KR100361357B1

KR100361357B1 - 배양된 조직등가물의 동결보존법

Info

Publication number: KR100361357B1
Application number: KR1019960701270A
Authority: KR
Inventors: 레온 엠. 윌킨스; 스티븐 알. 왓슨
Original assignee: 오가노제네시스, 인코오포레이티드
Priority date: 1993-09-15
Filing date: 1994-09-14
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2014-09-14
Also published as: FI113833B; FI961124A0; NZ273514A; NO961048D0; EP0719084A4; AU683301B2; CY2364B1; ATE210373T1; CA2182814C; PT719084E; CA2182814A1; NO961048L; EP0719084B1; KR960704461A; ES2169734T3; DE69429436T2; AU7683194A; DE69429436D1; JPH09505032A; NO311631B1

Abstract

본 발명은 시험관내 기법에 의해 제조한 배양된 조직 등가물의 냉동 저장법에 관한 것이다. 본 발명은 냉각된 항냉동제 중에 배양된 조직 등가물을 침지하는 단계, 항냉동제 용액과 침지한 배양된 조직을 교반하여 배양된 조직 등가물 내로 항냉동제 용액을 유효하게 침투시키는 단계 및 빠른 냉동 속도로 배양된 조직 등가물을 냉동시키는 단계를 포함한다. 냉동저장된 조직 등가물은 사용 전에 무한 기간 동안 저장할 수 있다. 배양된 조직 등가물은 등가의 인간 조직의 시험관내 모델이며, 저장상태애서 회수하는 경우, 생체내에서 이식 또는 시험관 내에서 스크리닝에 사용할 수 있다.

Description

배양된 조직 등가물의 동결 보존법

발명의 분야

본 발명은 시험관내 기법으로 제조한 배양된 조직 등가물의 동결 보존에 관한 것이다. 동결 보존한 배양된 조직은 사용하기 전까지 무기한 보관할 수 있다. 배양된 조직은 인간 조직과 대등한 시험관내 모델이며, 저장물로부터 회수시 생체 내에서 이식 또는 시험관 내에서 화합물 검색에 사용할 수 있다.

발명의 배경

조직 배양 기법은 조직 및 기관 등가물을 개발하는데 사용되고 있다. 이들 기법은 살아있는 세포, 영양분 및 배양 조건을 적절히 조합함으로써 기능성 조직 및 기관으로 재성형될 수 있는 콜라겐 매트릭스 구조를 포함한다.

현재, 배양된 조직 등가물은 보존 기간이 짧다는 이유로 그 사용이 제한되고 있다. 따라서, 현재까지는 임의의 기간 동안 적절한 재고량을 유지하는 것이 불가능했다. 또한, 상기 등가물의 한정된 보존 기간으로 인해, 폐기되는 정도가 심했다. 따라서, 배양된 조직의 저장 기간을 연장하여 적절한 재고량을 유지하고, 결과적으로 폐기물의 양을 감소시킬 수 있는 성공적인 동결 보존법의 개발이 요구되고 있다. 이러한 동결 보존법은 상기 등가물을 상업적으로 이용할 수 있게 하는데, 그 이유는 더 큰 배치(batch) 규모의 재고량을 유지시킬 수 있으며, 품질 관리를 점검할 수 있기 때문이다. 현재, USP 기준은 14일이 소요되는 멸균 테스트를 요구하고있다. 성공적인 동결 보존법 개발의 다른 이점은 추가 테스트 및 분석을 위한 개발의 특정 단계에서 배양된 조직 등가물의 성장을 억제할 수 있다는 점이다.

현재, 생물학적 물질의 저장 시간은 동결에 의해 연장된다. 동결에 의한 액체의 고화는 분자의 규칙적인 배열을 포함하는 결정화로 나타날 수 있다. 또는, 동결은 규칙적인 배열 없이 고화되는 비결정화 또는 유리화로 나타날 수 있다.

결정화법으로 살아있는 세포를 동결하는 경우 세포 내에 빙정이 형성되는 문제점이 존재한다. 이들 빙정들은 해동시 세포 생존능에 해를 끼친다. 그러나, 유리화에 의해 동결 보존되는 경우, 고화 및 해동시에도 상기 세포들은 생존할 수 있다. 유리화는 세포들을 동해(凍害)보호제(cryoprotectant) 중에 침지시키는 동안 조절된 속도로 세포들을 냉각 및 가온하는 것을 포함한다.

문헌[참조: Fahy 등, "Vitrification as an approach to cryopreservation", Cryobiology 21: 407-426 (1984)]에서는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 1 기압에서 유리화되는 중합체를 함유하는 동해보호제 용액을 기술하고 있다. 이러한 동결 보존 매질은 인간 단핵 세포의 유리화를 위해 개질되었다[참조: Takahashi 등, "Vitrification of Human Monocytes", Cryobiology 23: 103-115 (1986)].

동해보호제를 이용하는 세포 및 조직의 유리화는 세포들이 사용된 고농축 동해보호제 용액, 빠른 냉각 및 가온 속도, 열 충격 및 가온 또는 탈유리화 도중의 얼음 형성을 견딜 수 없기 때문에, 해동시 세포 생존율이 낮아진다는 점에서 문제가 된다. 종래 기법을 이용하는 경우, 배양된 조직 등가물의 동결 보존은 불가능한데, 그 부분적인 원인은 상기 등가물이 비교적 두껍고, 이종성이 높기 때문이다.본 발명자들은 동일한 동결 보존법을 모든 조직에 적용할 수는 없음을 발견하였다. 따라서, 배양된 조직 등가물의 동결 보존을 위한 유효하고, 실용적인 방법이 현재 절실이 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은, 빙정을 형성하지 않고, 해를 끼칠 수 있는 화학물질의 유효농도를 최소화하고, 가능한 온도에서 동해보호제의 신속한 투입 및 제거가 가능하며, 농도 및 온도의 정확한 상황을 모니터하기 위한 복잡한 장치를 필요로 하지 않는, 매우 낮은 온도에서 배양된 조직 등가물을 성공적으로 보존하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 조직이 인간 조직의 등가물로서 생존성과 유용성을 보유하도록 하는, 시험관내 기법으로 제조한 배양 조직 등가물을 동결 보존하는 방법을 밝혀내었다. 본 발명은 유효량의 동해보호제의 침투를 증강시키기 위한 교반을 포함한다. 본 발명의 방법은 구조적 완전성과 세포 생존력을 보호하는 방식으로, 배양된 조직 등가물의 동결 보존을 가능하게 한다.

본 발명의 방법은

1) 냉각된 동해보호제 용액에 배양된 조직 등가물을 침지시키고, 동해보호제 용액 및 침지된 배양 조직을 교반하여 동해보호제 용액이 배양된 조직 등가물 내로 효과적으로 침투하도록 하는 단계; 및

2) 적어도 약 -110℃ 이하, 바람직하게는 -140℃ 이하 및 가장 바람직하게는 -196℃까지, 매우 빠른 동결 속도로 배양된 조직 등가물을 동결시키는 단계를 포함한다.

일단 동결되면, 배양된 조직 등가물은 액체 질소의 온도인 -196℃에서 무기한 저장할 수 있다.

동결 보존된 조직 등가물의 해동은 빠른 속도로 온도를 증가시키면서 동결된 조직을 약 1 내지 3초 동안 가온시킴으로써 수행한다. 동결된 배양 조직 등가물은 37℃의 수조나, 다른 신속한 가열 메카니즘으로 해동할 수 있다.

인간 조직을 위한 등가물로서 사용하기 전에, 해동한 배양 조직 등가물을 세정하여 동해보호제 용액을 제거한다. 동해보호제 용액은 예를 들어 생리적 pH에서 등장 완충 용액으로 세정함으로써 제거할 수 있다. 그 후, 배양된 조직 등가물은 사용 전에 상기 완충 용액에 일시적으로 저장할 수 있다.

제1도는 본 발명의 방법에 따라 동결 보존한 후의 살아있는 피부 등가물의 횡단면(A) (Living Skin Equivalent; LSE)과 대조용으로 동결시키지 않은 LSE의 횡단면(B)을 비교한 도면이다.

제2도는 MTT 분석법을 이용하여 동결 보존한 배양된 조직의 생존율을 시험한 결과를 나타내는 그래프이다. 제2(A)도는 0.5 내지 1.0 시간 동안 동결 보존한 후, 신속하게 해동시키고 37℃의 10% 이산화탄소 배양기 내에서 24시간 동안 항온처리한 LSE이다. 44 ㎠의 샘플중 면적이 0.5 ㎠인 3 개의 펀치(punch)를 MTT 분석하여 생존율을 측정하였다. 제2(B)도는 섬유아세포 생존율을 분석하기 위하여 동결 보존후 표피층을 제거한 LSE의 진피 부분을 나타낸다. 44 ㎠의 샘플중 면적이 0.5 ㎠인 3 개의 펀치를 MTT 분석하여 생존율을 측정하였다.

제3도는 동결 보존된 LSE의 동물 이식 결과를 나타낸다 제3(A), 3(B) 및 3(C)도는 생체 검사 조직의 광학 현미경 사진(H&E) 부위에서 나타나는, 전체 크기가 2 X 2 cm인 무흉선 생쥐의 상처 위에서 시간 경과에 따른 LSE의 이식전과 이식후의 사진을 나타낸다. LSE 이식물을 동결시키고, 72 시간 동안 저장한 후, 해동하고 같은 날 사용하였다. 제3(A)도는 비동결, 비이식의 대조용 LSE의 사진(135배 확대)이고; 제3(B)도는 6일 동안 동결 보존한 LSE의 이식후의 사진(175배 확대)이고; 제3(C)도는 LSE를 이식한 지 30일 후의, 동결 보존한 LSE의 사진(130배 확대)이다.

조직 공학은 화학 제제나 약학적 화합물에 의한 손상에 대한 반응을 조사하기 위해 사용할 수 있는 조직 등가물을 구성하는데 배양된 조직 세포를 이용하는 새로운 분야이다. 또한, 배양된 조직은 이식할 수 있는 인간 조직을 형성하기 위해 사용할 수 있다.

조직 등가물은 본 명세서에 참고로 인용한 미국 특허 제4,485,096호; 제4,485,097호; 제4,539,716호; 제4,546,500호; 제4,604,346호; 및 제4,837,379호를 포함하는 다수의 특허에 기술되어 있다. 이 조직 등가물의 한 성공적인 이용예로는 실제의 인체 피부와 형상이 유사한 소위 "살아있는 피부 등가물(Living Skin Equivalent)"이라 불리는 것이 있다. 살아있는 피부 등가물(LSE)은 두 개의 층으로 구성되어 있다: 상부 층은 콜라겐 매트릭스 내의 인체 진피 섬유아세포의 하부 층을 덮고 있는 분화되고, 층을 이룬 표피성 각질세포로 이루어져 있다[참조: Parenteau 등, "Epidermis Generated In Vitro: Practical Considerations andApplications," J. of Cellular Biochemistry, 45:245-251 (1991); Parenteau 등, "The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function," Cytotechnology, 9:163-171 (1992); 및 Bell 등, "The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to Irritants", Toxic. in Vitro, 5:591-596 (1991)]. 이식용 LSE는 현재 3가지 증후, 즉 정맥 궤양, 피부과적 수술 및 화상에 대해 임상실험 중이다. 상기 LSE는 시험관 내에서 제조된 완전 두께의 이층 피부 조직이다.

본 발명에 참고로 인용한 미국 출원 일련번호 제07/974,740호에 기술된 바와 같이 안구 각막의 시험관내 기관 등가물이 개발되어 왔다. 각막 조직 등가물은 3개의 구별되는 세포층, 즉 층을 이룬 비늘 모양의 상피로 이루어진 외부층, 콜라겐 섬유와 스트로마 세포로 이루어진 중간층 및 단순한 비늘 모양의 상피, 소위 각막 내피로 이루어진 내부층을 보유한다. 시험관 내 각막 등가물은, 여러 가지 생성물과 생물질에 대해, 생체 내 눈과 피부 자극의 가능성에 관한 정확하고, 저렴한 비동물 예측 모델로 이용되는 시험관내 독성 분석에 사용할 수 있다.

동결 보존의 목적은 무한 기간 동안 생물학적 물질의 구조적 완전성과 생존율을 보존함으로써 이들 물질을 이용할 수 있게 하고, 필요시에 사용할 수 있게 하는 것이다. 저장 기간이 한정된 복잡한 조직은 생성물의 유용성과 이용율을 높이기 위해 동결 보존할 필요가 있을 것이다. 그러나, 생물학적 물질의 동결 보존의 역사에 의하면 특정 세포를 위한 동결 보존법의 최적화는 조직 내에서 다른 세포 유형 또는 기타 세포와 함께 사용하는 경우 반드시 양호한 결과를 나타내지는 않는 것으로 밝혀졌다. 두 개의 층으로 된 LSE는 세포 밀도, 함수량 및 완전 두께의 LSE의 구조의 조직화 수준 때문에 더 구체화된 방법의 개발이 필요하였다. 또한, 본 발명의 동결 보존법은 3 개의 층으로 구성된 각막 등가물 및 기타 유사하게 구조적으로 복잡한 배양된 조직 등가물에 적용할 수 있다.

I. 정의

본 명세서에서 사용한 용어 "배양된 조직 등가물(cultured tissue equivalents)"은 포유동물 조직의 조직 등가물을 의미하는데, 이때 상기 조직 등가물은 시험관내 기법에 의해 제조되며, 두 개의 층으로 이루어진 피부 등가물, 특히 LSE 및 3 개의 층으로 이루어진 각막 등가물을 포함한다. 배양된 조직 등가물의 형상은 생체내 포유동물의 기관, 전형적으로 인간의 기관과 유사하다. 일례로 LSE의 형상은 인간의 피부와 많은 유사점을 보유한다. 대사 및 유사분열적으로 활성인 인간 진피 섬유아세포(HDF)는 구성물의 진피층 전반에 걸쳐 발견되는데, 이는 격자 내로 콜라겐 및 기타 매트릭스 성분을 분비하는 것으로 밝혀졌다. 표피는 인간 피부의 유사분열 속도와 유사한 유사분열 속도로 이분되는 것으로 나타나는 기본층으로 구성되어 있다. 기본층 상부의 표피는 생체 내에서 피부와 동일한 층을 나타내며, 단층 각막으로 덮인 케라토하이알린(keratohyalin) 및 라멜라(lamellar) 과립을 함유하는 명확한 가시 모양의 과립층을 보유한다. 면역조직화학적 연구는 라미닌, 콜라겐 타입 IV 및 칼라닌(GB3) 같은 정상적인 인간 피부 내에서 진피-표피 결합에 통상 관여하는 외세포성 매트릭스 성분의 존재를 입증하였다.

본 명세서에서 사용한 용어 "교반(agitation)"은 조직 등가물 내로 동해보호제 용액의 관류를 촉진하는 임의의 기계적 교반 수단을 의미하며, 원심분리와 진탕(shaking)을 포함한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "동해보호제 용액(cryoprotectant solution)"은 "세포 침투성 유리 형성제" 및 "비-세포 침투성 유리 형성제"를 포함하는 임의 용액을 의미한다. 비-세포 침투성 유리 형성제는 콘드로이틴 설페이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고분자량 형태의 복합 탄수화물, 또는 히드록시에틸 전분과 같은 헤타전분을 포함한다. 세포 침투성 유리 형성제는 글리세롤이 바람직하나, 프로필렌 글리콜, 에티렌 글리콜, 디메틸설폭사이드 및 당업계에 공지된 기타 침투성 유리 형성제를 포함한다.

본 발명용으로 적합한 동해보호제 용액에는 세포 침투성 유리 형성제 및 비-세포 침투성 유리 형성제가 모두 포함된다. 바람직한 동해보호제 용액은 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM) + 0.3% 신생 송아지 혈청(NCS)의 기제내에 65%의 글리세롤을 포함한다. 본 발명용으로 적합한 다른 동해보호제 용액은 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM)중의 0.3% 신생 송아지 혈청(NCS)의 기제내에 20.5%의 디메틸 설폭사이드(DMSO), 15.5% 아세트아미드, 10.0%의 프로필렌 글리콜, 6.0%의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 당업자는 특정 용도에 따라 최대 생존율을 유지하기에 적합한 공지된 동해보호제 및 동결, 저장, 해동 및 세정 절차를 이용하여 상기 용액들을 변형 및 최적화할 수 있다.

II. 동결 보존법

본 발명의 동결 보존법은 세포와 동해보호제가 평형에 이르기에 충분한 조건하에서 일정 기간 동안 동해보호제 용액에 배양된 조직 등가물을 침지시키는 단계를 필요로 한다.

배양된 조직 등가물은 농도 증가 및 온도 감소에 의해 등급화된 동해보호제 용액에 순차적으로 침지시킨다. 완전 강도(농도: 100%)의 동해보호제 용액은 기본 배지로 희석하여 일련의 더 낮은 농도의 강도를 산출한다. 적합한 기본 배지로는 당업자가 사용하는 임의의 공지된 포유동물 세포 배양 배지를 들 수 있으며, 예컨대, 둘베코의 개질된 이글 배지가 있다. 침지시키기 전에, 일련의 동해보호제 용액을 예비 냉각한다. 배양된 조직 등가물은 일차로 15 내지 35% 농도, 더 바람직하게는 25% 농도의 동해보호제 용액에 침지시키는 것이 바람직하다. 침지 온도는 22 내지 25℃이며, 실온이 더 바람직하다. 다음 단계로, 배양된 조직 등가물은 40 내지 60% 농도, 더 바람직하게는 50% 농도의 동해보호제 용액에 침지시키며, 침지 온도는 10 내지 -2℃이며, 4℃가 더 바람직하다. 그 다음에 최종적으로, -10 내지 -30℃, 더 바람직하게는 -20℃의 온도에서 100% 농도의 동해보호제 용액에 배양된 조직 등가물을 침지시킨다. 이들 각각의 침지의 경우, 약 10 내지 약 20분, 더 바람직하게는 약 15분 동안 배양된 조직 등가물을 특정 용액 내에 침지시킨다. 각각의 침지 단계에서 초과량의 동해보호제 용액은 냉각제, 더 높은 농도의 동해보호제 용액을 첨가하기 전에 제거한다.

임의의 하나 이상의 침지 단계, 바람직하게는 100% 농도의 동해보호제 용액을 이용하는 최종 침지 단계 중에, 배양된 조직 등가물 내로 동해보호제 용액이 효과적으로 침투하기에 충분한 시간 동안 상기 동해보호제 용액 중의 상기 배양된 조직 등가물을 교반한다. 당업자는, 예를들어, 배양된 조직 등가물의 유형, 동결보존 용액의 양과 조성 및 교반중 생성되는 힘을 포함하는 요인에 기초하여 배양된 조직 등가물 내로 동해보호제 용액을 효과적으로 침투시키는 데 필요한 적합한 시간을 용이하게 결정할 수 있다. 교반은 약 10 내지 20분간 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 교반은 종래의 진탕 트레이를 이용하여 수행하는 것이 바람직하다.

최종 침지 단계 후, 배양된 조직 등가물 및 동해보호제 용액을 적어도 -140℃ 내지 -180℃로 냉각한다. 냉각 속도는 1 분당 약 -10℃ 내지 약 -30℃가 바람직하며, 1 분당 약 -15℃ 내지 약 -20℃가 더 바람직하다. 냉각은 냉각 장치, 예를 들어 -110℃ 내지 -196℃, 더 바람직하게는 -140℃ 내지 -180℃의 온도로 프로그램할 수 있는, 시판되는 세포 냉동기를 비롯한 냉각 장치를 이용하여 수행할 수 있다.

그 후, 생성되는 동결 보존한 배양 조직 등가물은 예를 들어, 약 -110℃ 또는 그 이하의 유리전이 온도에서 백(bag) 또는 플라스틱 트레이 내에 저장한다. 관류한 배양된 조직 등가물은 동결시키기 전에 플라스틱 파우치 내에 진공 밀봉하는 것이 바람직하다. 조직 등가물을 진공 밀봉하는 것이 바람직한데, 그 이유는 상기 과정으로 처리함으로써 37℃의 수조 내에 침지한 후에 상기 물질의 신속한 해동이 보장되기 때문이다. 또한, 진공 밀봉은 멸균 조건하에서 배양된 조직 등가물의 저장과 해동을 가능하게 하며, 동결 및 해동 중에 신속한 열전달을 증가시킨다. 동결보존한 배양 조직 등가물은 용이하게 구입할 수 있는 통상적인 장치 및 적합한 플라스틱 백을 이용하여 진공 밀봉할 수 있다.

III. 동결 보존된 배양 조직 등가물의 해동.

빠른 속도로 온도를 증가시키면서 가열함으로써 동결된 배양 조직 등가물의 조직이 약 1 내지 3초 내에 해동되도록 한다. 매우 빠른 해동 속도로 동결된 배양 조직 등가물을 가온하는 적합한 방법으로는 수조를 이용하는 가온방법 또는 유도 가열을 이용하는 가온방법 등이 있다. 진공 밀봉한, 동결된 배양 조직 등가물을 37℃의 수조 내에 침지시켜 동결된 배양 조직 등가물을 해동시키는 것이 바람직하다.

동해보호제는 독성이 있기 때문에, 해동후 약 15분 내에, 바람직하게는 해동후 가능한한 신속히 해동된 배양 조직 등가물로부터 동해보호제 용액을 제거하여 배양된 조직의 생존능을 손상시키는 것을 피한다. 일단 배양된 조직이 해동되면, 생리적 pH(약 pH 6.8 내지 7.4)에서 바람직하게는 0.5 내지 2.0 M의 수크로오즈를 포함하는 등장 완충용액으로 동해보호제 용액을 대체한다.

상기와 같이 제조한 배양된 조직 등가물은 생체 내에서의 이식 또는 착상이나 시험관 내에서의 화합물의 검색에 사용할 수 있다.

하기하는 실시예는 본 발명의 수행에 사용되는 물질 및 방법을 추가로 기술한다. 하기 실시예는 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.

실시예

생존능을 성공적으로 회복시키지 못하는, 배양된 조직 등가물, 살아있는 피부 등가물(LSE)의 동결 보존을 위한 몇가지 통상의 종래 기술에 의한 방법을 수행한 후에, LSE에서의 높은 수준의 표피 조직화로 인해 그러한 종래 방법을 이용하여서는 동결 보존을 달성하는 능력이 제한됨을 발견하였다. 동결 보존중에, LSE는 단세포 현탁액 보다는 조직과 더 유사하게 행동하는 것으로 나타났다. 그 후, 본 발명자들은 종래의 유리화 개념에 기초하여 동결 보존 방법을 연구하였다.

I. 고전적인 유리화에 의한 LSE의 동결.

유리화는 결정의 형성 보다는 고화된 유리 형성 상(phase)을 얻기 위해 액체의 냉각 중에 점도를 증가시키는 단계를 이용하는 동결 보존법이다. 유리화는 종래의 동결 용액을 이용하여 빙정이 형성되지 않을 만큼 충분히 빠른 속도로 온도를 강하시키거나, 동해보호제의 수준을 종래의 동결 속도로 빙정이 생성되지 않을 만큼 충분한 수준으로 증가시킴으로써 수행할 수 있다.

전형적으로 1℃/분의 냉각 속도와 5 내지 20%의 동해보호제 농도를 이용하는 느린 동결 방법은 세포내 유리화를 진행시켜 단세포 현탁액이 조절된 세포외 빙정의 형성시에도 생존할 수 있게 한다[참조: Hubel 등, "Intracellular Ice Formation during the Freezing of Hepatocytes Cultured in a Double Collagen Gel", Biotechnol. Prog., 7: 554-559 (1991)]. 지금까지 이질적인 물리적 특성을 보유하는 복잡한 다층 조직 및 상기 층내의 다른 세포 유형은 얼음 형성에 의한 느린 동결 방법 수행중에 손상되는 것으로 알려져 왔다. 본 명세서에서 정의한 배양된 조직 등가물은 그 3차원 구조로 인해 세포내 얼음 형성 및 세포외 얼음 형성이 용이해진다.

테스트한 첫번째 유리화 용액은 성공적이지 못했으며, 변형 가능성의 수준이 매우 높았다. 이 용액은 개질된 VS1 이었다(Fahy 등, 상기 참조). 이 테스트에 사용한 개질된 VS1 용액은 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM)내의 0.3% 신생 송아지혈청(NCS)의 기제내에 20.5%의 디메틸설폭사이드(DMSO), 15.5%의 아세트아미드, 10.0%의 프로필렌 글리콜, 6.0%의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 함유하였다. VS1은 기본 배지로서 DMEM을 사용하고, 혈청 알부민 대신에 NCS를 사용하도록 개질하였다.

기본 배지를 이용하여 완전 강도의 개질된 VS1 용액을 희석하여 50% 및 25% 강도의 용액을 획득하였다. 상기 단계별 첨가 방법은 다음과 같다: LSE를 실온에서 15분 동안 25%의 VS1 용액에 침지시킨 후, 4.0℃에서 15분 동안 50%의 VS1 용액으로 대체하고, -20℃에서 15 내지 20분 동안 100%의 VS1 용액으로 대체하였다. 그 후, LSE는 온도가 -180℃에 이를 때까지(약 15분) 증기상 액체 질소 내의 -180℃ 유지 챔버에 넣어 두었다. 그 후, LSE는 약 -130℃에서 30분 내지 수일간 저장하였다.

해동 방법은 유리화된 LSE를 4.0℃의 50% VS1 + 1M 수크로오즈 내에 15분 동안 침지시킨 후, 실온에서 15분 동안 그 용액을 25% VS1+1M 수크로오즈로 대체하고, 실온에서 15 분 동안 DMEM + 1M 수크로오즈 용액으로 대체한 다음, 실온에서 15분 동안 DMEM 용액으로 대체하는 단계들로 구성되었다.

상기 방법으로 더 큰 중심 영역의 비-생존성 표피 세포를 얻고, 단지 LSE의 가장자리에서만 생존능(조직학적 검사로 확인함)을 얻었다. 생존능이 감소한 이유는 동해보호제가 LSE에 효과적으로 침투하지 못하기 때문인 것으로 확인되었다. 이 동해보호제의 관류 부족은 온도 감소에 따른 동해보호제 용액의 점도 증가에 기인하는 것이었다. -20℃에서 동해보호제는 여전히 액체이나, 꽤 점성이 있는 물질이다.

II. 동결 보존법을 이용하는 LSE의 동결.

A. 생존율을 증강시키기 위해, 본 발명의 방법을 이용하여 상기한 내용을 반복하는데, 이때 LSE는 최종단계 또는 100% VS1 관류 단계 중에 5 내지 15분 동안 원심분리하였다. 이 방법은 MTT 전환에 의해 측정되는 바와 같이 거의 100%의 생존율로의 현저한 개선을 나타냈다 [참조: Gay 등, "The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants", Toxic. in Vitro, 6:303-315 (1992)].

동결 LSE와 비-동결 LSE의 형태학적 차이는 거의 또는 전혀 없는 것으로 관찰되었다. 시료들 간에 약간의 변형 가능성이 나타났지만, 시료가 적절히 유리화되지 않는 경우, 해동 후 그의 형태학적 외양은 전체적으로 비-생존성 세포로 나타났다는 것에 주목하였다. 원심분리의 비실용적인 대형화 특성 때문에, -20℃ 냉동기에서 진탕기 플랫폼 상의 교반은 차후에 관류 증강 수단으로서 연구되었다. 이러한 교반 유형은 교반 방법으로서 원심분리를 이용하여 관찰된 것과 유사한 결과를 나타냈다.

B. 본 실험에서 사용한 유리화 용액은 발암성 화합물인 아세트아미드를 포함하지 않았다[참조: W.F. Rall, Cryobiology, 24: 387-404 (1987)] DMEM + 0.3% NCS(완전 강도) 내에 65% 글리세롤을 함유하는 신규한 유리화 용액을 평가하였다. 단계별 첨가 과정 및 해동 방법은 모두 개질된 VS1을 이용하는 상기 절차와 동일하였다: 기본 배지를 이용하여 완전 강도 용액을 희석하여 강도가 50% 및 25%인 용액을 얻었다. 상기 단계별 첨가 방법은 하기와 같다: LSE를 실온에서 15분 동안 25%용액에 침지시킨 후, 4.0℃에서 15분 동안 50% 용액으로 대체하고, -20℃에서 15 내지 20분 동안 100% 용액으로 대체하였다. 그 후, LSE는 온도가 -180℃에 이를 때까지(약 15분) 증기상 액체 질소 내의 -180℃ 유지 챔버에 넣어 두었다. 그 후, LSE는 약 -130℃에서 30분 내지 수일간 저장하였다. 해동하기 위해, 유리화된 LSE를 4.0℃에서 50% 용액 + 1M 수크로오즈 내에 15분 동안 침지시킨 후, 그 용액을 실온에서 15 분 동안 25% 용액 + 1M 수크로오즈 용액으로 대체하고, 이 용액을 실온에서 15분 동안 DMEM + 1M 수크로오즈로 대체한 다음, 실온에서 15분 동안 DMEM 용액으로 대체하였다.

이 방법은 개질된 VS1을 이용하는 방법보다 더 큰 생존률을 일관되게 제공하였다. 또한, 상기 용액은 변형가능성을 감소시켰다: 냉동저장된 LSEs는 일관되게 더 큰 생존 가능 가능성을 나타냈다. 제1도에서 확인되는 바와 같이 동결된 LSE와 비동결된 LSE 사이에서 외형상의 명백한 형태학적 차이는 없었다. 제2도에서 확인할 수 있는 바와 같이 생존율은 조직학적 연구와 MTT 분석에 의해 100%에 근접하는 것으로 평가되었다. 교반중 글리세롤 동해보호제의 독성은 5분에서 40분 까지 여러 노출 시간에서 시험하였으며, 최소 독성을 위한 바람직한 노출시간의 범위는 10분 내지 15분이었다.

C. 본 실험에서, 더 큰 크기의 LSE를 평가하였다. 생존율의 변화가능성은 해동 과정중 가온 용액과 가깝게 접촉하는 LSE의 표면적의 증가에 의해 감소될 수 있음을 확인하였다. 이는 최종 동결 단계 전에 관류된 LSE를 함유하는 보호성 파우치 내를 진공으로 하여 LSE와 보호성 파우치 주변 사이 공기의 단열 효과를 최소화함으로써 수행하였다. 상기 절차는 조직의 더 큰 가온 속도로 귀결되며, LSE, 특히 섬유아세포의 세포 생존율을 증가시켰다. 섬유아세포는 표피 세포 보다 탈유리화(가온중 얼음의 형성)에 더 민감한 것으로 나타났다.

해동된 LSE는 MTT 생존율 분석 및 통상의 조직학적 연구를 이용하여 각층의 생존율을 평가하기 전에 37℃의 배지에서 하루 동안 항온처리하였다. 본 발명의 방법과 65% 글리세롤을 이용하여 신속히 동결된 LSE는 제2(A)도에서 확인할 수 있는 바와 같이 해동후 1일 후에 양호한 생존율을 나타냈다. 표피층과 진피층 사이의 세포 밀도가 매우 다르기 때문에, 동결된 LSE의 진피층(DE)은 분리하여 측정하였다(참조: 제2(B)도). 제3도에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 층은 양자 모두 양호한 생존율과 형태 유지성을 나타냈다.

세포 생존율은 MTT 분석법, 즉 세포 성장률 및 생존율을 측정하기 위해 개발된 비색 MTT 전환 분석법을 이용하여 측정하였다. 상기 분석법은 문헌[참조: Gay 등, "The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants", Toxic. in Vitro, 6:303-315(1992)]에 상세히 기술되어 있다. 가용성 테트라졸륨 염의 청색 포르마잔 침전물로의 대사 감소는 완전한 미토콘드리아 기능을 보유한 생존 세포의 존재에 의존한다. 상기 분석법을 이용하여 배양된 인간 각질세포를 비롯한 여러 가지 유형의 세포에서 세포독성을 정량적으로 분석하였다. 1 ml당 0.33 mg의 MTT를 함유하는 LSE 분석 배지(미국, 미주리, 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴퍼니에서 시판됨) 1.5 ml를 각각의 웰에 첨가하였다. LSE는 MTT-함유 분석 배지 내에서 3 내지 4시간 동안 항온처리하였다. 전환기 말기에 LSE의 노출부를 직경이 8 mm인 피부 생검 펀치로 절제하고, 실온에서 0.04 N HCl로 산성화한 이소프로판올 0.3 ml 내에서 2 내지 24시간 동안 추출하였다. 추출기의 말기에, 각각의 추출물 0.2 ml를 96웰 평판의 웰에 이전하고, 평판 판독기(다이나테크)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 바탕 용액으로 이소프로판올 추출 매질을 이용하였다. LSE에 대해, 보고된 총 MTT 전환율은 LSE 내에서 섬유아세포와 각질세포의 연합된 대사 활성의 합이다. MTT 염색후, 진피로부터 표피를 벗겨냄으로써 진피층내 섬유아세포의 상대 분포 및 표피층내 각질세포의 상대 분포를 결정하였다.

III. 무흉선 생쥐에의 LSE 이식.

상기한 바와 같이 동결 저장한 후, 새로이 해동한 LSE(해동후에 항온처리하지 않음)를 무흉선 생쥐에게 이식하고, 이식능의 임의의 변화, 즉 이식 속도의 임의 변화, 단기 손상의 징후 또는 장기 지속성의 임의 변화를 측정하였다.

대조용 비-동결, 비-이식된 LSE의 형태는 제3(A)도에 나타낸다.

해동한 LSE의 이식 후 6 일째 및 30 일째에 행한 검사 결과는 각각 제3(B)도와 제3(C)도에 나타낸다. 6 일째에 이식물은 변성 또는 국소 괴사의 징후를 나타내지 않았다. 30 일째에 이식물은 동등한 표피 지속성과 진피 매트릭스의 혈관 형성을 나타냈다. 또한, 형태학적 비교에서 확인할 수 있는 바와 같이 이식물 수용의 관점에서 대조용의 비-동결 LSE와 해동된 LSE의 차이는 없었다 (자료는 제시하지 않음).

전술한 바와 같이 명확한 이해를 목적으로 제시한 예시 및 실시예를 통해 본발명을 상세히 설명하였지만, 첨부하는 특허청구의 범위로 한정되는 발명의 범위 내에서 본 발명의 변형 실시는 당업자에게 명백할 것이다.

Claims

(a) 농도가 증가하고, 온도가 감소하는 일련의 동해(凍害)보호제 (cryoprotectant) 용액에 배양된 조직 등가물을 연속하여 침지시켜 동해보호된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계;

(b) 상기 동해보호된 배양 조직 등가물을 1 분당 -10℃ 또는 더 빠른 냉각 속도로 -110℃ 이하의 온도로 냉각하여 유리화된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계; 및

(c) -110℃ 또는 그 이하의 온도에서 상기 유리화된 배양 조직 등가물을 저장하여 저장된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계를 포함하고,

이 때,

상기 배양된 조직 등가물은 살아있는 피부 등가물 또는 각막 조직 등가물이며,

저장 전에, 상기 농도가 증가하고, 온도가 감소하며, 침지시킨 배양 조직 등가물을 포함하는 단계(a)의 일련의 동해보호제 용액중 하나 이상의 용액을 상기 배양된 조직 등가물 내로 상기 동해보호제 용액을 효과적으로 침투시키기에 충분한 조건 하에서 교반하는 것을 특징으로 하는 배양 조직 등가물을 유리화하는 방법.
(a) 농도가 증가하고, 온도가 감소하는 일련의 동해보호제 용액에 배양된 조직 등가물을 연속하여 침지시켜 최종 온도 -10℃ 내지 -30℃에서 동해보호된 배양조직 등가물을 생성하는 단계;

(b) 상기 동해보호된 배양 조직 등가물을 1 분당 -10℃ 또는 더 빠른 속도로 -110℃ 이하의 온도로 냉각하여 유리화된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계; 및

(c) -110℃ 또는 그 이하의 온도에서 상기 유리화된 배양 조직 등가물을 저장하여 저장된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계를 포함하고,

이 때,

상기 배양된 조직 등가물은 살아있는 피부 등가물 또는 각막 조직 등가물이며,

저장 전에, 상기 농도가 증가하고, 온도가 감소하며, 침지시킨 배양 조직 등가물을 포함하는 단계(a)의 일련의 동해보호제 용액중 하나 이상의 용액을 상기 배양된 조직 등가물 내로 상기 동해보호제 용액을 효과적으로 침투시키기에 충분한 조건 하에서 교반하는 것을 특징으로 하는 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
(a) 실온에서 10 내지 20분 동안, 기본 매질 중의 동해보호제의 농도가 15% 내지 35%인 첫번째 동해보호제 용액에 배양된 조직 등가물을 침지시켜 첫번째 동해보호된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계;

(b) 10℃ 내지 -2℃의 온도에서 10 내지 20분 동안, 기본 매질 중의 동해보호제의 농도가 40% 내지 60%인 두번째 동해보호제 용액 중에 단계(a)의 상기 첫번째 동해보호된 배양 조직 등가물을 침지시켜 두번째 동해보호된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계;

(c) -10℃ 내지 -30℃의 온도에서 10 내지 20분 동안, 동해보호제의 농도가 100%인 세번째 동해보호제 용액 중에 단계(b)의 상기 두번째 동해보호된 배양 조직 등가물을 최종적으로 침지시켜 세번째 동해보호된 조직 등가물을 생성하는 단계;

(d) 단계(c)의 상기 세번째 동해보호된 배양 조직 등가물을 1 분당 -10℃ 또는 더 빠른 냉각 속도로 -110℃ 이하의 온도로 냉각하여 유리화된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계; 및

(e) -110℃ 또는 그 이하의 온도에서 상기 유리화된 배양 조직 등가물을 저장하여 저장된 배양 조직 등가물을 생성하는 단계를 포함하고,

이 때,

상기 배양된 조직 등가물은 살아있는 피부 등가물 또는 각막 조직 등가물이며,

적어도 단계(c)의 배양된 조직 등가물과 동해보호제 용액은 상기 배양된 조직 등가물 내로 상기 동해보호제 용액을 효과적으로 침투시키기에 충분한 조건 하에서 교반시키는 것을 특징으로 하는 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 동해보호제 용액이 세포 침투성 유리 형성제(cell-penetrating, glass-forming agent)와 비-세포 침투성 유리 형성제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함하는 것인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제4항에 있어서,

상기 비-세포 침투성 유리 형성제가 콘드로이틴 설페이트, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 포함하는 복합 탄수화물의 고분자량 형태인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제4항에 있어서,

상기 비-세포 침투성 유리 형성제가 헤타전분(hetastarch)인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제6항에 있어서,

상기 헤타전분이 히드록시에틸 전분인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제4항에 있어서,

상기 세포 침투성 유리 형성제가 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 디메틸설폭사이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 세포 침투성 유리 형성제가 글리세롤인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,

단계(c)의 상기 저장된 배양 조직 등가물을 온도 -196℃의 액체 질소에서 저장하는 것을 특징으로 하는, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제3항에 있어서,

상기 농도가 100%인 동해보호제 용액은 둘베코의 개질된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagles' medium) + 0.3% 신생 송아지 혈청 중의 65% 글리세롤; 둘베코의 개질된 이글 배지 중의 0.3% 신생 송아지 혈청의 기제내 20.5% 디메틸설폭사이드 + 15.5% 아세트아미드 + 10% 프로필렌 글리콜 + 6% 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 포함하며, 상기 농도가 100%인 동해보호제 용액을 기본 배지로 희석하여 단계(a)와 단계(b)의 동해보호제 용액을 제조하는 것을 특징으로 하는, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,

해동된 생존성 배양 조직 등가물을 생성하기 위한 유효 속도로 상기 저장된 배양 조직 등가물을 해동하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제12항에 있어서,

상기 해동된 생존성 동해보호된 배양 조직 등가물을 생리적 pH로 완충처리한 등장액으로 세정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 등장액이 0.5 내지 2.0 M의 수크로오즈를 포함하는 것인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 냉각 속도가 1 분당 -10℃ 내지 1 분당 -30℃인, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 냉각 단계 이전에 상기 배양 조직 등가물을 보호성 파우치 내에 멸균 진공 밀봉하는 것을 특징으로 하는, 배양된 조직 등가물을 유리화하는 방법.