KR100260483B1

KR100260483B1 - Rna 비루스에 대하여 저항성을 갖는 식물 제조방법

Info

Publication number: KR100260483B1
Application number: KR1019930703916A
Authority: KR
Inventors: 이사오 이시다; 요시미 오까다
Original assignee: 마나배 게이사꾸; 기린 비이루 가부시키가이샤
Priority date: 1992-04-17
Filing date: 1993-04-16
Publication date: 2000-07-01
Anticipated expiration: 2013-04-16
Also published as: PT592685E; EP0592685B1; CA2111565A1; EP0592685A4; AU656676B2; AU3905893A; DE69331216T2; WO1993020686A1; ES2169040T3; US5491080A; ATE209683T1; JP3336307B2; JP2000287569A; KR940701212A; JP3110460B2; EP0592685A1; DE69331216D1; BR9305489A; DK0592685T3

Abstract

본 발명은, 2개쇄 RNA를 특이적으로 분해하는 효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA배열을 식물염색체중에 짜넣어서 발현시킴으로써 RNA비루스에 대해서 저항성을 갖는 식물을 제조하는 방법, 및 그와같은 방법으로 얻어진 RNA비루스에 대해서 저항성을 갖는 식물에 관한 것이다.

본 발명에 의한 식물은, 복수의 RNA 비루스에 대해서 저항성을 갖는다.

Description

[발명의 명칭]

RNA 비루스에 대하여 저항성을 갖는 식물 제조방법

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 유전자조환(組換)기술을 사용하여 RNA비루스에 저항성을 갖는 식물을 제조하는 기술에 관한 것이다.

더 구체적으로는, 본 발명은 2개쇄 RNA분해 효소를 코드하는 DNA배열을 식물 염색체중에 짜넣어서 발현시킴으로써, 복수의 RNA비루스에 저항성을 갖는 식물 제조 방법, 및 그와 같은 방법으로 얻어진 복수 비루스저항성 식물체에 관한 것이다.

[배경기술]

비루스는 식물에 있어서 큰 스트레스원의 하나이다. 비루스병해에 의해서 작물의 산지가 이동되거나, 품종이 갱신되거나 하는 일도 흔한 일이다. 그러나, 현재로서는 비루스에 직접 작용하는 유효한 약제는 없고, 그 방제는 오로지 간접적인 수단에 의존하고 있다. 작물에 비루스저항성을 부여하는 것은 육종의 중요한 목표의 하나이지만, 교배 가능한 야생종·근연종중에 저항성 유전자원이 발견되지 않는 경우도 많고, 이와같은 경우에 종래의 교배등에 의한 육종기술로는 비루스 저항성품종을 육성할 수 없었다.

이와같은 종래의 육종기술의 결점을 보증하는 방법으로서, 근년에 이르러 유전자조환 기술을 사용하여 식물에 비루스 저항성을 부여하는 방법이 개발되었다. 유전자조환 기술을 사용하면 상기한 바와같은 교배의 벽을 넘어 유전자 도입이 가능하고, 또 기존품종에 비루스저항성만을 도입할 수도 있다.

유전자 조환기술을 사용하여 식물에 비루스 저항성을 부여하는 주된 방법으로써는, 비루스 유래의 유전자(비루스의 외피단백을 코드하는 유전자, 새털라이트 RNA의 cDNA)를 식물에서 발현하게 하는 방법이 보고되었다. (예를들면, Hort Science, 25, 508, 1990). 그러나, 이들 방법에는 이하와 같은 결점이 있다.

1) 어떤 비루스의 외피단백질 유전자를 발현하고 있는 식물은, 그 비루스의 감염에 대해서는 저항성을 나타내지만, 다른 종류의 비루스에 대해서는 전혀 저항성을 나타내지 않는다. 즉, 외피단백질 유전자의 발현에 의해서 얻어지는 비루스 저항성은, 비루스 특이적인 것이다. 비루스의 외피단백질은 비루스마다 다르므로, 복수의 비루스에 대해서 저항성을 부여하기 위해서는, 그들 복수의 비루스의 외피단백질유전자를 모두 식물에 도입할 필요가 있다. 실제로 감자에 감자 X비루스 및 감자 Y비루스의 외피단백질 유전자 양자를 짜넣어서 발현시켜 2개의 비루스에 저항성을 갖는 식물을 만들어냈었다는 보고가 있지만(Bio/technology, 8, 750, 1990), 이와같은 방법에 있어서는 3개, 4개 또는 더 다종의 비루스에 대해서 동시에 저항성을 갖는 식물을 만들어 내기 위해서는 다대한 노력이 들어, 현실적이 아닌 것은 명백하다.

새털라이트 RNA를 발현시키는 방법의 경우에도 얻어지는 비루스 저항성은 비루스 특이적인 것이다. 또 이 방법은 병원비루스가 새털라이트 RNA를 갖지 않으면 적용할 수 없어서 범용성이 없다.

2) 외피단백질유전자를 발현시키는 방법은, 병원비루스가 단리되어서 비루스의 유전자 구조가 해명되어, 외피단백질유전자가 동정되어서 비로서 이용될 수 있는 방법이고, 미지의 비루스에 대해서는 적용불가능하다.

3) 비루스 유전자는 돌연변이를 이르키는 확률이 일반적으로 높다.

예를들면 교배등의 종래기술로 만들어지는 비루스저항성품종에 대해서는 자연계에 있어서 저항성을 극복하는 비루스주(overcomer)의 발생이 가끔 관찰된다.

유전자조환기술에 의한 비루스저항성식물에 대해서도, 이와 같은 저항성을 극복하는 비루스주가 출혈될 가능성이 있다.

[발명의 개시]

본 발명은, 단일 유전자를 식물의 염색체중에 짜넣어서 발현시킴으로써, 복수의 RNA 비루스에 대해서 저항성을 갖는 식물을 제조함을 목적으로 한다.

일반적으로 세포중의 RNA는 1개 쇄이고, 메신저 RNA, 트랜스퍼 RNA등과 같이 여러가지의 중요한 기능을 갖고 있다. 이에 대해서, 2개쇄 RNA는 통상세포중에는 존재하지 않지만, 어떤 종류의 비루스의 유전자는 2개쇄 RNA이고, 또 1개쇄 RNA를 유전자로 하는 비루스도, 세포중에서 복제하는 과정에서 2개쇄상태를 거친다(생화학사전·제2판, p.961, 동경화학동인, 1990). 즉, RNA 비루스가 감염하면 세포중에 2개쇄 RNA이 나타난다.

그래서, 본 발명자들은, 식물비루스의 대부분이 RNA비루스인 것에 주목하여 1개쇄 RNA를 분해하지 않고, 2개쇄 RNA만을 특이적으로 분해하는 효소를 식물에서 발현시켰을 때에 식물은 대부분의 RNA비루스에 대해서 저항성을 나타낼 것이라고 기대하여, 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명자들이 아는 한, 종래 이와같은 시도는 전혀 행해지지 않았다.

즉, 본 발명은 2개쇄 RNA를 특이적으로 분해하는 효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA배열을 식물염색체중에 짜넣어서 발현하게 함으로써, RNA비루스에 대해서 저항성을 갖는 식물을 제조하는 방법, 및 그와같은 방법으로 얻어진 RNA비루스에 대해서 저항성을 갖는 식물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하겠다.

1) 2개쇄 RNA를 특이적으로 분해하는 효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA배열.

2개쇄 RNA를 특이적으로 분해하는 효소활성을 갖는 단백질(이하「2개쇄 RNase」라함.)이란, 2개쇄 RNA를 분해 하지만, 1개쇄 RNA는 거의 분해하지 않는 RNA분해효소(리모누크레아제)(이하「RNase」라함) 활성을 갖는 단백질을 말한다. 2개쇄 RNase로서는 대장균 유래의 RNaseⅢ, 효모유래의 pac 1 유전자에 코드된 RNA분해효소등이 알려져 있다.

본 발명에 있어서는, 이들의 자연계에 존재하는 여러가지의 2개쇄 RNase중의 어느것을 사용하여도 좋다. 또, 이들에 여러가지 아미노산치환, 결손, 부가, 삽입이 가해진 변이 2개쇄 RNase라도, 2개쇄 RNA를 특이적으로 절단하는 활성을 보지하고 있는한 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서「실질적으로 (어떤 2개쇄 RNase)」라고 하는 경우의「실질적으로 」라는 용어는 자연계에 존재하는 2개쇄 RNase만이 아니고, 이와 같은 변이 2개쇄 RNasee 포함하는 것을 나타낸다.

이하에 나타낸 실시예에 있어서도 2개쇄 RNase를 코드하는 DNA배열로써, 효모 Schizo-saccharomyces pombe 유래의 pac 1 유전자를 사용했지만, 본 발명의 목적에 사용할 수 있는 2개쇄 RNase를 코드하는 DNA배열은, 이 pac 1에 한정되는 것이 아님은 물론이다.

또, 일반적으로 어떤 DNA배열이 어떤 아미노산배열을 갖는 폴리페프티드를 코드하는 경우에, 하나의 아미노산에 대응하는 유전코드(코돈)가 복수 존재하기 때문에, 하나의 아미노산배열에 대응하는 DNA배열이 복수개 존재한다(축중이성체). 본 발명에 사용되는 2개쇄 RNase를 코드하는 DNA배열에 있어서도, 그것이 코드하는 폴리페프티드의 아미노산배열을 변화시키지 않는 범위에 있어서 임의의 유전코드를 사용할 수 있는 것은 물론이다.

pac 1 유전자는 이미 전염기배열이 공지되어 있으므로(EMBO J., 10, 221, 1991)이 공지의 염기배열에 의해서 효모 Schizosacch-aromyces pombe(예를들면 ATCC 2478주 등)에서 단리하거나, 일부 또는 전체를 화학합성하거나 하여 얻어짐은 당업자에 있어서 자명하다.

pac 1 유전자이외에, 대장균 유래의 2개쇄 RNase인 RNaseⅢ의 유전자의 전염기배열이 공지되어 있다(Nucleic Acids Res., 13, 4677, 1985).

2) 2개쇄 RNase를 코드하는 DNA배열의 발현 2개쇄 RNase를 코드하는 DNA배열이 유전자 조환 식물체중에서 발현하기 위해서는 적어도 이 DNA배열이 RNA에 전사시킴이 필요하다.

식물세포의 염색체중에 외래유전자를 짜넣는 경우에, 어떤 확률에 의해서 염색체상의 피전사영역에 짜넣어짐은 알려져 있기 때문에(EMBO J., 6, 3891, 1987). 2개쇄 RNase를 코드하는 DNA배열을 단독으로 짜넣어서 발현시킬 수도 있다. 그러나, 바람직하기로는 적당한 프로모터 및 터미네이터배열을 연결한 후에 짜넣는 것이 바람직하다.

이 경우에 프로모터로써는 이제까지 식물 세포중에서 기능함이 알려져 있는 모든 프로모터, 구체적으로는 리브로스-1,5-2인산카복실라제 소서브유니트를 코드하는 유전자의 프로모터, 노파린합성효소유전자의 프로모터, 칼리플라워모자익비루스 19S-RNA를 생성하는 프로모터, 칼리플라워모자익비루스의 35S-RNA를 생성하는 프로모터(CaMV25S 프로모터)(Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 83, 2358, 1986, Plant Cell Rep., 4, 355, 1985, Cell, 30, 763, 1982, Nature, 313, 810, 1985)등을 사용할 수 있다. 터미네이터로써도, 이제까지 식물세포중에서 기능하는 것이 알려져 있는 모든 터미네이터를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 노파린합성효소유전자의 터미네이터, 옥토핀합성효소유전자의 터미네이터(J. M01, Appl, Gen., 1, 561, 1982, EMBO J., 3, 835, 1984)등을 이용할 수 있다.

3) 2개쇄 RNase를 코드하는 DNA배열의 식물로의 짜넣기 식물세포에 2개쇄 RNase를 코드하는 DNA배열을 도입하려면, 이미 보고되어 확립되어 있는 여러가지 방법, 예를들면 Agrobacterium tumefaciens의 Ti플라스미를 벡터로써 사용하는 방법이나, 식물편이나 식물프로토플라스트에 직접 DNA를 도입하는 방법등을, 목적으로 하는 식물종류에 따라서 적의하게 사용할 수 있다.(예를들면 “Plant genetic transformation and gene expression, a laboratory manual”, Draper, J. et al. eds., Blackwell Scientific Publications. 1988를 참조). 일반적으로, 유전자를 도입하고자 하는 식물이 쌍자엽식물인 경우에는, Ti플라스미드벡터를 사용하는 것이 바람직한 경우가 많다. 단자엽식물이나 아그로박테륨에 감염되기 어려운 쌍자엽식물의 경우에는, 일렉트로포레이션등의 물리적 도입법이 바람직하다. 유전자도입을 위한 식물재료로써는, 도입법에 따라서 엽편, 경편, 괴경편, 프로토플라스트, 카루스, 화분등에서 적당한 것을 선택할 수 있다. 형질전환된 식물조직 또는 세포를 식물종에 따라 적당한 조건하에서 조직배양함으로써 형질전환식물체를 재생할 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는, pac 1 유전자를 포함한 식물형 질환벡터의 구축을 나타낸 도면이다.

제2도는 형질전환 담배(삼선)의 엽중의 pac 1 유전자산물의 검출을 위한 전기영동의 결과를 나타낸 사진이다. 비형질전환체(control), β-GUS트랜스제닉담배(β GUS) 및 pac 1 ＃1, ＃2형질 전환담배(삼선)의 엽조추출액을, 항 pac 1 항체(위의 판넬) β-갈락토스- pac 1 융합단백질로 흡수된 항 pac 1 항체(야래의 판넬)와 반응시켰다.

제3도는 형질전환담배(삼선)의 엽중의 pac 1 유전자산물의 검출을 위한 전기영동의 결과를 나타낸 사진이다. 비형질전환체(control), pac 1 ＃3, ＃4, ＃8, ＃9 형질전환담배(크산치 nc)의 엽조추출액을, 항 pac 1항체와 반응시켰다.

제4도는 담배 모자익비루스(TMV)접종담배(삼선)엽중의 TMV외피단백질의 검출을 위한 전기영동의 결과를 나타낸 사진이다. TMV접종후 11일째의 비형질전환체(control), β-GUS트랜스제닉담배(β GUS 및 pac I #1, #2, #4트랜스제닉담배(삼선)(TMV+의 렌) 또는 TMV를 접종하고 있지 않은 담배(TMV-의 렌)의 비루스 접종 상엽에서 전단백질을 추출하여 항 TMV 토끼혈청과 반응시켰다.

제5도는 TMV접종후 19일째의 비형질전ghks체(control), β-GUS트랜스제닉담배(β GUS) 및 pac 1 ＃1, ＃2, ＃4트랜스제닉담배(삼선)의 병징출현을 나타낸 생물의 형태를 나타낸 사진이다.

제6도는, TMV접종후의 비형질전환체(control), β-GUS트랜스제닉담배(β GUS) 및 pac 1 ＃1, ＃2, ＃4트랜스제닉담배(삼선)에 있어서의 병징출현의 경과를 나타낸 도면이다. 병징의 정도를 이하의 2단계로 나누어서 나타냈다.

TMV감염후 병징이 상엽에 약간 출현 +병징이 현저한 상태

제7도는 TMV접종에 의해서 비형질전환체(control) 및 pac 1 ＃3, ＃4, ＃8, ＃9형질전환담배(크산티 nc)의 비루스접종엽에 나타난 괴사반의 수와 크기의 감염후의 시간경과에 의한 변화를 나타낸 도면이다. 종축에 접종업 좌절반 영역의 괴사반수, 횡축에 감염후의 시간을 취하고, 괴사반의 상대적인 크기를 0의 크기로 나타냈다.

제8도는, CMV접종후 13일째의 β-GUS트랜스제닉담배(β GUS) 및 pac 1 ＃1, ＃2, 트랜스제닉담배(삼선)에 나타난 병징을 나타낸 생물의 형태를 나타낸 사진이다.

제9도는 CMV접종후의 β-GUS트랜스제닉담배(β GUS) 및 pac 1 ＃1, ＃2, 트랜스제닉담배(삼선)에 있어서의 병징출현의 경과를 나타낸 도면이다. 병징의 정도를 이하의 3단계로 나누어서 나타냈다.

엽의 일부분에 약간의 황화부위의 출현 +

+와 +++의 중간상태 ++

황화가 엽전체에 퍼진 상태의 출현 +++

제10도는 CMV접종 담배(크산티 nc)엽중의 CMV외피단백질의 검출을 위한 전기영동의 결과를 나타낸 사진이다. CMV접종후에 14일째의 비형질전환체(control) 및 pac 1 ＃3, ＃4, ＃8, ＃9형질 전환담배(크산티 nc) (CMV+의 렌) 또는 CMV를 접종하지 않은 담배(CMV-의 렌)의 비루스접종 상엽에서 전단백질을 추출하여, 항 CMV토기혈청과 반응시켰다.

제11도는 CMV접종후 14일째의 비형질전환체(control) 및 pac 1 ＃3, ＃4, ＃8, ＃9형질 전환담배(크산티 nc)에 나타난 병징을 나타낸 생물의 형태를 나타낸 사진이다.

제12도는, CMV접종후의 비형질전환체(control) 및 pac 1 ＃3, ＃4, ＃8, ＃9형질 전환담배(크산티 nc)에 있어서의 병징출현의 경과를 나타낸 도면이다. 병징의 정도를 이하의 3단계로 나누어서 나타냈다.

엽의 일부분에 약간의 황화부위의 출현 +

+와 +++의 중간상태 ++

엽전체에 황화가 퍼진 상태의 출현 +++

제13도는 PVY접종후의 비형질전환체(control) 및 pac 1 ＃3, ＃4, ＃8형질 전환담배(크산티 nc)에 있어서의 발병의 경과를 나타낸 도면이다. 각 담배크론 6개체에 접종하고, 발병한 개체의 출현수를 나타냈다.

제14도는 식물발현용개변 RNaseⅢ 유전자 DNA의 디자인을 나타낸 도면이다.

아미노산번역영역을 대문자로 비번역부분을 소문자로 나타내었다. 각 합성올리고 DNA의 잘린곳을 하선으로 나타내었다.

또, PCR프라이머 부분은 망목으로 나타내었다.

제15도는, 합성된 DNA의 리가제반응과 PCR에 의한 증폭방법을 나타낸 도면이다.

제16도는 TMV접종후 3일째의 R1식물(pac 1 ＃8-2, pac 1 ＃8-4, pac 1 ＃8-3) 및 콘트롤에 있어서의 접종엽을 나타낸 생물의 형태를 나타낸 사진이다.

[방법을 실시하기 위한 최량의 형태]

이하에 실시예를 들어 더 구체적으로 본 발명을 설명하겠으나, 본 발명의 범위는 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예에서는, 2개쇄 RNase DNA배열로써 전술의 pac 1 유전자를 사용하고, 식물에서 이 유전자를 발현시키기 위한 프로모터로써는 CaMV 35S프로모터를 사용했다. pBJ 121벡터(EMBO J., 6, 3901, 1987)위에 타고 있는 대장균유래의 β-글루구로니타제 유전자(β-GUS)와 pac 1 유전자의 2개쇄 RNase단백을 코드하는 영역을 포함한 DNA를 교체하고, pac 1 유전자를 식물에서 발현시키기 위한 플라스미드를 구축했다.

본 발명의 효과를 확인하기 위한 숙주식물로써 담배(삼선주와 크산티 ne주)를 사용하고 pac 1 유전자를 포함한 pBI 121플라스미드를 도입한 아그로박테륨을 사용하여, 리프디스크법(Science, 223,469, 1985)에 의해서 담배형질 전환체를 얻었다.

형질전환체식물중의 pac 1 유전자산물의 발현의 체크는, 엽의 조추출액을 SDS폴리아크릴아미드전기영동하여, 항 pac 1항체에 의해서 면역화학적으로 행하였다.

담배모자익비루스(TMV-OM주), 오이모자익비루스(CMV-Y루) 및 감자 Y비루스(PVY-T주)를 사용하여 비루스감염시험을 행한 결과, pac 1 유전자를 고발현하는 형질전환담배식물체는, 어떤 비루스에 대해서도 저항성을 나타냈다.

[실시예 1]

형질전환식물을 만드는데 사용되는 플라스미드의 구축(제1도) Schizosaocharomyces pombe 유래의 pac 1 유전자를 포함한 약 3kbp의 제한효소 Hind Ⅲ단편(EMBO J., 10, 221, 1991)을 Cla Ⅰ_Rsa Ⅰ 및 Cla Ⅰ+Dra Ⅰ로 절단후에, 각각 1% 아가로스겔전기영동으로 분획하고, 약 900bp의 Rsa Ⅰ-Cla Ⅰ단편과 약 250bp의 Cla Ⅰ-Dra Ⅰ단편을 아가로스겔에서 추출정제했다.

이들 2개의 단편을 pBluescript ⅡSK+(Stratagene사)벡터의 Sma Ⅰ사이트로 서브크론하여 약 1150bp의 pac Ⅰ유전자단편이 삽입된 플라스미드를 얻었다. 이 플라스미드를 정제하고 EcoRⅠ+BamH Ⅰ로 절단후에, Klenoweks편(다까라주조)으로 평활말단으로 하여, 아가로스겔전기영동에 의해서 평활말단화된 약 1150bp의 pac 1 유전자를 포함한 DNA단편을 추출정제했다.

한편, pB Ⅰ 121벡터플라스미들(Clonetech사)를 Sma Ⅰ+Sst Ⅰ로 절단후에, β-GUS유전자를 제거하고, Sma Ⅰ린커를 거쳐서 셀프라이게이션 시켜서 pBⅠ 121-GUS를 만들었다. 이 pBⅠ 121-GUS벡터플라스미드를 SmaⅠ로 절단후에 알칼리포스파타제(CIAP:베링거사)처리한 단편과, 상기에서 얻은 약 1150bp의 pac 1 유전자를 포함한 DNA단편을 라이게이션하여 대장균 XL1-Blue주(Stratagene사)에 도입했다. pac 1 유전자가 CaMV 35S프로모터의 하류에 바른 방향으로 삽입된 플라스미드를 pBI 121+ pac 1라 한다.

[실시예 2]

[아그로박테륨에 의한 담배의 형질전환]

형질전환에는, 담배(Nicotiana tabacum)삼선주(Samsun)와 크산티 nc주(Xanthi nc)를 사용했다. pRK 2013플라스미드를 갖는 대장균 C600주를 헬퍼로 하는 접합전달에 의해서, 플라스미드 pBI 121+pac 1를 대장균 XL1-Blue중에서 아그로박테륨(Agrobacterium tumefaciens)LBA 4404중에 도입했다(예를들면, DNA Cloning Ⅱ, D. M. Glover, IRL Press, 1985를 참조).

리프디스크법(Science, 223, 496, 1985)에 의해서 담배엽편에 아그로박테륨을 감염시키고 250㎍/㎖클라포란, 100㎍/㎖가나마이신이 들어 있는 MS-B5배지(Murashige & skoog 기본재지(Physiol. Plant., 15, 473, 1962)에 B5비타민을 첨가한 것)위에 올려놓고 형질전환조직을 선택했다.

슈트가 나오면 호르몬프리의 MS배지로 옮겨서 발근시켰다. 얻어진 형질전환식물체는, 무균인비트로커쳐(invitro culture)로 계대 배양했다.

[실시예 3]

[형질전환 담배중의 pac 1 유전자 산물의 검출]

인비트로로배양된 형질전환 담배의 엽을 동일양의 추출버퍼 A(50mM TrisHC ℓ pH7.5, 0.25M KC ℓ, 2mM EDTA, 1mM 멜캅토에타놀, 0.1mM 디티오스레이톨(DTT), 200βM페닐메틸설포닐플루오리드(PMSF), 20㎍/㎖로이페프틴, 50㎍/㎖소의 폐아프로티닌(bovine lung approtinine). 0.05% 데옥시콜산나트륨)에 넣고, 테프론페트설포디나이저(20㎖)를 사용하여 마쇄했다.

15,000rpm, 4℃, 20분간 원심분리후에, 상청을 취했다. Bradley의 방법(Bio-rad사의 단백아세이키트)로 단백질량을 측정하고 하나의 샘플당 150㎍의 단백질을 취하고, SDS폴리아크릴아미드겔(10% 아크릴아미드)전기영동을 행하였다. 전기영동후에, 세미드라이브로트장치(잘트리우스사)에 의해서 폴리비닐리덴디플로오리드(PVDF)막(밀리포어사)에 단백질을 전사했다.

pac 1 유전자산물과 대장균 S4단백질과의 융합단백질을 대장균에 생산시켜 정제하고, 이것을 토끼에 면역하여 항혈청을 얻었다. 이 항혈청의 이무노글로블린(immunoglobulin) G획분을 취하고, S4단백질을 결합시킨 셀룰로스칼럼을 소통하는 획분을 얻었다. 다음에, 이 획분을 대장균이 만든 pac 1 유전자산물(EMBO J., 10, 221, 1991)을 결합시킨 아피니티(affinity)컬럼에 흡착시켜, 세정후에, 흡착된 항체를 용출하여 항 pac 1항체액을 얻었다.

PVDF막에 전사한 형질변환담배엽의 단백질을 상기의 항 pac 1항체와 반응시켜, 퍼옥시다제 ABC키트(Vectastain : 프나코시사)를 사용하여 항체와 반응하는 단백질을 검출했다. 이 실험에서 검출된 단백질이 pac 1 유전자산물인 것을 확인하기 위해서 대장균이 만든 β가락토시다제 pac 1 융합단백질과 사전에 반응시킨 항 pac 1 항체를 사용해서 똑같은 실험을 행하여, 상기의 실험결과와 비교했다.

형질전환담배(삼선)에서는 pac 1 ＃1과 ＃4의 크론에서, pac 1 유전자산물로 생각되는, 항 pac 1항체와 특이적으로 반응하는 밴드(약 70kDa)가 검출되었다. 한편 콘트롤의 비형질전환담배와 pBI 121플라스미드 도입담배(이하「β-GUS트랜스제닉담배」라함), 및 형질전환체의 pac 1 ＃2 크론에서는 항 pac 1 항체와 특이적으로 반응하는 밴드는 검출되지 않았다(제2도, 단＃4에 대하여는 결과가 나타나 있지 않다.) 또 형질전환체 pac 1 ＃1, ＃2에 대해서, 삭물세포중의 pac 1 유전자의 mRNA의 유무를 조사한 결과, 어떤 경우도 발현이 확인 되었다(데이타는 나타나 있지 않다). ＃2크론에서 pac 1 단백질이 검출되지 않는 이유는 명백하지 않다.

한편, 형질전환담배(크산티 nc)에서는, pac 1 ＃8의 크론에 pac 1 유전자산물로 생각되는 단백질의 밴드(약 70kDa)가 검출되었으나 콘트롤의 비형질전환담배 및 형질전환체 pac 1 ＃3, ＃4, ＃9의 크론에서는 pac 1 유전자산물 검출은 되지 않았다(제3도).

[실시예 4]

[pac 1 유전자산물의 2개쇄 RNase분해효소활성의 검출]

인비트로로배양한 트랜스제닉담배(삼선)의 엽을 등량의 추출버퍼 B(추출버퍼 A에서 데옥시콜산나트륨을 제외한것)에 의해서 마쇄하고, 실시예 3과 똑같이하여 전단백질을 추출했다. 200㎍단백질에 상당하는 엽추출액(용량이 43㎕로 되도록 버퍼 B로 희석)에, 1㎕의 실시예 3에서 얻은 항 pac 1 항체액 또는 1㎕의 인산버퍼를 혼합하고, 4℃에서 2시간 인큐베이트했다. 다음에, 5㎕의 Ig Gsorb(엔자임센터 : 프나코시사)를 첨가하고 4℃에서, 5분간 원심분리 후에, 상청을 취하고, 2개쇄 RNA분해효소활성을 측정했다. 하기의 반응액중에서 샘플과 트리튬라벨된 2개쇄 RNA기질을 37℃에서, 30분간 반응시키고, 트리클로로초산(TCA)불활성 획분중의 방사활성을 측정하고(EMBO J., 10, 221, 1991). 항 pac 1항체를 넣지 않았을 때의 값에서 항체를 넣었을때의 값을 뺀 값을 pac 1 유전자산물에 의한 RNA분해효소 활성으로 했다(표 1)

[반응액] 50㎕샘플

50㎕ 2 ×반응버퍼(40mM Tris-HC ℓ

pH7.5, 0.2MKC ℓ, 0.02M

MgC ℓ₂, 0.2mM DTT

50㎍/㎖³H poly A : poly U^＊)

＊기질³Hpoly A : poly U의 조제

10㎎/㎖ polyA(팔머시아사)24.6㎕(246㎍)

10㎎/㎖ polyU(팔머시아사)25㎕(250㎍)

20β Ci/㎖³Hpoly A(아마샴사) 250㎕(약 4㎍)

3MKC ℓ 330㎕

1M Tris-HC ℓ pH7.5 20㎕

멸균정제수로 전량을 1㎖로 하고, 25℃에서 하룻밤 반응시켰다.

[표 1]

실시예 3에서 항 pac 1 항체와 특이적으로 반응되는 밴드가 검출된 트랜스제닉담배 pac 1 ＃만이, 유의한 pac 1 산물에 의한 2개쇄 RNA분해효소활성을 나타냈다.

[실시예 5]

[담배모자익비루스(TMV)감염시험]

1) pBI 121+pac 1 플라스미드도입담배(삼선)인비트로식물을 순화후 3주간 경과된 것에 10mM인산나트륨버퍼(pH7.4)에 현탁한 TMV-OM주(0.1㎍/㎖)를 카보란덤을 사용하여 엽의 표현측에 접종했다.

감염후 11일째에, 비루스를 접종한 엽보다 위의 엽을 일부 절취하고, 그 5배중량의 SDS버퍼(2% SDS, 80mM Tris-HC ℓ pH6.8, 2% 2-멜캅토 에타놀, 10%글리세린)로 전단백질을 추출했다. 각 샘플을 SDS전기영동용 샘플버퍼(50mM Tris-HC ℓ pH6.8, 1% SDS, 1% 2-멜캅토 에타놀, 10%글리세린, 0.05% 브로모페놀부루)로 100배로 희석한후에, 10㎕를 SDS 폴리아크릴아미드전기영동(12.5% 아크릴아미드)으로 분획했다. PVDF막에 단백질을 전사하고, 항 TMV혈청(토끼)(300배 희석)과 퍼옥시다제 ABC키트에 의해서, 감염식물의 엽중의 TMV를 검출했다(제4도).

트랜스제닉담배(삼선) pac 1 ＃2 및 콘트롤(비형질전환체, β-GUS트랜스제닉담배)의 접종상엽중에서는 감염후 11일째에서 TMV가 검출된 데에 대해서, 트랜스제닉낙담배 ＃1에서는 검출되지 않았다. ＃4에서는 TMV가 검출되었으나, ＃2 및 콘트롤에 비해서 명백하게 TMV외피 단백질의 양이 적었다.

이들 트랜스제닉담배(삼선)의 비루스감염에 의한 모자이크병징출현(접종후 19일째)을 제5도에 나타냈다. 항 pac 1 항체에서 특이적으로 염색되는 단백질이 발현되고, pac 1 유전자산물에 의한 2개쇄 RNA 분해 효소활성이 검출된 트랜스제닉담배 pac 1 ＃1(실시예 3, 4참조)에서는 명백한 모자이크병징출현의 지연이 확인되었다. 한편 pac 1 유전자산물의 발현을 확인할 수 없었던 트랜스제닉담배 pac 1 ＃2에서는, 병징의 지연도 확인할 수 없었다. 제6도에 TMV감염후의 병징출현을 그래프로 나타냈다.

2) pBI 121+pac 1 플라스미드도입담배(크산티 nc)

삼선의 경우와 똑같이 하여, 순화후 3주간 경과된 식물체에 TMV-OM(0.1㎍/㎖)을 접종했다. 비루스를 접종하는 엽은 아래에서 4∼5매째의 것으로 했다. 비루스감염후에 접종엽에서의 괴사반의 출현을 관찰하고, 괴사반의 출현시기, 괴사반의 수 및 크기를 그래프로 나타냈다(제7도).

항 pac 1 에서 특이적으로 염색되는 단백질이 발현되어 있는 형질전환 담배(크산티 nc) pac 1 ＃8(실시예 3참조)에서는 괴사반의 출현이 지연되는 동시에, 그 수 및 크기가 감소되었다. 한편 pac 1 유전자단백질의 발현이 발견되지 않았던 형질전환담배 pac 1 ＃3, ＃4, ＃9에 있어서는, 괴사반의 출현시기, 수 및 크기에 대해서, 콘트롤(비형질전환체)과 현저한 차이는 확인할 수 없었다.

이상의 결과는 2개쇄 RNase(pac 1 유전자산물)의 담배식물(삼선, 크산티 nc)에서의 발현이, TMV의 복제를 억제 함을 나타내고 있다.

[실시예 6]

[오이모자이크비루스(CMV)감염시험]

1) pBI 121+pac 1 도입담배(삼선)

인비트로식물을 순화후에 2주간 경과된 것에 10mM 인산나트륨버퍼(pH 7.4)에 현탁한 CMV-Y주(1㎍/㎖)를 카보란덤을 사용하여 엽의 표면쪽에 접종하고, 비루스감염후의 병징의 출현을 관찰했다. 접종후 13일째의 각 담배식물체의 병징발현의 상태를 제8도에 나타냈다. 또 제9도에 접종후의 병징의 출현, 엽에 나타나는 황화의 정도를 그래프로 나타냈다.

콘트롤의 β-GUS트랜스제닉 담배(삼선)에 비해서 pac 1 트랜스제닉담배에서는 병징발현이 지연되어, 접종후 19일째의 병징(엽의 황화의 정도)은 β-GUS>pac 1 ＃2>pac 1 ＃1의 순이었다.

2) pBI 121+pac 1 도입담배(크산티 nc)

삼선의 경우와 똑같이 하여, 순화후 2주간 경과된 식물체에 CMV-Y(0.1㎍/㎖)를 접종했다. 비루스감염후 14일째에 비루스를 접종한 엽보다 위의 엽(위에서 3매째의 엽)의 일부를 절취하고, 실시예 5의 1)과 똑같이 하여 전단백질을 추출하고, 분획하여 PVDF막에 전사하고, 항 CMV형청(토끼, 약 2000배 희석)과 퍼옥시다제 ABC키트에 의해서 감염식물엽중의 CMA를 검출했다.

형질전환 담배(크산치 nc)pac 1 ＃8에서는, 콘트롤 및 pac 1 단백질의 발현이 발견되지 않는 형질전환 담배 pac 1 ＃3, ＃4, ＃9에 비해서, 접종 상엽중의 CMV 외피단백질의 감소가 확인되었다(제10도).

감염 14일째의 콘트롤 및 각형질전환식물의 엽에 나타난 병징(황화의 정도)을 제11도에 나타냈다. 또, 제12도에 비루스접종후의 병징출현, 황화의 정도를 그래프에 나타냈다. pac 1 형질전환담배(크산티 ne) pac 1 ＃8에서는, 콘트롤, pac 1 ＃3, ＃4, ＃9에 비해서 명백하게 병징의 출현이 지연되었다. 이들 결과는 형질전환담배 pac 1 ＃8의 업중에서는 CMV의 복제가 억제되어 있는 것을 나타낸다.

[실시예 7]

[감자 Y비루스(PVY)감염시험]

pBI 121+pac 1 프라스미드도입담배(크산티 nc)를 사용하여 감자 Y비루스(PVY)의 감염시험을 행하였다.

Nicotiana sylvestris에 PVY회저계통(PVY-T)을 접종후에, 건조보존된 감염엽에 5배량의 10mM인산나트륨버퍼(pH 7.1, 20mM 2-멜캅토에타놀을 포함함)을 첨가하고, 유발로 갈아서 으깨었다. 원심분리후에, 상청을 상기의 버퍼로 1000배로 희석하고, 카보란덤을 사용하여, 순화 2주간 후의 형질전환담배(크산티 nc)의 엽의 표면쪽에 접종했다.

콘트롤(비형질전환체) 및 형질전환담배(크산티 nc)각 6개체에 PVY-T접종후에, 병징을 관찰하고, 명백한 병징(회저반의 출현)을 나타낸 개체의 출현수를 제13도에 나타냈다. pac 1 단백질을 발현하는 형질전환담배 pac 1 ＃8에서는, 콘트롤, pac 1 단백질을 발현하지 않은 pac 1 형질전환 담배 ＃3, ＃4에 비해서 발병개체의 출현이 지연되고, TMV 및 CMV접종시험의 경우와 마찬가지로, PVY에 대해서도 pac 1 도입에 의한 비루스저항성의 부여효과가 확인되었다.

[실시예 8]

[식물발현용 개변 PNase III 유전자의 합성]

식물발현용 개변 RNase Ⅲ 유전자를 디자인(제14도)함에 있어서, 대장균유래 RNase Ⅲ 유전자의 염기배열(Nucleic Acids Res., 13, 4677, 1985, Corrigenda, 6400)에 의해서, 아미노산에 대응하는 코돈을 식물유전자의 코돈 이용빈도(Nucleic Acids Res., 17,477, 1989)가 높은 것으로 바꾸고, 아데닌, 티민염기의 연속된 부분은, 아미노산배열을 변화시키지 않은 범위에서 구아닌 또는 시토신염기와 치환했다. 또, 5′-측 번역개시코돈(ATG)앞에 제한 효소 EcoRI 인식배열. 3′-측번역 종지코돈(taa)의 뒤에 제한효소 Sa Ⅱ인식배열을 부가했다.(제14도의 소문자로 나타낸 염기). 또, 염기의 합성은 제14도에 경계선으로 나타낸 것과같이 26의 부분(제15도의 1∼13 및 1c∼13c)으로 나누어서 합성을 행하였다. 합성은, 애플라이드바이오시스템즈사의 DNA합성기(A394)를 사용해서 행하였다.

합성한 DNA는, OPC카트리지(애플라이드바이오시스템즈사)를 사용하여 정제하고, 분광광도계로 260m의 흡수를 행함으로써 DNA농도를 결정했다. 합성한 DNA의 결합은, 모든 합성 DNA의 동시리가제 반응후에 PCR에 의해서 행하였다(Proc. Nat 1, Sci, USA, 88, 4084, 1991). 제15도에 나타낸 것과같이 5′-측말단+쇄의 합성 DNA(제15도의 1)과 3′-측말단-쇄의 DNA(제15도의 13c)를 제외한, 24개의 합성 DNA 각각 25pmoℓ을 반응액 15㎕에 개개로 반응을 행하였다. 반응후에, 68℃에서 10분간 가온했다. 24종의 인산화된 DNA용액을 1개의 튜브에 모으고, 또 2.5㎕(10pmoℓ/㎕)씩 인산화되어 있지 않은 1 및 13c의 DNA를 첨가하고, 아닐린반응(95℃, 5분간 가열후에 1.5시간에 실온까지 내린다)을 행하였다. 이것에 40유니트의 T4리가제(베링거)를 첨가하여, 12℃에 하룻밤 반응시켰다. 68℃에서 10분간 가열하고, 리가제를 실활(失活)시간후에, 반응액 20㎕를 취하고, RNase Ⅲ의 5′-측말단과 3′-측말단의 PCR플라이머(제14도의 망목부분)에 의해서 PCR를 행하였다. PCR는 반응액 100㎕로 94℃에서 1분, 57℃에서 2분, 72℃에서 2분, 35사이클의 조건으로 행하였다(퍼킨엘머시타스사, 모델 280), PCR에 의해서 얻어진 약 700bp의 밴드를 EcoRI, Sal 1 소화하고, 1.5%아가로스겔전기영동후에 겔에서 추출하여, pBluescript ⅡSK+(Stratagene사)벡테로크로닝했다. 클로닝된 RNaseⅢ 유전자 DNA는, DNA시퀸스에 의해서 디자인된 것과 동일하다는 것을 확인했다.

여기서 얻어진 RNaseⅢ 유전자 DNA는, pBI 121플라스미드로 연결식물에 도입함으로써, 복수의 비루스에 저항성을 나타내는 식물을 제조할 수 있다.

[실시예 9]

[R1식물(트랜스제닉식물의 종자에서 발아시킨 것)에 있어서의 비루스 저항성]

pac 1 트랜스제닉담배 ＃8(크산티 nc)에서 얻어진 종자를 500㎍/㎖가나마이신을 포함한 MS호르몬프리배지에 놓아 두어, 정상적으로 발아된 가나마이신내성묘를 선발했다. 이들을 가나마이신을 포함하지 않은 MS호르몬프리배지에서 인비트로증식시켜, 엽에서 DNA를 추출했다(이시다, 미자와 저「세포공학실험조작입문」1992 고오단샤간), 추출된 DNA를 제한효소 EcoRI과 BamHI로 소화후에, 1%아가로스겔로 전기영동하여 서덴블로트를 행하였다. 악틴유전자를 내부표준으로써, pac 1 유전자를 Ro식물(원래의 pac 1 ＃8크산티 nc)과 마찬가지로 1카피갖는 것(헤테로). 그 2배의 2카피갖는것(호모)을 동정했다. 순화후 2주간의 R1식물크산티 nc＃8-2, ＃8-4(호모), ＃8-3(헤테로) 및 콘트롤(크산티 nc 담배)에 대해서, TMV감염실험을 행하였다. TMV(OM주)를 10mM인산버퍼(pH 7.4)에 의해서 0.1㎍/㎖로 희석하고, 카보란덤과 함께 엽의 상면에 접종했다. 감염후 4일째에 TMV감염에 의해서 생긴 스포트수와 크기를 관찰했다(제16도). 이 결과에서 pac 1 유전자로 형질전환된 식물의 비루스저항성 형질은 후대로 유전됨이 확인되었다.

[산업상 이용가능성]

2개쇄 RNase(pac 1 유전자산물)를 발현하는 식물은, TMV, CMV등에 대해서 저항성을 갖고 있었다. 이들의 비루스는 상이한 그룹에 속하는 식물비루스이고, 유전자구조, 유전자의 발현양식, 또는 복제의 메카니즘등 여러가지 점에서 크게 다르다. 예를들면, TMV는 단일의 게놈 RNA를 갖는 단립자성비루스인데 대해서, CMV는 3개로 분절된 게놈 RNA를 갖는 3립자성 비루스이다. 이와같이 크게 상이한 복수의 비루스에 대해서 저항성을 나타낸 조환식물체를 단일의 유전자의 도입 발현에 의해서 만든 예는, 종래 전혀 알려지지 않았다.

복제메카니즘이 전혀 다른 TMV, CMV등에 대해서 모두 저항성을 나타낸 것은 2개쇄 RNase의 발현에 의해서 넓은 범위의 RNA 비루스의 복제가 억제되고, 비루스의 증식이 저해되는 것을 나타낸다. 또 어떠한 돌연변이 비루스라도, RNA비루스인 이상 반드시 복제단계에서 2개쇄 RNA를 형성한다. 따라서, 2개쇄 RNase의 발현에 의한 비루스 저항성에 대해서는 이것을 극복하는 비루스가 출현할 가능성이 매우 낮은 것은 당업자에 있어서 명백하다.

이상 상술한 바와같이, 본 발명의 유전자 조환에 의한 비루스 저항성식물을 제조하는 기술은, 비루스저항성식물품종의 육성에 널리 응용할 수 있다고 생각된다.

배열표

배열번호 :1

배열의 길이 : 709

배열의 형 : 핵산

사슬의 수 : 2개쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산

하이포세티컬배열 : No

안티센스배열 : No

배열 :

Claims

2개쇄 RNA를 특이적으로 분해하는 효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA배열을 단독으로 또는 프로모터 및 터미네이터를 연결시킨 상태로 형질 전환법에 의하여 식물세포의 염색체 중에 짜 넣은 후 세포를 배양하고 이 세포로부터 식물체를 재생시켜서 상기 DNA 배열을 식물체에서 발현시킴으로써, RNA 비루스에 대하여 저항을 갖는 식물 제조 방법.
제1항에 있어서, 2개쇄 RNA를 특이적으로 분해하는 효소활성을 갖는 단백질이 실질적으로 대장균 유래의 리보누크레아제 Ⅲ 또는 효모유래의 pac 1 유전자에 코드된 RNA 분해효소인 RNA비루스에 대하여 저항성을 갖는 식물 제조 방법.
제1항에 있어서, 2개쇄 RNA를 특이적으로 분해하는 효소활성을 갖는 단백질이 실질적으로 리보누크레아제 Ⅲ 또는 pac 1 유전자에 코드된 RNA 분해효소인 RNA 비루스에 대하여 저항성을 갖는 식물 제조 방법.