JPH09110601A - 培養上皮細胞シートの凍結保存 - Google Patents
培養上皮細胞シートの凍結保存Info
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 皮膚創傷包帯としての使用において、生きて
いる培養上皮細胞層の凍結保存の方法について開示す
る。 【解決手段】 本方法は細胞層の完全性を維持してお
り、有糸分裂能を有し生理的に健康な形態の、有意数の
細胞を保存する。非細胞貫通性の凍結保護剤の使用と、
ある種の凍結溶解条件を包含している。
いる培養上皮細胞層の凍結保存の方法について開示す
る。 【解決手段】 本方法は細胞層の完全性を維持してお
り、有糸分裂能を有し生理的に健康な形態の、有意数の
細胞を保存する。非細胞貫通性の凍結保護剤の使用と、
ある種の凍結溶解条件を包含している。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞の生存性とコ
ロニー形成能力を有している、皮膚創傷の包帯として有
用な培養上皮組織シートの凍結保存および長期間の保存
に関する。
ロニー形成能力を有している、皮膚創傷の包帯として有
用な培養上皮組織シートの凍結保存および長期間の保存
に関する。
【０００２】
【従来の技術】火傷や潰瘍、外科的切除などによる漿液
の漏出予防と皮膚の創傷部の感染を予防する一方で、新
しい細胞の成長を促進する皮膚創傷包帯の開発が、医学
界では重要視されている。従来の包帯は、広範囲の創傷
を充分に保護することができず、幾つかの代換方法が開
発されている。これらの代換方法は、死体皮膚、ブタ皮
膚の切断したものかあるいは完全な厚みのあるものを移
植する方法、ヒト他家移植、ヒト自己移植などである。
免疫抑制療法を採用しない限り、自己移植以外は拒絶反
応によって、殆どの場合、成功しなかった。さらに従来
の自己移植技術は広範な表面を覆うような重症の火傷の
場合には実施できなかった。
の漏出予防と皮膚の創傷部の感染を予防する一方で、新
しい細胞の成長を促進する皮膚創傷包帯の開発が、医学
界では重要視されている。従来の包帯は、広範囲の創傷
を充分に保護することができず、幾つかの代換方法が開
発されている。これらの代換方法は、死体皮膚、ブタ皮
膚の切断したものかあるいは完全な厚みのあるものを移
植する方法、ヒト他家移植、ヒト自己移植などである。
免疫抑制療法を採用しない限り、自己移植以外は拒絶反
応によって、殆どの場合、成功しなかった。さらに従来
の自己移植技術は広範な表面を覆うような重症の火傷の
場合には実施できなかった。
【０００３】グリーンらは、火傷や潰瘍、および他の皮
膚の創傷を治療するために何層かの細胞の厚みをもった
上皮細胞シートを培養する方法を開発した。米国特許4,
016,036 号には、上皮の層状のシートを作成するため
に、ケラチノサイトを連続的に培養する方法が開示され
ている。米国特許 4,304,866号には、ケラチノサイトを
培養し、デスパーゼのような酵素を用いて付着支持体か
ら細胞シートを剥がす移植可能な細胞シートを製造する
方法が開示されている。米国特許 4,456,687号には、上
皮細胞の成長を促進するのに有用な薬剤が開示されてい
る。これらの特許の開示内容は引用により、本願に組み
込まれている。グリーンらにより開発された培養システ
ムでは、上皮細胞は、組織培養用皿やフラスコ表面で速
やかに分裂し、最終的にコンフルエントで適度に層状と
なった、細胞相互がしっかりと結合したシート状態とな
る。これらのコンフルエントな培養は、例えば酵素デス
パーゼ（米国特許 4,304,866号参照) を用いた処理によ
り、結合細胞シートとして公開することができる。培養
シートは、ワセリン浸漬ガーゼあるいは、他の非付着性
支持体に付けて、手術室へ培養液中に入れたまま移送
し、患者の処置に使用する。
膚の創傷を治療するために何層かの細胞の厚みをもった
上皮細胞シートを培養する方法を開発した。米国特許4,
016,036 号には、上皮の層状のシートを作成するため
に、ケラチノサイトを連続的に培養する方法が開示され
ている。米国特許 4,304,866号には、ケラチノサイトを
培養し、デスパーゼのような酵素を用いて付着支持体か
ら細胞シートを剥がす移植可能な細胞シートを製造する
方法が開示されている。米国特許 4,456,687号には、上
皮細胞の成長を促進するのに有用な薬剤が開示されてい
る。これらの特許の開示内容は引用により、本願に組み
込まれている。グリーンらにより開発された培養システ
ムでは、上皮細胞は、組織培養用皿やフラスコ表面で速
やかに分裂し、最終的にコンフルエントで適度に層状と
なった、細胞相互がしっかりと結合したシート状態とな
る。これらのコンフルエントな培養は、例えば酵素デス
パーゼ（米国特許 4,304,866号参照) を用いた処理によ
り、結合細胞シートとして公開することができる。培養
シートは、ワセリン浸漬ガーゼあるいは、他の非付着性
支持体に付けて、手術室へ培養液中に入れたまま移送
し、患者の処置に使用する。
【０００４】広い範囲の火傷はこれらの方法により調製
された自己移植材料を用いてカバーすることができる。
しかし自己移植のためには、培養するための時間が必要
である。自己移植のための細胞を培養している間に、一
時的な創傷包帯として有効な他家移植によって創傷を保
護することができる。他家移植の材料は慢性的な皮膚の
潰瘍と剥離皮膚移植供給者側の傷跡の治癒を促進する。
グリーンらの方法により調製された培養自己移植材料
は、マサチューセッツ州ケンブリッジに所在するバイオ
サーフェース・テクノロジー有限会社から入手可能であ
る。他家移植材料は実験や臨床試験用として入手可能で
ある。
された自己移植材料を用いてカバーすることができる。
しかし自己移植のためには、培養するための時間が必要
である。自己移植のための細胞を培養している間に、一
時的な創傷包帯として有効な他家移植によって創傷を保
護することができる。他家移植の材料は慢性的な皮膚の
潰瘍と剥離皮膚移植供給者側の傷跡の治癒を促進する。
グリーンらの方法により調製された培養自己移植材料
は、マサチューセッツ州ケンブリッジに所在するバイオ
サーフェース・テクノロジー有限会社から入手可能であ
る。他家移植材料は実験や臨床試験用として入手可能で
ある。
【０００５】培養上皮細胞移植の使用における実用上の
重大な問題は、本質的に保存期間が短いことにある。シ
ートの生存性とコロニー形成能は、シートの成育してい
る培地から離れると速やかに失われて行く。これは、シ
ートが生産設備から手術室まで移動する時間と距離を限
定している。細胞シートは並外れて脆いものである。こ
の細胞シートは、ディスパーゼで剥離させた後、せいぜ
い、６時間から８時間足らずの間に創傷面に処置した場
合、生育とコロニー形成能の機能を維持することができ
る。時間的な制限が大量の細胞シートを確保することを
阻害している。培養シートの保存時間を延長するため凍
結保存する技術が開発されれば、世界中に移送すること
のできる大量の細胞シートの維持が可能となるであろ
う。
重大な問題は、本質的に保存期間が短いことにある。シ
ートの生存性とコロニー形成能は、シートの成育してい
る培地から離れると速やかに失われて行く。これは、シ
ートが生産設備から手術室まで移動する時間と距離を限
定している。細胞シートは並外れて脆いものである。こ
の細胞シートは、ディスパーゼで剥離させた後、せいぜ
い、６時間から８時間足らずの間に創傷面に処置した場
合、生育とコロニー形成能の機能を維持することができ
る。時間的な制限が大量の細胞シートを確保することを
阻害している。培養シートの保存時間を延長するため凍
結保存する技術が開発されれば、世界中に移送すること
のできる大量の細胞シートの維持が可能となるであろ
う。
【０００６】先行技術には凍結保存や特定の細胞培地の
使用、確実な包装技術などを包含する種々の組織保存法
の説明があふれている。凍結保存は、凍結保護剤の存在
下で物質を凍結させて長期間貯蔵することを可能にす
る。この薬剤は、細胞の内外の水性物質を排除し、氷の
結晶の生成を予防する。凍結保護剤の性質や量及び／ま
たは、凍結融解サイクルの後細胞の生存性を維持する試
みにおける凍結工程の時間、経過、温度などに関しての
多数の開示されたプロトコールがある。例えば、米国特
許 4,559,298号や 4,688,387号を参照されたし。
使用、確実な包装技術などを包含する種々の組織保存法
の説明があふれている。凍結保存は、凍結保護剤の存在
下で物質を凍結させて長期間貯蔵することを可能にす
る。この薬剤は、細胞の内外の水性物質を排除し、氷の
結晶の生成を予防する。凍結保護剤の性質や量及び／ま
たは、凍結融解サイクルの後細胞の生存性を維持する試
みにおける凍結工程の時間、経過、温度などに関しての
多数の開示されたプロトコールがある。例えば、米国特
許 4,559,298号や 4,688,387号を参照されたし。
【０００７】凍結保存によって組織を保存することは、
複雑で高価な工程であり、高い変動し得る結果を生み出
すことが可能となる。しかし、これ以外の方法で、非常
に短時間の間、たとえば約８時間より以上に、動物組織
の保存生存性を延長した例はない。例えば、Pittelkow
他の例(J.Invest.Dermatol.4:410-17,413-14,1986 年)
を参照されたし。長い間、スキンバンクは、一時的な他
家移植の被覆として、凍結したヒトの皮膚を火傷に使用
してきた。しかし、この凍結はあまり実用的ではない。
複雑で高価な工程であり、高い変動し得る結果を生み出
すことが可能となる。しかし、これ以外の方法で、非常
に短時間の間、たとえば約８時間より以上に、動物組織
の保存生存性を延長した例はない。例えば、Pittelkow
他の例(J.Invest.Dermatol.4:410-17,413-14,1986 年)
を参照されたし。長い間、スキンバンクは、一時的な他
家移植の被覆として、凍結したヒトの皮膚を火傷に使用
してきた。しかし、この凍結はあまり実用的ではない。
【０００８】保存皮膚は代謝学的には活性であるが、上
皮細胞が自己再生できるかどうかは確実ではない (Hemi
bach, D.,et al., Artificial Dermis for Major Burn
s:" aMulti-Ceter Randomized Clinical Trial",Ann, S
urg. 313-320, September 1988) 。
皮細胞が自己再生できるかどうかは確実ではない (Hemi
bach, D.,et al., Artificial Dermis for Major Burn
s:" aMulti-Ceter Randomized Clinical Trial",Ann, S
urg. 313-320, September 1988) 。
【０００９】グリーンらにより述べられているように、
大規模な培養上皮自己移植の生産は、患者自身の皮膚に
より、永続的に広い範囲の傷を覆うことを促進してい
る。大量の培養上皮は、患者のために生産されるもので
あるが、上皮の寿命に限界があり、大きな問題となって
いる。この結果として、キャンセッダとデルッカは10％
グリセロールを含んだ培養液中で、培養ケラチノサイト
のコンフルエントシートを凍結する方法を開発した（EP
0 296 475参照) 。しかしながら、この方法を用いた経
験では、細胞の回復率が変動し、そして一般的に、非常
に低いことが確認された。さらに、インキュベーション
時間の幅が非常に狭く、大規模な生産のためには、非実
用的であることが判明した。その上、何らかのプロトコ
ールにより凍結させ、液体窒素中で保存後融解させた移
植は、しばしばヒビが入る。創傷の被覆は可能かもしれ
ないが、細胞レベルでは、コンフルエントシートの活性
状態については問題が残る。
大規模な培養上皮自己移植の生産は、患者自身の皮膚に
より、永続的に広い範囲の傷を覆うことを促進してい
る。大量の培養上皮は、患者のために生産されるもので
あるが、上皮の寿命に限界があり、大きな問題となって
いる。この結果として、キャンセッダとデルッカは10％
グリセロールを含んだ培養液中で、培養ケラチノサイト
のコンフルエントシートを凍結する方法を開発した（EP
0 296 475参照) 。しかしながら、この方法を用いた経
験では、細胞の回復率が変動し、そして一般的に、非常
に低いことが確認された。さらに、インキュベーション
時間の幅が非常に狭く、大規模な生産のためには、非実
用的であることが判明した。その上、何らかのプロトコ
ールにより凍結させ、液体窒素中で保存後融解させた移
植は、しばしばヒビが入る。創傷の被覆は可能かもしれ
ないが、細胞レベルでは、コンフルエントシートの活性
状態については問題が残る。
【００１０】高分子量の凍結保護剤を使用した初期の研
究では、ポリビニールピロリドン(PVP) やデキストラン
（分子量30-100Kd) のみが凍結保存の間の赤血球の破壊
を予防することを確認している(Pegg,D.E.,"Banking of
Cells,Tissues and Organsat Low Tempratures ", Cur
rent Trends in Cryobiology,A.Smith 編集,1970)。グ
リセロールとデキストランおよびヒドロキシルエチル澱
粉の組み合わせが羊の精子の凍結融解の自動力を部分的
に維持する(Schmehl et al.,"The Effects ofNonpenetr
ating Cryoprotectants Added to Test-Yolk-Glycerol
Extender on the Post-Thaw Motility of Ram Spermato
zoa" 23 Cryobiol. 6:512-17,1986) 。
究では、ポリビニールピロリドン(PVP) やデキストラン
（分子量30-100Kd) のみが凍結保存の間の赤血球の破壊
を予防することを確認している(Pegg,D.E.,"Banking of
Cells,Tissues and Organsat Low Tempratures ", Cur
rent Trends in Cryobiology,A.Smith 編集,1970)。グ
リセロールとデキストランおよびヒドロキシルエチル澱
粉の組み合わせが羊の精子の凍結融解の自動力を部分的
に維持する(Schmehl et al.,"The Effects ofNonpenetr
ating Cryoprotectants Added to Test-Yolk-Glycerol
Extender on the Post-Thaw Motility of Ram Spermato
zoa" 23 Cryobiol. 6:512-17,1986) 。
【００１１】生存性の指標としてトリパンブルー染料排
除を行った場合、ヒドロキシルエチル澱粉(HES) のみ
が、造血源である凍結保存細胞の生存性を促進すること
が確認されている。しかし、凍結保護剤が添加され、そ
の後で非常に時間のかかる方法で、緩やかに除去されて
いった場合にのみ有効である(Conscience,Fischer, "An
Improved Preservation Technique for Cells of Hemap
oetic Origin" 22 Cryobiol. 5: 495-98, 1985)。この
生存性のパラメーターは短期間の膜安定性に関する情報
のみを提供し、組織の増殖潜在力や長期間の生存性に関
するデータは提供していない。この文献の著者らは、HE
S は、上皮性組織由来細胞の凍結保存には無効であると
のべている。別の研究では、細胞の長期間の生存性をよ
り反映しているパラメーターであるが、細胞増殖分析物
により決定されるように、造血源である細胞の凍結保存
にはHES が有効であった (Wang, et al., Cryobiol, 2
4: 229-237, 1987) 。
除を行った場合、ヒドロキシルエチル澱粉(HES) のみ
が、造血源である凍結保存細胞の生存性を促進すること
が確認されている。しかし、凍結保護剤が添加され、そ
の後で非常に時間のかかる方法で、緩やかに除去されて
いった場合にのみ有効である(Conscience,Fischer, "An
Improved Preservation Technique for Cells of Hemap
oetic Origin" 22 Cryobiol. 5: 495-98, 1985)。この
生存性のパラメーターは短期間の膜安定性に関する情報
のみを提供し、組織の増殖潜在力や長期間の生存性に関
するデータは提供していない。この文献の著者らは、HE
S は、上皮性組織由来細胞の凍結保存には無効であると
のべている。別の研究では、細胞の長期間の生存性をよ
り反映しているパラメーターであるが、細胞増殖分析物
により決定されるように、造血源である細胞の凍結保存
にはHES が有効であった (Wang, et al., Cryobiol, 2
4: 229-237, 1987) 。
【００１２】凍結保護剤として高分子量の非浸透性（ガ
ラス成形性) 薬剤を使用した研究が、上記した赤血球や
リンパ球のような浮遊性細胞に集中している傾向にあ
る。しかし、凍結保存の期間中に細胞の凝集性シートの
完全性を保つ必要性が、生存細胞（即ち組織再生能力を
もった細胞) の回復を極端に制限するものである。
ラス成形性) 薬剤を使用した研究が、上記した赤血球や
リンパ球のような浮遊性細胞に集中している傾向にあ
る。しかし、凍結保存の期間中に細胞の凝集性シートの
完全性を保つ必要性が、生存細胞（即ち組織再生能力を
もった細胞) の回復を極端に制限するものである。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】上皮細胞の生きた培養
シートを保存することのできる凍結保存の手法論を提供
することが本発明の目的である。この方法論において
は、その方法とは創傷の治療に有用な上皮組織の形成を
可能にするため、シートの構造上の結合性を保ってお
り、さらにシートの細胞の有糸分裂能力を維持するもの
である。皮膚の創傷包帯としての有用性を維持できるよ
う、生きたままの培養上皮細胞のコンフルエントシート
を凍結保存する新規な方法が発見された。本方法によれ
ば、シート中の細胞のコロニー形成能を維持することが
できる、即ち健康な上皮の再生をすることのできるよう
な有糸分裂が可能な形で上皮細胞シート中に有意な数の
生細胞を保存することができる。本方法は、さらに、将
来使用するための凍結保存状態にシートを成熟させ、保
存したとき、培養上皮シートを回収することを可能にす
る。
シートを保存することのできる凍結保存の手法論を提供
することが本発明の目的である。この方法論において
は、その方法とは創傷の治療に有用な上皮組織の形成を
可能にするため、シートの構造上の結合性を保ってお
り、さらにシートの細胞の有糸分裂能力を維持するもの
である。皮膚の創傷包帯としての有用性を維持できるよ
う、生きたままの培養上皮細胞のコンフルエントシート
を凍結保存する新規な方法が発見された。本方法によれ
ば、シート中の細胞のコロニー形成能を維持することが
できる、即ち健康な上皮の再生をすることのできるよう
な有糸分裂が可能な形で上皮細胞シート中に有意な数の
生細胞を保存することができる。本方法は、さらに、将
来使用するための凍結保存状態にシートを成熟させ、保
存したとき、培養上皮シートを回収することを可能にす
る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本方法は以下のステップ
からなる。1)少なくとも、非細胞浸透性ガラス形成剤と
好ましくは細胞浸透性ガラス形成剤を含む凍結保存溶液
にシートを浸漬する。2)少なくとも -65℃、より好まし
くは-120℃（水のガラス転移温度) 以下、そしてとくに
好ましくはとくに長期保存の温度である-180℃以下にシ
ートを冷却して冷凍する。好ましい冷却方法として、液
体窒素の蒸発気雰囲気下で凡そ-180から-196℃の範囲で
冷却することが望ましい。3)さらに次の工程として、少
なくとも−65℃以下から凡そ-180℃の範囲にシートを保
存する。4)コロニー形成能が少なくとも35％、しばしば
40％で多くの場合50％以上である細胞からなる完全なシ
ートを調製するため融解を行う。
からなる。1)少なくとも、非細胞浸透性ガラス形成剤と
好ましくは細胞浸透性ガラス形成剤を含む凍結保存溶液
にシートを浸漬する。2)少なくとも -65℃、より好まし
くは-120℃（水のガラス転移温度) 以下、そしてとくに
好ましくはとくに長期保存の温度である-180℃以下にシ
ートを冷却して冷凍する。好ましい冷却方法として、液
体窒素の蒸発気雰囲気下で凡そ-180から-196℃の範囲で
冷却することが望ましい。3)さらに次の工程として、少
なくとも−65℃以下から凡そ-180℃の範囲にシートを保
存する。4)コロニー形成能が少なくとも35％、しばしば
40％で多くの場合50％以上である細胞からなる完全なシ
ートを調製するため融解を行う。
【００１５】凍結保護溶液は以下の成分を重量パーセン
トで含有している。非細胞浸透性ガラス形成剤約5-20
％、好ましくは15％、および細胞浸透性ガラス形成剤約
10％。細胞浸透性ガラス形成剤としてグリセロール、プ
ロピレングリコール、エチレングリコール、ジメチルス
ルフォオキシド(DMSO)あるいはそれらの混合物もしくは
誘導体を用いる。細胞浸透性ガラス形成剤としてはグリ
セロールが特に好ましい。非細胞浸透性ガラス形成剤と
してデキストラン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシ
ルエチル澱粉、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリ
コール、あるいはそれらの混合物もしくは誘導体を用い
る。デキストラン、ヒドロキシル澱粉が特に好ましい。
トで含有している。非細胞浸透性ガラス形成剤約5-20
％、好ましくは15％、および細胞浸透性ガラス形成剤約
10％。細胞浸透性ガラス形成剤としてグリセロール、プ
ロピレングリコール、エチレングリコール、ジメチルス
ルフォオキシド(DMSO)あるいはそれらの混合物もしくは
誘導体を用いる。細胞浸透性ガラス形成剤としてはグリ
セロールが特に好ましい。非細胞浸透性ガラス形成剤と
してデキストラン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシ
ルエチル澱粉、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリ
コール、あるいはそれらの混合物もしくは誘導体を用い
る。デキストラン、ヒドロキシル澱粉が特に好ましい。
【００１６】好ましい実施態様においては、凍結ステッ
プは少なくともおよそ-4℃からおよそ -80℃まではシー
トをゆるやかに冷却する必要がある。次いで、液体窒素
の蒸発気温度であるおよそ-180℃からおよそ-196℃の範
囲の温度まで冷却する。ゆるやかな冷却は、約１℃／分
の冷却率で行う。さらに好ましくは、融解ステップは空
気もしくは他のガスを使用して１分から５分の間、低い
保存温度から-120℃からおよそ -80℃までにシートを加
温することが必要である。つまり、加温率は約20℃／分
から約100 ℃／分とする。さらにシートはウオーターバ
スで培養するか、あるいは約20℃から約37℃の温度まで
上昇させることができる。
プは少なくともおよそ-4℃からおよそ -80℃まではシー
トをゆるやかに冷却する必要がある。次いで、液体窒素
の蒸発気温度であるおよそ-180℃からおよそ-196℃の範
囲の温度まで冷却する。ゆるやかな冷却は、約１℃／分
の冷却率で行う。さらに好ましくは、融解ステップは空
気もしくは他のガスを使用して１分から５分の間、低い
保存温度から-120℃からおよそ -80℃までにシートを加
温することが必要である。つまり、加温率は約20℃／分
から約100 ℃／分とする。さらにシートはウオーターバ
スで培養するか、あるいは約20℃から約37℃の温度まで
上昇させることができる。
【００１７】皮膚創傷包帯として使用する前に、融解シ
ートは、細胞を一時的に使用前に保存可能とするため、
凍結保護剤を使用せず、生理学的pHで、例えば等張緩衝
液、好ましくは乳酸リンゲル液で濯ぐ。本方法で使用す
るシートの上皮細胞は好ましくは培養ケラチノサイトで
ある。コンフルエントシートは何層かの細胞の厚みがあ
り、違った層から構成されている。
ートは、細胞を一時的に使用前に保存可能とするため、
凍結保護剤を使用せず、生理学的pHで、例えば等張緩衝
液、好ましくは乳酸リンゲル液で濯ぐ。本方法で使用す
るシートの上皮細胞は好ましくは培養ケラチノサイトで
ある。コンフルエントシートは何層かの細胞の厚みがあ
り、違った層から構成されている。
【００１８】培養ヒト上皮細胞シートは、皮膚創傷の治
療のため永久的な自己移植材料としての機能を果たすこ
とができる。一時的な他家移植材料としても、このシー
トは慢性的な皮膚潰瘍および、切除した部分の移植片提
供者の治療剤として使用することができるし、さらには
高い有効性を有する熱傷包帯として使用できる。シート
はラインワルドとグリーンにより開発された培養システ
ムにより調製できる。このシステムでは連続培養上皮細
胞は組織培養皿やフラスコの表面で速やかに分裂し、最
終的には、相互に強固に結合した細胞からなる、ゆるや
かな層状性の極性化したシートを形成する。培養シート
の断面の顕微鏡写真を図１に示した。層状化した上皮細
胞培養は、デスパーゼのような酵素を用いて処理するこ
とにより、結合性細胞シートとして剥がし、非付着性の
材料例えばワセリンやヴァセリンをしみ込ませたガーゼ
にはりつけて固定し、手術室まで培養液に入れて運び、
患者へ処置する。
療のため永久的な自己移植材料としての機能を果たすこ
とができる。一時的な他家移植材料としても、このシー
トは慢性的な皮膚潰瘍および、切除した部分の移植片提
供者の治療剤として使用することができるし、さらには
高い有効性を有する熱傷包帯として使用できる。シート
はラインワルドとグリーンにより開発された培養システ
ムにより調製できる。このシステムでは連続培養上皮細
胞は組織培養皿やフラスコの表面で速やかに分裂し、最
終的には、相互に強固に結合した細胞からなる、ゆるや
かな層状性の極性化したシートを形成する。培養シート
の断面の顕微鏡写真を図１に示した。層状化した上皮細
胞培養は、デスパーゼのような酵素を用いて処理するこ
とにより、結合性細胞シートとして剥がし、非付着性の
材料例えばワセリンやヴァセリンをしみ込ませたガーゼ
にはりつけて固定し、手術室まで培養液に入れて運び、
患者へ処置する。
【００１９】培養上皮細胞移植片の使用における重大な
制限となる事項は、その極端な脆さと保存期間の短さに
ある。移植片が８時間以上、その培養支持体から離れて
いる場合、最適な細胞条件の下で生育の回復とコロニー
形成のための分離細胞の能力を測定すると、移植片の細
胞生存性は、実質的に低下しているという実験結果が得
られている。このため、培養上皮細胞シートの販売は地
域的に限定されていた。即ち培養施設で分離を開始する
ために、培養に最初にデスパーゼを添加してから、少な
くとも８時間以内に移植片を準備し、輸送を行い、患者
に投与するために生産センター十分近い病院である必要
があった。移送の実際の時間は、移植片を調製するため
に時間を要するので 2.3時間しかなかった。手術室のス
ケジュールと移植片の到着時間は注意深くコーディネイ
トされなければならなかった。シートの保存はどのよう
な時間であっても不可能であったし、そのために用時調
製品の在庫を保持することができなっかった。
制限となる事項は、その極端な脆さと保存期間の短さに
ある。移植片が８時間以上、その培養支持体から離れて
いる場合、最適な細胞条件の下で生育の回復とコロニー
形成のための分離細胞の能力を測定すると、移植片の細
胞生存性は、実質的に低下しているという実験結果が得
られている。このため、培養上皮細胞シートの販売は地
域的に限定されていた。即ち培養施設で分離を開始する
ために、培養に最初にデスパーゼを添加してから、少な
くとも８時間以内に移植片を準備し、輸送を行い、患者
に投与するために生産センター十分近い病院である必要
があった。移送の実際の時間は、移植片を調製するため
に時間を要するので 2.3時間しかなかった。手術室のス
ケジュールと移植片の到着時間は注意深くコーディネイ
トされなければならなかった。シートの保存はどのよう
な時間であっても不可能であったし、そのために用時調
製品の在庫を保持することができなっかった。
【００２０】分離した上皮細胞シートの生存性がこのよ
うに短時間である理由を説明することは、観察によって
あきらかとなる。すなわち上皮細胞は、トリプシンとED
TA処理により培養体から分離した単細胞として、表面に
再結合することを防ぐような条件に一時的に保持された
場合に、分裂のためのポテンシャルを失い、最終的な分
化を起こすことが判明した。
うに短時間である理由を説明することは、観察によって
あきらかとなる。すなわち上皮細胞は、トリプシンとED
TA処理により培養体から分離した単細胞として、表面に
再結合することを防ぐような条件に一時的に保持された
場合に、分裂のためのポテンシャルを失い、最終的な分
化を起こすことが判明した。
【００２１】８時間以上に生存性を測定する実験により
以下のことが明らかとなった。即ちデスパーゼ処理をし
た移植片を保持する温度は、コロニー形成能(CFE) と回
復したコロニー形成細胞の全細胞数(CFCまたは回復全細
胞×CFE)によって測定する細胞生存性に極めてクリティ
カルな温度だった。生理学的温度条件と同等かやや低い
温度で培養上皮シートを保存すると、新鮮な組織のCFE
を保持することができない。同様に培地条件、pH、二酸
化炭素／酸素のバランス等を注意深く制御しても、４℃
での保存は明らかに確信できる効果をもたらさなかっ
た。仮に培養シートが限界温度範囲である10℃から25
℃、好ましくは13℃から23℃に保持された場合には、CF
E はおよそ 20-30時間以上も長く保持することができ
る。しかし、今のところ、創傷包帯としての有用性を保
持して、１日以上培養シートを保存する方法はない。創
傷治療の適用のため用時調製した物を保存品として保持
することは出来ないことである。
以下のことが明らかとなった。即ちデスパーゼ処理をし
た移植片を保持する温度は、コロニー形成能(CFE) と回
復したコロニー形成細胞の全細胞数(CFCまたは回復全細
胞×CFE)によって測定する細胞生存性に極めてクリティ
カルな温度だった。生理学的温度条件と同等かやや低い
温度で培養上皮シートを保存すると、新鮮な組織のCFE
を保持することができない。同様に培地条件、pH、二酸
化炭素／酸素のバランス等を注意深く制御しても、４℃
での保存は明らかに確信できる効果をもたらさなかっ
た。仮に培養シートが限界温度範囲である10℃から25
℃、好ましくは13℃から23℃に保持された場合には、CF
E はおよそ 20-30時間以上も長く保持することができ
る。しかし、今のところ、創傷包帯としての有用性を保
持して、１日以上培養シートを保存する方法はない。創
傷治療の適用のため用時調製した物を保存品として保持
することは出来ないことである。
【００２２】凍結保存方法の歴史を見ると、特定の細胞
を凍結保存するプロトコールの最適化は、ほかのタイプ
の細胞を用いたり、異なる種の同じタイプの細胞を用い
たり、組織中の他の細胞を用いたりする場合には、必ず
しも良い結果を示していないことがわかる。ケラチノサ
イトの浮遊液を凍結する方法では、完全なシートに適用
した場合、不満足な結果しか得られていない。実際に移
植に使用するための完全な組織を凍結することは、我々
の知る限り、どのような組織型であっても成功しなかっ
た（Canceda ほかによるEP O296475を参照のこと) 。
ここに開示してある培養基盤から分離した後の生きた培
養上皮細胞のコンフルエントシートを凍結保存する方法
は有糸分裂能や受入れ可能なレベルで細胞の形成能を保
持するか、シートの保全性を保持する。要約すれば、本
方法は４ステップからなる。最初に、細胞シートは、細
胞内及び細胞間の水を凍結保護剤と完全に混合するか置
換するために充分な時間、凍結保護溶液中で平衡化させ
る。第二に、シートは、氷晶形成と続くダメージを避け
るために凍結保護された細胞を充分にゆっくりした温度
降下率で、好ましくは約-180℃から-196℃に冷却する。
凍結したシートは、長期間の場合約-180℃で、短期間の
場合はもっと高温で、たとえば -65℃で保存できる。使
用前にシートは空気もしくは他のガスを使って 1-3分の
内に室温にて加温し、ついでたとえばウオーターバス中
で速やかに温めて、完全に融解する。第四に、凍結保護
剤は、乳酸リンゲル溶液などの等張緩衝液で培養上皮細
胞シートを濯いで除去する。
を凍結保存するプロトコールの最適化は、ほかのタイプ
の細胞を用いたり、異なる種の同じタイプの細胞を用い
たり、組織中の他の細胞を用いたりする場合には、必ず
しも良い結果を示していないことがわかる。ケラチノサ
イトの浮遊液を凍結する方法では、完全なシートに適用
した場合、不満足な結果しか得られていない。実際に移
植に使用するための完全な組織を凍結することは、我々
の知る限り、どのような組織型であっても成功しなかっ
た（Canceda ほかによるEP O296475を参照のこと) 。
ここに開示してある培養基盤から分離した後の生きた培
養上皮細胞のコンフルエントシートを凍結保存する方法
は有糸分裂能や受入れ可能なレベルで細胞の形成能を保
持するか、シートの保全性を保持する。要約すれば、本
方法は４ステップからなる。最初に、細胞シートは、細
胞内及び細胞間の水を凍結保護剤と完全に混合するか置
換するために充分な時間、凍結保護溶液中で平衡化させ
る。第二に、シートは、氷晶形成と続くダメージを避け
るために凍結保護された細胞を充分にゆっくりした温度
降下率で、好ましくは約-180℃から-196℃に冷却する。
凍結したシートは、長期間の場合約-180℃で、短期間の
場合はもっと高温で、たとえば -65℃で保存できる。使
用前にシートは空気もしくは他のガスを使って 1-3分の
内に室温にて加温し、ついでたとえばウオーターバス中
で速やかに温めて、完全に融解する。第四に、凍結保護
剤は、乳酸リンゲル溶液などの等張緩衝液で培養上皮細
胞シートを濯いで除去する。
【００２３】
【発明の実施の形態】以下に詳細な工程を開示する。培養上皮細胞シートの調製 上皮細胞（ケラチノサイト）は 10-12日でコンフルエン
スに達するような比重でT150培養フラスコ（コスター
ル）に播種する。数種の上皮細胞株から調製した凍結細
胞浮遊液の培養物は、他家移植用に使用できる。火傷患
者からバイオプシーにより得た細胞は自己移植用に使用
できる。培養はガス気密フラスコを使用して、37℃で、
FAD 培地（アデニン添加ハムス F12培地１部、ダルベッ
コ修正イーグル培地(DME)3部、10％ウシ胎児血清(FBS)
、 0.4μg ／mlヒドロコルチソン、１×10-10Mコレラ
トキシン、2 ×10-9M トリイオドチロニン) で行う。さ
らに致命的に放射した 3T3繊維芽の存在下で生育させ
る。米国特許 4,016,036号を参照のこと。10ng／mlの上
皮細胞成長因子は最初の接種に含まれる。
スに達するような比重でT150培養フラスコ（コスター
ル）に播種する。数種の上皮細胞株から調製した凍結細
胞浮遊液の培養物は、他家移植用に使用できる。火傷患
者からバイオプシーにより得た細胞は自己移植用に使用
できる。培養はガス気密フラスコを使用して、37℃で、
FAD 培地（アデニン添加ハムス F12培地１部、ダルベッ
コ修正イーグル培地(DME)3部、10％ウシ胎児血清(FBS)
、 0.4μg ／mlヒドロコルチソン、１×10-10Mコレラ
トキシン、2 ×10-9M トリイオドチロニン) で行う。さ
らに致命的に放射した 3T3繊維芽の存在下で生育させ
る。米国特許 4,016,036号を参照のこと。10ng／mlの上
皮細胞成長因子は最初の接種に含まれる。
【００２４】細胞培養物がコンフルエンスに達したら、
その細胞培養物を移植片の調製に使用する。上澄みの培
地は吸引し、40mlのデスパーゼII（ベーリンガーマンハ
イム）を最終濃度2.5mg/ml（約1.2U/ml)になるようにフ
ラスコに加え、37℃でインキュベートする。シートの端
が剥離したら（45分間) 、フラスコの上部をハンダゴテ
で焼いて取り除く。
その細胞培養物を移植片の調製に使用する。上澄みの培
地は吸引し、40mlのデスパーゼII（ベーリンガーマンハ
イム）を最終濃度2.5mg/ml（約1.2U/ml)になるようにフ
ラスコに加え、37℃でインキュベートする。シートの端
が剥離したら（45分間) 、フラスコの上部をハンダゴテ
で焼いて取り除く。
【００２５】酵素溶液は20mlのDME 培地に置換する。次
いで上皮細胞シートは20mlの DME培地でもう一度濯ぐ。
第２の濯ぎ液を3-4ml 残し、全溶液を吸引し、ワセリン
（Vaseline（登録商標）) をしみこませた 5×10cmのガ
ーゼ（チーズブロー ポンズ) をガーゼ包帯に面してい
る表面の細胞に重なるように剥離した細胞シートの上に
載せる。次いで結合性細胞シートを12-15 のステープル
（リガクリップ エチコン/J&J) で包帯に止めておく。
いで上皮細胞シートは20mlの DME培地でもう一度濯ぐ。
第２の濯ぎ液を3-4ml 残し、全溶液を吸引し、ワセリン
（Vaseline（登録商標）) をしみこませた 5×10cmのガ
ーゼ（チーズブロー ポンズ) をガーゼ包帯に面してい
る表面の細胞に重なるように剥離した細胞シートの上に
載せる。次いで結合性細胞シートを12-15 のステープル
（リガクリップ エチコン/J&J) で包帯に止めておく。
【００２６】シートは広めに切断し、固定し、そして移
植片を上皮細胞面を上にして 100mmの皿に移す。移植片
の端を浮き上がり防止のためにラバーポリスマンを使っ
て、皿に押さえておく。DME 12mlをゆるやかに加え、次
いで皿を保存用コンテナーに移す。（図１はこの方法に
よる典型的な培養シートの断面図を示したものであ
る。）細胞回復(R) とコロニー形成能分析(CFE) は有糸
分裂能力のある全細胞数(CFC) を確認するために行う。
この操作において、凍結保存工程の間の生存性を保護す
る最適条件が決定される。その条件とは凍結保護培地の
組成、凍結に先立つ凍結保護培地での平衡化時間、凍結
速度、保存温度、融解工程、濯ぎ工程、つづく保存など
についてである。
植片を上皮細胞面を上にして 100mmの皿に移す。移植片
の端を浮き上がり防止のためにラバーポリスマンを使っ
て、皿に押さえておく。DME 12mlをゆるやかに加え、次
いで皿を保存用コンテナーに移す。（図１はこの方法に
よる典型的な培養シートの断面図を示したものであ
る。）細胞回復(R) とコロニー形成能分析(CFE) は有糸
分裂能力のある全細胞数(CFC) を確認するために行う。
この操作において、凍結保存工程の間の生存性を保護す
る最適条件が決定される。その条件とは凍結保護培地の
組成、凍結に先立つ凍結保護培地での平衡化時間、凍結
速度、保存温度、融解工程、濯ぎ工程、つづく保存など
についてである。
【００２７】コロニー形成能(CFE) 分析は、凍結後１〜
３日の間保存した後、以下に示す例のように調製した移
植片を対象に行う。非凍結移植片をコントロールとして
分析する。固定クリップは鉗子を用いてはずし、準備の
できた細胞シートはトリプシン(0.05%) とEDTA(0.01%)
を含む等張緩衝液の単細胞浮遊液に分離させる。酵素反
応はウシ血清の添加で停止させ、続いて0.5ml の細胞浮
遊液を4.5ml のFAD に加えることによって10倍希釈を行
い、これを２回続けて行う。最初の細胞浮遊液のアリコ
ートは血球計を使って数える。最終細胞密度が1000-200
0 個／mlになるように細胞浮遊液を調製し、細胞浮遊液
１mlを、放射線照射で殺した 3T3細胞を含む12mlの FAD
培地をいれた100mm 皿に播く。
３日の間保存した後、以下に示す例のように調製した移
植片を対象に行う。非凍結移植片をコントロールとして
分析する。固定クリップは鉗子を用いてはずし、準備の
できた細胞シートはトリプシン(0.05%) とEDTA(0.01%)
を含む等張緩衝液の単細胞浮遊液に分離させる。酵素反
応はウシ血清の添加で停止させ、続いて0.5ml の細胞浮
遊液を4.5ml のFAD に加えることによって10倍希釈を行
い、これを２回続けて行う。最初の細胞浮遊液のアリコ
ートは血球計を使って数える。最終細胞密度が1000-200
0 個／mlになるように細胞浮遊液を調製し、細胞浮遊液
１mlを、放射線照射で殺した 3T3細胞を含む12mlの FAD
培地をいれた100mm 皿に播く。
【００２８】10-14日後、培養細胞はリン酸緩衝生理食
塩中の10％フォルマリンで固定し、１％ローダミンと１
％ナイルブルーＡの混合溶液で染色する。コロニーは解
剖用顕微鏡を用いてカウントし、発育しているか発育不
全かスコアーをつける。CFE は次のように計算する。 CFE ＝全コロニー数／平板培養細胞数
塩中の10％フォルマリンで固定し、１％ローダミンと１
％ナイルブルーＡの混合溶液で染色する。コロニーは解
剖用顕微鏡を用いてカウントし、発育しているか発育不
全かスコアーをつける。CFE は次のように計算する。 CFE ＝全コロニー数／平板培養細胞数
【００２９】回復パーセント、CFE パーセントはそれぞ
れ以下のように計算する。 (RFZ／ RFS）×100 ＝回復％ (FEFZ／ CFSFS )×100 ＝CFE ％ ここでは、FZは凍結、FSは新鮮を意味する。
れ以下のように計算する。 (RFZ／ RFS）×100 ＝回復％ (FEFZ／ CFSFS )×100 ＝CFE ％ ここでは、FZは凍結、FSは新鮮を意味する。
【００３０】コロニー形成細胞(CFC) の全回復は以下の
計算による。 CFC= 全回復細胞の率 × 回復コロニー形成能(CFE)
の率 CFC=(CFEFZ× RFZ／ CFSFS× RFS) ×100
計算による。 CFC= 全回復細胞の率 × 回復コロニー形成能(CFE)
の率 CFC=(CFEFZ× RFZ／ CFSFS× RFS) ×100
【００３１】本発明のプロトコールを使用した場合のCF
E%は通常35％を超えており、一般的には40％を超え、し
ばしば50％かそれ以上に達する。
E%は通常35％を超えており、一般的には40％を超え、し
ばしば50％かそれ以上に達する。
【００３２】凍結保存プロトコール 凍結保存の方法の開発には、最終的な工程を特定するた
めに、独立した研究を積み重ねて、最適要素をつなぎ合
わせて、工程のそれぞれの要素を最適化することが必要
である。最大の生存性の維持と適合する、最適な凍結、
保存、融解、濯ぎの工程それぞれは特定することが必要
である。これらの要素は先に述べたようにコロニー形成
能分析によって特定する。
めに、独立した研究を積み重ねて、最適要素をつなぎ合
わせて、工程のそれぞれの要素を最適化することが必要
である。最大の生存性の維持と適合する、最適な凍結、
保存、融解、濯ぎの工程それぞれは特定することが必要
である。これらの要素は先に述べたようにコロニー形成
能分析によって特定する。
【００３３】標準的な凍結保存培地は、ウシ血清、グリ
セロール、細胞浸透性ガラス形成剤を添加した生理学的
均合塩溶液（例えば細胞培養培地）よりなっている。浮
遊状態に細胞を凍結保存することでは成功するが、細胞
シートから取り出した細胞の生存性を保存するための能
力としては、よくわかっていない。図２は標準的な凍結
保存培地に付加成分、非細胞浸透性ガラス形成剤（デキ
ストランなど）を補った場合の有益な効果を示す。非細
胞浸透性剤を細胞浸透性剤と一緒に使った場合、細胞浸
透性剤のみで使用した場合と比較して細胞の回復、従っ
て生存性(CFC)が大幅に向上することは注目しなければ
ならない。
セロール、細胞浸透性ガラス形成剤を添加した生理学的
均合塩溶液（例えば細胞培養培地）よりなっている。浮
遊状態に細胞を凍結保存することでは成功するが、細胞
シートから取り出した細胞の生存性を保存するための能
力としては、よくわかっていない。図２は標準的な凍結
保存培地に付加成分、非細胞浸透性ガラス形成剤（デキ
ストランなど）を補った場合の有益な効果を示す。非細
胞浸透性剤を細胞浸透性剤と一緒に使った場合、細胞浸
透性剤のみで使用した場合と比較して細胞の回復、従っ
て生存性(CFC)が大幅に向上することは注目しなければ
ならない。
【００３４】図３は非細胞浸透性ガラス形成剤を使用
し、生存性が向上したことを示している。これらの薬剤
は複雑な炭水化物の高分子構造をとっている。非細胞浸
透性ガラス形成剤は好ましくはおよそ50-500キロダルト
ン(kd)の高分子デキストラン、好ましくは50-70kd のコ
ンドロイチン硫酸、ポロビニールピロリドン、ポリエチ
レングリコール、ヒドロキシエチル澱粉のような変異化
澱粉をあげることができる。細胞浸透性ガラス形成剤は
グリセロールが好ましいが、プロピレングリコール、エ
チレングリコール、ジメチルスルフォキシド、および先
行技術により知られた他の浸透性ガラス形成剤も使用す
ることができる。
し、生存性が向上したことを示している。これらの薬剤
は複雑な炭水化物の高分子構造をとっている。非細胞浸
透性ガラス形成剤は好ましくはおよそ50-500キロダルト
ン(kd)の高分子デキストラン、好ましくは50-70kd のコ
ンドロイチン硫酸、ポロビニールピロリドン、ポリエチ
レングリコール、ヒドロキシエチル澱粉のような変異化
澱粉をあげることができる。細胞浸透性ガラス形成剤は
グリセロールが好ましいが、プロピレングリコール、エ
チレングリコール、ジメチルスルフォキシド、および先
行技術により知られた他の浸透性ガラス形成剤も使用す
ることができる。
【００３５】凍結保存工程の初めには、凍結保護培地中
で凍結させるために細胞シートを、凍結保護剤と細胞を
平衡化するさせるために、充分な時間浸漬させる必要が
ある。図４は、凍結前に凍結保護剤に対して培養上皮シ
ートを長時間平衡化した場合の生存性に対する効果を示
したものである。データは、凍結保存シート中の細胞の
生存性に影響せずに、シートを凍結前に凍結保護剤に２
時間まで平衡化させることができることを示している。
平衡化は、典型的な条件として、およそ 30-60分間、17
℃から25℃で、通常は室温で薄型保存用皿中の凍結保護
溶液の中で行う。
で凍結させるために細胞シートを、凍結保護剤と細胞を
平衡化するさせるために、充分な時間浸漬させる必要が
ある。図４は、凍結前に凍結保護剤に対して培養上皮シ
ートを長時間平衡化した場合の生存性に対する効果を示
したものである。データは、凍結保存シート中の細胞の
生存性に影響せずに、シートを凍結前に凍結保護剤に２
時間まで平衡化させることができることを示している。
平衡化は、典型的な条件として、およそ 30-60分間、17
℃から25℃で、通常は室温で薄型保存用皿中の凍結保護
溶液の中で行う。
【００３６】平衡化の次に、シートと凍結保護溶液を入
れた皿は、ガス及び水を透過しないようにシールしてお
く。シールしたコンテナー中のシートは、少なくとも -
65℃（ドライアイスを使い) 、好ましくは-120℃に、さ
らに長期間保存するためにはおよそ-180℃から-196℃に
冷却する。冷却速度は、０℃から -80℃まではゆっくり
と行う(1℃／分以下) 。これは氷結晶の形成を抑制する
ために役立つ。好ましくは、冷却は、 -40℃から-100℃
の温度に、好ましくは -80℃から -85℃に市販のプログ
ラムセルフリーザー（クリモンド社製No.1010/2700）の
ような冷却比率調整冷却装置によって最初に行う。次い
で液体窒素保存容器に移し、その温度をさらに下げるた
めに液体窒素の蒸気中で維持する。
れた皿は、ガス及び水を透過しないようにシールしてお
く。シールしたコンテナー中のシートは、少なくとも -
65℃（ドライアイスを使い) 、好ましくは-120℃に、さ
らに長期間保存するためにはおよそ-180℃から-196℃に
冷却する。冷却速度は、０℃から -80℃まではゆっくり
と行う(1℃／分以下) 。これは氷結晶の形成を抑制する
ために役立つ。好ましくは、冷却は、 -40℃から-100℃
の温度に、好ましくは -80℃から -85℃に市販のプログ
ラムセルフリーザー（クリモンド社製No.1010/2700）の
ような冷却比率調整冷却装置によって最初に行う。次い
で液体窒素保存容器に移し、その温度をさらに下げるた
めに液体窒素の蒸気中で維持する。
【００３７】好ましい凍結プロトコールでは、組織がお
およそ４℃となるまでシールしたコンテナー中のシート
を冷却する。次いでそのシートは１分間に１℃ずつ冷却
する。シートの温度が少なくとも -65℃に下げた後、好
ましくは -85℃に下げた後、コンテナーは液体窒素冷凍
庫に移し、約-180℃ (窒素蒸気) または-196℃ (液体窒
素) で保存する。
およそ４℃となるまでシールしたコンテナー中のシート
を冷却する。次いでそのシートは１分間に１℃ずつ冷却
する。シートの温度が少なくとも -65℃に下げた後、好
ましくは -85℃に下げた後、コンテナーは液体窒素冷凍
庫に移し、約-180℃ (窒素蒸気) または-196℃ (液体窒
素) で保存する。
【００３８】-180℃かまたはそれ以下での組織の保存は
図５に示すように、それよりも高い温度でシートを保存
するよりも細胞のコロニー形成能を維持することができ
る。液体窒素蒸気を用いて-180℃で保存することは機械
式フリーザーを使用して -80℃で保存したり、ドライア
イスを用いて -77℃で保存したりするよりも優れている
ことは、データにより明らかである。 -80℃や -77℃で
の保存では初めの２日または３日の間に生存性は劇的に
減少する。対照的に-180℃での生存性はより長期間安定
である。移植片は好ましくは-180℃で輸送する。
図５に示すように、それよりも高い温度でシートを保存
するよりも細胞のコロニー形成能を維持することができ
る。液体窒素蒸気を用いて-180℃で保存することは機械
式フリーザーを使用して -80℃で保存したり、ドライア
イスを用いて -77℃で保存したりするよりも優れている
ことは、データにより明らかである。 -80℃や -77℃で
の保存では初めの２日または３日の間に生存性は劇的に
減少する。対照的に-180℃での生存性はより長期間安定
である。移植片は好ましくは-180℃で輸送する。
【００３９】シートを融解するためにはシールしたコン
テナーを液体窒素冷凍庫から移し、空気中で室温におよ
び１分間からおよそ 3-5分間保持する。これは20℃／分
から100 ℃／分の間の加温比率を生み出す。それから、
移植片は加温比率にかかわらず室温に温められる。好ま
しくは、最終段階では、移植片が融解するまでウオータ
ーバスにシールしたコンテナーを沈めておく。これによ
り、凍結シートがひび割れない。融解は、37℃のウオー
ターバスに1.25分漬けておくことで行うことができる。
ウオーターバスの温度が25℃であれば、融解はおよそ
1.5分で行われる。ウオーターバスを省略して、かわり
に室温でシートを融解することができる。しかし、この
場合は27分必要であり、しばしば細胞の生存性を低下さ
せる。
テナーを液体窒素冷凍庫から移し、空気中で室温におよ
び１分間からおよそ 3-5分間保持する。これは20℃／分
から100 ℃／分の間の加温比率を生み出す。それから、
移植片は加温比率にかかわらず室温に温められる。好ま
しくは、最終段階では、移植片が融解するまでウオータ
ーバスにシールしたコンテナーを沈めておく。これによ
り、凍結シートがひび割れない。融解は、37℃のウオー
ターバスに1.25分漬けておくことで行うことができる。
ウオーターバスの温度が25℃であれば、融解はおよそ
1.5分で行われる。ウオーターバスを省略して、かわり
に室温でシートを融解することができる。しかし、この
場合は27分必要であり、しばしば細胞の生存性を低下さ
せる。
【００４０】融解したシートは１時間以内、好ましくは
可能な限り速やかに、凍結保護剤から取り出す。一度シ
ートが融解したら、コンテナーを開け、凍結保護剤を希
釈するために、凍結保存溶液を生理的なpH（約6.8-7.4)
の等張緩衝液、好ましくはFAD 培地や乳酸リンゲル液に
交換する。表1Aに、生理的pHの等張緩衝液のすべてが凍
結保護剤の希釈に役立つとは限らないことを示す。リン
酸緩衝生理食塩と標準生理食塩はCFE で判定した場合、
明らかに生存性を低下させる。融解したシートは、好ま
しくは15分間緩衝液で平衡化する。また４時間まで CFE
をゆるやかに低下させて放置させることができる。（表
５）
可能な限り速やかに、凍結保護剤から取り出す。一度シ
ートが融解したら、コンテナーを開け、凍結保護剤を希
釈するために、凍結保存溶液を生理的なpH（約6.8-7.4)
の等張緩衝液、好ましくはFAD 培地や乳酸リンゲル液に
交換する。表1Aに、生理的pHの等張緩衝液のすべてが凍
結保護剤の希釈に役立つとは限らないことを示す。リン
酸緩衝生理食塩と標準生理食塩はCFE で判定した場合、
明らかに生存性を低下させる。融解したシートは、好ま
しくは15分間緩衝液で平衡化する。また４時間まで CFE
をゆるやかに低下させて放置させることができる。（表
５）
【００４１】
【表１】融解後凍結保存培養上皮移植片からの凍結保護
培地の除去 濯ぎ液として生理学的pHの等張緩衝液を使用緩衝液 コロニー形成細胞数（％） rCFE FAD 9.0 35.0 PBS 3.4 13.1 正常生理食塩 3.0 11.5
培地の除去 濯ぎ液として生理学的pHの等張緩衝液を使用緩衝液 コロニー形成細胞数（％） rCFE FAD 9.0 35.0 PBS 3.4 13.1 正常生理食塩 3.0 11.5
【００４２】移植片は凍結保護培地から取り出され、濯
ぎ溶液に入れて室温に15分間静置した。コロニー形成能
分析をし、CFE 回復(rCFE)は非凍結、非保存コントロー
ル移植片の％として計算した。FAD ;F12/DMEケラチノサ
イト増殖培地、PBS;リン酸緩衝生理食塩、正常生理食
塩;0.9% 生理食塩
ぎ溶液に入れて室温に15分間静置した。コロニー形成能
分析をし、CFE 回復(rCFE)は非凍結、非保存コントロー
ル移植片の％として計算した。FAD ;F12/DMEケラチノサ
イト増殖培地、PBS;リン酸緩衝生理食塩、正常生理食
塩;0.9% 生理食塩
【００４３】
【表２】融解移植片濯ぎ時間増加の効果時間 コロニー形成細胞数（％） rCFE 1 時間 6.4 71.1 2 時間 5.2 57.8 4 時間 4.5 50.0
【００４４】移植片は凍結保護培地から取り出され、FA
D 濯ぎ溶液に入れて室温に上記に示された一定時間静置
した。コロニー形成能分析をし、CFE 回復(rCFE)は非凍
結、非保存コントロール移植片の％として計算した。
D 濯ぎ溶液に入れて室温に上記に示された一定時間静置
した。コロニー形成能分析をし、CFE 回復(rCFE)は非凍
結、非保存コントロール移植片の％として計算した。
【００４５】凍結保存の最終工程を制限するものについ
ては試験を行い、図６に示している。生存しさらに正常
な代謝機能の回復した完全な細胞シートの生産には、培
養上皮シートは凍結前に 1時間まで凍結保護剤中で平衡
化し、凍結、融解、凍結保護剤中への残置は１時間まで
かけ、最終的に乳酸リンゲル溶液中の濯ぎは２時間まで
おこなうことをこのデータは示している。
ては試験を行い、図６に示している。生存しさらに正常
な代謝機能の回復した完全な細胞シートの生産には、培
養上皮シートは凍結前に 1時間まで凍結保護剤中で平衡
化し、凍結、融解、凍結保護剤中への残置は１時間まで
かけ、最終的に乳酸リンゲル溶液中の濯ぎは２時間まで
おこなうことをこのデータは示している。
【００４６】上に開示したようにして調製されたシート
は、創傷の表面に接触する発育する層をもち包帯として
ガーゼ裏打ちを使用して、火傷や潰瘍などの清浄な皮膚
創傷を外科的に覆うことができる。他家移植シートは実
際には脱落するが、拒絶の前に、安全かつ効果的な創傷
の保護に役立つ。自己移植シートは一般的には永久的で
あり、完全に層状化した皮膚を形成するまで分化する。
この凍結保存方法で行った高いCFC とCFE 値は、シート
中の個々の細胞の大多数が有糸分裂能があり、多数の上
皮細胞コロニーが創傷部分に形成されることを意味して
いる。
は、創傷の表面に接触する発育する層をもち包帯として
ガーゼ裏打ちを使用して、火傷や潰瘍などの清浄な皮膚
創傷を外科的に覆うことができる。他家移植シートは実
際には脱落するが、拒絶の前に、安全かつ効果的な創傷
の保護に役立つ。自己移植シートは一般的には永久的で
あり、完全に層状化した皮膚を形成するまで分化する。
この凍結保存方法で行った高いCFC とCFE 値は、シート
中の個々の細胞の大多数が有糸分裂能があり、多数の上
皮細胞コロニーが創傷部分に形成されることを意味して
いる。
【００４７】本発明を次の非限定的実施例により更に説
明する。
明する。
【００４８】
【実施例１】回収した培養移植片を15% デキストラン(7
0,000mw)と10％グリセロールからなる凍結保護剤を含む
培養液をいれた、浅い保存用皿にいれる。コンテナーは
ガスと水が透過しないようにシールし、そして充分に溶
液をいれて、ほとんど空間が残らないようにし、移植片
を室温で30分間平衡化する。このシートは組織片が約４
℃になるまでシールしたコンテナー中で冷却する。シー
トは、次いでおよそ -85℃まで、１分間に１℃ずつ冷却
してゆく。シートの温度が -85℃に達したらコンテナー
は液体窒素冷凍庫に移し、液体窒素蒸気中で保存する
（約-180℃）。
0,000mw)と10％グリセロールからなる凍結保護剤を含む
培養液をいれた、浅い保存用皿にいれる。コンテナーは
ガスと水が透過しないようにシールし、そして充分に溶
液をいれて、ほとんど空間が残らないようにし、移植片
を室温で30分間平衡化する。このシートは組織片が約４
℃になるまでシールしたコンテナー中で冷却する。シー
トは、次いでおよそ -85℃まで、１分間に１℃ずつ冷却
してゆく。シートの温度が -85℃に達したらコンテナー
は液体窒素冷凍庫に移し、液体窒素蒸気中で保存する
（約-180℃）。
【００４９】シートを融解するためには、シールしたコ
ンテナーを液体窒素フリーザーから取り出し、おおよそ
１分間、空気中で室温に放置する。ついで37℃のウオー
ターバス中に約75秒間置き、融解させる。融解後、コン
テナーを開け、シートを生理学的pHにした乳酸リンゲル
溶液に５分間つける。次いで、緩衝液を交換し、シート
を少なくとも10分間、培地中で平衡化させる。
ンテナーを液体窒素フリーザーから取り出し、おおよそ
１分間、空気中で室温に放置する。ついで37℃のウオー
ターバス中に約75秒間置き、融解させる。融解後、コン
テナーを開け、シートを生理学的pHにした乳酸リンゲル
溶液に５分間つける。次いで、緩衝液を交換し、シート
を少なくとも10分間、培地中で平衡化させる。
【００５０】
【実施例２】移植片は、15％ヒドロキシエチル澱粉(Hes
pan(登録商標))および10％グリセロールからなる凍結保
護溶液に入れた浅い保存用皿中で室温、15分間平衡化す
る。平衡化後、コンテナーはガス及び水が透過しないよ
うにシールされる。シールしたコンテナー中のシートは
組織がおよそ４℃になるまで冷却する。このステップに
続き、シートはおよそ -85℃まで１分間に１℃ずつ冷却
してゆく。シートが -85℃に達したら、液体窒素冷凍庫
に移し、液体窒素で保存する（約-196℃) 。
pan(登録商標))および10％グリセロールからなる凍結保
護溶液に入れた浅い保存用皿中で室温、15分間平衡化す
る。平衡化後、コンテナーはガス及び水が透過しないよ
うにシールされる。シールしたコンテナー中のシートは
組織がおよそ４℃になるまで冷却する。このステップに
続き、シートはおよそ -85℃まで１分間に１℃ずつ冷却
してゆく。シートが -85℃に達したら、液体窒素冷凍庫
に移し、液体窒素で保存する（約-196℃) 。
【００５１】シートを融解するためには、シールしたコ
ンテナーを液体窒素フリーザーから取り出し、おおよそ
１分間、空気中で室温に放置する。ついでウオーターバ
ス中に置き、融解させる。融解後、コンテナーを開け、
シートを生理学的pHにした乳酸リンゲル溶液または無血
清DME/F12 ケラチノサイト生育培地に５分間つける。５
分後、緩衝液を交換し、シートを４時間、培地中で平衡
化させる。本発明は他の特定の形態で実施できる。他の
実施も次の特許請求の範囲に含まれる。
ンテナーを液体窒素フリーザーから取り出し、おおよそ
１分間、空気中で室温に放置する。ついでウオーターバ
ス中に置き、融解させる。融解後、コンテナーを開け、
シートを生理学的pHにした乳酸リンゲル溶液または無血
清DME/F12 ケラチノサイト生育培地に５分間つける。５
分後、緩衝液を交換し、シートを４時間、培地中で平衡
化させる。本発明は他の特定の形態で実施できる。他の
実施も次の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】デスパーゼにより培養フラスコから遊離させた
層状培養ケラチノサイトシートの断面図である。本発明
の方法を用いた層状培養ケラチノサイトシートの代表的
な顕微鏡写真である。
層状培養ケラチノサイトシートの断面図である。本発明
の方法を用いた層状培養ケラチノサイトシートの代表的
な顕微鏡写真である。
【図２】凍結保護に非細胞浸透性剤を使用した場合の効
果を棒グラフで示す。培養ケラチノサイトシートは10％
グリセロールを含む凍結保存培養(CPM) 中に６分間(gly
c-6) 、ついで30分間(gly c-30)平衡化させるか、15％
デキストラン(70 kd) を含む10％グリセロールを含む凍
結保存培養(CPM) 中に30分間平衡化させ、その後-180℃
に冷却し、-180℃で 2-3日保存した。融解後、生存性
は、全細胞回復(R)、コロニー形成能(CFE) 、細胞シー
トの分解後のコロニー形成細胞(CFC) の生存性などを評
価して測定した。；CFC=回復細胞×回復細胞のCFE(非凍
結、非保存のコントロールシートをパーセントで表現し
た)
果を棒グラフで示す。培養ケラチノサイトシートは10％
グリセロールを含む凍結保存培養(CPM) 中に６分間(gly
c-6) 、ついで30分間(gly c-30)平衡化させるか、15％
デキストラン(70 kd) を含む10％グリセロールを含む凍
結保存培養(CPM) 中に30分間平衡化させ、その後-180℃
に冷却し、-180℃で 2-3日保存した。融解後、生存性
は、全細胞回復(R)、コロニー形成能(CFE) 、細胞シー
トの分解後のコロニー形成細胞(CFC) の生存性などを評
価して測定した。；CFC=回復細胞×回復細胞のCFE(非凍
結、非保存のコントロールシートをパーセントで表現し
た)
【図３】デキストランとヘスパン（ヒドロキシルエチル
澱粉) の凍結保存培養上皮移植片の生存性に及ぼす効果
を棒グラフで示す。移植片は、10％グリセロールに15％
ヘスパン、15％デキストラン(70kd)または、15％デキス
トラン(500kd) のいずれかを含むCPM 中に平衡化させ、
-180℃に冷却し、２日間保存した。融解後の生存性はR
、CFE 、CFC を評価して測定した。非凍結、非保存コ
ントロール移植片のパーセントで表現した。
澱粉) の凍結保存培養上皮移植片の生存性に及ぼす効果
を棒グラフで示す。移植片は、10％グリセロールに15％
ヘスパン、15％デキストラン(70kd)または、15％デキス
トラン(500kd) のいずれかを含むCPM 中に平衡化させ、
-180℃に冷却し、２日間保存した。融解後の生存性はR
、CFE 、CFC を評価して測定した。非凍結、非保存コ
ントロール移植片のパーセントで表現した。
【図４】凍結保存培養上皮移植片の生存性に及ぼす凍結
前の凍結保護培地の効果を棒グラフで示す。移植片は、
室温で10％グリセロールに15％デキストラン(70kd)を含
む凍結保存培地に、30、60、120 分平衡化させた。融解
後、移植片の細胞はR 、CFE 、CFC を検定した。結果は
コントロール移植片のパーセントで表現した。
前の凍結保護培地の効果を棒グラフで示す。移植片は、
室温で10％グリセロールに15％デキストラン(70kd)を含
む凍結保存培地に、30、60、120 分平衡化させた。融解
後、移植片の細胞はR 、CFE 、CFC を検定した。結果は
コントロール移植片のパーセントで表現した。
【図５】凍結保存培養上皮移植片の生存性に及ぼす保存
温度の効果を棒グラフで示す。移植片は、室温で10％グ
リセロールに15％デキストランを含む凍結保存培地で、
30分平衡化し、 -85℃で凍結し、液体窒素蒸気中で-180
℃で保存するか、 -80℃で機械式フリーザーで保存する
か、固形二酸化炭素（ドドライアイス、昇華点 -77℃)
を用いて -65℃で保存するかした。融解後移植片のR 、
CFE 、CFC を測定した。結果をコントロール移植片とし
て非凍結、非保存移植のパーセントで表現した。
温度の効果を棒グラフで示す。移植片は、室温で10％グ
リセロールに15％デキストランを含む凍結保存培地で、
30分平衡化し、 -85℃で凍結し、液体窒素蒸気中で-180
℃で保存するか、 -80℃で機械式フリーザーで保存する
か、固形二酸化炭素（ドドライアイス、昇華点 -77℃)
を用いて -65℃で保存するかした。融解後移植片のR 、
CFE 、CFC を測定した。結果をコントロール移植片とし
て非凍結、非保存移植のパーセントで表現した。
【図６】凍結保存培養上皮移植片の融解処理後の効果を
棒グラフで示す。移植片は、凍結前に、凍結保存培地
に、60分平衡化した。-180℃で 1-3日間、凍結保存後、
移植片は速やかに融解させた。融解後0 、30、60分後CP
M から取り出し、１から２時間乳酸リンゲル液で濯い
だ。処理後の移植片の細胞回復、CFE 、CFC を測定し、
コントロール移植片として非凍結、非保存移植片のパー
セントで表現した。
棒グラフで示す。移植片は、凍結前に、凍結保存培地
に、60分平衡化した。-180℃で 1-3日間、凍結保存後、
移植片は速やかに融解させた。融解後0 、30、60分後CP
M から取り出し、１から２時間乳酸リンゲル液で濯い
だ。処理後の移植片の細胞回復、CFE 、CFC を測定し、
コントロール移植片として非凍結、非保存移植片のパー
セントで表現した。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年１０月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (72)発明者 スーザン エフ．シェーファー アメリカ合衆国 01778 マサチューセッ ツ， ウェイランド，ハッピー ハロー ロード ５ (72)発明者 アレキサンダー シャーマー アメリカ合衆国 02178 マサチューセッ ツ， ベルモント，フレデリック ストリ ート 15 (72)発明者 リチャード オデッセイ アメリカ合衆国 02162 マサチューセッ ツ， ニュートン ロウアー フォール ズ，クレホア ドライブ 15
Claims (28)
- 【請求項１】 次のステップからなる、凍結保存状態で
生存する上皮細胞の結合性シートを維持するための改良
された方法。 A. 培養し、ゆるやかに層状化したその培養基盤から分
離した上皮細胞のシートを供給する。 B. 細胞浸透性ガラス形成剤と組み合わせた非細胞浸透
性ガラス形成剤を含む凍結保護溶液に上記培養シートを
浸漬する。 C. 凍結保護溶液中のシートの温度を約 -65℃かそれ以
下になるように冷却する。 D. ステップC の操作で得たシートを約 -65℃かそれ以
下の温度で保存する。 E. 層状化する分化能力のある、生存細胞の完全な有糸
分裂能のあるシートを調製するために凍結保存したシー
トを融解するステップであり、上記の完全なシートは皮
膚創傷包帯として有用である。 - 【請求項２】 凍結保護溶液が上記の非細胞浸透性ガラ
ス形成剤を約５％から約20％含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 非細胞浸透性ガラス形成剤がデキストラ
ン、ポリエチレングリコール、ポリビニールピロリド
ン、ヒドロキシエチル澱粉、コンドロイチン硫酸、およ
びこれらの混合物および誘導体からなる群から選択され
たものである請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 非細胞浸透性ガラス形成剤がデキストラ
ン、またはヒドロキシエチル澱粉である請求項１記載の
方法。 - 【請求項５】 ガラス形成剤が分子量およそ70キロダル
トンから 500キロダルトンであるデキストランである請
求項４記載の方法。 - 【請求項６】 凍結保護溶液が、グリセロール、ジメチ
ルスルフォオキサイド、およびこれらの混合物および誘
導体からなる群から選択されたものである細胞浸透性ガ
ラス形成剤を約10重量％含む物である請求項１記載の方
法。 - 【請求項７】 細胞浸透性ガラス形成剤がグリセロール
である請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 浸漬ステップが凍結保存溶液にシートが
平衡化するために充分な時間行われる請求項１記載の方
法。 - 【請求項９】 浸漬ステップが15分から 180分間行われ
る請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 上記の凍結保護溶液に17° -30℃で 1
20分間シートを浸漬し、それから60分以内、４℃に冷却
する請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 冷却のステップが約４℃から約 -80℃
以下までシートを冷却するために１分間に約１℃の比率
で行われる請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 シートをゆっくりとおよそ-80 ℃に冷
却し、次いで温度範囲を-180℃からそれ以下に冷却する
請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 冷却と保存ステップが-120℃からそれ
以下にする請求項１記載の方法。 - 【請求項１４】 冷却と保存のステップが硬質、透明、
無菌、ガス不透過性コンテナー中で行われる請求項１記
載の方法。 - 【請求項１５】 冷却と保存のステップが、保存期間が
延長できるおよそ-180℃からそれ以下の温度で行われる
請求項１記載の方法。 - 【請求項１６】 約-180℃以下の温度でシートを冷却
し、そして-120℃から-80℃までの温度範囲にシートを
融解させることがシートをガス中でインキュベートする
ことによりなされ、それに続く融解が、溶液中に浸漬す
ることによってなされる請求項１記載の方法。 - 【請求項１７】 融解ステップが、約１分から５分間の
間一度 -80℃までシートを加温し、次いで室温まで上げ
ることからなる請求項１記載の方法。 - 【請求項１８】 次のステップが、追加された請求項１
記載の方法。 E. 約４時間まで均合塩溶液に移すことにより、上記シ
ートの生存性を維持するため融解シートから凍結保護剤
を除去する。 - 【請求項１９】 均合塩溶液がDME/F12 のような培養液
であるかまたは乳酸リンゲル液である請求項18記載の方
法。 - 【請求項２０】 ステップB が液体窒素蒸気にシートを
曝すことによりなされる請求項１記載の方法。 - 【請求項２１】 上皮細胞がケラチノサイトである請求
項１記載の方法。 - 【請求項２２】 生存性細胞の完全なシートが少なくと
も35％のコロニー形成能で特徴づけられる請求項１記載
の方法。 - 【請求項２３】 生存性細胞の完全なシートが少なくと
も40％の細胞回復で特徴つげられる請求項１記載の方
法。 - 【請求項２４】 ステップB に先立って支持体にシート
を設置する追加ステップを含む請求項１記載の方法。 - 【請求項２５】 患者への皮膚創傷包帯として適用する
ための準備のため、約-180℃以下の温度で、凍結保護剤
を染み込ませた上皮細胞の培養シートを処理するための
方法であって、その方法がシートの温度を１分間に20℃
から１分間に100℃の間の比率で-120℃から -80℃の範
囲であげ、その後20℃から37℃のあいだの温度にあげる
ステップからなる方法。 - 【請求項２６】 シートをガスに曝すことにより約 -80
℃の温度にあげ、ついで溶液中で20℃から37℃の間の温
度に加温する請求項25記載の方法。 - 【請求項２７】 およそ４時間まで、均合塩溶液中で上
記シートをインキュベートすることにより、上記シート
を浸漬する凍結保護剤を除去する付加ステップを含む請
求項25の方法。 - 【請求項２８】 上記デキストランが細胞浸透性剤グリ
セロールと組み合わせてある請求項５記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8255454A JPH09110601A (ja) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | 培養上皮細胞シートの凍結保存 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8255454A JPH09110601A (ja) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | 培養上皮細胞シートの凍結保存 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3511450A Division JP2722134B2 (ja) | 1990-06-04 | 1991-05-21 | 培養上皮細胞シートの凍結保存 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09110601A true JPH09110601A (ja) | 1997-04-28 |
Family
ID=17279000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8255454A Pending JPH09110601A (ja) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | 培養上皮細胞シートの凍結保存 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09110601A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005239690A (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-08 | Toshitsugu Kawada | 抜歯体の凍結保存方法、移植方法及び運搬用保存液 |
| WO2010046949A1 (ja) * | 2008-10-22 | 2010-04-29 | Inui Hiroaki | 細胞をガラス化保存する方法および細胞のガラス化保存用容器 |
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-
1996
- 1996-09-05 JP JP8255454A patent/JPH09110601A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02174848A (ja) * | 1988-10-14 | 1990-07-06 | Tutortec Inc | 表皮シート並びにその製法、貯蔵方法および用途 |
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