KR100446113B1

KR100446113B1 - 5-이노신산을 생산하는 미생물 및 그를 이용한5-이노신산의 생산방법

Info

Publication number: KR100446113B1
Application number: KR10-2001-0073897A
Authority: KR
Inventors: 김현수; 정성오; 황수연; 이재철
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2001-11-26
Filing date: 2001-11-26
Publication date: 2004-08-30
Anticipated expiration: 2021-11-26
Also published as: KR20030042972A

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJIP009(KCCM-10226)의 변이주로서, 직접발효법에 의해 5-이노신산(5-inosinic acid)을 고농도·고수율로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330) 및 그를 이용하여 5-이노신산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물은 하기 특성을 갖는다:

아데닌 요구성; 크산틴 및 구아닌 누출형; 우레아제 결손; 라이소자임 고-감수성; 스트렙토마이신 내성; 프롤린 유사체 내성; 글루타민 유사체 내성; 발린, 루신 및 이소루신 유사체 내성; 테트라하이드로폴레이트 유사체 내성.

Description

5-이노신산을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 5-이노신산의 생산방법{Microorganism producing 5-inosinic acid and process for producing 5-inosinic acid using the same}

본 발명은 5-이노신산(5-inosinic acid)을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 5-이노신산의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)[종전 브레비박테리움 (Brevibacterium)] CJIP009(KCCM-10226)의 변이주로서, 직접발효법에 의해 5-이노신산을 고농도·고수율로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330) 및 그를 이용하여 5-이노신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

5-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 갖는다. 그 뿐 아니라, 식품, 의약품 및 각종 의료적 용도 등 다방면에서 이용되고 있다. 특히, 글루탐산 나트륨(sodium glutamate)과 함께 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광받고 있는 핵산계 조미료중의하나이다.

현재 직접발효법으로 5-이노신산을 생산하는 방법들이 공지되어 있다. 이 때 가장 중요한 것은 고농도·고수율의 5-이노신산을 보다 경제적으로 생산하는 것이라 할 수 있다.

본 발명자들은 직접발효법에 의해 5-이노신산을 고농도·고수율로 생산할 수 있는 새로운 미생물을 개발하기 위하여, 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 발효배지 첨가시, 퓨린 생합성계에 효과가 있는 발린(valine), 루신(leucine) 및 이소루신(isoleucine)의 유사체인, 발린 하이드록사메이트(valine hydroxamate), 노르발린(norvaline), 메틸발린(N-methyl-DL-valine), 티아이소루신(DL-thiaiso-leucine), 이소루신 하이드록사메이트(isoleucine hydroxamate), 루신 하이드록사메이트(leucine hydroxamate) 및 루신 메틸 에스테르(leucine methyl ester)에 대한 내성을 부여함과 동시에, 퓨린 생합성계에서 일탄소 단위(one-carbon unit) 전달자로 알려진(Escherichia coli and Salmonella, 1996, p561-579) 테트라하이드로폴레이트(THF: tetrahydrofolate)의 유사체인, 트리메토프림(trimethoprim), 피리메타마인(pyrimethamine), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 아미노프테린 (aminopterin)에 대한 내성을 부여한 미생물이 기존의 미생물에 비해 5-이노신산을 고농도·고수율로 생산할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 직접발효법에 의해 5-이노신산을 고농도·고수율로 생산하고, 발린, 루신 및 이소루신의 유사체에 대한 내성과, 테트라하이드로폴레이트의 유사체에 대한 내성을 동시에 갖는 미생물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 5-이노신산을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

첫째, 본 발명은 발린, 루신 및 이소루신의 유사체, 및 테트라하이드로폴레이트의 유사체에 대한 내성을 갖고, 5-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)에 관한 것이다.

둘째, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)을 배양하고, 그 배양물로부터 5-이노신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009(KCCM-10226)의 변이주이다. 본 발명에서 친주로 사용된, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009(KCCM-10226)은 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6872의 변이주로서, 하기 특성 및 효과를 갖는 것이다(대한민국특허 제2000-81471호):

(ⅰ) 아데닌을 요구하는 반면, 크산틴 및 구아닌을 요구하지 않으나 첨가함으로서 생육이 촉진된다[크산틴 및 구아닌 누출형 변이주(leaky mutant)].

(ⅱ) 우레아(urea)를 자화할 수 있는 우레아제(urease)가 결손되어 있다.

(ⅲ) 세포벽 분해효소인 라이소자임(lsozyme)에 대해 높은 감수성을 가짐으로써, 세포내에 생성된 다량의 5-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 합성능력이 부분적으로 결손되어 있다.

(ⅳ) 스트렙토마이신(streptomycin)에 대한 내성을 가짐으로써, 발효과정중 발생하는 오염에 효과적으로 대응할 수 있다.

(ⅴ) 배양과정중 고농도의 포도당 및 여러 탄소원이 첨가되고, 배양 후반기에 5-이노신산이 배양액내에 축적됨에 따라, 균체 외부의 삼투압이 증가한다. 이에 따라, 미생물의 정상적인 생리활성이 저해되어 균체 성장이 둔화되고, 5-이노신산 생성이 저하된다. 이러한 현상을 방지하기 위한 목적으로, 삼투압 내성 형질을 강화하기 위하여, 삼투압 조절에 중요한 역할을 하는 프롤린(L-proline)의 세포내 농도를 증가시키고자 하였다. 이에, 프롤린의 유사체들, 예를 들어 3,4-디하이드로프롤린, L-아제티딘-2-카복실산, 티아프롤린(L-티아졸리딘-4-카복실산), (S)-2,2-디메틸-4-옥사졸린디카복실산, (S)-5,5-디메틸-4-티아졸린디카복실산, (4S,2RS)-2-에틸-4-티아졸리딘카복실산, (2S,4S)-4-하이드록시-2-피롤린카복실산, 2-피페리딘카복실산 및 2,5-피롤리딘디온에 대한 내성을 부여함으로써, 보다 효율적으로 삼투압에 의한 영향을 배제시킬 수 있다.

(ⅵ) 퓨린 생합성계에 필수적으로 요구되는 글루타민의 유사체, 예를 들어, 아자세린 및 DON(6-디아조-5-옥소-L-노르루신)에 대한 내성을 부여하였다.

본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009(KCCM-10226)의 상기 (ⅰ)∼(ⅵ)의 특성외에, 하기 특성 및 효과를 추가로 갖는다:

(ⅶ) 발효배지 첨가시, 퓨린 생합성을 촉진하는 것으로 알려진, 발린, 루신및 이소루신의 유사체들, 예를 들어, 발린 하이드록사메이트, 노르발린, 메틸발린, 티아이소루신, 이소루신 하이드록사메이트, 루신 하이드록사메이트 및 루신 메틸 에스테르에 대한 내성을 부여하였다.

(ⅷ) 퓨린 생합성계에서 일탄소 단위 전달자로 알려진 테트라하이드로폴레이트의 유사체들, 예를 들어 트리메토프림, 피리메타마인, 메토트렉세이트 및 아미노프테린에 대한 내성을 부여하여, 배양액중에 직접 5-이노신산을 고수율·고농도로 축적시킬 수 있다.

본 발명에 따른 균주의 대표적인 유사체들에 대한 생화학적 특성을 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872와 비교하여 표 1에 기재하였다.

특성	ATCC6872	CJHB100(KCCM-10330)
아데닌	비요구성	요구성
구아닌(크산틴)	비요구성	누출형
라이소자임 감수성(최저생육억제농도)	80 ㎍/㎖	8 ㎍/㎖
3,4-디하이드로프롤린 내성	1000 ㎍/㎖	3500 ㎍/㎖
스트렙토마이신 내성	500 ㎍/㎖	2000 ㎍/㎖
아제티딘 카복실산 내성	5 ㎎/㎖	30 ㎎/㎖
티아프롤린 내성	10 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖
아자세린 내성	25 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖
설파구아니딘 내성	50 ㎍/㎖	200 ㎍/㎖
노르발린 내성	0.2 ㎎/㎖	2 ㎎/㎖
트리메토프림 내성	20 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖

본 발명의 미생물을 얻기 위하여, 아래 과정을 수행하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009(KCCM-10226)를 X-선, 자외선, 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸설페이트 또는 에틸아민 등의 화학적 변이유도제로 처리하였다. 이를 최소배지(주 2)중에 1.7%의 한천(agar), 및 발린, 루신, 이소루신 및 테트라하이드로폴레이트의 유사체를 각각 농도별로 함유한 배지에 적절히 희석한 후 도말하여 콜로니(colony)를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양하고, 종배지(주 3)에서 24 시간 배양하였다. 발효배지(주 4)에서 5∼6 일씩 배양한 결과, 발효배양액에 축적되는 5-이노신산 생성량이 우수한 미생물을 각각의 유사체에 대하여 단계적으로 선별하였다. 그 후, 최종 단계의 미생물중에 발효배양액에 축적된 5-이노신산 생성량이 가장 우수한 균주를 선별하였다. 이 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)이라 명명하였다. 이 균주는 부다페스트 조약하에 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2001년 10월 31일자로 기탁되어 수탁번호 제KCCM-10330호를 부여받았다.

(주 1) 영양배지: 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 엑기스 1%, 한천 2%, pH 7.2

(주 2) 최소배지: 포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10 ㎎/ℓ, 황산철 10 ㎎/ℓ, 황산아연 1 ㎎/ℓ, 염화망간 3.6 ㎎/ℓ, L-시스테인 20 ㎎/ℓ, 칼슘 판토테네이트 10 ㎎/ℓ, 티아민 염산염 5 ㎎/ℓ, 바이오틴 30 ㎍/ℓ, 아데닌 20 ㎎/ℓ, 구아닌 20 ㎎/ℓ, pH 7.3

(주 3) 종배지: 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모 엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100 ㎎/ℓ, 구아닌 100 ㎎/ℓ, pH 7.2

(주 4) 플라스크 발효배지: 글루탐산 나트륨 0.1%, 염화암모늄 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20 ㎎/ℓ, 황산망간 20 ㎎/ℓ, 황산아연 20㎎/ℓ, 황산구리 5 ㎎/ℓ, L-시스테인 23 ㎎/ℓ, 알라닌 24 ㎎/ℓ, 니코틴산 8 ㎎/ℓ, 바이오틴 45 ㎍/ℓ, 티아민 염산염 5 ㎎/ℓ, 아데닌 30 ㎎/ℓ, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8%되게 첨가하여 사용(pH 7.2)

(주 5) 발효조 종배지: 포도당 5.4%, 펩톤 1%, 효모 엑기스 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80 ㎎/ℓ, 황산아연 40 ㎎/ℓ, 황산망간 40 ㎎/ℓ, L-시스테인 80 ㎎/ℓ, 칼슘 판토테네이트 60 ㎎/ℓ, 티아민 염산염 20 ㎎/ℓ, 바이오틴 240 ㎍/ℓ, 아데닌 1200 ㎎/ℓ, 구아닌 1200 ㎎/ℓ(pH 7.2)

(주 6) 발효조 본배지: 염화칼슘 120 ㎎/ℓ, 황산구리 8 ㎎/ℓ, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24 ㎎/ℓ, 황산아연 24 ㎎/ℓ, 황산망간 24 ㎎/ℓ, L-시스테인 26.4 ㎎/ℓ, 글루탐산 나트륨 0.12%, 티아민 염산염 6 ㎎/ℓ, 바이오틴 40 ㎍/ℓ, 니코틴산 50 ㎎/ℓ, 알라닌 145 ㎎/ℓ, 아데닌 200 ㎎/ℓ, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 32%되게 첨가하여 사용(pH 7.2)

본 발명에 따른 5-이노신산의 생산방법은 다음과 같다.

코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산 및 비타민 등을 함유한 통상의 배지내에서 호기성 조건하에 온도 및 pH 등을 조절하면서 배양한다. 탄소원으로는 글루코스, 프럭토스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기 질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 무기 화합물로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 그 밖에도, 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕 배양 또는 통기교반 배양에 의해, 바람직하게는 20∼40 ℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하고, 5∼6 일간 배양하며, 직접발효에 의해 축적된 5-이노신산을 상법에 따라 분석한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 노르발린 내성주 CJNV2의 선별

코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009(KCCM-10226)를 인산염 완충액(pH 7.0) 또는 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷∼10⁸세포/㎖로 현탁시켰다. 여기에 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10∼50 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 실온 또는 32 ℃에서 20∼40 분간 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 2 회에 걸쳐 0.85% 식염수로 세척하고, 1.7%의 한천을 함유한 최소배지(주 2)에 노르발린을 각각 0.5 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖ 및 2 ㎎/㎖ 함유한 배지에서 적절히 희석한 후, 도말하여 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양하고 종배지(주 3)에서 24 시간 배양하였다. 발효배지(주 4)에서 3∼4 일씩 배양한 결과, 발효배양액에 축적된 5-이노신산 생성량이 가장 우수한 CJNV2를 선별하였다. 표 2에 CJNV2의노르발린 내성농도를 CJIP009(KCCM-10226)와 비교하여 나타내었다.

특성	CJIP009(KCCM-10226)	CJNV2
노르발린 내성농도	0.2 ㎎/㎖	2 ㎎/㎖

실시예 2: 트리메토프림 내성주 CJHB100의 선별

실시예 1의 코리네박테리움 암모니아게네스 CJNV2를 인산염 완충액(pH 7.0) 또는 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷∼10⁸세포/ℓ로 현탁시켰다. 여기에 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10∼50 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 실온 또는 32 ℃에서 20∼40 분간 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 2 회에 걸쳐 0.85% 식염수로 세척하고, 1.7%의 한천을 함유한 최소배지(주 2)에 트리메토프림을 각각 50 ㎍/㎖, 75 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 함유한 배지에서 적절히 희석한 후, 도말하여 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양하고 종배지(주 3)에서 24 시간 배양하였다. 발효배지(주 4)에서 3∼4 일씩 배양한 결과, 발효배양액에 축적된 5-이노신산 생성량이 가장 우수한 CJHB100를 선별하였다. 표 3에 CJHB100의 트리메토프림 내성농도를 CJNV2와 비교하여 나타내었다.

특성	CJNV2	CJHB100
트리메토프림 내성농도	20 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖

실시예 3: 삼각플라스크 발효역가 실험

사용균주: 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100

종배지: 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모 엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100 ㎎/ℓ, 구아닌 100 ㎎/ℓ, pH 7.2

플라스크 발효배지: 글루탐산 나트륨 0.1%, 염화암모늄 1%, 황산마그네슘1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20 ㎎/ℓ, 황산망간 20 ㎎/ℓ, 황산아연 20 ㎎/ℓ, 황산구리 5 ㎎/ℓ, L-시스테인 23 ㎎/ℓ, 알라닌 24 ㎎/ℓ, 니코틴산 8 ㎎/ℓ, 바이오틴 45 ㎍/ℓ, 티아민 염산염 5 ㎎/ℓ, 아데닌 30 ㎎/ℓ, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8%되게 첨가하여 사용

발효방법: 종배지 3 ㎖을 지름 18 ㎜ 시험관에 분주하고, 상법에 따라 가압살균한 후 사용균주를 접종하였다. 30 ℃ 온도에서 24 시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 27 ㎖을 500 ㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120 ℃ 온도에서 10 분간 가압살균하여 종배양액 3 ㎖을 접종한 후, 5∼6 일간 배양하였다. 이 때, 회전수는 분당 200 회, 온도 30 ℃, pH 7.2로 조절하였다. 배양 결과, 배지내 5-이노신산 축적량은 19.7 g/ℓ였다.

실시예 4: 5 ℓ 발효조에서의 발효역가 실험

사용균주: 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100

종배지: 실시예 3과 동일

발효조 종배지: 포도당 5.4%, 펩톤 1%, 효모 엑기스 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80 ㎎/ℓ, 황산아연 40 ㎎/ℓ, 황산망간 40 ㎎/ℓ, L-시스테인 80 ㎎/ℓ, 칼슘 판토테네이트 60 ㎎/ℓ, 티아민 염산염 20 ㎎/ℓ, 바이오틴 240 ㎍/ℓ, 아데닌 1200 ㎎/ℓ, 구아닌 1200 ㎎/ℓ(pH 7.2)

발효조 본배지: 염화칼슘 120 ㎎/ℓ, 황산구리 8 ㎎/ℓ, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24 ㎎/ℓ, 황산아연 24 ㎎/ℓ, 황산망간 24 ㎎/ℓ, L-시스테인 26.4 ㎎/ℓ,글루탐산 나트륨 0.12%, 티아민 염산염 6 ㎎/ℓ, 바이오틴 40 ㎍/ℓ, 니코틴산 50 ㎎/ℓ, 알라닌 145 ㎎/ℓ, 아데닌 200 ㎎/ℓ, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 32%되게 첨가하여 사용(pH 7.2)

발효방법: 종배지 50 ㎖를 500 ㎖ 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압살균하였다. 사용균주를 접종하고 30 ℃에서 24 시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효조 종배지 1000 ㎖를 2.5 ℓ 발효조에 넣고, 온도 120℃에서 15 분간 가압살균하여 종배양액 50 ㎖를 접종한 후, 1∼2 일간 배양하였다. 이 때 회전수는 분당 900 회, 온도 28∼34 ℃, pH 7.2로 조절하였다.

또한, 발효조 본배지 1250 ㎖를 5 ℓ 발효조에 넣고 온도 120 ℃에서 15 분간 가압살균하였다. 발효조 종배양액 250 ㎖를 접종한 후, 배양하면서 배양액내에 환원당의 함량이 2%가 되었을 때 1, 2, 3 및 4 차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀과 혼합하여 최종 환원당으로 각각 32%되도록 첨가하여 5∼6 일간 배양하였다. 이 때 회전수는 분당 900 회, 온도 30 ℃, pH 7.2으로 조절하였다. 배양 결과, 배지내 5-이노신산 축적량은 71.9 g/ℓ였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)을 이용하면, 직접발효법에 의해 경제적으로 5-이노신산을 고농도·고수율로 얻을 수 있다.

Claims

5-이노신산(5-inosinic acid)을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330).
제1항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5-이노신산을 생산하는 방법.