JPS63307898A - ラットｂＦＧＦおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １果上Δ秤肛立」 本発明は、ラット塩基性線維芽細胞成長因子（以下、ｒ
ｂＦ　Ｇ　Ｆと略称することもある。）およびその製造
のための組換えＤＮＡ技術に関する。

従来の技術 塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は主として下垂
体より分泌される分子量約１７０００の塩基性ポリペプ
チドホルモンであり、当初ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞など
の線維芽細胞に強い増殖促進作用を示す因子として分離
された［Ｄ。

Ｇ　ｏｓｐｏｄａｒｏｗｔｃｚ；ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２４９　：１２３　（１９７４）］。しかし、そ
の後中胚葉由来の殆んど全ての細胞に対して増殖促進作
用を示すことが判明した［Ｄ　、　Ｇ　ｏｓｐｏｄａｒ
ｏｗｉｃｚら：ナショナル・キャンサー・インスティテ
ユート・モノグラフ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃａｎｃｅ
ｒ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ）４
Ｂ、１０９（１９７８）］。中でもｂＦＧＦの血管新生
作用は細胞増殖促進作用と相まって損傷の治療薬および
血栓症、動脈硬化症などの予防治療薬としての可能性を
示すものである。しかし、天然に存在するｒｂＦＧＦは
極めて微量であり、未だにｒｂＦＧＦのアミノ酸配列や
遺伝子の塩基配列は決定されていない。

一方、材料が比較的容易に得られるウシｂＦＧＦは、既
に精製され、そのアミノ酸配列が決定されている［Ｆ、
Ｅｓｃｈら；　プロシーディンゲス・オブ・ナショナル
・アカデミ−φオブ・サイエンシズ・才ブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ［Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ　　ｏｒ　　ｔｈｅ　　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａ
ｄｅｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ　　ｏｆ　　ｔ
ｈｅ　　ＵｎｉｔｅｄＳ　ｔａｔｅｓ　　ｏｆ　　Ａ　
ｍｅｒｉｃａ（以下、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、−Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡと略称することもある。）Ｌ２．
６５０７（１９８５）］］。しかしこの場合においても
大量生産は非常に難しい。

一方、ヒ）ｂＦＧＦの遺伝子組換えＤＮＡ技術による製
造が報告されている［ＥＭＢＯ（ヨーロピアン・モレキ
ュラー・バイオロジー・オーガナイゼーション）ジャー
ナル、５．２５２３（１９８６）。

ＰＣＴ国際公開第ＷＯ３７７０１７２８号公報参照］。

発明が解決しようとする問題点 上記のようにｒｂＦ　Ｇ　Ｆの性質、アミノ酸配列およ
び遺伝子については不明の点が多い。ラットのｂＦＧＦ
も、医薬品あるいは試薬として用いる可能性が考えられ
る。そこでｒｂＦ　Ｇ　Ｆをコードする遺伝子を同定し
、その蛋白質を遺伝子組換え技術によって大量生産する
方法が望まれていた。

問題点を解決するための手段 一般に、ヒトにより近い動物の蛋白質はそのアミノ酸配
列において非常に高い相同性があり、アミノ酸の異なっ
ている部分もその大部分はコドンのｏｎｅ　　ｐｏｉｎ
ｔ　　ｍｕｔａｔｔｏｎによって導びかれるものである
。従って前記したヒトのｂＦＧＦのアミノ酸配列より導
びかれるＤＮＡ配列は、ｒｂＦＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列
に極めて良く似ているものと推定される。

そこで本発明者らはこのような考えに基づいてヒトｂＦ
ＧＦ遺伝子の一部をＤＮＡプローブとし、これを用いて
ｒｂＦＧＦｃＤＮＡをラット細胞よりクローニングした
。該ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡを構築し、該ＤＮＡで
形質転換された形質転換体を培養すると、ｒｂＦＧＦが
生産されることを見い出した。本発明者らは、これらの
知見に基づき、さらに研究した結果、本発明を完成した
。

本発明は、（１）、アミノ酸配列： Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｂｅ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｇ　ＩＹ　−Ｈｔｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ
　−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ
ｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−１１ｅ　−Ｈ
ｉｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｒｇ　
−Ｖ　ａｔ　−ＡＳＰ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｔ　−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉ
ｓ　−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ
ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｕ
　−Ａｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖａｔ　−Ｖａｔ　−Ｓｅ
ｒ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖａｌ　−
Ｃｙｓ　−Ａｌａ　−Ａｓｎ　−Ａｒｇ　−Ｔｙｒ　−
Ｌｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｍｅｔ　−ＬＹＳ−Ｇ　ｌｕ　
−Ａｓ＋）　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅ
ｕ　−Ａｌａ　−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｖａ
ｌ　−Ｔｈｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｃｙｓ　−
Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ
　ｒｇ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−９ｅｒ−Ａｓｎ−
Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ　−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅ
ｒ　−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ　−Ｔｈｒ　−Ｇ　ｌｙ−、Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ
ｙｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−９ｅｒ　−
Ｌ　ｙｓ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ　−Ａｌａ　−１１ｅ　
−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｍｅｔ　
−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ（１
）を含有するポリペプチドであるラット塩基性線維芽細
胞成長因子（■）。

２、ラット塩基性線維芽細胞成長因子をコードする塩基
配列を含有する組換えＤＮＡ（Ｉ［）。

３、ＤＮＡ（ＩＩＩ）を含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体。

４、ＤＮＡ（ＩＩＩ）を含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体を培地に培養し、培養物中にラット塩基
性線維芽細胞成長因子を生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする該因子の製造法である。

本発明のｒｂＦＧＦ（ｎ）は、少なくとも、式（１）で
表わされるポリペプチドを含有する。

上記ＤＮＡ（ＩＩＩ）としては、たとえば塩基配列：Ｃ
ＣＣＧＣＡＣＴＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧ　　ＣＧＧＣ
ＧＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡ
Ａ　　ＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧ　　ＣＧＧＣＴＣＴＡＣＴ
　　ＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧ
ＣＧＣＡＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡＣＧＧ　　ＣＣＧＣＧＴ
ＧＧＡＣＧＧＣＧＴＣＣＧＧＧ　　ＡＧＡＡＧＡＧＣＧ
Ａ　　ＣＣＣＡＣＡＣＧＴＣＡＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣ
ＣＡＡＧＣＡＧＡ　　ＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡ　　ＧＴＴ
ＧＴＧＴＣＣＡ　　ＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣ
ＧＡＡＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧ　　ＣＴＡＴＧＡＡＧＧ
Ａ　　ＡＧＡＴＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴ　　
ＣＴＡＡＧＴＧＴＧＴ　　ＴＡＣＡＧＡＡＧＡＧ　　Ｔ
ＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＧＣＣＴ　　ＧＧＡＧＴ
ＣＣＡＡＴ　　ＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡ　　ＣＴＴＡＣＣ
ＧＧＴＡＣＧＧＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴ　　
ＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴ　　ＧＡＡＡＣＧＡＡＣＧＧＧＣ
ＡＧＴＡＴＡ　　ＡＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣＧ
ＧＧＧ　　ＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＴＡＣＴ　
　　ＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡ　　　ＡＴＧＴＣＴＧＣＴＡ
　　　ＡＧＡＧＣ（ＩＶを含有する塩基配列（Ｖ）が好
ましい。

本発明のＤＮＡ、形質転換体および本発明の製造法にお
けるｒｂＦＧＦとしては、上記アミノ酸配列でしめされ
るｒｂＦＧＦ（ＩＩ）が好ましい。

本発明方法におけるｒｂＦＧＦ蛋白質のポリペプチドを
コードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型ベ
クターは、例えば、 （イ）ｒｂＦ　Ｇ　ＦをコードするＲＮＡを分離し、（
ロ）該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次
いで二重鎖ＤＮＡを合成し、 （ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、（ニ）得
られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換し、 （ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばＤＮＡプローブを用いｒ　　　たコロ
ニーハイブリダイゼーション法、により　　　り目的と
するＤＮＡを含有するプラスミドを丁　　　　単離し、 Ａ　（へ）そのプラスミドから目的とするクローン化Ｄ
）　　　　ＮＡを切り出し、 （ト）該クローン化ＤＮＡをビークル中のプロモーター
の下流に連結する、ことにより製造することができる。

ｒｂＦＧＦをコードするＲＮＡは、ラットの種々の臓器
、例えば、脳、下垂体、あるいは肝臓などから得ること
ができる。

ラットの臓器からＲＮＡを調製する方法としては、グア
ニジンチオシアネート法［Ｊ、Ｍ。

Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１　Ｂ、５２９４（１９７９）］
などが挙げられる。

このようにして得られたＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを
合成し、例えばＷａｔｓｏｎ　　と　Ｊ　ａｃｋｓｏｎ
の方法（Ｗａｔｓｏｎ、Ｃ，Ｊ、　ａｎｄ　　Ｊａｃｋ
ｓｏｎ、Ｊ、　Ｆ、。

ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル・アプローチ
（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　　Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌＡｐｐｒｏａｃｈ）Ｉ　ＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ、　　０
ｘｆｏｒｄ、　ｐ７９　、１９８５）に従って例えばλ
フアージベクター　λｇ＋１０　（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ　、
　Ｖ　、ら、ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル
・アプローチ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、　（ｌｆｏｒｄ、　
ｐ４９　、１９８５）に組みこみ、これを大腸菌９例え
ばＣ６００、Ｈｆ１Ａ（Ｈｕｙｎｈ。

Ｔ、Ｖ、ら、同上）に感染させ、ｃＤＮＡライブラリー
を作成することができる。

−このようにして得られたｃＤＮＡライブラリーより、
自体公知の方法、例えばプラーク・ハイブリダイゼーシ
ョン法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｔｏｎｉｎｇ）Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　ｐ３２０　、１９８２）およびＤＮＡ塩基配列
決定法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７４，５６０（１９７７
）。

ニュークレイツク　アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９，３０９（
１９８１）］を用い、求めるファージクローンを選出す
る。

次に、該ファージクローンを集め、例えばＤ　ａｖｉｓ
らの方法（Ｄａｖｉｓ　　ら、アドバンスト・バクチリ
アル中ジェネティクス（ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒ
ｉａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　１
９８０　）により、ファージＤＮＡを抽出して、そのｃ
ＤＮＡ部分を制限酵素を用いて切り出し、これをプラス
ミド例えばｐＵｃ１３等に組みこみ直して、使用するの
も好都合である。

上記クローン化されたｒｂＦＧＰをコードする塩基配列
を含有するＤＮＡを有するプラスミドはそのまま、また
は所望により制限酵素で切り出す。

クローン化された遺伝子は、゛発現に適したビークル（
ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベ
クターを得ることができる。

ベクターとしては、たとえば大腸菌由来のプラスミドｐ
ＢＲ３２２［ジーン（ｇｅｎｅ）、２．９５（１９７７
）］、ｐＢＲ３２５［ジーン、４，１２１（１９７８）
］、ｐＵｃ　１２　［ジーン、１９，２５９（１９８２
）］。

ｐＵｃ１３［ジーンーエ町、２５９（１９８２）］、枯
枯草由由のｐＵＢｌｌｏ［バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅ
ｇ＋１ｃａｌ　　　ａｎｄ　　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
ｌ　　　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ
）、　１１２．６６７８（１９８３）］。

ｐＴＰ５．ｐｃ１９４．酵母由来プラスミド（例、ｐｓ
Ｈ１９，ｐｓＨ１５）、あるいはλファージなどのバク
テリオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィ
ルスなどの動物ウィルスなどがあげられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終始コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。さらに
該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接
続する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である
場合は、ｔｒｐプロモーター、　ｌａｃプロモーター、
ｒｅｃ　Ａプロモーター、λＰＬ　　プロモーター。

１２ｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌であ
る場合は、ＳＰＯ１プロモーター、５ＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎ　Ｐプロモーターなど、宿主が酵母である場
合は、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｇ
ＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい
。とりわけ宿主がエシェリキア属菌でプロモーターがｔ
ｒｐプロモーターまたはλＰＬプロモーターであること
が好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げられ
、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好ましい。

このようにして構築されたＤＮＡ（Ｉｎ）を含有するベ
クターを用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
ツ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　
Ｄ　Ｈ１［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ、６０．　ｌ　６０（１９６Ｂ）］、　Ｍ
ｌ　０３［ヌクレイツク・アシッズ拳リサーチ、（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　　Ａｃａｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９゜
３０９（１９８１）］、ＪＡ２２１［ツヤ−ナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　
ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）コ　
１２０，５１７（１９７Ｂ）］、ＨＢＩＯ１［ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１上、４５９
（１９６９）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇ　ｅ
ｎｅｔｉｃｓ）、　３９　、４４０　（１９５４）］な
どが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ　１１
１４　［ジーン、２４，２５５（１９８３）コ、２０７
−２１［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏｆ　　Ｂ　１ｏｃｈｅ＋ａｉｓｔｒｙ）旦
、８７（１９８４）］などが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサッカロマスセスセレビシ
アエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ３７−１１Ａ、ＤＫＤ−
５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、株化したもの（ｃｅｌｌ　　１ｉｎ
ｅ）が好ましく、たとえばサル細胞ＣＯ５−７［セル（
ｃｅｌｌ）、２３　、１５７　（１９８１）］、Ｖｅｒ
ｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞
、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
−，６９゜２１１０（１９７２）、ジーン、１７，１０
７（１９８２）などに記載の方法に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　＆　　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ）、１６８．１１１（１９７９）などに記載の方法
に従って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７５；　　１
９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイクロジー（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、ＤＮＡ（ｎ）を含有するベクターで形
質転換された形質転換体が得られる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としでは液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム−塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー
、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ
抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたと
えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタ
ミン類、成長促進因子などを添加してもよい。

培地のｐａｌは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ
、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキ
ュラー・ジェネティックス（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｒ
　　Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）、４３１−４３３　、Ｃｏ
１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９７２）］が好まし
い。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせる
ために、たとえば３β−インドリル　アクリル酸のよう
な薬剤を加えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダーｄＢ　ｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、ら。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　
ＵＳＡ、７７．４５０５（１９８０）］が挙げられる。

培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に
応じて通気や攪拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえばＭＥＭ培地［サイエンス（５ｃｉｅｎ
ｃｅ）１２２．５０１　（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地
［ヴイクロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、８，３９６（１
９５９）］、ＲＰＭＩ　１６４０培地［ジャーナル・才
ブ・ザ・アメリカン・メディカル拳アソシエーション（
Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ａｓ
ｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌ　　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏ
ｎ）１９９．５１９（１９６７）］、１１９ｇ培地プロ
シーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・
バイオロジカル・メデイスン（Ｐ　ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｓ　ｏｃｉｅｔｙ　　ｆｏｒｔ
ｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｃａｌ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）７
３．１（１９５０）］などが挙げられる。これにさらに
約５〜２０％の胎児牛血清を添加しても良い。ｐＨは約
６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃
、培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気
や攪拌を加える。

上記培養物からｒｂＦＧＦ蛋白を分離精製するには、例
えば下記の方法により行うことができる。

ｒｂＦＧＰ蛋白を培養菌体あるいは細胞から抽出するに
際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集
め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩
衝液に懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、
フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび（または）
凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離によりｒｂＦ　Ｇ　Ｆ蛋白を得る方法などが適宜
用い得る。

とりわけ、フレンチプレス法あるいはリゾチームと超音
波処理を併用する方法が好ましい。　　　　　゛上記上
澄液からｒｂＦＧＦ蛋白を精製するには、自体公知の分
離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。

これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

さらに具体例には、上記上澄液をＤＥＡＥセルロースな
どを担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかける
ことにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を除くことが
できる。たとえば、中性附近のトリスなどの緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄液をかけ、素
通り画分を集めることは有効である。また、さらに０Ｍ
セルロースなどを用いたイオン交換クロマトグラフィー
にかけることにより、塩基性蛋白質であるｒｂＦＧＦ蛋
白質を担体に吸着させ、塩溶液を用いてこれを溶出させ
ることにより精製することができる。

０Ｍセファデックス等の酸性樹脂のカラムクロマトグラ
フィーにより、菌体抽出液から直接、ｒｂＦＧＦを精製
することができる。たとえば、上清液を、弱酸性緩衝液
（例、リン酸緩衝液）で平衡化したＣＭ−セルロースカ
ラムにかけることにより、効率良く行なうことができる
。カラムを同じ緩衝液で洗浄後、カラムを、塩（例、Ｎ
ａＣ１）をさらに含有する緩衝液を用いて溶出すること
により、ｒｂＦＧＦを溶出させることができる。これら
の溶出液は透析後、凍結乾燥することができる。

また、ヘパリン−セファロースを担体としたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法ヲ、ｒｂＦ’ＧＦ’の精製法
として、大腸菌抽出液中のｒｂＦＧＦ蛋白質にも適用す
ると好都合である。たとえば中性附近のトリス、リン酸
などの緩衝液で平衡化したヘパリン・セファロースカラ
ムに、上記溶出液をかけ、十分洗った後、ＮａＣ１など
の直線勾配溶出を行うことによりｒｂＦＧＦ蛋白質を精
製することができる。

特に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパ
リンカラム（たとえばＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｆ　−ｐａ
ｋＨＲ・８９４昭和電工製など）は有効である。

上記ヘパリンセファロースカラムと同様に、中性附近の
緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったのちＮａＣｌ７ｊ
どの直線勾配溶出を行うと、ｒｂＦＧＦはほぼ均一な標
品として回収することができる。

この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、乾
燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清ア
ルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器へ
の吸着を防ぐことができ好適である。

また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤と
してはβ−メルカプトエタノール。

ジチオスレイトール、グルタチオンなどが挙げられる。

このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキシ
ンも含まない、実質的に純粋なｒｂＦＧＦが得られる。

本発明の実質的に純粋なｒｂＦ　Ｇ　Ｆとしては、蛋白
質含量としてｒｂＦＧＦを９５％（ｗ／Ｗ）以上である
もの、さらに好ましくはｒｂＦ　Ｇ　Ｆを９８％（ｗ／
　ｗ）以上であるものが挙げられる。

本発明の遺伝子組み換え技術によって得られたｒｂＦＧ
Ｆ蛋白質の一例として、例えば第２図におけるアミノ酸
配列において、アミノ酸番号１〜１４５で示されるポリ
ペプチドを含有する蛋白質を挙げることができる。該ポ
リペプチドはそのＮ末端にＭｅｔを有していてもよい。

かくして生成するｒｂＦ　Ｇ　Ｆの活性は、公知のＢＡ
ＬＢＡ／Ｃ３Ｔ３細胞の増殖促進効果などにより測定す
ることができる。

本発明のＤＮＡで遺伝子感染または形質転換した細胞で
は、本来わずかのｒｂＦＧＦＬか合成されない、あるい
は全く合成されない各種細胞においても大量のｒｂＰＧ
Ｆを産生せしめることができ、ｒｂＦＧＦを有利に導く
ことができる。

本発明のｒｂＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質をコードする遺伝子を含
有する発現型プラスミドは、これを各種細胞に導入する
ことにより該細胞にｒｂＦ　Ｇ　Ｆを産生させることが
できるため、ｒｂＦＧＰを大量に取得することができる
。

ここに製造されるｒｂＦＧＦは、細胞増殖促進活性を有
し、毒性は低いので、火傷、創傷、術後組織などの治癒
促進剤、あるいは血管新生作用による血栓症や動脈硬化
症などの治療薬として用いることができる。また、細胞
培養を促進させるための試薬として用いることができる
。

本発明のｒｂＦＧＦを医薬として用いるには、そのまま
粉末として、または他の薬理学的に許容されうる担体、
賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤１錠剤
、カプセル剤、液剤、軟膏）として、温血哺乳動物（例
、ヒト、マウス、ラットハムスター、ウサギ、犬、ネコ
）に対して非経口的または経口的に安全に投与すること
ができる。

注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ塘や
その他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行な
われる。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従っ
て調製しうる。さらに、医薬組成物としての注射剤、液
剤９錠剤、カプセル剤等を製造する際には、無菌条件下
で行なう。

本発明のｒｂＦ　Ｇ　Ｆを上記した医薬として用いる場
合には、たとえば上記した温血動物に、投与ルート、症
状などを考慮して、１日量約１ｎｇないし１００μｇ／
ｋｇの中から適当潰を選んで投与される。

また、本発明のｒｂＦ　Ｇ　Ｆを細胞培養を促進させる
ための試薬として用いる場合、培地１（２あたり約０．
０１〜１０μｇ１　さらに好ましくは約Ｏ６１〜１０μ
ｇとなるように培地を加えることが好ましい。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、Ｉ　ＵＰＡＣ−ＩＵ　Ｂ　　Ｃ
ｏｍｍ１ｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｓｉｃａ
ｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　：相補的デオキシリボ核酸Ａ　　　：アデ
ニン Ｔ　　　：チミン Ｇ　　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　　：リボ核酸 ｄＡＴＰ　　　：デオキシアデノシン三すン酸ｄＴＴＰ
　　　：デオキシチミノン三すン酸ｄＧＴＰ　　　：デ
オキシグアノシン三すン酸ｄＣＴＰ　　　：デオキシシ
チジン三リン酸ＡＴＰ　　　：アデノシン三すン酸 Ｔｄｒ　　　　：チミジン ＥＤＴＡ　　：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ　　　、
ドデシル硫酸ナトリウムＡｌａ　　　　：アラニン Ｖａｌ　　　　：バリン Ｌｅｕ　　　　：ロイシン １１ｅ　　　　：イソロイシン Ｓｅｒ　　　　：セリン Ｔｈｒ　　　　；スレオニン Ｃｙｓ　　　　ニジスティン Ｍｅｔ　　　　：メチオニン Ｇｌｕ　　　　：グルタミン酸 Ａｓｐ　　　　：アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　　　；リジン Ａｒｇ　　　　：アルギニン Ｈｉｓ　　　　：ヒスチジン Ｐｈｅ　　　　：フエニールアラニン Ｔｙｒ　　　　：チロシン Ｔｒｐ　　　コトリプトファン Ｐｒｏ　　　　ニブロリン Ａｓｎ　　　　：アスパラギン Ｇｉｎ　　　　：グルタミン 後述の参考例１で得られたＥ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｌｔＫ１２　　ＤＨＩ／ｐＴＢ６２７は、昭和６
１年（１９８６年）３月１３日から財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ１４４９４として寄託され
、また、本微生物は、昭和６１年４月２日から通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲｌ）に受託番
号　ＦＥＲＭ　　Ｐ−８７２６として寄託され、該寄託
はブダペスト条約に基づく寄託に切換えられて、受託番
号　ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１２８０として同研究所（ＦＲ
［）に保管されている。

後述の実施例１で得られたＥ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｌｔＫ１２　　ＤＨＩ／Ｉ）ＴＢ７８４は、昭和
６２年（１９８７年）５月２９日からＩＦＯに受託番号
ＩＦ０　１４６１６として寄託され、また本微生物は昭
和６２年６月６日からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ　　Ｐ
−９４０３として寄託されている。

実施例 以下の参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

参考例１　（ヒトｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡを含む
プラスミドの構築） ヒト包皮由来初代培養細胞ｍＲＮＡより合成したｃＤＮ
ＡをｐＣＤベクター［Ｏｋａｙａｍａら、モレキュラー
・セル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｅｌ
ｌＢｉｏｌｏｇｙ）、３．２８０（１９８３）参照コに
組み込んで作成した大腸菌χ！７７６を宿主としたｃＤ
ＮＡライブラリーをＮａｔｉｏｎａｌ　　Ｉ　ｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ　　ｏｆＣｈｉｌｄ　　Ｈｅａｌｔｈ　　ａｎ
ｄ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、の岡山博士より分与
を受けた。このｃＤＮＡライブラリーよりアルカリ法（
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，＆　　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、
ヌクレイツク・アシッズ・レサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）　、上、１５１３（１
９７９）コでプラスミドＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを
大腸菌ＤＨＩに感染させ、約２Ｘ１０”個のｃｌｏｎｅ
よりなる大腸菌ＤＨＩを宿主としたｃＤＮＡライブラリ
ーを作成した。

上記大腸菌ＤＨＩを用いたｃＤＮＡライブラリーをニト
ロセルロースフィルター（ミリポア社、ＨＡＴＦフィル
ター）上に約５　Ｘ　ｌ　Ｏ’　ｃｌｏｎｅ／フィルタ
ーとなるように１０枚まき、このフィルターをマスター
フィルターとしている各２枚ずつを１組としたレプリカ
フィルター計２０枚を作成した。

このレプリカフィルター上の大腸菌を０．５ＮＮａＯＨ
溶液で溶かし、露出変性したプラスミドＤＮＡをフィル
ター上に固定した［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ。

＆　　Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、　Ｓ、、Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

ＳＣｉ、ＵＳＡ　　７２．３９６１（１９７５）］。

一方、Ｆ、Ｅｓｃｈらにより報告されている［Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８
２゜６５０７＜１９８５）］ウシ塩基性線維芽細胞成長
因子のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸Ｎｏ。

１３−２０（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ
　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｓｐ、−Ｐ　ｒｏ）およびアミノ
酸Ｎｏ、８９−９６　（Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　−Ｇ　ｌｕ
　−Ｃｙｓ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ）
をもとに、これらのアミノ酸配列に対応する塩基配列を
化学合成した。一部のコドンは３番目の文字を任意に固
定した。それぞれ八Ｔ ５′ＧＧ　／ＧＴ　Ｃ／ｃ　ＴＴＡ／Ｇ　ＡＡＡ／ＧＴ
　Ｇ　Ｇ　ＣＣＡ　ｃ　ｃ　Ａ　ａ　ｃ　、および５’
ＴＣＡ　　　　　　　　Ａ　　　　　　　　ＡＡ／ＡＡ
／ＡＡ／ＡＡ／ＧＣＡ Ｇ　　　　　　　　Ｇ　　　　　　　　ＧＴ／ｃＴＣＧ
ＴＣＧＧＴであり、下線を引いた塩基は固定したものを
示した。このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造製）を用いて５０μｅ・の反
応液［オリゴヌクレオチド０．１μｇ、５０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ８゜０、ｌｏｍＭ　　ＭｇＣＬ
、　　１０ｍＭメルカプトエタノール、５０μＣｉγ−
”Ｆ　　ＡＴＰ（＞５０００Ｃｉ／ｍａ＋ｏｌｅ）、３
ユニツト　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ］中で３７℃
１時間反応させ、オリゴヌクレオチドの５′末端を３１
ｐで標識した。

上記方法で標識したオリゴヌクレオチドニ種をプローブ
として、別々に、ＤＮＡを固定したレプリカフィルター
に会合させた。会合反応は、１０μＣｉのプローブを含
む５ｘＳＳＰＥ［１８０ｍＭＮａＣ１，１Ｏｎ＋Ｍ　　
ＮａＨ＊ＰＯ，，１ｄＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４）］
、　５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ、　０　、１％ＳＤＳ
。

１００μｇ／−変性サケ精子ＤＮＡ溶液１〇−中で、３
５℃１６時間行い、反応後フィルターを５ｘＳＳＣ［０
，１５Ｍ　　ＮａＣ１，０，０１５Ｍ５　ｏｄｉｕｍ　
　ｃｔｔｒａｔｅコ０．１％ＳＤＳ溶液で室温で３０分
ずつ３回さらに４５℃３０分ずつ２回洗浄した［ＴｏＭ
ａｎｉａｔｉｓら、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ
　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｐ。

３０９（１９Ｂ２）］。

洗浄したフィルターよりラジオオートグラムをとり、二
種類のプローブの両方に対して反応する菌株を一組２枚
のレプリカフィルターのラジオオートグラムを重ね合わ
せることにより探した。この方法により５　ｘ　ｌ　Ｏ
’　　ｃｌｏｎｉｅｓより二種類のプローブに対して反
応する１株［Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　Ｋ
ｌ　２　　ＤＨＩ／ｐＴＢ６２７（ＩＰＯ１４４９４、
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１２８０）］を得、これよりプラス
ミドＤＮＡ（１）ＴＢ６２７）をアルカリ法［Ｈ，Ｃ，
ＢｉｒｍｂｏｉＩｌら、ヌクレイツク・アシッズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌｅｌｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）１．１５１３（１９７９）］によって抽出した。

実施例１ （１）　　ラット脳ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリ
ーの作製 ラット脳より、ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート
法［Ｃｈｉｒｇｖｉｍら、［バイオケミストリー（Ｂ　
ｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ、上８．５２９４，１９７
８］を用いて抽出した。このＲＮＡよりポリ（Ａ）ＲＮ
　ＡをオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー
により精製した［Ａｖｉｖとｔ、ａａｅｒ、プロシージ
ング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ）６９゜１４０Ｂ、（１９７２）］。このポリ（
Ａ）ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを、Ｗａ
ｔＳＯｎＪ　ａｃｋｓｏｎの方法［Ｗａｔｓｏｎ、　Ｃ
，Ｊ、　ａｎｄ　　Ｊａｃｋｓｏｎ。

Ｊ、Ｆ、、ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル・
アプローチ（ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ＡＰｒａｃ
ｔｉｃａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ）ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓ
ｓ、０ｘｆｏｒｄ。

ｐ７９，１９８５］に従って、λファージベクターλｇ
ｔｌ　０（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、　Ｖ、ら、ＤＮＡクローニ
ング・ア・プラクティカル・アプローチ、ＩＲＬＰ　ｒ
ｅｓｓ、　Ｏｘｆｏｒｄ、ｐ４９　、１９８５　）を用
いて作成した。１０Ｍｇのポリ（Ａ）ＲＮＡより出発し
て、約１．５ＸＩＯ’個のクローンよりなる大腸菌Ｃ６
００、Ｈｆ（２Ａ（Ｈｕｙｎｈ　　Ｔ、　Ｖ、ら、同上
）を宿主としたｃＤＮＡライブラリーを得ることができ
た。

（２）上記ファージｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｃ６
００、Ｈｆ１２Ａを宿主として、軟寒天プレート上に、
約ｌＸｌ０’クローンずつ、１０枚まき、これを、ニト
ロセルロースフィルター（ミリポア社、ＨＡＴＦフィル
ター）上に移した後、０．５ＮＮ　ａ　ＯＨ溶液でとか
し露出変性したファージＤＮＡをフィルター上に乾燥固
定した（Ｍａｎｉａｔｉｓら。

「モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ）ＪＣｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒ
ｂｏｒＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐ３２０　、１９８２
　）。

一方、参考例１で得られたヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　　ｃＤ　
ＮＡを含むプラスミドｐＴＢ６２７を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで消化して得られるヒトｂＦＧＦ’コードｆｉ域ヲ含
む４３０ｂｐＤＮＡ断片をニックトランスレーション法
（Ｍａｎｉａｔｉｓら、同上、ｐ１０９）により３＠ｐ
ｔｌＩ識し、プローブとした。

標識したプローブと、ＤＮＡを固定したフィルターを、
標識プローブを含む、５ＸＳＳＰＥ［０゜９Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１）Ｒ７，４）
、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ］、５０％ホルムアミド、　５　
Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　０　、１％ＳＤＳ、１０
０μｇ／−変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０ｄ中で４２℃、
１６時間、会合反応を行い、反応後、フィルターを２ｘ
ＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ、０゜０
１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で
室温で３０分ずつ２回、ｔｘｓｓｃ、ｏ、ｔ％ＳＤＳ溶
液中で、５５℃で３０分ずつ２回洗浄した。洗浄したフ
ィルターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、
プローブと反応するクローンを検索した。この方法によ
り得られたクローンλＲＦ−１よりＤａｖｉｓらの方法
（Ｄａｖｊｓら、「アドバンスト・バクチリアル・ジェ
ネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｊ、Ｃｏ１ｄＳ　ｐｒｉｎｇ　
　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　１９８
０　）によりファージＤＮＡを抽出し、これより制限酵
素ＥｃｏＲＩ消化により８２０ｂｐの鎖長を有するｃＤ
ＮＡ部分を切り出した。このｃＤＮＡ部分の制限酵素地
図を第１図に示した。

このｃＤＮＡ部分をプラスミドｐｃＵ１３のＥｃ。

Ｒ１部位に組み込んでｐＴ８７８４を作製した。

このプラスミドｐＴＢ７８４を用いて大腸菌に１２　　
ＤＨＩを形質転換させることにより、該プラスミドｐＴ
８７８４を含む形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２　　Ｄ　Ｈｌ　／ｐＴ　Ｂ　７８
４（ＩＦＯ１４６１６，ＦＥＲＭ　　Ｐ−９４０３）を
得た。

（３）次に上記（２）で得られたｐＴＢ７８４のｃＤＮ
Ａ部分であるＥｃｏＲＩ　　８２０ｂｐＤＮＡ断片の塩
基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法［Ｍ　ｅ
ｓｓ　ｉｎｇら、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
）Ｊ９，３０９．（１９８１）］によって決定した。

この結果より、ラットｂＦＧＦの全アミノ酸配列を決定
することが出来た。

ｃＤＮＡの塩基配列と、その配列から推定されるアミノ
酸配列を第２図に示す。なお第２図中、ｔｒａｍはｔｅ
ｒｍｉｎａｔｅｒ　ｃｏｄｏｎを示す。

第２図に示したアミノ酸配列は、報告されているウシあ
るいはヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列と非常によく似てお
り、このｃＤＮＡがラットｂＦ　Ｇ　Ｆをコードするも
のであることを示している。

実施例２　　ｒｂＦＧＦをコードする遺伝子の動物細胞
における発現ニ プラスミドｐＴＢ７８４をＥｃｏＲＩで切断し、ｒｂＰ
ＧＦをコードする０、８ｋｂのＤＮＡ断片を分取する。

別にｐＴＢ６５３［サイエンス（Ｓ　ｃ　１ｅｎｃｅ）
　。

２３６．１１１６（１９８７）］をＥｃｏＲ■で切断し
、ＭｕＬＶ　　ＬＴＲ，ＳＶ４０プロモーターを含む４
．３ｋｂＤＮＡ断片を分取する。このＤＮＡ断片と上記
０　、８　ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片をつないで環状化しＭｕ
ＬＶ　　ＬＴＲ，ＳＶ４０プローＥ−一ターと同方向に
ｒｂＦＧＦが挿入されたものを選択してプラスミドｐＴ
８７８５を得る。このプラスミドは動物細胞に導入する
とＭｕＬＶ　　ＬＴＲあるいはＳＶ４０プロモーターの
支配下にｒｂＦＧＦ　ｃＤＮＡを発現することができる
。

サルＣＯ５−７細胞を１０％胎児牛血清を含むＤＭＥＭ
培地で単層環ｌｌ（ファルコン径６０ｎｕｓプラスチッ
クディツシュ）した後、同培地で培地交換する。交換の
４時間後に公知の方法［Ｏｒａｈａｍら。

ヴイクロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９
７３）コに従いプラスミドｐＴ８７８５のＤＮＡＩ　Ｏ
μｇを含むカルシウムホスフェートゲルを調製して細胞
に添加し、ｐＴＢ７８５感染ＣＯ５−７細胞を得る。さ
らにその４時間後グリセロール処理して０．５％胎児牛
血清を含む培地で上記ｐＴＢ７８５感染ＣＯ５−７細胞
の培養を続けた後、７０〜７２時間後に産生されたｒｂ
ＦＧＰを含む培地を集める。この培地中に含まれるｒｂ
ＦＧＦｆｉは以下の方法により測定される。

ｒｂＦＧＦ活性はＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対する増殖
促進作用により、同じ活性を示す精製ウシ脳ＰＧＦ標品
（宝酒造株式会社製）の重量で表わすことができる。

マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞を５％仔牛血清を含むＤ
ＭＥＭ培地でタンク９６穴マイクロタイタープレート（
平底）に１穴あたり２Ｘ１０３個を０．２−の培地にて
播種して、培養し、翌日。

０．５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地に交換する。

３日間培養したのち０．５％ＢＳＡを含むＤＭＥ培地で
５倍ずつ段階的に希釈した検体を１穴あたり１０μ添加
して、培養し、２０時間後に５Ｈ−Ｔｄｒ（５Ｃｉ／ｓ
ｍｏｌ、　０　、５　ｔａｃ　Ｌ／ｌｄ　　ＲＣＣＡ　
ｍｅｒｓｈａｍ）を各穴に２μずつ加える。６時間後に
細胞を０．２％トリプシン−０，０２％ＥＤＴＡを含む
リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ　）処理ではがし、タイター
チックセルハーベスタ−を用いて、グラスフィルター上
に細胞を捕集し細胞に取り込まれた３Ｈ−Ｔｄｒ量をシ
ンチレーションカウンターにて測定する。同様の操作で
重量既知のウシ脳ＦＧＦ（宝酒造製）活性を測定し、得
られた検量１曲線より、検体中のｒｂＦ　Ｇ　Ｆ　＠を
算出することが出来る。

この方法により′前記発現プラスミドを感染させたＣＯ
５−７細胞の培地中にｒｂＰＧＦ活性が検出できる。

実施例３　　ｒｂＦＧＦをコードする遺伝子の大腸菌に
おける発現： （１）ｒｂＦＧＦ発現用プラスミドｐＴ８７８６の構築 前記実施例１（２）で得られたｒｂＦＧＦ　ｃＤＮＡを
含むプラスミドｐＴＢ７８４をＥｃｏＲＩで切断し、０
　、８　ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を得る。このＤＮＡ断片を
さらにＨａｅ■で切断して０　、５　ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断
片を得る。別にリン酸化反応後の合成オリゴヌクレオチ
ド ”ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣ。

”ＣＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＣ。

”ＴＣＣＧＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＡＧ。

および ”ＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴ をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させ、これをさらに上
記０．５ｋｂＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合させる。結合物をＥｃｏＲＩで消化して０．５４ｋ
ｂＤＮＡ断片を調製する。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ
７８１　［Ｋｕｒｏｋａ、ｗａ、Ｔ　、らニュークレイ
ツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１
ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）１１．３０７７−３０８５（１９
８３）ＩＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、このＤＮＡに上
記０．５４ｋｂＤＮＡを結合させて環状化し、プラスミ
ドを得る。

このプラスミドのうち、ｒｂＦＧＦ　ｃＤＮＡがｔｒｐ
プロモーターと順方向に挿入されたものを選択して、ｒ
ｂＦＧＦ発現用プラスミドｐＴ８７８６を得る。

このプラスミドｐＴＢ７８６を用いて大腸菌ＤＨ１を形
質転換させることによりプラスミドｐＴ８７８６を含む
形質転換体Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉＤＨ
Ｉ／ｐＴＢ７８６を得る。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、それぞれ１％グルコース。

０．４％カザミノ酸、８μｇ／−テトラサイクリンを含
むＭ９培地で培養し、Ｋ　１ｅｔｔ値か約２００の時点
で、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μｇ／ｄになる
ように添加し、さらに４時間培養する。

培養後、菌体を集め、１／２０量の２０ｓ＋ＭＴｒｉｓ
−ＨＣ１，ｐＨ７，６，１０％シュークロース溶液に懸
濁する。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（ＰＭＳＦ）を１ｍＭ、ＥＤＴＡを１０ｍＭ、Ｎ
ａＣ１をＯ，１Ｍ、スペルミジン塩酸塩を１０＋ｅＭ、
リゾチームを１００　μｇ／ｌｄ（いずれも最終濃度）
となるように添加し、θ℃、４５分放置後、３０秒間超
音波処理を加える。この溶液を１８００　Ｏｒｐｍ（サ
ーバル遠心機、５Ｓ３４−ａ−ター）３０分間遠心して
上清を得、菌体抽出液とする。

この菌体抽出液には、実施例２に記載の方法を用いて、
強いｒｂＦＧＰ活性を検出することができる。

発明の効果 本発明の形質転換体を培地に培養することにより、ｒｂ
ＦＧＦを大１に製造せしめることができるので、医薬、
試薬等として有用なｒｂＦＧＰを大量に供給することが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られたｃＤＮＡ部分の制限酵素
地図を示す。 第２図は、実施例１で得られたｃＤＮＡ部分の塩基配列
と、その配列から推定されるアミノ酸配列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を含有するポリペプチドであるラット塩基性線維芽細胞
   成長因子。 ２、ラット塩基性線維芽細胞成長因子をコードする塩基
   配列を含有する組換えＤＮＡ。 ３、ラット塩基性線維芽細胞成長因子が特許請求の範囲
   第１項記載のポリペプチドである特許請求の範囲第２項
   記載のＤＮＡ。 ４、塩基配列： 【遺伝子配列があります】 を含有する塩基配列である特許請求の範囲第２項記載の
   ＤＮＡ。 ５、特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡを含有するベク
   ターで形質転換された形質転換体。 ６、特許請求の範囲第５項記載の形質転換体を培地に培
   養し、培養物中にラット塩基性線維芽細胞成長因子を生
   成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該因子
   の製造法。