JPS59206761A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫化学的測定法の一つである酵素免疫測定法
（Ｅｎｚｙｍｅ　　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）　　（
以下、［三ＩＡと略称する）に関するものである。

生体に作用する種々のタンパク、ホルモン等を高感度で
測定するための免疫化学的測定法は近年、臨床検査の分
野で重要性を増している。免疫化学的測定法の一つとし
て、ＥＩＡが知られており、この測定法は、例えば、抗
原又は抗体をベルオキシターゼのような酵素で標識し、
これと基質との反応性（酵素活性）を定但する方法で市
る。Ｅ［Ａは測定手法の相違により、サンドイツチ法、
二抗体法、競合法等に更に分けられるが、基本原理であ
る抗体及び抗原等を適当な担体に不溶化し、これに抗原
及び抗体等の非測定物を作用させる点、また、その量の
測定のために抗体及び抗原に酵素をラベルし、それを次
に反応させ、ぞの後、同相と液相とを分則し、同相側又
は液相側の酵素活性値を測定することにより、その目的
物質の値を知る点については共通である。

そのため、Ｅ［△では測定途中において、担体に不溶化
した抗原抗体の活性、及び酵素標識抗体あるいは同抗原
の酵素活性が失活しないようにすることが４要である。

最近、臨床検査試薬の分野では５門の検体を迅速処理す
る必要があるため、一定の機器により自動化が容易であ
るいわゆる、マイクロプレー！〜を担体として用いる方
法の開発が要求されている。

しかしながら、担体としてマイクロプレートを用いる場
合には測定途中でのプレートの洗浄、分注操作を行なう
に際して担体のウェル表面を乾燥する必要があるが、こ
の乾燥によって担体のウェル表面上に結合している酵素
標識抗体あるいは同抗原の活性又は抗体、抗原の活性が
低下すると官う欠点がある。そのため、乾燥段階におい
てこれらの活性が低下した場合には、正確な測定値を得
ることができないこととなる。

本発明者等は上記実情に鑑み、従来、公知のＥＴＡによ
って測定試験を行なうに当り、測定途中、特に、担体の
乾燥段階において担体上の感作物の活性が失活するのを
抑制する方法を得るべく種々検討した結果、酵素標識抗
体あるいは同抗原又は抗体、抗原が結合した担体表面上
をある特定の物質で処理することにより、本発明の目的
が達成されることを見い出し、本発明を完成し１〔。

すなわち、本発明の要旨は、酵素免疫測定法において、
担体上に感作された酵素標識抗体あるいは同抗原、抗体
又は抗原の表面をタンパクよりなる保護剤で処理するこ
とを特徴とづる酵素免疫測定法に存する。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明ではＥＩＡによる測定法を対象とづるものである
が、例えば、サンドイツチ法、二抗体法、競合法などの
いずれの方法の場合にも適用できる。

また、これらの公知の測定法にて、本発明において活性
低下を抑制し得る対象物としては、通常、酵素標識抗体
あるいは抗原の酵素活性、更に、抗体又は抗原の活性が
挙げられる。

抗体、抗原等のタンパクなどを不溶化するための担体と
しては特に限定されるものではないが、本発明では、多
数のウェルを有するマイクロプレートを用いた場合に、
より大きな効果が発揮されるので好ましい。担体の材質
はその種々の物質の性質による非特異吸着量、固定化可
能容量、化学的安定性、物質的均一性などを考慮して決
定され、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネートなど
の合成樹脂が好適である。

本発明で用いられる標識するための酵素としては、例え
ば、ベルオキシターゼ、β−Ｄ−ガラクトシターゼ、ア
ルカリフォスファターゼなどが挙げられ、なかでも、ベ
ルオキシターゼがその特性に−一り最も広範に使用でき
るので好ましい。

本発明においては、担体上に結合した酵素標識抗体ある
いは同抗原、又は抗体あるいは抗原の活性低下を抑制す
るために、その表面をタンパクよりなる保護剤で処理す
ることを必須の要件とするものである。このタンパクの
具体例としては、卵白、ウシ血清アルブミン（以下、Ｂ
、Ｓ、Ａと略称する）又はゲラチン等が挙げられる。な
お、ゲラチンは加水分解したものでも同様に使用できる
。

担体上への前記保護剤の処理は通常、測定試薬、例えば
結合、未結合の分離（Ｂ／Ｆ分離）に使用する洗浄液に
０．０１〜５重間％、好ましくは０゜０５〜２重量％の
前記保護剤を添加し、この液にて担体を洗浄することに
より容易に実施することができる。この洗浄は通常、前
記溶液を１〜６０秒程庫、担体のウェル表面と接触する
ことにより行なわれる。

本発明ではこの保護剤による処理により、担体上に結合
している酵素標識抗体又は同抗原などが乾燥により失活
するのが抑制されるものである。

この原因については一審らかではないが、保護物質の分
子が急速に担体のウェル表面に吸若し、先にウェル表面
に吸着している感作物の表面をコーティングし保護する
ため、急激な乾燥状態により失活する瑣象が抑制される
ものと思われる。

本発明において上述の保護剤による処理を終えた担体は
、次いで、常法に従って公知の測定順序で処理が続Ｅ、
ｌｌられる。例えば、酵素標識抗体を感作し、その上に
保護剤を処：ｌＩ！Ｌ、た担体は次いで、乾燥処理を施
したのち、酵素基質と反応させることににり酵素活性を
測定することかできる。

以上、本発明では、担体上に結合した酵素標識抗体など
の感作物が乾燥時に失活づるのを抑制させるため、特に
、担体としてマイクロプレートを用いる測定法に適して
おり、より正確な測定が期待できる。また、本発明では
保護剤で表面をコーティングしたことによる測定値への
悪影響及びその他年都合な点はない。

次に、本発明を実施例により更に詳細に説明づるが、本
発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定され
るものではない。

実施例１〜３及び比較例１〜４ ポリスチレン製のマイクロプレートよりなる担体の各ウ
ェル（容積０　、３５ｍ　！；Ｌ＞にベルオキシターゼ
を含む酵素標識抗体溶液をピペットにより注入し、４°
Ｃの＞ＲＩ宴で一晩静置したのち、各つエル中の溶液を
ビベツ１〜により吸収除去づること（こより、酵素標識
抗体がウェル表面に均一に感（’１（コーティング）さ
れた担体を（！Ｉ　７こ３、次いで、この担体の各ウェ
ル申に、ｐＨ８，０、第１表に示す保護剤１％を添加し
た溶液をそｔしそれピペットにより注入し、５秒後に再
び？主人しｌこ溶液を吸収除去した。

このような処理を施したマイクロプレー！−を次いで、
２５℃の温度で第１表に承り時間、放置づることにより
乾燥ざぜたのち、酵素基質を各ウールに等迅注入し、室
温で一定時間、酵県反応させることにより酵素活性−を
測定した。なお酊系ζ古↑１゜（ベルオキシダービ活性
）の測定は基質として、ＡＢｌ−８（２，２’−−アジ
ン・ビス（３・コーブール＼ ペンゾチアソ“リン・６・スル小ン醗）〉を１０ｍＭで
用い、各ウェルに０．３１１１立ずつ分注し、室温（２
５℃）で３０分間反応させて測定し１こ。

そして、無乾燥の場合におりる酵素活性を１００％とし
た場合の乾燥処理による活性低下のυ］合を相対値で求
め、その結果を第１表に示す。

第１表 第１表の結果より、本発明の保護剤を添＋３１１　シフ
こ溶液て・処理した場合には、担体の乾燥ｌｌ谷間が８
分、６０分と長くなっても、無乾燥のときの酵素法を生
と大差がないことが判るが、その他の場合に（ま、乾燥
処理により酵素活性が大幅に低下して０ることが判る。

実施例４〜６及び比較例５ 実施例１の方法において、Ｐ　Ｂ　Ｓ　６”ｃ　’７１
’液【こグ５２表に示す保護剤を０．１％添加しｌこ溶
液（こてウェル表面を処理した以外は全く同１蚤な方法
’（−ｉｌｌ定を行なったところ、第２表に示づ゛結果
であった。

第２表 第２表の結果より、本発明のイ呆護へ１１（まＱ、１％
と極めて少量であっても、乾１こにる酵素活性／＞＜失
活するのを十分に防止する効ｗ　ｈ＜あることｂ＜　Ｉ
Ｉる。

°　　実施例７〜９及び比較例６ 実施例１の方法において、第３表に示すグラチン瀧度と
して、しかもマイクロプレートの乾燥を放置乾燥でなく
、送風による急激な乾燥とした以外は全く同様な方法で
測定を行なったところ、第３表に示す結果であった。

第３表 第３表の結果より、本発明の保護剤の効果は送風による
急激な乾燥処理の場合においても、少ない添加量で酵素
活性の低下をがなり防止することができる。

実施例１０〜１２及び比較例７ まずマイクロプレートに抗体を感作した、感作方法は酵
素標識抗体の感作方法と同様に、任意濃度に抗体をＰＢ
Ｓ溶液で希釈し、各つＴルに分注し、４℃で一晩静置し
、その後溶液を吸込除去し、抗体感作担体を１″Ｉた。

使用した抗体は抗ヤギガンマクロプリンＧ抗体である。

次いで前回同様に各保護剤＜　１　ｗｔ％）を含むＰＢ
Ｓ溶液にて処理し、（コントロールは無処理）その後室
温乾燥（２５°Ｃ１１時間）、凍乾乾燥を実施し、その
次に酵素標識抗体の非特異結合を防止する処理を行ない
、その後、任意濃度にＰ　［３Ｓ溶液にて希釈した酵素
標識ヤギカンマグロブリンＧ抗体を各つ１ルに０゜３℃
立分注し、３７℃で２時間稈抗原抗体反応をさせ、その
後ＰＢＳ溶液で洗浄し、最後に前回同様の基質（ＡＢＴ
Ｓ＞を各ウェルに０．３ｎ＋文分注し、酵素反応を行な
った。つまり口の方法で、感作抗体の活性を、感作抗体
が捕えた酵素標識ヤギガンマグロブリンＧの酵素活性の
量を測定する事により間接的に証明する事かできる。活
性を無乾燥の場合を１００％として相対値で求め、第４
表に示す結果を得た。

第４表 第４表の結果より、本発明の保護剤は酵素標識抗体のみ
ならず、感作抗体の活性低下を抑制御る効果も有するこ
とが判る。

代理人　弁理士　定立　勉 ばか１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　酵素免疫測定法において、担体上に感作された酵素
   標識抗体あるいは同抗原、抗体又は抗原の表面をタンパ
   クよりなる保護剤で処理することを特徴とする酵素免疫
   測定法。 ２　保護剤が卵白、ウシ血清アルブミン又はグラチンで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵素
   免疫測定法。 ３　保護剤での処理が０．０１〜５重量の保護剤を含有
   する測定試薬溶液にて担体表面を浸漬させる方法である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵素免疫
   測定法。 ４　担体がマイクロプレートよりなることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の酵素免疫測定法。 ５　担体の材質が合成樹脂であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の酵素免疫測定法。 ６　酵素標識抗体あるいは同抗原を形成する酵素がベル
   オキシターゼであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の酵素免疫測定法。