KR100193107B1

KR100193107B1 - 성분b로 명명된 신규 단백질

Info

Publication number: KR100193107B1
Application number: KR1019950702407A
Authority: KR
Inventors: 안토니오 시라나
Original assignee: 레지날드 쇼트버그 에스. 안토니우스-소도; 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-21
Publication date: 1999-06-15
Also published as: JP3025014B2; NO315800B1; EP0675956A1; RU2177480C2; DK0675956T3; ITRM920919A1; ES2193152T3; EP0675956B1; FI114478B; WO1994014959A1; US5908827A; PT675956E; UA46702C2; CA2151156A1; IT1257184B; ITRM920919A0; FI20040608A; AU690093B2; NO952494D0; ZA939621B

Abstract

추출파 이온교환 크로마토그래피와 고해상 크로마토그래피에 의한 정제공정을 통하여 뇨로부터 수득가능한 신규 단백질에 관계하며 기술한다. 분자량은 9KDa이고 항염중, 항-응집과 항-종양성질이 있다. 단백질은 TGF-알파가 이의 수용체에 결합하는 것을 저해한다.

Description

성분B로 명명된 신규 단백질

제1도는 뇨에서 성분B를 얻는 과정의 순서도이다.

제2도는 성분B의 게놈 전사유닛(SEQ ID NO:2에 보고된 성분B의 게놈 DNA)의 제한효소지도.

제3도는 성분B의 프로모터 부위서열(SEQ ID NO:2에 보고된 성분B의 프로모터부위). AP-1, AP-2, SP-1와 E-박스 전사인자에 대한 결합부위를 나타낸다. TATA박스도 지적하고, GRE도 지적한다.

제4도는 성분B 유전자의 제한효소지도이다. 유도된 mRNA는 선으로 나타낸 게놈 유전자 아래에 있고 곽은 단백질 코딩서열을 나타낸다.

제5도는 클론 4D 삽입된 제한효소지도이다.

제6도는 pBSCB4D 플라스미드의 제한효소지도이다.

제7도는 성분B DNA 서열은 RACE 클로닝에 사용되는 일반적인 방법이다.

제8도는 성분B cDNA 서열로써 제한효소부위가 나타나있고(이는 SEQ ID NO:3에 보고된 성분 cDNA이다).

본 발명은 성분B라 칭하는 신규 단백질에 관계한다. 특히 본 발명은 뇨, 뇨에서 준비한 물질에서 수득한 신규의 단백질, 이 단백질을 인코드하는 게놈 DNA 또는 cDNA 를 이용한 재조합 DNA기술에 의한 이의 생산, 그리고 치료요법적으로 이를 포함하는 제약학적 성분물과 이의 용도에 관계한다.

뇨 유도물질의 정제와 추출과정에서 신규 단백질이 분리되는데 이는 폴리펩티드 특징을 나타내고, 상대적으로 저분자량이다. 사람뇨를 카올린과 같은 흡습성물질로 처리하고, 하기의 과정에서와 같이 여과와 이온 교환 크로마토그래피와 고해상크로마토그래피를 실시하면 무정형 백색분말로써 냉동건조된 화합물이 수득되고 이는 HPLC-RP에서 단일 피크를 나타내고, 환원상태에서 소듐 도데실설페이트(SDS-PAGE) 존재하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석한 경우 약 9KDa의 분자량을 가진다. 이와 같은 단백질을 이하에서 성분B로 명명한다 .

성분B는 SEQ ID NO:1에서 보고된 것과 같이 아미노산 서열을 통해 구체적으로 특징화된다.

따라서 본 발명은 뇨를 흡수물질로 처히한후에 투석시킨 농축뇨에서 성물물 자체의 분리와 하기에서 기술하는 것과 같은 이온교환 크로마토그래피와 고해상 크로마토그래피에 의한 정제과정으로 구성된 공정을 통하여 수득할 수 있는 성분B로 명명된 신규단백질을 이용하는 것이다.

적절하게는 본 발명에 따른 단백질은 산업적 생산에 유용할 정도로 다량의 뇨가 있기 때문에 사람의 뇨에서 추출한다. 본 발명은 SEQ ID NO:1로 구성된 폴리펩티드, 이의 염, 기능적 유도물질, 전구물질과 활성성분 그리고 다른 단백질 또는 폴리펩티드 가령, 하나이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 하나이상의 아미노산이 서열에 첨가되었을 경우 성분B와 동일한 활성을 가지고, 성분B로 구서된 폴리펩티드와 다른 단백질이 융합된 돌연변이로써 체액에서 반감기가 더오래 지속되는 것과 같은 활성돌연변이체에 관계한다. 따라서 성분B는 이뮤노글로블린과 같은 또다른 단백질과 융합될 수도 있다.

여기에서 사용된 염의 정의는 카르복실기의 염과 공지방법을 통하여 얻을 수 있는 화합물의 아미노기능기 염 모두를 의미한다.

카르복실기염은 나트륨, 칼륨, 칼슘염과 같은 무기염, 트리에탄올아민, 아르기닌 또는 리신과 같은 아민으로 형성된 것과 같이 유기염기 염과 아미노기염은 염산과 같은 무기산염과 아세트산과 같은 유기산염으로 구성된다. 여기에서 사용된 기능적 유도체 정의는 공지의 방법에 따라 단부-N 또는 C기에 또는 아미노기의 측쇄에 있는 기능기에서 만들어질 수 있는 유도체를 언급하는 것으로 본 발명에서는 제약학적 수용가능한 즉, 단백질 활성을 파괴시키지 않고 이를 포함하는 제약학적 조성물에 득성을 제공하지 않는다. 이와 같은 유도체에는 카르복실기와 에스테르 또는 지방산 아미드와 아미노기의 N-아실유도체 또는 자유 OH기의 O-아실 유도체 그리고 알카노일 또는 아로일기와 같은 아실기로 형성될 수 있다.

전구체는 사람 또는 동물체내에서 성분B로 전환할 수 있는 화합물이다. 단백질의 활성부분에서 본 발명은 성분 자체단독으로 또는 관련분자에 복합하여 또는 당 또는 인산 또는 폴리펩티드 분자 응집체의 일부에 결합된 단편과 함께 화합물의 폴리펩티드 사슬의 전구체 또는 임의 단편을 언급하는 것으로 이때 이와 같은 단편 또는 전구물질은 의약물로써 성분B와 동일한 활성을 가진다.

본 발명은 전술한 것과 같은 폴리펩티드와 유도체 혼합물에도 관계한다.

본 발명의 제2편으로는 뇨를 흡수물질로 처리후에 투석된 농축뇨에서 단백질을 분리하고 이온 교환 크로마토그래피와 고해상 크로마토그래피를 통하여 정제하는 것으로 구성된 과정과 같은 성분B의 준비과정에 관계한다. 적절하게는 성분B는 제1도에서 설명한 과정을 통하여 준비된 다음의 단계로 구성된다:

a) 카올린으로 산성 pH에서 뇨를 처리하고 암모니아로 추출하고,

b) 암모니아와 Bio Rex 70 수지에서 (a)성분을 용출시키고,

c) 아세테이트 완충액과 DEAE 세파로스 수지에서 (b)부분을 용출시키고,

d) 아세테이트 완충액과 CM 세파로스 수지에서 (c)성분을 용출시키고,

e) 아세테이트 완충액과 아세토니트릴 혼합물과 HPLC C18 수지에서 (d)성분을 용출시키고,

f) 아세테이트 완충액과 DE-52 수지에서 (e)성분을 용출시키고,

g) 아세테이트 완충액과 D-제피리 수지에서 (f)성분을 용출시키고,

h) 수용성 트리폴로로아세트산과 아세토니트릴 혼합물과 HPLC C18 수지에서 (g)성분을 용출시키고,

i) 아세테이트 완충액과 D-제피리 수지에서 (h)성분을 용출시킨다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 핵산서열로 구성된 제조합 DNA 분자, 이의 활성 돌연변이체 또는 융합단백질, 발현벡터, 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포, 형질전환된 세포의 적절한 배지에서의 배양을 통한 폴리펩티드 이의 활성 돌연변이체 또는 융합단백질의 준비과정에 관계한다.

재조합 DNA 분자정의에는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 이의 복합체가 포함된다. 특히 본 발명은 SEQ ID NO:2 와 SEQ ID NO:3에서 각각 설명한 뉴클레오티드 서열에 관계한다.

SEQ ID NO:2 는 성분B를 인코드하는 게놈DNA 서열을 보고하고; 제2도에서는 성분B 전사유닛의 제한효소 지도를 설명한다.

SEQ ID NO:3 는 성분B를 인코드하는 CDNA 서열을 보고하고; 제8도에서는 성분B cDNA 서열을 나타내고 이때 제한효소위치는 표시되어 있다. 성분B의 클로닝은 상이한 기술을 통하여 실행될 수 있다. 이들 기술중 하나에 따라 올리고핵산 또는 이의 혼합물이 준비될 수 있는데 이들 서열은 성분B 또는 이의 단편서열에서 유도될 수 있고 이는 cDNA 또는 성분B를 인코드하는 게놈 DNA를 크로닝하기 위한 프로브로써 사용할 수 있다.

SEQ ID NO:4 는 SEQ ID NO:2 에 보고된 게놈 DNA 와 SEQ ID NO:3 에 보고된 cDNA 에 인코드된 아미노서열을 보고한다.

본 발명은 성분B 또는 이의 단편에 대한 DNA 서열과 하이브리드되는 재조합 DNA 분자에 관계한다.

유전자는 교유의 인트론을 포함하거나 하지 않을 수 있으며, 공지의 방법으로 적절한 세포로부터 추출하고 정제시킬 수 있다. 사람 게놈 DNA와 같은 적절한 DNA에는 제한효소로 적절하게 절단하고, 수득된 단편은 DNA라이브러리를 형성하기 위해 적절한 제한효소 벡터에 도입시킨다. 이와 같은 벡터는 본 발명에 따른 성분B를 인코드하는 서열을 확인하기 위해 합성 올리고 뉴클레오티드 프로브와 함께 선택될 수 있다.

특히, 본 발명에 따르면 성분B의 게놈 DNA는 분리되고 클론될 수 있다.

한편, 상응하는 mRNA는 성분B를 발현사키는 세포에서 분리하고 공지방법으로 cDNA를 생산하는데 사용될 수 있다. 후에 이중나선으로 전환되는 cDNA는 적절한 벡터에 유도되어 적절한 숙주세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 생성 배양물은 표적서열을 인코드하는 cDNA를 얻기 위해 적절한 프로브로 선택될 수 있다. 일단 소요의 클론이 분리되면 cDNA 는 게놈 DNA와 동일한 방식으로 조정할 수 있다.

유전자 코드의 변성 때문에 특정 아미노산을 인코드하는데에는 다양한 코드가 사용될 수 있어 하나이상의 올리고뉴클레오티드가 생성되고, 이들 각각은 성분B의 단편을 인코드할 수 있다. 그러나 이중 하나만이 유전자의 핵산서열과 동일한 서열을 가진다. 이러한 존재와 DNA와 하이브리드 할수 있는 능력이 표적 펩티드를 인코드하는 유전자를 클로닝하는데 사용될 수 있다. 또는 성분B의 유전자 단편을 인코드할 수 있는 이론적으로 가장 적절한 서열을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드는(rules for the use of codons in Lathe R, et al.J.Molec.Biol. 183:1-12(1985)) 성분B 또는 이의 단편을 인코드하는 상보 DNA의 확인을 허용한다.

핵산의 하이브리드 과정은 공지되어 있다. Maniatis T. et al. Molecular Cloning: Alaboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982) and in Haymes B.T. et al. Nucleic Acid Hybridization: A practical approach, IRL Press, oxford, England, (1985). 핵산 프로브를 이용하여 하이브리드 과정을 통하여 게놈 또는 cDNA 유전자 라이브러리에서 이와 같은 하이브리드를 할 수 있는 DNA 서열을 확인하고 이는 후에 본 발명에 따른 폴리펩티드(성분B)를 인코드하는지를 확인하기 위해 분석될 수도 있다. 이와 같은 상보적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 합성되고 그리고 본 발명에 따른 폴리펩티드(성분B)의 유전자를 확인하고 분리하는데 사용될 수 있다. 일단 공지의 방법을 이용하여 성분B에 대한 특이적 올리고뉴클레오티드가 선택되면 합성되고 DNA 또는 소요의 유전자를 발현시킬 수 있는 세포에서 유도한 cDNA 와 하이브리드하고 cDNA 소스에는 소요의 서열이 풍족하고, 소요의 유전자를 다량 발현시킬 수 있는 세포에서 RNA 를 추출하고 역전사효소를 사용하여 cDNA 로 전환시킬 수 있다.

또는 성분B에 특이적으로 적합한 올리고뉴클레오티드는 합성되고 RACE-PCR에 의해 성분B cDNA 단편의 증폭을 위한 프라이머로써 사용될 수 있다(M.A. Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990).

특히, 본 발명에 따르면, 상이한 사람과 세포조직의 스크리닝은 성분B의 mRNA에 대한 가장 적절한 원료를 확인하기 위해 우선적으로 실행된다. 사람은 뇌, 신장, 간, 폐, 심장, 췌장, 태반, 지라, 고환, 흉선, 뇨와 상피육종, 전골수구 백혈병, 유방아데노 육종, 부르키츠, 임파종과 흑색종이 이 목적을 위해 스크린될 수 있다.

스크리닝은 역전사효소-중합효소 사슬반응(RT-PCR) 민감성 검사를 이용하여 실행할 수 있다.

사람 뇨조직이 mRNA의 최적 원료로 나타났다.

성분B의 cDNA클론은 3'와 5' cDNA Ends의 신속한 증폭(RACE)오 같은 증폭방법을 사용하여 조직에서 얻을 수 있다.

전술한 방법으로 수득된 성분B를 인코드하는 DNA 분자는 공지기술로 만들어진 발현벡터내에 유입될 수 있다. 이중 나선 cDNA 는 합성 DNA 어댑터를 이용하는 기술 또는 블런트-단부결합기술을 사용하여 플라스미드 벡터에 연결될 수 있다.

표적단백질의 발현에서 발현벡터는 소요의 단백질을 인코드하는 DNA에 결합된 전사와 해독을 유전자의 발현과 단백질의 생산을 허용하는 방식으로 조절하는 정보를 포함하는 특정 뉴클레오티드로 구성된 무엇보다도, 유전자를 전사시키기 위해 RNA 중합효소에 의해 인지되는 프로모터에 의해 진행되고 전사과정이 시작된다.

많은 프로모터가 진핵과 원핵세포에 사용될 경우 상이한 효능(강한 프로모터와 약한 프로모터)을 가지도록 작동되는 것이 공지되어 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 프로모터는 람다 박테리오 파지 프로모터 int, pBR322 의 β-락타마제 유전자의 프로모터 B1a, pBR325 의 클로람페니를 아세틸트란스퍼라제 유전자의 프로모터 CAT 등과 구조성과 람다 박테리오파지의 주요 좌와 우프로모터와 같은 원핵생물의 프로모터(P1 와 Pr), 대장균 프로모터 trp, rec A, lac Z, lac I, ompF 와 gal 또는 하이브리드 프로모터 trp-lac(Glik B. R. J. Ind. Microbiol. 1:277-282(1987)와 같은 유도성 프로모터가 될수 있다.

원핵세포에서 다량의 유전자 발현을 위해 다량의 mRNA 를 생산시킬 수 있는 강한 프로모터와 함께 mRNA 가 효과적으로 해독되는가를 확인하기 위해 리포좀의 결합부위를 사용할 수 있다.

가령 시작코드에서 적절한 방식으로 위치한 샤인-달가노(SD) 서열에 의해 제공될 수 있다.

진핵세포에서 사용되는 숙주에 따라 전사와 해독을 조절하는 상이한 서열이 사용될 수 있다. 이들은 아데노바이러스 또는 파필로마 바이러스, 원숭이 바이러스와 같은 바이러스 원료에서 유도될 수 있는데 이때 조절시그날은 다량의 발현을 가지는 특이적 유전자와 관계한다. 가능한 예로는 허피스 바이러스의 프로모터 TK, SV40 프로모터, 이스트의 유전자 ga14 의 프로모토가 된다.

전자개시를 조절하는 신호는 유전자의 발현을 조절할 수 있도록 억제 또는 활성을 시키기 위해 적절하게 선택될 수 있다.

전사와 해독을 조절하는 신호와 함께 본 발명의 성분 B를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 분자는 숙주세포 크로모좀에서 표적유전자의 서열을 수용할 수 있는 벡터내에 유입된다.

크로모좀내에 유입된 DNA 를 가지는 세포는 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 선택할 수 있는 하나이상의 표식을 사용하여 선택할 수 있다. 표식은 항생제 저항성 또는 (구리와 같은) 중금속 저항성을 세포에 제공한다. 선택유전자는 공감염에 의해 세포자체에 유입되거나 또는 발현될 DNA 서열에 직접적으로 결합될 수 있다. 다량의 유전자 발현을 위해 다른 원소가 필요할 수도 있다. 이와 같은 요소는 전사 강화물질, 종료신호와 인트론으로 구성된다. 이와 같은 요소를 포함하는 발현벡터는 Okayama H. Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983) 에서 상술된 것으로 구성될 수 있다.

특정 플라스미드, 또는 바이러스 벡터를 선택하는 것으로 간주되는 인자는: 이를 포함하지 않은 것에서 용이하게 분리하기 위한 벡터를 포함하는 세포를 감지하고; 특정숙주에서 원하는 만큼 벡터 복제수를 가지고; 상이한 숙주세포에 벡터를 전달하는 것이 가능한지등이다.

적절한 원핵벡터에는 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드, pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184등(Maniatis T. et al, ibid), pC194, pC221, pT127 와 같은 바실러스 플라스미드(Gryczan T.M. The Molecular Biology of the Bacilli, Academic press, Ny, 307-329 (1982), pIJ101 와 같은 스트렙토마이세스 플라스미드Kendall K.J. et al. J. bacteriol. 169:4177-4183)와 슈도모나스 플라스미드(John J.F. et al. Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986)(Izaki K. Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742)등이 된다.

적절한 진핵벡터는 BPV, SV40, 베큘로바이러스 또는 이의 유도체로 구성된다. 이와 같은 벡터는 공지되어 있다. (Bostein D. et al. Miami Wint Symp. 19:265-274)(Broach J.R. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces:Life Cyle and Inheritance, Cold Spring Harbor, NY, 455-470 (1981) (Broach J.R. cell 28:203-204 (1982)(Bollon D.P. et al. J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980) (Maniatis T. Cell Biology:A Comprehensive Treatise Vol 3: Gene Expression Acad. Press NY 563-608 (1980).

준비된 발현벡터는 형질전환, 전이감염, 리포팩션, 결합, 원형질융합, 전기적 구멍형성, 인산칼슘으로 침전, 직접주입등과 같은 적절한 방법으로 숙주세포에 유도할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주세포는 원핵 또는 진핵세포이다.

적절한 원핵세포에는 대장균, 바실러스, 스트렙토마이세스, 슈도모나스, 살모넬라, 세라티아와 같은 박테이라가 포함된다.

적절하게는 대장균 K12 의 294주(ATCC 314446) 또는 대장균 X1776(ATCC 31537), 대장균 W 3110(F, 람다, ATCC 27325)와 같은 대장균이다.

적절한 진핵세포에는 사람, 쥐 또는 헴스터(CHO)와 같은 포유류 세포인데, 이들은 정확한 위치에서 폴딩과 글리코실화와 같은 해독후 변형을 하기 때문이다.

이스트 세포도 본 발명에 사용될 수 있다. 강한 프로모터와 다수의 플라스미드를 사용한 다양한 재조합 DNA 기술이 있어 이스트에서 소요의 단백질을 생산할 수 있다.

숙주세포에 벡터를 유입시킨후에 벡터를 포함하는 세포의 선택적 성장을 허용하도록 배지에서 배양한다.

클론된 DNA 서열의 발현은 성분B, 이의 돌연변이체 또는 이의 단편의 생산을 허용한다. 이렇게 발현된 단백질은 추출, 침전, 크로마토그래피, 전기영동 또는 컬럼겔에 고정화시킨 항-성분B 항체를 이용하는 친화성 크로마토그래피로 구성된 통상기술를 사용하여 분리 또는 정제시킬 수 있다. 성분B는 유전 전이 동물에서 우유분비된 단백질로 생성될 수도 있다.

본 발명의 또다른편으로는 성분B, 이의염, 기능적 유도체, 전구체 또는 활성단편을 약물로써 이용하는 것이다.

특히, 성분B는 항-염증성, 항-응고성 그리고 항-종양성 성질을 나타낸다. 또한 성분B는 행동적 그리고 체액분포와 같은 TGF-알파의 변형된 양, 맥관형성과 관련된 질병의 치료에 유용하다.

사실, 성분B는 TGF-α가 이의 수용체에 결합되는 것을 저해시키는 것으로 나타나는데, A 431 세포막에서 얻은 수용체에 I125-TGF-알파를 치환하여 측정하면 친화력 상수 Ki=0.77 x 10*-10 M 으로 나타낸다.

제약학적 수용가능한 부형제 또는 용출제와 복합하여 치로요법적 활성량의 성분B를 포함하는 제약학적 조성물은 본 발명의 목적이다. 이와 같은 조성물은 경구, 직장, 비강 특히, 비경구적 투여에 적합하도록 제조될 수 있다. 또한 성분B의 국소 이용도 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따른 제형에는 리포좀 또는 라틱산 또는 글리콜산과 같은 공중합체의 마이크로캡슐에 기초하여 피하이식과 같은 지연 방식도 포함된다.

본 발명의 또다른 편은 다음의 상술한 설명에서 나타난다.

[사람뇨에서 성분B의 준비과정]

사람뇨에서 성분B의 준비와 정제는 도면1에 요약하였다.

a) 단계 1

출발물질은 사람뇨이고 여기에 염산을 첨가하여 pH 가 3.0 이 되도록 한다. 침전물은 버리고 뇨에 카울린을 첨가한다(10g/시작뇨).

현탁액은 16시간 방치하고, 그다음 원심분리시킨다. 상충액은 제거하고 카울린은 pH 11.0 2M 암모니아로 추출한다.

암모니아 용출 pH는 8.0 이고 막여과(1000 달톤여과)에 의해 농축시킨다. 전체 준비는 4℃에서 실행한다.

b) 단계 2

(a)용액에 아세트산을 첨가하여 pH4.0 으로 하고 pH4.0 에서 아세트 완충액으로 균등화시킨 Bio Rex 70에 넣는다.

용액은 4시간동안 교반시키고 그다음 압력필터에서 여과시킨다.

흡수된 물질은 pH9.0 에서 암모니아 용출을 통하여 Bio Rex 70 수지에서 용출시킨다.

크로마토그래피 용출물은 막한외여과(1000 달톤여과)에 의해 농축시킨다.

전체과정은 4℃ 에서 실행한다.

c) 단계 3

pH 5.6 에서 균등화시킨 (b) 물질은 미리 pH5.6에서 균등화시킨 DEAE 세파로스와 같은 이온교환수지에 흡수시킨다.

흡수용출을 위해 pH5.6 에서 암모늄 아세테이트 완충액을 사용하여 실시한다. 크로마토그래피 용출은 막 한외여과(1000달톤여과)에 의해 농축시킨다.

전과정은 4℃에서 실시한다.

d) 단계 4

pH4.5 에서 아세테이트 완충액으로 균등화시킨 (b) 물질은 미리 pH4.5에서 균등화시킨 CM 세파로스와 같은 이온교환수지에 흡수시킨다.

완전한 흡수용출을 위해 pH 5.6 에서 암모늄 아세테이트 완충액을 사용하여 실시한다. 크로마토그래피 용출은 막 한외여과(1000달톤 여과)에 의해 농축시킨다.

전과정은 4℃에서 실시한다.

e) 단계 5

pH 5.6 에서 암모늄 아세테이트 완충액으로 균등화시킨 HPLC C18 수지에서 (d) 물질을 25℃로 정제한다.

흡수된 물질은 pH 5.6 에서 아세토니트릴 30% v/v 를 포함하는 암모늄 아세테이트 완충액을 사용하여 용출시킨다.

크로마토그래피 용출은 진공하에서(40℃)로 농축시킨다.

f) 단계 6

(e)단계물질은 0.02M 암모늄 아세테이트로 pH 5.6 에서 균등화시킨 DE-52 와 같은 이온교환수지에 정제시킨다.

흡수된 물질은 0.25M 완충액으로 실시하고 농축은 막한외여과(1000달톤 여과)에 의해 농축시킨다.

전과정은 4℃에서 실시한다.

g) 단계 7

(f) 단계물질은 20mM 아세테이트 나트륨 완충용액(완충액 A) pH6.2 에서 균등화시킨 D-지피르 팩 컬럼(세프라코어에서 시판)와 같은 이온교환수지에서 정제한다.

흡수된 물질의 용출은 100% 완충액A와 1M Nac1을 포함하는 pH6.2의 100% 20mM 아세테이트 나트륨 완충액에서 실행한다.

h) 단계 8

(g) 단계물질은 HPLC와 같은 C18 수지에서 25℃ 역상 크로마토그래피에 의해 정제한다.

흡수후에 용축은 TFA(0.1%)와 TFA(0.1%)로 산성화된 아세토니트릴 수용액 혼합물에 의해 형성된 선 농도에서 실시한다.

크로마토그래피 용출은 진공하에 증류(45℃)로 농축되고 냉동 건조된다.

i) 단계 9

단계7을 반복한다.

최종 생산물인 성분B는 무정형 백색 분말로써 회수된다.

[실시예 2]

[성분B 의 분석학적 특징]

뇨에서 정제된 물질 성분B의 주요 물리적-화학적 특징을 특징화하기 위해 다음과 같은 분석학적 과정을 거친다.

a) 아미노산 서열

성분B의 아미노산 서열은 에드만 방법에 의해 결정한다.

분석은 서열화기 Applied Biosystem 모델 477A 를 사용하여 실행한다.

이와 같은 분석은 SEQ ID NO:1에 보고된 81 아미노산 잔기에 대해 성분B의 아미노산 서열을 확인할 수 있게한다.

b) 분자량 결정

분석은 전자분무-질량 스펙트로메트리에 의해 실시하고, 분자량이 8937,9 달톤으로 나타났다. 이와 같은 분석에서 다섯개 S-S 결합을 가지고 Tyr에 결합된 SO4 기에 80달톤을 가진다.

실시예 3 : 사람 성분B 게놈 DNA 의 분리.

람다 파지 벡터 EMBL-3 SP6/T7 에서 사람 게놈 DNA 라이브러리는 Clontech(cat. No. HL 1067 J, Lot No. 1221)에서 구입하였다. 게놈 DNA 는 사람 태반에서 추출하고 부분적으로 Sau 3A 로 절단시킨다. DNA 단편은 EMBL-3 Sp6/T7 벡터의 BamHI 부위로 클로닝하기전에 8 내지 22Kb 사이의 크기를 만들기 위해 당농도에서 분리한다.

[배양배지]

Clontech(cat.No. C1004-1)에서 구입한 대장균 K802 세포는 MgSO4 와 0.2% 맥아당이 보충된 LB 배지에서 배양하였다.

파지 라이브러리는 0.1M NaC1, 8mM MgSO4, 50mM 트리스 C1 pH 7.5, 0.01% 젤라틴(SM)으로 희석시킨다.

DNA 라이브러리는 1.5% 아가-LB 플레이트에 도말한다. 라이브러리 플레이팅을 위한 상측 아가로스는 0.136M NaC1, 0.6% 아가로스 1% 트립톤(Merck cat No. 7213)이다.

[하이브리드 반응 시약]

20xSSC 3M NaC1, 0.3M 시트레이트 나트륨 pH7.0

하이브리드용액 5xSSC, 0.02% SDS, 0.1% N-라우도사르코신,

0.5% 차단제(Boehringer cat No. 1096176).

세척액 A 3xSSC, 0.1% SDS, 특정프로브에 따른

(HRP-올리고스) 다양한 농도의 뇨

세척액 B 1xSSC, 0.1% SDS

(32P-올리고스 CBEX4L)

[감지 시스템]

HRP-올리고/DNA 하이브리드는 ECL 키트에 의해 감지되고 Amersham 의 Hyperfilm ECL 에 노출시킨다(cat. No. RPM 2106 and 2104).

32P-올리고프로브된 필터는 Hyperfilm β-max(Amersham cat. No. RPN10)에 노출시켜 나타난다.

[올리고뉴클레타이드]

올리고뉴클레오타이드는 자등 DNA 합성기에 의해 합성된다.

OPC 카트릿지(Applied Biosystem cat. No. 400771) 또는 PAGE 변성에 의해 정제될 수 있다.

프로브로 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 CB1, CB2 와 CBEX2L 의 합성의 마지막회 동안에 N-MMT-C12-아미노 변형 물질(Clontech cat. No. 5206-1)으로 5' 수정된다.

말-양고추냉이 과산화효소(HRP, Boehringer cat. No 814393)는 균일이가기능기 교차결합제로써 1,4-폐닐렌 디이소티오 시아네이트(Aldrich cat. No 25,855-5)를 사용하여 M.S.Urdea(Nuc. Ac. Res. 16, 4937, 1988)에 따라 변형된 올리고뉴클레오타이드에 공액될 수 있다.

HRP-올리고프로브는 Nucleopac PA-100 컬럼(Dionex cat. No. 043010)에 음이온 교환 HPLC 에 의해 정제한다. 용출은 20mM Na 인산 완충액 pH 6.0 으로 실행하고 30분간 0.2 내지 1.0M NaC1 선농도에서 실행한다.

정제된 HRP-올리고뉴클레오티드는 Centricon 10 에 의해 농축되고 PBS 로 세척하고 암실에서 4℃에 저장한다.

HRP-올리고뉴클레오티드 농도는 OD403(∈403=89.5㎝-1xmM-1)에 의해 계산한다.

다음의 올리고뉴클레오티드가 합성된다:

[라이브러리 적정]

사람 게놈 DNA 라이브러리는 표준과정(F. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology)에 의해 적정할 수 있는데 라이브러리의 다양한 희석액과 대장균 K822 세포의 24시간 배양물 0.3ml 을 감염시킨다. 세포-라이브러리 혼합물은 20분간 실온에서 배양시키고 10분간 37℃ 에 이동한다. 감염된 세포는 50℃로 미리 가열한 4ml 탑 아가로스와 혼합하고 37℃로 미리 가열한 10㎝ 아가플레이트에 붓는다. 플레이트는 37℃ 에서 ON 배양한다.

각 플레이트에 있는 플락수를 계산한다. 2중 플레이트를 각 라이브러리마다 준비한다. 사람 게놈 DNA 라이브러리 역가는 예상한 것과 같이 5x10*9 pfu/ml 이다.

[라이브러리 스크리닝]

37℃ 0.6ml 세포배양물에서 24시간 배양시킨 대장균 K802 를 SM 에 현탁시킨라이브러리액(6x10*4 pfu)로 감염시킨다. 감염과 플레이트는 전술한 것과 같이 실시하나 탑 아가로스 9ml 와 15㎝ 플레이트를 사용한다.

세미 융합 플레이트는 Amersham 에 따라 Hybond N+ 나일론 막에 옮긴다.

블럿된 DNA 는 여과기에 두어 변성시키고 여과지는 1.5M NaC1, 0.5M NaOH 를 7분간 빨아들이게 한다.

블럿된 DNA 는 그다음 각 3분씩 2회 중화용액(1.5M NaC1, 0.5M 트리스-C1 pH 7.2, 1mM EDTA)에 젖은 여과종이에 필터를 위치하여 중화된다.

여과지는 2xSSC 로 세척하고, 공기-건조시킨다. DNA 는 20분간 0.4M NaOH 에 젖은 여과지에 여과기를 두어 막에 고정시킨다.

여과지는 1분간 5xSSC 로 최종적으로 세척하고, 하이브리드를 위해 4℃에서 플라스틱백에 저장한다. 사람 게놈 DNA 라이브러리(1x10*6 클론)이 HRP-CB2 올리고프로브와 고밀도 플레이트에서 스크린한다. 20 포지티브 클론이 선택된다.

6개 양성클론이 HRP-CB1 와 HRP-CB2 올리고프로브로 재스크린 한다. 4D, 12B, 15로 명명된 클론은 성분B 유전자에 양성이 되는가를 확인하였다.

[하이브리드 반응]

여과지는 하이브리드용액에 30분간 42℃ 에서 선배양하고, 45분간 42℃에서 적절한 HRP-올리고프로브(5ng/ml 올리고뉴클레오티드/하이브리드액)으로 하이브리드시키고, 적정농도에서 뇨를 포함하는 세척액에 42℃에서 각 15분간 2회 세척한다.

필터는 실온에서 간단히 2xSSC에 세척하고 하이브리드 플락은 ECL 시약에 의해 감지하고 60분간 Hyperfilm 에 노출시킨다.

HRP-올리고프로브된 필터에 대한 세척조건은 대장균과 람다파지 DNA 에 비특이적 하이브리드반응을 최소화하기 위해 실험적으로 결정된다. 표적 DNA 의 500 내지 15 아토몰범위 내에서 연속적인 희석은 람다 DNA(10ng) 존재하에 Hybond N+ 막에 스팟한다. 람다와 대장균 DNA(10ng각)이 네기티브 콘트롤로써 사용된다. 몇가지 스트립이 준비되고 5ng/ml 프로브로 하이브리드 실험에 사용된다. 세척은 0, 9, 18, 27 와 36% 요소를 포함하는 세척액A로 실행한다.

18% 와 27% 뇨는 각각 CB1 와 CB2 에 효과가 있는 것으로 보인다. CBEX2L 로 하이브리드한 필터는 18% 뇨가 포함된 세척액A로 세척한다.

32P-올리고 CBEX4L 로 하이브리드는 50℃ 에서 실행하고 여과는 세척액 B 로 45℃ 에서 세척한다.

[플락 스크리닝]

포지티브 플랏은 파스퇴르 피펫으로 집어내고 클로로포름과 SM 1ml을 포함하는 튜브에 이동한다. 실온에서 교반하면서 2hr 배양시킨후에 현탁액은 4℃에 저장한다.

10-3 희석된 파지 현탁액 10㎝ 플레이트에 도말하고, 두개 올리고프로브로 두개 복제필터에서 재스크린한다. 하나는 제1스크린에 사용되고 또다른 하나는 성분B의 인접부분과 일치한다.

두개 프로브와 독립된 양성클론을 선택하고 전술한 것과 같이 재현탁시킨다.

[파지 원액 준비]

양성클론은 대장균 K802 세포에 감염시켜 확장시키고 15㎝ 아가플레이트에서 성장시킨다. 37℃ ON 배양후에 융합 용해물은 10ml SM 이 있는 아가플레이트에서 수득한다. 몇방울의 클로로포름을 첨가하고, 세포찌꺼기는 4℃ 5분간 3000rpm 으로 원심분리에 의해 제거하고 파지를 포함하는 상층액은 50% 글리세롤에 넣고 -80℃ 에서 저장한다.

[파지 DNA 의 추출]

2x10*9 대장균 K802 세포는 선택된 파지클론(세포/파지비율=4:1)에 감염시키고, 37℃ 에서 100ml 액체 배양배지에서 ON 배양한다. 배양종료시에 완전한 세포 용해물은 배양물에 클로로포름(5μ 1/ml)을 첨가하여 실행할 수 있다.

[파지 DNA 서열화]

파지 DNA는 자동화 DNA 시퀀스 (Applied Biosystem mod. 371A)가 있는 Applied Biosystem(cat. No. 401388)의 시퀀스 킷트에 의해 서열화할 수 있다. 파지 DNA는 시퀀스에 의해 서열화된 40, 12B와 15 에서 추출한다.

프라이머는 성분B(CBF1, CBF2, CBR1, CBR2)에서 또는 이용할 수 있는 cDNA 또는 게놈 DNA 데이타에서 유도할 수 있다.

시퀀스 데이타에는 세개클론이 완전한 길이의 성분B 유전자를 포함하는 것으로 나타낸다.

[파지 DNA 제한효소 분석]

파지 DNA 는 단일과 다양한 제한효소 절단에 의해 제시한다.

DNA 단편은 0.6% 아가로스겔 전기영동에 의해 해리되고 Hybon N+막에 블럿한다. 필터는 올리고뉴클레오티드 CBEX2L, CB2 와 CBEX4L 로 반복 프로브한다.

[pBlueScript II SK 에서 성분B 유전자의 부클로닝]

EcoR1, Xho I와 Sfi 1으로 성분B 클론 4D 의 제한효소 분석과 성분B의 세개 액손에 특이적인 올리고프로브로 서던 블랏에서 전체 성분B 유전자는 5.2Kb EcoR1 단편으로 구성됨을 나타낸다(제5도).

파지 DNA 는 클론 4D 에서 추출하고 EcoR1 으로 절단한다.

생성된 DNA 단편은 아가로스 겔 전기영동에 의해 해리시키고 5.2Kb 단편은 Qiaex(qiagen cat. No. 20020)에 의해 정제하고 EcoR1 직선화시킨 pBlueSritp II KS (Stratagene cat. No. 212207)에 연결시킨다. 대장균 균주 XL1-Blue(Stratagene cat. No. 200268)는 혼합물로 형질전환시키고 형질 전환된 세포는 Ap/Tc 플레이트에서 선택한다. EcoR1 으로 제한효소 분석에 의해 예측된 플라스미드를 포함하는 한 클론을 분리하고 pBSCB4D 라 명명한다.

제한효소 분석은 Smal, Kpni, Hind III, Sfil, Accl, Notl, Sall, Xhol, EcoRV, Clal, Hinc II, Hind II, Scal, Bgl II, Aat2, Ncol, Nhel, Hpal and Mlul 으로 실시한다. 또한 서든 블랏팅은 단일과 이중 절단후에 pBCCB4D 에 성분B 특이적 올리고프로브로 실행한다.

제6도는 pBCCB4D 플라스미드의 제한효소 지도를 나타낸다.

제4도에서는 성분B 유전자의 제한효소 지도이다. 성분B 유전자에는 2개 인트론에 의해 분리되는 3개 엑손을 포함한다.

엑손은 연속적인 수용부와 제공부 절단부위가 인접해 있다.

엑손1은 84 pb 길이의 26nt 해독안된 mRNA 와 가상적인 시그날 펩티드의 19개 a.a을 코딩하는 서열을 포함한다.

이는 410bp 인트론에 의해 엑손2와 분리되어 있다.

엑손2는 길이가 120bp 이고 가상 신호 펩티드용 3개 a.a 와 성숙 단백질의 37 a.a 을 인코드 한다. 이는 약 550bp 의 인트론에 의해 엑손3과 분리되어 있다.

엑손3은 길이가 326bp 이고 이는 성분B의 C-단부 44 a.a 과 폴리(A0 꼬리가 부착된 3' 진행부위에서 폴리아데닐 신호(TATAAA) 14bp 를 포함하는 해독안된 mRNA 192nt 를 인코드한다.

특히 이 3개 게놈클론에서 시그날 펩티드 인코드 서열에는 가상적인 신호 펩티드의 11 위치에 Leu 코돈이 포함된 것을 알수 있다.

게놈 유전자에서 유도된 성분B의 a.a 서열은 Edman 에 의한 실험과 동일한 것으로 나타났다.

엑손1으로의 상류 서열분석에서 -28 위치에 TATA 박스와 -58 의 GC-풍부한 박스, -83 의 AP-1 부위, -360의 AP-2 와 몇개 E박스를 포함한 다양한 상류 프로보터 원소와 인헨서, 포함하는 프로모터 부위(제3도)가 있음을 나타낸다.

TATA 박스는 전사 개시 인자 TFIID 의 적절한 결합부위이다.

이는 GC-풍부한 박스는 Sp-1 의 결합부위를 나타내고 일반적인 전사인자는 다양한 유전자의 전사와 관계하는 것으로 보인다(Transcription and Splicing B.D. Hames D.M. Glover Eds, IRL press, 1988).

AP-1 부위는 AP-1 의 결합부위이고, 전사인자 복합체는 c-fos 와 c-jun 에 의해 형성된다. AP-1 부위는 세포성장과 분화와 관계한 몇개 유전자가 있다. AP-1 은 단백질 카이나제 C 의 활성물질에 반응하는 유도를 조절하는 몇가지 cis-원소중 하나이다(The hormonal control of gene transcription P. Cohen J.G. Foulkes Eds. Elsevier, 1991).

AP-2 부위는 PMA 와 CAMP 에 의해 활성화되는 전사인자인 AP-2의 표적이다.

E 박스는 유전자의 조직-특이적 발현을 결정하는데 중요한 역할을 하는 몇가지 인핸서부위에서 통상 발현되는 서열이다. E 박스에는 특이적 E 박스에 따른 2개 중간 염기가 변화되는 CANNTG 서열을 포함한다(R.E. Kingston Current Opinion Cell, Biol, 1989; 1, 1081-1087).

성분B 프로모터에는 글루코코르티코이드 수용체(GRE)에 의해 잠재적인 반응성 원소로 포함하고 이는 성분B가 글루코코르티코이드에 의해 유도될 수 있음을 나타낸다.

포유류 세포에서 발현을 위한 벡터에 성분B 유전자의 서브클로닝 포유류 세포에 rec-단백질의 발현은 인트론 존재하에 개선되는 것으로 공지되어 있다. 성분B 게놈 DNA 는 포유류 세포에서 발현될 수 있다.

이를 위해 +50 에서 +14B 의 1364bp 단편 성분B 유전자를 Pvu II 와 Nar 1 절단에 의해 pBSCB4D 에서 절단한다. 제2도에서는 Pvu II 와 Nar 1 부위를 기초한 성분B 전사유닛의 제한효소 지도를 나타낸다. 전체 성분 B 유전자는 유전자의 5' 단부를 생산하는 합성 올리고뉴클레오티드와 이 단편의 연결에 의해 재구성시키고 진핵 발현 플라스미드에 연속 유전자 클로닝의 적절한 제한부위가 있다.

[실시예 4]

[성분B cDNA 클론의 분리]

Frohman dt al., (1988) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 85, 8998 기술에 의한 cDNA 단부(RACE)의 신속한 증식은 성분B mRNA 의 5' 와 3' 단부에 상응하는 부분적인 cDNA 클론을 얻는데 사용된다. 부분적인 클론은 겹쳐진 DNA 서열이 포함되고 따라서 완전한 길이의 성분B cDNA 서열을 구성하기 위해 복합된다. RACE 클로닝에 사용되는 일반적인 과정은 제7도에 나타낸다.

3' RACE 에서 성분B 유전자의 제2엑손의 DNA 서열을 이용할 수 있고 유전자 특이적 프라이머 CKCB1 (5'-TCAAGTGCTACACCTGCAAGGAG-3')(SEQ ID NO:21)을 만드는데 사용 된다. cDNA 합성은 AP 의 어뎁터 프라이머라 불리는 올리고뉴클레오티드 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO:24)를 사람 뇨 폴리 A+ RNA 꼬리에 프라임시킨다. cDNA 는 CKCB1 와 AP 프라이머로 PCR 반응의 주형으로 사용되고 이는 성분 B cDNA 의 3' 단부에 상응하는 약 450bp 단편을 생성한다.

5' RACE 에서 프라이머 CKCB7 (5'-CGTCAGAGAGGAGGTG-3)(SEQ ID NO:22)는 450bp 3' RACE 단편의 DNA 서열로부터 디자인되고 사람 자궁 폴리 A+ RNA 에서 cDNA 합성의 프라임으로 이용된다. mRNA 의 CKCB7 프라이머를 제거하기 위해 정제한 후 올리고데옥시시티딘 꼬리를 cDNA 3' 단부에 첨가한다. 꼬리가 붙은 cDNA 는 프라이머 CKCB2 (5'-ACCGTCACCAGCGTGGTC-3)(SEQ ID NO:23)와 앵커 프라이머(ACP, 5'-CTACTACTACTACG CCACGCGTCGACTAGTACCGGIIOOGIGGGIIG-3')(SEQ ID NO:25) 또는 유니버샬 증폭 프라이머(UAP, 5'CTACTACTACTAGGCCACGCGTCGACTAGTAC-3')(SEQ ID NO:26)와 PCR 의 주형으로 사용된다. CKCB2는 제2엑손 서열의 3' 단부에 결합되고 ACP 는 올리고테옥시시티딘 꼬리에 결합된다. 성분B mRNA 5' 단부에 상응하는 DNA 서열을 가진 약 230bp 단편이 수득된다.

사용된 일반적인 실험과정(가령 폴리아크릴 아미드겔 전기영동, 에탄올 침전과 제한효소처리), 박테리아 배양배지(LB)와 화학적 용액(페놀)이 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed,. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York에 상슬되어 있다.

[3' RACE 클로닝과정]

cDNA 단부의 신속한 증폭을 위한 3' RACE 시스템은 Life Technologies, Inc., Grand Island, NY에서 구입하였다. 사람 자궁 폴리 A+ RNA 는 Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto,CA에서 구입하였다. 제1가닥 cDNA 합성은 3' RACE 시스템에서 제공하는 시약과 과정을 사용하여 실시한다. 간략하면, 자궁 폴리 A+ RNA 1μg 을 10 μM AP 용액 1μ1와 12μl DEPC-처리된 물로 복합하고 혼합물은 10분간 65℃로 가열한다. 얼음에서 혼합물에 냉각하고 반응성분은 최종농도가 약 20mM 트리스-HC1(pH 8.4), 50mM KC1, 2.5mM MgC12, 100μg/ml 소혈청 알부민, 500mM AP, 500μM dATP,dCTP, dGTP 와 dTTP 와 50ng/ml RNA/19μ1을 되도록 첨가한다. 반응혼합물은 42℃ 로 가열하고 1μl(200)SuperScript 역전사 효소를 첨가한다. 42℃ 30분간 배양한후에 반응혼합물은 얼음에서 냉각시키고 1μl RNaself(20)을 첨가한다.

RNaself 절단은 42℃ 에서 10분간 실행한다. 반응혼합물은 PCR 전에 -20℃ 에서 저장한다.

PCR 에서 4개 동일한 40μl 혼합물은 각각 다음의 성분을 가지도록 준비한다: 1μl 자궁 폴리 A+ cDNA/40mM KC1, 70mM 트리스-HC1(pH8.8), 0.1% 트리톤 X-100, 1mM MgC12, 0.25μM CKCB1 와 0.5μM AP. 3' RACE 시스템에서 시약은 PCR 을 위해서는 사용하지 않는다. CKCB1 와 AP 프라이머는 Applied Biosystems, Inc. 모델 392 올리고뉴클레오티드 합성기에서 합성한다.

탈보호, 냉동건조, DEPC-처리한 물에 재현탁후에 각 용액의 OD는 260nm 에서 측정한다. OD 측정에 기초하여 각 오리고뉴클레오티드의 10μM 용액을 DEPC-처리한 물에서 준비한다.

원 올리고뉴클레오티드 용액은 더이상의 정제없이 PCR 에 사용한다. 3' RACE 시스템에 공급되는 AP 와 동일한 결과를 나타내는 AP 농도는 실험적으로 결정한다; 0.4μM AP 는 Life Technologies, Inc 의 0.2μM 과 등가이다.

40μl PCR 반응은 다음을 포함하는 10μl 혼합물에 첨가하기전에 94℃ 로 가열한다. 1.25U AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 40mM KCL, 70mM 트리스 HC1(pH8.8), 0.1% 트리톤-X-100, 1mM MgC12, 각 1mM dATP,dTTP, dGTP 와 dCTP, PCR 에서 각 시약 최종농도는 1μl 자궁 cDNA/50μl, 1.25U AmpliTaq DNA 중합효소/50μl, 40mM KC1, 70mM 트리스-HC1(pH8.8), 0.1%트리톤 X-100, 1mM MgC12, 0.2μM CKCB1, 0.4μM AP 의 각 0.2mM dATP, dTTP, dGTP 와 dCTP 를 가진다. 94℃ 에서 5분 배양후에 Don, R.H., Cox P.T., Wainwright, B.J., Baker, K. and Mattick, J.S. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 4008 에 따라 73℃에서 63℃로 결합온도를 다양하게 하여 실행한다.

PCR 증폭후에 4개반응을 복합하고, DNA 산물은 5% 폴리아크릴 아미드겔에서 전기영동에 의해 크기분리한다. 약 450bp 의 DNA 산물을 겔에서 절단하고 투석튜브에서 전기용출에 의해 정제한다.용출물은 페놀:클로로포롬 50:50(v/v) 혼합물로 추출하고 에탄올 침전시키고, 건조하고 10μl 증류수로 재현탁시킨다.

Taq DNA 중합효소의 주형 독립적 단부 효소활성과 dATP 의 강한 선호성으로 인하여(Clark, J. M. (1988) Nucl. Acds Res 16, 9677 and Mole, S.E., Iggo, R.D. and Lane D.P. (1989) Nucl. Acids Res 17, 3319),정제된 450bp PCR 단편은 각 3' 단부에서 단일 데옥시아데노신 잔기를 가지는 것으로 기대된다. PCR 단편의 서브클로닝과 특징화를 위해 Marchuk et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 1154 에 상술된 것과 같이 pBluescriptSK+(Stratagene, La Jolla, CAT-벡터를 준비한다. pBluescript 플라스미드(20㎍)은 EcoRV제한효소로 절단하고 페놀: 클로로포름=50:50(v:v)혼합물로 추출하여 정제한다. 에탄올 정제후에 DNA는 50mM KCl, 10mM 트리스-HCl(pH 9.0), 0.1% 트리톤 X-100, 1.5mM MgCl2, 2mM dTTP를 포함하는 Cin 50㎕ 반응액에 9 taq DNA중합효소로 70℃ 2시간 처리한다. 벡터는 다시 페놀과 클로로포름(50:50 v:v )에탄올 침전으로 추출하여 정제하고 이 과정은 각 단부에 하나의 데옥시티미딘 잔기를 첨가하게 하고 Taq DNA중합효소로 합성된 DNA 단편의 삽입을 위한 벡터를 제공하게 된다.

포스포릴화안된 450bp PCR 단편은 T4 DNA 라이가제와 반응하여 T-백터내로 삽입할 수 있다(New England Biolabs, Beverly, MA) 연결반응은 16℃ 에서 약 72시간 배양하고 컴피턴트 대장균 XL1-블루세포(Stratahene, La Jolla, CA)를 형질전환하는데 사용될 수 있다. 형질전환된 세포는 50㎍/ml 암피실린을 포함하는 LB아가에 도말한다. 세포를 도말하기전에 100ml 2% X-gal(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)와 40ml 100mM IPTG (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)를 연속적으로 각 플레이트의 아가표면에 스프레이하고 건조시킨다. 37℃에서 ON배양후에 블루 콜로니와 흰색 콜로니를 볼 수있다. 플라스미드 DNA는 12개 흰색 콜로니 배양물에서 정제한다. 모든 12개 분리체에 450bp 삽입물이 포함된다. 3CB4, 3CB6, 3CB7, 3CB8, 3CB9 5개 클론은 부넉으 위해 사용된다. DNA 서열분석을 서열버젼 2.0kit(United States Biochemical, Cleveland, Ohio)를 사용하여 실시한다.

[5' RACE 클로닝과정]

cDNA단부의 신속한 증폭을 위한 5' RACE 시스템은 Life Technologies, Inc., Grand Island, NY에서 구입하였다. 사람 자궁 폴리 A+RNA 는 Clontech Laboratories, Palo alto, CA에서 구입하였다. 5' RACE 클로닝 실험은 다음을 제외하고는 5' RACE 시스템에 공급되는 시약과 과정을 이용하여 실시한다: (a) CKCB7, ACP 와 UAP 프라이머는 Applied Biosystem, Inc, 모델 392 올리고 뉴클레오타이드 합성기에서 합성되고 3' RACE 클로닝과 같이 준비되고, (b) 3' RACE 클로닝에서 상술하는 Touchdown PCR 온도 사이클링 프로그램이 cDNA 증폭에 사용된다. 제1가닥 cDNA 는 다음과 같이 합성된다. 자궁 폴리 A+ RNA 의 1㎕(1㎕)은 13.51㎕ DEPC-처리된 물과 CKCB7 10μM 용액 0.5㎕ 와 복합하고 혼합물은 10분간 70℃에서 가열된다. 혼합물을 얼음에서 냉각시킨후에 반응성분은 최종 조성물이 20㎕ 용적에 20μM 트리스-HCl(pH 8.4) 50mM KCl, 30mM MgCl2, 10mM DTT, 2O0mM CKCB7, 각 400μM dATP, dCTP, dGTP 와 dTTP 그리고 40ng/μl RNA 가 되도록 첨가한다. 반응혼합물은 42℃로 가열하고 Superscirpt II 역전사효소 1μl(220U)를 첨가한다. 42℃ 에서 30분 그리고 70℃에서 15분 배양시킨후에 반응혼합물은 55℃에 두고 1μl(RNaseH(2U)를 첨가한다. RNaseH 절단은 55℃ 에서 10분간 실시한다.

cDNA는 Glassmex DNA Isolation Spin Cartridge(5' RACE 시스템에 포함됨)을 이용하여 결합안된 dNTPs, CKCB7 와 단백질에서 분리한다. 특히, 120μl 결합용액(6M NaI)는 제1가닥 반응에 첨가하고 CDNA/NaI 용액도 GLASSMAX 스핀 카트릿지로 이동한다. 20초간 13,000 X g 에서 원심분리한다. 이 단계 F를 2회 반복한다. 400μl 냉각(4℃)70% 에탄올로 2회 세척후에 cDNA 는 50μl 멸균된 증류수를 스핀 카트릿지에 넣어 용해시키고 20초간 13,000 Xg에서 원심분리시킨다. 호모폴리머 꼬리는 TdT와 dCTP를 이용하여 cDNA 3' 단부에 첨가한다. 꼬리반응은 PCR 적응 완충액에서 실시한다. 10μl 정제된 cDNA는 7.5μl DEPC-처리된 물, 2.5μl 10X 반응완충액, 1.5μl 25mM MgC12 용액과 2.5μl 2mM dCTP 용액과 복합한다. 반응혼합물은 94℃에서 2-3분간 배양시킨다. 1분간 얼음에서 냉각시킨후에 1μl TdT(10U/μl)를 첨가한다. 최종 조성물은 다음과 같다. 10μl cDNA/20mM 트릭스-HC1(pH 8.4), 50mM KC1, 1.5mM MgC12, 200μM dCTP, 0.40/μl TdT. 반응혼합물은 37℃에서 10분간 그 다음 70℃에서 10분간 배양하여 TdT를 비활성화시킨다.

PCR 에서 다음과 같은 최종 프라이머 농도(/50μl)가 되는 4개 상이한 반응을 준비하였다 :

1. 400nM ACP

2. 800nM ACP

3. 360nM UAP and 40nM ACP(UAP:ACP, 9:1)

4. 720nM UAP and 40nM ACP(UAP:ACP, 9:1)

4개 반응의 나머지 성분의 최종농도 /50μl는 동일하다 : /50μl 자궁폴리 A+dc-꼬리 cDNA/20mM 트리스-HC1(pH 8.4), 50mM KC1, 1.5mM MgC12, 400nM CKCB2, and 200/μM dATP, dCTP, dGTP and dTTP. ACP와 UAP프라이머를 포함하는 성분을 최종용적 45μl와 혼합하여 94℃로 가열시킨다. 20mM 트리스-HC1(pH8.4)의 AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) 1.25U 5μl 혼합물을 최종용적 50μl에 첨가한다. Touchdown PCR 온도 사이를 프로그램(3' RACE 클로닝에서 언급함)은 5'cDNA단편을 증폭하는데 사용된다.

PCR 증폭후에 4개반응은 복합되고, DNA 산물은 8% 폴리아크릴아디드겔 전기영덩에 의해 크게 분리된다. 약 230bp DNA 산물이 겔에서 절개되어 정제되고 450dp 3' RACE 단편에서 상술한 것과 같은 T-벡터내로 서브클론된다. 5개클론, 5CB2, 5CB3, 5CB5, 5CB6, 5CB11은 분석을 위해 선택한다. DNA서열 분석은 Sequenase version 2.0Kit(United States Biochemical, Cleveland, Ohio)를 사용하여 실시한다.

제8도에서는 RACE 클론 5CB3 와 3CB7 에서 합체된 완전한 성분 B cDNA 서열을 보고한다.

서열배열에 의해 5cb3, 5cb6, 5cb11 와 3cb4, 3cb7, 3cb9의 cDNA 서열이 성분 B액손(실시예 3의 4D게놈)와 완전히 일치하였다.

본 발명은 특정 실시예로 설명하였으나 본 발명의 영역과 범위내에서 수정이 가능하다.

Claims

서열 1의 펩티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
서열 1의 폴리펩티드를 생산하는 방법에 있어서

a) 카올린으로 산성 pH 에서 뇨를 처리하지 않고 암모니아로 추출시키고,

b) 암모니아와 Bio Rex 수지에서 (a)성분을 용출시키고,

c) 아세테이트 완충액과 DEAE 세파로스 수지에서 (b)부분을 용출시키고,

d) 아세테이트 완충액과 CM 세파로스 수지에서 (c)부분을 용출시키고,

e) 아세테이트 완충액과 아세토니트릴 혼합물과 HPLC C18수지에서 (d)부분을 용출시키고,

f) 아세테이트 완충액과 DE-52 수지에서 (e)부분을 용출시키고,

g) 아세테이트 완충액과 D-제피리 수지에서 (f)부분을 용출시키고,

h) 수용성 트리플로로아세트산과 아세토니트릴 혼합물과 HPLC C18 수지에서 (g)부분을 용출시키고,

i) 아세테이트 완충액과 D-제피리 수지에서 (h)성분을 용출시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 뇨는 사람뇨인 것을 특징으로 하는 공정.
제 1 항에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열로 구성된 것을 특징을 하는 DNA 분자.
제 4 항에 있어서, DNA분자와 하이브리드할 수 있고 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 코드할 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
서열 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 게놈 DNA 분자.
서열 3의 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 게놈 cDNA 분자.
제 4 항 내지 7 항중 어느 한 항에 따른 DNA 분자로 구성된 발현벡터에 있어서, 발현벡터는 원핵벡터 또는 진핵벡터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 8 항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포에 있어서, 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
서열 1로 구성된 폴리펩티드를 생산하는 방법에 있어서, 제 9항에 따른 형질변환된 숙주세포를 배양하여, 숙주세포에서 발현 벡터를 발현시켜, 배지 또는 숙주세포내에 있는 폴리펩티드를 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 약물로 사용되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.