JPS6391093A - 高分子量ｄｎａの迅速単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、分子生物学の分野、そしてより詳細には、制
限酵素分析に適した高分子量ＤＮＡ０単離に関する。

背景技術 分子生物学においては、近年、新規制限酵素、改良ＤＮ
Ａクローニング方法、改良ハイブリダイゼーション・ゾ
ロープおよび改良ハイブリダイゼーション・支持体につ
いて大きな進歩がみられた。しかしながら、これらの方
法に用いるためのサンプルの調製については、仮りにあ
ったにせよ、はとんど注意が払われていない。すなわち
、これらの方法に用いる核酸（特にＤ？ＪＡ　）の単離
および調製の速度および効率の向上に対しては、はとん
ど何もなされていない。

高分子量ＤＮＡ単離についての古典的文献は、Ｍａｒｍ
ｕｒ［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ３．２０８〜２１８（１９
（５１））である、Ｍａｒｍｕｒの教示する方法は１４
工８を含むものであるが、完璧さを期すためにその一部
を反復する必要がある。これらの工程の多くは時間のか
かるものであり、また大部分がＤＮＡを首尾よく確実に
単離するには極めて熟練した技術者を必要とする。以下
に、。

著者によって与えられた全詳細を示して個々の工程を論
じることとする。

ｔ　細胞溶解 細胞懸濁液をまず洗剤であるドデシル硫酸ナトリウムを
用い６０℃で処理して細胞溶解を試みる。溶解が達成さ
れたら次工程に進み、達成されなかったら酵素のリソチ
ームを添加して細胞を３０〜６０分間溶解（ダイジェス
ト）させる。

これらの工程は逆にすることもできるが、逆にした場合
、以後の過程が正しく行われるべく、洗剤を添加しなけ
ればならない。この細胞溶解方法は広い範囲にわたって
有効ではあるが、普遍的にそうというわけではない。リ
ンチームおよび洗剤処理のいずれに対しても抵抗性のあ
る細胞壁を持った生物も存在する（例えばストレプトコ
ッカス・ピオゲネス（８ｔｒｅｐｚｏｃｏｃｃｕｓｐｙ
ｏｇｅｎｅｓ）など）。

２、　脱タンパク 粘稠な溶解懸濁液を・ぞ−クロレート濃度１Ｍとし、そ
してクロロホルム−イソアミルアルコール混合物で抽出
する。次に、この混合物を遠心分離すると３層が形成さ
れるが、その中間層がタンノξりを含んでいる。上層の
水性層は核酸を含み、そして以後の処理のために取り出
される。

３、核酸沈殿 核酸は、前記水性層の上にエタノールを重層し、そして
核酸をガラス棒上に集めること知よって沈殿させる。そ
の沈殿をフラスコの側面に押しつけることによって該沈
殿から過剰のエタノールを切る。この工程は、極めて熟
練した技術者を必要とする。何故ならば、以後のすべて
のＤＮＡ沈殿工程についてもいえることであるが、目的
とするＤＮＡの著しいロスが生じ得るからである。これ
らのロスは、不完全な沈殿、洗浄中の沈殿再溶解、およ
び沈殿ＤＮＡの容器壁への何重のために生じる。

４、　核酸の溶解 前記沈殿を冷食塩水−クエン酸塩緩膏液に移し、そして
ゆるく攪拌することにより再溶解する。過度に攪拌する
とＤＮＡの剪断が生じ、その結果低分子：ｌ　ＤＮＡが
形成されるため、細心の注意を拡う必要がある。

５、　脱タンパク 可溶性核酸を工程２に記載のとおり再抽出してすべての
残留タンパクを除く。完全なタンパク除去を保証するた
めにこの工程を何度か反復してもよい。溶媒層の界面に
ほんのわずかなタン／９りしかみられなくなったら、完
全に除去されたものと推定される。

＆　核酸沈殿 工程３を反復して核酸を更に精製する。

Ｚ　核酸の溶解 工程４を反復して、更に処理するための核酸溶液を得る
。

８、　リボヌクレアーゼ処理 前記溶液中に存在する核酸混合物をリボヌクレアーゼを
用いて５７℃で３０分間処理してサンプル中に存在する
あらゆるＭＡｅ消化（ダイジェスト）する。消化後は、
以前の抽出（工程２および５）に対して抵抗性のあった
タン、ｏりを除くことができる。

９　脱タンパク 工程２を反復すると、ＲＮＡ　、リボヌクレアーゼ処理
により遊離したタンパク、およびリボヌクレアーゼそれ
自体を含まないＤＮＡが得られる。

１０、　　ＤＮＡ沈殿 工程５の記載と同様にしてＤＮＡを沈殿させる。

１１、　　ＤＮＡの溶解 工程４の記載と同様にしてＤＮＡを再溶解する。

１２、インゾロビルアルコールでの沈殿そのＤＮＡ溶液
にアセテ−）　−ｇＤＴＡ緩衝液を添加し、そしてその
溶液を迅速に混合する。該溶液の混合中に、その渦流中
に０．５４容のイソプロピルアルコールを適加する。次
に、著者によればｒ　ＤＮＡは通常、約０．５容のイソ
プロピルアルコールでまずゲル相を経た後、繊維状形態
をとって沈殿する」が、これまた熾しい工程である。

１五　インプロピルアルコールでの沈殿「収率が良けれ
ば」工程４および１２を反復することができる。

１４、最終洗浄 最終沈殿は、画壇（７０〜９５％）量のエタノールを含
む水性エタノール中で付着沈殿全ゆるく攪拌することに
より、アセテートおよび塩不含に洗浄される。以後その
ＤＮＡは、その後の分析に使用すべく遇択された緩衝液
への溶解に利用できる。

Ｍａｒｍｕｒおよび今日まで分子生物学者達に受継がれ
ている方法は複雑でありまた目的ＤＮＡをロスしやすい
。Ｍａｒｍｕ　ｒによれば、この方法に注意深く従って
行えば、５０チまでの、細ｊ泡からのＤＮＡ回収回収金
４成することができるが、これとて大して高い収率では
ない。この方法はまた一般的に１〜２日間という、望ま
しからぬ程に長い処理時間を必要とする。更に、Ｍａｒ
ｍｕｒによれば、広い範囲の様々な微生物からＤＮＡ　
ｆ：効率的に単離する技術を案出することは極めて困難
である。Ｍａｒｍｕｒ法は、はとんどすべてのＯｒａｍ
陰性生物および多くのＧｒａｍ陽性生物を含む様々な生
物に対して有効ではあるが、甑めて重要な生物の一つで
あるストレプトコッカス・ピオゲネスはこの方法によっ
ては溶解されない。この生物は通有の病気であるストレ
ッジ・スロー）（ｓｔｒｅｐｔｈｒｏａｔ）の原因菌で
ある。

やはりＭａｒｍｕｒによって開示されたＤＮＡを単離す
るための別法は、塩化セシウム遠心分離を利用する。こ
の方法は工程数はずっと少くなるものの遠心に３日間を
要し、従ってこれも迅速なりＮＡ単離法ではない。その
上、セシウムイオンは、回収ＤＮＡの生物活性に悪影響
を及ぼす。

Ｃａｒｔｅｒ　ａｔ　ａｌ、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、Ｖｏｌｕｍｅ　１（３）。

１４２〜１４７（１９８３））は、塩化セシウムに代え
てトリフルオロ酢酸セシウムを用いる吹成された等比重
遠心分離媒質を開示している。このトリフルオロ酢酸セ
シウムは塩化セシウムと同様の方法で用いられる。しか
しながらトリフルオロアセテート陰イオンは、伝統的な
セシウム密度勾配媒質に比べ、それよりも高品質の核酸
調製物を生じる性質をトリフルオロ酢酸セシウムに対し
て付与する。このトリフルオロ酢酸セシウムの使用によ
り、核酸の分離および精製における等比重遠心分離の応
用範囲が広がったが、この方法も依然として、固有的に
、時間がかかりかつ面倒である。

（）ｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、（Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ　　５６ｔ５２〜５Ｂ（１９７５
）”］は、哺乳動物細胞からの高分子量ＤＮＡの単離に
有用な類似の方法を開示している。この方法では、細胞
の溶解にプロテイナーゼＫおよび洗剤であるドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）が用いられる。

この方法は、これらの溶解条件を受は入れる微生物に対
しても適用できる。脱タンパクは、クロロホルム：イソ
アミルアルコールよりはむしろフェノール地利緩衝液を
用いて行われる。しかしながら、フェノールの使用は、
次の処理に進む前にそれを除去するために、４時間透析
する必要がある。存在するすべてのＲＮＡ　ｉリボヌク
レアーゼを用いて消化した後そのりボヌクレアーゼをプ
ロテイナーゼにおよびＳＤＳ　’ｊｉ用いて消化する。

次いでそのＤＮＡを更に２回脱タンパクし、そして再び
透析する。最後にそのＤＮＡ　ｙ＆：エタノールで沈殿
させる。この方法ではＭａｒｍｕｒの方法以上の利点は
ほとんど得られない。ＤＮＡ沈殿回数は少いが、この方
法には２つの長時間の透析工程が導入されている。

Ｃｈａｓｓｙ　ｅｔ　ａｌ、（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ
　ＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
、Ｖｏｌｕｍｅ　３９（１）、１５３〜１５８（１９８
０））は、リゾチームの微生物溶解作用の有用性を拡げ
る方法を開示している。この方法は、改変媒質、特にＬ
−トレオニン含有媒質中での生物の増殖に依存する。こ
れによって、リゾチーム処理を受けやすい弱化された細
胞壁架橋構造を有する生物へと導かれる。この方法は、
溶解すべき生物が前記改変媒質中で増殖することが分っ
ているときにのみ有用であるにすぎず、また生物を増殖
させることなく臨床検体から直接採取されたＤＮＡを用
いる可能性を全く排除してしまう。

従って、この方法は、一般的有用性を有しない。

ｐｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ
ｅｒ８．Ｖｏｌｕｍｅ　２６゜３３５〜５４１　（１９
８５））は、ヒト白血球からＤＮＡを迅速に抽出しそし
て精製する方法全開示している。

この方法は、洗剤による細胞溶解、細胞材料の酢酸カリ
ウム沈殿、リボヌクレアーゼ消化、］弘。

ｊｆｆＩ製のためのＤＥＡＥ−セルロースを用いる吸着
クロマトグラフィ、およびＤＮＡのエタノール沈殿を含
む。この方法は、洗剤による溶解を受ける微生物、一般
的には、Ｇｒａｍ陰性生物にのみ適用可能にすぎない。

Ｐｏｔｔｅｒθｔａ１．法は、細胞成分の沈殿に酢酸カ
リウムを用いそして吸着クロマトグラフィを用いる点で
Ｍａｒｍｕｒ法とは異なっている。これらの著者は、酢
酸カリウム沈殿工程でＤＮＡのロスのアシ得ることを認
めている。更に、多くの沈殿法についてもそうであるよ
うに、沈殿の完全な回収を保証するためにサンプルを遠
心分離する必要があり、そして遠心分離には高価な装置
と貴重な時間が必要である。沈殿工程および遠心分離工
程は避けた方が有利であろう。

吸収クロマトグラフィを用いてＤＮＡ　Ｉ　ｎ！ｆｉす
ることもめる種の欠点を生じ得る。何故ならば、最も高
分子量のＤＮＡは支持体に最強に結合しやすく、それ故
、カラムから容易には溶出されないからである。このた
め、最も高分子量のＤＮＡが選択的に失われるという結
果になりかねない。

Ｄｅ　Ｋｌｏｖｅｔ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｉＣａｌＭｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌｕｍｅ
　２ｓ１８９〜１９６（１９８４））は、エルスコビア
φキサンテンオリチカ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ　ｘａｎ−
ｔｈｉｎｅｏｌｙｔｉｃａ）から単離された単一のグル
カナーゼ酵素であるリチカーゼ（１ｙｔｉｃａｓｅ）ｅ
洗剤の存在下または非存在下て用いて細胞を溶解するこ
とにより醪母から高分子量ＲＮＡおよびＤＮＡを迅速に
嚇離する方法を開示している。溶解後、サンプルを等容
のフェノール：クロロホルム（４：１）溶液で抽出する
ことにより脱タンパクする。その混合物は層分離のため
に遠心分離され、そして核酸含有水相が集められる。こ
の相の酢酸ナトリウム濃度を０．３　Ｍ　（…５．Ｏ）
とし、そして２容のエタノールを用いて核ｄｋ沈殿させ
る。るるいは、高分子ｆＲＮＡは、塩化リチウムを用い
た選択的沈殿によって単離することができる。高分子″
ｉ　ＤＮＡは、その沈殿上清から、または予め沈殿しお
いた核酸から直接、単離することができる。前者の場合
、ＤＮＡ単離後、リボヌクレアーゼ処理を施して存在す
るＲＮＡを破壊する。次いでフェノール：クロロホルム
抽出によりＤＮＡを再び脱タンパクし、そしてエタノー
ルで沈殿させる。この方法は全体として、いずれも望ま
しくない有機溶媒による脱タンパクの反復およびエタノ
ールによる沈殿の反復を伴うという点でＭｕｒｍｅｒ法
に極めて類似している。これらのタイプの処理は、熟練
技術者、大規模な装置および施設を要しまた相当な時間
がかかるので望ましくない。

Ｍｏｎ５ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

Ｖｏｌｕｍｅ　１６ｓ１９〜２４（１９８３））は、連
鎖球菌からの細胞溶解およびＤＮＡ調製のための一般的
方法ｔＳ示している。仁の方法は、その生物の溶解に、
ストレプトミセス・グロビスボルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｌ
！Ｉ！７ｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）　１　Ｂ　２
９から単離すれた溶解ｉｎ素ムタノリジン（エンド−Ｎ
−アセチルムラミニダーゼ）を用いる。前述の如く、こ
れらの生物はリソチームおよび洗剤誘導溶解に対して抵
抗性がある＠Ｍｅｎｓｅｎ　ａｔ　ａｌ、はまた、連鎖
球菌が一般的プロチアーゼでろるプロテア−ゼＫに対し
て抵抗性があることも示した。ＭＯｎ５１１９ｎ　ｅｔ
ａｌ・は・塩化セシウム遠心分離を用いて高分子量ＤＮ
Ａを単離した。前述の如く、これは極めて時間のかかる
手順であり、臨床サンプルのルーチン調製には適切でな
い。

前述の方法はいずれも、臨床診断応用上重要′な微生物
を溶解しそしてそれらのＤＮＡを単離するための完全に
一般的な方法を提供するものではない。一般的に、これ
らの方法は、単一の酵素および／または洗剤を用いて限
られた生物群を溶解するものである。

Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ　ｅｔ　ａｌ、（米国特許＄４，４
８３，９２０号、１９８４年１１月２０日交付）は、高
濃度（８０チ）のカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉ
ｃ）塩である沃化ナトリウムの存在下に伝令ＲＮＡ　’
ｉ　フィルタに固定することを開示している。ここでカ
オトロピック塩は、タンパクを変性し、それらｆｔｍＲ
ＮＡから解離させ、そして実質的にすべての細胞成分を
可溶化してハイブリダイゼーション・フィルタを通過さ
せるために用いられる。

ｖｏｎ　Ｈｌｐｐｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ
　Ｖｏｌｕｍｅ　１４５＋５７７〜５８０（１９６４）
は、カオトロピック塩くよるタンパクおよび核酸の変性
を研究した結果、タンツクの方が核酸よシもこのような
変性を受けやすいことを見出した。このような知見から
２本鎖高分子ｉ−ＤＮＡを変性することなくタンパクを
変性しそれによってタンパクの核酸からの解離を助長す
るカオトロピック塩ａ度を選択することが可能かもしれ
ないと結論することができる。

広範囲にわたる様々な源から高分子量核ＩＪ’に単離す
るための迅速で効率がよくしかも簡単な方法が依然とし
て必要とされている。

本発明の開示 高分子量核酸ヲそれらの源生物がら単離する方法であっ
て、 （Ａ）　　所望の核酸を含むあるいは含むと思われる前
記生物の懸濁液を形成させ； （Ｂ）　　該生物を少くとも一種の分解酵素（１ｙｔｉ
。

ｅｎｚｙｍｅ）で処理し； （Ｃ）　　該生物全工程（Ｂ）の前に、工程（Ｂ）と同
時に、または工程（Ｂ）の後で、界面活性剤で処理し；
（Ｄ）　　所望しない種類の核酸を、それら所望しない
核酸に対し特異的なヌクレアーゼで処理することにより
分解し； （Ｅ）　タンパクを少くとも一種の広域活性プロテアー
ゼで消化することにより分解し ；（Ｆ５　　少くとも一種のカオトロピック剤を添加す
ることによシ残留タンパクを変性しそしてそれらを核酸
から解離させ：そして （ｑ　核酸を透析しそして濃縮する、 工程より成る前記方法。

本発明の説明 前述のとおり、核酸、特にＤＮＡをそれらの源生物（ｓ
ｏｕｒｃｅ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）から単離するための改
良された方法が必要とされている。源生物とは細胞、特
に微生物細胞、ウィルスおよびマイコプラズマを含む、
核酸を含有するあらゆる生物を意味する。この方法の対
象とする細胞には哨乳動物または細菌由来のａ廁および
補乳動物細胞と細蕗細胞の混会物が包含される。この改
良法によれば、広範囲にわたる様々な源生物から、特に
大部分の臨床的に関連のある細胞タイプから高分子量核
酸を迅速かつ高収率で回収することができる。驚くべき
ことに、本発明の方法によれば極めて様々な生物から高
分子量核酸を約９０分で単離できることが分った。この
方法はＤＮＡの単離に最高に利用されるものと期待され
るが、ＲＮＡの単離にも有用である。

便宜上の理由から、この方法を細胞の懸濁液を用いて行
われるものとして記述するが、その他の該酸含有源生物
も同様にして処理され得ることは理解されるべきである
。実際問題としては、この単離方法を５００μｌ緩衝剤
中にｌＸ１０７〜ｌＸ１０ａ個細＠を含む細胞上用いて
開始するのが便利である。硼酸ナトリウムおよび燐酸ナ
トリウムを含む様々な緩衝剤を用いることができるがト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉ
ｓ）が好ましい。好ましい緩衝剤濃度は１０ｍＭである
が、約１ｍ）Ｊ〜約５００　ｍ＋Ｊの濃度も受は入れ可
能である。好ましい−は約８であるが約４〜約９の範囲
の−も受は入れ可能である。緩衝剤はまた１〜５００　
ｍＭ塩化ナトリウム（１０ｍＭが好ましい）を含むこと
もでき、また同様に、約１〜１０ｍＭエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤ’Ｉ’Ａ）（約１　ｍＭが好ましい）を含
むこともできる。好ましい緩衝剤組成は、１０　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　、　１０鮨塩化ナトリウム、１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　、ｐＨｓ、ｏ　（Ｔｒｉｓ緩衝剤、關８．　Ｏ）
である。この方法は、希釈度およびプロセスタイミング
ｆｔ、調整することによりより多容量および／または異
なる数の細胞を受は入れるべく容易に適合させることが
できる。

本発明の方法は、単一の分解酵素を用いて行うこともで
きるが、かかる酵素の混合物を用いるのが好ましい。生
物＠濁液に添加すべき分解酵素の混合物は、一般的に溶
菌酵素「カクテル」でらり、そして就中、リゾチーム、
エンド−Ｎ−アセチルムラミニダーゼおよびアクロモペ
プチダーゼを含むことができる。この細胞溶解混合物中
の酵素の最終濃度は、それぞれ５０〜５００ｔｔｇ／ｒ
ｎｌ、１０〜５００μｇ／ｍｌおよび５０〜５ｏｏｌｌ
シ酵ノ範囲であってよい。好ましい濃度は、それぞれ３
００　μｇ／ｒｎｌ　、　３０　μｇ／ｍｌおよび３０
０　μｇ／ｍｌである。

この分解酵素カクテルは、前述のＴｒｉｓ緩衝剤ｐＨ８
，０中で調製することができ、あるいは、任意の一般的
に許容される緩衝剤を用いることができる。このカクテ
ルは、前述の懸濁液に約２０℃〜７０℃の温度範囲で添
加でき、また約１〜６０分間の間インキュベートするこ
とができる。

一般的に、酵素プロセスは酵素がその高温によって変性
されなければ、温度が高い程速く進行することが知られ
ている。従って、消化の完了に必要な時間を最短とする
ために、所与の酵素カクテルに対゛して可能な限り（変
性奮起こさない）高い温度で操作するのが好ましい。以
後のすべての酵素分解工程についてこれと同じことがあ
てはまる。前述の酵素混合物についての好ましい処理条
件は、約３７℃の消化温度で約１゜分という条件である
。所望により、細胞溶解を更に向上させるために、還元
剤を細胞溶解混合物に添加することができる。ジチオト
レイトール、ジチオエリトリトール、システィンおよび
アスコルビン酸を官む様々な還元剤を用いることができ
、そして２−メルカプトエタノールが好ましい。いずれ
の還元剤についても、最終濃度は、０．１〜５０　ｍＭ
の範囲とすることができる。

好ましい濃度は、５　ｍＭである。細胞の溶解および可
溶化の両方を更に向上させるために、細胞溶解混合物に
非プロトン溶媒を添加することができる。かかる溶媒と
しては、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およ
びスルホランと共にジメチルスルホキシド（ＤＭＳ　Ｏ
）が好ましい１つである。非プロトン溶媒の最終濃度は
、１〜２０嗟（ｖ／ｖ）の範囲とすることができる。好
ましい濃度は、１０４　（ｖ／ｖ）である。

この特定の酵素混合物の分解作用は広域であり、そして
、次の属に属す微生物を包含する。

エーロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ。

アコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）ｓｐ。

アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ
。

アースロパクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ。

アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ。

バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ。

ブレビバクテリウム（Ｂｌｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
ｓｐ。

クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ｓｐ。

エンテロバクタ−（ｇｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ。

エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ。

フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
ｓｐ。

クレブシェラ（Ｋｌｅｂｇｉｅｌｌａ）ｓｐ。

クルチア（Ｋｕｒｔｈｉａ）ｓｐ。

２クトパチＡ／　ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓ
ｐ。

ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）ｓｐ。

マイクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃｕｓ）ｓｐ。

マイコプラズ−ｑ　（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）ｓｐ。

はデイオコツカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ。

プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）ｓｐ。

ゾロタξノパクタ−（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ
）ｓｐ。

シュードモナｙ、　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ。

サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｓｐ。

サルシナ（Ｓ３ｒｃｉｎａ）ｓｐ。

セラチア（Ｓｓｒｒａｔｉａ）ａｐ。

シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ｓｐ。

スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
ｓｐ。

ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ｓ
ｐ。

ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｓｓ）ｓｐ。

その溶菌作用を更に広げるために、前記酵素カクテルに
その他の酵素を添加することもてきる。適切な酵素とし
ては例えば次のものが挙げられる：リパーゼ、リソＲプ
ターゼ、工；ノドーＮ−アセチルグルコサミニダーゼＤ
ｊたはＨ。

デキストラナーゼ、セルラーゼ、ゲルコアはラーゼ、ヒ
アルロニダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン
ア゛ミダーゼ、ストレプトミセスＫＭエンドペプチダー
ゼ、ストレプトミセスＳＡ工／ドぼブチダーゼおよびス
トレプトミセス延エンドはブチダーゼ。かかる酵素は、
一般的に、約１０〜５００μｇ７’ｒｎｌ混合物の濃度
範囲で有用でめる。溶菌性カクテルに含めるための一種
以上の付加的酵素の選択は、溶解すべき細胞の細胞壁お
よび細胞膜構造に依存する。例えば、■型ペプチドグリ
カンを含む細胞の溶解を向上するために、ストレプトミ
セスＬエンドペプチダーゼを添加することができる。こ
れら酵素の各々の酵素特異性は、一般的に知られており
、また酵素選択は、存在する生物のタイプに基づいて行
われるものと思われる。

細胞の完全溶解は、細胞溶解混合物への界面活性剤添加
、溶解温度の上昇および／またはより長い反応時間の使
用により保証することができる。界面活性剤添加は、分
解酵素処理の前、それと同時、あるいはその後のいずれ
であってもよい。一般的に、ドデシル硫酸ナトリクム（
ＳＤＳ）　ｋ約０．１　％　（ｗ／ｖ）の最終濃度と１
６１−ｔ”添加し、そして温度を約６０℃に１０分間高
めるのが好ましい。ＳＤＳ　９度は、約０．０５％〜約
１％　（ｗ／ｖ）であってよく；温度は、約り０℃〜約
７０℃の範囲であってよく；そして時間は、約１分〜約
６０分間であってよい。同様のや外下にその池の界面活
性剤を用いることができる。

これらには、例えば陽イオン、隘イオンおよび非イオン
界面活性剤例えばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００、オクチ
ルーβ−Ｄ−グルコピラノシド、３−ＣＣ５−コラミド
ゾロピル）ジメチルアンモニオツー１−プロ／ぐンスル
ホネート（ＣＨＡＰＳ）および３−〔（３−コラミドプ
ロピル）ジメチルアンモニオツー２−ヒドロキシ−１−
プロパンスルホネート（ＣＩＬＡＰＳ　Ｏ）などが挙げ
られる。

この手順段階でＤＮＡまたはＲＮＡのいずれを単離した
いのか決定する必要が６る。この段階までは、処理によ
ってＤＮＡまたはＲＮＡのいずれも分解されることはな
い。この段階で、所望の核ｒＲｔ−単離できるように一
方または他方を分解するのが有利である。本発明は、Ｄ
ＮＡの単離に最大の有用性を持つことが、明侍されると
ころ、本発明方法の残シの部分は、ＤＮＡ単離について
論じることとし、そして特異的な手順変更が必要となる
場合にのみＰＮＡ単離に言及することとする。

ａＩ＠溶解液（ｌｙｓａｔｅ）中のＲＮＡはリボヌクレ
アーゼ（ＲＮａｓｅ）　ｆ用いて分解することができる
。

ＲＮａｓｅ　Ｉ　Ａが好ましいｔ＃索であるが、その他
のＲＮａｓｅ類例えばＲＮａｓｅ　Ｔ　、　ＲＮａｓｅ
　Ｕ　、　ＲＮａｓｅ　ＨまたはＦ４Ｈａｓｅ　Ｂなど
を代わりに用いることもできる。ＲＮａ　ｓ　ｅは約り
０℃〜約７０℃の温度で約１〜約６０分間、細胞溶解混
合物１−あたシ約５０〜５００μｇの最終′ａ度となる
よう添加される。好ましい処理条件は約６０℃で約１０
分間、約３００μｇ／Ｉｎ１ＲＮａＳｅＩＡｔ−添加す
るという条件である。これらの条件は、ＤＮＡ　′に分
解することなく、細胞溶解液中のＲＮＡｔ−迅速に分解
するのに役立つ。ＲＮＡ単離が所望の場合には、ＲＮａ
ｓ　ｅ消化に代えてデオ中シリボヌクレアーゼ（ＤＮａ
ｓｅ）による消化を行う。ＤＮａｓｅ　Ｉはこのように
して用いるのに適した酵素である。しかしながら所望の
り２スの核酸の分解を避けるためには、適切な純度のＲ
Ｎａ　ｓ　ｅまたはＤＮａｓｅ　ｔ’用いることが重要
である。

この時点で細胞溶解混合物に幾分かの’ｒｒｉｓ緩衝剤
、−８，０、または水を添加してその粘度を下げること
が、任意ではめるがしばしば望ましい。高粘度は、本方
法の残りの工程の操作が非効率的となるため、単離ＤＮ
Ａの回収率低下の原因と゛なり得る。この任意の希釈は
ＲＮａｓｅ処理工程の一部として取り込むことができる
。

細胞溶解混合物中に存在する細胞性タンパクおよびＲＮ
ａｓｅは、次いで非特異的プロテアーゼまたはかかる広
域活性プロテアーゼ混合物を用いて分解することができ
る。好ましいプロテアーゼはプロテア−ゼにであるが、
その他のもの例えばストレプトミセス・グリゼクス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）から単離
されるアルカリ性プロテアーゼなどを代わりに用いるこ
とができる。

最終濃度は、好ましくは約２０〜７０℃で約５〜１２０
分間にわたり５０〜５００μｇ／’ｍｌである。

好ましい特異的処理条件は約６０℃で約３０分間にわた
り約３００μｇ／ｍｌのプロテア−ゼに濃度とする条件
である。このタンツク分解工程は一般的に従来技術の有
機溶媒抽出にとって代わるものである。これら抽出を排
除することによって、回収可能ＤＮＡの収率を大きく向
上させることができる。何故ならばそれら抽出はＤＮＡ
を多大な剪断力に晒し、そしてしばしば高分子量ＤＮＡ
を処理中に失われてしまうようなより小さな断片に破砕
してしまうからである。所望によっては、タンパク分解
を更に向上するために細胞溶解混合物に還元剤を添加す
ることができる。ジテオトレイトール、ジチオエリトリ
トール、システィ／およびアスコルビンｌｉｋ含む様様
な還元剤を用いることができるが、２−メルカプトエタ
ノールが好ましい。それら還元剤のいずれについても最
終濃度は、１〜１００ｍＭの範囲とすることができる。

好ましい濃度は、５ｍ１ｌである。細胞の溶解および可
溶化の両方全頁に向上させるために非プロトン溶媒を細
胞溶解混合物に添加することができる。かかる溶媒とし
ては例えばＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）お
よびスルホランと共にジメチルスルホヤシト（ＤＭ８０
）が好ましい１つである。この非プロトン溶媒の最終濃
度は、１〜５０％（ｖ／ｖ）の範囲とすることができる
。好ましい濃度は、１０４（ｖ／ｖ）である。

この時点まで依然として核酸と解合しあるいは混合物中
に存在するすべてのタンパクを一橋以上のカオトロピッ
クの添加により変性しそして核酸から解離することがで
きる。カオトロピック剤とは、タンパクおよび核酸の二
次および三次構造に変えることができる任意の物質を意
味する。このカオトロピック剤は、２本鎖ＤＮＡの変性
を回避する条件下に混合物に添加すべきである。このこ
とは、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ　）処理の温
度を約４０℃以下、好ましくは約３０℃以下とすべきで
あることを意味する。これら比較的低い温度が重要であ
るのは、２本鎖ＤＮＡは、それを安定化している結合タ
ンパクが分解され、変性されあるいはそれから解離して
しまうと熱変性に対し一段と感受性が高くなるという理
由およびカオトロピック剤は２本鎖ＤＮＡの熱的融点を
下げることができるという理由からである。約４℃とい
うような低い温度を用いることもできる。好ましいカオ
トロピック剤は塩類、例えばトリフルオロ酢酸ナトリウ
ム、過塩素酸ナトリウムおよび沃化ナトリウムなどであ
る。好ましい塩は、約０．５Ｍの最終濃度のトリフルオ
ロ酢酸ナトリウムであるが、約０．１〜約１．０Ｍの範
囲であってもよい。カオトロープ処理の持続時間は約１
〜３０分間であるが５分間が好ましい。場合によっては
、本発明方法の過程で細胞から放出される内容物が、カ
オトロピック剤添加時に細胞成分が沈殿して回収ＤＮＡ
の純度および−ｔｉｔ下ばてしまいかねないような量と
なることがある。かかる沈殿は、カオトロピック剤の添
加直前に緩衝剤例えばＴｒｉｓ緩衝剤、−８，０、また
は水を混合物に添加することによりおよび／または、よ
り少量のカオトロピック剤を用いることにより避けるこ
とができる。

この段階で、ＤＮＡは最終的精製および濃縮のための準
備が整う。これは、コロジオ／膜透析−濃縮により行う
ことができる。この透析−濃縮プロセスを開始する前に
、その濃縮プロセスがあまりに速く進みすぎて細胞成分
を沈殿させてしまうことのないように、その混合物を低
塩緩衝剤、例えば１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　１　ｍＭ
　ＥＤＴＡ　、　ｐ）１８．０などを用いて希釈するこ
とができる。所望濃度に達する前に混入物（生物の分解
生成物および本発明方法に用いられる試薬）の完全な除
去を保証するために、濃縮プロセス中に更に緩衝剤を添
加するのが望ましいこともある。この＃縮プロセスは、
好都合な容量のＤＮＡ含有溶液が残留したところで止め
ることができる。

このようにして調製されたＤＮＡは、ＵＶ分光分析によ
り示し得るように純粋である。ＤＮＡについての２６０
　ｎｍでの吸光度対２８０　ｎｍでの吸光度の比は１．
５〜２である。本発明の方法は、高い純度レベルを示す
そのような比の生成物を与える。より小でな比は、タン
パクによる汚染金子し、そしてより高い比はＤＮＡ　Ｆ
：４製物のＲＮＡ汚染を示す。

そのようにして得られる精製ＤＮＡは使用準備が整って
おり、あるいは後の使用のためにこの形で貯蔵すること
ができる。それは、その他色色な用途のある中で制限エ
ンドヌクレアーゼ消化、分子量決定およびノ・イブリダ
イゼーション分析にそのまま利用することができる。Ｄ
ＮＡクローニングまたは組換作業には更なる処理が必要
となることもめる。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例１および２に記載の方法と実質的に同じ方法によ
り、クレブシェラ・ニュモニエ（Ｋｌ　ｅ　ｂ−ｓｉｅ
ｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス
・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ）、エンテロバクタ−・エーロゲネス（ｇｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏ−ｇｅｎｅｓ）、プロテウ
ス・ミラリビス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）
、イー・コーライ（Ｅ、ｃｏｌｉ）およびスタフィロコ
ッカス・エビデルミス（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）からゲノムＤＮＡｆｔ単雌し分析
するのに成功した。

実施例　１ シュードモナス’ｚルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの細菌ゲノムＤＮＡの単離
および分析 Ａ、　　ＤＮＡ単離 シュードモナス・エルギノｆ　ＤＰ　２９５（ＡＴＣＣ
受託番号１０１４５）の細胞懸濁液を、パスツールピペ
ットを用いて通夜寒天基礎培地含有ベトリ皿上での６７
℃−夜増殖物から、まずいくつかの単一コロニーを取９
出すことにより調製した。

次に、それら細胞を、１２Ｘ７５ｍ硼珪酸ガラス製試験
管中の、１０　ｍＭ　ＮａＣＡ’および１　ｍｌＪ　Ｅ
ＤＴＡを含む１　ｍｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝削、
−８，０中で渦動することにより懸濁し混合した。その
細胞懸濁液を前述の緩衝剤を用いて希釈することによシ
、約３Ｘ１０８個細抱／−の濃度を得た。その細胞濃度
は、細胞懸濁液を１２Ｘ７５ｔｍ硼珪酸ガラス製試験管
中で、ＭｃＦａｒｌａｎｄ比濁分析計濁度標準（１）と
視覚により比較することによって測定した。次に５００
μｌのこの細胞懸濁液を以後の処理のために、別の１２
Ｘ７５絽硼珪酸ガラス製試験管に移した。

分解酵素カクテルは、水１ゴあたりリゾチーム１ｏｓｙ
ｖｔ含むもの１５０μｌ、水１ゴあたりアクロモスブチ
ダーゼ１０Ｒ９を含むもの１５０μｌ水１−あたりエン
ド−Ｎ−アセチルムラミニダーゼ１ｊｇ’を含むもの１
５０μｌを組み合わせることにより調製した。このカク
テルは一２０℃で貯蔵した。４５μｌのこのカクテルを
５００μｌの細胞懸濁液に添加した。その混合物を渦動
し、そして３７℃で１９分間インキュベートした。

この試験管に５．６μｌのＩＣｌ５ＤＳ、および水１ゴ
あたりリボヌクレアーゼｌＡ１０Ｊ９を含むもの１５μ
ｉｆ添加し、渦動し、そして６０℃で１０分間インキュ
ベートした。

その試験管に１０　ｍＭ　ＮａＣ１および１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡを含む１００μＪの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝剤
、ｐＨａ、　０を添加し、そして渦動してサンプルを希
釈した。

水１ｒＲｔ６たりプロテイナーゼに１０＃９’に含むも
の２０μｌをこの試験管に添加し、渦動し、そして６０
℃で３０分間インキュベートした。

その試験管を２０℃に冷却し、そしてそれに０．２２μ
ｍ　Ｎａ１ｇｅｎｅフィルタユニットを用いて最初に濾
過しておいた６８６μノの１Ｍトリフルオロ酢酸ナトリ
ウムを徐々に添加した。その試験管全渦動し、そして２
０℃で５分間インキュベートした。

その試験管に７５０μＥのＴＥ緩衝剤（１鯛ＥＤＴＡ　
ｉ含有する１　０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝剤、ｐＨ８，０
）？：添加し、そして渦動してサンプルを希釈した。

次にそのサンプルを透析および濃縮のためにＫＭＷから
２−容量のコロジオン膜にューハンプシャー州キーン（
Ｋｅｅｎｅ）のＳｃ、ｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅ
ｌｌから入手可能）に移した。このコロジオン膜の平均
保持分子量（ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）は
２５，０００ダルトン以上である。透析には、ＴＥ緩衝
剤を用いた。５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌ
ｌ透析・濃縮装置におけるサンプルのｒａｍを容易にす
るために、１９インチ水銀の真空を用いた。

サンプル容量が約２００μノまで減少した後に真空を解
き、そして５００μｊのＴＥ媛衝剤、ｐＨａ、。

をそのサンプルに添加し、そしてそのサンプルを２−ガ
ラスピにシト中に吸引しそしてそれをもとのコロジオン
膜に放出することにより混合した。透析物を除去し、セ
してＴＥ緩衝剤、　ｐＨａ、　０で置換した。約５０μ
ｇの最終容量となるまでそのサンプルの透析および濃縮
を再開した。次に１ｎｌ製ＤＮＡサンプルｆｔＲａ１ｎ
ｉｎ　Ｐ　−２００ビはット先端でコロジオン膜から取
り出し、そして４℃で貯蔵のため、ｔ５ｒｎｔポリプロ
ピレン％ｊ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒ　ｆ管に入れた。

Ｂ、制限エンドヌクレアーゼ消化 上で得られた約５０μノの精製ＤＮＡサンプルのうちの
２５ｔｈｌを別のｔ　５　ｍｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管
に移しそしてそれに次のもの、すなわち、６μｌの５ｘ
ＥｃｏＲＩ制限酵素緩衝剤（５０ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２．２
５０塵ＮａＣｊおよび５００　ｐｇ／／ｍｌのＢｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
から入手した牛血清アルブミンを含有する５　００　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝剤、−Ｚ５）および１　ａｌのＢｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した１００
単位／μｌ　ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを添加
した。その’ｆｆ１ｒ：ゆるく渦動し、そして３７℃で
４時間インキュベートした。７５μｌの５　Ｘ　Ｆｉｃ
ｏｌ１色素溶夜（Ｓｉｇｍａ社から入手した１　２、５
　Ｓ　Ｆｉｃｏｌｌタイプ４００−　ＤＬ　、　５０　
ｍＭ　ＥＤｒＡＯ，１３１ブロムフエノールブルーおよ
び（Ｌｌ　！１％キシレノシアツール）を添加すること
により反応を止めた。

Ｃ，アガロースゲル電気泳動 １．６９のＳｅａｋｅｍ　ＬＥアガロースを１００℃で
２０ＯＮｔのＴｒｉｓ−アセテート緩衝剤（２ｍＭ　シ
臥含有２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−アセテート緩衝剤）、Ｐ
Ｈ８，０中で融博することによ５０．８　％アガロース
ゲルを調製した。その溶融アガロースｌ５ｏｃに冷却し
そして２０クエル・くシ状物（ｖｒｅｌｌ　ｃｏｍｂ）
を有する１５Ｘ２０αＢｉｏＲａｄ’％気泳動トレーに
おいてゲルを鋳込んだ。七〇ケ゛ル？ｊ−ｘ温に冷却し
そしてそのゲル金４℃で１時間放冷した。くし状物を除
去しそしてそのゲルに１５００ｍｊのＴｒｉｓ−アセテ
ート緩衝剤、〆Ｉ８．０を用いて室温で阻０ＲＩＩ（ｌ
サブマリーン・ゲル電気泳動ユニットに入れた。３０μ
ｌのＤＮＡ−Ｆｉｃａｌ１色素含有溶液をアガロースゲ
ル中のウェルに添加した。次ニＤＮＡ　Ｆｆｒ片の′心
気泳動分離を２５０ｄ／時でユニットを循環する前記緩
衝剤を用いて１．５ボルト／ｃＩＬで１５時時間性させ
た。

Ｄ、サイズ分＠　ＤＮＡの膜支持体上への移動エレクト
ロプロッティング法を用いた。ゲル中のＤＮＡ断片をま
ずゆるく揺動させながら室温で６０分間７００ｔｆＬｔ
の０．４Ｎ水酸化ナトリウム中で変性させた。次いでそ
のゲル’に７００７！のエレクトロプロット緩衝剤（６
ｍＭ酢酸ナトリウムおよび０．３　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｆ
含有する１　２　ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝剤、ｐＨ７，５）
中で５分間処理した。変性ＤＮＡ断片のゲルから膜支持
体への電気泳動移動（エレクトロブロッティング）は、
Ｈｏｅｆｅｒ　ＴＥ　４２Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ　Ｅｌｅ
ＣｔｒＯｐｈＯｒｅＳｉＳ　Ｃｅ１ｌｉ用いて行つた。

そのゲルをエレクトロプロッティング目的に調製するた
め、Ｈｏｅｆｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ　ｃａｓｓｅｔ
ｔｅの片側を３１の室温のエレクトロプロット緩衝剤、
ｐＨ７，５を含む８１ポリプロピレントレーに漬けたＯ
そのＴｒａｎｓｐｈｏｒ　Ｃａ５ｓｅｔｔｅの内面上に
１５、５　Ｘ　２２　ａａ　Ｄａｃｒｏｎ＠ポリエステ
ル繊維スポンジ（Ｅ、Ｉ、ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅ
ｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙの登鎌商標）を置
き、そして次の材料を積層した。すなわち、１枚の１５
Ｘ２１．５αプロツタ一紙、１片のゲルと同サイズに切
断しである荷電変性ナイロン膜（Ｅ、Ｉ、ｄｕ　Ｐｏｎ
ｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙか
ら入手できるＧｅｎｅ　ＳｃｒｅｅｎＴＭＰｌｕｓ）、
前記変性ＤＮＡ断片を含むアガロースゲル、および２枚
の１５Ｘ２１５ｃｍプロッター紙。この’ｒｒａｎｓｐ
ｈｏｒＣａｓｓｅｔｔｅのアセンブリを完成させるため
に、そのＤａｃｒｏｎ■ポリエステルスポンジ／プロッ
ターｇ／アガロースゲル／プロッター紙サンドイッチを
’ｒｒａｎｓｐｈｏｒ　ｃａｓｓｅｔｔｅの両側の間に
固定し、そして５℃に冷却された４、５１のエレクトロ
プロット緩衝剤、ｐＬ！　７．５　ｉ含有するＴｒａｎ
ａｐｈｏｒＣｅｌｌに入れた。Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ　Ｃ
ｅ１ｌの作動は、次のとお９のすなわちまず１ｏボルト
で６０分間、次いで４０ボルトで６０分間という２つの
異なる電圧設定値で行った。Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ　Ｃｅ
１ｌの作動中は終始５℃の温度を維持した。次に、その
膜をＴｒａｎａｐｈｏｒ　ｃａｓｓｅｔｔｅから取ジ出
し、エレクトロプロット緩衝剤、声ｚ５中ですすぎ、そ
して室温で６０分間空気乾燥した。

ｇ、　　ＤＮＡプローブ調製 ゲノムＤＮＡのｒＲＮＡをコードする部分とハイブリダ
イズし得るＤＮＡ配列を含むことが知られているプラス
ミドＤＮＡ　（ｐＫＫ　３５３５　、　Ｂｒｏｓｉｕｓ
　ａｔａｊ、、Ｐｌａｓｍｉｄ、’Ｖｏｌｕｍｅ　６．
１１２〜１１８（１９８１）：ｌ　ｔ、ＩＩＡプローブ
として用いるために、ニックトランスレーション・キッ
ト（Ｅ、１．ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｏ　Ｎｅｍｏｕｒｓａ
ｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙから入手できる）を用いて５２ｐ
で標識した。次のものをｔ　５　ｍｌ　ｇｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ管に添加した：９ｐｌの５５０　ｐｇ／ｍｌシラス
ミドＤＮＡ　；６１μｌの水、５０μノのニックトラン
スレーション緩衝剤；４０μｌのｄＡ’ｒＰ　、　ｄＣ
）’ｒＰおよびｄ’ｒ’ｒＰを含有する溶ｇ；３ｏｏｏ
キュリー／ミリモルの比活性を有する／ミリキュリーの
５２ｐ−ｄｃＴｐ（１０゜μｅの容盆）；２０μｌのＤ
ＮＡポリメラーゼエ；および２０　ｐｉのＤＮａｓｅ−
それら内容物ｆ　Ｒａ１ｎｉｎＰ−２００ピペツト先端
中に吸引しそれらをもとの管中に放出することにより混
合した。次に、反応を１５Ｃで６０分間進行させた。６
μｊ０５００　ｍＭ　ＥＤＴＡを添加して反応を止めた
。次にＴ］４衝剤ｐｉ（ａ、　Ｏを用いた０、　７　Ｘ
　３０　ｃｍ　５ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムでのサ
イズ分離により、５２ｐ標識プローブＤＮＡ　’ｉ未取
込みデオキシヌクレオチドトリホスフェートから分離し
た。標識２本鎖ＤＮＡプローブの比活性は約３×１ｏ８
ｄｐｍ／μｇｒ：ＮＡテあった。

Ｆ、　　ＤＮＡプローブ・ハイブリダイゼーション移さ
れたＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼーション膜（前記
工程りにおいて調製）を６０℃で揺動器プラットホーム
上のシールされたプラスチックボックス中、０．５　％
　８ＤＳ　、　１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１０
Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液は、０．２１　フィコール、
０．２％ポリビニルピロリドンおよび０．２　％牛血清
アルブミン、フラクション５を含む）を含む２００ｉの
３　Ｘ　ＳＳＣ緩衝剤（３Ｘ　ＳＳＣ緩衝剤は、０、４
５　Ｍ　ＮａＣ６および０．０４５Ｍクエン酸ナトリウ
ムを含有する）中で３０分間１００μｇ７ｍｌの音波処
理された変性サケ精子ＤＮＡを用いてプレハイブリダイ
ズさせた。次にそのｆｆｆｉ”Ｐ［２ＤＮＡプローブ全
沸噂水浴中で５分間１００℃に加熱することにより変性
し、氷上で４℃に急冷し、そしてそのまｔｇ上のプレハ
イプリダイゼーショ／混合物に添加して約４Ｘ１０６ｄ
ｐｎ＆酵とした。連続的に揺動させながら、ハイブリダ
イゼーションを６０℃で２０時時間桁させた。２０時間
後、連続的に揺動させながら、６０℃で１５　％　ＢＤ
Ｓ含有３Ｘ　ＳＳＣ緩衝剤を用いて４回にわたり各１５
分間連続洗浄することにより、すべての未反応５２ｐ標
５　ＤＮＡプローブを除去した。

次にその膜を洗浄溶液から取り出し、そして室温で空気
乾燥した。

Ｇ、制限断片、長子形分析 ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限部位間に含まれるリポソ
ームＲＮＡオはロンｔＸ線フィルム上のメンブレンのオ
ートラジオグラフィによりｔｌｌ＆ハイブリッド全可視
化することによシ検出した。フェノール／クロロホルム
抽出オヨヒアルコール沈、殿を用いたＤｅ　Ｋｌｏｗｅ
ｔのＤＮＡ単；堆力法を用いることによシ既に得られて
いるのと同じ断片ナイズおよび断片数が７ユードモナス
・エルギノザ細几包より観察された。

実施例　２ ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）からの細菌ゲノムＤＮＡ
の単離と分析Ａ、　　ＤＮＡ単離 ストレプトコッカス・フェカリスＤＰ　２８３（ＡＴＣ
Ｃ受託番号１９４３３　）の細胞懸濁液全、バスツール
ビはットを用いて血液寒天基礎培地含有ベトリ皿上での
３７℃−夜増殖物から、まずいくつかの単一コロニーを
取り出すことにより調製した。次に、それら細胞全１２
Ｘ７５ｙ＋ｍ硼珪酸ガラス製試験管中の１０　ｍＭ　Ｎ
ａＣＪおよび１　ｍＭＥＤＴＡ　ｅ含む１−の１０　ｍ
ｋｆ　Ｔｒｉｓ緩衝剤、Ｐｉ（８，ＣＩ中で渦動するこ
とにより懸濁し混合した。七の細、ｌ＠懸濁液を前述の
緩衝剤を用いて希釈することにより約６×１０８個細胞
／−の濃度を得た。その細胞濃度は、細胞懸濁液を１２
Ｘ７５ｓｎ硼珪酸ガラス製試験管中で、ＭｃＦａｒｌａ
ｎｄ比濁分析計濁度標準（２）と視覚により比較するこ
とによって測定した。次に５００μ！のこの細胞懸濁液
を、以後の処理のために別の１２Ｘ７５ｍ硼珪酸ガラス
製試験管に移した。

４５μｊの実施例１　（Ａ）で調製された分解醪素カク
テルを５００μｌの細胞懸濁液に添加した。その混合物
を渦動し、そして３７℃で１０分間インキュベートした
。

この試験管に５．６μノの１０チＳＤＳを添加し、渦動
しそして６０℃で１０分間インキュベートした。

その試験管に水１−ｎｔ４たり１０ｊ１ｇのりボヌクレ
アーゼエＡを含むもの１５μｌを添加し、渦動しそして
６０℃で１０分間インキュベートした。

その試験管に１０　ｍＭ　ＮａＣＪおよび１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡを含む１００μＪの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝剤
、ｍ　８．０を添加し、そして渦動してサンプルを希釈
した。

水１ｒＲｔあた。Ｄ　１０　ＱのプロテイナーゼＫ′ｆ
ｒ：含むもの２０μｌをこの試験管に添加し、渦動し、
そして６０℃で３０分間インキュベートした。

その試験管ｆｔ２０℃に冷却し、そしてそれにＣＬ　２
２　μｍ　Ｎａ１ｇｅｎｅフィルタユニットを用（１て
最初に濾過しておいた６８６μ１０１Ｍトリフルオロ酢
酸ナトリウムを徐々に添加した。その試験管を渦動し、
そして２０℃で５分間インキュベートした。

その試験管に７５０μｌのＴＥ緩衝剤を添加しそして渦
動してサンプル全希釈した。

次にそのサンプルを透析および濃縮のために試験管から
８Ｗｔｔ容量の５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅ
ｌｌコロジオン膜（平均保持分子量は７５，０００ダル
トン以上である）に移した。透析には、ＴＥ緩衝剤、ｐ
Ｈｓ、　Ｏを用いた。５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃ
ｈｕｅｌｌ平底装置におけるサンプルの濃縮を容易にす
るために、１９インチ水銀の真空を用いた。装置内側に
磁気撹拌棒を用いてこのプロセスにおける透析緩衝剤の
混合を容易にした。

サンプル容量が約２００μｌまで減少した後に真空を解
き、そして５００μｌのＴｇ緩衝剤、ｐＨ８，０をその
サンプルに添加し、そしてそのサンプルを２−ガラスピ
ペット中に吸引しそしてそれをもとのコロジオン膜に放
出することにより混合した。更に透析液を除去し、そし
てＴＥ緩衝剤、ｐＨｓ、　Ｏで置換した。約５０μｌの
最終容量となるまでそのサンプルの透析および濃縮を再
開した。

次に！ｆＩｆｉＤＮＡサンプルｆ　Ｒａ１ｎｉｎ　Ｐ−
２００ピペツト先端でコロジオン膜から取り出し、そし
て４℃で貯蔵のため、１．５−ポリプロピレン製Ｅｐｐ
ｅｎｄｏｒ　ｆ管に入れた。

工程（Ｂ）から（Ｆ５までは実施例１（Ｂ）から（ｙ）
の記載と同様にして行った。

Ｇ、制限断片長多形分析 ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限部位間に含まれるリポソ
ームＲＮＡオペロンをＸ線フィルム上のメンブレンのオ
ートラジオグラフィにより標識ハイブリッドを可視化す
ることにより検出した。フェノール／クロロホルム抽出
およびアルコール沈殿を用いたＤｏ　ＫｌｏｗｅｔのＤ
ＮＡ単離方法を用いることにより既に得られているのと
同じ断片サイズおよび断片数が観察された。

実施例　３ 細菌ＤＮＡの単離および分析 Ａ、　　ＤＮＡ単離 プラスミドｐＫＫ　５５３５を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉ−ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ、　１２株ＬＭ１０３
５の未増幅（ｕｎａｍｐｌｉ−ｆｉｅｄ）細胞懸濁’Ｑ
　（Ｂｒｏｓｉｕｓ　ａｔ　ａｌ、Ｐｌａｓｍｉｄ。

Ｖｏｌｕｍｅ　６．１１２〜１１８（１９８１））　’
Ｉ：パスツールビはットを用いて１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン含有トリブチカーゼ犬豆寒天（ｔｒｙｐｔｉｃ
ａｓｅ　ｓａｙ　ａｇａｒ）を含むベトリ皿上での３７
℃−夜増殖物から、まずいくつかの単一コロニーを取り
出すことにより調製した。次にそれら細胞を１２Ｘ７５
ｍｍ硼珪酸ガラス製試験管中の、１０　ｍＭ　ＮａＣ１
および１ｍＭ　ＥＤＴＡ’を含む１ｒｎｔの１０　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ緩衝剤、−８，０中で渦動することにより懸
濁し混合した。

その細胞懸濁液を前述の緩衝剤を用いて希釈すること罠
より約３Ｘ１０８個ｍｍＡｄの濃度を得た。

その細胞濃度は細胞懸濁液を１２Ｘ７５ｍ＋硼珪酸ガラ
ス製試験管中でＭｃＦａｒｌａｎｄ比濁分析計濁度標準
（１）と視覚により比較することによって測定した。次
に５００μ！のこの細胞！濁ｇＸヲ以後の処理のために
、別の１２Ｘ７５！ｍ硼珪酸ガラス裂試験管に移した。

４５μｌの実施例１（Ａ）でＪＡ′ＸＭされた分解酵素
カクテルを試験管中の５００μｇの細胞懸濁液に添加し
た。その混合物を渦動し、そして′５７℃で１０分間イ
ンキュベートした。

この試験管に５．６μノの１０　％　ＳＤＳおよび水１
−あたり１０叩のりボヌクレオーゼＩＡを含むもの１５
μｌを添加し、渦動しそして６０Ｃで１０分間インキュ
ベートした。

その試験管に、１０　ｍＭ　ＮａＣｌおよび１　ｍＭ　
Ｅ［７ｒＡを含む１００μＪの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩
ｆ＃剤、ｐＨｓ、　０を添加しそして渦動してサンプル
を希釈した。

水１−あたり１０］９のプロテイナーゼＫを含むもの２
０μ！をこの試験管に添加し、渦動し、そして６０℃で
３０分間インキュベートした。

その試験管を２０℃に冷却し、そしてそれにＱ、２２μ
ｍ　Ｎａ１ｇｅｎｅフィルタユニットを用いて最初にｐ
遇しておいた６８６μｌのＩＭ　）リフルオロ酢酸ナト
リウムを徐々に添加した。その試験管を渦動し、そして
２０℃で５分間インキュベートした。

その試験管に７５０μ！のＴＩ緩衝剤を添加しそして渦
動してす：／プルを希釈した。

次にそのサンプルを透析および濃縮のために試験管から
８４容量の５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ｌａ　５ｃｈｕｅｌ
ｌコロジオン膜に移した。コロジオン膜の平均保持分子
量は、７５，０００ダルトン以上であった。

透析にはＴＥ緩衝剤ｐＨｓ、　Ｏ’に用いた。５ｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ＆　５ｃｈｕｅｌｌ平底装置におけるサン
プルの濃縮全容易にするために、１９インチ水銀の真空
を用いた。

サンプル容量が約２００μｇ−１で減少した後に真空を
解き、そして５００μノのＴＥ緩衝剤、−８，０、をそ
のサンプルに添加し、そしてそのサンプルを２−ガラス
ピはシト中に吸引しそしてそれをもとのコロジオン膜に
放出することにより混合した。更に、透析物を除去しそ
してＴＥ緩衝剤、ｐ）Ｉ　ｓ、　Ｏで置換した。約５０
μｊの最終容量となるまでそのサンプルの透析および濃
縮を再開した。

次にそのようにして得られた精製ＤＮＡサンプルｆ　Ｒ
ａ１ｎｉｎ　Ｐ−２００ピはット先端でコロジオン膜か
ら取り出し、そして４℃で貯蔵のため、１．５−ポリプ
ロピレン製Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れた。

Ｂ、アガロースゲル電気泳動 実施例１（Ｂ）に記載の方法に次の改変を加えて電気泳
動を行った： Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中の２５ｔｔｌのｎＩ製ＤＮＡサ
ンプルに６　ｔｔｌの５Ｘ　Ｆｉｃｏｌ１色累溶液（Ｓ
　ｉ　ｇｍａ社から入手した１２．５％Ｆｉｃｏｌｌタ
イプ４００−　ＤＬ、　５０ｍＭ　ロス０．１３％ブロ
ムフェノールブルーおよヒ０．１３チキンレンンアノー
ル）を添加した。次に３０μｌのＤＮＡ　−フィコール
色素含有溶液全アガロースゲル中の９エルに添加した。

次に緩衝剤としてユニットを２５０．１Ｍ時で循環させ
ながらＤＮＡの電気泳動分離″ｆ：３ボルト／ｃＩＩＬ
で２時間進行させた。

Ｃ，プラスミドＤＮＡ検出 大９ｔｍ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）中のプラスミドＤＮＡの存
在はゲルを紫外光（３０２ｎｍ）にｔｔＳ露することに
よりまた核酸の螢光を観察することにより確認された。

プラスミドｐＫＫ　５５３５の存在証明は、螢光性核酸
を写真に取り、そしてそのプラスミドの分子量に相当す
るバンド全観察することにより得られた。この実施例３
の結果は、本発明の方法がインタクトなプラスミドＤＮ
Ａの単離にも有用であることを実証している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）高分子量核酸をそれらの源生物から単離する方法で
   あって、 （Ａ）所望の核酸を含む、あるいは含むと思われる前記
   生物の懸濁液を形成させ； （Ｂ）該生物を少くとも一種の分解酵素で処理し； （Ｃ）該生物を工程（Ｂ）の前に、工程（Ｂ）と同時に
   、または工程（Ｂ）の後で、界面活性剤で処理し；（Ｄ
   ）所望しない種類の核酸を、それら所望しない核酸に対
   し特異的なヌクレアーゼで処理することにより分解し； （Ｅ）タンパクを少くとも一種の広域活性プロテアーゼ
   で消化することにより分解し； （Ｆ）少くとも一種のカオトロピック剤を添加すること
   により残留タンパクを変性し、そしてそれらを核酸から
   解離させ；そして （Ｇ）核酸を透析しそして濃縮する、 工程より成る前記方法。 ２）源生物が細胞、ウィルスおよびマイコプラズマより
   成る群より選択される特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３）前記細胞が微生物である特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ４）前記生物の懸濁液が分解酵素の混合物で処理される
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）分解酵素の混合物がリゾチーム、エンド−Ｎ−アセ
   チルムラミニダーゼおよびアクロモペプチダーゼより成
   る特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６）ヌクレアーゼがＲＮａｓｅである特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ７）ヌクレアーゼがＤＮａｓｅである特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ８）カオトロピック剤がトリフルオロ酢酸ナトリウム、
   過塩素酸ナトリウムおよび沃化ナトリウムより成る群よ
   り選択される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９）高分子量ＤＮＡを細胞またはウィルスより単離する
   方法であって、 （Ａ）所望のＤＮＡを含む、あるいは含むと思われる前
   記細胞またはウィルスの懸濁液を形成させ； （Ｂ）該細胞またはウィルスを、リゾチーム、エンド−
   Ｎ−アセチルムラミニダーゼおよびアクロモペプチダー
   ゼより成る分解酵素で処理し； （Ｃ）該細胞またはウィルスをドデシル硫酸ナトリウム
   で処理し； （Ｄ）該細胞またはウィルスよりのＲＮＡをＲＮａｓｅ
   で分解し； （Ｅ）タンパクをプロテイナーゼＫで消化することによ
   り分解し； （Ｆ）カオトロピック塩を添加することにより残留タン
   パクを変性しそしてそれらをＤＮＡから解離し；そして （Ｇ）ＤＮＡを透析しそして濃縮する、 工程より成る前記方法。