KR0161667B1

KR0161667B1 - 헤파린 유도체 및 그 제조방법과 그를 함유하는 의약품

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Publication number: KR0161667B1
Application number: KR1019900000266A
Authority: KR
Inventors: 피아니 실바노; 타마노네 쟝프랑코; 로베르토 알피노 라울; 리타 밀라니 마리아
Original assignee: 지암파올로 지로티; 알파 와셔만 에스.피.에이.
Priority date: 1989-01-30
Filing date: 1990-01-11
Publication date: 1998-11-16
Also published as: NO900392D0; IT8903328A0; IT1234826B; DK0380943T3; IL92912A; JPH0678369B2; NZ232115A; AU4885890A; FI96425C; IE900316L; PT92991A; FI900446A0; ES2058609T3; ATE111107T1; JPH02240102A; FI96425B; NO301719B1; AU610034B2; DE69012154D1; ZA90263B

Abstract

내용없음.

Description

헤파린 유도체 및 그 제조방법과 그를 함유하는 의약품

본 발명은 시판용, 정제된 또는 저분자량의 헤파린을 임의 선택적으로 염과 환원제 존재하에 염기성 매질 속에서 처리함으로써 제조되는, 변형된 구조를 가지는 새로운 헤파린 유도체에 관한 것이다.

이 새로운 헤파린 유도체는 또한 1988년 6월 10일 출원한 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기술된 바와 같은 헤파린 유도체를 임의 선택적으로 염 또는 환원제 존재하에 중성 또는 염기성 매질 속에서 가열함으로써 제조될 수 있다. 새로운 헤파린 유도체는 시판용 헤파린, 또한 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기재된 헤파린 유도체와는 전혀 다른 화학 물리적 특성을 가지며, 또한 상술한 두 종류의 생물학적 작용과 전혀 다른 생물학적 작용을 한다. 특히 이 새로운 헤파린 유도체는 헤파린 구조체의 전형적인 작용인 항응혈 작용을 가지지 않으며, 반면에 원래 그대로의 또는 개선된 고유의 생물학적 작용, 예를 들면 항결석 작용이 있으므로 신장결석증의 치료 및 예방을 위한 약제로서 적합하다. 문헌(Bowyer R. G. et al, Clin. Chim. Acta, 95, 23(1979))에는 헤파린의 옥살산 칼슘 결정의 형성 및 응집의 강한 억제제라고 발표되어 있으며, 문헌신장 결석증에 있어서 결정화의 억제제 및 이들의 임상적 적용(Baggio B. Bologan, Sep. 7-9(1987))에는 헤파린이 옥살산염의 요배설을 감소시킨다고 기술되어 있다. 그러므로 헤파린은 결석증에 대한 약제로서 가능하지만, 그 고유의 항응고작용 및 항응혈작용 때문에 일반적으로 신장결석증에, 특히 옥살산 칼슘 신장 결석증에 사용될 수 없다. 반면 본 발명의 새로운 제품은 헤파린의 전형적인 항응고 특성을 가지지 않으므로, 부작용 없는 매우 특수한 약제로 장기간 치료를 요하는 만성적인 병인 신장결석증의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 목적물인 헤파린 유도체는 전체적으로 유럽 특허공보 제0133078호(Mardiguian J. S.) 및 문헌(Hirono S. at al. in Conn. Tissue Res, 3, 73-79, (1975))에 기재되어 있는 제품들과는 전혀 다른 화학 물리적 특성을 가진다. 즉, 평균 분자량이 실제로 변화되지 않으므로 인해 알 수 있는 바와 같이 해중합되지 않으며, U. V. 스펙트럼에서 225-230mm에서의 흡수가 없고¹³C-NMR 스펙트럼에서 이중결합의 공명에 해당하는 피크가 존재하지 않으므로 인해 우론산의 4와 5위치에 이중결합이 존재하지 않음을 알 수 있다. 또한 본 발명에 따라 제조된 화합물의¹³NMR 스펙트럼은 글루코사민의 위치 6에 있는 탄소원자의 시그널의 강도와 위치가 변하지 않음을 보여주며, 또한 안히드로 유도체의 생성에 있어서 6-황산화 탄소원자의 관여로 인해 3,6-안히드로글루코사민의 생성의 경우에 변화되어야 하는 6-탈황산화 탄소원자와 6-황산화탄소원자 사이의 강도의 비가 변화되지 않음을 보여주므로, 본 발명의 헤파린 유도체는 삼프손 피.(Sampson P.) 및 메이어 케이.(Meyet K. in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68, 2329-31(1971))에 의해 분리된 화합물의 화학 물리적 특성을 나타내지 않는다. 마지막으로 본 발명의 목적물인 제품은 예를 들어¹³C-NMR 스펙트럼에 있어서 53 및 54p.p.m에서 피크가 존재하지 않는다는 사실에서 알 수 있는 바와 같이, 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 특허 청구된 화합물과는 화학 물리적 특성이 전혀 다르다.

본 발명은 새로운 헤파린 유도체, 신장결석증의 치료에 이를 함유하는 의약품 및 그 제조방법, 즉 임의 선택적으로 염 및 환원제 존재하에 다양한 근원의 시판용 헤파린, 또는 정제된 헤파린 또는 저분자량의 헤파린을 염기성 매질 속에 가열시킴으로써 화학적 변형에 의하여 제조하는 방법에 관한 것이다.

이 새로운 헤파린 유도체는 또한 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기술된 헤파린 유도체를 임의 선택적으로 염 및 환원제 존재하에 중성 또는 염기성 수성 매질 속에서 가열함으로써 제조될 수 있다. 화학적 변형을 위한 반응은 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기재된 바와 같은 방법으로 시판용 또는 정제된 또는 저분자량의 헤파린을 고온에서 염기성 처리함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 제조방법에 있어서 몇가지 기본적인 매개변수(주로 온도 또는 시간)는 상기 이탈리아공화국 특허출원서에 기재된 방법에서부터 적절하게 수정된 것이다. 특히 상기 방법과 비교할 때 온도는 상승되었고 시간은 연장되었다. 시판용, 정제된 또는 저분자량의 헤파린은 두 단계의 연속적인 반응을 통하여 우선 상기 이탈리아공화국 특허출원서에서 특허 청구되는 화합물로 변형된 다음, 계속해서 화학적 변형이 이루어져 본 발명의 화합물로 변형된다.

다시 말해서, 특수한 반응조건은 출발물질인 헤파린을 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기재된 특성을 가지는 중간화합물로 변형시킬 뿐만 아니라, 계속적으로 이 화합물을 본 발명에 기재된 화학 물리적 특성을 가지는 최종 화합물로 변형시킨다. 이는 선택되는 특수한 조건에 따라서 중간 화합물은 반응진행중에 다소 고농도로 존재할 수 있으며, 저농도에서는 이용 가능한 화학 물리적 방법에 의해 검출될 수 없다는 것을 명백히 해준다. 또한 온도 및 시간 이외의 매개변수도 사용될 수 있다. 예를 들면 염기의 농도도 또한 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 특허 청구된 화합물의 생성방향 대신 본 발명의 목적 화합물의 생성 방향으로 반응의 평형을 이동시킬 수 있다. 실제로 반응의 평형은 반응의 모든 매개변수에 의존하므로 그 평형은 매개변수의 조절에 따라서 변화된다. 그러므로 매개변수(첫째로 온도, 둘째로 시간)를 측정하는데 있어서 매우 중요한 사항은 제한적인 용어가 아닌 실질적이고 예증적인 용어로 설명되어야 한다는 것이다.

화학적 변형 반응은 또한 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기재된 방법에 따라 제조된 화합물을 출발물질로 사용하여 수행될 수도 있다.

이 두 번째 경우에 있어서, 이 출발화합물은 임의 선택적으로 염 및 환원제 존재하에, 중성 또는 염기성 수성 매질 속에서 가열된다.

마지막으로 화학적 변형반응은 상술한 화합물의 분리단계를 거치지 않고 수행될 수 있다. 즉, 본 화학적 변형반응은 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기재된 방법중의 하나에 따라서 제조된 반응혼합물로 직접 수행될 수 있다. 이 경우 중간 반응혼합물은 새로운 반응에 필요한 화학적 매질을 생기게 할 수 있는 화학적 처리, 예를 들면 산, 염기 또는 이온교환수지에 의한 pH의 수정; 투석(透析) 또는 이온교환수지 또는 겔컬럼에 의한 염의 제거; 염 또는 그 조합물의 첨가 등의 화학적 처리를 한다.

이렇게 얻어진 변형된 헤파린 구조를 가지는 새로운 화합물은 출발화합물 및 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 특허 청구된 화합물과는 다른 화학적 물리적 특성(예를 들면 비선광도 및¹³C-NMR 시그널)을 가진다. 특히 본 헤파린 유도체는 아노머 탄소의 피크가 나타나는 102와 92p.p.m 사이의 영역에서 시판용 헤파린 유도체와는 완전히 다른 시그널을 보여주며 상기 이탈리아공화국 특허출원서에 기재된 화합물의 전형적인 특성인 53 및 54p.p.m에서 피크가 존재하지 않는다. 또한 본 발명의 새로운 화합물은 출발물질인 시판용 헤파린과 비교할 때 낮은 값의 비선광도(20°-30° 낮음)를 가지는 것을 특징으로 한다. 비선광도의 감소정도는 출발물질인 헤파린의 비선광도보다 높은 값을 나타내는 상기 이탈리아공화국 특허출원서에 기재된 화합물과 비교하면 훨씬 더 크다.

시판용 또는 정제된 또는 저분자량의 헤파린의 화학적 변형은 염기(바람직하게는 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 수산화물) 존재하에, 임의 선택적으로 알칼리금속 또는 알칼리토금속염 및 환원제(바람직하게는 수소화붕소나트륨) 존재하에, 고온에서 또는 장시간 동안 수성 매질 속에서 수행된다.

사용되는 알칼리금속 또는 알칼리토금속염기 및 염으로는 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 바륨 염기 또는 염이 바람직하다.

염기로서 사용될 수 있는 물질은 수산화나트륨, 칼륨, 바륨 등이다.

염으로서 바람직하게 사용될 수 있는 물질은 초산나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘 및 마그네슘; 염화나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘 및 마그네슘; 및 황산나트륨, 칼륨 및 마그네슘이다.

시판용이거나 정제된 또는 저분자량의 헤파린을 임의 선택적으로 1N 또는 1N 이하의 알칼리금속 또는 알칼리토금속염과, 촉매적인 량의 환원제(바람직하게는 수소화붕소나트륨) 존재하에 0.01N-1N의 알칼리금속 또는 알칼리토금속염기의 수용액속에 용해시킨다. 이 용액을 75℃와 반응혼합물의 끓는점 사이의 온도에서 0.5-24시간 동안 반응시킨다. 반응이 완료되면 이 용액을 실온으로 냉각시켜서 중성 pH로 되게 하고 임의 선택적으로 정제처리(예를 들면 이온 교환 칼럼에 통과시키거나 투석을 행함)를 한 다음 최종적으로 2-4배 용량, 바람직하게는 2.5배 용량의 탄소수 1-3의 알코올(예를 들면 에틸알코올)의 첨가 또는 동결 건조에 의해 침전시킴으로써 변형된 구조의 헤파린 제품을 얻는다.

본 발명의 목적물인 새로운 헤파린 유도체는 또한 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 따라 제조되는 헤파린 유도체, 또는 상기 출원서에 기재된 반응 혼합물을 출발물질로 사용하여 제조될 수 있다.

첫번째 경우, 헤파린 유도체를 임의 선택적으로 1N 또는 그 이하의 알칼리금속 또는 알칼리토금속염과 촉매적인 량의 환원제 존재하에, 0.01N-1N의 알칼리금속 또는 알칼리토금속염기의 수용액 속에 용해시키고 이 용액을 75℃와 반응혼합물의 끓는점 사이의 온도에서 0.5-24시간 동안 반응시킨다.

두 번째 경우, 상기 이탈리아공화국 특허출원서에 따라 제조된 반응혼합물을 임의 선택적으로 염산 또는 초산 또는 프로피온산 등과 같은 산을 가하여 용액의 pH를 중성까지 조절하거나, 또는 투석 또는 음이온 수지와 양이온 수지에의 통과 또는 겔여과 등에 의해 경우에 따라 존재하는 염 및 환원제를 제거시키거나 또는 상기 처리를 두가지 이상 적절히 조합하여 수행하므로써 변형시킨 다음, 75℃와 반응혼합물의 끓는점 사이의 온도에서 0.5-24시간 동안 반응시킨다.

상기 두 경우 모두, 상술한 바와 같은 반응이 완료될 때 목적하는 최종제품이 분리된다.

본 발명의 방법에 따라 제조되는 변형된 헤파린류는 종래 기술에 공지된 알칼리처리에 의해 얻어지는 헤파린류와는 완전히 다른 고유한 화학 물리적 특성을 가진다.

출발물질 헤라핀과 비교시 새로운 헤파린 유도체의 구조적 변화는 특히¹³C-NMR 스펙트럼에서의 공명의 위치 및 상대적 강도로부터 전기영동 특성으로부터, 비선광도 값의 감소 및 황함량 및 황산염/카르복실 비의 감소(카르복실 함량의 불변)로부터 또한 일정량의 유리아미노기의 존재로부터 입증된다.

본 발명의 새로운 헤파린 유도체의 구조의 보다 특징적인 변화는¹³N-NMR 스펙트럼에서 나타나는 큰 변화를 연구함으로써 확인되었다. 이러한 변화는 스펙트럼의 일정한 영역으로 표현되며 이에는 새로운 피크의 출현 및 다른 피크의 변형 및 소멸이 포함된다. 특히 중요한 점은 시판용 헤파린 및 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기재된 제품에 대한 92-102p.p.m 사이의 영역에서 이두론 산과 글루코사민 단위의 탄소원자1에 해당하는 시그널의 이동이 나타난다는 점이다. 또한 상기 이탈리아 특허출원서에 발표된 헤파린 유도체의 특성인 53 및 54p.p.m에서의 두 개의 시그널의 소멸현상도 특히 중요한 사실이다.

특히, 시판용 헤파린과 비교시에 101.3p.p.m에서 새로운 피크가 존재한다. 새로운 화합물과 출발화합물의¹³C-NMR 스펙트럼을 비교 조사하면 스펙트럼의 일정 영역이 변화되지 않은 상태이므로 따라서 헤파린 구조의 결정적 부분은 전혀 변형되지 않았다는 것을 알 수 있다. 특히 황산화 또는 탈황산화글루코사민 단위의 위치 6에 대한 시그널은 수정되지 않았다. 더욱이 황산화된 글루코사민 단위의 위치 2에 대한 피크, 이두론산의 카르복실기에 대한 피크 및 헤파린중 우론산 잔기의 평균 20%를 구성하는 글루쿠론산의 위치에 대한 피크는 변형된다.

또한 새로운 변형된 헤파린은 초산바륨 완충액(0.1M, pH 5.8)에서 출발화합물과는 다른 전기영동 특성을 가진다. 즉 새로운 헤파린은 시판용 헤파린보다는 높고, 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기재된 변형된 헤파린 보다는 낮은 유동성을 가진다.

새로운 헤파린 유도체는 황함량이 6%-9%이고, 황산염/카르복실비가 1.20-1.70이며, 546nm에서의 비선광도는 +10°-+40°(수용액중)이고, 589nm에서의 비선광도는 +20°-+30°(수용액중)이며, 유리아미노기의 값은 0.4%-2.1%인 것을 특징으로 한다.

화학적 변형은 제조시 사용되는 방법에 따라 다른 방식으로 계산된다.

본 발명에 따르는 제품을 시판용 헤파린으로부터 제조하는 경우에는, 출발물질 헤파린과 중간화합물로서 생성되는 이탈리아공 특허출원 제3504 A/88호에 기재된 변형된 헤파린에 대한 화학 물리적 특성을 비교하는 것이 필요하다.¹³C-NMR을 고려하는 경우, 해당 분야에 숙련된 사람이면 본 특허명세서의 실험부분인 실시예에 인용된 공명값을 검토함으로써 명백히 알 수 있는 바와 같이, 전체 스펙트럼 특히 102-92p.p.m 사이의 아노머탄소의 간격에서 나타나는 총변화를 고려해야 한다. 편의상 반응의 진행을 이해하기 위해서 546 또는 589nm에서의 비선광도의 변화를 고려할 수 있다.

실제로 시간의 추이에 따라 측정된 비선광도의 값은 사용된 반응조건에 따르는 특징적인 변화를 보여준다. 일반적으로, 80℃에서 자동온도조절 장치된 1N 수산화나트륨중의 시판용 헤파린 4% 용액의 589 및 546nm에서의 비선광도의 값을 시간의 추기에 따라 측정하여 기록한 표 1로부터 분명히 알 수 있는 바와 같이, [α]값은 처음에는 증가되다가 그 다음에는 감소된다. 표 2 및 3에서 분명히 알 수 있는 바와 같이 측정된 비선광도 값으로부터 본 발명에서 특허 청구하는 화학적 변형과 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에서 특허 청구하는 화학적 변형은 뚜렷하게 구별된다.

기록된 값에서 보여주는 것은 본 발명의 화학적 변형은 저온, 즉 60℃에서 또한 장시간에서는 주목할만하게 이루어지지 않으며, 이와 대조적으로 상기 이탈리아공화국, 특허출원서에 기재된 화학적 변형은 고온, 즉 90℃에서는 주목할만하게 이루어지지 않음을 보여준다.

¹³C-NMR 스펙트럼에서 53 및 54p.p.m에서의 피크의 점진적 소멸 및 비선광도의 감소는 본 발명의 목적물인 헤파린 유도체가 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 특허 청구된 제품을 출발물질로 하여 정제한 후 제조되거나 또는 중간 반응혼합물의 적합한 화학적 처리를 통해 제조되는 경우에 고려된다. 전자의 경우는 53 및 54p.p.m에서의 피크들의 적분의 합과 62.5-69p.p.m에서의 글루코사민의 위치 6의 탄소의 피크들의 적분의 합계비가 고려된다. 62.5-69p.p.m에서의 피크는 그 세기가 일정하고 기타 피크로부터 독립적인 스펙트럼 영역에 있으므로, 임의의 기준으로서 선택된다.

상기 비의 값은 반응중에 감소하여 반응 종결시에는 소멸된다. 반면 비선광도의 값은 일정치까지 점차로 감소되며, 589nm에서의 비선광도의 감소가 53 및 54p.p.m에서의 공명의 감소와 병행하여 이루어지므로서 이 비선광도 값을 계산할 수 있다.

본 발명의 목적물인 새로운 헤파린 유도체는 출발물질인 헤파린의 전형적인 생물학적 작용을 거의 나타내지 않으며 탁월한 항결석 작용을 가진다. 이 항결석 작용은 두가지 특수한 생물학적 테스트에 의해 측정되었다. 즉, 옥살산염의 막유출(transmembrane flux)의 측정은 문헌(Baggio B., et al., Lancet 1984, (Ⅱ), 12-14)에 기재된 방법에 따라 수행되었으며, 막의 단백질의 인산화에 대한 조사는 문헌(Baggio B. et al., IRCS Med. Sci. 14, 368(1986))에 따라 행해졌다. 그 결과는 옥살산염의 막유출, 막의 단백질의 인산화에 대해 각각 결석 특발형 환자에게서 생기는 적혈구를 사용하여 대조용에 대한 본 발명의 제품에 의해 이루어지는 억제%로서 표현하였다. 옥살산염의 적혈구 유출은 12시간의 야간 단식후 다음과 같이 측정되었다. 즉 헤라핀화 된 시험관내에 수집된 정맥 혈액 100ml를 150mM의 Nacl, 10mM의 Kcl, 20mM의 TRIS Hcl(pH 7.4)을 함유하는 용액으로 3회 세척하였다. 그 다음 이 샘플을, 10mM의 옥살산 나트륨을 가한 동일용액으로 50% 헤마토크리트로 현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 그 다음 4℃에서 배양하였다. 원심 분리한 후, 상기 용액으로 20% 헤마토크리트로 현탁된 적혈구를 여러 부분으로 나누어 여기에 일정¹⁴C-옥살산염(8,000-10,000cpm)을 가하였다. 10, 20, 30, 60, 90, 120분, 24시간 후에, 해당부분을 원심 분리하여 상등액에 대해 베타 카운터에서의¹⁴C 활성을 측정하였다. 옥살산염의 교환 유동상수는 다음과 같은 1차 함수의 기울기로부터 계산된다.

위 식에서, t는 시간, K는 유동상수, A는 0시간, t시간, 동위원소의 평형(00)에서의 옥살산염의 양을 나타낸다.

막의 단백질의 인산화에 대한 조사에는 옥살산염의 비정상적인 막 유출과 관련되는 석회 특발병인 신장 결석증으로 고통을 겪는 환자에게서 생기는 환영세포를 사용하였다. 환영세포의 내인산화는 100mM의 TRIS Hcl(pH 7.5), 8mM Mgcl₂, 2mM의 (32p) ATP, dir 50㎍의 막의 단백질을 최종부피 125㎕되게 함유하는 매질 속에서 배양시간을 변화시키면서 37℃에서 이루어졌다. 2%의 도데실황산나트륨 및 1%의 메르캅토에탄올을 가하여 배양을 중단시키고 5분 동안 100℃에서 끓었다. 그 다음 추적자로서 20㎕의 사카로즈 포화용액 및 12㎕의 0.05% 피로닌을 가하였다. 이렇게 처리된 단백질의 양 20㎍ SDS-폴리아크릴아미드겔에 대해 전기영동시켰다. 그 다음 겔을 쿠마시블루(Coomassie Blue)에 의해 착색시키고 건조시킨 다음 20분 동안 오토라디오그라피를 행하였다. 오토라디오그램은 단백질 밴드에 32p가 융합되는 양을 정하기 위한 농도계에 의해 읽혀졌다. 기타 생물학적 활성은 헤파린의 전형적인 여러 가지 테스트를 통해 측정되었다. 실제로 항 Xa 인자, APTT, 출혈시간 및 실험적 혈전증으로부터의 보호에 대한 테스트를 수행하였다. APTT 활성은 종래의 방법(Larrieu M.J. and Weiland G., Rev. Hematol., 12, 199, (1957))에 의해 측정되었으며, 항 Xa 활성은 종래 방법(Yin E. T. and Wesslers., Biochem, Biophys. Acta, 201, 387, (1970))에 의해 측정되었다.

테스트시 각 화합물을, 절식한 쥐로부터 취한 혈장내에 용해시킨 후, 각 방법에 필요로 하는 농도로 희석시켰다. 각 화합물에 대한 측정은 두가지 활성에 대해 수행되었다. 각 테스트에서 매우 큰 변화를 야기시키는 양을 mcg/ml 단위로서 각 화합물에 대해 계산하였다. 특히 각 제품의 활성은 각각 APTT 시간을 2배로 하는 농도, 항-Xa 값을 30% 증가시키는 농도, 즉 mcg/ml로서 나타내었다. 두가지 테스트에서 얻어진 값(표3)은 새로운 화합물이 낮은 항응고성을 가진다는 것을 확인시켜준다.

출혈시간에 대한 테스트는 종래 방법(Dejana E. et al., Thromb. Haemost. 48, 108, (1982))에 따라 쥐를 사용하여 수행되었으며, 그 결과로서 대조용 쥐의 출혈연장 시간에 대한 새로운 헤파린류로 처리한 쥐의 출혈연장 시간의 퍼센트를 계산하여 나타내었으며 동일 량(1mg/kg/i.v.)으로 투여된 해당 출발 헤파린의 연장시간과 비교하였다.

항응혈 활성은 문헌(Reyers S. et al., Thromb. Res. 18, 669-674, (1980))에 기술되어 있는 울혈 정맥 혈전증 테스트에 의해 평가되었다.

새로운 화합물에 의해 이루어지는 보호는 출발 헤파린에 의해 이루어지는 항응혈 보호는 100으로 간주하여 이에 대한 퍼센트로서 계산하였다.

얻어진 결과는 항결석 작용에 대한 테스트에 있어서 두 형태의 헤파린류는 사실상 동등하거나 개선되었음을 보여준다. 이와는 대조적으로 시판용 헤파린에 대한 특정 테스트에 의해 입증되는 항응고성 작용은 새 헤파린에서는 사실상 존재하지 않는다.

상술한 생물학적 테스트의 값은 화학 물리적 특성과 함께 실험 부분에 기록되어 있다.

새로운 헤파린 유도체는 신장 병리학 특히 신장결석증의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 바람직한 투여경로는 헤파린의 전형적인 투여경로이다. 즉 약간의 염(용액을 등장액으로 유지시키기 위한 목적)과 약간의 방부제를 함유하는 멸균 수용액 형태로 비경구 투여 및 피하투여된다.

또한 본 발명의 헤파린 유도체는 다른 경로로 바람직하게는 위저항성 약제 조성물로서 투여될 수 있다.

시판용 헤파린, 또는 시판용 헤파린 나트륨의 처리에 의해 정제된 헤파린, 또는 종래의 방법에 따라 해중합에 의해 얻어지는 저분자량의 헤파린은 본 발명의 목적물인 수정된 헤파린을 제조하는데 사용될 수 있다. 사용되는 헤파린의 정제 및 해중합 방법은 본 발명을 구체적으로 설명하는 실시예 이전에 기술되어 있으나, 이에 국한되는 것으로 간주되어서는 안된다. 황산염/카르복실비의 측정은 전위차 측정법으로 수행되었다. 황의 퍼센트 측정은 전위 차 측정법 및 쉐니거(Schoeniger)법으로 수행되었다.¹³C-NMR 스펙트럼은 용매로서 D₂O, 기준내 표준물질로서 3-트리메틸실릴프로판술폰산 나트륨을 사용하여 바리안(Varian) CFT-75 분광광도계를 이용하여 75.47MHZ에서 수행하였다.

[헤파린 나트륨 ALFA 87-81]

시판용 헤파린 나트륨 50g을 4000ml의 물 속에 용해시키고 그것을 4000ml의 물, 114ml의 초산 및 1200ml의 에틸알코올 중에 222.4g의 초산칼슘 일수화물을 함유하는 용액에 50분간 따라 부으면서 온도는 8°-10℃로 유지시킨다. 이렇게 생성된 현탁액을 5℃에서 15시간 지난 다음 여과시킨다. 이 여과액에 에틸알코올 2000ml를 가하고 5℃에서 3시간 지난 다음 생성된 침전물을 여과한다. 그 다음 이 침전물을 400ml의 물에 용해시킨 후 이 용액의 pH를 1N 수산화나트륨을 사용하여 7.0으로 조절한 다음, 200ml의 Dowex 50W X8(나트륨형태)수지와 140ml의 물로 20분간 처리한다. 용액과 수지를 동일한 수지 160ml가 들어있는 크로마토그래픽 칼럼(Ø=4cm, h=13cm)속에 옮겨 넣는다. 이 용액을 삼출시키고 용액의 총 부피가 800ml가 될 때까지 증류수로 용출시킨 다음 상기 용액에 24g의 초산나트륨삼수화물과 2000ml의 에틸알코올을 가한다. 이 침전물을 여과하여 진공하에 건조시켜서 ALFA 87-81이라 불리는 정제된 헤파린나트륨 36.5g을 얻었다. 그 화학물리적 특성은 다음과 같다.

*C-NMR 스펙트럼(p.p.m):177.3; 104.7; 102.0; 99.5; 80.1; 78.6; 72.4; 72.0; 69.1; 60.7;

*S=10.6%

*황산염/카르복실비=22.0

*[α]=+54°(C=HO중 1%)

*[α]=+47°(C=HO중 1%)

*유리 NH=0.0%

*APTT=1.7㎍/ml

*항 Xa=20.6㎍/ml

*출혈시간의 연장200%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=73.5%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=24%(C=10㎍/ml)

[시판용 헤파린 나트륨 ALFA 88-247]

*C-NMR 스펙트럼(p.p.m):177.3; 177.1; 104.7; 102.0; 99.6; 79.2; 78.9; 78.7; 72.5; 71.9; 69.2; 62.8; 61.0; 60.7; 60.3

*S=10.9%

*황산염/카르복실비=2.1

*[α]=+54°(C=HO중 1%)

*[α]=+47°(C=HO중 1%)

*유리 NH=0.27%

*APTT=0.7㎍/ml

*항 Xa=30.3㎍/ml

*출혈시간의 연장200%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=69.2%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=24%(C=10㎍/ml)

[시판용 헤파린 나트륨 ALFA 87-120]

*C-NMR 스펙트럼(p.p.m):177.3; 104.7; 102.1; 99.5; 78.7; 72.5; 72.0; 69.2; 62.7; 60.8

*S=11.4%

*황산염/카르복실비=2.3

*[α]=+57°(C=HO중 1%)

*[α]=+55°(C=HO중 1%)

*유리 NH=0.4%

*APTT=1.4㎍/ml

*항 Xa=26.4㎍/ml

*출혈시간의 연장200%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=61.0%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=23%(C=10㎍/ml)

[시판용 헤파린 나트륨 ALFA 87-163]

*C-NMR 스펙트럼(p.p.m):177.6; 104.8; 102.0; 99.5; 78.6; 72.4; 72.0; 69.2; 62.7; 60.8

*S=11.0%

*황산염/카르복실비=2.0

*[α]=+60°(C=HO중 1%)

*[α]=+51°(C=HO중 1%)

*유리 NH=0.6%

*APTT=2.1㎍/ml

*항 Xa=23.4㎍/ml

*출혈시간의 연장200%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=79.2%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=20%(C=10㎍/ml)

[저분자량 헤파린나트륨 ALFA 87-198]

저분자량의 헤파린나트륨 LMW ALFA 87-198은 국제특허공보 WO 87/06729에 기술되어 있는 방법에 따라 구리이온 존재하에 과산화 수소로 해중합시켜 제조하였다. 이 화합물은 다음과 같은 화학 물리적 특성을 가진다.

*C-NMR 스펙트럼(p.p.m):177.73; 104.87; 102.0; 99.6; 80.2; 78.6; 72.4; 71.9; 69.2; 62.7; 60.6

*평균분자량=4400달톤

*S=11.60%

*황산염/카르복실비=2.31

*[α]=+47°(C=HO중 1%)

*[α]=+43°(C=HO중 1%)

*유리 NH=0.0%

*APTT=8.5㎍/ml

*항 Xa=40.6㎍/ml

[실시예 1

헤파린 ALFA 87-81 1.8g을 0.4g의 수산화나트륨(0.225N) 2.3g의 초산나트륨(0.625N) 및 10mg의 수소화 붕소나트륨을 함유하는 수용액 45ml에 가한다.

이렇게 생성된 용액을 95℃에서 3.5시간 동안 자동온도 조절시킨 다음 실온으로 냉각시킨 후 빙초산으로 중성으로 조절한 후 2.5용량의 에탄올을 가한다. 이 침전물을 필터 상에 수집하여 에탄올-물 6:1 혼합물에 용해된 초산나트륨 2% 용액(W/V)으로 세척한 다음 에탄올-물 6:1 혼합물로 세척하고 건조시킨다. 이렇게 하여 생성물 1.77g을 얻었다. 이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ(p.p.m.으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다.

*δ:177.7; 104.6; 101.8; 101.3; 100.3; 98.2; 80.7; 78.9; 74.5; 73.7; 72.8; 71.4; 68.9; 62.7; 61.4; 60.7

*S=7.35%

*황산염/카르복실비=1.50

*[α]=+26°(C=HO중 1%)

*[α]=+24°(C=HO중 1%)

*유리 NH=1.22%

*APTT=124.0㎍/ml

*항 Xa=41.2㎍/ml

*출혈시간의 연장=19%(1mg/kg, i.v.)

*출발물질에 대한, 혈전증에 대한 보호=10%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=61.0%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=20%(C=10㎍/ml)

[실시예 2]

헤파린 ALFA 88-247 30g을 수산화나트륨(6.75g:0.225N) 및 수소화 붕소나트륨(200mg)을 함유하는 수용액에 가한다.

이 용액을 90℃에서 4시간 동안 자동온도조절시킨 다음 초산으로 중성 조절한 다음 흐르는 물로 하룻밤, 증류수를 사용하여 6시간 동안 투석시킨다. 이 투석물을 동결건조하여 생성물 26.4g을 얻었다. 이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ(p.p.m.으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다.

*δ:177.8; 104.7; 101.9; 101.4; 98.4; 80.6; 79.8; 79.3; 79.0; 73.5; 72.8; 71.8; 69.0; 62.7; 61.3; 61.1; 60.8

*S=7.7%

*황산염/카르복실비=1.30

*[α]=+33°(C=HO중 1%)

*[α]=+28°(C=HO중 1%)

*유리 NH=1.20%

*APTT=16.7㎍/ml

*항 Xa=44.7㎍/ml

*출혈시간의 연장=46%(1mg/kg, i.v.)

*출발물질에 대한, 혈전증에 대한 보호=70%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=74.4%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=28%(C=10㎍/ml)

[실시예 3]

헤파린 ALFA 88-120 30g을 수산화나트륨(6.75g:0.225N)을 함유하는 수용액 750ml에 가한다.

이 용액을 90℃에서 4시간 동안 자동온도조절시킨 다음 초산으로 중성 조절하고, 흐르는 물로 24시간 동안, 증류수로 6시간 동안 투석시킨다. 이 투석물을 동결건조하여 생성물 26.2g을 얻었다. 이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ(p.p.m.으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다.

*δ:177.7; 104.7; 101.9; 101.4; 80.6; 79.0; 79.8; 74.8; 73.4; 72.8; 71.8; 71.3; 69.0; 62.7; 61.3; 61.0

*S=7.7%

*황산염/카르복실비=1.38

*[α]=+32°(C=HO중 1%)

*[α]=+30°(C=HO중 1%)

*유리 NH=1.30%

*APTT=18.9㎍/ml

*항 Xa=44.8㎍/ml

*출혈시간의 연장=57%(1mg/kg, i.v.)

*출발물질에 대한, 혈전증에 대한 보호=37.5%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=65.2%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=21%(C=10㎍/ml)

[실시예 4]

헤파린 ALFA 87-163 10g을 수산화나트륨(2.25g:0.222N), 초산나트륨(12.81g:0.625N) 및 수소화 붕소나트륨(50mg)을 함유하는 수용액 250ml에 가한다.

이 용액을 90℃에서 4시간 동안 자동온도조절시킨 다음 실온으로 냉각시키고, 초산수용액으로 중설 조절한 다음 흐르는 물로 24시간 동안, 증류수로 6시간 동안 투석시킨다. 이 투석물을 동결건조하여 생성물 7.8g을 얻었다. 이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ(p.p.m.으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다.

*δ=177.7; 104.6; 101.9; 101.4; 98.6; 98.4; 80.3; 79.8; 79.4; 79.0; 73.8; 72.9; 69.1; 62.6; 61.3; 60.6

*S=7.8%

*황산염/카르복실비=1.35

*[α]=+37°(C=HO중 1%)

*[α]=+30°(C=HO중 1%)

*유리 NH=2.01%

*APTT=60.1㎍/ml

*항 Xa=82.0㎍/ml

*출혈시간의 연장=18%(1mg/kg, i.v.)

*출발물질에 대한, 혈전증에 대한 보호=12.5%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=62.6%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=19%(C=10㎍/ml)

[실시예 5]

4g의 수산화나트륨(0.225N), 23g의 초산나트륨(0.625N), 100mg의 수소화 붕소나트륨 및 18g의 헤파린 ALFA 87-163을 함유하는 수용액 450ml을 60℃에서 3.5시간 동안 자동온도조절시킨다. 이 용액의 부피의 반을 취하여 실온으로 냉각시킨 다음 빙초산으로 중성조절하고 2.5부피의 에탄올을 따라 붓는다. 이 침전물을 필터상에 수집하여 에탄올-물 6:1 혼합물로 세척한 다음 건조시킨다. 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에 기술된 헤파린 유도체와 동일한 생성물 8g을 얻었다. 이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ(p.p.m.으로 표현)에서 특성 시그널을 보여준다.

*δ:177.3; 104.3; 101.9; 99.5; 98.4; 97.2; 96.8; 79.8; 79.2; 78.6; 72.2; 71.9; 71.3; 68.9; 62.6; 60.6; 60.3; 54.2; 53.2

상기 생성물은 다음과 같은 화학 물리적 특성을 가진다.

*S=8.25%

*황산염/카르복실비=1.68

*[α]=+68°(C=HO중 1%)

*[α]=+56°(C=HO중 1%)

*유리 NH=0.67%

상기 생성물을 150ml의 증류수에 용해시키고 이 용액을 75℃에서 24시간 동안 자동온도 조절시킨다. 그 다음 실온으로 냉각시킨 후 이 용액을 3g의 초산나트륨을 가하여 중성으로 조절한 다음 2.5부피의 에탄올을 따라 붓는다.

이렇게 생성된 침전물을 에탄올-물 6:1 혼합물로 세척하여 건조시킨다.

생성물 6.8g이 얻어졌다. 이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ(p.p.m.으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다.

*δ=177.2; 104.8; 101.9; 101.3; 80.8; 80.5; 79.5; 78.9; 74.6; 73.8; 73.0; 71.8; 71.6; 69.0; 63.2; 61.4; 60.8

*S=6.30%

*황산염/카르복실비=1.33

*[α]=+26°(C=HO중 1%)

*[α]=+21°(C=HO중 1%)

*유리 NH=1.5%

*APTT=111.9㎍/ml

*항 Xa=55.5㎍/ml

*출혈시간의 연장=16%(1mg/kg, i.v.)

*출발물질에 대한, 혈전증에 대한 보호=12.5%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=68.1%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=32%(C=10㎍/ml)

[실시예 6]

실시예 5에서 생성된 용액의 나머지 반을 빙초산으로 중성으로 조절하고 75℃에서 24시간 동안 자동온도 조절시킨다. 그다음 실온으로 냉각시키고 이 용액에 2.5부피의 에탄올을 서서히 따라 붓는다. 이 침전물을 필터상에 수집하여 에탄올-물 6:1 혼합물로 세척한 다음 건조시킨다. 그 결과 7.2g의 생성물을 얻었다. 이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ(p.p.m.으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다.

*δ=177.3; 104.8; 101.8; 101.3; 80.8; 80.5; 79.5; 74.6; 73.8; 73.0; 71.8; 71.6; 68.9; 63.1; 61.4; 60.8

*S=6.32%

*황산염/카르복실비=1.36

*[α]=+24°(C=HO중 1%)

*[α]=+20°(C=HO중 1%)

*유리 NH=1.49%

*APTT=101.3㎍/ml

*항 Xa=53.9㎍/ml

*출혈시간의 연장=18%(1mg/kg, i.v.)

*출발물질에 대한, 혈전증에 대한 보호=20%(1mg/kg, i.v.)

*옥살산염의 막유출의 억제=78.3%(C=100㎍/ml)

*막의 단백질의 인산화의 억제=26%(C=10㎍/ml)

[실시예 7]

저분자량 헤파린 LMW ALFA 87-198 12g을 수산화나트륨(12g:1.0N), 초산나트륨(15g:0.625N) 및 수소화붕소나트륨(60mg)을 함유하는 수용액 300ml에 가하였다. 이 용액을 60℃에서 4시간 동안 자동온도 조절시킨 후 실온으로 냉각시키고, 중성으로 조절한 다음 흐르는 물로 24시간 동안, 증류수로 6시간 동안 투석시킨다. 그 다음 이 용액을 동결건조시켜 이탈리아공화국 특허출원 제3504 A/88호에서 제조된 헤파린 유도체와 같은 생성물 10g을 얻었다. 이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ(p.p.m.으로 표현)에서 특성 피크를 나타낸다.

*δ=177.3; 104.8; 101.9; 100.3; 80.5; 80.1; 79.4; 72.7; 71.9; 69.0; 62.7; 60.6; 54.3; 53.2

*S=8.25%

*황산염/카르복실비=1.53

*[α]=+63°(C=HO중 1%)

*[α]=+55°(C=HO중 1%)

*유리 NH=0.3%

이 헤파린 유도체 5g을 100ml의 증류수에 용해시키고 이 용액을 75℃에서 24시간 동안 자동온도 조절시킨 다음 실온으로 냉각시키고 이 용액을 중성으로 만든 다음 동결건조하여 3.2g의 생성물로 얻었다.

이 생성물의C-NMR 스펙트럼은 다음과 같은 δ에서 특성피크를 나타낸다.

*δ=177.6; 104.6; 101.8; 101.3; 80.7; 78.9; 74.4; 73.6; 72.7; 71.3; 69.1; 62.7; 61.3; 60.8

*S=6.80%

*황산염/카르복실비=1.52

*[α]=+19°(C=HO중 1%)

*[α]=+16°(C=HO중 1%)

Claims

101.3p.p.m.에서 특성 시그널이 존재하며, 특히 102-92p.p.m. 사이의 영역에서¹³C-NMR 스펙트럼을 나타내며, 비선광도는 15°-40° 사이의 수용액 중에서 546nm이며, 황 함량은 6%-9%이고, 황산염/카르복실비는 1.20-1.70이고, 유리아미노기의 함량은 0.4%-2.1%인 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체.

시판용, 정제되었거나 또는 저분자량의 헤파린을 함유하는 수용액을 0.01N-1N의 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염기수용액으로 75℃와 반응혼합물의 끓는점 사이의 온도에서 0.5-24시간 반응시켜 반응혼합물로부터 헤파린 유도체를 분리해내는 것을 특징으로 하는 청구범위 제1항 기재의 헤파린 유도체의 제조방법.

제2항에 있어서, 상기 반응혼합물은 이온교환 칼럼을 통한 여과 또는 투석(透析)에 의하여 정제되고, 상기 헤파린 유도체는 중성 pH에서 탄소수 1-3의 알코올을 2-4배 용량 가하여 침전시키거나, 또는 동결건조에 의하여 침전시킨 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체의 제조방법.

제2항에 있어서, 염은 나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘, 마그네슘의 초산염 혹은 염화물, 나트륨, 칼륨, 마그네슘의 황산염 붕의 한가지 이상이고, 환원제가 상기 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염기수용액에 가하여지는 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체의 제조방법.

(1) 시판용, 정제되었거나 또는 저분자량의 헤파린을 함유하는 수용액을 0.01N-1N의 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염기수용액으로 40℃-70℃의 온도에서 0.5-24시간 반응시키고, 반응혼합물을 이온교환 칼럼을 통하거나 또는 투석에 의하여 정제시킨 후 중성 pH에서 탄소수 1-3의 알코올을 2-4배 용량 가하여 침전시키거나 또는 동결건조에 의하여 반응물을 분리시키는 단계와, (2) 상기 반응물의 수용액을 75℃와 반응혼합물의 끓는점 사이의 온도에서 0.5-24시간 가열시키고, 반응혼합물의 수용액으로부터 헤파린 유도체를 분리시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 청구범위 제1항 기재의 헤파린 유도체의 제조방법.

제5항에 있어서, 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 염 또는 환원제중 한가지 이상을 상기 제(1)단계에서 상기 염기의 수용액에 가하는 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체의 제조방법.

제6항에 있어서, 상기 반응혼합물을 상기 제(2)단계에서 이온교환 칼럼을 통하거나 또는 투석에 의하여 정제시킨 후, 중성 pH에서 탄소수 1-3의 알코올을 2-4배 용량 가하여 침전시키거나 또는 동결건조에 의하여 헤파린 유도체를 분리해내는 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체의 제조방법.

시판용, 정제되었거나 또는 저분자량의 헤파린을 함유하는 수용액을 0.01N-1N의 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염기수용액으로 40℃-70℃에서 0.5-24시간 반응시키고, 반응혼합물을 중성 pH가 되게 하고, 0.5-24시간 동안 75℃와 반응혼합물의 끓는점 사이의 온도에서 자동온도 조절되게 하여 상기 반응혼합물로부터 헤파린 유도체를 분리해내는 것을 특징으로 하는 청구범위 제1항 기재의 헤파린 유도체의 제조방법.

제8항에 있어서, 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 염과 환원제의 한가지 이상을 상기 염기의 수용액에 가하는 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체의 제조방법.

제8항에 있어서, 상기 반응혼합물은 이온교환 칼럼을 통한 여과 또는 투석에 의하여 정제되고, 상기 헤파린 유도체는 중성 pH에서 탄소수 1-3의 알코올을 2-4배 용량 가하여 침전시키거나 또는 동결건조에 의하여 분리해 내는 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체의 제조방법.

제6항에 있어서, 염기는 나트륨, 칼륨 또는 바륨수산화물이고 염은 나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘, 마그네슘의 초산염 혹은 염화물 또는 나트륨, 칼륨, 마그네슘의 황산염이고, 환원제는 나트륨 보로하이드라이드(borohydride)이고, 상기 헤파린 유도체는 상기 반응혼합물에 2.5배 용량의 에틸알코올을 가하여 정제되는 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체의 제조방법.

제9항에 있어서, 염기는 나트륨, 칼륨, 또는 바륨수산화물이고, 염은 나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘, 마그네슘의 초산염 혹은 염화물 또는 나트륨, 칼륨, 마그네슘의 황산염이고, 환원제는 나트륨 보로하이드라이드(borohydride)이고, 상기 헤파린 유도체는 상기 반응혼합물에 2.5배 용량의 에틸알코올을 가하여 정제되는 것을 특징으로 하는 헤파린 유도체의 제조방법.

상기 청구범위 제1항에 따른 헤파린 유도체를 활성성분으로 함유하는 신장병 치료용 의약품.