CN103392001A - 新型水痘-带状疱疹病毒株以及使用所述毒株的水痘和带状疱疹病毒疫苗 - Google Patents
新型水痘-带状疱疹病毒株以及使用所述毒株的水痘和带状疱疹病毒疫苗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及新型水痘-带状疱疹病毒株以及使用所述毒株的水痘和带状疱疹病毒疫苗。更具体地，本发明涉及从韩国患者分离的VZVMAV06的基因组DNA、其开放阅读框(ORF)、VZVMAV06的基因组DNA及其ORF编码的蛋白质，以及包含所述蛋白质作为活性成分的疫苗组合物。
Description
技术领域
本发明涉及新型水痘-带状疱疹病毒(VZV)株和使用所述毒株的水痘和带状疱疹病毒疫苗。更具体地，本发明涉及分离自韩国患者并被减毒的VZVMAV/06毒株的基因组DNA，其开放阅读框(以下称为ORF)，VZV MAV/06毒株的基因组DNA及其ORF编码的蛋白质，以及包含所述蛋白质作为活性成分的疫苗组合物。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(以下称为VZV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，是具有两种不同症状(水痘和带状疱疹)的疾病的起因。
作为从临床标本中分离的VZV毒株，Dumas毒株的完整核苷酸序列已被初步报道(Davison，A.J.和Scott，J.E.，1986)。另外，截止到目前，已完成的23种VZV毒株(包括亲本Oka毒株和源自亲本Oka毒株的三个疫苗病毒株(vOka毒株、Varivax毒株和Varilrix毒株))的完整核苷酸序列已被报告至NCBI GenBank数据库中。
目前，可以通过比较分析疫苗病毒株和临床病毒株的完整核苷酸序列来进行对于减毒疫苗毒株特定区域的研究(Argaw等人，2000;Gomi等人，2002;Tillieux等人，2008;Yamanish等人，2008)。
而且，自1994年，绿十字公司(Green Cross Corp.)主要生产“Suduvax”作为针对水痘的减毒疫苗。用于生产Suduvax的MAV/06病毒株是这样获得的:于1989年从感染水痘的33个月大的韩国患者的水泡中分离水痘-带状疱疹病毒，在人胚肺细胞中原代培养分离的VZV，通过测试水痘-带状疱疹病毒的多种特性确定培养的VZV是一种新型的VZV(Park等，Propagation of Varicella-Zoster Virus isolated in Korea，J.Kor.Soc.Virol.21，1-9，1991)。
自1994年，Suduvax已经在韩国市场销售，自1998年在全球市场使用。但是，尽管Suduvax的有效性和安全性已经在市场上被证明，仍未报道能够描述疫苗减毒和有效性机制的分子生物学特性。
分子生物学特征对于提高质量控制和质量保证的精度以确保减毒疫苗的效力、安全性和均一性是十分重要的，并且应尽快被研究。
公开内容
技术问题
为了解决这个问题，本发明人发现了分离自韩国患者的新型VZVMAV/06毒株的基因组序列，对所分离的VZVMAV/06毒株进行了分子生物学分析，包括ORF分析和系统发生分析，从而完成了本发明。
本发明的一个目的是提供VZV MAV/06毒株的基因组DNA。
本发明的另一个目的是提供VZV MAV/06毒株基因组DNA的开放阅读框(ORF)。
本发明的再一个目的是提供VZV MAV/06毒株基因组DNA的ORF编码的蛋白质。
本发明的再一个目的是提供包含VZV MAV/06毒株基因组DNA或其ORF的重组表达载体。
本发明的再一个目的是提供包含VZVMAV/06毒株基因组DNA或其ORF的转化体。
本发明的再一个目的是提供制备VZV MAV/06毒株基因组DNA或其ORF编码的蛋白质的方法。
本发明的再一个目的是提供包含VAV MAV/06毒株蛋白质作为活性成分的疫苗组合物，
技术方案
为了达到上述目的，本发明的提供了VAV MAV/06毒株的基因组DNA及其ORF编码。
在下文中，将详细地描述本发明。
本文所用术语“开放阅读框”或“ORF”是DNA碱基序列，指翻译成氨基酸序列的DNA碱基序列，指从翻译起始密码子(例如，ATG)到终止密码子(例如TGA，TAA和TAG)的碱基序列。
在一个一般性方面中，本发明提供了具有SEQ ID NO.1之碱基序列的水痘-带状疱疹病毒(VZV)MAV/06毒株的基因组DNA。
在另一个一般性方面中，本发明提供了VZV MAV/06毒株基因组DNA的ORF。更详细地，所述ORF可选自具有SEQ ID NO.2之碱基序列的ORF0，具有SEQ ID NO.3之碱基序列的ORF17，具有SEQ ID NO.4之碱基序列的ORF29，具有SEQ ID NO.5之碱基序列的ORF56，和具有SEQ ID NO.6之碱基序列的ORF60。
在另一个一般性方面中，本发明提供了VZVMAV/06毒株基因组DNA或其ORF所编码的蛋白质。更详细地，本发明提供了由具有SEQ IDNO.1之碱基序列的VZV MAV/06毒株基因组DNA或选自以下的ORF所编码的蛋白质:具有SEQ ID NO.2之碱基序列的ORF0，具有SEQ IDNO.3之碱基序列的ORF17，具有SEQ ID NO.4之碱基序列的ORF29，具有SEQ ID NO.5之碱基序列的ORF56，和具有SEQ ID.6之碱基序列的ORF60。
在另一个一般性方面中，本发明提供了包含VZV MAV/06毒株基因组DNA或其ORF的重组表达载体。更详细地，本发明提供了包含具有SEQ ID NO.1之碱基序列的VZV MAV/06毒株基因组DNA或选自以下的ORF的重组表达载体:具有SEQ ID NO.2之碱基序列的ORF0，具有SEQID NO.3之碱基序列的ORF17，具有SEQ ID NO.4之碱基序列的ORF29，具有SEQ ID NO.5之碱基序列的ORF56，和具有SEQ ID NO.6之碱基序列的ORF60。
本文所用术语“重组载体”是能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的表达载体，指包含可操作性连接有待表达之基因插入物的基本调控元件的基因构建体。本文所用术语“可操作性连接”指核酸表达调控序列和编码靶蛋白的核酸序列彼此功能性连接以进行一般性功能。与重组载体的可操作性连接可以使用本发明所属技术领域公知的基因重组技术进行，区域特异性DNA切割和连接可以使用本发明所属技术领域一般已知的酶容易地进行。
能够在本发明中使用的合适的表达载体可包含膜靶向或分泌信号序列以及表达调控元件，例如启动子，起始密码子，终止密码子，聚腺苷酸化信号和增强子。一般起始密码子和终止密码子可被认为是编码免疫原性靶蛋白的核苷酸序列一部分，需要在已施用基因构建体的个体中具有功能性，并且必须与编码序列同框。通常启动子可以是组成型的或可诱导的。原核细胞中可用的启动子的例子可包括lac，tac，T3和T7启动子，但不限于此。真核细胞中可用的启动子的例子可包括β-肌动蛋白启动子，人血红蛋白启动子，人肌酸启动子和人金属硫蛋白启动子，以及猴病毒40(SV40)启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子如HIV长末端重复序列(LTR)启动子，莫洛尼氏病毒启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子，EB病毒(EBV)启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，但不限于此。所述表达载体可包含用于选择含有所述载体之宿主细胞的可选择标记物。可选择标记物用于选择被载体转化的细胞，并且作为可选择标记物，可以使用赋予可选择表型(例如抗药性，营养需求，细胞毒性剂抗性或表面蛋白的表达)的标记物。由于在用选择性试剂处理的环境中只有表达可选择标记物的细胞生存，所以可以选择经转化的细胞。另外，在可复制的表达载体的情况下，可包含复制起点，其是起始复制的特定核酸序列。作为重组表达载体，可以使用具有多种形状的载体，例如质粒，病毒，粘粒等。对重组载体的类型没有特别的限制，只要所述载体可发挥在多种宿主细胞(如原核细胞和真核细胞)中表达期望基因并产生期望蛋白质的作用，但是可优选这样的载体，其能够大规模生产具有类似于天然状态的形式的外源蛋白，同时具有活性强和表达能力强的启动子。
为了表达任一个选自本发明SEQ ID NO.1至6的碱基序列所编码的VZV MAV/06毒株蛋白，可以使用多种表达宿主/载体组合。作为适用于真核细胞的表达载体，可使用源自SV40，牛乳头瘤病毒，腺病毒，腺相关病毒，巨细胞病毒和逆转录病毒等的表达调控序列，但本发明不限于此。可用于细菌宿主细胞的表达载体可包括从大肠杆菌(Escherichia coli)中得到的细菌质粒，例如pET，pRSET，pBluescript，pGEX2T，pUC载体，colE1，pCR1，pBR322，pMB9及其衍生物，具有更广宿主范围的质粒如RP4，噬菌体DNA例如多种噬菌体λ衍生物如λgt10，λgt11，NM989，以及其它DNA噬菌体如M13，单链丝状DNA噬菌体等。可在酵母细胞中使用的表达载体可以是2℃质粒及其衍生物。可用于昆虫细胞的载体可以是pVL941。
重组载体可插入宿主细胞以形成转化体。在这种情况下，合适的宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌属(Streptomyces sp.)，假单孢菌属(Pseudomonas sp.)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)。此外，合适的宿主细胞可以是真菌如曲霉属(Aspergillus sp.)，酵母如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)，真核细胞如低等真核细胞，高等真核细胞，例如昆虫细胞等。
宿主细胞可优选地源自植物和/或哺乳动物。特别地，可以使用猴肾细胞7(COS7)、NSO细胞、SP2/0、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)细胞、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞，HEK293细胞等，但本发明并不限于此。特别地，可优选CHO细胞。
本文所用术语“转化进宿主细胞”可包括用于将核酸引入生物体、细胞、组织或器官的任何方法，并且通过选择本领域已知的适合于宿主细胞的标准技术来完成。这些方法可包括电穿孔法，原生质体融合法，磷酸钙(CaPO4)沉淀法，氯化钙(CaCl2)沉淀法，使用碳化硅纤维的搅拌法，农杆菌介导的转化法，和PEG、硫酸葡聚糖或lipofectamine
和干燥/抑制介导的转化，但不限于此。
将其中表达重组载体的经转化宿主细胞培养在营养培养基中，以使得可大规模生产任一个选自本发明SEQ ID No.1至6的碱基序列所编码的VZV MAV/06毒株蛋白。在这里，可根据宿主细胞适当地选择一般培养基和培养条件。在培养细胞和大量生产蛋白质期间可适当地控制条件(如温度，培养基pH，培养时间等)以进行细胞生长。如上所述重组产生的任一个选自SEQ ID No.1至6的碱基序列所编码的VZVMAV/06蛋白可从培养基或细胞的裂解物中回收并通过一般生物化学分离技术进行分离和纯化(Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);DeuschenM.，Guide toProtein Purification Methods Enzymology，Vol.182.Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1990))。作为分离技术，可使用电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、透析、层析(离子交换层析、亲和层析、免疫吸附层析、体积排阻层析)、等电聚焦和其多种改进和组合方法，但本发明不限于此。
在另一个一般性方面，本发明提供了疫苗组合物，其含有任一个选自SEQ ID NO.1至6号的碱基序列所编码的VZVMAV/06毒株蛋白作为活性成分。在这种情况下，所述疫苗组合物还可含有可药用佐剂或赋形剂。可使用任何佐剂，只要它在佐剂注射进体内时促进抗体形成从而实现本发明的目的。特别地，可优选使用选自铝盐(Al(OH)3或ALPO4)，鲨烯，山梨聚糖，聚山梨醋80，CpG，脂质体，胆固醇，单磷酰脂(MPL)A和吡喃葡萄糖基脂A(GLA)中的至少一种，但本发明不限定于此。
有益效果
根据本发明，分析分离自韩国患者分离的水痘-带状疱疹病毒(VZV)MAV/06毒株的完整基因组序列并与23种VZV病毒株的碱基序列进行比较，从而可确认由重复序列变异造成的物种间基因组长度多态性和复制起点。此外，通过生物信息学研究、比较基因组研究等，VZV MAV/06毒株病毒的完整序列可有助于理解减毒VZV疫苗病毒株的分子特性。
附图说明
图1示出了本发明VZV MAV/06毒株(下文中，图中用“Suduvax”表示)的ORF图谱;
图2示出了基于完整核苷酸序列的24种VZV病毒株的系统发生树;
图3示出了基于非编码核苷酸序列的24种VZV病毒株的系统发生树;
图4示出了基于疫苗病毒株和临床病毒株之间12个ORF差异的疫苗病毒株特征性系统发生树;
图5示出了VZV病毒株的重复序列和基因组长度之间的相关性;
图6示出了本发明VZVMAV/06毒株的ORF0和Oka疫苗病毒株之间的突变；
图7示出了本发明VZVMAV/06毒株的ORF17中的3bp缺失区域;
图8示出了本发明VZVMAV/06毒株ORF56中的3bp缺失区域;
图9示出了本发明VZV MAV/06毒株ORF29中的15bp缺失区域;以及
图10示出了本发明VZVMAV/06毒株ORF60中的3bp缺失区域。
最佳实施方式
在下文中，将参照实施例和附图详细描述本发明。然而，本发明的实施例和附图为举例说明目的而公开，但本发明的范围不限于此。
[实施例1]病毒和DNA测序
MAV/06病毒株这样获得:1989年从水痘感染的33个月大的韩国患者的水泡中分离水痘-带状疱疹病毒获得并在人胚肺细胞中原代培养分离的VSV(Hwang，K.K.，Park，S.Y.，Kim，S.J.，Ryu，Y.W.，&Kim，K.H.，Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Varicella-ZosterVirus isolated in Korea.J.Kor.Soc.Virol.21，201-210，1991)。
在34至36℃下，将培养的MAV/06病毒株在人和琢鼠胚胎的二倍体肺细胞中传代培养55次，并通过细胞敏感性和温度敏感性测试证实传代培养的MAV/06病毒株是减毒的(Hwang等，Marker test for attenuationo fvaricella-zoster virses isolatedinKorea)。减毒病毒株被命名为“MAV/06”并用于生产Suduvax。
将减毒的MAV/06病毒株在人胚胎的二倍体肺细胞中连续传代培养来制备病毒种子母液，将制备的病毒种子母液连续传代培来制备病毒种子工作液。
此外，使用病毒种子工作液传代培养5次生产最终的疫苗“Suduvax”，并使用最终疫苗进行序列分析。
使用QIAamp DNA迷你试剂盒(Macrogen)从MAV/06病毒株储液中提取DNA(浓度为5.5μg/100ul)。由罗氏诊断的基因组测序FLX标准系统测定DNA序列。
获得23,722个平均长度约400bp的序列片段，使用Consed程序(http：//bozeman.mbt.washington.edu/consed/consed.html)进行组装和查看所得到的序列片段。序列片段的平均质量为99.99%。124,759个序列中有99.38%与衍生的共有序列相匹配，且覆盖率为每个核苷酸83次读取。将这些与两个参照病毒株Dumas(NC_001348)和Varilrix(DQ008354)比对，通过使用从相邻重叠群(contig)获得的引物进行PCR测序来填充重叠群之间的缺口。
已完成MAV/06病毒株的完整基因组序列登记在NCBI GenBank数据库(2011年8月9日)并用SEQ.ID No.1表示。如SEQ.ID No.1所示，确认MAV/06病毒株的基因组长度为124,75gbp。
[实施例2]开放阅读框的分析
MAV/06病毒株的开放阅读框(ORF)在整个基因组序列的位置通过对两个参照病毒株Dumas(NC_001348)和Varilrix(DQ008354)的Blast搜索确定。可以确认，所得数据包含MAV/06病毒株基因组每个ORF的第一个与最后一个核苷酸的位置以及ORF的方向。
ORF信息通过ORF寻找程序(如CLC序列查看器(版本6.1http：//www.cicbio.com/index.php)和NCBI提供的ORF Finder核实。当blast检索结果与ORF发现程序的结果不一致时，使用BioEdit序列比对编辑器(北卡罗莱纳州立大学徵生物学系，版本5.0.9http://www/mbio.ncsu.edu/BIOEDIT/bioedit.html)和手动编辑检查相应ORF的核苷酸序列，从而决定起始和终止密码子的位置。最后，通过翻译的氨基酸序列确认所有定位的ORF。
上述分析结果显示在以下项(1)至(4)中。
(1)MW/06病毒株基因组结构和ORF图谱。
MAV/06病毒株基因组的结构是VZV病毒株的典型结构，其中基因组可以被划分为6个区域，即，TRL，UL，IRL，IRS，US和TRS，区域的长度分别为88bp、104,799bp、88bp、7,267bp、5,232bp和7,276bp。
MAV/06病毒株基因组的G+C含量为约46.1%，总基因组长度与24个VZV病毒株的总基因组长度显著相似。本发明中所分析的VZV病毒株和它们的GenBank登记号，基因组的长度以及G+C含量在下表1中示出。
[表1]本发明中所分析的VZV病毒株信息
MAV/06病毒株包括74个ORF。已证实其中64个ORF为UL基因，4个ORF为US基因。
IRS中3个基因(ORF62-64)以相反方向重复出现在TRS(ORF69-71)中，在74个ORF中，70个ORF以正向出现，34个ORF以反向出现。此外，ORF的方向在VZV毒株中100%保守。图1示出MAV/06病毒株(在所有的附图中以“Suduvax”表示)的ORF图谱。
(2)MAV/06病毒株的系统发生分析
基于表1中病毒株的完整核苷酸序列，使用邻接法构建系统发生树。
通过ClustalW(版本2.0.1)以及随后的手动编辑，将MAV/06病毒株的ORF核苷酸序列与登记在NCBI GenBank数据库中的表1中24种VZV毒株的核苷酸序列和氨基酸进行多重比对。
使用所得的输出文件通过Dnadist和包括在Phylip包中的临近程序(版本3.69，http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)构建系统发生树。通过Kimura-2-参数获得距离矩阵。通过邻接(NJ)法和最大相似性(ML)法进行聚类分析，所得的树文件通过Treeview程序(版本1.6.6)浏览。通过自展分析验证了系统发生树的显著性。系统发生树用Seqboot程序产生的1000个复制子构建，通过Consense程序确定的共有树。
基于整个核苷酸序列通过最大相似性(ML)法构建系统发生树。结果是，包括MAV/06病毒株的病毒株(vOka，Varilrix和Varivax)(为4个减毒活病毒疫苗的病毒株)形成一个集群，M2DR病毒株和8个病毒株形成与其相邻的一个集群(如图2所示)。此外，CA123病毒株独立地形成第三个集群，11，22，03-500和HJ0病毒株形成第四集群，剩余的临床病毒株形成在其他集群。
作为基于非编码核苷酸序列使用最大相似性(ML)法构建的系统发生树所得的结果，从韩国患者分离的MAV/06病毒株和从日本患者分离的Oka病毒株树形成了独特的集群(日本-韩国(J-K)集群)(如图3所示)。在基于完整核苷酸序列和一般氨基酸序列构建的24个VZV病毒株的系统发生树上，pOKa病毒株位于4个疫苗病毒株(vOka，Varilrix，Varivax，和MAV/06)和19个临床病毒株之间)但在基于非编码核苷酸序列构建的24个VZV病毒株的系统发生树中，pOKa病毒株位于疫苗病毒株之间。也就是说，已经确认，在基于完整核苷酸序列和一般氨基酸序列构建的24个VZV病毒株的系统发生树中，4个疫苗病毒株(vOka，Varilrix，Varivax和MAV/06)在日本-韩国(J-K)群集中形成了亚进化枝，而在基于非编码核苷酸序列构建的24个VZV病毒的系统发生树中，它们没有形成亚进化枝。
为了确认区分疫苗病毒株和临床病毒株的主要ORF，构建根据ORF的74个系统发生树。其中，疫苗病毒株特异性的系统发生树在12个ORF中证实(如图4所示)。能够获得疫苗病毒株特异性系统发生树的ORF为ORF0，1，6，18，31，35，39，59，62，64，69和71。
(3)重复序列(reiteration sequence)和基因组长度的多态性分析
VZV病毒株的ORF长度几乎没有变化。可以确认VZV病毒株的74个ORF中，ORF63的长度在VZV病毒株之间的几乎没有差别。如下表2所示，可以确认，由于重复序列的长度，3个ORF(ORF11，14和22)在毒株之间的长度多态性是相对高的。
[表2]VZV病毒株的重复序列
1R序列的总和
2基因组的长度
3R序列缺失后基因组的长度
4以从长度最短到最长的顺序进行的排序
也就是说，R1定位在ORF11中并通过组合18bp元件(共有:GGACGCGATCGACGACGA)和15bp元件(共有:GGGAGAGGCGGAGGA)的多种序列形成。由于MAV/06病毒株中ORF11中的15-bp元件的额外重复，其长度与Oka疫苗病毒株不同。
另外，R2位于ORF14中，并设置多个42bp元件(共有:ACCTCGGCCGCTT/aCCCGAAAG/taCCCGATCCCGCCGTCGCGCCC，在这里，小写字母表示总和的小偏差)，R2中还包含其部分(32bp元件)。在MAV/06病毒株中，与Oka疫苗病毒株中的一样，ORF11的42bp元件重复7次。
此外，R3定位在ORF22的3-末端中心，且9bp元件反复地重复。9bp元件的共有序列是GC/tCCGC/tG/cCA/g(在这里，小写字母表示总和的小偏差)。重复数(n)在株间显着不同。在03-500病毒株中，重复的次数为73次，在vOka病毒株中，重复次数为3。在MAV/06病毒株中，9bp元件的重复数为11，但在Varilrix和Varivax病毒株中，重复数为8。
此外，R4和R5为非编码区。R4设置有27bp元件(共有:CCCCGCCGATGGGGAOGGGOCGCGOTA)，在R4中还包括其部分(11bp元件)。R4(R4a)位于IRS中的ORF62和63之间，与其互补的R4b定位在TRS中的ORF70和71之间。R4a的长度与R4b的相同，但在HJ0病毒株的情况下，R4a和R4b的长度是不同的。由于HJ0病毒株的R4b中，27bp元件又重复了4次，R4b的长度比R4a的长度长108bp。在Varilrix和Varivax病毒株的情况下，27bp元件又重复了5次。在MAV/06病毒株中，27bp元件又重复了3次。
R5定位于ORF60和61之间且设置有88bp元件，包括24bp元件。这两个元件不同于其他重复序列。具有两种类型的重复序列。和大多数的病毒株一样，MAV/06病毒株包括两个88bp元件和一个24bp的元件，但vOka和pOka病毒株的包括三个88bp元件和两个24bp元件。
通过比较24个VZV病毒株的基因组序列长度和重复序列的长度，确认VZV病毒株基因组长度的多态性是由于重复序列的长度。BC病毒株作为最长的基因组包含最长的重复序列，但MAV/06病毒株作为最短的基因组包含第二短的重复序列。最长基因组和最短基因组之间的长度(700bp)与最长重复序列和最短重复序列之间的差异(724bp)相似。如果从基因组中缺失重复序列，基因组的长度缩短，变异系数(CV)变化。重复序列从整个基因组中缺失时，0.000129被缺失，CV计算为0.00179。
实际上，如图5所示。当基因组的长度的次序按照重复序列的长度的次序设定时，相关系数(r2)为0.9854，几乎建立了VZV病毒株基因组和重复序列的长度之间的线性关系。
(4)复制的起始
VZV病毒株的复制起始(ORI)序列位于ORF62和63之间。在36个病毒株中ORI序列的长度为80bp，在HJ0病毒株中ORI序列的长度为108bp，这是由于在ORI序列的排列中TA和GA二核苷酸的重复数目彼此不同。
在下表3所示，MAV/06病毒株的ORI序列定位在基因组第110080位和110183位之间，其中包含15个GA串联重复和11个TA串联重复。
表3
1TA串联重复的数目
2GA串联重复的数目
基因组110235位置的串联重复数目是不同的，但是，一般在Oka疫苗病毒株和MAV/06病毒株中，在对应于Dumas病毒株(参照病毒株)110235位置的核苷酸位置的一个位置上，GA串联重复中的A被G替换。除了HJ0和Varilrix病毒株(HJ0病毒株中缺失(TA)3(GA)2，Varilrix病毒株中缺失一个GA串联重复)，ORI序列在ORF70和71之间准确地互补重复。
(5)MAV/06病毒株ORF的特性分析
病毒株MAV/06的ORF0长度由于突变而提高。终止密码子TGA(第388-390核苷酸位置)突变为编码精氨酸(Agr)的CGA。估测为终止密码子的TCA发现于与ORF1重叠的下游端区域。扩展的ORF0编码221个氨基酸残基的新蛋白质。相同的突变在其它相似的vOka，Varilrix和Varivax疫苗病毒株中证实(图6)。
在所有的临床病毒株中，pOka病毒株包括编码129个氨基酸的ORF0且长度为390bp。
与参照病毒株Dumas病毒株相比，由于第658位至660位的TCT和第367位至第369位的TCA分别从MAV/06病毒株的ORF17(SEQ IDNO:3)和ORF56(SEQ ID NO.5)中缺失，ORF17和ORF56的长度缩短3bp(图7和图8)。所有上述的缺失导致丝氨酸(5)氨基酸残基的缺失。另一方面，MAV/06病毒株的ORF60(SEQ ID NO.6)中，3个核苷酸(ATG)插入在第28位(图10)。有趣的是，包括pOka病毒株的所有Oka疫苗病毒株中都发现了一个插入和两个缺失。
另外，在MAV/06病毒株和Oka疫苗病毒株中，ORF29(SEQ IDNO.4)的长度比Dumas毒株和大多数临床病毒株的ORF29的长度短15bp(AACATTTCAGGGTCA)。参照病毒株Dumas毒株和大部分临床病毒株连续且重复地包含15bp序列。在M2DR，CA123和8个临床病毒株中，ORF60的长度与Oka疫苗病毒株和MAV/06病毒株的ORF60的长度相同(图9)。
[序列表自由文本]
SEQ ID NO.1是VZVMAV/06毒株基因组DNA序列。
SEQ ID NO.2是VZVMAV/06毒株基因组DNA的ORF0。
SEQ ID NO.3是VZVMAV/06毒株基因组DNA的ORF17。
SEQ ID NO.4是VZVMAV/06毒株基因组DNA的ORF29。
SEQ ID NO.5是VZVMAV/06毒株基因组DNA的ORF56。
SEQ ID NO.6是VZVMAV/06毒株基因组DNA的ORF60。
Claims (11)
1.水痘-带状疱疹病毒(VZV)MAV/06毒株的基因组DNA，其具有SEQ ID NO.1的碱基序列。
2.VZV MAV/06毒株基因组DNA的开放阅读框(ORF)，其选自:具有SEQ ID NO.2之碱基序列的ORF0、具有SEQ ID NO.3之碱基序列的ORF17、具有SEQ ID NO.4之碱基序列的ORF29、具有SEQ ID NO.5之碱基序列的ORF56，以及具有SEQ ID NO.6之碱基序列的ORF60。
3.蛋白质，其由权利要求2或3所述的VZVMAV/06毒株基因组DNA的开放阅读框编码。
4.重组表达载体，其包含:具有SEQ ID NO.1之碱基序列的VZVMAV/06毒株基因组DNA或选自以下的ORF:具有SEQ ID NO.2之碱基序列的ORF0、具有SEQ ID NO.3之碱基序列的ORF17、具有SEQ IDNO.4之碱基序列的ORF29、具有SEQ ID NO.5之碱基序列的ORF56，以及具有SEQ ID NO.6之碱基序列的ORF60。
5.宿主细胞，其被权利要求4所述的重组表达载体转化。
6.权利要求5所述的宿主细胞，其中它们选自动物细胞、植物细胞、酵母、大肠杆菌(Escherichia coli)和昆虫细胞。
7.权利要求6所述的宿主细胞，其中它们选自猴肾细胞7(COS7)、NSO细胞、SP2/0细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、WI38细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞，HEK293细胞，大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌属(Streptomyces sp.)，假单孢菌属(Pseudomonas sp.)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。
8.制备由任一个选自SEQ ID NO.1至6的碱基序列所编码的VZVMAV/06毒株之蛋白质的方法。
9.疫苗组合物，其包含:权利要求8所述的VZVMAV/06毒株之蛋白质作为活性成分。
10.权利要求9所述的疫苗组合物，其还包含可药用佐剂从而在注射所述佐剂进入机体时促进抗体形成。
11.权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是选自以下的至少一种:铝盐(Al(OH)3或ALPO4)、鲨烯、山梨聚糖、聚山梨酯80、CpG、脂质体、胆固醇、单磷酰脂质(MPL)A和吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
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