JPS63258484A - マルトオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はマルトオリゴ糖の製造法に関し、詳しくは固定
化酵素にでんぷん等の基質を作用させてマルトオリゴ糖
を効率よく製造する方法に関する。

〔従来の技術１発明が解決しようとする問題点〕マルト
オリゴ糖の有用性に着目し、マルトオリゴ糖に関する研
究が盛んに行われるようになってきたが、現在のところ
工業的に大量生産されているのはマルトースのみである
。マルトトリオース。

マルトペンタオースなどは試薬用などとして少量生産さ
れているにすぎない。

マルトオリゴ糖の生産をでんぷんを原料として行う方法
が提案されており、たとえばマルトペンタオースの生産
を、でんぷん懸濁液にα−アミラーゼを加えて液化後、
酵素を失活させ、さらに当該液化でんぷん液にマルトペ
ンタオース生成酵素を加えて反応させるというバッチ法
が行われている。そのほか、酵素を吸着樹脂等の高分子
担体に吸着させてカラムに充填し、これに基質を通液し
て反応性成物を得る方法も採用されている。

しかしながら、ハツチ法は反応に長時間を要する上に、
酵素の再使用ができないため、酵素コストが高くつく等
の問題点がある。また、カラムを用いる固定化法では基
質としてでんぷんを用いるため、カラム内で老化が起き
たり、流速等により担体から酵素が離脱しやすく、長期
間の運転が困難である等の問題点がある。しかも、吸着
樹脂と基質の接着時間が長くなると、該樹脂表面に基質
が詰まったり、カラム上部で生成したマルトオリゴ糖が
下部へ移動する間に反応が進行し、目的物の純度が低下
する。

そこで、本発明者らはマルトオリゴ糖生成酵素の担体に
ついて検討を重ね、該酵素を多孔質中空子膜に固定化す
ることにより該酵素の繰返し使用と長期運転が可能とな
ることを見出し、かかる知見に基いて本発明を完成する
に至った。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、マルトオリゴ糖生成酵素を多孔質中空子膜に
吸着させた固定化酵素にでんぷん、でんぷんの組成画分
およびでんぷんの分解反応生成物のうちの少なくとも１
種の物質を接触させることを特徴とするマルトオリゴ糖
の製造法を提供するものである。

本発明に用いるマルトオリゴ糖生成酵素はその起源を問
わず、動物、植物、微生物等に由来するものを任意に使
用できる。以下に本発明に使用することができるマルト
オリゴ糖生成酵素を例示する。

マルトース（Ｇ２）生成酵素 （１）植物起源β−アミラーゼ：オオムギ起源（Ｊ、　
Ｉｎ５ｔ、　Ｂｒｅｗｉｎｇ、、　６３．２４（１９５
７））　、ダイズ起ｆｉ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　
９５．６２１（１９６５））＋　コムギ起源（Ｃｅｒｅ
ａｌ　ｃｈｅｍ、、　４３．６２（１９６６））、甘藷
起源（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

４、７１４（１９６５）） （２）微生物起源β−アミラーゼ：バチルス・セレウス
起源（特公昭５６−２０８３５＞、バチルス・ポリミキ
サ起源（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｆｌｉｏｐｈ
ｙｓ。

月猟、　３３Ｂ−３４５（１９６４））、バチルス・メ
ガテリウム起ｆＪ（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、、　３８．１０２３−１０２９（１９７４））。

バチルス属ＢＱＩＯ起源（醗酵工学、　５７，１０２−
１１３（１９７９））、シュードモナス属ＢＱ６起源（
醗酵工学。

尼、　１０２−１１３（１９７９） （３）　　α−マルトース生成アミラーゼ：ストレプト
ミセス・プラエコソクスＮＡ−２３７起源（澱粉科学、
毅、　１５５−１６１（１９７８）Ｌ　ストレプトミセ
ス・トザエンシス起源（特開昭５Ｏ−１２５０４６）。

ストレプトミセス・パイグロスコピカス起＃（昭和４７
年度日本農芸化学大会講演要旨集８６頁マルトトリオー
ス（Ｇ３）生成酵素 （］、）　　ストレプトミセス・グリセウス起源（特公
昭５５−３７２３７．同５７−６９１５．澱粉科学２部
、　１７５（１９７９）　） （２）バチルス・ズブチリス起源（昭和５８年度日本農
芸化学大会要旨集１６９頁（１９８３）　’）マルトテ
トラオース（Ｇ４）生成酵素 （１）　　シュードモナス・スッソチェリ起源（Ａｒｃ
ｈ。

旧ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１４５．１０５
（１９７１））（２）　　シュードモナス・ザソカロフ
ィラ起源（特開昭６１−２０２６８７．同６ｍ−２０２
７００）マルトベンフォース（Ｇ５）生成酵素 （１１バチルス・リケニフォルミス起１ｌｌ（Ａｒｃｈ
。

Ｂｉｏｃｂｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１５道２９０
（１９７３）、特公昭５Ｏ（２）　　バチルス・セレウ
ス起源（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

（特開昭６Ｏ−１８８０６５） マルトヘキサオース（Ｇ６）生成酵素 （１）　　エアロバクター・エアロゲネス起源（アミラ
ーゼシンポジウム、　６．３１（１９７１）、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、、　４１０．３３３（１
９７５））（２）バチルス・サーキュランス起源（Ａｇ
ｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　４６．１５３９（１９Ｂ２）、澱粉科学
、　２９．１４５（１９８２））（３）バチルス・サー
キュランス起源（澱粉科学。

毅、　１０７（１９８２）　） マルトヘプタオース（Ｇ、）生成酵素 ＋１１　　穀類起源α−アミラーゼ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｊ、＋　５６＋８６（１９５４）、　Ａｒｃｈ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　９４．１２１（１
９６１）。

同誌、凹、　１０５（１９６２）、！粉科学、　２４．
４２（１９７７））上記マルトオリゴ糖生成酵素は高価
であるので、これら酵素を用いてマルトオリゴ糖を製造
するにあたっては、これら酵素を効率よく使用すること
が重要である。そのため、本発明ではこれら酵素を固定
化して用いるのである。

本発明ではマルトオリゴ糖生成酵素を多孔質中空子膜に
吸着させて固定化する。本発明に用いる膜モジュールは
基質が膜の外側から内側へ流れる構造を有しているため
、膜内側における高分子基質の目詰まりが少なく、スム
ーズな反応を行なうことができる。膜の形状としては中
空子型とキャピラリー型のいずれも使用でき、膜の材質
としてはセルロースアセテート、セルロースニトレート
等のセルロース系、フッ素系、ポリプロピレンなどから
なるＭＦ膜（精密濾過膜）およびポリアミド、ポリイミ
ド、ポリスルホン、ポリアクリロニトリルなどからなる
ＵＦ膜（限外濾過膜）等を使用することができる。

本発明では酵素の分子量により膜の排除限界分子量を変
えることにより高分子基質の透過をスムーズに行なうこ
とができ、排除限界分子量８，０００以上、通常は８，
０００〜１００，０００の膜を使用する。

また、膜への酵素の固定化は任意の方法で行なうことが
でき、たとえば膜条孔質表面への官能基の導入により活
性化して行なう方法があり、本発明では共有結合法によ
る酵素の固定化が好ましい。

共有結合法の中で架橋試薬による脱活性化法が最も有効
である。架橋試薬としては既知のものを使用でき、たと
えばグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナ
ート、トルエンジイソシアナートへキサメチレンジイソ
チオシアナート、ビスジアゾベンジジン、ベンジジン−
２，２”−ジスルホン酸、Ｎ、Ｎ’−エチレンビスマレ
インイミド、Ｎ、Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセト
アミド等があり、とりわけグルタルアルデヒドが好適で
ある。

その他の共有結合法として、酵素を膜の芳香族アミノ基
に固定化するジアゾカップリング法；カルボキシル基を
持つ膜をアジド、クロリド、カルボジイミド、イソシア
ナートなどの誘導体として、これと酵素タンパク胃中の
遊離アミン基とを結合させるペプチド法；ウッドワーク
試薬に、カルボジイミド試薬等のペプチド縮合試薬を用
いる方法；さらには酵素タンパク胃中の遊離アミノ基、
フェノール性の水酸基等をハロゲン等の官能基を有する
膜に固定化するアルキル化法などの共有結合法等を膜の
材質を考慮して選択、適用できる。

膜への酵素の固定化ならびに酵素反応試験は膜モジュー
ルを接続した酵素固定膜反応装置を使用して行なう。該
装置の主機能は次の通りである。

すなわち、基質溶液を基質タンクと酵素固定膜モジュー
ルにポンプで循環させて酵素反応を行ない、生成物は膜
を透過させ、未反応液はバイパスを通して基質タンクに
戻し、再度反応に供する。また、酵素の固定化は基質溶
液の代りに酵素液を入れ、透過液ラインを基質タンクに
接続し、ポンプで循環させることにより行なうことがで
きる。なお、膜透過液と同量の基質溶液が自動的にリザ
ーバータンクから補給することができ、連続運転を行な
それぞれ一定に保つことができる。

酵素の固定化についてマルトペンタオース生成酵素の場
合を例として説明すると、キャピラリー膜を使用し、ポ
リスルホン製のハウジングにセントする。これに１〜５
％のグルタルアルデヒド溶液を室温で７〜８時間循環さ
せて膜表面を活性化させる。この処理を４０℃で行なえ
ば４〜５時間で活性化は終了する。次いで、膜モジユー
ル内の残留グルタルアルデヒドを約１βの蒸留水で洗浄
する。

洗浄後、０．２〜１０■タンパク質７ｍＡのマルトペン
タオース生成酵素溶液を１０℃以下の低温で循環して固
定化する。固定化後、低温下にて基質タンク、配管、モ
ジュール内の未反応の酵素を回収したのち膜条孔質内部
の未反応酵素を逆洗浄により回収し、その後緩衝液で洗
浄する。

次に、本発明に用いる基質について説明する。

まず、でんぷんとしては、たとえば馬鈴薯、せ轟、トウ
モロコシ、モチトウモロコシ、　大麦、　小麦、米、タ
ピオカ、サゴなどの任意の原料から得られるものを使用
することができる。また、でんぷんの組成画分としては
、たとえばアミロース。

アミロペクチンなどがあり、でんぷんの分解反応生成物
としては、たとえば白色デキストリン、黄色デキストリ
ン、ブリティッシュガムなどの焙焼デキストリン；酸化
でんぷん、低粘性変性（酵素。

酸１機械高速攪拌等の処理による）でんぷんなどの化工
でんぷん；リン酸でんぷん、酢酸でんぷんなどで代表さ
れるでんぷんエーテル、でんぷんエステルなどのでんぷ
ん誘導体；放射線や中性子線を照射したり高周波処理あ
るいは温熱処理したでんぷんなどの物理的処理でんぷん
；α−でんぷんなどを挙げることができる。これらので
んぷん類は単独もしくは２種以上を組合セで用いること
ができる。

固定化酵素に基質を接触させて行なう反応は、使用する
酵素の性質、基質の性状等を考慮して条件を設定すれば
よく、たとえばマルトペンタオースを製造する場合、反
応温度は酵素の安定性、至適温度を考慮して４０〜４５
°Ｃとし、基質濃度を０．１〜３０％、好ましくは０．
５〜１０％として行なえばよい。また、基質のｐｌ＋は
４〜ＩＯで良いが、安定性や最も効率よくマルトペンタ
オースを生成する点で８〜８．５とすることが好ましい
。なお、運転の際の循環流量はマルトペンタオースの生
成率にそれ程大きな影響を及ぼさない。また、操作圧力
は低圧よりもやや高い圧力にて行なう方が透過速度も速
く、反応生成物中のマルトペンタオースの純度も高くな
るので好ましい。サニテーションの面ではラインに紫外
線殺菌装置を導入することにより雑菌の混入を防止する
ことができる。

フル１−ペンタオースの場合、３５％程度の生成率が得
られるが、他のオリゴ糖の副生を抑えるためにフル１−
ペンタオースが約３０％生成した時点で反応を終了させ
ることが望ましい。

酵素反応終ｒ後、反応液から常法により目的とするマル
トオリゴ糖を分離、精製する。

〔実施例〕

多孔質中空子膜（日東電工０菊製、膜モジ１−ルＮＴＥ
−３７０、有効膜面積０．１　％）を酵素固定膜反応装
置メンブレンマスター１３Ｍ−１（日東電工０菊製）に
接線し、膜の活性化とマルトペンタオース生成酵素の膜
への固定及びマルトペンタオースの製造を行なった。す
なわち、５％グルタルアルデヒド溶液を循環流量１１７
ｍ１ｎ、圧力０．６ｋｇ　／　ｃｔの条件で７時間室温
にて循環させて膜の活性化処理を行なった。次いで、こ
の活性化膜を室温にて１１の蒸留水で洗浄した後、マル
トペンタオース生成酵素（シ１−トモナス・エスピーＫ
Ｏ−８９４０起源、特開昭６Ｏ−１８８０６５）を固定
化した。固定化は、タンパク量１■／ｍｅのマルＩ・ペ
ンタオース生成酵素（活性ハ１６．７［Ｕ／ｍｊ！＞８
００ｍ７！を流量０．８　ＩＩ　／ｍｉｎ、圧力０．４
５　ｋｇ　／　ｃＪ。

温度５℃で１４時間循環させることにより行った。

酵素の固定化率（タンパク吸着率）は５１．２％であっ
た。吸着後の洗浄には２０ｍＭ１□リス−塩酸緩衝液（
ｐｌ＋　８　）を使用した。

このマルトペンタオース生成酵素固定膜を用いて基質を
通液し反応試験を行なった。基質には２％可溶性でんぷ
ん（ｐＨ８，純正化学製）を用い、濾紙で濾過後に通液
した。通液温度４５℃、循環流量０．６　ｊ！　／ｍｉ
ｎ、圧力０．４．　ｋｇ　／　ｃｔＡで運転し、透過液
を一定量ずつサンプリングし、反応生成物をＲｉｏ−Ｒ
ａｄ　ＩＩ　Ｐ　Ｘ　４２　Ａカラムを用いた高速液体
クロマトグラフィーで分析し確認した。この結果を第１
図に示す。

次に、同様の運転条件で基質として６％デキストリン水
溶液（ｐｌ＋８、パインデノクス＃１００、松谷化学製
）を使用した場合の結果を第２図に示す。

図から明らかなように、安定してマルトペンタオースが
生成している。また、第３図に示したように、基質に可
溶性でんぷんを用いた場合の同じ膜を用いての繰り返し
試験では、反応試験及び逆洗浄を１サイクルとして２０
回の運転サイクルを行なった後も酵素の活性低下はほと
んど認められず、安定してマルトペンタオースを製造す
ることができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、でんぷん類からマルトオリゴＩＪＮを
効率よく製造することができる。特に、膜を用いて固定
化酵素反応を行なうため、圧力による反応制御が可能で
あり、しかも膜への基質の目詰りもなく、長期間安定的
に反応を行なうことができる。また、酵素の繰返し使用
が可能なことも本発明の特色の１つである。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の実施例における透過液量
と反応生成物の生成率との関係を示すグラフ、第３図は
本発明の実施例における運転回数とｔｉ　ｆｓ度の関係
を示すグラフである。 Ｑ　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　
　　　　　　２賃及〕夜Ｊ　（１） 第２図 ｊメム五ｌンたζ量　ｔｌノ 運転回数（訪

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）マルトオリゴ糖生成酵素を多孔質中空子膜に吸着
   させた固定化酵素にでんぷん、でんぷんの組成画分およ
   びでんぷん分解反応生成物のうちの少なくとも１種の物
   質を接触させることを特徴とするマルトオリゴ糖の製造
   法。
2. （２）多孔質中空子膜が排除限界分子量８，０００以上
   の膜である特許請求の範囲第１項記載の方法。