JP3336307B2 - 複数のウィルスに抵抗性を持つ植物及びその作製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換え技術
を用いてＲＮＡウィルスに抵抗性を持つ植物を作出する
技術に関する。更に具体的には、本発明は、二本鎖ＲＮ
Ａ分解酵素をコードするＤＮＡ配列を植物染色体中に組
み込んで発現させることにより、複数のＲＮＡウィルス
に対して抵抗性を持つ植物を作出する方法、及びそのよ
うな方法で得られた複数ウィルス抵抗性植物体に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】ウィルスは植物にとって大きなストレス
源の一つである。ウィルス病害によって、作物の産地が
移動したり、品種が更新されたりすることも希ではな
い。しかし、現在のところウィルスに直接作用する有効
な薬剤はなく、その防除はもっぱら間接的な手段に頼っ
ている。作物にウィルス抵抗性を与えることは育種の重
要な目標の一つであるが、交配可能な野生種・近縁種の
中に抵抗性遺伝子源が見つからない場合も多く、このよ
うな場合、従来の交配等による育種技術ではウィルス抵
抗性品種を育成できなかった。

【０００３】このような従来の育種技術の欠点を補う方
法として、近年になって遺伝子組換え技術を用いて植物
にウィルス抵抗性を与える方法が開発されてきた。遺伝
子組換え技術を用いれば、上記したような交配の壁を超
えた遺伝子導入が可能であり、更に既存品種にウィルス
抵抗性のみを導入することもできる。

【０００４】遺伝子組換え技術を用いて植物にウィルス
抵抗性を与える主な方法としては、ウィルス由来の遺伝
子（ウィルスの外被蛋白をコードする遺伝子、サテライ
トＲＮＡのｃＤＮＡ）を植物で発現させる方法が報告さ
れている（例えば、HortScience, 25, 508, 1990）。し
かし、これらの方法には、以下のような欠点がある。

【０００５】1) あるウィルスの外被蛋白質遺伝子を発
現している植物は、そのウィルスの感染に対しては抵抗
性を示すが、別の種のウィルスに対しては全く抵抗性を
示さない。即ち、外被蛋白質遺伝子の発現によって得ら
れるウィルス抵抗性は、ウィルス特異的なものである。
ウィルスの外被蛋白質はウィルスごとに異なるので、複
数のウィルスに対して抵抗性を与えるためには、それら
複数のウィルスの外被蛋白質遺伝子をすべて植物に導入
する必要がある。実際にバレイショにバレイショＸウィ
ルス及びバレイショＹウィルスの外被蛋白質遺伝子を両
方組み込んで発現させ、２つのウィルスに抵抗性を持つ
植物を作出したという報告がある（Bio/technology, 8,
750, 1990) が、このような方法では３つ、４つ又は更
に多種のウィルスに同時に抵抗性を持つ植物を作出する
には多大な労力がかかり、現実的ではないことは明らか
であろう。

【０００６】サテライトＲＮＡを発現させる方法の場合
にも、得られるウィルス抵抗性はウィルス特異的なもの
である。更にこの方法は、病原ウィルスがサテライトＲ
ＮＡを持たなければ適用できず、汎用性に乏しい。

【０００７】2) 外被蛋白質遺伝子を発現させる方法
は、病原ウィルスが単離されてウィルスの遺伝子構造が
解明され、外被蛋白質遺伝子が同定されて初めて利用で
きる方法であり、未知のウィルスに対しては適用不可能
である。

【０００８】3) ウィルス遺伝子は突然変異を起こす確
率が一般に高い。例えば交配等の従来技術で作出された
ウィルス抵抗性品種に対しては、自然界において、この
抵抗性を克服するウィルス株(overcomer) の発生がしば
しば観察される。遺伝子組換え技術によるウィルス抵抗
性植物に対しても、このようなオーバーカマーが出現す
る可能性がある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、単一の遺伝
子を植物の染色体中に組み込んで発現させることによっ
て、複数のＲＮＡウィルスに抵抗性を持つ植物を作出す
ることを目的とする。

【００１０】一般に細胞の中のＲＮＡは一本鎖であり、
メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡなどのよ
うに種々の重要な機能を担っている。これに対し、二本
鎖ＲＮＡは通常細胞中には存在しないが、ある種のウィ
ルスの遺伝子は二本鎖ＲＮＡであり、また一本鎖ＲＮＡ
を遺伝子とするウィルスも、細胞中で複製する過程で二
本鎖状態を経る（生化学辞典 第２版、p.961 、東京化
学同人、1990）。即ち、ＲＮＡウィルスが感染すると細
胞中に二本鎖ＲＮＡが現れる。

【００１１】そこで、本発明者らは、植物ウィルスのほ
とんどがＲＮＡウィルスであることに注目し、一本鎖Ｒ
ＮＡを分解せず、二本鎖ＲＮＡだけを特異的に分解する
酵素を植物で発現させた時に、植物はほとんどのＲＮＡ
ウィルスに対して抵抗性を示すであろうことを期待し、
鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。本
発明者らの知る限り、従来このような試みは全く行われ
ていない。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、二本鎖ＲＮＡ
を特異的に分解する酵素活性を持つ蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列を植物染色体中に組み込んで発現させること
により、ＲＮＡウィルスに対して抵抗性を持つ植物を作
出する方法、及びそのような方法で得られたＲＮＡウィ
ルスに抵抗性を持つ植物に関するものである。

【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１４】1) 二本鎖ＲＮＡを特異的に分解する酵素
活性を持つ蛋白質をコードするＤＮＡ配列 二本鎖ＲＮＡを特異的に分解する酵素活性を持つ蛋白質
（以下「二本鎖RNase」という。）とは、二本鎖ＲＮＡ
を分解するが、一本鎖ＲＮＡはほとんど分解しないよう
なＲＮＡ分解酵素（リボヌクレアーゼ）（以下、場合に
より「RNase 」という。）活性を持つ蛋白質をいう。二
本鎖RNase としては、大腸菌由来のRNaseIII、酵母由来
のpacI遺伝子にコードされたＲＮＡ分解酵素などが知ら
れている。

【００１５】本発明においては、これらの自然界に存在
する種々の二本鎖RNase のいずれを用いてもよい。更
に、これらにいろいろなアミノ酸置換、欠損、付加、挿
入が加わった変異二本鎖RNase であっても、二本鎖ＲＮ
Ａを特異的に切断する活性を保持している限り、本発明
に用いることができる。本発明において「実質的に（あ
る二本鎖RNase ）」という場合の「実質的に」という用
語は、自然界に存在する二本鎖RNase だけでなく、この
ような変異二本鎖RNase をも包含することを示す。

【００１６】以下に示す実施例においては、二本鎖RNas
e をコードするＤＮＡ配列として、酵母Schizosaccharo
myces pombe 由来のpacI遺伝子を使用したが、本発明の
目的に使用し得る二本鎖RNase をコードするＤＮＡ配列
は、このpacIに限定されるものではないことはいうまで
もない。

【００１７】また、一般にあるＤＮＡ配列があるアミノ
酸配列を持つポリペプチドをコードする場合、一つのア
ミノ酸に対応する遺伝コード（コドン）が複数存在する
ために、一つのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列が複
数個存在する（縮重異性体）。本発明に用いる二本鎖RN
ase をコードするＤＮＡ配列においても、それがコード
するポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲に
おいて、任意の遺伝コードを用いることができることは
いうまでもない。

【００１８】pacI遺伝子はすでに全塩基配列が公知とな
っている（EMBO J., 10, 221, 1991）ので、この公知の
塩基配列を基に、酵母Schizosaccharomyces pombe（例
えばATCC 2478 株など）から単離したり、一部又は全体
を化学合成したりして得られることは、当業者にとって
自明であろう。pacI遺伝子のほかに、大腸菌由来の二本
鎖RNase であるRNaseIIIの遺伝子の全塩基配列が公知と
なっている（NucleicAcids Res., 13, 4677, 1985）。

【００１９】2) 二本鎖RNase をコードするＤＮＡ配列
の発現 二本鎖RNase をコードするＤＮＡ配列が遺伝子組換え植
物体中で発現するためには、少なくともこのＤＮＡ配列
がＲＮＡに転写されることが必要である。植物細胞の染
色体中に外来遺伝子を組み込む場合、ある確率によって
染色体上の被転写領域に組み込まれることが知られてい
る（EMBO J., 6, 3891, 1987）ので、二本鎖RNase をコ
ードするＤＮＡ配列を単独で組み込んで発現させること
も可能である。しかし、好ましくはあらかじめ適当なプ
ロモーター及びターミネーター配列を連結してから組み
込むことが好ましい。

【００２０】この場合、プロモーターとしては、これま
でに植物細胞中で機能することが知られているあらゆる
プロモーター、具体的にはリブロース−1,5−2 リン酸
カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子の
プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモータ
ー、カリフラワーモザイクウイルス19S-ＲＮＡを生じる
プロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの35S-Ｒ
ＮＡを生じるプロモーター（CaMV 35Sプロモーター）
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2358, 1986;Plant
Cell Rep., 4, 355, 1985; Cell, 30, 763, 1982; Nat
ure, 313, 810, 1985）等を用いることができる。ター
ミネーターとしても、これまでに植物細胞中で機能する
ことが知られているあらゆるターミネーターを使用する
ことができる。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の
ターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネ
ーター（J. Mol. Appl. Gen., 1, 561 1982; EMBO J.,
3, 835, 1984）等を利用することができる。

【００２１】3) 二本鎖RNase をコードするＤＮＡ配列
の植物への組み込み 植物細胞に二本鎖RNase をコードするＤＮＡ配列を導入
するには、すでに報告され確立されている種々の方法、
例えばAgrobacterium tumefaciens のＴｉプラスミドを
ベクターとして用いる方法や、植物片や植物プロトプラ
ストに直接ＤＮＡを導入する方法などを、目的とする植
物種に応じて適宜用いることができる（例えば"Plant g
enetic transformation and gene expression; a labor
atory manual", Draper, J. et al. eds., Blackwell S
cientific Publications, 1988を参照）。一般に、遺伝
子を導入しようとする植物が双子葉植物である場合に
は、Ｔｉプラスミドベクターを用いるのが好ましいこと
が多い。単子葉植物やアグロバクテリウムに感染しにく
い双子葉植物の場合には、エレクトロポレーションなど
の物理的導入法が好ましい。遺伝子導入のための植物材
料としては、導入法に応じて、葉片、茎片、塊茎片、プ
ロトプラスト、カルス、花粉などから適当なものを選ぶ
ことができる。形質転換した植物組織又は細胞を植物種
に応じた適当な条件下で組織培養することにより、形質
転換植物体を再生することができる。

【００２２】

【実施例】以下に実施例を挙げて更に具体的に本発明を
説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定される
ものではない。

【００２３】以下の実施例では、二本鎖RNase ＤＮＡ配
列として前述のpacI遺伝子を使用し、植物でこの遺伝子
を発現させるためのプロモーターとしてはCaMV 35Sプロ
モーターを使用した。pBI121ベクター（EMBO J., 6, 39
01, 1987）上に乗っている大腸菌由来のβ−グルクロニ
ダーゼ遺伝子（β-GUS）とpacI遺伝子の二本鎖RNase蛋
白をコードする領域を含むＤＮＡとを入れ替え、pacI遺
伝子を植物で発現させるためのプラスミドを構築した。

【００２４】本発明の効果を確認するための宿主植物と
してタバコ（サムソン株とキサンチnc株）を使用し、pa
cI遺伝子を含むpBI121プラスミドを導入したアグロバク
テリウムを用いて、リーフディスク法（Science, 223,
496, 1985 ）によりタバコ形質転換体を得た。

【００２５】形質転換体植物中のpacI遺伝子産物の発現
のチェックは、葉の粗抽出液をSDSポリアクリルアミド
電気泳動し、抗pacI抗体により免疫化学的に行った。タ
バコモザイクウィルス（TMV-OM株）、キュウリモザイク
ウィルス（CMV-Y 株）及びジャガイモＹウイルス（ＰＶ
Ｙ−Ｔ株）を用いてウィルス感染試験を行ったところ、
pacI遺伝子を高発現している形質転換タバコ植物体は、
いずれのウィルスに対しても抵抗性を示した。 （実施例１） 形質転換植物作製に用いるプラスミドの
構築（図１）Schizosaccharomyces pombe 由来のpacI遺伝子を含む約
３kbp の制限酵素HindIII 断片（EMBO J., 10, 221, 19
91）を、ClaI＋RsaI及びClaI＋DraIで切断後、それぞれ
１％アガロースゲル電気泳動にて分画し、約900bp のRs
aI−ClaI断片と約250bp のClaI−DraI断片をアガロース
ゲルより抽出精製した。これらの２つの断片をpBluescr
ipt IISK+ (Stratagene 社) ベクターのSmaIサイトへサ
ブクローンして、約1150bpのpacI遺伝子断片が挿入され
たプラスミドを得た。このプラスミドを精製し、EcoRI
＋BamHI で切断後、Klenow断片（宝酒造）で平滑末端に
し、アガロースゲル電気泳動により平滑末端化された約
1150bpのpacI遺伝子を含むＤＮＡ断片を抽出精製した。

【００２６】一方、pBI121ベクタープラスミド（Clonet
ech 社）をSmaI＋SstIで切断後、β-GUS遺伝子を取り除
き、SmaIリンカーを介してセルフライゲーションさせて
pBI121-GUSを作製した。このpBI121-GUSベクタープラス
ミドをSmaIで切断後アルカリフォスファターゼ（CIAP；
ベーリンガー社）処理した断片と、上記で得た約1150bp
のpacI遺伝子を含むＤＮＡ断片とをライゲーションし、
大腸菌XL1-Blue株（Stratagene社）に導入した。pacI遺
伝子がCaMV 35Sプロモーターの下流に正しい方向に挿入
されたプラスミドをpBI121＋pacIと呼ぶ。 （実施例２） アグロバクテリウムによるタバコの形質
転換 形質転換には、タバコ（Nicotiana tabacum)サムソン株
（Samsun）とキサンチnc株(Xanthi nc) を用いた。pRK2
013 プラスミドを持つ大腸菌C600株をヘルパーとする接
合伝達により、プラスミドpBI121＋pacIを大腸菌XL1-Bl
ue株からアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaci
ens)LBA4404 株に導入した（例えば、DNA Cloning II,
D.M. Glover, IRL Press, 1985 を参照）。

【００２７】リーフディスク法（Science, 223, 496, 1
985）によりタバコ葉片にアグロバクテリウムを感染さ
せ、250 μg/mlクラフォラン、100 μg/mlカナマイシン
入りMS-B5 培地（Murashige & Skoog 基本培地（Physio
l. Plant., 15, 473, 1962)にB5ビタミンを添加したも
の）上に置床して形質転換組織を選択した。シュートが
出てきたら、ホルモンフリーのMS培地に移し発根させ
た。得られた形質転換植物体は、無菌インビトロカルチ
ャーにて継代培養した。 （実施例３） 形質転換タバコ中のpacI遺伝子産物の検
出 インビトロで培養した形質転換タバコの葉を等量の抽出
バッファーＡ（50mM Tris-HCl pH7.5, 0.25M KCl, 2mM
EDTA, 1mM メルカプトエタノール, 0.1mM ジチオスレイ
トール(DTT), 200μM フェニルメチルスルホニルフルオ
リド(PMSF), 20μg/mlロイペプチン, 50μg/mlウシ肺ア
プロチニン(bovine lung approtinine),0.05 ％デオキ
シコール酸ナトリウム）に入れ、テフロン（登録商標）
ペッスルホモジナイザー（20ml）を使用し磨砕した。1
5,000rpm 、４℃、20分間遠心後、上清を取った。Bradl
ey の方法（Bio-rad 社の蛋白アッセイキット）で蛋白
質量を測定し、１つのサンプル当たり 150μg の蛋白質
を取り、SDS ポリアクリルアミドゲル（10％アクリルア
ミド）電気泳動を行った。電気泳動後、セミドライブロ
ット装置（ザルトリウス社）によりポリビニリデンジフ
ルオリド(PVDF)膜（ミリポア社）へ蛋白を転写した。

【００２８】pacI遺伝子産物と大腸菌S4蛋白質との融合
蛋白質を大腸菌に生産させて精製し、これをウサギに免
疫して抗血清を得た。この抗血清のイムノグロブリンＧ
画分をとり、S4蛋白質を結合させたセルロースカラムを
素通りする画分を得た。次に、この画分を大腸菌に作ら
せたpacI遺伝子産物（EMBO J., 10, 221, 1991）を結合
させたアフィニティカラムに吸着させ、洗浄後、吸着し
た抗体を溶出して抗pacI抗体液を得た。

【００２９】PVDF膜に転写した形質転換タバコ葉の蛋白
質を上記の抗pacI抗体と反応させ、パーオキシダーゼＡ
ＢＣキット（Vectastain；フナコシ社）を用いて抗体と
反応する蛋白質を検出した。この実験で検出された蛋白
質がpacI遺伝子産物であることを確認するために、大腸
菌に作らせたβ- ガラクトシダーゼ−pacI融合蛋白質と
前もって反応させた抗pacI抗体を用いて同様の実験を行
い、上記の実験結果と比較した。

【００３０】形質転換タバコ（サムソン）では、pacI＃
１と＃４のクローンから、pacI遺伝子産物と考えられ
る、抗pacI抗体と特異的に反応するバンド（約70kDa)が
検出された。一方、コントロールの非形質転換タバコと
pBI121プラスミド導入タバコ（以下「β-GUSトランスジ
ェニックタバコ」という。）、及び形質転換体のpacI＃
２クローンでは、抗pacI抗体と特異的に反応するバンド
は検出されなかった（図２、但し＃４については結果は
示していない）。なお、形質転換体pacI＃１、＃２につ
いて、植物細胞中のpacI遺伝子のｍＲＮＡの有無を調べ
たところ、どちらの場合も発現が認められた（データは
示されていない）。＃２クローンでpacI蛋白質が検出さ
れない理由は明らかでない。

【００３１】一方、形質転換タバコ（キサンチnc）で
は、pacI＃８のクローンにpacI遺伝子産物と考えられる
蛋白質のバンド（約70kDa)が検出されたが、コントロー
ルの非形質転換タバコ及び形質転換体pacI＃３、＃４、
＃９のクローンではpacI遺伝子産物検出はされなかった
（図３）。 （実施例４） pacI遺伝子産物の二本鎖ＲＮＡ分解酵素
活性の検出 インビトロで培養したトランスジェニックタバコ（サム
ソン）の葉を等量の抽出バッファーＢ（抽出バッファー
Ａからデオキシコール酸ナトリウムを除いたもの）によ
って磨砕し、実施例３と同様にして全蛋白質を抽出し
た。200 μg 蛋白質に相当する葉抽出液（容量が43μl
となるようバッファーＢで希釈）に、１μl の実施例３
で得た抗pacI抗体液又は１μl のリン酸バッファーをま
ぜ、４℃で２時間インキュベートした。次に、５μl の
IgGsorb（エンザイムセンター；フナコシ社）を加え、
４℃、５分間遠心後、上清をとり、二本鎖ＲＮＡ分解酵
素活性を測定した。下記の反応液中でサンプルとトリチ
ウムラベルした二本鎖ＲＮＡ基質を37℃、30分間反応さ
せ、トリクロロ酢酸(TCA) 不溶性画分中の放射活性を測
定し（EMBO J., 10, 221, 1991） 、抗pacI抗体を入れ
ないときの値から抗体を入れたときの値を差し引いた値
をpacI遺伝子産物によるＲＮＡ分解酵素活性とした（表
１）。 ［反応液］50μl サンプル 50μl ２×反応バッファー（40mM Tris-HCl pH7.5, 0.2M KCl, 0.02M MgCl₂, 0.2mM DTT, 50μg/ml ³H polyA:polyU^*） ＊基質 ³H polyA:polyU の調製 10mg/ml polyA （ファルマシア社） 24.6μl （246 μg） 10mg/ml polyU （ファルマシア社） 25μl （250 μg） 20μCi/ml ³H polyA（アマーシャム社）250μl （約４μg） 3M KCl 330μl 1M Tris-HCl pH7.5 20μl 滅菌精製水で全量を１mlにし、25℃で一晩反応させた。

【００３２】

【表１】

【００３３】実施例３において、抗pacI抗体と特異的に
反応するバンドが検出されたトランスジェニックタバコ
pacI＃１のみが、有意なpacI産物による二本鎖ＲＮＡ分
解酵素活性を示した。 （実施例５） タバコモザイクウィルス(TMV) 感染試験 1) pBI121＋pacIプラスミド導入タバコ（サムソン） インビトロ植物を馴化後３週間経過したものに、10mMリ
ン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）に懸濁したTMV-OM
株（0.1 μg/ml）を、カーボランダムを用いて葉の表側
に接種した。

【００３４】感染後11日目に、ウィルスを接種した葉よ
り上の葉を一部切り取り、その５倍重量のSDS バッファ
ー（2 ％ SDS, 80mM Tris-HCl pH6.8, 2％２−メルカプ
トエタノール, 10％グリセリン）で全蛋白質を抽出し
た。各サンプルをSDS 電気泳動用サンプルバッファー
（50mM Tris-HCl pH6.8, 1％ SDS, 1 ％２−メルカプト
エタノール, 10％グリセリン, 0.05％ブロモフェノール
ブルー）で100 倍に希釈後、10μl をSDS ポリアクリル
アミド電気泳動（12.5％アクリルアミド）で分画した。
PVDF膜へ蛋白質を転写し、抗TMV 血清（ウサギ）（300
倍希釈）とパーオキシダーゼＡＢＣキットにより、感染
植物の葉中のTMV を検出した（図４）。

【００３５】トランスジェニックタバコ（サムソン）pa
cI＃２及びコントロール（非形質転換体、β-GUSトラン
スジェニックタバコ）の接種上葉中からは、感染後11日
目でTMV が検出されたのに対し、トランスジェニックタ
バコ＃１からは検出されなかった。＃４からはTMV が検
出されたが、＃２及びコントロールに比べて明らかにTM
V 外被蛋白質の量が少なかった。

【００３６】これらのトランスジェニックタバコ（サム
ソン）のウィルス感染によるモザイク病徴の出現（接種
後19日目）を図５に示す。抗pacI抗体で特異的に染色さ
れる蛋白質が発現され、pacI遺伝子産物による二本鎖Ｒ
ＮＡ分解酵素活性が検出されたトランスジェニックタバ
コpacI＃１（実施例３、４参照）では、明らかなモザイ
ク病徴出現の遅延が認められた。一方、pacI遺伝子産物
の発現が認められなかったトランスジェニックタバコpa
cI＃２では、病徴の遅延も認められなかった。図６にTM
V 感染後の病徴出現をグラフで示す。

【００３７】2) pBI121＋pacIプラスミド導入タバコ
（キサンチnc） サムソンの場合と同様にして、馴化後３週間経過した植
物体にTMV-OM（0.1 μg/ml）を接種した。ウィルスを接
種する葉は下から４−５枚目のものとした。ウィルス感
染後、接種葉での壊死斑の出現を観察し、壊死斑の出現
時期、壊死斑の数及び大きさをグラフで示した（図
７）。

【００３８】抗pacI抗体で特異的に染色される蛋白質が
発現されている形質転換タバコ（キサンチnc）pacI＃８
（実施例３参照）では、壊死斑の出現が遅れるととも
に、その数及び大きさが減少した。一方、pacI遺伝子蛋
白質の発現が見られなかった形質転換タバコpacI＃３、
＃４、＃９においては、壊死斑の出現時期、数及び大き
さについて、コントロール（非形質転換体）と顕著な差
が認められなかった。

【００３９】以上の結果は、二本鎖RNase（pacI遺伝子
産物）のタバコ植物（サムソン、キサンチnc）での発現
が、TMV の複製を抑制することを示している。 （実施例６） キュウリモザイクウィルス(CMV) 感染試
験 1) pBI121＋pacI導入タバコ（サムソン） インビトロ植物を馴化後２週間経過したものに、10mMリ
ン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）に懸濁したCMV-Y
株（１μg/ml）を、カーボランダムを用いて葉の表側に
接種し、ウィルス感染後の病徴の出現を観察した。接種
後13日目の各タバコ植物体の病徴発現のようすを図８に
示す。また図９に接種後の病徴の出現、葉に現れる黄化
の程度をグラフで示す。

【００４０】コントロールのβ-GUSトランスジェニック
タバコ（サムソン）に比べてpacIトランスジェニックタ
バコでは病徴発現が遅れ、接種後19日目の病徴（葉の黄
化の程度）は、β-GUS＞pacI＃２＞pacI＃１の順であっ
た。

【００４１】2) pBI121＋pacI導入タバコ（キサンチn
c） サムソンの場合と同様にして、馴化後２週間経過した植
物体にCMV-Y （0.1 μg/ml）を接種した。ウィルス感染
後14日目に、ウィルスを接種した葉より上の葉（上から
３枚目の葉）の一部を切り取り、実施例５の1)と同様に
して全蛋白質を抽出、分画してPVDF膜に転写し、抗CMV
血清（ウサギ、約2000倍希釈）とパーオキシダーゼＡＢ
Ｃキットにより、感染植物の葉中のCMV を検出した。

【００４２】形質転換タバコ（キサンチnc）pacI＃８で
は、コントロール及びpacI蛋白質の発現がみられない形
質転換タバコpacI＃３、＃４、＃９に比べて、接種上葉
中のCMV 外被蛋白質の減少が認められた（図10）。

【００４３】感染14日目のコントロール及び各形質転換
植物の葉に現れた病徴（黄化の程度）を図11に示す。ま
た、図12にウィルス接種後の病徴出現、黄化の程度をグ
ラフで示した。pacI形質転換タバコ（キサンチnc）pacI
＃８では、コントロール、pacI＃３、＃４、＃９に比べ
て明らかに病徴の出現が遅れた。これらの結果は形質転
換タバコpacI＃８の葉中では、CMV の複製が抑制されて
いることを示す。 （実施例７） ジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）感染試
験 pBI121＋pacIプラスミド導入タバコ（キサンチnc）を用
いてジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）の感染試験を行っ
た。

【００４４】Nicotiana sylvestrisにＰＶＹえそ系統
（ＰＶＹ−Ｔ）を接種後、乾燥保存した感染葉に５倍量
の10mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0, 20mM ２−
メルカプトエタノールを含む）を加え、乳鉢ですりつぶ
した。遠心分離後、上清を上記のバッファーで1000倍に
希釈し、カーボランダムを用いて、馴化２週間後の形質
転換タバコ（キサンチnc）の葉の表側に接種した。

【００４５】コントロール（非形質転換体）及び形質転
換タバコ（キサンチnc）各６個体にＰＶＹ−Ｔ接種後、
病徴を観察し、明らかな病徴（えそ斑の出現）を示した
個体の出現数を図13に示した。pacI蛋白質を発現する形
質転換タバコpacI＃８では、コントロール、pacI蛋白質
を発現しないpacI形質転換タバコ＃３、＃４に比べて発
病個体の出現が遅れ、ＴＭＶ及びＣＭＶ接種試験の場合
と同様、ＰＶＹに対してもpacI導入によるウイルス抵抗
性の付与効果が認められた。 （実施例８） 植物発現用改変RNaseIII遺伝子の合成 植物発現用改変RNaseIII遺伝子をデザイン（図14）する
に当たって、大腸菌由来RNaseIII遺伝子の塩基配列(Nuc
leic Acids Res., 13, 4677, 1985; Corrigenda, 6400)
を基に、アミノ酸に対応するコドンを植物遺伝子のコド
ン利用頻度(Nucleic Acids Res., 17, 477, 1989)の高
いものに変え、アデニン、チミン塩基の連続した部分
は、アミノ酸配列を変化させない範囲でグアニン又はシ
トシン塩基と置換した。また、5'- 側翻訳開始コドン(A
TG) の前に制限酵素EcoRI 認識配列、3'- 側翻訳終止コ
ドン(taa) の後ろに制限酵素SalI認識配列を付加した
（図14の小文字で表した塩基）。また、塩基の合成は図
14に境界線で示したごとく26の部分（図15の１〜13及び
1c〜13c）に分けて合成を行った。合成は、アプライド
バイオシステムズ社のＤＮＡ合成機（A394）を用いて行
った。

【００４６】合成したＤＮＡは、OPC カートリッジ（ア
プライドバイオシステムズ社）を用いて精製し、分光光
度計で260nm の吸収を計ることによりＤＮＡ濃度を決定
した。合成したＤＮＡのつなぎ合わせは、全ての合成Ｄ
ＮＡの同時リガーゼ反応の後のPCR 応により行った(Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4084, 1991) 。図15に
示したように、5'- 側末端＋鎖の合成ＤＮＡ（図15の
１）と3'- 側末端ー鎖のＤＮＡ（図15の13c）を除く、2
4本の合成ＤＮＡそれぞれ25pmolを反応液15μlで個々に
反応を行った。反応後、68℃で10分間加温した。24種の
リン酸化したＤＮＡ溶液を１本のチューブに集め、更に
2.5μl(10 pmol/μl)ずつリン酸化していない１及び13
c のＤＮＡを加え、アニーリング反応（95℃、５分間加
熱後1.5時間で室温まで戻す）を行った。これに40ユニ
ットのT4リガーゼ（ベーリンガー）を加え、12℃で一晩
反応させた。68℃で10分間加熱しリガーゼを失活させた
後、反応液の20μl を取り、RNaseIIIの5'- 側末端と3'
- 側末端のＰＣＲプライマー（図14の網かけ部分）によ
ってＰＣＲを行った。ＰＣＲは、反応液 100μl で94℃
で１分、57℃で２分、72℃で２分、35サイクルの条件で
行った（パーキンエルマーシータス社、モデル280 ）。
ＰＣＲによって得られた約700bp のバンドをEcoRI, Sal
I 消化し、 1.5％アガロースゲル電気泳動後、ゲルから
抽出し、pBluescript IISK+(Stratagene社）ベクターへ
クローニングした。クローニングしたRNaseIII遺伝子Ｄ
ＮＡは、ＤＮＡシークエンスによってデザインしたもの
と同一であることを確認した。

【００４７】ここに得られたRNaseIII遺伝子ＤＮＡは、
pBI121プラスミドへつなぎ植物へ導入することによって
複数のウイルスに抵抗性を示す植物を作出し得る。 （実施例９） Ｒ1 植物（トランスジェニック植物の種
から発芽させたもの）におけるウイルス抵抗性pacI トランスジェニックタバコ＃８（キサンチnc）より
得られた種を 500μg/mlカナマイシンを含むＭＳホルモ
ンフリー培地に置床し、正常に発芽してきたカナマイシ
ン耐性苗を選抜した。これらをカナマイシンを含まない
ＭＳホルモンフリー培地でインビトロ増殖させ、葉より
ＤＮＡを抽出した（石田、三沢著「細胞工学実験操作入
門」1992 講談社刊）。抽出したＤＮＡを制限酵素EcoR
I とBamHI で消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動
しサザンブロットを行った。アクチン遺伝子を内部標準
として、pacI遺伝子をＲo 植物（元のpacI＃８キサンチ
nc）と同じく１コピー持つもの（ヘテロ）、その倍の２
コピー持つもの（ホモ）を同定した。馴化後２週間のＲ
1 植物キサンチnc＃8-2,＃8-4 （ホモ）、＃8-3 （ヘテ
ロ）及びコントロール（キサンチncタバコ）について、
TMV 感染実験を行った。TMV(OM株）を10mMリン酸バッフ
ァー(pH7.4) により 0.1μg/mlに希釈し、カーボランダ
ムと共に葉の上面に接種した。感染後４日目に、TMV 感
染によって生じたスポットの数と大きさを観察した（図
16）。この結果から、pacI遺伝子で形質転換した植物の
ウイルス抵抗性形質は後代に遺伝することが確かめられ
た。

【００４８】

【発明の効果】二本鎖RNase (pacI 遺伝子産物）を発現
している植物は、TMV 、CMV などに対して抵抗性を持っ
ていた。これらのウィルスは異なるグループに属する植
物ウィルスであり、遺伝子構造、遺伝子の発現様式、更
には複製のメカニズムなどさまざまな点で大きく異なっ
ている。例えば、TMV は単一のゲノムＲＮＡを持つ単粒
子性ウィルスであるのに対し、CMV は３つに分節したゲ
ノムＲＮＡを持つ三粒子性ウィルスである。このように
大きく異なる複数のウィルスに対して抵抗性を示す組換
え植物体を、単一の遺伝子の導入発現によって作出した
例は、従来全く知られていない。

【００４９】複製メカニズムの全く異なるTMV 、CMV な
どに対してともに抵抗性を示したことは、二本鎖RNase
の発現によって広い範囲のＲＮＡウィルスの複製が抑制
され、ウィルスの増殖が阻害されることを示している。
また、どのような突然変異ウィルスであろうとも、ＲＮ
Ａウィルスである以上必ず複製段階で二本鎖ＲＮＡを形
成する。従って、二本鎖RNase の発現によるウィルス抵
抗性に対しては、これを克服するオーバーカマーウィル
スが出現する可能性が極めて低いことは、当業者にとっ
て明らかであろう。

【００５０】以上示したように、本発明の遺伝子組換え
によるウィルス抵抗性植物作出技術は、ウィルス抵抗性
植物品種の育成に広く応用ができると考えられる。

【００５１】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：７０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ハイポセティカル配列：No アンチセンス配列：No 配列： CCGAATTCC ATG AAC CCA ATC GTT ATC AAC AGG CTT CAA AGG AAG CTT 48 GGCTTAAGG TAC TTG GGT TAG CAA TAG TTG TCC GAA GTT TCC TTC GAA 48 GGA TAC ACC TTC AAC CAC CAA GAG CTT CTT CAA CAA GCT CTT ACC CAC 96 CCT ATG TGG AAG TTG GTG GTT CTC GAA GAA GTT GTT CGA GAA TGG GTG 96 AGG TCT GCT TCT TCT AAG CAC AAC GAG AGG CTT GAG TTC CTT GGA GAC 144 TCC AGA CGA AGA AGA TTC GTG TTG CTC TCC GAA CTC AAG GAA CCT CTG 144 TCT ATC CTT TCT TAC GTT ATC GCT AAC GCT CTT TAC CAC AGG TTC CCA 192 AGA TAG GAA AGA ATG CAA TAG CGA TTG CGA GAA ATG GTG TCC AAG GGT 192 AGG GTT GAC GAG GGA GAC ATG TCT AGG ATG AGG GCT ACC CTT GTT AGG 240 TCC CAA CTG CTC CCT CTG TAC AGA TCC TAC TCC CGA TGG GAA CAA TCC 240 GGA AAC ACC CTT GCT GAG CTT GCT AGG GAG TTC GAG CTT GGA GAG TGC 288 CCT TTG TGG GAA CGA CTC GAA CGA TCC CTC AAG CTC GAA CCT CTC ACG 288 CTT AGG CTT GGA CCA GGA GAG CTT AAG TCT GGA GGA TTC AGG AGG GAG 336 GAA TCC GAA CCT GGT CCT CTC GAA TTC AGA CCT CCT AAG TCC TCC CTC 336 TCT ATC CTT GCT GAC ACC GTT GAG GCT CTT ATC GGA GGA GTT TTC CTT 384 AGA TAG GAA CGA CTG TGG CAA CTC CGA GAA TAG CCT CCT CAA AAG GAA 384 GAC TCT GAC ATC CAA ACC GTT GAG AAG CTT ATC CTT AAC TGG TAC CAA 432 CTG AGA CTG TAG GTT TGG CAA CTC TTC GAA TAG GAA TTG ACC ATG GTT 432 ACC AGG CTT GAC GAG ATC TCT CCA GGA GAC AAG CAA AAG GAC CCA AAG 480 TGG TCC GAA CTG CTC TAG AGA GGT CCT CTG TTC GTT TTC CTG GGT TTC 480 ACC AGG CTT CAA GAG TAC CTT CAA GGA AGG CAC CTT CCA CTT CCA ACC 528 TGG TCC GAA GTT CTC ATG GAA GTT CCT TCC GTG GAA GGT GAA GGT TGG 528 TAC CTT GTT GTT CAA GTT AGG GGA GAG GCT CAC GAC CAA GAG TTC ACC 576 ATG GAA CAA CAA GTT CAA TCC CCT CTC CGA GTG CTG GTT CTC AAG TGG 576 ATC CAC TGC CAA GTT TCT GGA CTT TCT GAG CCA GTT GTT GGA ACC GGA 624 TAG GTG ACG GTT CAA AGA CCT GAA AGA CTC GGT CAA CAA CCT TGG CCT 624 ＴＣＴ ＴＣＴ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＡＡ ＧＣＴ
ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＡＧ ６７２ AGA AGA TCC TCC TTC CGA CTC GTT CGA CGA CGA CTT GTT CGA GAA TTC 672 AAG CTT GAG CTT GAA TAATTTTTAG CAGAGTCGAC GG 709 TTC GAA CTC GAA CTT ATTAAAAATC GTCTCAGCTG CC 709

【図面の簡単な説明】

【図１】pacI遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築
を示す図である。

【図２】形質転換タバコ（サムソン）の葉中のpacI遺伝
子産物の検出のための電気泳動の結果を示す写真であ
る。非形質転換体(control) 、β-GUSトランスジェニッ
クタバコ（βGUS ）及びpacI＃１、＃２形質転換タバコ
（サムソン）の葉粗抽出液を、抗pacI抗体（上のパネ
ル）β−ガラクトース−pacI融合蛋白質で吸収した抗pa
cI抗体（下のパネル）と反応させた。

【図３】形質転換タバコ（キサンチnc）の葉中のpacI遺
伝子産物の検出のための電気泳動の結果を示す写真であ
る。非形質転換体(control) 、pacI＃３，＃４，＃８，
＃９形質転換タバコ（キサンチnc）の葉粗抽出液を、抗
pacI抗体と反応させた。

【図４】タバコモザイクウィルス(TMV) 接種タバコ（サ
ムソン）葉中のTMV 外被蛋白質の検出のための電気泳動
の結果を示す写真である。TMV 接種後11日目の非形質転
換体(control) 、β-GUSトランスジェニックタバコ（β
GUS ）及びpacI＃１、＃２、＃４トランスジェニックタ
バコ（サムソン）（TMV ＋のレーン）又はTMV を接種し
ていないタバコ（TMV −のレーン）のウィルス接種上葉
から全蛋白質を抽出し、抗TMV ウサギ血清と反応させ
た。

【図５】TMV 接種後19日目の非形質転換体(control) 、
β-GUSトランスジェニックタバコ（βGUS ）及びpacI＃
１、＃２、＃４トランスジェニックタバコ（サムソン）
の病徴出現を表す生物の形態を示す写真である。

【図６】TMV 接種後の非形質転換体(control) 、β-GUS
トランスジェニックタバコ（βGUS ）及びpacI＃１、＃
２、＃４トランスジェニックタバコ（サムソン）におけ
る病徴出現の経過を示す図である。病徴の程度を以下の
２段階に分けて示した。 TMV 感染後病徴が僅かに上葉に出現 ＋ 病徴が顕著になった状態 ＋＋

【図７】TMV 接種により非形質転換体(control) 及びpa
cI＃３、＃４、＃８、＃９形質転換タバコ（キサンチn
c）のウィルス接種葉に現れた壊死斑の数と大きさの、
感染後の時間経過による変化を示す図である。縦軸に接
種葉の左半分の領域の壊死斑数、横軸に感染後の時間を
取り、壊死斑の相対的な大きさを○の大きさで表した。

【図８】CMV接種後13日目のβ-GUSトランスジェニック
タバコ（βGUS ）及びpacI＃１、＃２トランスジェニッ
クタバコ（サムソン）に見られた病徴を表す生物の形態
を示す写真である。

【図９】CMV 接種後のβ-GUSトランスジェニックタバコ
（βGUS ）及びpacI＃１、＃２トランスジェニックタバ
コ（サムソン）における病徴出現の経過を示す図であ
る。病徴の程度を以下の３段階に分けて示した。 葉の一部分に僅かな黄化部位の出現 ＋ ＋と＋＋＋の中間の状態 ＋＋ 黄化が葉全体に広がった状態の出現 ＋＋＋

【図１０】CMV 接種タバコ（キサンチnc）葉中のCMV 外
被蛋白質の検出のための電気泳動の結果を示す写真であ
る。CMV 接種後14日目の非形質転換体(control) 、及び
pacI＃３、＃４、＃８、＃９形質転換タバコ（キサンチ
nc）（CMV ＋のレーン）又はCMV を接種していないタバ
コ（CMV −のレーン）のウィルス接種上葉から全蛋白質
を抽出し、抗CMV ウサギ血清と反応させた。

【図１１】CMV 接種後14日目の非形質転換体(control)
、及びpacI＃３、＃４、＃８、＃９形質転換タバコ
（キサンチnc）に見られた病徴を表す生物の形態を示す
写真である。

【図１２】CMV 接種後の非形質転換体(control) 、及び
pacI＃３、＃４、＃８、＃９形質転換タバコ（キサンチ
nc）における病徴出現の経過を示す図である。病徴の程
度を以下の３段階に分けて示した。 葉の一部分に僅かの黄化部位の出現 ＋ ＋と＋＋＋の中間の状態 ＋＋ 葉全体に黄化が広がった状態の出現 ＋＋＋

【図１３】ＰＶＹ接種後の非形質転換体(control) 、及
びpacI＃３、＃４、＃８形質転換タバコ（キサンチnc）
における発病の経過を示す図である。各タバコクローン
６個体に接種し、発病した個体の出現数を示した。

【図１４】植物発現用改変RNaseIII遺伝子ＤＮＡのデザ
インを示す図である。アミノ酸翻訳領域を大文字で、非
翻訳部分を小文字で示してある。各合成オリゴＤＮＡの
切れ目を下線で表している。また、ＰＣＲプライマー部
分は網目で示してある。

【図１５】合成したＤＮＡのリガーゼ反応とＰＣＲによ
る増幅方法を示す図である。

【図１６】TMV 接種後３日目のＲ1 植物（pacI＃8-2, p
acI＃8-4, pacI＃8-3）及びコントロールにおける接種
葉を表す生物の形態を示す写真である。

フロントページの続き (56)参考文献 Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ，［115］１／２，（1990），ｐ. １−21 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ，［11］４, （1985），ｐ．617−625 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，［13］13，（1985），ｐ. 4677−4685 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, ［10］１，（1991），ｐ．221−226 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，［172］１, （1989），ｐ．213−222 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，［87］２，（1990），ｐ. 588−592 Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，［78 ］３，（1988），ｐ．270−272 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A01H 1/00 - 5/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 二本鎖ＲＮＡを特異的に分解する酵素活
   性を持つ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を、アグロバク
   テリウム法、植物片又は植物プロトプラストへの直接Ｄ
   ＮＡ導入法及びエレクトロポレーション法から選ばれる
   いずれかの方法で形質転換可能な植物の染色体中に組み
   込んで発現させることにより、ＲＮＡウィルスに対して
   抵抗性を持つ植物を作出する方法。
2. 【請求項２】 二本鎖ＲＮＡを特異的に分解する酵素活
   性を持つ蛋白質が実質的に大腸菌由来のリボヌクレアー
   ゼIII 又は酵母由来のpacI遺伝子にコードされたＲＮＡ
   分解酵素である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 二本鎖ＲＮＡを特異的に分解する酵素活
   性を持つ蛋白質をコードするＤＮＡ配列が、アグロバク
   テリウム法、植物片又は植物プロトプラストへの直接Ｄ
   ＮＡ導入法及びエレクトロポレーション法から選ばれる
   いずれかの方法で形質転換可能な植物の染色体中に組み
   込まれ発現していることを特徴とするＲＮＡウィルスに
   抵抗性を持つ植物。
4. 【請求項４】 二本鎖ＲＮＡを特異的に分解する酵素活
   性を持つ蛋白質が実質的に大腸菌由来のリボヌクレアー
   ゼIII 又は酵母由来のpacI遺伝子にコードされたＲＮＡ
   分解酵素である請求項３記載の植物。