된 RNA를 샘플로 이용한 노던 블럿 분석에 의해 확인될 수 있다. 이 분석 방법의 절차는 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
화분 수정률이 감소되도록 내생적 전사 인자의 발현이 본 발명의 방법에 따라 억제되는지 아닌지는 예를 들면, 전사 인자를 인코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물 화분의 형태를 조직 화학적으로 착색 후 선택적으로 현미경으로 관찰하여 확인될 수 있다.
프로모터가 본 발명의 방법에 따라 벽판에서 특히 발현되는지 아닌지는 예를 들면, 프로모터가 GUS 유전자에 실시 가능하게 연결된 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 식물에서 꽃밥을 포함하는 꽃 조직을 조직 화학적으로 착색하여 GUS 활성의 분포를 검출하기 위해 일반적으로 이용되는 방법으로 확인될 수 있다.
하기에, 본 발명은 실시예에 기초하여 기술될 것이다. 본 발명의 범위는 실시예에만 한정되는 것은 아니다. 실시예에서 이용된 제한 효소, 플라스미드 등은 상업적으로 유용하다.
(실시예 1 : ZPT3-2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물 발현 벡터의 컨스트럭션)
이전에 보고된 꽃밥-특이적 ZF 유전자(Kobayashi et al., 상기) 중에서, PEThy ZPT3-2(ZPT3-2)의 cDNA는 식물 발현 벡터를 제조하기 위해 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터의 하류에 연결되었다.
특히, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 포함하는 DNA 단편(HindⅢ-XbaⅠ 단편) 및 플라스미드 pBI221(CLONTECH Laboratories Inc.로부터구입)에서 NOS 종결자를 포함하는 DNA 단편(SacⅠ-EcoRⅠ 단편)은 pUCAP35S를 제조하기 위해 플라스미드 pUCAP의 멀티-클로닝 사이트(van Engelen, F. A. et al., Transgenic Res., 4:288, 1995) 내로 성공적으로 삽입되었다. ZPT3-2의 cDNA를 포함하는 pBluescript 벡터는 KpnⅠ 및 SacⅠ 사이트(하나는 벡터 내의 사이트)에서 분열되었으며, 상기-기술된 pUCAP35S의 KpnⅠ과 SacⅠ 사이트 사이로 삽입되었다. 또한, 이 재조합 플라스미드는 EcoRⅠ과 HindⅢ을 이용하여 분열되었으며, ZPT3-2를 인코딩하는 DNA 단편은 바이너리 벡터 pBINPLUS 의 EcoRⅠ과 HindⅢ 사이트 사이로 삽입되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 구조된 ZPT3-2 유전자는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터 구역(P35S ; 0.9 kb), 본 발명의 ZPT3-2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(ZPT3-2 ; 약 1.9 kb) 및 노팔린 합성효소의 종결자 구역(Tnos ; 0.3 kb)을 포함한다. 도 2에서 Pnos는 노팔린 합성효소의 프로모터 구역을 나타내며, NPTⅡ는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ 유전자를 나타낸다.
(실시예 2 : ZPT3-2 프로모터 구역의 분리 및 GUS 리포터 유전자에 대한 결합)
페튜니아의 게놈 DNA 라이브러리로부터 대응하는 게노믹 클론을 분리하기 위해 ZPT3-2의 cDNA가 프로브로 이용되었다. 전사 개시 사이트의 DNA 단편(프로모터 구역 ; 약 2.0 kb) 상류는 서브클론되었다. 이 DNA 단편은 GUS 리포터 유전자의 상류에 연결되었으며 바이너리 벡터 내로 클론되었다.
특히, 방사성동위원소 표지된 프로브를 제조하기 위해 ZPT3-2의 cDNA는 일반적으로 이용되는 랜덤 프라이밍 방법(Sambrook et al., 상기)을 이용하여 [α-32P]dCTP로 표지되었다. 이 프로브로, EMBL3 벡터(Stratagene에 의해 제조된) 내에서 제조된 페튜니아(Petunia hybrida var. Mitchell)의 게노믹 라이브러리는 스크린되었다. 결과 클론으로부터 유전자의 상류 구역을 포함하는 약 2.0 kb의 게놈 DNA 단편이 pBluescriptSK 벡터의 EcoRⅠ 사이트에서 서브클론되었으며, 서열화되었다(도 3). 다음에, SalⅠ 인식 서열을 포함하는 링커 DNA는 SalⅠ 사이트가 그 안에(염기 포지션 : 2016) 도입되도록 ZPT3-2 유전자의 상류 서열에서 BglⅡ 사이트(염기 포지션 2006)에 삽입되었다. 그 후에, EcoRⅠ과 SalⅠ로 분열된 DNA 단편은 pUCAPGUSNT(pUCAP-ZPT3-2-GUSNT)의 GUS 코딩 구역의 상류에 삽입되었다. 따라서, ZPT3-2 유전자는 ZPT3-2 유전자의 코딩 구역의 N 말단 인접 구역에서 인 프레임으로 GUS 코딩 구역에 연결되었다. 또한, pBIN-ZPT3-2-GUS를 얻기 위해 EcoRI 및 HindⅢ으로 pUCAP-ZPT3-2-GUSNT를 분열시켜 얻어진 DNA 단편(ZPT3-2 프로모터, GUS 코딩 구역 및 NOS 종결자를 포함한)은 pBINPLUS 벡터 내로 삽입되었다(도 4).
(실시예 3 : 각 융합 유전자의 페튜니아 세포 내로의 도입)
상기-기술된 발현 벡터 각각은 아그로박테리움에 의해 다음의 절차로 페튜니아(Petunia hybrida var. Mitchell) 내로 도입되었다.
(1) 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주(CLONTECH Laboratories Inc.로부터 구입)는 28℃에서 250 mg/ml의 스트렙토마이신(streptomycin) 및 50 mg/ml의 리팜피신(rifampicin)을 포함하는 L 배지에서 배양되었다. Nagel et al.의 방법(상기)에 따라 세포 현탁액이 준비되었다. 실시예 1 및 2에서 구조된 플라스미드 벡터는 일렉트로포레이션에 의해 상기-기술된 균주 내로 도입되었다.
(2) 각 융합 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 다음의 방법을 이용하여 페튜니아 세포 내로 도입되었다 : 상기-기술된 (1)에서 얻어진 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404 균주는 YEB 배지에서 진탕하면서 배양되었다(28℃, 200 rpm)(DNA Cloning, Vol. 2, page 78, Glover D. M. Ed., IRL Press, 1985). 결과 배양 배지는 멸균수로 20 인자에 의해 희석되었으며, 페튜니아(Petunia hybrida var. Mitchell)의 잎 조각과 동시-배양되었다(coculture). 2∼3일 후, 상기-기술된 박테리아는 항생제를 포함하는 배지에서 제거되었다. 페튜니아 세포는 2주마다 선택 배지로 서브-배양되었다(subculture). 형질전환된 페튜니아 세포는 상기-기술된 2개의 융합 유전자와 동반하여 도입된 pBINPLUS로부터 유도된 NPTⅡ유전자의 발현에 기인한 카나마이신 저항성의 존재 또는 부재에 기초하여 선택되었다. 선택된 세포는 일반적으로 이용되는 방법으로 캘러스 내로 도입되었다. 캘러스는 식물 내로 재분화되었다(redifferentiated)(Jorgensen R. A. et al., Plant Mol. Biol., 31:957, 1996).
(실시예 4 : ZPT3-2 유전자가 도입된 형질전환된 페튜니아의 페노타입)
ZPT3-2의 cDNA를 식물 내로 도입하는 작용 및 효과가 검사되도록, 실시예 1의 벡터를 도입하여 얻어진 형질전환체는 ZPT3-2의 발현량을 측정하고 화분의 형태를 관찰하는 데 이용되었다.
특히, ZPT3-2의 cDNA가 35S 프로모터 조절하에서 도입된 형질전환체(15 개체)로부터, 유전자 발현이 코서프레션에 의해 억제된 개체(4 개체)는 노던 블럿 분석에 의해 선택되었다. 노던 블럿 분석의 조건은 다음과 같다 : 하이브리다이제이션은 7% SDS, 50% 포름아미드, 5×SSC, 2% 블록킹 시약(Boehringer Mannheim 제조), 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7.0), 0.1% 소디움 로릴 사코신, 50 ㎍/ml의 이스트 tRNA 및32P-표지된 프로브 DNA(1 ×107cpm)를 포함하는 용액에서 68℃에서 16시간 동안 수행되었으며, 68℃에서 30분 동안 2×SSC/0.1% SDS로 세척되었다.
상기-기술된 4개의 코서프레스된 형질전환체에서, 약 90%의 화분 세포가 성숙하기 전에 죽었다. 일반적으로 이용되는 플라보놀(flavonol) 착색으로, 화분 세포 표면의 엑신층에서 정상적으로 포함되는 플라보놀은 이러한 형질전환체의 파괴된 세포에서 실질적으로 검출되지 않았다(도 5 ; 형질전환체의 화분을 나타내는 사진에서 푸른빛을 띈 흰색의 불규칙한 형태를 지닌 그레인들은 파열된 세포들이다).
상기-기술된 관찰된 결과에 따라, 유전자 발현이 억제된 형질전환체의 화분 세포에서, 삼투압을 견딜 수 없는 세포가 파열되도록 세포벽의 성장이 엑신층 축적에서의 비정상에 기인하여 불충분했다는 것이 추측된다. 형질전환체의 화분 세포의 성장과 4분자 단계까지 정상 식물의 그것 사이에 인식되는 차이는 없었다. 화분에서 비정상이 일어나는 시간은 엑신층이 축적되는 시간 및 상기-기술된 작용 메카니즘을 지지하는 ZPT3-2가 정상적으로 발현되는 시간과 일치한다. 유전자 발현이 억제된 형질전환체에서, 화분 이외의 특성에서의 변화는 관찰되지 않았다. ZPT3-2 유전자가 과도하게 발현된 개체에서 화분 또는 다른 특성에서의 변화가 인식되지 않았음을 주목해야 한다.
상기 기술된 대로, ZPT3-2를 인코딩하는 유전자의 도입은 높은 속도로 화분 성장의 억제를 주도하여, 수정률 제거를 가능하게 한다. 그러한 속도는 유전자 도입에 이용되는 프로모터를 최적화하여 더욱 높아질 수 있다. 예를 들면, 실시예 1의 벡터에서 단독으로 이용되는 CaMV35S 프로모터 대신에, 활성을 높이기 위해 2개의 CaMV35S 프로모터가 탠덤으로 같이 연결될 수 있으며(소위 E2 프로모터) 결과 프로모터가 이용될 수 있다. 도입의 효과가 화분에 특이하고 식물의 다른 특성은 영향받지 않으므로, ZPT3-2 유전자의 도입은 선택적 형질전환 기술로 유용할 수 있다.
(실시예 5 : ZPT3-2의 프로모터 활성의 조직 특이성)
상기-기술된 DNA 단편의 조직-특이적 프로모터 활성은 실시예 2의 벡터를 도입하여 얻어진 형질전환체를 이용한 GUS 활성과 함께 조직 화학적으로 착색하여 검출되었다.
특히, ZPT3-2 유전자의 상류 구역의 융합 유전자를 GUS와 함께 도입하여 얻어진 형질전환체의 꽃은 기질로써 X-GUS를 이용하여 GUS 활성의 분포를 연구하는데 이용되었다(Gallagher, S. R. Ed., GUS 프로토콜 : 유전자 발현의 리포터로써 GUS 유전자를 이용, Academic Press, Inc., pp. 103-114, 1992). 결과로, GUS 활성은 꽃밥의 벽판에서 특히 검출되었다(도 6). 발현 시간은 일시적이었다. 활성의 최고점은 실질적으로 화분 세포의 감수분열 후 즉시 4분자 단계에 대응하였다. 따라서, ZPT3-2 유전자에 대한 프로모터가 꽃밥의 벽판에 특이한 활성을 나타냄이 발견되었다.
상기 기술된 대로, ZPT3-2 유전자에 대한 프로모터는 4분자 단계 근처에서 벽판에 특이한 활성을 나타낸다. 상기 기술된 대로, 벽판은 화분의 성장에서 필수적인 역할을 하는 조직이다. 따라서, 이 프로모터는 화분 성장의 상세한 연구에 대한 수단으로 유용하다. 또한, 화분의 성장은 세포독성을 지닌 유전자를 특히 발현하거나 조직 또는 벽판의 기능을 파괴하기 위해 프로모터 또는 그의 활성 단편을 이용하여 억제될 수 있다.
ZPT3-2 유전자로부터 유도된 전사 인자를 인코딩하는 DNA 및 ZPT3-2 유전자로부터 유도된 프로모터를 이용한 본 발명의 방법은 유전자 조작 방법을 이용한 식물의 특성을 선택적으로 변형하는 기술, 특히 웅성 불임시키는 기술로써 유용하다.
<110> NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES BIO-ORIENTED TECHNOLOGY RESEARCH ADVANCEMENT INSTITUTION <120> METHOD FOR LOWERING POLLEN FERTILITY BY USING TAPETAL LAYER-SPECIFIC ZINC FINGER TRANSCRIPTIONAL FACTOR GENE. <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1886 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <220> <221> CDS <222> (283)..(1614) <400> 1 cccacgcgtc cgcatgtgca gagataaata taaaccaaca tgacctacca ttaagatgag 60 acgatgatca tctaaaattt tggagctcag atgattttat tcgacaaatt tcctattttc 120 tcgctatggg tttccttttc agctaagcta cctccctcct tcttcttgat ttgattttct 180 tgggtttctt gtttcttctt gttttagggt ttttgataca catatatagt tgcttagtta 240 cgtagctaag taaggtgggt tatttcattt cttgaacttt ca atg gtt gat 291 Met Val Asp 1 tat caa gat ctt caa gtt ggg atg agc gga aca ctg tgg ata caa ctc 339 Tyr Gln Asp Leu Gln Val Gly Met Ser Gly Thr Leu Trp Ile Gln Leu 5 10 15 aag att gaa gac aaa caa gtt caa gaa ttg gat cat agt caa gat att 387 Lys Ile Glu Asp Lys Gln Val Gln Glu Leu Asp His Ser Gln Asp Ile 20 25 30 35 atg gac 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<400> 4 cargcnytng gnggncay 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 gtycgnranc cnccngtr 18
Claims (18)
- (ⅰ) 서열번호 1에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 포지션 1886까지의 서열을 지닌 DNA, (ⅱ) 스트린전트 조건하에서 서열번호 1의 염기 서열을 지니는 DNA를 하이브리다이즈하는 화분의 성장을 조절하는 전사 인자를 인코딩하는 DNA에서 선택된 핵산과 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하고 ;내생적 전사 인자를 인코딩하는 유전자는 스트린전트 조건하에서 핵산을 하이브리다이즈하는, 화분의 성장을 조절하는 내생적 전사 인자를 지닌 식물 세포를 제공하고 ;발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하고 ;발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생시키고 ; 및내생적 전사 인자의 발현이 억제되도록 핵산이 발현된 것에 대해 재생된 식물을 스크린하는 단계들을 포함하는 웅성 불임 식물을 생산하는 방법
- 제 1항에 있어서, 핵산은 프로모터에 대해 포워드 방향으로 연결되며, 식물 세포에서 센스 방향으로 전사됨을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 핵산은 프로모터에 대해 리버스 방향으로 연결되며, 식물 세포에서 안티센스 방향으로 전사됨을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 식물은 쌍자엽 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 4항에 있어서, 식물은 가지과 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 5항에 있어서, 식물은 페튜니아속 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 발현 카세트는 식물 발현 벡터 내로 통합됨을 특징으로 하는 방법
- 제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 웅성 불임 식물
- 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 포지션 1991까지의 서열을 지닌 DNA로 구성된 프로모터 ; 및 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이형적 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하고 ;발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하고 ; 및발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계들을 포함하는 웅성 불임 식물을 생산하는 방법
- 삭제
- 제 9항에 있어서, 식물은 쌍자엽 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 11항에 있어서, 식물은 가지과 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 12항에 있어서, 식물은 페튜니아속 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 9항에 있어서, 발현 카세트는 식물 발현 벡터 내로 통합됨을 특징으로 하는 방법
- 제 9항 및 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 웅성 불임 식물세포
- 삭제
- 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 포지션 1991까지의 서열을 지닌 DNA를 포함하는 프로모터
- 제 17항에 따른 프로모터와 프로모터에 실시 가능하게 연결된 이형적 유전자를 포함하는 식물을 웅성 불임시키는 데 유용한 식물 발현 카세트
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