JPS63243758A - 低ｐＩ蛋白質又は炭水化物で被覆された膜構造物並びにその製造及び使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、被覆された微孔性膜（メンブレン）からなる
膜構造物に関する。本発明は、また、この膜構造物の製
造法及び凝集法に於けるその使用法に関する。

〔従来の技術〕

微孔性膜は物質を分離するために多くの用途に使用され
てきた。このような物質は、種々の無機又は有機物質か
ら製造できる。例えば、ポリアミド微孔性膜が、その親
水性及び分離性能のために凝集分析用に使用されてきた
。

米国特許第４，０６６．５１２号には、ゼイン又はコラ
ーゲンのような水−不溶性蛋白質の被覆を有する微孔性
膜からなる膜構造体、及びそのような構造体の製造法が
記載されている。酵素は、生物学的反応のための大きな
安定した触媒表面を与えるために蛋白質被覆に結合して
いる。微孔性膜を製造するための有用な物質には、セル
ロースエステル及びナイロンのようなポリアミドが含ま
れる。

〔解決すべき課題〕

ポリアミド物質は、上記のような触媒膜構造物中の微孔
性膜として有用であるが、１個の免疫反応性種とそのレ
セプターとの反応を含む免疫分析で使用されるときに問
題がある。ナイロン膜は、特に、抗体及び抗原のような
免疫反応性種と存非特異的に反応しやすい。即ち、免疫
反応種は、恐らく対応するレセプター分子の代わりに、
又はレセプター分子の不存在下に、膜のサイトと錯体（
コンプレックス）化しやすい。即ち、このような免疫種
が、凝集分析で膜の近くに置かれる固体キャリアー物質
（例えば、ポリマービーズ）上に固定化されるとき、液
膜と該キャリアーとの間に望ましくない反応（又は相互
作用）が生じる。これらの望ましくない反応は、バック
グラウンド干渉と分析感度の低下とを惹き起こす。免疫
反応性種の活性に干渉しない膜を有することが非常に望
ましい。

米国特許第４，０６６．５１２号に記載された水不溶性
蛋白質は、免疫反応性種との望ましくない反応を減少さ
せるために有用である。しかしながら、これらの蛋白質
は、被覆工程に於て有機溶剤を使用することが必要であ
り、そのために不快な臭気、引火性、及び廃棄物処理の
ような有機溶剤に伴う別の諸問題が生ずる。従って、有
機被覆溶剤に付随する問題無しに、上記の反応を減少さ
せるか又は除くことが望ましい。

〔課題を解決するための手段〕

上記課題は、生物学的に不活性な物質から作られ、１０
−未満の平均孔サイズを有し、その上に５より大きいｐ
Ｉを有しない１種又は２種以上の水溶性蛋白質又は炭水
化物を含む被覆を有する微孔性膜からなる膜構造物によ
って克服される。

本発明は、また、（ａ）生物学的に不活性な物質から作
られ、１０１未満の平均孔サイズを有する微孔性膜を用
意し、そして、 （ｂ）該膜上に被覆を与える、１種又は２種以上の５よ
り大きいｐｌを有しない水溶性蛋白質又は炭水化物を液
膜の多孔度を実質的に減らすことなしに該膜全面に被覆
を与えるに十分な量で含む溶液と、前記微孔性膜を接触
させることから成る、膜構造物の製造方法を提供する。

本発明は、更に、水性液体中の多価免疫種を測定するに
あたり、 （ａ）水性液体を、免疫種と反応性のレセプター分子を
協働的に有する凝集試薬と接触させて、免疫種とレセプ
ター分子との反応生成物の凝集体を形成させ、 （ｂ）接触工程（ａ）と同時にか又はそれに続いて、該
凝集体を前記膜構造物と接触させ、（Ｃ）該凝集体を非
凝集物質から分離し、そして、 （ｄ）凝集体の量又は非凝集物質のいずれかを測定する ことを含んで成る、水性液体中の多価免疫種の凝集反応
測定方法を提供する。

〔実施態様〕

その最も広い面に於て、本発明は、濾過、化学的及び生
物学的触媒、診断検査、分離、免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏ
ｓｏｒｐｔｉｏｎｓ）　、並びに、当業者にとって容易
に明らかな多くの用途を含む、種々の目的のために使用
できる膜構造体に関する。例えば、このような構造体は
、生物学的物質の滅菌濾過、水圧流体（ｈｙｄｒａｕｌ
ｉｃ　ｆｌｕｉｄｓ）の濾過、及び水分析のためのバク
テリア又は他の有機体の捕集のために使用できる。また
、酵素をその上に付けろことができ、得られたコンポジ
ット（ｃｏｍｐｏｓ　ｔ　ｔｅ）は上記米国特許第４，
０６６．５１２号に記載されたような生物学的触媒用に
使用される。

好ましい実施態様に於て、該構造体は、広範囲の種々の
免疫反応種（−価又は多価）を検出及び定量するために
有用である。このような種は、一般に対応するレセプタ
ー即ち対応する抗体と錯体化するための１個又は２個以
上のサイトを有する抗原である。また、検出されるべき
免疫反応種は、対応する抗原又は抗体と反応性の１個又
は２個以上の錯体化サイトを有する抗体で有り得る。本
発明によって検出できる免疫反応性種には、ストレプト
コッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　Ａ抗原、ク
ラミジル及び淋菌有機体からの抗原、ＨＴＬＶ又は旧Ｖ
（ヒト免疫欠如症ビールス）又はそれらへの抗体、ヒト
絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）　、ロイチナイズ化
（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン（ＬＨ）、ヘルペ
スビールス、医薬、抗生物質並びに他のホルモン性、細
菌性、又はビールス性抗体及び抗原が含まれるが、これ
らに限定されるものではない。ある例に於て、種は生物
学的標本中に見出される有機体又はビールスから抽出し
なければならない。与えられた種のための抽出方法は、
当業者に公知である。ストレプトコッカスＡ抗原のため
の典型的抽出方法を、次に記載する。

本発明に於て有用な微孔性膜は、あらゆる生物学的不活
性物質からなる薄い多孔性物質である。

このような物質は、対象の免疫反応性種又はそのレセプ
ターと反応又は相互作用せず、ガラス、セラミックス、
繊維、合成及び天然ポリマー並びに当該技術で公知の他
のもののような物質を含む。

好ましい物質は、セルロースエステル、ポリアミド、及
びポリエステルである。ナイロンのようなポリアミドは
最も好ましい。

本発明の膜構造体は、用途が濾過、分析又は他の類似の
用途のいずれであっても、意図する用途　゛のために十
分な多孔度を有さなくてはならない。

凝集分析で膜構造体を使用する実施態様に於て、多孔度
は流体及び非凝集物質の通過を許容するに十分であるが
、凝集した物質を保持するものでなくてはならない。換
言すれば、膜孔は、被覆の後、如何なる試薬及び非凝集
粒子の通過をも許容するために十分大きくなくてはなら
ないが、凝集粒子が通過することを許容するように十分
大きくてはならない。凝集分析に於ける使用のために、
平均膜孔サイズは、その時使用される凝集試薬の平均直
径の少なくとも５倍、好ましくは６〜１５倍である。更
に特に、膜の平均孔サイズは、一般的に１０−未満、好
ましくは、０．２〜５趨である。

有用な膜は、多くの供給者から商業的に入手し得る。例
えば、有用なポリアミド物質は、Ｐａ１ｌＣｏｒｐ、か
ら商業的に入手し得る。一つの有用な膜は、ＢＩＯＤＹ
ＮＥ　Ａ又はＵＬＴＩＰＯＲＮ−６６として上記会社に
より製造され市販されているナイロン−６６徽孔性膜で
ある。を用なセルロースアセテートｓも、商業的に入手
し得る。有用な膜は、特別の用途のために所望の形状に
成形できる。

上記のように、微孔性膜は、使用に先立って、１種又は
２種以上の水溶性蛋白質又は炭水化物で被覆される。一
般に、１種の蛋白質又は炭水化物のみがその上に被覆さ
れる。しかしながら、任意の水溶性蛋白質又は炭水化物
が、本発明によって予期し得ない結果を与えるのではな
く、本発明で有用な物質は、それぞれ、５より大きいｐ
Ｉを有しないものである。

用語ｐＩ　（又は、等電点）は、分子内に於ける正の電
荷と負の電荷が同じ数で分子が電荷的に中性である場合
のｐＩｆとして知られている。蛋白質又は炭水化物のｐ
Ｉは、公知の物質及び方法を使用して測定できる。例え
ば、それは、ＬＫＢ　ＡｍｐｈｏｌｉｎｅＰＡＧ　ｐｌ
ａｔｅ　、　ｐＨ範囲３．５〜９．５、及び標準測定器
（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ）を使用
する等電的合焦（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓ
ｉｎｇ）によって測定できる。

有用な水溶性蛋白質には、カゼイン誘導体又は負に荷電
している他の蛋白質誘導体（例えば、スクシニル化カゼ
イン、スクシニル化ウシ血清アルブミン、及びスクシニ
ル化コラーゲンのようなカゼインのアシル化、アルキル
化、又はスルフォン化により得られる誘導体、並びに、
当業者に容易に明かな他の負に荷電した蛋白質又は炭水
化物）が含まれる。これらの物質は、適当な条件を用い
て、利用できるアミン基を有する蛋白質を、アシル化、
アルキル化、又はスルフォン化することによって容易に
製造される。有用なアシル化剤には、ジカルボキシル酸
及びポリカルボキシル酸から誘逗される無水物、アシル
ハライド及びエステルのような、米国特許第４，５９Ｌ
５７１号に記載されたものが含まれるが、これらに限定
されない。無水琥珀酸は、好ましいアシル化剤である。

スクシニル化カゼインの製造は、下記例３に記載されて
いる。

本発明に於て使用される蛋白質を変性するために有用な
アルキル化剤及びスルフォニル化剤には、ブロモ酢酸、
クロロ酢酸、フルオロニトロベンゼン、ｍ−（クロロス
ルフォニル）安息香酸、ブロモマロン酸、ブロモプロピ
オン酸、及びｐ−（クロロスルフォニル）安息香酸が含
まれるが、これらに限定されない。

有用な炭水化物には、水溶性セルロース誘導体が含まれ
る。代表的化合物は、カルボキシメチルセルロース、カ
ルボキシエチルセルロース及び当業者に容易に明かな他
のものである。これらのセルロース誘導体は、一般に商
業的に入手し得る。

好ましい被覆物質には、スクシニル化カゼイン、カルボ
キシメチルセルロース、スクシニル化ウシ血清アルブミ
ン、及びスクシニル化コラーゲンが含まれる。スクシニ
ル化カゼインが最も好ましい。

膜構造体は、所望の形状の微孔性膜を、適当な蛋白質又
は炭水化物の水溶液と接触させ、蛋白質又は炭水化物の
溶液が室温で膜を通過できるようにすることによって製
造できる。ある場合には、該溶液を４０℃に数分間加熱
することが有用である。該溶液中に存在する全蛋白質又
は炭水化物は、　。

酸膜の多孔度を実質的に減らすことなしに該膜全面に被
覆を与えるに十分な壇である。換言すれば、被覆は膜の
表面を完全にカバーするが、膜の孔が望ましくない範囲
にまでふさがれないように十分薄くなくてはならない。

被覆前の膜の最初の多孔度の少なくとも５０％が、被覆
後に残っていなくてはならない。このような結果を達成
するために必要な蛋白質又は炭水化物の量は、膜の多孔
度、溶液粘度、及び平均孔サイズに依存して変わるが、
−Ｓ的に、膜を被覆するために十分な量は、少なくとも
２５℃ｇｌｃｒ＆膜表面である。非常に少量の蛋白質又
は炭水化物が、膜被覆後に被覆溶液中に残っている。

被覆された膜構造体は、湿潤状態で直ちに使用できる。

しかしながら、貯蔵及び後の使用のために乾燥すること
もできる。あらゆる乾燥技術が、被覆が悪い影響を受け
ない限り使用できる。

本発明の膜構造体は多くの用途に使用できるが、ストレ
プトコッカスＡ抗原のような多価免疫反応種を検出する
ために使用することが好ましい。ストレプトコッカスＡ
抗原に関する本発明のこの態様は、例示する目的で示さ
れるものであるが、本発明の範囲をそのように限定する
ものでないと理解されるであろう。

ストレプトコッカスＡ有機体を含有すると考えられる生
物学的試料は、あらゆる適当な手段で患者から集めるこ
とができる。しかしながら、一般的に、塗布手段（ａｐ
ｐｌｉｃａｔｏｒ　ｍｅａｎｓ）が、感染している疑い
のある領域に適用綿棒（ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ　ｓｗａ
ｂ）を接触させて１、もし存在しているならばストレプ
トコッカスＡの細胞を集めることによって、生物学的試
料を集めるために使用される。続いて、抗原が適当な方
法で有機体から抽出される。好ましい抽出方法には、該
綿棒を、単独又は組合せで試料中の有機体、標本細胞及
び他の組織片からストレプトコッカスＡ抗原を放出する
１種又は２種以上の試薬を含む適当な抽出組成物中に浸
漬することが含まれる。

当該技術で公知の有用な抽出組成物には、ヨーロッパ特
許公報第１５０，５６７号に記載されたような、亜硝酸
塩と氷酢酸の混合物、及び米国特許第４，６１８，５７
６号に記載されたような細菌ストレプトマイセスアルプ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｓ）から誘導
された酵素が含まれる。他の抽出組成物は、硝酸塩（例
えば、硝酸ナトリウム又は硝酸カリウム）と非揮発性有
機酸（例えば、琥珀酸又はクエン酸）との混合物である
。

抽出に続いて、もし所望ならば短時間のインキュベーシ
ョンをしてもよい。遠心分離を、無関係の物質を除くた
めに使用することもできる。抽出後、抽出された抗原を
含有する媒体を、もし必要ならば媒体ｐｌ＋を抗原−抗
体反応に適するようにするために中和することもできる
。このような任意の工程は、例えば、５ｌｉｆｋｉｎ　
ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、１
５（１）、１８７　１８９頁（１９８２）に記載されて
いる。

多価免疫反応性種、例えば、ストレプトコッカスＡ抗原
の存在は、粒子の表面に適当な手段で結合している種と
反応性のレセプター分子（例えば、ストレプトコッカス
Ａ抗原の抗体）を有する水不溶性粒子からなる凝集試薬
によって検出される。

免疫反応性種とレセプターとの反応（又は結合）は、次
いで粒子同士が結合する結果となり、大きな凝集体を形
成する。

種の量は、凝集体の量又は非凝集物質の量を測定するこ
とによって分析できる。検出は、当業者に容易に明かな
適当な方法、例えば、凝集体の量を目視観察することに
よって行なうことができる。

好ましくは、トレーサー分子が、下記に詳細に記載する
ように、粒子との集合物で使用される。

指示試薬に於て有用である適当な粒子は、水不溶性で、
ある方法で集合される適当な数のトレーサー分子を有し
得る天然又は合成の粒子とすることができる。有用な粒
子の例には、フェリチン結晶、アガロース（ａｇａｒｏ
ｓｅ）粒子、ガラスピーズ、ラテックス粒子のようなポ
リマー粒子、及び当該技術で公知の他のものが含まれる
。次の文献には代表的な有用な粒子が記載されている。

米国特許第３．７００．６０９号、同第３．８５３，９
８７号、同第４，１０８，９７２号、同第４．２５８．
００１号、同第４，４０１，７６５号、同第４．４１９
，４５３号、同第４，４５９，３６１号、同第４．４７
８．９４６号、及び同第４，５９Ｌ５７１号。凝集分析
に於て有用な粒子は、一般に非常に小さく、即ち直径が
２−未満である。好ましくは０．１〜１声の平均直径を
有する。

特に有用な粒子は、ポリマーラテックス粒子であり、更
に好ましくはコアーシェルポリマーラテックス粒子とし
て当該技術分野で公知のものである。広範囲の種々のモ
ノマーが、粒子が水不溶性である限り、このような粒子
の製造に使用できる。

ポリマー化学に於ける当業者は、適切なラテックス粒子
を設計し製造できる。本発明の実施で使用される好まし
いコアーシェルポリマーラテックス粒子は、下記例２に
記載する。これらの粒子は、スチレンのホモ−又はコポ
リマーから成るコアと、クロロメチルスチレンのホモ−
又はコポリマーから成るシェルを有する。

本発明の実施に於て有用な粒子は、好ましくは、凝集体
又は非凝集物質中のトレーサーの量から種の定量的分析
をするために、それと−緒になる十分なトレーサー分子
を有している。トレーサー分子は、適当には粒子の外表
面に付いているか、又は、好ましくは、粒子内に分布し
ている。凝集体を検出する如何なるトレーサー物質も使
用できる。

もし、フェリチン結晶が粒子として使用されるならば、
トレーサー分子はそれらの結晶中に元々ある鉄の分子で
ある。他の天然又は合成粒子は、トレーサーとしてラジ
オアイソトープ、比色染料、蛍光物質、化学ルミネッセ
ンス化合物、燐光化合物、及び当該技術で公知の他の検
出し得る物質を有し得る。好ましくは、トレーサーは、
ラジオアイソトープ、比色染料、又は蛍光物質（例えば
、米国特許第４．２５９，３１３号に記載されているよ
うな蛍光染料又は希土類キレート）である。最も好まし
くは、トレーサーは比色染料である。当業者は、適切な
トレーサーを使用される特定の粒子と組み合わせること
ができる。

トレーサーは、適当な方法で粒子中に分布される。例え
ば、トレーサーは例えば、米国特許第３．８５３，９８
７号に示されているようにして、均一に分布できる。好
ましくは、トレーサー分子は粒子の限定された領域、例
えば、表面付近又は内部に優位に位置される。好ましい
コアーシェル粒子に於て、コア又はシェルのいずれかに
あるが、最も好ましくは、実質的に粒子のコアにある。

換言すれば、該染料の非常に少量部分（例えば、５重量
％未満）が、粒子のシェル部分にある。

検出すべき免疫反応性種（ストレプトコッカスＡ抗原の
ような）と反応性のレセプター分子（例えば、抗体）は
、適当な手段、例えば、吸着又は共有結合によって粒子
の外側表面に結合している。

結合は例えば、上記文献に記載されたような公知の技術
を使用して達成できる。共有結合が好ましい。レセプタ
ー分子が抗体あるとき、モノクローナル又はポリクロー
ナルの何れも使用できる。抗体く全体又はその一部）は
、商業的に入手できるか又は公知技術を使用して製造で
きる。

抽出された免疫反応性種とレセプター分子とを接触させ
て凝集体を形成すると同時か又はその後で、凝集体をま
た本発明の水不溶性膜構造物と接触させる。一つの実施
態様に於て、凝集体は分離した容器内で形成でき、次い
で膜構造体と接触させる。また、好ましくは、凝集体は
、例えば、分析が行なわれる試験装置内に装着されてい
る膜構造体の存在下に形成される。

適当なインキュベーション期間が、もし望むならば、膜
と接触する前又は接触の間に、ａ集を最適化するために
使用できる。この期間の後で、非凝集残渣物質を、凝集
体を膜上に残しながら、膜から洗出する。この工程で如
何なる適当な洗浄流体も使用できるが、好ましくは、洗
浄溶液は５〜１０のｐＨを有し、塩のようなイオン性化
合物を含有する。

一度非凝集残漬物質が膜から洗出されると、凝集体又は
非凝集物質中の免疫反応性種の量は、もし、トレーサー
が容易に目視できる比色染料であるならば、一般に肉眼
で決定できる。他方、標準比色検出装置が使用できる。

他の種類のトレーサー、例えば、ラジオアイソトープ、
蛍光染料、燐光染料及び類似物は、適当な検出装置を必
要とする。

本発明をこれに限定するものではないが、免疫反応性種
の分析は、本発明の膜構造体からなる適当な試験装置を
使用して行なうことができる。このような装置は、抽出
された抗原が凝集試薬と反応するために堆積している１
個又は２個以上の窪みを有することができる。この試薬
、は、分析の間装置に添加でき、また、製造の時点でそ
の中に含ませることができる。一度凝集体が形成される
と、非凝集物質は膜から膜の下の分離した区画内に洗い
出すことができる。

スクシニル化カゼインは、下記例２に記載した方法によ
り製造した。

スクシニル化ウシ血清アルブミンは、ウシ血清アルブミ
ン（２００■）を０．５モル濃度燐酸ナトリウム緩衝液
（１０ｍｌ、ｐｌ＋８．５）に添加することによって製
造した。次いで琥珀酸無水物（２００■）を添加し、得
られた混合物を２５℃で３時間攪拌した。

混合物を、５ＰＥＣＴＲＡＰＯＲ２透析チユーブ（Ｓｐ
ｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ、＋Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｓ、Ｃａｌ１ｆｏｒｎｉ
ａ）を使用して蒸留水に対して透析した。１．６％の固
体を含む生成物１２−が得られた。ナトリウムアジド（
０，０１％）を保恒剤として添加した。

スクシニル化コラーゲンは、スクシニル化ウシ血清アル
ブミンを製造するために記載したのと同様な方法によっ
て製造し、生成物（１％固体）２０−を得た。

本例は、カルボキシメチルセルロースを使用する膜構造
体の、製造を示す。

ストレプトコッカスＡ抗原に対する抗体を、ビーズと抗
体とを約２時間垂直方向に回転させて（ｅｎｄ−ｏｖｅ
ｒ−ｅｎｄ）混合することによって、ユウロピウム（■
）（テノイルトリフルオロアセトン）３キレートを吸収
させた０、８μポリスチレンビーズに吸着させた。それ
によって結合した抗体の量は、ビーズ重量に対し５％で
あった。得られた凝集試薬の水溶液（０，３％固体）を
、それぞれ、（１）０．７５％カゼイン、（２）２％刊
カルボキシメチルセルロース、及び（３）２％ＴＭＴ力
ルポキシメチルセルロースで前処理されたナイロン−６
６微孔性膜（！ｌｚｍ平均孔サイズ）に添加した。次い
で、試薬を塩化ナトリウム（２００μｌ、１モル濃度塩
）の緩衝溶液（ｐＩｔ　８　）で洗浄した。次いで、バ
ックグラウンドレベルを洗浄工程の後にフィルター上に
残留する表面蛍光発光（励起３４２ｎｍ　、放射６１２
ｎｍ）の量を測定することによって分析した。この蛍光
発光値は、バックグラウンドの度合、即ち、膜構造体と
凝集試薬との間の反応の度合である。

蛍光発光値が低いほど、バンクグラウンドは低い。

下記第１表に、バックグラウンド蛍光発光の結果を示す
。カルボキシメチルセルロースがカゼインに比較してバ
ックグラウンドを実質的に減少したことが明かである。

監−上一表 ナイロン（カゼイン）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　８４４ナイ■ン（カル本キシメチ
ルセルトス、　　７Ｍ）　　　　　　　　　　　２５２
１−ユノクシニル　カゼインで−Ｕ　　　だｎ本例は、
膜構造体をスクシニル化カゼインで処理した他は例１と
同様である。

スクシニル化カゼインを次の方法で製造した。

カゼイン（５０ｇ）を０．５モル燐酸ナトリウムニ塩基
性（２，５リツトル、ｐＨ８，５）に添加した。得られ
た混合物を溶解を完結するために攪拌しながら４０℃に
加熱した。加熱を除いた後、無水琥珀＃（５０ｇ）を混
合物に添加し、次いで、常温で３時間連続的に攪拌しな
がらインキュベーションした。得られた溶液を、１００
０分子量のカットオフ膜（ＯＫ　−ＰＳとして人手可能
）を通して濾過した。

流出物の最初の固有抵抗は、１７．５ミリオームであっ
た。約８回繰り返した（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）後、固有抵
抗は１．７ミリオームに低下した。ついで、溶液を集め
、脱イオン水で２％固体に希釈した。

ナイロン−６６徽孔性膜を２％固体を含有するスクシニ
ル化カゼイン溶液（５０ｍ）で被覆して、膜構造体を製
造した。

ストレプトコッカスＡ抗原に対する抗体を、コア中のポ
リ　（スチレン−共−２−アセトアセトキシエチルメタ
クリレート）（７０：３０）、及びシェル中のポリ　（
ｍ、ｐ〜クロロメチルスチレン）から成るコアーシェル
ポリマー粒子上に共有結合で固定化して、凝集試薬を得
た。該粒子の平均直径は、約０．４５Ｅ＋であった。こ
れらの粒子には、ベルギー特許第８４３，６４７号の技
術に従って製造したコア中にレッド染料（Ｏｉｌ　Ｒｅ
ｄ　ＥＧＮ）が含有されていた。

無水琥珀酸の溶液（１０■／ｍ！ジメチルスルホキシド
）を、上記凝集試薬の懸濁液に、無水物１部：全蛋白質
１部の重量比で添加した。得られた懸濁液を２５℃で４
時間混合し、７０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得ら
れたベレットを０．１モルグリシン緩衝液（ｐＨ８，５
）中に０．３％固体の濃度で再懸濁した。

次いで、凝集試薬を生物学的試料から得られたストレプ
トコッカスＡ抗原と混合し、２分間３７℃でインキュベ
ートした。バンクグラウンド対照は、該試薬を抗原のな
い抽出溶液中でインキュベートすることによって得た。

次いで、凝集体の試料（１５０μりを、上記のようにし
てスクシニル化カゼインで製造した膜構造体上に置き、
第二の構造体をカゼインで製造した。

次いで、膜構造体上の凝集体を、１モルのトリシン（２
００ｐｌ　、　ｐＨ８，６）で洗浄し、非凝集物質を除
去した。

膜構造体上に残留した凝集体の量は、次いで、凝集体中
の染料の表面反射率を（５３０ｎｍ）で測定し、Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ変換器（Ｊ、Ｏｐｔ、Ｓｏ
ｃ、Ａｍ、、４３．ｐ。

５９５、１９５３）を使用して０．　（透過濃度−ｔｒ
ａｎｓｍｉ−ｓｓｉｏｎ　ｄｅｎｓｉｔｙ）に転換した
。バンクグラウンドレベルは、スクシニル化カゼイン膜
構造体について０．１２５であり、カゼイン膜構造体に
ついて０．１９４であった。スクシニル化カゼインが、
カゼイン以上にバックグラウンドに於ける著しい減少を
与えることが明かである。スクシニル化カゼイン処理構
造体上の凝集体の信号レベルは、０．４４５であり、カ
ゼイン処理構造体についての信号はスクシニル化カゼイ
ンのものと同様であった。処理されていないナイロン−
６６微孔性膜についてのハックグラウンド信号は、凝集
体自身の信号に匹敵する。、ｓｏｏよりも大きかった。

スクシニル化カゼインで処理された構造体は、著しく減
少したバックグラウンドを示し、凝集体信号は強く残っ
ていた。この構造体は、長期間の貯蔵に対して高い安定
性を示すことが認められた。

■主±北較災襞■ 本例は、本発明の膜構造体を、被覆物質として本国特許
第４，０６６．５１２号に記載されたようなカゼインを
使用して同様に製造した構造体と比較する。

ストレプトコッカスＡについての分析は、次のように行
なった。微孔性膜（５μｍ　ＢＩＯＤＹＮＥ　Ａ膜）を
ディスポーサブル装置内に装填した。スクシニル化カゼ
イン、スクシニル化ウシ血清アルブミン、スクシニル化
コラーゲン又はゼインのそれぞれの１％燐酸ナトリウム
溶液の約４０μｌを該装置に添加し、次いで１モル塩化
ナトリウム溶液４０ｍを添加した。次いで、ポリ　（ス
チレン−共−アセトアセトキシエチルアクリレート＞　
（８５：　１５）のコアと、ポリ　（ｍ−及びｐ−クロ
ロメチルスチレン−共−メタクリル酸）（９９，８：　
０．２）のシェルとから成り、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　ＥＧＮ
染料の３％アセトニトリル溶液を吸収したコアーシェル
ビーズの懸濁液を添加した。ビーズ組成物はグリシン緩
衝溶液（ｐＨ８，５）中にあり、０．３％固体を含有し
ていた。次いで、抽出されたストレプトコッカスＡ抗原
（４０ｐｆ）を添加した。この混合物を２分間３７°Ｃ
でインキュベートし、次いで溶液を膜を通して流出（ｄ
ｒａｉｎ）させた。１モル塩化ナトリウムの洗液（９０
μ））を添加した。膜上の凝集ビーズから得られた染料
を、表面反射率によって測定した。反射率読みは、Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ変換器を使用して変換値
（ｔｒａｎｓ−ｍｉｓｓｉｏｎ　ｖａｌｕｅ）に転換さ
せた。その値を上記第■表に示す。

また、同様のストレプトコッカスＡ分析を、ウシ血清ア
ルブミンで処理された膜及び米国特許第４．２５９，３
１３号に記載された蛍光ユウロピウムキレートを含有す
るビーズを使用して行なった。この試験結果は、ウシ血
清アルブミン被覆がバンクグラウンドを減少しなかった
ことを示した。

スクシニル化カゼイン　　　０．０２０　　　０．０３
５　０．１５１スクシニル化ウシ血清　　　０．０７４
　　　０．１３８　０．１８７アルプミン スクシニル化コラーゲン　　０．０２３　　　０．０３
７　０．１１９これらの試験結果は、下記のことを示し
ている。

ウシ血清アルブミン及びゼインはバックグラウンドを減
少しなかった。スクシニル化ウシ血清アルブミンによっ
て改良が得られたが、スクシニル化カゼインによって得
られたものほど大きくはながった。スクシニル化されな
いコラーゲンは、膜の孔を閉塞したために使用するには
粘稠過ぎたけれども、スクシニル化コラーゲンによって
得られたバンクグラウンド減少は、スクシニル化カゼイ
ンで得られたものと同様であった。

〔発明の効果〕

本発明は、膜と蛋白質又はキャリアー物質との非特異的
相互作用が著しく減少した膜構造体を提供する。この有
利性は、免疫反応性種が対応するレセプター分子との反
応を起こす免疫化学反応で膜構造体が使用されるとき、
特に重要である。結果として、免疫化学分析の感度が大
きく改良される。これらの有利性を達成するための手段
は、微孔性膜を１種又は２種以上の水溶性蛋白質又は炭
水化物で前処理又は被覆することである。被覆される蛋
白質又は炭水化物は、５より大きいｐＩを有しない。

上記の蛋白質又は炭水化物は、膜上に高密度の負の電荷
を与え、この電荷密度は負に荷電した免疫反応性種を反
発する。その結果は、改良された免疫種のレセプターと
の錯体化、減少したバックグラウンド、及び分析に於け
る高い感度である。

更に、水不溶性蛋白質を被覆するために必要な存機被覆
溶剤に伴う問題点が避けられる。本明細書に記載した種
類の蛋白質又は炭水化物のみが、本発明の実施に見出さ
れる予期されない結果をもたらす。

本発明の膜構造体を製造するために使用される被覆方法
は、数分間の間に行なうことができ、その後で膜構造体
は使用のために用意が整っている。

また、該構造体は、乾燥し、性能の低下をひきおこすこ
となく長期間貯蔵することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的に不活性な物質から作られ、１０μｍ未満
   の平均孔サイズを有し、その上に５より大きいｐＩを有
   しない１種又は２種以上の水溶性蛋白質又は炭水化物を
   含む被覆を有する微孔性膜を含んでなる膜構造物。 ２、（ａ）生物学的に不活性な物質から作られ、１０μ
   ｍ未満の平均孔サイズを有する微孔性膜を用意し、そし
   て、 （ｂ）該膜上に被覆を与える、１種又は２種以上の、５
   より大きいｐＩを有しない水溶性蛋白質又は炭水化物を
   、該膜の多孔度を実質的に減らすことなしに該膜全面に
   被覆を与えるに十分な量で含む溶液と、前記微孔性膜を
   接触させることから成る、膜構造物の製造方法。 ３、水性液体中の多価免疫種を測定するにあたり、 （ａ）前記水性液体を、前記免疫種と反応性のレセプタ
   ー分子を協働的に有する凝集試薬と接触させて、免疫種
   とレセプター分子との反応生成物の凝集体を形成させ、 （ｂ）接触工程（ａ）と同時にか又はそれに続いて、該
   凝集体を、生物学的に不活性な物質から作られ、１０μ
   ｍ未満の平均孔サイズを有し、その上に５より大きいｐ
   Ｉを有しない１種又は２種以上の水溶性蛋白質又は炭水
   化物を含む被覆を有する微孔性膜からなる膜構造物と接
   触させ、 （ｃ）該凝集体を非凝集物質から分離し、そして、 （ｄ）凝集体の量又は非凝集物質のいずれかを測定する ことを含んで成る、水性液体中の多価免疫種の凝集反応
   測定方法。