KR0135614B1 - 약독화 수두 생바이러스 백신 및 그의 제조방법 - Google Patents
약독화 수두 생바이러스 백신 및 그의 제조방법Info
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Abstract
본 발명은 사람 태아의 폐조직으로부터 초대배양하여 확립한 세포주(LuMA)를 이용하여, 수두 환자의 수포로부터 분리하여 여러 세포주에 계대배양함으로써 약독화한 수두 바이러스(MAV/06)주를 증식시킨 다음, 초음파처리를 통하여 수두 바이러스를 세로포부터 유리시킨 후 동결건조하여 제조한 면역원성이 우수한 약독화 수두 생바이러스 백신에 관한 것이다.
Description
제1도는 수두 바이러스 DNA를 제한효소 PstI으로 절단한 결과를 나타내는 자가방사능사진(autoradiograph).
제2도는 수두 바이러스 DNA를 제한효소 BglI으로 절단한 결과를 나타내는 자가방사능사진.
제3도는 백신 접종 전 수두 항체가 음성인 어린이에 있어서, 백신 접종 후 30일째 체혈한 혈청의 평균 항체가를 나타내는 그래프.
제4도는 백신 피접종자 전체의 백신 접종 전 및 접종 후 30일째의 평균 항체가를 나타내는 그래프.
본 발명은 신규한 약독화 수두 생바이러스 백신에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 수두 환자의 수포로부터 수두 바이러스를 분리하고 세포에 계대배양하여 약독화한 다음, 사람 정상 이배체 세포주를 사용하여 수두 예방에 탁월한 효과를 발휘하도록 제조한 생바이러스 백신에 관한 것이다.
수두(varicella)는 주로 소아에게 발생하는 바이러스에 의한 전염병으로 발진과 수포를 주 증상으로 한다. 어린이에게 수두가 발생하면 대개 그 증상이 미약하나 성인의 경우에는 심하며, 특히 면역기능이 결핍된 환자나 면역 억제제를 장기적으로 투여받고 있는 환자에게 수두가 발생하면 매우 위험하고 사망에까지 이를 수 있는 것으로 알려져 있다.
수두의 원인이 되는 바이러스는 허파토비리대(Herpetoviridae)과에 속하는데, 수두와 대상포진의 원인이 되는 바이러스는 동일한 것으로 알려지고 있다. 수두 바이러스(varicella-zoster virus)는 191년 처음으로 광학 현미경을 사용하여 환자의 수포액으로부터 관찰되었는데, 이 바이러스는 직경이 약 120 내지 180nm로 매우 크며, 천연두에서 관찰되는 바이러스 입자보다 조금 작은 것으로 확인되었다. 이 바이러스 입자는 전자현미경을 통해 다각형 또는 원형으로 관찰되는데(참조 : Ruska, Scientia, 37 : 17(1943), Ruska, Wochenschr, 22 : 703-704(1943)), 허피스(herpes) 그룹의 바이러스 입자들과 그 형태가 유사한 것으로 관찰되고 있다. 정 20면체의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)가 중앙에 위치하고, 그 외부는 외피 단백질(tegument)로 둘러싸여 있으며, 최외각에는 2중 구조의 막으로 되어 있다. 실험실적조건(in vitro)에서 증식하는 수두 바이러스는 강한 세포 친화성을 가지고 있어 세포 유리 바이러스(cell-free virus)를 만들기 어렵기 때문에, 허피스(herpes) 그룹의 다른 바이러스보다 잘 연구되어 있지 않다. 따라서, 바이러스 입자의 전체적인 화학적 조성도 잘 알려져 있지 않고, 단지 특징적인 DNA, RNA 및 단백질이 어느 정도 밝혀져 있을 뿐이다.
수두 바이러스는 사람 이외에 감수성이 있다고 알려진 동물이 아직 없으므로, 실험동물을 이용한 수두 바이러스의 생산은 불가능하다. 한편, 웰러(Weller)와 스토다드(Stoddard)가 처음으로 조직배양을 통하여 수두 바이러스를 분리한 후, 많은 종류의 사람과 원숭이 유래의 세포주에서 이 바이러스가 증식됨이 확인되었다(참조 : Weller et al., Proc, Soc. Exp. Biol. Med., 83 : 340-346(1953)). 그러나 배양 세포에서 증식한 수두 바이러스는 강하게 세포와 결합되어 있으므로, 세포 밖으로 유리되어 나오지 않는다. 결국, 이러한 수두 바이러스의 세포 친화성 때문에, 이 바이러스의 물리적 특성이나 생화학적 성질을 연구하는데 어려움이 많았으며, 수두 바이러스의 대량 배양이나 백신의 개발에도 상당한 장애가 되어 왔다.
본 발명에서는 이와 같은 수두 바이러스의 배양에 대한 문제점을 해결하고자 수두 환자의 수포로부터 수두 바이러스를 분리하고, 사람의 폐조직으로부터 확립한 세포주(LuMA)에 초대 배양하였다. 그 결과, 본 발명의 수두 바이러스주는 전기 세포주에 효과적으로 배양되었으며, 그로부터 제조된 생바이러스 백신은 우수한 수두 예방 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다.
결국, 본 발명의 첫째 목적은 수두 생바이러스 백신제조에 유용한 신규한 수두 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기 수두 바이러스를 이용하여, 수두의 예방에 효과적인 생바이러스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 수두 바이러를 효과적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 발명의 발명자들은 수두 환자의 수포로부터 7개의 수두 바이러스를 분리한 다음, 수두 바이러스 특유의 세포변성효과(cytopathic effect : CPE)의 확인, 전자현미경을 통한 사진촬영, 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 통한 수두 바이러스 단백질의 확인, 형광항체반응을 통한 감염 세포에서의 바이러스 확인 및 혈청중화반응 등을 통하여, 이 바이러스가 수두 바이러스임을 최종 확인하였다. 또한, RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석을 퉁하여 분리한 수두 바이러스가 비켄(Biken) 백신주인 오카(Oka)주, 야생주(wild strain)인 웹스터(Webster)주와 엘렌(Ellen)주 등과 다른 신규한 수두 바이러스라는 것을 확인하였다.
분리된 수두 바이러스를 약독화하기 위하여, 배양온도는 34℃에서 LuMA 세포에 11대, GEL(guinea pig embryonic lung) 세포에 13대, LuMA 세포에 8대, MRC-5세포에 4대, 그리고 다시 LuMA 세포에 19대를 배양하였다. 이렇게 하여 총 55대를 계대배양한 다음, 가장 약독화가 신경독력 실험과 각종 실험동물을 이용한 독성실험 등 전임삼실험을 거쳐 안전성을 확인하였다. 본 발명에서 분리된 수두 바이러스 MVA/06주는 사단법인 한국종균협회(KFCC)에 1994년 10월 13일 기탁번호 KFCC-10844로 기탁되었다.
아울러, 세포성 면역은 수두 바이러스의 초기감염(primary infection)으로부터의 회복과 방어적 면역반응(protection)에 체액성 면역보다 더 중요한 역할을 담당하며, 특히 항체 의존성 세포매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity : ADCC)은 세포성 면역반응의 한 부분으로서, 특별히 바이러스의 감염초기에 주요한 방어적 효과를 방휘하는 것으로 보고되거 있다(참조 : Kamlya et al., Infect. Immum., 38 : 554-557(1982)). 따라서, 백신접종 후 ADCC를 측정하는 것은 중화 항체가의 측정과 더불어 백신의 효과를 평가하는 중요한 지표로 여거지며, 실제로 AIDS 백신의 효능을 측정하는데 이 방법이 사용되어지고 있다(참조 : Ljunggren et al., J. Immun. Methods, 104 : 7-14(1987)). 이러한 의미에서, 본 발명의 백신의 효과를 측정하는 지표로서, 형광항체, 중화항체의 측정과 더불어 ADCC 활성을 측정하였는 바, 이때 ADCC 역가는 형광항체에 비하여 8배에서 31배 정도 더 높은 것으로 나타났다.
결국, 본 발명의 수두 바이러스(MAV/06)주는 병원성을 나타내지 않을 정도로 충분히 약독화되었을 뿐만 아니라, 면역원성에서도 우수하여 중화항체와 더불어 형광항체 및 중요한 방어적 면역반응의 하나인 ADCC를 유발하는 항체도 고역가로 생성케함이 확인되어 수두의 예방에 사용될 수 있음이 입증되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 수두 바이러스의 분리 및 동정
수두 환자의 수포로부터 7개의 수두 바이러스로 예상되는 바이러스를 분리한 다음, MVA/01, MVA/02…및 MVA/07주로 명명하고, 수두 바이러스 특유의 세포변성효과(CPE)의 확인, 전자현미경을 통한 사진촬영, 웨턴 블롯팅에 의한 수두 바이러스 단백질의 확인, 형광항체 반응을 통한 감염세포에서의 바이러스 확인 및 혈청 중화반응 등을 통하여, 이 바이러스가 수두 바이러스임을 최종 확인하였다. 또한, RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석을 통하여, 분리한 수두 바이러스가 비켄(Biken) 백신주인 오카(Oka주, 야생주(wild strain)인 웹스터(Webster)주와 엘렌(Ellen)주 등과 다르다는 것을 확인하였다.
실시예 1-1 : 수두 바이러스의 분리
바이러스 분리는 임상소견상 수두로 판단되는 환자의 수포로부터 체취한 수액을 사용하였다. 바이러스 분리에 사용된 배지는 EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium)배지에 FBS(Hyclone, USA), 겐타마이신(gentamycine, 유한양행) 및 피노헤마글루티닌(phytohemagglutinin, PHA, DIFCO)을 각각 2%, 200㎍/ml, 20㎍/ml이 되도록 첨가하여 제조하였다. 채취한 재료를 냉장상태로 실험실까지 신속히 운반한 다음 일반 원심분리기(IEC contra-8, USA)로 3,000rpm에서 30분간 원심분리하고, 침전물과 상충액을 각각 HEF(human embronic fibroblast) 세포에 30분 동안 흡착하였다. 흡착 후 유지용 배지(FBS 2% 함유)로 교환하고 CO2배양기에서 37℃로 배양하였다. 분리를 시도한 7개 재료의 원심 상층액과 침전물 모두에서 바이러스를 분리할 수 있었다.
실시예 1-2 : 세포변성효과의 관찰
HEF 세포를 배양용기에서 약 3일간 배양하여 단층을 형성시킨 다음, 동량의 수두 바이러스(약 3×102TCID50)를 두 개의 배양용기에 각각 접종하고 4 내지 5일간 배양하면서 바이러스에 의한 CPE를 관찰하였다. 그 결과, 초기 CPE는 주위의 세포와 비교하여 약간 둥글게 되며, 조금 부풀어 오르고, 주위의 세포와 분리되기 시작하면서 현미경 시야에서 약간의 윤기를 발하였다. 이러한 현상은 시간이 경과할수록 주변 부위로 확대되었으며, CPE 중앙 부위의 세포막이 융합되어 합포체를 형성하였다. 말기에 가서는 이러한 합포체들이 터져서 배양용기 표면에서 떨어지는 현상이 나타났다.
실시예 1-3 : 전기영동 및 면역블롯 분석
수두 바이러스 불니주 7개를 HEF 세포에서 증식시킨 다음, 바이러스 감염세포를 초음파기(LAB-LINE, USA)로 20kHz에서 15초 동안 초음파 처리하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 상층액을 항원으로 사용하였다. 대조 바이러스로서 미합중국 종균협회(ATCC, Md, USA)로부터 구입한 웹스터주, 오카주 및 엘렌주를 같은 방법으로 배양, 정제한 후 사용하였다.
제조된 항원을 SDS-PAGE로 전기영동한 결과, 바이러스 분리주 7개는 웹스터주, 오카주 및 엘렌주와 비슷하였다. 이어, 나이트로셀룰로스 막(Bio-Rad)에 블롯팅시켜 면역학적 분석을 실시하였다. 블롯팅된 막을 5% 스킴 밀크용액(PBS 완충용액, pH 7.4)으로 제어(blocking)하였고, 가토 면역혈청을 동일 완충용액에 : 100으로 희석하여 37℃에서 90분간 반응시켰다. 아울러, 호스 래디쉬 퍼록시다제(horse radish peroxidase)가 결합된 고우트 안티-래빗 IgG 혈청(goat anti-rabbit IgG serum, Sigma Chemical Co. Ltd., USA)를 1 : 100으로 희석하여 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 면역반응이 끝난 다음, 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)이 0.06%, H2O2가 0.03% 함유된 ).01M 트리스 완충용액(pH 7.5)으로 약 5분간 발색시켰다. 그 결과, 수두 바이러스 분리주의 면역블롯 양상은 오카주, 웹스터주와는 거의 동일하였고 엘렌주와는 약간 상이한 것으로 나타났다.
실시예 1-4 : 전자현미경에 의한 수두 바이러스의 확인
수두 바이러스 분리주를 HEF 세포에 접종한 다음, CPE가 80 내지 90% 나타났을 때 배양액을 채취하였다. 이 배양액을 3,000g에서 30분간 원심분리하여 세포편을 가라앉히고 상층액을 채취하여 50,000g에서 1시간 동안 원심분리한 다음, 침전물을 전자현미경 관찰을 위한 재료로 사용하였다. 침전물을 적당한 농도로 인산완층 식염수(PBS, pH 7.2)에 부유시키고, 이것을 깨끗한 유리 슬라이드에 2방울 점적하였다. 그 위에 2% 인텅스텐산(phosphotungstic acid, pH 7.2)을 1방울 점적하여 잘 혼합한 후, 그리드를 올려놓고 7분간 흡착시켰다. 그런 다음, 흡착된 그리드를 공기중에서 건조시키고 전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 대부분의 바이러스가 이막이 없는 뉴클레오캡시드 상태로 관찰되고, 외막이 있는 완전한 바이러스 입자와 DNA가 없는 빈 캡시드만 있는 것도 가끔씩 관찰되었다.
실시예 1-5 : 혈청중화 시험
수두 백신을 기니픽에 면역하여 얻은 항혈청으로 오카주 등과 분리한 바이러스에 대하여 중화반응을 실시하였다. 전기영동 실험에서와 같은 방법으로 항원을 준비하고, 배지에 희석하여 1ml당 100PFU로 수두 바이러스 감염가를 조정하였다. 항혈청은 2배수로 단계희석하여 준비하고, 희석된 혈청 1ml과 항원 1ml을 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 각 재료들을 24공-플레이트에 배양된 HEF 세포에 접종하고, 1시간 정도 경과한 다음 배지를 갈아주고 37℃에서 배양하면서 플라크를 관찰하였다. 혈청중화값은 플라크수를 50% 중화할 수 있는 혈청의 최대 희석배수로 결정하였다. 그 결과, 수두 백신을 면역하여 얻은 항혈청과 바이러스 분리주와의 중화반응은 대조주와의 중화반응과 비교할 때 중화력이 약간 떨어지며, 비동화되지 않은 혈청이 비동화된 혈청에 비해 약 4배 정도 중화력이 강한 것으로 나타났다(참조 : 표 1).
[표1] 오카주 및 분리주에 대한 수두 백신 면역혈청의 중화도 비교
실시예 1-6 : 형광항체 반응
HEF 세포를 유리 슬라이드에 배양하고 오카주와 바이러스 분리주를 각각 0.05MOI씩 접종하였다. 이 거슬 37℃ 3일간 배양하고 다음과 같이 형광항체 반응을 실시하였다. 배양된 슬라이드를 트윈 20(tween20)이 0.1%로 들어 있는 PBS(0.01M, pH 7.4) 용액으로 10분씩 3회 세척하고, 수두 바이러스 항혈청(기니픽 혈청)을 PBS에 50배 희석하여 충분량 저적한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이것을 다시 PBS로 5회 세척하고 PBS에 20배 희석한 안티-기니필 IgG-FITC(anti-guinea pig IgGFITC, Siga Chemical Co. Ltd., USA)를 충분량 점적하여 다시 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이것을 PBS로 5회 세척하여 공기중에서 건조시키고 현미경으로 관찰하였다. 음성 대조군으로는 바이러스가 감염되지 않은 정상 HEF 세포를 사용하였다. 그 결과, 음성 대조군인 HEF 세포에서는 특이 형광이 없었고, 대조주와 분리주를 감염시킨 세포는 감염되지 않은 쥐의 세포와 대조를 이루면서 강한 형광을 나타내었다.
실시예 1-7 : 수두 바이러스의 RFLP 분석
바이러스 증식시킬 세포를 성장 배양액으로 5 내지 6일간 배양하여 완전히 단층을 형성시킨 후, EMEM 배지에 2% FBS와 50㎍/ml의 겐타마이신, 15mM HEPES를 첨가한 유지 배양액으로 바꾸어주고, 약 24시간 배양 후 바이러스 증식에 사용하였다. 바이러스에 감염된 세포를 관찰하면서 CPE가 약 20 내지 30% 발생하였을 때, 배양액을 제거하고 0.25% 트립신-0.02% EDTA 용액을 처리하여 세포를 회수하여 감염된 세포와 새로운 세포와의 비율을 1 대 5로 하여 다시 한번 새로운 세포에 감염시켰다. 재차 감염된 세포가 80 내지 90%의 CPE를 보일 때, 배양액을 제거하고 세포에 0.25% 트립신-0.02% EDTA 용액을 처리하여 회수한 후 소분하였다. 6-공 플레이트에 공당 5×105세포를 성장 배포액에 부유시켜 넣고, 37℃에서 6일간 배양한 후 배당액을 유지 배양액으로 바꾸어 주었다. 그런 다음, 다시 24시간 배양하고 새로 준비한 세포와의 비율을 1 대 5로 하여 감여시킨 후, 37℃에서 1시간 동안 흡착시켰다. 감염 후 공에 남에 있는 배양액을 완전히 제거하고 공당 50μCi의 오르토프스페이트(orthophosphte, Amersham, U.K.)가 함유된 인산이 없는 배양액을 5ml씩 넣어주고 CPE가 90% 이상 나타날 때가지 배양하였다.
방사능 표지가 된 DNA를 추출하여, PstI 및 BglI 제한효소로 절단하고 젤 전기영동을 실시하고, 대표적인 밴드를 각각 A, D, F, J 및 H 등으로 명명하였다(참조 : 제1도 및 제2도). 제1도 및 제2도에서, 제1레인 내지 제7레인은 MVA/01 내지 MVA/07 주의 DNA, 제E레인은 엘렌주의 DNA, 제W레인은 웹스터주의 DNA, 제O레인은 오카주의 DNA를 PstI 및 BglI으로 각각 적단하여 전기영동한 결과를 나타낸다. 하기 표 2는 제1도 및 제2도의 결과를 전기 각 밴드의 존재유무를 중심으로 요약하여 나타낸 것이다. 표 2에서 보듯이, 비교주로 사용한 세 바이러스는 모두 다른 양상을 나타내었으며, 분리된 수두 바이러스 7종류는 분리주, 1, 4, 5, 6번이 한 그룹을 형성하고 있고(패턴Ⅰ), 분리주 2, 3번이 다른 한그룹을 형성하고 있으며(패턴Ⅱ), 분리주 7번은 비교주로 사용한 바이러스나 분리주 모두와 서로 다른 양상을 나타냈다(패턴Ⅲ). 특히, 분리주 2, 3번은 현재 백신으로 생산되어 시판되고 있는 오카 바이러스와 같은 양상임을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 분리된 패턴Ⅰ과 Ⅲ의 바이러스는 현재 일본에서 백신으로 생산하여 시판하고 있는 오카 바이러스주와는 다르다는 결론을 얻었다.
[표2] 본 발명의 7가지 분리주에 대한 RELP 분석
실시예 2 : 수두 바이러스 제조를 위한 최적 숙주세포의 선별
수두 바이러스 백신의 제조에 적한 숙주세포를 세계보건기구(WHO)의 Eequirements for varicella vaccine(WHO Technica Report Series, No. 725, 1985)에 따라 조사한 결과, LuMA 세포(KCTC 0035BP)가 마이코플라스마(mycoplasma)를 비롯한 외래성 미생물에 감염되지 않았음을 확인하였으며, 누드 마우스(nude mouse)를 이용한 실험에서 종양원성이 없음도 확인하였다. 또한 염색체 검사에서도 300개의 세포를 대상으로 실험하였을 때. 84.3%가 정상적인 염색체수(2n=46)를 갖고 있음도 확인하였다. 이러한 염색체 검사결과는 백신제조에 적합하다고 인정된 MRC-5나 WI-38 세포의 76%와 70% 보다 훨씬 정상에 가까운 것이며, 세포의 성장속조와 수두 바이러스의 생산량에 있어서도 이들 세포보다 우수한 것으로 판단되었다. 바이러스의 생산량에 있어서도 이들 세포보다 우수한 것으로 판단되었다. 바이러스의 생산량에 있어서는 0.05MOI(multiplicity of infection)을 접종한 후, 경시별로 조사한 성적을 다음 표3에 나타내었다.
[표3] 숙주 세포에 따른 수두 바이러스의 생산량 비교
실시예 3 : 수두 바이러스의 약독화
분리한 각 수두 바이러스를 약독화하기 위하여, 후술하는 실시예 5의 결과에 따라 배양온도 34℃에서 LuMa 세포(KCTC 0035BP)에 11대, GEL(guinea pig embryonic lung) 세포에 13대, LuMA 세포에 8대 MRC-5세포에 4대, 그리고 다시 LuMA 세포에 19대를 배양하였다. 이렇게 하여 총 55대를 계대배양한 다음, 가장 약독화가 많이 된 것으로 여겨지는 수두 바이러스 MVA-06주를 원숭이를 이용한 신경독력 실험과 각종 실험동물을 이용한 독성실험 등 전임상실험을 거쳐 안전성을 확인하였다. 약독화된 수두 바이러스 MAV/06주는 사단법인 한국종균협회(KFCC)에 1994년 10월 13일 기탁번호 KFCC-10844로 기탁되었다.
실시예 4 : 수두 생바이러스 백신의 제조
실시예 3에서 수독한 약독화된 MVA/06주는 LuMA 세포에 9계대 더 계대배양한 다음, 생바이러스 백신을 다음과 같이 제조하였다. 약독화된 MVA/06주를 LuMA 세포에 적당한 비율로 계대배양하여 약 80% 이상의 세포가 수두 바이러스 특유의 CPE가 발현됨을 확인한 후, 세포배양액을 제거하고 0.05% EDTA 용액을 첨가하여 세포를 배양용기 표면으로부터 박리시켰다. 이때, 세포배양을 배지로는 FBS가 10% 첨가된 EMEMF 배지를 각각 사용하였으며, 세포 배양온도는 37℃, 바이러스 배양온도는 35℃를 유지하도록 하였다. 박리된 가염세포는 원심분리(3,500rpm, 10분)를 통하여 가라앉히고 동결건조용 안정제(0.01MPBS 완충용액, 소디움 글루타메이트 0.1% 인혈청알부민(human serum albumin) 0.5%, D-솔비톨 5%, 젤라틴 0.3%, pH 7.0에 부유한 다음, 초음파처리(power : 4, duty cycle : 50%, 5분)에 의하여 세포내부에 있던 수두 바이러스를 유리시켰다. 이 부유액을 원심분리한 다음, 상층액만을 취하여 동결건조하여 생바이러스 백신을 제조하였다. 제조된 생바이러스 백신은 각종 무균시험을 통하여 외래성 미생물의 혼입이 없음을 확인한 후, 다음 실험에 도입되었다.
실시예 5 : 수두 바이러스의 임상실험(면역원성)
면역원성 실험을 위하여, 실시예 4에서 제조한 동결건조된 1,000플라크 생성단위(plaque forming unit : PFU)의 수두 생바이러스에 증류수를 가한 0.5ml 용액을 수두 항체 음성인 어린이 5명과 수두 항체 양성인 성인 17명에게 피하로 1회 주사하였다. 접종 전 항체가 음성인 어린이 5명에서는 백신접종후 중화 항체가가 43이었고, 형광항체가는 147로서 접종 전 항체 양성인 경우에 비하여 다소 그 역가가 떨어지기는 하나 비슷함을 알 수 있었다(참조 : 제3도). 또한, 백신 접종 전 항체가 양성인 경우에는 접종 전 혈청의 평균 항체가는 중화항체가(PRNT50)가 14이었고, 형광항체가(FAMA)가 33이었다. 백신접종 후 30일째 체혈한 혈청의 평균항체가는 중화항체가가 78이었고, 형광항체가가 173으로 백신 접종전에 비하여 5 내지 6배의 항체가 상승을 나타내었다(참조 : 제4도).
한편, 아베터(Arbeter) 등이 18명의 어린이에게 각각 540PFU의 오카(Oka) 바이러스를 접종했을 때 평균 형광항체가 28일 얻을 수 있었다고 하였고(참조 : Arberter, et al., J. Pediatrics, 100 : 886-893(1982)), 와이벨(Weibel) 등은 Merck 백신(Oka주)를 468명의 어린이에게 약 8,000PFU씩 접종했을 때 8주 후에 평균 12의 항체가를 얻을 수 있다고 하였는데(참조 : Weibel, et al., New Engl. J. Med., 310 : 1409-1415(1984)). 이러한 결과와 비교해 볼 때, 본 발명에서 제조한 백신의 성적은 매우 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 약독화 생바이러스 백신의 경우 항체를 형성하는 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역반응도 잘 유도하는 것으로 알려져 있는데(참조 : Haynes, Science, 260 : 1279-1285(1993)), 본 발명의 백신에서도 이를 확인할 수 있었다.
세포성 면역은 수두 바이러스의 초기감염으로부터의 회복과 방어적 면역반응에 체액성 면역보다 더 중요한 역할을 담당하며, 특히 ADCC는 세포성 면역반응의 한 부분으로서 특별히 바이러스의 감염초기에 주요한 방어적 효과를 발휘하므로, 형광항체, 중화항체의 측정과 더불어 백신 접종 후 ADC를 측정하여 백신의 효과를 평가하였다. 그 결과, ADCC 활성을 측정하였고, 이때 ADCC 역가는 형광항체에 비하여 8배에서 31배 정도 더 높은 것으로 나타났다(참조 : 표 4).
[표4] 백신 접종 전 항체 음성인 어린이의 경우 면역 후 항체가 비교
실시예 6 : 수두 생바이러스 백신의 임상실험(부작용)
전기 실시예 8에서와 마찬가지로, 수두 항체 음성인 어린이 5명과 수두 항체 양성인 성인 17명에게 1,000플라크 생성단위의 생 수두 바이러스를 함유한 0.5ml 용액을 피하로 1회 주사한 다음, 30일까지 매일 부작용의 발생여부를 조사하였다. 그런 다음, 접종 후 30일째 채혈하여 수두 바이러스에 대한 항체가를 조사하였다. 그 결과, 피접종자 모두가 수두 특유의 임상증상인 수포 및 발진 등을 나타내지 않았으며, 접종부위의 국소적인 부종, 근육통, 발적 및 열감 등이 11명에게 나타났지만, 이것들은 아주 미약한 증상으로서 발생 후 약 2 내지 4일에 소실되는 것을 확인하였다(참조 : 표 5). 수두의 증상은 수두 바이러스 감염 후 약 14일이 지나면 나타나는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 실험에서 백신 접종후 30일까지 수두 특유의 증상이 발현되지 않은 것은 본 발명의 MVA/06주가 백신으로 사용하기에 안전할 정도로 약독화되었다고 볼 수 있다.
[표1] 수두 생바이러스 백신(MVA/06)주 접종에 따른 부작용
본 발명의 수두 생바이러스 백신은 현탁에 형태로 또는 동결건조 형태로 제조될 수 있다. 동결건조 백신에는 1종 이상의 안정제를 첨가하는 것이 바람직하다. 적절한 안정제로는 예를 들면, 탄수화물(솔비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트로스, 글루코스 등), 단백질(알부민, 카제인 등) 또는 그들의 분해생성물, 단백질 함유제(소혈청, 탈지유 등) 및 완충용액(알칼리금속 인산염 등)이 있다. 또한, 임의로 보조제 활성을 갖는 일종 이상의 화합물이 첨가될 수도 있다. 적절한 보조제로는 예를 들면, 수산화 알루미늄, 인산염, 산화물 또는 사포닌 등이 있다.
상기의 조성물은 근육 또는 피하주사로 투여될 수 있다. 이때의 수두 바이러스 함량은 1,000 이상의 플라크 생선단위를 나타내는 생 수두 바이러스를 1회 투여하는 것이 바람직하다.
이상에서 상세히 설명되고 입증되었고, 본 발명의 수두 바이러스(MVA/06)주는 병원성을 나타내지 않을 정도로 충분히 약독화되었을 뿐만 아니라, 면역원성에서도 우수하여 중화항체와 더불어 형광항체 및 중요한 방어적 면역반응의 하나인 ADCC를 유발하는 항체도 고역가로 생성케함이 확인되어 수두의 예방에 사용될 수 있음이 입증되었다.
Claims (3)
- 수두 바이러스(MVA/06)주(KFCC-1084)를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약독화 수두 바이러스 백신.
- 제1항에 있어서, 수두 바이러스(MVA/06)주는 1,000플라크 생선단위(PFU) 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 약독화 수두 바이러스 백신.
- 수두 바이러스(MVA/06)주(KFCC-1084)를 사람 정상 이배체 세포주 LuMA 세포(KCTC 0035BP)에 배양하는 공정을 포함하는 제1항 기재의 약독화 수두 바이러스 백신의 제조방법.
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| KR100434024B1 (ko) * | 1996-01-24 | 2004-07-21 | 주식회사 엘지생명과학 | 수두바이러스의대량생산방법 |
| WO2012115474A3 (ko) * | 2011-02-24 | 2012-11-22 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 신규한 수두 대상포진 바이러스주 및 이를 이용한 수두 및 대상포진 바이러스 백신 |
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1994
- 1994-11-23 KR KR1019940030949A patent/KR0135614B1/ko not_active IP Right Cessation
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| CN103392001A (zh) * | 2011-02-24 | 2013-11-13 | 牧岩生命工学研究所 | 新型水痘-带状疱疹病毒株以及使用所述毒株的水痘和带状疱疹病毒疫苗 |
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