JPS63502112A - メルファラン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 メルフアラン誘導体 本発明はメルフアラン誘導体に関する。

構造式は添附図面に記載する。

本発明は式！ 〔式中Ｒ１は式■ Ｃ式中Ｒ４及びＲ５は同−又は異っていてよく、ブロム、クロル、゛ヨード又は アルキルスルホニル勿示す。） Ｒ茸　は弐■ （式中Ｒ，及びＲ，ｄ同−又は異っていてよく、Ｒ１アルキル、アリール、カル ボキシ、ヒドロキシ又はアミノであり、ｎは０−１０である。） であり、 Ｒ１はヒドロキシ又は抗１ｊＣｔ−結合する部位を有する残基によって離脱する か又はこの残基によって置き代えられる基であり、ちるいはＲ１は抗＠を結合す る部位を有する残基である。〕なる化合物を提供する。

好ましいアルキル基は８個又はそれより少ない炭素原子を有するものである。好 ましいアリール残基は１２個又はそれより少ない炭素原子を有するものでろる。

Ｒ１基はオルト−、メタ−又はバラ−位にらるこ式■の化合物は式中−Ｒ１が抗 体によって離脱するか又はこれで置き代えられる基でちる化合物が好ましい。

この様な−Ｒ１として隣接−〇〇−基と共に活性エステル基となるものが挙げら れる。Ｒ，として特別な基はＮ−ヒドロキシサクシンイミドである。他のＲ，基 は混合無水物、Ｎ−ヒドロキシスルホサクシンイミド、アジド及びｐ−ニトロフ ェニルエステルである。

Ｒ，は抗体であるのが有利である。

抗体はモノクロナール抗体である。本発明に於て有用な抗体は胸、脳、色素細胞 腫、肺、すい臓及び結腸膿瘍ＶＣ％異性を示すものである。

抗体は完全な免疫グロブリン又は抗１１１結合するたとえばそれは非連偏細胞と 比べて選択的に１１４４細胞によって吸収される。

まだ更に抗体ポリマー、たとえば抗体ベンタメアエＥＭ及びこ１らの誘導体、た とえば免疫グロブリンモノマーを使用することができる。

■ｇｃｔａ、工ｇａ冨ｂ、工ｇＧｔ、及び工ｇＧｍ　も使用可能である。

式１、■及び■の化合物は不活性キャリヤー分子、たとえばヒト血清アルブミン 又は合成ポリマーを介してモノクロナール抗体に間接的に結合する。

本発明の化合物は薬学的に妥当なキャリヤーと混合してよい。

本発明の化合物の投与形態は選択される。特に本発明の化合物を静脈内、腹腔内 、胸膜内、心膜内に及び脳内髄液に投与することができる。

本発明による化合物は、メルフアラン’ｉ−Ｒ，−００−基を有するアシル化化 合物でアシル化して式■の化合物となすことによって製造することができる。

式Ｖの化合物を基Ｒｓ　ｋ有する化合物と反応させる。この基は抗体残基によっ て離脱し、こめ残基によって置き代えられる。

本発明はＲ１が抗体、Ｒ１ｅ　Ｒ，及びＲ４−７が上述の意味を有する上記式Ｉ の化合物及び薬学的に妥当な希釈剤から成る薬理学的組取物も提供する。

Ｒ３が抗体である本発明の化合物はｍｆｓ治療に有メルフアラン（ＭＫＬ）は芳 香族アルキル化剤であり、これはフェニルアラニンからこれを誘導することによ って細胞にアミノ酸輸送システムで入り込む。本発明の化合物は、腫瘍細胞を標 的するために製造されたメルフアランの特定の誘導体である。

ＭＢＬのアミノ基をアシル化することによって、Ｎ−アシル誘導体を合成し、こ れは試験管内で腫瘍細胞に対してＭＥＬよりも１００倍低い毒性を示す。

次いでＮ−アシルメルフアランの活性エステル（ＮａＭ　）　ｆモノクロナール 抗体（ｕｏＡｂθ）と反応させて、マウスＬｙ　−２，１同種抗原のヒトトラン スフェリンレセプター（ＴＦＲ）となす。これら双方は内部移行するらしい。Ｎ ａＭの３０分子までが特異的にアルキル化活性を維持し、抗体活性に於て最小の 損失を示す。抱合体の試験管内細胞毒性を、腫瘍細胞への（”Ｈ）−チミジン導 入阻害によってテストする。これは抱合体が遊離ＮａＭよりも１０−２５倍以上 の活性を有する抗体反応性細胞系に対して特異的ＭｏＡｂ抱合体でマウス胸腺＠ を有するマウスを生体内処理することは、ＮａＭ％Ｍ］ｌ：Ｌ又は抗体単独で得 られるよりも生存を延ばし、既成の皮下腫瘍の生長をより一層大きく阻害する。

生体内の研究は、静脈内又はｍ瘍内投与ともに皮下腫瘍の腸腔内処理よりも有効 であることも示す。

不発明に於て使用される好ましい処理を下記に詳述する。

本発明の好ましい方法は、活性エステルを介してＭＫＬのトーアシル誘導体′に ＭｏＡｂｓ　ｆ（結合することを必要とする。それによって特異的に標的細胞に 薬品が導かれ、一方遊離の薬品を汚染するためいくら性についてテストする。

材料及び方法 （９）、Ｅｌ　マウス胸腺腫工Ｔ　Ｔ　（１）７５　Ｎ　Ｓのり生仔牛血清〔フ ロー（、Ｆ’ｌｏｗ　”）　研究所、オーストラリア〕、２　ｍＭ　グルタミン （連邦血清研究所、Ｃ８Ｌ、メルボルン、オーストラリア〕が補充されている。

細胞系ＯＥＭを同一添加物を有するＲＰＭ工１６４０中で保持する。生体内実験 ムにあたり、毛。

シ ＶＯ５７Ｅ　Ｌ　／　６　Ｘ　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ！　）　ＰＨ、ＣＢＦＫ ）　？遠心分離しく１，５００ＲＰＭＸＳ分）、ミ寥寥キ王脹とニＯＢＦ、マウ スに皮下（Ｓ、Ｃ，）又は腹腔内（ｉ、ｐ、）・注射する。

の病理学部で飼胃する。

モノクロナール抗体：　ＭＯＡｂａ　ｆ上記学部で製造し、同定する：（ｌ）マ ウスＩＪ７−２．１　特異性（７）と反応する抗−Ｌｙ−２，１：　及び（ｉＤ ヒトトランスフェリンレセプター（Ｔ　Ｆ　Ｒ）　（Ｉ［）と反応するＡ３０Ｂ （抗ＴＦＲ）。

ＭｏＡｂａ　’Ｊｚ腹水液から４０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、ＰＢＳ中に 溶解し、同一緩衝液で透析して単離する。この粗製沈殿物をプロティン−Ａセン アロース（メルフシア）に吸収し、ＰＥ８（ｐＨ７，３）′で十分に洗滌し、α ２Ｍグリシン／ｍａｔ　（ｐＨ２，８）で溶離するか又はアフィゲルブルー（Ａ １１１ｇ８１オーストラリア）を通過させ、ＰＢＳで溶離する。

グロブリン（８ＡＭＧ　）でロゼツテイング（Ｒｏｓｅ−ｔｔｔｎｇ　’）　し て測定する（１２）。

Ｎ−アセチルメルフアランの製造：　乾燥ジメチルホルムアミド（Ｄｍｐ）Ｃ１ ，５ｔｎｔ）中にＭＩＬ（２００〜）を有する懸濁液を無水酢酸（８８マクロー ル）で処理し、１時間攪拌し、無水酢酸のもう一部（８８マクロール）を便に３ 時間かけて加え、澄明な溶液が得られる。次いで反応混合物を水田に注ぎ、ジク ロロメタンで抽出する。ジクロロメタン抽出物を水洗し、次いで、無水硫酸ナト リウムで乾燥する。ジクロロメタンの蒸発は油を生じる。これをエーテルで粉に つぶし、生じる固体（８２％収率）をジクロロメタン／エーテルを用いて再結晶 する。

クロロホルム：メタノール（２：１）を用いてシリカゲルプレート（ＤＣ−プラ スチックトレインシリカゲル６０１２８４、メルク）上での薄層クロマトグラフ ィー分析によれば、純粋なサンプルの証明となるＲｆ　＝１３５　でただ１つの スポラトラ示す。

抱合体の調製及び定量：　ＮａＭの活性エステルをＮａＭ５０１９ｔ”ＤＭＦｌ 　ｏｏママクロール中溶解して製造し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨ８ ゜２００マクロ一ルＤＭＩＰ中に２．２ｑ）を加え、次いでＮ、Ｎ−ジシクロへ キシルカルボジイミド（ＤＭＩＦ２００マクロール五８岬）を添加する。反応混 合物を室温で１時間、４℃で１８時間放置し、使用しないならば４週間後廃棄す る。ＤＭＦ中にＮａＭ活性エステル（１，４−７，０ｍｍｐｏｌｅ　）　を有す る溶液（１０〜５０マクロール）を精製された七ノクロナール抗体親和力１５〜 ２．０ｑを有する溶液に加え、混合物１ｔ１時間、室温で反応させ、沈殿したプ ロティンを遠心分離によって分離する。ＮａＭ及びその他の未反応の原料を、セ ファデックス（５ｅｐｈａａｅｘ　）Ｇ　−２５カラ、ム（ＦＤ−１ｏ、ファル マシア）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーで分離する。薬品−ＭＯムｂ抱合 体中に導入されたＮａＭを２５８　ｎｍ　（Ｅｚｓｓ　＝　ＩＸ　１０’　Ｍ− ｍ−”　）で吸収スペクトロメトリーで測定する。この測定は、ブラットフオー ドダイーノくインディング（Ｂｒａｄｆｏｒａ　Ｄｙｅ−Ｅｉｎａｉｎｇ）　検 定（１）によってＮａＭｅ評価して、プロティンの寄与を控除した後に行われる 。抱合体のアルキル化活性度をエプスタイン（Ｅｐｓｔａｉｎ　）法（３）の変 法で測定する。非共有抱合体についてｉｊＤＭＩＦ中にＮａＭ　（１，４−７， ０ミリモル）ｔ−有する溶液（１０−５０マクロール）＋ｉ　ＭＯＡｌ）と混合 し、非共有的に会合する（！ＢＬ−ＭｏＡｂ錯体を生じる。この錯体ｔ−ＦＤ− １０ゲルｐ過によって精製する。

体抱合体の抗体活性を測定するのに使用し、これをカンプリング法で使用される 同一処理？行った抗体の活性と比較する。

めに行う−これらは薬品−抗体抱合体が細胞に接触している時間で異なる。

に加え、１時間５７℃で培養する。遊離薬品（α５Ｍ　１ａＨＯＯ１ｆ溶解して 調製）及び薬品−抗体抱合体ｆ！：０．２２μμ小孔フイルターを通してｐ遇し 、無で７％ＣＯ，雰囲気中で２４時間培養する。

（ｂ）３ｏ分検定：　細胞（２−５Ｘ１０・／　ｗｌ　）　２００マクロールを 無菌プラスチック遠心分離管中に集め、無菌の薬品又は抱合体中に再懸濁し、３ ０分間３７℃で混合する。細胞を遠心分離（１５００ＲＰＭＸＳ分）し、次いで 生長培地に再悪濁する。細胞１００マクロールを複製壁／サンプルを用いてマイ クロ力価プレート中にまき、１８−２４時間培養する。複製サンプルは選択され た夫々の濃度で調製される。

更にまた２つの検定を、ｌＪａＭ　−ＭｏＡ’ｂ　抱合体の特異性を証明するた めに行う。

（ａ）遊１％ｉｉＭｏＡｂによる阻害−細胞を抱合体の添加前に遊離ＭｏＡｂで 前以って培養し、洗滌前のすべての段階を４℃で行う以外は（上記）３０分検定 と同様に行う。

（ｂ）　Ｌ−ロイシンによる阻害−細胞をＬ−ロイシン１ｍＭの存在又は不在下 で２４時間かけて培養する以外Ｆｉ（上記）２４時間検定と同様に行う。

培養期間後、検定のすべてに（ＩＢ）チミジンの１マクロールを含有する培地５ ０マクロール（特異的活性＝　５　Ｃ１／ｍｍｏ’ｌ　：　Ａｍｅｒｓｈａｍ　 ）　’ｉ加え、プレートを２４時間培養する０次いで細胞を細胞採取器を用いて ガラスフィルターペーパー上に採取する。１０分間、８０℃で乾燥し、個々のサ ンプルを分離し、β−シンチレーションカウンターで数える。（！Ｅ）−チミジ ンの導入をコントロールの導入に於ける百実貌上のポイントに対し５％を越えな い。

生体内実験 （ａ）生存研究：　膿瘍細胞をマウスに腹腔内注射し、６時間後一連の腹腔内処 理を開始する。夫々のグループ、中、マウスの百分率を時間の関数としてプロッ トする。

（１＋）膿瘍生長＝（ｉ）腫瘍細胞をマウスの腹壁に皮下注射し、処置を開始す る前に触知できる腫瘍に発育する。次いでマウスに一連の腹腔内処理を行い、護 蕩のサイズをカリバースクエアー（ｃａｌｉｐｅｒ　５ｑｕａｒｅ　）で毎日測 定し、それは腫瘍の垂直軸に沿って測る：データを平均膿瘍サイズとして記録す る（２つの直径上標準誤差の生成物）。マウス８−１０匹の実験グループ、同一 の性及び年令のすべてを夫々の実験に使用する：又は（１１）腫瘍細胞ｔ−腹壁 に皮下注射し、ｆｉｌｌが発育して触知できた時処理を開始する：（ｉＩｉ）個 々のマウスをその夫々の腫瘍生長進行について監視する＝（■）処理剤ｔ−腫瘍 内（１，１，）及び静脈内（ｉ、ｖ、）に投与する。

（ｃ）　ｌｌ性：　急性前件試験に関して０１１７９７５匹のグループに種々の 薬用量のＭＫＬ％ＮａＭ又ＦｉＮａＭ−ＭｏＡｂ　抱合体を有する単一注射を行 う。結果ｔ”ｑ／ｋｇで表わされる薬用量に対するマウスの生存率係としてプロ ットする。

結果 これらの研究はメルフアランのＮ−アセチル誘導体がＭｏＡｂｓに、その薬品及 び抗体活性を維持しながら結合することを証明するためのものでろる。ＥＭｉ点 で特徴的な特異的毒性抱合体を、その生体内阻害活性に関して血清及び充実性腫 瘍モデルともに試験した。

Ｎ−アセチルメルフアランの抗体への結合：　ＭｏＡｂｓ。

Ｔｈｙ　−２，１及び抗−ＴＩＲ’ｉ種々の故の活性エステル（材料及び方法） と反応させて、結合された県品、の量が変化した抱合体を生じる。ＮａＭの３０ 分子までプロティンの良好な修復と結合することができるが、３ｏ−３５分子ｔ Ｓえるとプロティン溶解反の損失による洗穀が生じる（第１．２図）。

ＮａＭ活性エステル７０ｎモルの抗−Ｌｙ−２，１５な結果がＮａＭの活性エス テルを抗−ＴＦＲｉＣ！！３合した場合に得られる（第２図）。かくて有利な結 合の分子らたり導入されたＮａＭ　１０−３０分子の間にろる。ＮａＭ抱合体の アルキル化活ｉｔ−決定するためにエプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ　）法を用い た場合、アルキル化活性の〉９０％を抱合体上に維持すること七見い出した。し たがって多量のＮａＭ　ｆ　ＭＯＡｂｓにプロティンの僅かな損失で共有結合す ることができる。−抱合前及びその後の抗体力価をロゼッティング法（第３図） によって測定し、Ｂ３の５０％希釈で希釈度として及びＣＫＭｉ的細胞全細胞す ロゼツトとして測定する。ＮａＭ　１０及び２５分子を含有する抗−Ｌ７−２． １　抱合体は夫々１：４５，０００及び１：２０、ＯＯＯの抗体力価を有する。

一方抱合されていない抗−Ｌｙ　−２，ｊ　力価け１ニア５，０００でろる。

活性のより良い維持を示すならば、１０及び５０分子を含有する抗−ＴＩＦＲ抱 合体は夫々１　：　６Ｌ１０００及び１：５２，０００の力価を有する。一方抱 合されていない抗−ＴＦＲ力価は１　ニア５，０００でらる（データは示されな い。）。非共有ＮａＭ　−ＭｏＡｂ　抱合体は、共有ＮａＭ　−ＭｏＡｂ　抱合 体に極めて類似の力価を有する（データは示されない。）。したがって抱合体処 理によって明らかに抗体活性の僅かな損失がある。しかし共有結合した・抗体の 力価は、次の実抗Ｌｙ−２，１及び抗−ＴＦＲ双方の細胞再往を夫々Ｌ７　２” Ｋ３及びＴＦＦｌ”ＯＥＭ　！８胞上でテストし、遊離ＮａＭ又は当該抗体に非 共有結合したＮａＭの細胞毒性と比較する。共有結合した薬品の細胞徴活性を遊 離１ｉａＭの活性以上にかなり増加し及び遊離ＭＥＩ。

に比して低いｉｆＥ胞男性を示す（第４，５図）ことが２つの場合から明白でろ る。たとえばＣ”Ｅ）チミジン導入に於ける５０％“阻害は、遊離ＮａＭに対し て２．５Ｘ１０”−４Ｍ（活性度で２５倍増加）及び遊離ＭＥＬに対して五１Ｘ １０−６Ｍ（活性度で６倍減少）に比して抗−ＴＦＲ抱今に対して９．５　Ｘ　 １０−’Ｍで生じる（第５図）。同時に（”Ｈ）チミジン導入に於ける５０％阻 害は、遊離ＮａＭに対して７．５　Ｘ　Ｉ　Ｑ　５に比して抗−Ｌｙ　−２，１ 抱合体に対して７．５　Ｘ　１０１Ｍで生じる。これはすなわちＮａＭが特異的 にＥ３細胞を標的とした場合、活性度な１０倍増加する（第４図）。２つの実験 を対比することによって、非共作用を標的細胞上で補体９不在下に有しないこと は注目すべきである。

特異的細胞毒性：　標的細胞上での阻害効果が特異的であることを示さねばなら ない。

４つの処理を行う。

（ａ）５０分検定を次のことを証明するために行う。

それは抱合体が特異的に結合する標的Ｐ３胞の結果として抗原を結合する部位で 細胞毒性であることである。抗体反応性及び非−反応性細胞系をこの場合に使用 する：抗−Ｌ７−２．　ｊ　抱合体は抗体反応性細胞系、Ｅ３を結合し、３０分 露光後にこれらの細胞上にその細胞毒性を及ぼすことを示す（第６図）。この場 合（ｓＨ）−チミジン導入での５０％阻害は、遊離ＮａＭに対する１０Ｘ１０’ に比してＡ　２　Ｘ　Ｉ　Ｑ−ＳＭで生じる。この阻害が抗体の特異的結合に起 因するかどうかを決定するために、Ｌ７−２−細胞系、ＢＷ５１４７０Ｕ−を使 用する。ＢＷ５１４７０Ｕ−細胞系はＥ３よりもＮａＭに対して３倍敏感である 。しかし比較してみると抗−Ｌ７−２．１　抱合体は１７−２−ＢＷ５１４７０ Ｕ−細胞系の最小阻害？示す。

この検定は、２つのＴＩＦＲＯＩＣＭとＴ　Ｆ　Ｒ−１３細胞系に対する抗−Ｔ ＩＦＲ抱合体に関しても行われる（第７図）。抗−ＴＦＲ抱合体ｉｊＯＫＭ細胞 への（”Ｈ）チミジン導入に於て遊離ＮａＭに対する五〇×１０−４ＭＫ比１． てａＯＸｌｏ−’Ｍ（Ｄ濃１ｆｉ−？’５０％阻害をもたらす。再匿、非反応゛ 性Ｅ３細胞系の非阻害′を同一モル濃度範囲で観察する。

（ｂ）２つのモデルに関して、付加的な実験を非特異釣魚の制御として負のｌＪ ａＭ　−ＭＯＡＩ）　抱合体を用いて行う。たとえば２つの抗−Ｌｙ　−２，１ と抗−ＴＩＦＲ抱合体ｆｔＬｙ−２”Ｅ３細胞系に対してテストし、抗−ＴＰＲ 抱合体がＥ３細胞系の非阻害を証明する（データは示されない。）。同様にＴＩ ＦＲ０１Ｍ細胞系に対してテストした場合、抗−”７−１１　抱合は非細胞毒性 を示す（データは示されない。）。

＜ｃ）標的細胞へのｌＩａＭ　−ＭｏＡ′ｂ　抱合体の結合は特異的であり、こ れが抗体結合部位に生じることをより一層保証するために、抱合体の結合を遊離 抗体によって４℃で阻害する研究を行う。５Ｘ１０−ｓＭのＮａＭ濃度（１５マ イクロ？抗−Ｉ、ｙ　−２，１’）　−（１０マイクロｔは飽和する。）で］ｌ ｃ３標的細胞上の抗−１００マイクロｆの添加に対して８０％まで減少する（第 ８図）。同様に抗−ＴＦＲ１００ｆｆイクｏｆの添加はＯＦｉＭ標的細胞上での 抗−ＴνＲ抱合体の細胞毒性に同等の減少？生じる（データは示されない。）。

これはＮａＭ　−ＭｏＡ′ｂ　の細胞毒性が抗体結合能に直接関係することを明 らかに示す。

（（転）　ＭＫＬはアミノ酸転送系によって活性キャリヤーを媒介して吸収され ることは公知であり、Ｌ−ロイシン、競合阻害剤と共に培養した場合、０１Ｍ細 胞上での細胞毒性活性に２５〜４０％の減少が濃度範囲（１０−ｓ〜１０−’　 Ｍ　）にわたって観察される（第９図）。しかしＬ−ロイシンの同一濃度はＯＦ ｉＭ細胞上でのＮａＭ及びｋｌａＭ−抗−ＴＩＰＲの細胞毒性作用を減少するこ とができない。これはＮａＭとＮａＭ　−抗−ＴＦＲともにＭＢＬに対する異な るメカニズムによって０１Ｍ細胞に入ること、前者は恐らく受身拡散によって、 後者はＴＩＦＲレセプターによって入（１）のＦ！５変種を用いて行われ、この 腺腫は生体内で２４時間より少ない倍加時間を有する、急激に増殖する腫瘍であ る。

（ａ）生存研究：　ＣＢＦＩ　マウスのグループに５Ｘ１０’Ｂ３腫瘍細胞を腹 腔内注射する。腫瘍接種４時間後、マウスに次の処置の１つを行う：　（１）　 Ｐ　Ｂ　８　；　（ｉｉ）遊ｌ１Ｍ　Ｂ　ＩＪ　；　Ｇ１１）遊離ＮａＭ　；　 ４Ｖ）抗−Ｉ、７−２．１　とＭａＭとの非共有抱合体；及び（ｖ）抗−Ｌｙ　 ７　Ｚ　１　抱合体。夫々の試剤を腫瘍接種後１日目で更に投与し、注射あたり 受け入れられるＮａＭ又はＭＫＩＪ及び抗体の平均量は夫々１５マイクロ？及び １５０マイクロ？であり、抗−Ｌｙ　−１１抱合体で処理されたマウスの１グル ープにあっては夫々７．５マイクロ？及び７５マイクロ？しか受け入れられない 。抗−Ｌｙ　−２，１で処理されたマウスは注射あたり７５マイクロｔしか受け 入れないことに注目しなければならず、この薬用量ｉＪＲａＭに抱合し九場合、 抗−Ｌｙ　−２，１がその活性の５０係を失うという事実を訂正させる。ＰＢＳ 処理されたマウスは２５日の生存期間を有し、一方ＮａＭ　ｌ、か受け入れてい ないもう１つのグループは腫腸接種３０日以内に死亡する（第１０図）。共有結 合したＮａＭ−抗−Ｌｙ−２，１３０マイクロ？で処理されたマウスの９ｏ％と 抱合体１５マイクロ？又はＭＫＬ３０マイクロ２で処理されたマウスの３０％と を比較すれば、１００日以上の間肺瘍なく生存する。このグループは非共有結合 したＮａＭ−抗−Ｌ７・−２，１又は抗−１７−２，１単独を受け入れ名マウス −その生存期間はほんの３５日である−より一鴫長く生存する。

ｒｂ）連潟生長：　３Ｘ１０・Ｅ３１１１１ｊ％細胞を皮下注射されたＣＥＰ、 マウス９匹を有するグループは、腫瘍接種２日後充実性腫瘍ヲ発生する。このマ ウスに上述の６つの処置剤の１つを腹腔内注射する。注射あたりの受け入れられ るＮａＭ及び抗体の量は、２日目及び８日目で夫々１０マイクロ？であり、この 薬用量の２倍、すなわちＮａＭ　２０マイクロ？及び抗体２００マイクロｆ’（ ５，６，７及び９日目で示す。

再度抗−Ｌｙ　−２，１で処理されたマウスは注射らたりこの養生（ｒｅｇｉｍ ｅｎ　）の半分を受け入れ、七のよ・り一層大きい活性度が得られる。次のマウ スに於て＠瘍生長が阻害される。そのマウスはＰＥＳ％ＭＫＬ又はＮａＭ単独を 受け入れるマウスに比してその処理剤中に抗体を受け入れる。１０日目で抱合体 グループは、非共有ＮａＭ−抗−Ｌｙ−２，１抱合体又は抗−Ｌｙ　−２，１で 処理されたマウスのどちらよりも小さい腫瘍を有することが明らかである（第１ １図）。

共有抱合体で処理されたマウスの個々の腫瘍生長カーブを描く場合（第１２図） 、完全な退化は観察されない。しかしマウスの２５％は第二次のネット（ｎｅｔ ）腫瘍生長を処理の間に示し、更に処理剤を投与しない場合にしかサイズが増加 しない。またマウス１匹は実質上杭−Ｌｙ　−２，１抱合体に応答しないことが 明らかでろる。それによって全体的にこのグループの平均腫瘍サイズがかなり増 加する。腫瘍生長に於ける阻害がＰＥＳ’ｉ受は入れたマウスに比べて処理され たマウスの他のすべてのグループに観察されることに注目しなければならない（ 第１１図）。

これはより早い処置による増カルた効ンを示唆する。

腹腔内治療と他の方法の投与との比較として、コントロール試験を行う。２×１ ０・Ｅ３腫瘍細胞を皮下注射されたＣＢＦ！　マウスの１２グループは腫瘍接種 ４日後に充実性腫瘍ヲ発生する。これらのマウスに腫瘍接種後４日及び６日目で 腹腔内又は静脈内のどちらか、あるいＩ′１８日及び９日目で腫瘍内にＰＥ８、 抗−Ｌｙ　−１１、非共有ＮａＭ−抗−Ｌ７−２．１　抱合体又（ｄ共有ＮａＭ −抗−Ｌ７−２．１　抱合体のどれか１つを注射する。注射あたり受け入れられ るＮａＭ及び抗−Ｔ−１７−２，１の量は夫々１０マイクロ？及び１００マイク ロ２でちる。前述の様にこの処理剤中で抗体を受け入れるこれらのマウスは、投 与の処置法に無関係にＰＢＳ単独を受け入れるマウスよりも小さい膿瘍を有する （第１３ａ、ｂ％Ｃ図）。ｌＪａＭの全量用量の治療に限定されることである。

というのはＮａＭ−抗−Ｌｙ　−２，１抱合体を受け入れたマウスが、非共有Ｎ ａＭ−抗−Ｌ７−２．１　抱合体又は抗−Ｌ７−２．１単独のどちらかを受け入 れるマウスよりも明らかに小さい膿瘍を有しないからである（第１５ａ図）。

コレＦｉＮａＭ　１００マイクロｆまで受け入れたマウスの前記実験（第１１図 ）と対照的である。

マウスがこれらの処理剤２０マイクロ？ｔ−静脈内投与で受け入れた場合、ＩＮ 、ａＭ−抗−Ｌｙ　−２，１抱合体と他の処理剤との効率の重要な相異が観察さ れる（第１３１）図）。８−１５日目から抱合体処理されたグループの平均腫瘍 サイズはＰ　Ｂ　Ｓ、を凰独で受け入れたグループの約３０係にしかすぎない。

これは腫瘍生長がかなり阻害されたことを示す。その場合抗−Ｌｙ　−，２，１ 又は非共有ＮａＭ−抗−Ｌｙ−２，１ｉ受は入れたマウスの平均腫瘍サイズは８ −１２日間かけてＰＢＳ処理されたマウスのサイズより明らかに大きいことが考 えられる。

腫瘍内注射されたマウスは、腫瘍が１６５（７ｆｆ”の平均腫瘍サイズ（８日目 ）に達するまでその最初の処理剤を受け入れない。しかし１１日目までにＮａＭ −抗−Ｌ７−１１　抱合体を腫瘍内に受け入れたマウスはＰＥＥＩ、非共有１１ ａＭ−抗−Ｉ、ｙ　−２，１又は抗−Ｉ、ｙ　−２，１のどれかを単独で腫瘍内 注射されたマウスよりも明らかに小さい腫ｍｔ有する（第１３ｃ図）。

この傾向は１６日目で実験を終了するまで続く。一方腫瘍生長でもつとも大きい 減少が１．２日目で生じ、共有抱合体処理されたマウスの平均腫瘍サイズはＰＢ Ｓ処理されたコントロールマウスのサイズの８１係であるつ抗−Ｌｙ　−２，１ に非共有結合したＮ＆Ｍｅ受は入れるマウスは抗−Ｉ７−２．１に単独で受け入 れるマウスよりも小さい腫瘍を有し４いことを注目しなければならない。これは この抱合体の腫瘍阻害効果が抗−Ｌｙ　−２，１成分自体によることを示唆する つ ＬＤ−５０−値として表わして示す。図からＮａＭのＩ、Ｄ−５０は、Ｍ　Ｉｌ ｉ　Ｌ、のほんのａ　ｑ／に９に比して１１５ＸＩ９／′Ｋｇである。すなわち ＭＥＬは生体内でＮａＭより約２０倍毒性である。ＮａＭ　−ＭｏＡｂ　抱合体 は最大のテスト薬用量（１・８　ｊｌＰ／ｋｌ？　）でＯＤＡマウスに対して無 毒でちることが分る。

論考： モノクロナール抗体は精巧な選択性を有することのが適当である。極微粒子キャ リヤーと異って、ＭｏＡｂｓは循環することができ、介在する液及びリンパに入 り込むことができる。ＭｏＡｂｅは標的細胞に大きい選択性をもって結合するこ とができるが、これは薬品放出の効果的方法を構成している力１又はしていない 。大きな重要性は、標的抗原がエンドサイト−シス及びプロティン選別に関する 細胞メカニズムに結びつく度合にある。しかしＴＰＲ及びＬ７−２−ルセプター が薬品内部移行（１６）ＩＣ対する優れた標的剤であることが分る。キャリヤー としてのＭｏＡｂの他の問題は、変性せずＶ！−ＭｏＡｂに結合することができ る薬品負荷量に関する。ＭＨＬを抗原に結合する前もっての試みは中間体キャリ ヤー、たとえばポリグルタミン酸（２）を必要とする。というのは多分ＭＩＣＬ を直接抗体に結合するのが困難であるからである。しかしこの抱合体は生体内で 有効性を示さない。

ＭＥＬのＮ−アシル誘導体全最初に合成することによってこの誘導体の活性エス テルを製造することができる°。この誘導体ｔ’ｘ　ＭｏＡ’ｂｓ上でリジンの ｅ−アミノ基と反応する。このＮａＭ活性エステルｆ　ＭｏＡｂｅに良好に結合 し、ＭｏＡｂの分子らたりｌｉａＭ　３０分子までを有する抱合体が得られ、こ れは純粋なＭｏＡｂ活性の５０〜８０係を維持する（第１．２図）。前述の様に 抱合体の溶解度及び抗体活性は、ＮａＭ導入ノコのレベル以上に明らかに減少ス ル。

ＮａＭ−抗−Ｌｙ　−２，１及びｌｌａＭ−抗−ＴＦＲ抱合体がＮａＭの細胞毒 性効果を保持することを示す。これらは夫々結合された１１ａＭの抗慮瘍活性度 を、遊離ＮａＭの等モル量の活性度の１０−２５倍増加する（第４．５図）。こ れらの抱合体はまた試験管内で行われた特異的検定に於て、標的細胞に対して細 胞毒性を増加する。ＮａＭ抱合体の抗体結合活性は、選択的細胞毒性を明らかに 生じる。これは特異的検定法に見られる。その方法に於てＮａＭ−抗−Ｌｙ　− ２，１及びＮａＭ−抗−ＴＦＲ抱合体の双方はＬｙ　−２＋及びＴＦＲ＋細胞夫 々に対してのみ細胞毒性を示し、その特異的認識及び標的細胞への結谷がｌｌａ Ｍ単独よりもこれらを有効にする。、％定のモル濃度でＥ３標的細胞上にあるＮ ａＭ−抗−Ｌｙ　−２，１の細胞毒性効果は、純粋な抗−１１７−２，１の添加 で８０％まで減少する（第８図）。これは抗体結合が抱合体の細胞毒ＮａＭ−抗 −ＴＦＲ抱合体双方の細胞毒性作用から守ることができない（第８図）。これは これらが０１Ｍ細胞にＭＩＬに対する異なるメカニズムで入り込むこと、前者は 恐らく受身拡散によって、後者はＴＦＨによって入り込むことを示唆する。した がって抱合体中のＮａＭは特異的に標的細胞に向い、多分抗原を介して細胞に入 り込むことが分る。ＮａＭそれ自体が０１Ｍ細胞に対してＭＫＬより１００倍小 さい細胞毒性であり、しかしＮａＭ−抗体抱合体はＭＥＬより４倍小さい細胞毒 性であるにすぎないことに注目することが重要である。それ故にｌｌａＭ　−Ｍ ｏＡｂ　抱合体の内部移行されたＮａＭはリゾシームによって崩壊し、もつと活 性なもとの分子、ＭＩＬ１ｋｌ！脱することができる。ＮａＭ　−ＭｏＡｂ　抱 合体調！ｌＩ！ヲ汚染する遊離又は非会合ＮａＭはそれ故その誘導された形で細 胞に対してかなり非毒性であることにも注目しなければな体の効能はに地豆立て すでに立証されている。圭港内のＮａＭ　：抗−Ｔ’Ｔ　−２，１抱合体の活性 は２つの生存及び腫瘍生長実験で調べられている。マウスＨ３腫瘍で腹腔内接種 されたマウスの生存期間は、抗−ＩＪｙ　−２，１に共有結合したＮａＭが遊離 ＮａＭ　、抗−Ｉ、ｙ　−２，１に非共有結合したＮａＭ又は抗−Ｉｉｙ　−２ ，１単独よりも有効な腫瘍阻害剤であることを明らかに示す（第１０図）。ＭＩ ＩＪ単独はマウスの３０係を〉１００日間腫瘍なしで生存させることができるが 、その使用はその狭い治療範囲（１００マイクロタはマウスに有毒である。）に よって妨げられる。したがってＮａＭ−抗−Ｌｙ　−２，１抱合体処理はがなり 安全で、より一層有効である。

当然のことながら、薬品及び腫４ｆｌ胞双方の放出部位をこの結果を評価した場 合に考慮しなければならない。というのは特異的標的が実際達成されているか又 は腹腔が精巧なテスト管と全く同様に動くかどうかを認めるのは困難であるから である。その結果として更に臨床的な膿瘍生長シスチルも使用される。それはこ のＮａＭ　−Ｍｏｌ　抱合体が種々のバリヤーを妨げ、ｍ瘍細胞に集中すること ができることを測定する。すべての皮下腔腫生長実験に於て、治療は触知できる こぶが認められるまで開始せず、腹腔肉処理で投与されるＮａＭ−抗−Ｌｙ−λ １　抱合体は最も有効な腫瘍阻害剤である（第１１図）。しかしＮａＭ−抗−Ｉ Ｊ７−２．１　抱合体の１００マイクロ？でさえも（６注射以上）、処理剤１ｉ ｉ−腹腔内投与した場合これらのマウスの腫瘍生長を徹底的に阻害できないこと が明白である。対照としてＮａＭ−抗−Ｌｙ−２，１の２０マイクロ２しか静脈 内投与しない場合、抱合体処理したマウスのａ瘍生長に於て７０係減少が観察さ れる（第１３１）図）。ＮａＭ−抗−Ｉ、ｙ　−２，１抱合体の２０マイクロｆ を同一の処理法を用いて腹腔内投与した場合、腫瘍生長に於て５５俤減少がある にすぎないことは、極めて有利であるとみなされる。静脈内ＮａＭ−抗−Ｌｙ− ２，１抱合体処理が静脈内非共有ＮａＭ−抗−Ｌ７−２．１　抱合体又は抗−′ Ｌｙ−２，１のどちらよりももつと有効であることも明らかでちる。十分に証明 された皮下Ｅ８腫瘍の処理は局在を要求し、（第１３図）から明らかな様に抗− Ｌｙ−２，１抱合体に非共有結合したＮａＭは抗−Ｌ７−２．１単独よりも有効 ではない。これはＮａＭと抗−Ｌｙ　−２，１との間の非共有的会合がＥ３腫瘍 へのＮａＭの特異的標的化にとって不十分に安定であるが、一方抗−Ｌｙ　−２ ，１への共有付加によるＮａＭの特異的標的化が可能になることを示唆する。皮 下Ｅ３腫瘍に対する共有ＮａＭ−抗−Ｌｙ　−２，１抱合体の有効性は、腹腔内 投与の場合に限られるが、静脈内投与は処理のより一層有効な形態？示し、一般 にＮａＭ　−抗−Ｌｙ　−２，１抱合体のより一層大きい薬用量が投与される実 験が試みられることに何の疑いもない。

腹腔内及び静脈内治療ともに多くの困難な問題を被る。投与後、薬品は肝臓で不 活性化され、血清中で加水分解され又は血漿プロティンと結合して又は急激な排 泄によって除去される。更に一般に腫瘍は比較的不十分な血液供給を有し、薬品 は拡散によってしか腫瘍の内部に達しない。したがって薬品は高い選択的ｍ瘍阻 害剤であるが、すべて腫瘍細胞に高濃度で達することができない。実験のこの理 由のために、腫瘍内治療の効果、すなわち免疫毒素（１８）を用いる腫瘍治療に 望のある結果を生じる投与法を決定するために実験が更に行われる。

腫瘍生長に於けるもつとも大きい減少は、共有ＮａＭ　−ＭｏＡｂ　抱合体処理 したマウスの平均腫瘍サイズがＰＢＳ処理したコントロールマウスの６１係サイ ズである１２日目に生じる。それは非共有ＮａＭ　−抗−Ｌｙ　−２−１又は抗 −Ｌ７−２．１　単独で腫瘍肉処理されたマウスに観察されるよりも明らかに大 きい腫瘍生長の減少である（第１３ｃ図）。この例としてｒｉ腫瘍内投与された 抱合体２０マイクロｔは静脈内の抱合体２０マイクロ？と同一の効果を示さず、 腹腔内投与の２０マイクロ１よりぎりぎりでしか優Ｇｅｒａｎ　Ｕｚｍａｎ、　 Ｅ、　、　Ｂｏｏｎｅ、　Ｅ、　Ａ、及びＭＯｃａｒｔｈｙ、　Ｒ＋Ｅ、　１急 性白血病の子供の末梢血液から得られたヒトリンパ芽球の連続培養、Ｃａｎｃｅ ｒ　１８　：　５２２−５２９　。

Ｃ，、Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ、　Ｗ、及びＬｉｅｗ、　Ｆ、　Ｙ、　、？ウスＬｙ −２，１細胞表面抗原に対するモノクロナール抗体。

免疫学４６５１３５−１４４　、１９８２７、）ｌｏｇａｒｔｈ、　Ｐ、　Ｍ、 　Ｂｅｎｎｉｎｇ　、　Ｍ、　Ｍ、及びＭｃｋｅｎｚｉｅ　。

工、　Ｆ、　Ｏ，、マウス中に放射線誘発された腫瘍の同種抗原フェノタイプ。

Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ工ｎｓｔ、　６９　：６１９−８２８　、１９ ８２ ９、Ｈｙｍａｎ、　Ｒ，及びＳｔａｌｌｉｎｇｅ、Ｖ、、　Ｔｂｙ　−１変種の 相補性検定パターン及び抗原が親集団中で変種“Ｐｒθ−ｅｘｉｓｔ″を失うこ とを証明する。

Ｊ−Ｒａｔｅ、ｃａｎｃｅｒ　工ｎｓｔ、５２　：　４２９　−　４５６　、　 １９７４Ｆ、　Ｏ，、免疫療法に関するメトトレキサーテーモノクロナール抗体 抱合体の研究、Ｊ、Ｎａｔｌ　ｃａｎｃｅｒ工ｎｓｔ、　７５　：　３１９−３ ３２　、１９８５１１、Ｐａｎａｃｃｉｃｏ、　Ｍ、　、　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、 　Ｏ，Ｈ，、Ｚａｌｃｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｒ。

及びＭｃｋｅｎｚｉｅ、工、　Ｆ、　Ｏ，、ヒトトランスフェリンレセプターに 対するモノクロナール抗体。、ｒ、　Ｎａｔｌ。

ＣＡｎｃｅｒ工ｎｓｔ、（新聞中に）、１９８５チゼラと反応するリンパ細胞の 副集団を見つけるタメの敏感なロゼンティング法、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ’ｌ。

ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｖｅｒｈｕｌｓｔ、　Ａ、及びＰｉａｒｒｅｓ、　Ｍ、　、ラ ット抗−マウスＴ４モノクロナール抗体（Ｈ１２９，１９）ｔｒｉ　ｌ　ａ反応 性Ｔ細胞クローンの増殖速度を阻害し、抗−１ａ細Ｊｉ１分解Ｔ細胞クローンの 間で２つのフェノタイプ的に別個の（Ｔ４＋、Ｌｙ　ｔ　−２，３−及びＴ４− １Ｌｙ　ｔ　−２，３”　）部分集合を描く。Ｊ。

工ｍｍｕｎｏ１．　１３２　；　２７７５−２７８２　、１９８４１４、Ｐｉｅ ｔｅｒｓｚ、　Ｇ、　Ａ、　、　Ｚａｌｃｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｒ，及びＭｃｋａ ｎｚｉｅ。

工、　Ｆ、　Ｃ，、特異的な抗−腫瘍活性にアトリスマイシン−モノクロナール 抗体錯体の使用。（非公開結果）、１９８５ １５、Ｓｍｙｔｈ、Ｍ、Ｊ、、　Ｐｉｅｔｅｒｓｚ、Ｇ、Ａ、、　Ｇｌａｓｓｏ ｎ、Ｅ、Ｊ、及びＭｃｋｅｎｚｉｅ、■、　Ｆ、　Ｏ，、腫瘍に対するクロラム ブシルの特異的標的法、Ｊ、　Ｎａｔｌ、ガン協会、ユ；５０３　−　５１０　 、　１９８６ ビーターツ １　＆　Ｓｍｙｔｈ、　Ｍ、　Ｊ、　、　Ｐｉｅｔｓｒｓｚ、　Ｇ、　Ａ、及び Ｍｃｋｅｎｚｉｅ、工。

Ｆ、　Ｃ，、薬品−抗体抱合体の作用メカニズム、Ａｕ５ｔ。

Ｊ、ＫＸｐ、ＥｉＯｌ、Ｍｅ＋ｉ、Ｓｃｉ、　（新聞中に）、１９８５１７、Ｖ ｉｅｔｉｃｓ、　Ｄ、　Ｔ、　、　Ｒａｂｏｎ、　Ａ、及びＲＩＬＩ）ｉｎＯＶ ｉｔＺ、　Ｍ。

Ｌ−ロイシン、輸送の競合基質のＬ−ロイシンによるメルフアラン治療でアミノ 酸がメルフアラン１ａ　Ｗａｉｌ　−Ｈｌｌｌｍａｎ、Ｇ、、　Ｒｕｎｇｅ、Ｗ 、、　Ｊａｎｓｅｎ、Ｆ、Ｋ。

及（ｆｉ　Ｖａｌｌｅｒａ、　０．　、ヌードマウスモデル甲ヒト腫瘍上での抗 Ｍｒ　６７．０００プロテインイムノトキシンの細胞毒性効果、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｏｅ、　４５　；　１３２Ｂ　−１３５８、１９８５ 凡例　パートＡ 第１図：　ＮａＭの抗−Ｌ７．−２．．１（α５ｑ）への結合。抗Ｌｙ　−２， １分子らたりＮａＭ導入モル数（−）及びプロティン修復（○）を反応混合物中 でＮａＭの０モルの数の関数として示す（横座標）。

第２図：　ＮａＭの抗−ＴＦＲ（ａ５ｙ９）への結合。

抗−ＴＦＲ分子あたりＮａＭ導入モル数（−）及びブロチイン修復（○）を反応 混合物中でＮａＭのｎモルの数の関数として示す（横座標）。

第３図：　抗体力価を工ＴＴ（１’１７５ＮＳ　１３標的細胞上で抗−Ｌｙ　− ２，１抱合体の抗体希釈度に対する係ロゼント形成細胞として測定するウ一連の 希釈を純粋な抗−Ｌ７’−２，１（ム）及び１０モルに１ａＭ／−１１−／’抱 合体（○）又は２５モルＮａＭ　１モル抱合体（・）との抗−Ｌｙ　−２，１と のどれかの溶液ａ、ｓｗｑ／−について行う。

第４図＝　２４時間検定で工ＴＴ（１）７５に＋３Ｅ３細胞上で遊離１ｉａＭ　 （！Ｉ　）、抗−Ｌｙ　−２，１ＭｏＡｂに非共有結合したＮａＭ、２５モルＮ ａＭ　１モル抱合体（◇）、抗−Ｌｙ　−２，１ＭｏＡｂ　に共有結合、２５モ ルＮａＭ１モル抱合体（・）及び遊離ＭＫＩＩ（◆）の阻害効果（テキスト参照 ）つ 第５図：　２４時間検定に於てＯＢＭ細胞上で薬品不含（曹）、抗−ＴＦＲ，Ｍ ｏＡｂ　に非共有結合した薬品、３０モルＮａＭ　１モル抱合体（◇）又は抗− ＴＦＲＭｏムｂに共有結合した抱合体、３０モＡ／ＮａＭ１モル抱合体（・）を 用いてＮａＭの阻害効果。

第６図＝　３０分検定に於て抗体反応性細胞（Ｅ５）上で遊離ＮａＭ　（■）又 ｉｊＮａＭ抗−１７−２，１抱合体２５モルＮａＭ１モル抱合体（・）の及び抗 体反応性細胞ＢＷ１４７０Ｕ−上で遊離ｌａＭ　Ｃ口）又は抱合体（○）の阻害 効果。

第７図＝　３０分検定に於て抗体反応性細胞（ＯＥＭ）上で遊離ＮＩＬＭ　（Ｉ ｍ　）又はＮａＭ抗−Ｔ’ＰＲ抱合体、３０モルｌｉａＭ　１モル抱合体（・） の及び抗体非反応性細胞Ｅ３上で遊離Ｎ＆Ｍ　（ロ）又は抱合体（０）の阻害効 果。

第８図＝　３０分検定に於てＥ３標的細胞上でＮａＭ−６抗−Ｌｙ　−２，１抱 合体、２５モ／ｌ／　１ｌａｌＪ　１モル抱合体（・）及び抱合体プラス純粋な 抗−Ｌｙ　−２，１（ム）の阻害効果。

第９図：　ＭＢＬ（◆）、ＮａＭ　（ＩＩＩ　）又はＮａＭ−抗−ＴＦＲ抱合体 ３０モルＮａＭ／モ元抱合体に対する０ｇＭ細胞の敏感性に於けるＬ−ロイシン の効果。

１ｍＭＬ−ロイシンは露光の間存在しない（○）；１ｍＭＬ−ロイシンが存在す る（燵）。

第１０図：　工ＴＴ（１）１５Ｎ８　］１１！５腫瘍を生じる０３１ｇマウスの 生存。マウス８匹のグループを３Ｘ１０’細胞／マウスと共に培養する。４時間 後、ラターマウスの腹腔内にＦＢ日Ｃ口）、遊離ＭＦｉＬ５０マイクロ？（◆） 、遊離ＮａＭ　３０　？イクロ１（ｌｌ’ｌ、純粋な抗−Ｌｙ−２，１３０マイ クロ？（ム）、非共有抗−Ｌ７−λ１　及びｌＮａＭ　３０マイクロ２（◇）及 びＮａＭ−抗一”−７−２，１抱合体１５マイクロＶ（○）及び３０マイクロ？ （・）のどれかを投与する。

第１１図：　３Ｘ１０’細胞を皮下注射したＣＥＦＩマウス中の胸腺腫工ＴＴ（ １）７５１１８　１３の生長。マウス９匹のグループＶＣ（↑）表示で腹腔内処 理を行う：ＰＢＳ（ロ）、遊離Ｎ＆Ｍ　（Ｉｍ　）、遊離ＭＥＬ（◆）、ＮａＭ −抗−Ｌ７−２．１　抱合体（・）、非共有的に抱合されたＮａＭ−抗−Ｌｙ− ２，１（◇）及び抗−Ｌｙ−２−１（ム）。誤差線は平均からの１標準誤差を示 す。

第１２図：　３Ｘ１０・工ＴＴ（１）７５１１ＥＩ　ＢＳ腫瘍細胞を皮下注射し た及び２，５，６，７．８及び９日目にＮａＭ−抗一１７−２．１−抱合体を腹 腔内処理した０ＢＦＩマウスの個々の生長カーブ。

第１３ａ、ｂ、ｃ図：　２Ｘ１０１細胞を皮下注射し九〇ＢＦｇマウスに於ける 胸腺腫工’１’　Ｔ　（１）７５Ｎ８Ｂ３の生長。マウス８匹のグループに次の 処理を行う；（ｉ）ＰＢ８（ロ）、（１１）抗−１７−１１（ム）、０１１）Ｎ ａＭ−抗−Ｌ７−２．１　抱合体（９）及び非共有的に抱合されたＮａＭ−抗− Ｌｙ−２，１（◇）を腹腔内（ａ）、静脈内（ｂ）又は腫瘍内（Ｑ）投与のどれ かを行う。

第１４図：　腫瘍のないＣＢＡマウスに於いて遊離ＮａＭ　（ａｌｌ　）、遊離 ＭＥＬ（◆）及びＮａＭ−抗−ＴＦＲ抱合体（・）の毒性。

パートＢ 上記１１−　ＡｃＭＫＬ　−ＭｏＡ’ｂ　抱合体は試験管内及び生体内で特異性 及び細胞毒性を発揮するが、生体内での結果を改良するために、Ｎ　−ＡｃＭＥ Ｌ　ヘの？（ａｂ’）１フラグメントの結合をここで報告する。ｍ瘍への薬品− 抗体錯体の接近性を増加するために及びＦａレセプターを介する非特異的結合を 減少するために、Ｎ−アセチル−メルフアラン（Ｎ　−ＡＯＭＫＩ＋　）をＰ　 （ａｂ’）１フラグメントと抱合させる。この７ラグメントを工ｇＧ　ＭｏＡｂ 　のペプシン退化によって合成する。

Ｎ　−ＡｃＭｌｉＬ　２０分子までは有利に夫々Ｆ　（ｅｒ’ｏ’）＠フラグメ ント（２５分子／インタクトエｇＧと比較して）に薬品及び抗体活性を保持して 結合するっしかしＮ−ｈａｙＥＬ−Ｆ　（ａｂ’）、抱合体は、試験管内で非特 異性Ｆｃレセプター結合の不在にもかかわらず特異的細胞毒性を示し、ＩＦ（ａ ｂ’）１フラグメントを使用した場合より一層大きい浸透性を示す。１１−　Ａ ｃＭＥＬ　−Ｆ（ａ　ｂ’　）１　及びＡ　−ＡｃＭＩＬ−工ｇＧ抱合体は生体 内で同様な抗−腫瘍活性を有する。すべての工ｇＧ及び有効である。すべての１ ｇＧに比してＦ（ａｂ’）１フラグメントのより低い免疫原性及びその抱合体の 同様な細胞毒性は、Ｆ（ａｂ’）１抱合体がますます大きい臨床上の有用性を有 することを示唆する。Ｆ　（ａｂ’）１７ラグメントの使用はいくつがの利点を 有しなければならない：第一に１１Ｆｃレセプターを介する非−腫瘍細胞への非 特異的結合が避けられる；第二にＦｃブロテ’ｆ　７　ｕ　ＭｏＡｂのもっとも 免疫原性プロティンであルノテ、マウスＭｏＡｂｓ　ｆ治療に使用する場合、よ り小さい免疫原性Ｐ（ａｂ’）１処理が望まれる。最後にＭｏＡｂのＰａプロテ ィンの除去はその分子サイズを約３０％まで低下する。これは抱合体が生理学的 バリヤーにもつと有効的に浸透することができ、循環からＩＩ！！へ通した場合 細胞のバリヤーを回避する（細網内皮システム）ことができると考えられる。し ばしばＰ（ａｂ’）１抱合体の試験管内及び生体内効能ｉＮ−ＡｃＭＥＬとイン タシトニｇＧ　ＭｏＡｂ　との抱合体と比較試験する。

材料及び方法　パート３ 略語 Ｎ−ＳＮ−５−Ａｃ　＝　Ｎ−アセチルメルフアランＭＥＬ　＝メルフアラン ＤＭＥ　＝＝ドルベコ（Ｄｕｌ＋ｅｃｃｏ　）　変性されたイーグルス培地 ｙｏＡｂ（ｓ）　＝モノクロナール抗体ＴＡＲ＝）ランス７エリンレセブター ＳＡＭＧ　：羊抗−マウスグロブリン ＣＥＦｌ　＝（Ｃ５７ＢＬ／６Ｘ：ＢＡＬＢ／Ｃ）Ｉ’ＩＰＢＳ　＝＝ニリン塩 で緩衝されたサライン腫瘍細胞：　Ｅ３、マウス胸腺腫工ＴＴ（１）７５ＮＳの クロナール変種（スミス等、１９８６Ｃ）：及びマウスリンパＫＬ４（ホロゲイ ン％、１９６Ｂ）ｆ試験管内でＤＭＥｊ中に保持する。このＤＭＥには１０チ熱 不活性化された新生仔牛血清（７０−研究所、シトニー、オーストラリア）、２ ｍＭグルタミン（連邦血清研究所、（ＣＡＬ）、メルボルン、オーストラリア） 、１０Ｏｍｕｇ　／−ストレプトマイシン（グラキソ、メルボルン、オーストラ リア）及び１００工、Ｕ／ｗｄペニシリン（ａｓＬ）が補充されている。生体内 実験のために、Ｂ３を（０５７ＥＬ／６　Ｘ　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｅ　／　（１！　’ ）　Ｐ　１　（ＯＢ　Ｆ　ｔ　）マウスに於て腹水液中に連続的に通過させるこ とによって保つ；腹水液からの細胞を洗滌し、ＰＥ８中に懸濁されたＩ）ＫＭ及 びリン酸塩緩衝されたサライン（ＰＢＳ。

ｐＨ７，５）中で２回遠心分離しく　４００　ＰＸＳ分）、ＯＢＦ！マウスに皮 下注射する。

マウス：　ＯＢＦ、マウスをメルボルン大学の病理学部で飼育する。

モノクロナール抗体：　抗−Ｌｙ　−２，１ｍｏｈｂ（工ｇＧ１　）　（Ｈｏｇ ａｒｔｎ、１９ｓ２）ｋｍ水液から４０係硫酸アンモニウムで沈殿させて単離し 、ＩｇＧ分画をプロティンＡセファロース（フアルファシア；ピスカタウェーッ ＮＪ）に吸収し、ＰＢＳ（ｐＨ７，５）で十分に洗滌し、α２Ｍグリシｙ／ＨＣ Ｌ　（ｐＨ２，８）で溶離する。中和の後、ＭｏＡｂ　’ｚＰ　Ｂ　８に対して 透析し、分別し、−７０℃で保存する。抗体活性を羊−抗−マウス免疫グロブリ ン（８ＡＭＧ　）ｉ用いてロゼツテイングして測定する（　Ｐａｒｉａｈ　等、 １９７８）ペプシン崩壊によるｐ　（ａ’ｂ’）＊の調製：　抗−Ｌ７−１１Ｍ ＱＡｂのＦ　（ａｂ’）、　７ラグメントｆｒ：調製するのに採用される崩壊の 最適条件は、［ＬＩＭクエン酸塩、ｐＨ己８．５７Ｃで６−８時間、１−２り／ −の工ｇＧ濃度及び２５　ｍｕｇ／−のベプクン濃度を用いて行う（Ｐａｒｈａ ｍ、　１９８３”）。インタシトニｇＧ　ｔプロティンＡ−セ７アロース（ファ ルマシア）で除去し、夫々の調製を収率（〉８０％）で計算し、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動によって下降及び非下降条件下で同定する。

Ｎ　−ＡｃＭＢＬ−工ｇＧ及びＮ　−ＡｃＭＥＬ　−Ｆ　（ａｂ’）ｌ抱合体の 調製：　Ｍ］ｌｉＬのＮ−アセチル誘導体を調製し、前述のすべての工ｇＧ及び Ｉ’（ａｂ’）１に抱合する（スミス等、１９８６ａ）。簡単にＭＥＬｔ−無水 酢酸でアセチル化し、次いでこのＮ　−ＡｃＭＥＬ誘導体の活性エステルをＭｏ Ａｂ抗体のアミノ基に結合させる。

活性：Ｃｘゼンティング検定〔パリシュ等、１９７Ｂ）は、前もってＩＪ　−Ａ （！ＭＥＬ−工ｇａ抱合体の抗体活性を立証する（スミス等、ｆ９８ｄａ）。Ｎ −ＡＣ！ＭＥＩＩ　−７（ａｂ’）１抱合体の抗体活性を、放射線標識された１ ２５工−エｇＧ　’に用いる競合結合検定ですべての工ｇＧ１及びＦ（ａ’ｂ’ ）１フラグメントと比較する。

この検定法で２倍の希釈を抗体２５　ｍｕＬ　、　Ｆ　（ａｂ’）１抱合体２５ ｍμ−又は工ｇＧ抱合体２５ｍμＷＬｔｔ−用いて９６ウエル丸底プレート中で 行い、これにＩＩｓニー抗−Ｌｙ　−２，、１の２５　ｎｕｔを加えるっ次いで Ｅ６標的細胞（Ｌ　５　Ｘ　Ｉ　Ｄ　’　／　ｔｄ　）５０　ｍｕｔを加え、Ｐ ＢＳ中で洗滌（３回）、プレートのカット及びγ−カウンターで個々のサンプＡ ／をカウントする前の３０分間培養するウコントロールウエルは°コールド１抗 体又は抱合体２５　ｒｎｎＬを含まず、結果をコントロールサンプルのｔｚｓニ ー抗−Ｌ７−λ１　結合に於ける百分率減少として計算することに注目しなけれ ばならない。

抗体活性：　［”ｌｌ〕チミジンの腫瘍細胞への導入を測定する２つの検定を、 Ｆ（ａ’ｂ’）１抱合体の薬品活性を評価するために行う。これらは抱合体が細 胞に接触する時間で異なる。ａ）２時間検定：細胞（１−５ＸＩ　Ｑ・／　ｍｌ 　）　１００　ｍｕＬ’＜　９６ウ工ル平底マイクロ力価プレートに加え、１時 間５７℃で培養する。遊離薬品（α５Ｍ重炭酸ナトリウム中に溶解しテｍｍ　） 　ＥｌびＮ　−ＡｃＭＫＬ抱合体（Ｐ　（ａｂ’）ｍ及び工ｇＧ）を１２２　ｍ ｕｍ小孔フィルターを通して濾過し、無菌状態を確保し、希釈を無菌ＰＥ８中で 行う。遊離薬品又１ｆ　１＋　−ＡｃＭＫＬ抱合体５０　ｍｕｔｖｉ−複製ウェ ル／サンプルを用いて細胞に加える。コントロールウェルに培地又はＰ　Ｂ　Ｓ 　５０　ｍｕＬ　’ｒ：加え、細胞を５７℃で７％ＣＯ１雰囲気中で２４時間培 養する。あるいは（１））　３０分検定：細胞（１−５Ｘ１０・／　ｍｌ　）　 ２００ｍｕｔｆ無菌プラスチック遠心分離管中に集め、無菌の薬品又１ｄ　Ｆ　 （ａｂ’）、抱合体中に再懸濁し、３０分間３７℃で混合する。細胞を遠心分離 （４ｏｏｊｘｓグレート中にまき、１Ｂ−２４時間培養する°。

（特異的活性＝　５　（Ｊ　／　ｍｚｎｍｏｔ：　Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　ｆ加 え、プレートを２４時間培養する。次いで細胞を採取する。１０分間、８０℃で 乾燥し、サンプルをシンチレーションカウンターで数える。ｌ　（”ａ）−チミ ジンの導入をコントロールの導入に於ける百分率阻害として表わす。得られたポ イントに対する標準誤差が二重測定法によって生じるが、得られた実験上のポイ ントに対し５％を越えない。

生体内実験＝（ａ）腫瘍生長：腫瘍細胞をマウスの腹壁に皮下注射し、処理を開 始する前に触知できる腫瘍に発生する。次いでマウスに一連の腹腔肉処理を行い 、腫瘍のサイズをカリバースクエアー（ｃａｌｉ−ｐｅｒ　Ｂｑｕａｒｅ　）　 で毎日測定し、それにＰＸＭ瘍の画直軸に清って測る：データを平均腫瘍サイズ として記録する（２つの直径士像準誤差の生成物）。マウス８−１０匹の実験グ ループ、同一の性及び年令のすべてを夫々の実験に使用する。

結果 これらの研究は、Ｎ　−ＡｃＭＥＬがＭｏＡｂｓのＩＰ（ａｂ’）１フラグメン トに生体内で薬品及び抗体活性を維持しながら共有結合することを証明し、充実 性腫瘍モデル中でこの抱合体と工ｇＧ　ＭｏＡｂ　Ｋ共有結合したＮ−ＡｃＭＥ Ｌとを比較するためである。Ｐ（ａｂ’）１へのＮ−ＡｃＭＥＬの結合：抗Ｌ７ 　２．１　７’　（ａｂ’）ｔ　ｋ種々の量の１１−　ＡｃＭＥＬ活性エステル と反応させて、結合された薬品の量が変化した抱合体を生じる。

Ｎ　−ＡｃＭＥＬ活性エステル２５０　ｎモルのＦ　（ａ　ｂ’）ｇ５ｎ５Ｎへ の添加は、Ｆ（ａｂ’）１分子あたＯＮ−ＡｃＭＥＬ　６分子の導入をプロティ ンの８５％修復で生じる。（第１５図）対照としてＮ　−ＡｃＭＥＬ活性エステ ルの２倍量の添加は（４６ｏｎ−［ニル）　Ｎ　−ＡｃＭＫＬ３３分子の導入を ５５係プロテイン修復で得られる。

それ故有利な結合のための条件が立証された。すなわち試験管内及び生体内で更 にテストされたＦ（ａｂ’％抱合体がＦ　（ａｂ’）を分子あたり導入された刃 −ＡａＭＩＬ　１０−２０分子の間にある。Ｎ　−ＡｃＭＩｅＬをＦ　（ａｂ’ ）１フラグメントにプロラインの僅かな損失で共有結合することができる。−し かし抱合体中の薬品及び抗体活性は測定を必要とする。

Ｎ　−ＡｃＭＥＬ　−Ｆ　（ａｂ’）１の抗体活性：　崩壊及びＮ−ＡａＭＩＬ への抱合前及びその後の抗体力価を競合放射なわちＥ３標的細胞に結合する１工 ６エー抗−Ｌ７−２．１の３５％（最大結合の半分が観察される）でコールド抗 体の希釈度は減少する。〕。Ｎ　−ＡｃＭＩＬ２０分子を含有するＦ　（ａ　ｂ ’）＠抱合体は１：３２の抗体力価を有し、抱合されたＮ　−ＡＯＭＫＬは１： ３２、抗−Ｌｙ　−２，１力価は１：１００である。したかっ、てＦ（ａ’ｂ’ ）１フラグメントへのペプシン崩壊に関して明らかに抗体活性の僅かな損失がａ る。しがし他の測定できる損失は２０　Ｎ　−ＡｃＭＩＬ分子までの抱合で生じ ない５Ｎ　−ＡｃＭＫＬ導入度合が２０分子ｔ−越えた場合、抗体活性に重大な 損失が観察される（データは示されない。）。

試験管内細胞毒性：　抗−Ｌ７−２．　Ｉ　Ｐ　（ａｂ’）ｌ抱合体の細胞毒性 ｆｔＬ７−２＋Ｅ３　細胞上でテストし、遊離１１−　ＡｃＭＩＬ及び抗−ｂｙ 　−２，１に非共有結合したＮ　−ＡＣＭＨＬの細胞毒性と比較する。Ｆ（ａｂ ’）１抱合体の細胞毒活性は遊離Ｎ　−ＡｃＭＥＬよりかなり大きく及びＮ　− ＡｃＭＫＬ−工ｇＧ抱合体より少し大きいことが明白である（第１７図）。たと えば（３Ｈ）チミジン導入に於ける５０％阻害は、Ｎ　−ＡｅＭＫＬ−工ｇＧに 対して９．０Ｘ１０−”Ｍ及び遊＠　ＡｃＭＩＬ　Ｋ対しテア、　５　Ｘｆ　Ｏ ”−４Ｍに比して、Ｆ（ａｂ’）１抱合体に対して７．５　Ｘ１０’Ｍの１１− 　ＡＣＭＥＬ　？Ｊｊ度で生じる。がくてＦ（ａ−ｏ’）１抱合体及び工ｇＧ抱 合体は遊離Ｎ−ムｃＭＫＬより４ｏ〜５０倍細施毒性である。

特異的細胞男性：　Ｎ　−ＡｃＭ］Ｉｉｌ、　Ｆ（ａｂ’）１　抱合体の阻害活 性は、Ｎ　−ＡｃＭＫＬ−工ｇＧ抱合体について前に述べた様にＭｏＡｂと反応 する標的細胞に特異的である（スミス等、１９８６ａ）。３０分検定を使用する 場合、１つのＦ（ａｂ’）ｌ抱合体及び２つの細胞系を用いる。

Ｆｒａｂ’）１抱合体は１７−２”Ｅ３ｉ結合し、３０分露光後にこれらの細胞 上にその細胞毒性を及ぼすことを示す（第１８図）。この場合（ｊｌ（）−チミ ジン導入での５０％阻害は、遊離Ｎ−八ｃＭＥＬに対する１、５Ｘ１０−”Ｍに 比しＴ１．５Ｘ１０−５ＭＩＺ）Ｎ−ＡｃＭＥＬ濃度で生じるつ対照としてＥ３ より遊離Ｎ−ＡｃＭＫＬに１０倍敏感なＩＣＬ４（Ｌ７−２−）は、テストされ たモル濃度にわたって、Ｐ　（ａｂ’）＊　（Ｌｙ　−２”）の細胞毒性効果に 比較的耐性である。

腫瘍生長：　ＡＯＸｌ　０’　１３腫瘍細胞を皮下注射されたＣ！ＥＦ、マウス ９匹を有するグループは、腫瘍接種４日後充実性腫瘍を発生し、次の処理剤の１ つを静脈内注射する：　（ｉ）　Ｐ　Ｂ　Ｓ　；　（ｉｉ）遊離？＋　−ＡａＭ ＢＬ　；（ｉｉｉ）　Ｆ　（ａｂ’）ｍ　；　６ｖ）共有Ｎ　−ＡｃＭＥＬ−工 ｇＧ抱合体；及び（Ｖ）共有Ｎ　−ＡｃＭＩＬ　−Ｆ　（ａｂ’）１抱合体。り に−７’ｌＣ４及び５日目でＮ　−Ａｃ１ＪＩＬ　１５　ｍｕｇ及び（又は）工 ｇＧ又はＦ’（ａｂ’）１１５０　ｍｕｇ　ｆ＜投与する。アＢＳ、Ｎ−ＡｃＭ ＥＩＪ又は抗体を単独で投与したグループに比してＮ　−ＡＱＭＥＩＪ抱合体を 投与したマウスに腫瘍生長の阻害がある（第１９図）。８日目で抱合体グループ はＨ−ＡｃＭＥＬ又ＦｉＦ　（ａｂ’）１で処理されたマウスのどちらよりも小 さい腫瘍ヲ有し、１１日目でＮ　−ＡｃＭＥＬ−工ｇＧ処理されたマウスの平均 腫瘍サイズはＰＥ８処理されたマウスの５０％サイズである。Ｆ（ａｂ’）１抱 合体処理がもつと効果的でおる。これは上記グループの平均腫瘍サイズをＰＥ８ 処理されたグループの平均サイズの６０係に下げる。Ｆ（ａｂ’）□抱合体処理 されたマウスの個々の腫瘍生長カーブを挙げた場合、２つの完全な退化が観察さ れ、マウスの他の４／１０匹は処理の経過の間に腫瘍サイズで減少を示す（デー タは示されない。）。しかし１１日目で退化したこれらの腫瘍は発育を開始し、 ＰＥ８処理された腫瘍の半分の大きさに生長する。同様な腫瘍負荷及びより一層 早い処理を用いてＮ　−ＡｃＭＫＬ　−Ｆ（ａｂ’）１及びＮ　−ＡｃＭＥＬ− 工ｇＧ処理の限界を評価するために、もう１つの実験を行う。それはＣＥＦＩマ ウス１０匹のグループにλ口×１０δＥ３腫瘍ｆａＭを皮下注射する。これによ って腫瘍接種４日後、充実性腫瘍が発生する。マウスＫＰＢＳ、抗−Ｌ７−２． １、ＭＥＬ、抗−トランスフェリンＭＯＡＩ）　（抗−ＴＦＲ）に共有結合する Ｎ　−ＡｃＭ刊Ｌ（スミス等、１９８６ａ）又はＮ　−ＡｃＭＥＬ−抗−Ｌｙ　 −２，１１’　（ａ　ｂ’　）！抱合体のどれか荀膿瘍接種後３，５及び８日目 に静脈内注射するっ投与されるＡｃＭＫＬ又はＭＩＬの量は３日目で８ｍｕｇ、 ５日目で１５　ｍｕｇ及び６日目で７　ｍｕｇ（すなわち全量３０　ｍｕｇ　Ｎ 　−ＡｃＭＫＬ　：）である。前述の様にこの処理でに３−　ＡｃＭＩＬ及び抗 −Ｌ７度７日巨匠ＦＢＳ％ＭＥＬ又は抗体単独を投与されたマウス（第２０図） よりも小さい腫瘍上Ｍし、１１日目でＦ（ａｂ’）Ｉ抱合体処理したマウスの平 均腫瘍サイズｌ−１ＰＢｓ処理したマウスの１５％サイズ及びＲ−ＡｃＭＥＬ− 抗−ＴＦＲ処理したマウスの２０％サイズである。Ｆ（ａｂ’）１抱合体処理し たマウスの個々のａｌｌｌｌ−ブは、マウスの９／１０が処理期間（５−６日） で腫瘍サイズを減少し、これらの腫瘍の５つは完全に退化し、再発生しないこと を示す（第２１図）。Ｆ　（ａ　ｂ’　）＠処理の終了で、残存する４つの腫瘍 はサイズを増加しはじめ、ＰＢＳ処理したマウスの平均生長度合よりもすべてゆ っくりした変動的な度合で生長する。マウスの１匹しかＦ（ａｂ’）１抱合体に 対して二次的な応答分水さない。Ｎ−ＡｃＭＥＬ−工ｇａ　（抗−Ｌｙ−２，１ ）抱合体で同様に処理されたマウスの追加グループに於て、腫瘍の４／１０が完 全に根絶する（データは示されない。）。

論考 ＭＥＬの非特異的毒性を減少するために、より小さい細胞毒性Ｎ　−ＡｃＭＦ： Ｌ誘導体を合成し、ＭｏＡｂｓと結合させる（スミス等、１９８６ａ）。このＮ −ＡｃＭＩＬ−工ｇＧ抱合体が、フェニルアラニンアミノ酸輸送シスチルではな （ＭＯＡｔ）を介して細胞に入り込むことを証明し、それ故にＭｏＡｂを結合し た細胞にだけ細胞毒性でらる。更にＮ−ムＣＭＥＩＪ−工ｇＧ抱合体は生体内で 遊離ＭＢＬ％Ｎ　−ＡｃＭＦｉＬ又は抗体単独よりも有効に腫瘍を根絶する。こ れは静脈内に投与された時にもつとも有利である（スミス等、１９８６ａ）。こ の研究でＮ−ムａＭＫＬ−■ｇＧの特異性及び細胞毒性をＭｏＡｂのＦ’ｃ部分 の離脱し、導入されたＰ（ａｂ’）１フラグメントｆ　Ｎ　−ＡｃＭＩＣＬと結 合させることによって更に増加することができる。Ｎ　−ＡｃＭＥＬ−エｇＧ抱 合体に関して同一抱合処理？用いて（スミス等、１９Ｂ６ａ）、Ｎ　−ＡｃＭＥ Ｌ活性エステルは有利にＩＦ（ａｂ’）１フラグメントに結合し、分子Ｆ（ａｂ ’）１らたり結合されるｋＪ　−ＡｃＭＢＩ、の２０分子までを有する抱合体ｔ Ｓ造する（第１５図）。そのＩＦ（ａｂ’）１活性の保持に加えて（第１６図） 、Ｆ（ａｂ’）、抱合体はＮ　−ＡａＭｌｌ：Ｉ、の細胞毒性効果を保持し、結 合された３−ＡＣＭＥＩＪの抗−ｍ瘍活性は等モル量の遊離Ｎ−ＡａＭＫＬの活 性の５０倍に増加する（第１７図）。

Ｆ　（ａ　ｂ’）ｌ抱合体は、また試験管内で行われる細胞毒性検定で標的細胞 に特異性を示す（第１８図）。抱合体のＦ（ａ’ｂ’）１結合活性は抱合体中に 選択的細胞毒性を明らかに生じる。というのｉｊ　１’　（ａｂ’）ｍ抱合体は Ｎ　−ＡｃＭＦｌｉＬ単独よりも細胞毒性であるＬｙ−２Ｅ３細胞に対しτしか 細胞毒性を発揮しないからである。

これらの試験管内研究ｋ　％　Ｆ　（ａｂ’）１フラグメントが抱合体の特異性 及び細胞毒性の維持と共にＮ−ＡｃＭＩＬと共有結合することができるかどうか 確認するために行う。Ｎ　−ＡｃＭＥＬと抗−Ｌ７−２．１　へのＦ（ａｂ’） ｌフラグメントの抱合は、少数のＮ　−ＡｃＭＩｌ；Ｌ分子がＰ（ａ’ｂ’）１ に結合することができるけれども、すべての抗−Ｌ７−２．１　及び、Ｎ　−Ａ ＯＭＢＣＬの抱合に同等であるといえる。抗体活性、プロティン溶解度及び修復 を維持する。したがってＦ（ａｂ’）１抱合体は試験管内でインタクトエｇＧ抱 合体と同一の細胞毒性を示すことは驚くべきことではない。

Ｆ（ａｂ’）、抱合体の細胞毒性活性がすでに試験管内で立証されているので、 Ｆ（ａｂ’）、抱合体の生体内効能を証明された充実性腫瘍モデルを用いて調べ る。

最初の皮下腫瘍生長実験で、治療は触知できるかたまりが認められるまで開始せ ず、静脈内処理で投与されるもののうちＦ′（ａｂ′）！抱合体は最も有効な腫 瘍阻害剤である（第１９図）。その効果ｉｊ　１７−　ＡｃＭＫＬ−工ｇＧ処理 に比してほんの僅かしか優れておらず、Ｆ’　（ａｂ’）を抱合体処理したマウ スのすべては腫瘍サイズの減少を示しく　６／１０　）、２匹のマウスしが完全 に退化した腫瘍を有しない。この腫瘍は処理の終了後８日目で再び発生する。抱 合体治療の限界を評価するために、個々のマウスに静脈内抱合体処理の抗−腫瘍 活性を約束することを考慮するならば、ＣＢＦ、マウスに２．０Ｘ１０−細胞を 皮下注射し、充実性腫瘍発生１日前に静脈内処理を始める。これに於て及び最初 の腫瘍生長実験に於て、抱合体処理され九マウスにＮ　−ＡｃＭＥＬを投与した 場合、腫瘍サイズに於てより一層大きい減少がより一層早い時期の処理で達成さ れるう個々の唾瘍生長カーブは、腫瘍の９７１０が処理の経過中にサイズを減少 しく第２１図）、これらの膿瘍の５つが退化し、再び現われない（）２００日） ことを示す。この結果は、静脈内投与法を用いて皮下に注入された工Ｔ　Ｔ　（ １）　７５ＮＳＥ３＠瘍を治療した初めて成功列でろる。ＩＪ−ＡｃＭＥＬ−工 ｇＧ　３０　ｍｕｇでマウスをより一層早い時期に静脈内処理することは、Ｐ（ ａｂ’）２抱合体処理とほとんど同等に有効である。したがって２つの腫瘍生長 実験に於て膿瘍細胞数及び処理法を変えることによって、Ｎ　−ＡｃＭＥＬ−工 ｇＧ抱合体及びＦ（ａｂ’％抱合体の生体内効能の点で大きな相異を証明するこ とができなかった。Ｆ（ａｂ’）１フラグメントの重要な特徴は、マクロファー ジ及びヘパトサイト（ｈｅｐａｔｏａｙ−ｔｑθ）上にＩＰｃ　レセプターを結 合するできないことである。このことはそれ故抱合体蓄積を肝及び細網内皮シス テム中に限定しなければならず、そしてそのより一層小さいサイズのために、Ｉ Ｐ（ａｂ’）１抱合体は腫序の毛管状の網状組織を浸透することもできねばなら ない。しかしこれとは対照的に、より短い半生（より速い解除）及び一般１ｃＩ Ｆ（ａｂ’）　フラグメントのより低い親和性は、インタクトエｇＧ抱合体を用 ＭｏＡｂ消費の動力学、腫瘍サイズとＭｏＡｂ結合の間の関係並びＶＣＭｏＡｂ 貯蔵部位がＦ（ａｂ’）１及びインタフ）　ＭｏＡｂ−薬品抱合体の相対的有効 性を決定するのに価値ある基準であることは明白でおる。当然Ｆ（ａｂ’）１抱 合体を治療的に使用することの可能性は、腫瘍部位からのその急速な解除を補償 するに十分なほど高い薬用量を投与することによる。

引用文献　パートＢ ゴデイング Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ、　Ｗ、及びＬｉｅｗ、　Ｆ、　Ｙ、　；　？ウスＬｙ　− ２，１細胞表面抗原に対するモノクロナール抗体。免疫学り、　Ｓ、　、　Ｅｏ ｙｓｅ、　Ｅ、　Ａ、及び８ｔｏｃｋｅｒｔ、に、　；　（１９６８）白血病マ ウスのアスパラギン合成活性、サイエンス１６０　ｉ　５３３−５３５゜ パーハム Ｐａｒｈａｍ、Ｐ、（１９６３’）　ＢＡＬＢ　／　Ｏ？ウスからモノクロナゆ 　工ｇＧ１、工ｇＧ　２ａ及び工ｇＧ　２ｂ　のフラグメンテーションについて 。Ｊ、免疫学１３１　：　２８９５−２９０２゜ゼラと反応するリンパ細胞の副 集団を見つけるための敏感なロゼンティング法、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ２０　；　１７３−１８３　、１９７８゜スミス Ｓｍｙｔｈ、　Ｍ、　Ｊ、　、　Ｐｉｅｔｅｒｅｚ、　Ｇ、　Ａ、及びＭｃｋｅ ｎｚｉｅ、工、Ｆ。

Ｃ−：　（１９８Ｓａ）　モノクロナール抗体への抱合に於てＮ−アセチル−メ ルフアランの抗−腫瘍活性の選択的増加、Ｃｊａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ＋（新聞中に ）。

（１９８６１））メトトレキサーテーモノクロナール抗体抱合体の作用メカニズ ム、Ａｕ５ｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ。

ステ２ Ｓｔｅｌｌａ、　Ｖ、　Ｊ、及びＨｌｍｎｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｋ、　Ｊ、：　（ １９８０）プロドラッグ及びサイトスベシフインクドラッグデリバリイＪ、Ｍｅ ｄ、（！ｈｅｍ、　２３　：　１２７５−１２８２　。

Ｗａｈｌ、　Ｒ，Ｌ、　、　Ｐａｒｋｅｒ、　Ｏ，Ｗ、及びＰｈｉ’１ｐｏｔｔ 、　Ｇ、　Ｗ、：（１９８３）　モノクロナールＦ　（ａｂ’）１で改良された 放射性偉及び腫瘍局在化。Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、　２４　：　５１６−３２５ 凡例　パートＰ 第１５図：　Ｎ−ＡＱＭＢＬの抗−Ｌ７　２−　Ｉ　Ｐ（ａｂ’）２（ａ５ｑ） への結合。抗−Ｌｙ　−２，Ｉ　Ｐ（ａｂ’）１分子あたり導入Ｎ　−ＡｃＭＩ Ｌの分子（園）及びプロティン修復（・）を反応混合物中でＮ−）、ＱソＫＬの ｎ−Ｅニルの数の関数として示す（横座標）。

第１６図：　抗体力価を、Ｎ　Ｔ　Ｔ　（１）　７５１１８１　ｓ標的細胞上で Ｆ（ａｂ’）１抱合体の抗体希釈度に対する１１３ニーＦ　（ａ　ｂ’　）！結 合の減少率として測定する。いくつかの希釈を抗−１７−２，１（ム）、抗−Ｌ ｙ　−２，１，７（ａｂ’）ｌ　（閣）又はＦ（ａ’ｂ’）１抱合体（嗜）２０ モルＮ　−ＡａＭＥＬ　１モル抱合体のどれかのα８岬／−溶液について行う。

第１７１：　２４時間検定でＥ３細胞上で、遊離Ｎ　−ＡｃＭＢＬ　（■）、抗 −Ｌｙ　−２，１ＭｏＡｂに共有結合した！ｉ　−ＡｃＭＦ！Ｌ、　２０モルＮ 　−ＡｃＭＩＬ　１モル抱合体（○）又ｎ　Ｆ　（ａｂ’）Ｉ　ＭＯＡｂに共有 結合したＮ−ＡｃＭＥＬ、　２０モルＮ　−ＡＱＭＫＬ　１モル抱合体（・）の 阻害効果（テキスト参照）。。

第１８図：　３０分検定で抗体反応性細胞（Ｅ３）上で遊離Ｎ　−ＡＯＭＫＴＪ 　（■）又はＮ−ムｃＭＥＬ　−Ｐ　（ａｂ”）宜抱合体、２０モルＮ−ムＣＭ ＥＬ　／モル抱合体（・）及び抗体非反応性細胞（ｈＬ４）上で遊離Ｎ　−Ａｃ ＭＥＬＣ口）又は抱合体（○）の阻害効果。

第１９図：　３Ｘ１０６細胞を皮下注射された０ＢＦＩ　−ｆウスに於ける胸腺 膓Ｉ　Ｔ　？　（１）　７５ＮＳ　Ｅ　３の生長。マウス１０匹のグループＫ（ ↑）表示で静脈内部ｉ４を行う：ＰＢ！３（ロ）、遊１にＬ（園）、Ｎ　−Ａｃ ＭＥＬ−抗−Ｌｙ　−２，１抱合体（・）、Ｎ−ＡＣＭＥｉＬ　Ｆ　（ａｂ’） ｇ抱合体（○）及び抗−Ｌｙ　−２，１（ム）。誤差線は平均腫瘍サイズの士標 準誤差を表わす。

第２０図：　２ＸＩＬｌ・細胞を皮下注射されたＣＥＦＩマウスに於ける胸腺腫 工Ｔ　Ｔ　（１）　７５Ｎｅ　ｗ　３の生長。マウス１０匹のグループに（↑） 表示で静脈内に次の処理を行う：ＰＥ１３（ロ）、遊）４ＭＥＬ（◆）、Ｎ　− ＡｃＭＥＬ　−Ｆ　（ａｂ’）１抱合体（・）、Ｎ−ＡｃＭＥＬ−抗−ＴＦＲ抱 合体（◇）及び抗−Ｌｙ　−２，１（ム）。誤差線は平均腫瘍サイズの士標準誤 差を表わす。

第２１図：　２Ｘ１０・工Ｔ　Ｔ　（１）　７５ＮＳ　ｘ３腫瘍細胞を皮下注射 し、Ｎ　−ＡｃＭＥＬ　−Ｆ　（ａ’ｂ’）を抱合体を３，５及び６日月に静脈 内処理０貫）した（！ＥＦＸマウスの個々の腫瘍生長カーブ。破線はＰＥＳ処理 されたマウスの平均腫瘍サイズを示す。

本発明の精神及び範囲を逸脱することなく上述の事項に変更及び改変を加えるこ とができ、本発明はすべての新規な特徴及びここに記載された特徴の組み合せを 包含する。

７０　１４０　２１０　２８０３５０　４２０４９０　５６ＯＮａＭ（モル添加 １１ ＮａＭ（モル添加） 抗体希釈度　：ｘ　１０−’） 耐甜渡、（Ｍ） ＮａＭ濃度（Ｍｌ ＮａＭ濃度　（Ｍｌ 冶 ＮａＭ濃度（Ｍ） 薬品濃度（Ｍｌ 生存率％ 腫瘍接種後の日数 胆σ庸目」麦の日数 ＮａＭ　薬用量（ｍｇ／に９１ Ｎ−ＡｃＭＥＬ（モル　添加） Ｎ−＾ｃＭＥＬ濃度（Ｍｌ Ｎ−ＡｃＭＥＬ濃度°（Ｍ） 腫瘍接種後の日数 Ｈ勿扉接種後の日数 国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＸＲＣ）Ｉ　ＲＥ ＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼式Ｉ〔式中Ｒ１は式ＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼式ＩＩ（式中Ｒ４及びＲ５は同一又は異って いてよく、ブロム、クロル、ヨード又はアルキルスルホニルを示す。） であり、 Ｒ２は式ＩＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼式ＩＩＩ（式中Ｒ６及びＲ７は同一又は異っ ていてよく、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシ、ヒドロキシ又はアミノであ り、ｎは０−１０である。） であり、 Ｒ３はヒドロキシ又は抗原を結合する部位を有する残基によって離脱するか又は この残基によって置き代えられる基であり、あるいはＲ３は抗原を結合する部位 を有する残基である。〕なる化合物。
2. ２．Ｒ３は隣接−ＣＯ−基と共に活性エステル基、混合無水物、Ｎ−ヒドロキシ スルホサクシンイミド、アジド及びｐ−ニトロフェニルエステルなる群から選ば れる請求の範囲第１項記載の化合物。
3. ３．Ｒ３はＮ−ヒドロキシサクシンイミドである請求の範囲第１項記載の化合物 。
4. ４．Ｒ３は抗体、抗体ポリマー、抗体マノマー又は抗原を結合する部位を有する 抗体フラグメントである請求の範囲第１項記載の化合物。
5. ５．Ｒ３は胸、脳、色素細胞腫、肺、すい臓及び結腸腫瘍に特異性を示す群から 選ばれた抗体、抗体ポリマー、抗体マノマー又は抗原を結合する部位を有する抗 体フラグメントである請求の範囲第１項記載の化合物。
6. ６．Ｒ３は抗原を結合する部位を有する抗体フラグメントであり、Ｆ（ａｂ′） ２及びＦ（ａｂ′）、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３から選ば れる請求の範囲第１項記載の化合物。
7. ７．式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼式Ｉ〔式中Ｒ１は式ＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼式ＩＩ（式中Ｒ４及びＲ５は同一又は異って いてよく、ブロム、クロル、ヨード又はアルキルスルホニルを示す。） であり、 Ｒ２は式ＩＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼式ＩＩＩ（式中Ｒ６及びＲ７は同一又は異っ ていてよく、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシ、ヒドロキシ又はアミノであ り、ｎは０ −１０である。） であり、 Ｒ２はヒドロキシ又は抗原を結合する部位を有する残基によって離脱するか又は この残基によって置き代えられる基であり、あるいはＲ２は抗原を結合する部位 を有する残基である。〕なる化合物を製造するにあたり、メルフアランをＲ２− ＣＯ−基を有するアシル化化合物アシル化して式ＩＶ ▲数式、化学式、表等があります▼式ＩＶなる化合物をなし、その後所望の場合 には式ＩＶなる化合物を上記の様な基Ｒを有する化合物と反応させることよりな る上記式Ｉなる化合物の製造方法。
8. ８．式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼式Ｉ〔式中Ｒは式ＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼式ＩＩ（式中Ｒ４及びＲ５は同一又は異って いてよく、ブロム、クロル、ヨード又はアルキルスルホニルを示す。） であり、 Ｒ２は式ＩＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼式ＩＩＩ（式中Ｒ６及びＲ７は同一又は異っ ていてよく、Ｈ、アルキル、アリール、カルボキシ、ヒドロキシ又はアミノであ り、ｎは０−１０である。） であり、 Ｒ３は抗原を結合する部位を有する残基である。〕なる化合物と薬学的に妥当な 希釈剤から成る薬理学的組成物。
9. ９．本発明の式Ｉなる化合物、例、テスト又は処理のどれか１つに関して前述し た様に化合物を又は実質的にその化合物を含有する薬学的組成物を製造する方法 。
10. １０．本発明の明細書及び／又は請求の範囲に個々に又は集合的に言及された又 は示された物品、物質、部品、成分、手段、特徴、方法、工程、化合物及び組成 物及びそれらのうちのどれか２つ又はそれ以上のいくつか及びすべての組成物。