JPS6322191A - 遺伝子の発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、植物、植物の部分および植物の培養細胞にお
ける遺伝子の新規な発現方法、並びに該方法を行う場合
に使用するＤＮＡ断片および該ＤＮＡ断片を含有するプ
ラスミドに関するものである。

本発明は根粒の特定の誘導プロモーターの制御下に任意
の起源の遺伝子を上述のように発現させる方法に関する
ものである。

本発明は特にマメ科植物と他の植物との双方を包含する
形質転換された植物における根粒の特定の遺伝子のかか
る発現方法に関するものである。

さらに、本発明は本発明方法を実施する際に使用される
ｇ！　植物プロモーターを有するＤＮＡ１！！ｒ片、並
びに該ｏ　Ｎ　Ａ断片を含有するプラスミドに関するも
のである。

ここに使用する用語を次のように定義する：根粒の特定
の遺伝子：根粒植物の根粒においてのみ活性である植ｅ
ＩＪ遺伝子、または根粒において増大された発現を示す
遺伝子。根粒の特定の植物遺伝子は所定の発生段階にお
いて発現され、共生中に調和的に（ｉｎ　ａ　ｃｏｏｒ
ｄｉｎａｔｅｄ　ｍａｎｎｅｒ）活性化され、これによ
り窒素の固定が行われ、固定されか窒素が植物の代謝に
利用される。

誘導植物プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｌａｎ
ｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）　　ニ一般的に、植物遺伝子か
らの低活性から高活性に誘導するプロモーター活性５′
末端領域を意味する。本発明に関して「誘導植物プロモ
ーター」とは、根粒の特定の遺伝子のリーダー配列を有
する５″末端領域から誘導されるか、該領域に含まれて
いるか、あるいは該領域と同一であるプロモーターであ
って、本発明に関して特徴づけられている遺伝子の発現
を促進、調節することができるプロモーターを意味する
。

リーダー配列ニ一般的に、ｍＲＮＡに転写されるが、さ
らに蛋白質に翻訳されることのないＤＮＡ配列を意味す
る。従って、リーダー配列は転写開始から翻訳開始を指
令するＡＴＧコドンまでのＤＮＡ断片を有する。本発明
に関して「リーダー配列」とは、上述の誘導植物プロモ
ーターに含まれ、代表的には４０〜’ｒｏｂｐをを有し
、かつ転写後８周節に関する標的である配列を有する短
いＤＮＡ断片を意味する。

プロモーター領域：　ＲＮＡポリメトーゼに関する標的
配列を有するプロモーターを有するＤＮＡ断片、並びに
場合によっては転写エフェクター物質に関する標的配列
を有する活性化領域。本発明においては、転写エフェク
ターに関する標的配列は、プロモーターに対して３′位
、すなわち根粒の特定の遺伝子の暗号づけ配列、介在配
列または３′末端領域に位置することもある。

また、ここでは分子生物学分野の当業者に一般的に知ら
れている次の多数の分子生物学用語を使用する。

ＣＡＰ付加付加部位−７チル−ＧＴＰが付加しているヌ
クレオチド。

ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメント：隣接するペントー
スの３″および５′の炭素原子間のホスホジエステル結
合を介して結合しているヌクレオチドの直線的配列。

発現：ポリペプチドを生成するために構造遺伝子により
もたらされるプロセス。これは転写と翻訳および場合に
よっては翻訳後の修飾との組合せである。

末端領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ）　　：
暗号づけ領域を囲むＤＮＡ配列。５゛末端領域を含む。

３′末端領域は転写後ターミネーター等を含むことがあ
る。

遺伝子：３または４種の部分、すなわち＋１１遺伝子生
成に関する暗号づけ配列、（２）遺伝子が発現されるか
否かを制御するプロモータ領域における配列、（３）転
写終結および場合によってはポリアゾニレ−ジョン（ｐ
ｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）を条件づける３′末端
におけるこれらの配列、並びに存在する場合には（４）
介在配列から成るＤＮＡ配列。

介在配列：任意のペプチド断片に対して暗号づけを行わ
ない遺伝子中のＤＮＡ配列。介在配列は前駆体ｍＲＮＡ
　（ｐ　ｒ　ｅ−ｍＲＮＡ）に転写され、前駆体ＲＮ　
Ａのｍ　ＲＮ　Ａへの修飾により除去される。

キメラ遺伝子二種々の遺伝子からの部分からなる遺伝子
。例えば、キメラＬｂｃｘ　　５”−３′−ＣＡＴは大
腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１．ｉ）から誘導されるクロロアンフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒｏ
ａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｓｅ）暗号づけ配列と、大豆のＬｂｃ、遺伝子の５″
および３′末端調節領域とからなる。

クローニング：生物の個体群、またはかかる生物の１種
から誘導されるＤＮＡ配列、または無性生殖による配列
を得る過程、あるいは、特に、特定の生物または生物の
部分を分離する過程、およびこのサブフラクションの均
質な個体群としての増殖。

暗号づけ配列：ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する
ＤＮＡ配列。

交差接種群（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｇ
ｒｏｕｐ）　：この群の他の種の根粒から分離されたり
ゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌によって有効
な根粒を生成することができる一部のマメ科植物種。

ヘモグロビン（Ｌｂ）：もっばら根粒中で合成される酸
素結合性蛋白質。Ｌｂ蛍白質は根粒組織における酸素の
張力を調節し、酸素をバタテロイドに輸送する。このよ
うにして酸素に敏感なニトロゲナーゼが保護される。Ｌ
ｂ遺伝子は根粒の特定の遺伝子である。

メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）：遺伝子の転写に
より、場合によってはｍＲＮＡの修飾により生成するＲ
ＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子の一部がポリ
ペプチドに翻訳されることによって、該ペプチドのアミ
ノ酸配列を決定する遺伝情報の伝達を媒介する。

下流：　ＤＮＡ配列における位置。遺伝子の位置に関す
る転写方向５’−３”に関して定義される。

従って、３゛末端領域はこの遺伝子の下流に位置する。

ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸エステル
および含窒素複素環式塩基から成るＤＮＡまたはＲＮＡ
のモノマー単位、この塩基はグリコシドの結合を介して
糖部分（ペントースの１′位の炭素）に結合されており
、この塩基と糖とが結合したものがヌクレオチドである
。この塩基はヌクレオチドを特徴づけるものである。４
種のＤＮＡ塩基はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シ
トシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）である。４種のＲＮＡ
塩基はＡ。

Ｇ、Ｃおよびウラシル（Ｕ）である。

上流：　ＤＮＡ配列における位置。遺伝子の位置に関す
る転写方向５′−３”に関して定義される。

従って、５゛末端領域はこの遺伝子の上流に位置する。

植物の形質転換：遺伝子が有余分裂および減数分裂によ
って確実に遺伝されるように、あるいは遺伝子が短期間
のみ維持されるように、遺伝子が植物細胞のゲノムに取
込まれて行くプロセス。

プラスミド：プラスミドが宿主細胞において複製される
ような無傷（ｉｒ＋Ｌａｃｔ）のレプリコンを有する染
色体外性二重鎖構造ＤＮＡ。このプラスミドを単細胞生
物内に入れた場合、この生物の特徴はプラスミドのＤＮ
Ａの結果として変化あるいは形質転換を起こす０例えば
、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｌ）に関する遺伝子を担
持するプラスミドは、初めはテトラサイクリンに感受性
である細胞を、テトラサイクリンに耐性である細胞に形
質転換させる。プラスミドにより形質転換された細胞は
形質転換細胞と呼ばれる。

ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシル基との間のペプチド結合によって結合されてい
るアミノ酸の直線的配列。

組換え：異なる起源のＤＮＡ断片を組み合わせることに
より新しいＤＮＡ分子が生じること。

復製：ＤＮＡ分子を再生する過程。

レプリコン：　ＤＮＡ複製の開始に関する起源およびそ
の制御と複製に必要な機能を特定化する遺伝子を有する
自己複製遺伝体。

制限断片：特定の標的ＤＮＡ配列を認識する薄紫による
二重鎖の開裂によって生ずるＤＮＡ断片。

ＲＮＡポリメラーゼ：　ＤＮＡのＲＮＡへの転写を行わ
せる酵素。

根粒：主として根粒植物のりゾビウム菌による感染から
生ずる特定の組織。この組織は宿生植物によって生成さ
れるので植物細胞からなるが、リゾビウム菌は感染する
と植物細胞膜によって囲まれ、分化（ｄｉｆｆｅｒｎｔ
ｉａｔｅ）　ｌ、てバクテロイドになる。根粒はりゾビ
ウム属に属していない窒素固定細菌の感染によって他の
植物種においても生成される。また、根粒の特定の植物
遺伝子はこれらの根粒に発現される。

サザン（ｓｏｕｔｈｅｒｎ）−ハイブリッド形成：変性
ＤＮＡをアガロースゲル中で分画した後にニトロセルロ
ース膜に移動させる。移動したＤＮＡをハイブリッド形
成によって所定のＤＮＡ配列または所定の遺伝子につい
て分析する。この処理によって、放射性元素の標識をつ
けた単鎖ＤＮＡ配列（プローブ）を、ニトロセルロース
に結合している相補的な単鎖ＤＮＡ配列に結合させるこ
とができる。次いで、プローブと結合しているＤＮＡ断
片の膜上の位置を）ｌフィルムで検出することができる
。

共生による窒素固定：根粒のバクテロイドは空気中の窒
素（二窒素）を植物によって利用されるアンモニウムに
転化しているが、植物は炭素化合物と共にバクテロイド
を提供している関係。

共生生物（ｓｙｍｂｉｏｎｔ）　　：共生関係の一方で
あり、リゾビウム菌は微小共生生物と呼ばれる。

形質転換：細胞がＤＮＡ分子を取込む過程。

翻訳：　ｍＲＮＡからポリペプチドを生成する過程。

あるいは、ｍＲＮＡ分子中に存する遺伝情報によってポ
リペプド合成中に特定のアミノ酸の順序が指示される過
程。

転写：　ＤＮＡ配列から相補的ＲＮＡ配列を合成する過
程。

ベクター：宿主細胞において複製でき、かつ１個または
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を有するプラスミド
、ファージＤＮＡまたは池のＤ’ＮＡ配列、該認識部位
では、本質的な生物学的機能を喪失することなく確定で
きる方法で、かかるＤＮＡ配列を開裂させることができ
る。

従来の植物育種はそれぞれ所望の性質を有する植物系統
の交雑育種を繰返すことに基づいている。

すべての望ましい性質を有する子孫系統の確認は特に時
間のかかるプロセスであり、これは性質の生物化学的お
よび遺伝学的基礎が知られていないからである。従って
、新しい系統は、これらの系統の表現型に従って、普通
野外実験で多数の系統をスクリーニングした後に、選択
される。

世代を通じて、個体群の栄養状態すなわち健康状態と、
満足できる収量を得るために窒素を確実に十分供給する
農業上の可能性との間には、直接結びつきが存在してい
る。既に１７世紀には、エントウのほかにインゲン、ル
ピナス、大豆、ミヤコグサ、ソラマメ、アルファルファ
、イガマメおよびウマゴヤシを含むマメ科植物が、これ
らの植物の成育地で成育する作物を改善することができ
る性質を有していることが見出されている。今日では、
これは多数のマメ科植物が自身で窒素のたくわえを作る
ことができるからであることが知られている。これらの
植物は根にこれらの植物と共生間係を保って生活してい
る細菌を持っている。

これらのマメ科植物の根がリゾビウム菌に感染すると、
大気中の窒素を結合窒素に変えることができる根粒が形
成し、これは窒素固定と呼ばれる過程である。

これにより大気中の窒素は宿主植物、並びに後日同じ生
育地で生育する植物が利用できる形態に変る。

１９世紀には、上述の可能性は窒素を供給して作物収量
の新規な増加を達成するために利用されている。

しかし、その後、収量の一層の増加は、特に天然の肥料
および含窒素合成肥料によって達成されていた。この結
果生ずる環境汚染のために、達成できる可能な最高収量
に必要な窒素を確実に供給できる他の可能な方法を提供
することが望まれている。

従って、マメ科植物に存在する窒素固定系を改善できる
こと、並びに他のｔｉｉ物に窒素固定系を取込むことが
できることは価値あることである。

今日では、開発された組換え体Ｄ　Ｎ　Ａ技術および植
物の形質転換系によって、新しい性質を有する植物を制
御された方法で提供できるようになった。同じ植物種の
ほか、他のすべての原核生物または真核生物から、この
ような特性を導き出すことができる。さらに、ＤＮＡ技
術は望ましい性質を有する子孫系統の迅速かつ特定の確
認を可能にする。このようにして、特定の植物系統に１
種以上の望ましい性質を迅速かつ明確な方法で付与する
ことができる。

同様に、植物細胞に明確な性質を付与することができ、
従ってこのような性質を既知の組織培養法によって植物
細胞系統として維持することができる。

かかる植物細胞は、色素、フレーバー、芳香成分、植物
ホルモン、薬物、−次および二次の代謝物、並びにポリ
ペプチド（酵素）のような特殊な興味ある化学的および
生物学的生成物を生成するために利用することができる
。

所定の遺伝子生成物の生物学的生成に必要な因子および
機能の範囲は既知である。転写の開始および調節、並び
に転写後プロセシングの開始および調節は特徴づけるこ
とができる。

遺伝子レベルでは、これらの機能が主として５′末端領
域によって行われることが知られている。

原核遺伝子および真核遺伝子の５′末端領域の広い範囲
が配列されており、なかんずくこの点を考えて遺伝子発
現の調節に関するほか遺伝子発現の調節にとって重要な
サブ領域（ｓｕｂ　−ｒｅｇｉｏｎ）に関する広汎な知
識が与えられている。原核生物と真核生物とは調節機構
に大きな差異があるが、これらの２つの群には多くの共
通の特徴がある。

遺伝子発現の調節は転写レベルで起こることがあるが、
転写開始頻度の調節によって行うのが好ましい。後者に
ついてはよ（知られており、特にベンジャミン・レビン
著「ジェーン・エクスプレッション（Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ）　Ｊ、（ジョ７−ライレイ・アンド・
サンズ社）第１’！（１９７４）第２巻、（第２版、１
９８０）、第３巻（１９７７）に記載されている。ある
いはまた、かかる調節は、転写後レベルにおいて、例え
ば、翻訳速度における翻訳開始および翻訳？、結の頻度
調節によって行うことができる。

本発明に関し、根粒の特定の遺伝子の５′末端領域、例
えば、大豆のノヘモグロビンＬｂｃｚ遺伝子の５゛末端
領域を異種のマメ科植物における外来遺伝子の誘導発現
（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に使用
できることが示されている。プロモーターの誘導（ｉｎ
ｄｕｃｔｉｏｎ）および調節は転写レベルにおける言周
節および誘導の形態で行うのが好ましく、従ってプロモ
ーターの誘導および言周節はデンマーク国特許出願明細
書第４８８９／８５号に説明されているインデューサビ
リティ（ｉｎｄｕｃａｂｉｌｉ　ｔｙ）とは異なる。後
者のインデューサビリティは転写レベルで行うのが好ま
しい。

大豆のＩ、ｂｃ、遺伝子およびミヤコグサに転移された
キメラしｂＣコ遺伝子の転写は、根粒が植物の根に出現
すると直ちに、低レベルで開始される。次いで、根粒が
赤くなる直前に転写の著しい増加が起こる。他の根粒の
特定の遺伝子の範囲の転写は正確にこの時点で開始され
る。Ｌｂ遺伝子および他の根粒の特定の遺伝子の転写の
同時誘導は、かかる発現パターンを制御する種々の遺伝
子に関して共通のＤＮＡ配列が存在していなければなら
ないことを意味する。従って、レグヘモグロビンｃ３遺
伝子は遺伝子の１つの種類を代表するもので、プロモー
ターおよびリーダー配列、活性化に関する標的区域、並
びにＬｂｃｌ遺伝子の組織特異性の調節要素は、完全な
遺伝子の種類（ｃｌａｓｓ）の調節要素を代表するもの
である。

Ｌｂ遺伝子の５′末端領域のプロモーターは大豆におい
て機能し、根粒におけるＬｂ遺伝子の転写に対して責任
をもっている。さらに、次ぎのＬｂ遺伝子のリーダー配
列における転写開始および翻訳開始の双方の効率は、Ｌ
ｂｉ白質が根粒中の全蛋白賞金を量の約２０％を占めて
いるので、高いことが知られている。

大豆の４種のヘモグロビン遺伝子Ｌｂａ、Ｌｂｃ、、Ｌ
ｂＣ２、およびｌ、ｂｅ、の５′末端領域の配列は次の
第１表に示す配列表から明らかであり、第１表には４個
の５″末端領域の間の相同関係（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）が
明確になるように配列が記載されている。

この配列表において、“−一”は当該位置に塩基が存在
していないことを示す。遺伝子の名称およびＡＴＧ開始
コドンより上流の塩基位置の数を配列表の右側に示す。

さらに、重要な配列には下線を引いた。

この配列表から明らかなように、４個の５′末端領域の
間には明確な相同関係が存在し、またＣＡＰ付加部位よ
り２３〜２４ｋｌ）上流の位置においては、これらのす
べてが“ＴＡＴＡ”ボックスに対応するＴＡＴＡＴＡＡ
Ａ配列を有している。

なお、この“ＴＡＴＡ”ボックスは、真核細胞において
は、ＣＡＰ付加部位より対応する数のｂｐ上流に位置す
るのが一般的である。さらに、ＣＣＡＡＧ配列はＣＡＰ
付加部位より６４〜７２ｂｐ上流に存在し、この配列は
ＣＡＰ付加部位より一般に７０〜９０ｂｐ上流に位置す
る“ＣＣＡＡＴ″ボックスに対応する。ＣＡＰ付加部位
から翻訳開始コドンＡＴＣまでに５２〜６９ｂｐのリー
ダー配列が存在し、これは約７５〜８０％の明確な相同
関係を示す。

さらに、本発明においては、大豆のレグヘモグロビン遺
伝子、例えばＬｂｃ、、の５′末端領域が他の植物種に
おいて機能的に活性であることが分かった。これは、大
腸菌クロロアンフェニコールアセチル　転移酵素（ＣＡ
Ｔ）遺伝子を、該ＣＡＴ遺伝子の発現がＬｂプロモータ
ーによって制御されるように、大豆のＬｂｃ３遺伝子の
５゛および３′末端領域と融合させることにより証明さ
れた。この融合断片を組込みベクターｐＡＲ１およびｐ
ＡＲ２２にクローングすることによりプラスミドｐＡＲ
２９およびｐＡＲ３０を生成させる。これらのプラスミ
ドを相同組換えによって了グロバタテリウム・リゾゲネ
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ
）　Ｔ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　領域に組込む。ロツス・コルニ
クラツス（Ｌｏｔｕｓ　ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ）　
（ミャコグサ）植物の形質転換、すなわちＴ　　ＤＮＡ
領域の転移は胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）における傷怒
染（ｉｍｏｕｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）によって達成さ
れる。植物の形質転換細胞から発生した根はインビトロ
（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）培養で採取され、抗生物質によっ
て、ニー、リゾゲネス（Ａ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）
菌を含まない状態になる。体細胞の胚形成または器官発
生によってかかる根の培養から完全に再生された植物が
生成する。

次いで、再生された植物にリゾビウム・ロチ（Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ　１ｏｔｉ）菌を接種し、分析のために根粒
を採取する。次いで、キメラＬｂｃ、ＣＡＴ遺伝子の転
写および翻訳が、形質転換された植物の根粒において、
生成したクロロ７ンフエニコールアセチル転移酵素の活
性として検出される。

従って、大豆のＬ　ｂ　Ｃｓプロモーターのような根粒
の特定の遺伝子のプロモーター含有５′末端領域は外来
植物において機能的に活性であると結論づけることがで
きる。このことは、マメ科植物とその対応するりゾビウ
ム微小共生生物との間の極めて特殊な相互作用の結果と
してのみ根粒が発生するのであるから、驚くべきことで
ある。

大豆は、リゾビウム・ヤポニクム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
ｊａｐｏｎ　ｉｃｕｍ）　種およびロツス・コルニクラ
ツス種に惑染した場合にのみ、またリゾビウム・ロチ種
に感染した場合にのみ根粒を生成する。従って、大豆お
よびロツス・コルニクラツスは、各群が２種の異なるリ
ゾビウム種によって根粒を生成する２種の異なる交差接
種（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）群に属する
。従って、ロツス・コルニクラツスにおける大豆のキメ
ラ遣（分子の発現は、根粒の特定の遺伝子の発現に適用
できる予期できぬ普遍的な調節系であることが分る。含
まれている調節ＤＮＡ配列は、遺伝子の５′および３′
末端領域、例えば１ｂｃ３遺伝子の２．０Ｋｂ５’およ
び０．９　Ｋ　ｂ３′末端領域に配置することができる
。この結果、任意の他の植物種および任意の他の植物細
胞系統において、根粒の特定のプロモーターおよび調節
配列を使用することができる。

他の実験では、根粒の特定のＮ２３遺伝子の５′末端領
域を、ＣＡＴ遺伝子の発現がＮ２３プロモーターによっ
て制御されるように、ＣＡＴ遺伝子およびＬｂｃ３の３
′末端領域に融合させた。上述の方法によって、この融
合断片を組込みベクターｐＡＲ２２にクローニングして
プラスミドＮ２５−ＣＡＴを生成させ、次いでこのプラ
スミドをニー。

リゾゲネスに組み合わせ、ロツス・コルニクラッスおよ
びトリホリウム・レペンス（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｒｅ
ｐｅｎｓ）（ホワイトクローバ）に転移させた。さらに
、リゾビウム・ロチを感染させたエル、コルニクラツス
およびリゾビウム・トリホリ−（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　
ｔｒｉｆｏｌｉｉ）を感染させたティー・レペンスにお
いて得られた転移Ｎ２５−ＣＡＴ遺伝子の根粒に特異的
な発現は、根粒の特定の遺伝子の発現が植物種およびリ
ゾビウム種とは無関係であることを示す。従って、マメ
科植物と種々の交差接種群のりゾビウム種との間に形成
される異なる共生系における根粒の特定の遺伝子の発現
は普遍的な調節系によって調節される。

欧州特許出願公開明細書第１２２．７９１号に開示され
ているように、１つの種からの植物の遺伝子は、アグロ
バクテリウムで媒介された形質転換によって、異なる植
物種に転移させることができる。また、欧州特許出願公
開明細書第１２２゜７９１号に開示されているように、
種子貯蔵蛋白質「ファセオリン（Ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）
　Ｊを暗号に変える転移遺伝子はタバコおよびアルファ
ルファにおいて発現させることができる。また、文献か
ら知られているように、かかる発現は種子に特異的であ
る〔「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミツク・ソサイエティ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、５ｃｉ）Ｊ　　８２．　３３２−３３２４　
　（１９８５）：ｌ　　。

本発明は、レグヘモグロビンＬｂｃ３遺伝子およびＮ２
３遺伝子のような根粒の特定の遺伝子の５′プロモータ
ー領域、暗号づけ領域、または３′末端領域から、調節
ＤＮＡ配列を使用して、転移遺伝子を根粒に特異的に発
現させる新規な方法を提供する。この方法は、欧州特許
出瀬公開明細書第１２２．７９１号の特徴であるアグロ
バクテリウムを媒介として種子貯蔵蛋白質「ファセオリ
ン」を形質転換および発現させる方法とは異なる。上述
の欧州特許出願公開明細書第１２２，７９１号における
転移ファセオリン遺伝子の発現は、特別な調節要件を有
するファセオリン遺伝子属をタバコおよびアルファルフ
ァにおいて発現させることができることを示すにすぎな
い。この欧州特許出願は、特殊な調節要件を有する任意
の他の遺伝子を任意の他の植物または種物組織において
発現させることができることを示しておらず、また示唆
してもいない。

本発明の目的は、所望の遺伝子を植物、植物の部分、お
よび植物の培養細胞において発現させる可能性を提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、根粒の特定の誘導プロモーターを
制御することにより、任意の起源の遺伝子の発現を可能
にすることにある。

本発明の他の目的は、所望の遺伝子をマメ科植物におい
て発現させる可能性を提供することにある。

本発明の他の目的は、根粒の特定の遺伝子を非マメ科植
物中に発現させる可能性を提供することにある。

本発明の他の目的は、マメ科植物に存在する窒素固定系
を改善し、かつこの窒素固定系を他の植物中に組込むこ
とにある。

本発明の他の目的は、ある場合に、３′末端領域の特定
の配列、暗号づけ配列、および介在配列を使用して根粒
の特定のプロモーターの調節に影響を与えることができ
るようにする可能性を提供することにある。

さらに、本発明の目的は、上述の誘ぷ掴吻プロモーター
を有するプラスミドを提供することにある。

かかる本発明の目的は、発現させる遺伝子とプロモータ
ー配列を有する５′末端領域との双方、場合によっては
３′末端領域を含有する組換えＤＮＡセグメントを植物
細胞に導入し、この形質、転換された植物細胞を増殖培
地において培養することにより、植物、植物の部分、お
よび植物の培養細胞において遺伝子を発現させるに当り
、根粒の特定の遺伝子からの誘導植物プロモーター（上
述の定義を参照のこと）を有するＤＮＡ断片を組換えＤ
ＮＡセグメントとして使用することを特徴とする本発明
の遺伝子の発現方法を行うことによって達成される。

本発明方法によって、植物、植物の部分、および植物の
培養細胞において外来遺伝子を明確に発現させることが
できる。この点に関して特に遺伝子は、例えば、植物の
病気に対する抵抗性および有用ポリペプチド含有量の増
加のような望ましい性質を存する植物を提供する。

本発明方法の他の用途は、植物の培養１細胞および植物
において、例えば、色素、フレーバー、植物ホルモン、
薬物、−次および二次の代謝物のような有価生成物を本
発明方法によって生成させることである。

根粒の特定の遺伝子を発現させる本発明方法により、活
性な窒素固定系の形成に必要な根粒の特定の遺伝子を、
マメ科植物および他の植物の双方において発現させるこ
とができる。正しい発生の制御（後述の実施例日参照）
によって、非マメ科植物において共生窒素固定系を形成
させることができる。驚くべきことには、このようにし
て、マメ科植物に存在する窒素固定系を改善できるほか
、他の植物に窒素固定系を組込むことができる。

根粒において外来遺伝子を発現させる本発明方法の用途
は、除草剤に対する抵抗性のほか、病気および有害生物
に対する抵抗性を有するマメ科撞物を提供できることで
ある。

本発明方法の一例においては、誘導植物プロモーターを
有し、レグヘモグロビンの５′末端領域と同一であるか
、ｇＫ　ＲＪｆ域から誘導されるが、あるいはに３８Ｎ
域を有するＤＮＡ断片を使用する。このようにして任意
の遺伝子の発現を達成することができる。

かかるＤＩＪＡ断片の例は下記の配列を有する大豆の４
種のレグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域のＤＮＡ断
片である。

Ｌｂａ： ＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴ　Ｇ。

Ｌｂｃ、　　： Ｌｂｃｚ　　： ｑλＡ：λＧ、ｍ、；、、Ｔ　　ＡＡＣλＡＣλＡＭＧ
　　入Ａλ、へτλＡＧＴＣａ　　入λＡ＾λ入Ｃ入λ
λ　ＴλτＣ。

Ｌｂａ３　： 本発明方法の他の例では、下記の配列を有するＬ　ｂｃ
３−５　’　−３’−ＣＡＴ遺伝子の５′末Ｍ６Ｎ域と
同一であるか、該領域から誘導されるが、あるいは該領
域を存するＤＮＡ　Ｉｔｌｒ片を使用する。

Ｌｂｃ！−５’　−３’　−ＣＡＴ　：本発明方法のさ
らに他の例では、下記の配列を有するＮ２３遺伝子の５
′末端領域と同一であるか、該領域から誘導されるか、
あるいは該領域を存するＤＮＡＵＴ片を使用する。

入Ｔ’Ｔ　　ＴＧＧ　　ＴＡＣＧＡＡ　ＡＧＣＴＡＡ　
ＴＴＣＧＴＣＧＡＬｂ’ｃ１： ＡＡＧ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＭＡ　ＴＡＡ　ＡＴＣ！　Ｔ
ＴＧ　ＴＴＴＡＡＴ　ＧＴＴ　　ＧＴＴ　ＴＡＡ　ＡＡ
Ｔ　ＭＧ　ＴＭ　ＡＴＴＴＣＣＡＴＡ　ＴＡＴ　ＴＴＡ
　ＣＧＴ　ＴＴＧ　ＴＧＡ　ＡＴＣＴＴＡ　ＴＡＣＧＴ
Ｔ　　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　　ＴＴＬｂｃ
２： ＧＴＡ　ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＴＧＴ　Ｔ
ＴＣＡＣＴＧＴＴ　ＧＧＴ　ＴＡＡ　ＡＡＴ　ＭＧ　Ｔ
Ｍ　ＡＴＴ　ＡＴＡＴＣＣＡＴＡ　ＴＡＣＴＡＡ　ＡＧ
Ｔ　　ＴＴＧ　ＴＧＡ　ＡＴＣＬｂｃ３： ＴＡＴ　　ＴＡＴ　　ＴＴＣＡＣＴ　　ＡＡＡ　　ＡＣ
Ｔ　　ＴＧＴ　　ＴＡＴＡＧＴ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＴＡ
Ｔ　ＧＧＴ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　’ＦＡＡＴＭ／ＴＴ　Ａ
ＧＧ　ＡＴＣＴＡＣＴＧＣＡＴＴ　ＧＣＣＧＴＡＴＣＡ
　ＴＴＧ　ＴＡＴ　’Ｉ’ＧＧ　ＡＴＡ　ＡＡＣＡＣＴ
　ＴＴＴ　ＡＡＧ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＡＴＴＡＴＡ　Ａ
ＴＣＧＡＴ　　ＡＣＴ　　ＴＴＡ　ＴｊＬＡ　ＡＡＡ　
ＴＡＡ　ＡＴＴ　　ＣＣＡ　　ＡＡＴ　ＭＴこの配列は
本発明において使用する０、９Ｋｂ３’末端領域に位置
する。従って、本発明方法の特別な例では、本発明に特
徴づけられている根粒の特定のプロモーター領域の調節
に影響を与えるか、あるいはかかる調節を媒介する上述
の領域の配列を使用する。

本発明方法の特別な例では、根粒の特定の遺伝子の暗号
づけ配列の領域、あるいはかかる遺伝子の介在配列の領
域を使用する。暗号づけ配列または介在配列が、根粒の
特定のプロモーターの活性および規則性に影響を与える
ことができるか、あるいは他の方法で所望の遺伝子生成
物の収量に影響を与えることができる配列を有している
場合には、このようにして暗号づけ配列または介在配列
を使用することができる。

かかる暗号づけ配列および介在配列の例は、次の配列を
有する大豆の４種のレグヘモグロビン遺伝子である。

駁　士　　仁　　シ　　ゴご　、：：　　　ｊ：　　　
ｇＣ：ＩＣＪ＞ロ　　　ＣＪ　　　　　　Ｃ５（ｊ　　
　　Ｊａｍ　　　　＜　　　　←七ゴ　塁定　　＃　　
仁　　北　ゴ８　　仁　　セ書屋　Ｈ耘　葺　■　Ｉ　
コ　卜 ベ ト ペ ロ ト ロ −ロ　　−ｐ　　　！−ＩＯ（ＪＯＪ＜ＯＣＪ　　　Ｃ
ＪＯｈ。

戯戎　　芒足ｇ　号藁　　＝舎　；乙＝　　ミ　　コス
　　＝＝コＯαυ　　！−＋　　　　ト　　シ〈　　　
　←　　ト　　　ロー？　　　＞＜　　　ｄ、　　　　
　←　　−ロ　　　　ロ　　←　　　←、ＪＩ−１ｆ−
１←　　　　ＣＪ　　　　　　　　＜　　　　ロリ　　
　　　　　クトク駁　８８　　日　邑巳　ｉロ　ヨ　ミ ＯＵ　　　　　＞ａ　　　　　？ り０　　　筐り　　　　←　　　　　　　ト　　　關←
　　　　　公←　　　ト　　　　　トコ２　　製　　仁
　　　　ト＝ト＝←　　←　　　ト＆４　　　＆）１　
　　　　伽８＜ト コａ　　　ａｕ　　　ｈ　　　　　ト　　−ク　　　ロ
ー　　り　　　く、−、＜　　　＞（Ｃｊ じロ　　ト←　　ト　　　　に　　号と　　　北　　乏
　　　赳＝七　　ジ乏　　？　　　８　１０　　　”０
　８　　　←ト（ロＬＩＣＪ　　　　ｉ”’　　■　　
＝５　　μ　　已菌０　０←　　ト ・・　・・　・　　葺　肛　藷　ミ　ョヘ　−←　　Ｑ
＋ＣＪ　　　（ 、＜ｈ　　　公ｈ　　　ｕ　　　　　ｒ−＞ｕ　　　　
＜％４　　　Ｆ−１ｈ＝Ｑ　　＝ト　　←　　　　ロ　
　切＜　　　　ＪＣＪ　　　？　　　　←’　　＜Ｌｌ
　　　＋ｍ（＠　　　　　＜　　　＜ロ　　　くロ　　
く　　　（２Ｉ−Ｉ　　　吐　　　トｌ＋１＜　　　　
ω（二←Ｓ　　顛　北　　乏　　と　　　Ｑ　＝←　　
藁ト　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ベ　　　　　＜　　　　　トドト く ベ ト く ペ ト ク ト υ く り ペ ト ■　　＝　　番　　１　芝　邑口葺 基　＝　　シ　　５　シ　コａ　韮 ｄＩ目　滅　　麺　Ｅ　目ａ　的 膨５ｏ；ｉｔ　　纒　＃ｇ　　Ｂ３　　：’的　韮　　
５ＥＥ；５Ｗ２９ ＜＜　　　臣む　　　仁　　　９　　　柘北　　ｈ＜　
　　ＣＪ　　　肛　　＜　　　？　　ボ淀　　こゴポ　
芸　錘　享　短　　ジ　ｅｇ　　Ｈ運已仁　′５５　　
乏　　如　ご　　■ミ　基−Ｑ　　　　にロ　　　　　
ｕｈｈ 口置却　口　　ａ　番　　８　同　３ 韮　閥　５　ヨ　輩　　ｇ　　；ｇ　　′３５？　　　
　　Ｖａ　　　　　＜口 韮　韮　廼　ジ　哩　　ご　′；′ＩごＱ　　　　＞ロ
　　　　＜Ｑ Ｌｂｃ３蛋白質のアミノ酸配列は暗号づけ配列の上に示
されている。

さらに、本発明は本発明方法を実施する際に使用する誘
導植物プロモーターを有する新規なりＮＡ断片に関する
もので、このＤＮＡ断片は根粒の特定の遺伝子の５′末
端領域と同一であるか、該領域から誘導されるか、ある
いは該領域を有することを特徴とする。かかるＤＮＡ断
片の例は、植物のヘモグロビン遺伝子の５′末端領域と
同一であるか、該領域から誘導されるか、あるいは該領
域を有するＤＮＡ断片である。本発明のかかるＤＮＡ断
片の例は、次の配列を有する大豆の４種のヘモグロビン
遺伝子の５′末端領域と同一であるか、該領域から誘導
されるか、あるいは該領域を有するＤＮＡ断片である。

Ｌｂａ： Ｌｂｃｌ　： Ｌｂｃｚ　　： Ｌｂｃｓ　　： 本発明のかかるＤＮＡ断片の他の例は、下記の配列を有
するＬ　ｂｃｓ−５’　−３’−ＣＡＴ遺伝子の５′末
端領域と同一であるか、該領域から誘導されるか、ある
いは該領域を有するＤＮＡ断片である。

Ｌ　ｂｃｓ−５’　−３’　−ＣＡＴ　：本発明のかか
るＤＮＡ　１ｉＩｒ片のさらに他の例は、下記の配列を
有するＮ２３遺伝子の５′末端領域と同一であるか、該
領域から誘導されるか、あるいは該領域を有するＤＮＡ
断片である。

さらに、本発明は本発明方法を実際する際に使用するプ
ラスミドに関するもので、このプラスミドは誘導植物プ
ロモーター（上述の定義を参照のこと）を有するＤＮＡ
断片を含有することを特徴とする。本発明の適当なプラ
スミドはｐＡＲ１１、　ｐＡＲ２９゜ｐＡＲ３０および
Ｎ２５−ＣＡＴ　　（実施例３．４および１１を参照の
こと）であり、このプラスミドはさらにニー、リゾゲネ
スＴＤＮＡ領域に組み合わせることができる。

さらに、本発明は本発明に関連して使用するアグロバク
テリウム菌株に関するもので、この菌株はＴ　ＤＮＡ領
域に組込まれた根粒の特定の遺伝子の誘導植物プロモー
ターを有するＤＮＡ断片を含有し、従って上記ｇＢ性植
物プロモーターを形質転換させることができることを特
徴とする。本発明に係る細菌の菌株はｐＡＲ２９を担持
するＡＲ１１２７，ｐＡＲ３０を担持するＡＲ１１３４
，ｐＡＲ１１を担持するＡＲ１０００およびＮ２５−Ｃ
ＡＴを担持するＡＲ２０４’−Ｎ２３−ＣＡＴである。

本発明が上述の例に限定されるものでないことは勿論で
ある。

従って、本発明は大豆のレグヘモグロビン遺伝子の５′
末端領域のみを使用するのではない。よく知られている
ように、すべてのマメ科植物のレグヘモグロビン遺伝子
は同じ機能を有しく［ザ・ビオロジー・オプ・ナイトロ
ジエン・フィクセイション（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
ｏｆ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ）Ｊキプセ
ル　ニー（Ｑｕｉｐｓｅｌ＾、）曙、北オランダ出版社
。

アムステルダム、オクスフォード、４４９〜５５４頁（
１９７４）参照〕、さらにインゲン豆のＰｖＬｂ　１遺
伝子に関しては大豆のＬｂｃ３遺伝子との高度の相同関
係が存在することが分っている。また、他の根粒の特定
の遺伝子の発現をレグヘモグロビン遺伝子と同様な方法
で調節できることも知られている。

従って、本発明はすべての植物のレグヘモグロビン遺伝
子または他の根粒の特定の遺伝子の５′末端領域の使用
を包含し、かかるＤＮＡ断片の使用は所望の遺伝子生成
物の発現を本発明によって特徴づけられている調節の主
題（ｓｕｂｊｅｃｔ　ｍａｔｔｅｒ）とする。

また、本発明は、本発明によって特徴づけられている調
節を自然条件下に行うかあるいは媒介する任意の起源の
かかる断片の使用を、可能にする。

これは、特に、レグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域
の標識づけした配列とのハイブリッド形成によって、遺
伝子ライブラリーまたはゲノムからのＤＮＡ断片から単
離できるような断片に適用される。

よく知られているように、プロモーター活性および規則
性を変えることなく５′末端領域の重要でないサブ領域
のヌクレオチド配列を変えることができる。また、５′
末端領域の重要なサブ領域の配列を変えることによって
、ヌクレオチド配列と転字開始および翻訳開始に必要な
因子またはエフェクター物質との間の結合親和力を変え
ることができ、従ってプロモーター活性および規則性を
改善することができることもよく知られている。

また、勿論、本発明はこのように変えた５′末端領域の
配列を有するＤＮＡ断片の使用を包含しており、特に、
かかるＤＮＡ断片を使用することによって、所望の遺伝
子生成物の発現が、本発明によって特徴づけられている
調節を受ける場合には、任意の遺伝子の５′末端領域の
領域と根粒の特定の遺伝子の５′末端領域とを組み合わ
せることによって生成したＤＮＡ断片を挙げることがで
きる。

微生物の形質転換はそれ自体既知の方法〔例えば、マニ
アチス（Ｍａｎ　ｉａ　ｔｉｓ）等著：「モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）　Ｊ　（１９８２）、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−を参照のこと〕によって実施される。

植物細胞の形質転換、すなわち植物細胞中にプラスミド
ＤＮＡを導入することも、それ自体既知の方法〔ザンブ
リスキイー（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ）等「エンボ・ジエー
（ＥＭＢＯＪ）Ｊ　２．２１４３〜２１５０　（１９８
２）を参照のこと）によって実施される。

制限エンドヌクレアーゼによる開裂および他のＤＮＡ修
飾酵素による切断（ｄ　ｉｇｅｓ　ｔｉｏｎ）はよく知
られている技術であり、供給者の指示する方法によって
実施される。

本発明に関連して使用されるアグロバクテリウム・リゾ
ゲネス１５８３４　、ａｒｆＲは米国イリノイ州エバン
ストン所在のノースウェスト大学、生物科学部門のジェ
イ・ニー・リフピンコツト（Ｊ、Ａ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏ
　ｔ　ｔ）によって単離されでいる。

次に本発明を実施例について説明する。

イエンセン・ニー、ウー１等が「ネーチャー」第２９１
巻、第３８１７号、第６７７〜６７９頁（１９８１）に
記載している方法によって、大豆の遺伝子ライブラリー
から大豆の４種のレグヘモグロビン遺伝子Ｌｂａ＋　、
Ｌｂｃ、　、、ｔ、ｂｃｔおよびＬｂｃ３を得た。上述
の遺伝子ライブラリーの作成（ｃａｎｓ　ｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ）に使用するＤＮＡを単離するための出発物質とし
ては、遺伝的に安定な近文不変（ｉｎ−ｂｒｅｄ　１ｎ
ｖａｒｉａｂｌｅ）大豆種「グリシン・マキシマム・バ
リアプル・エバンス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ。

ｖａｒ、　Ｅｖａｎｓ）　Ｊを使用した。大豆の４種の
レグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域は、イエンセン
・ニー、ウー、がオーフス（Ａｒｈｕｓ）大学・分子生
物研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｋｙｌ
ａｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉ）の博士論文に記載している方
法によって分離した。４種の５′末端領域の配列は、サ
ンガー・エフ、が「ジェー・モル・バイオ（Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏ、）ｊ　１４３゜１６１　　（１９８０）
に記載しているジデオキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ）法を使用
することによって決定し、これを配列式に示した。

この作成は以下に説明するように一連の処理工程で実施
した。

Ｌｂｃ、゛　云　のサフ゛クローニングＩ、ｂｃ、遺伝
子を１２ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ制限断片上で大豆ＤＮＡラ
イブラリーから分離した。これはヴイボルグ（Ｗｉｂｏ
ｒｇ）等によって「ヌクリ・アシッズ・レス・（Ｎｕｃ
ｌ、’Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）Ｊ　１０　。

３４８７　　（１９８２）に記載されている。この断片
の部分を第１図の上部に示す。この断片を、第１図に示
す酵素によって切断し、次いで第１図に示すようにｐＢ
Ｒ３２２に連結した。次いで、得られたプラスミドＬｂ
ｃｚＨＨおよびｌｂｃ。

ＨＸをｐｖｕ　Ｉ　Ｉにより切断し、再連結してｐＬｐ
ＨＨおよびｐＬｐＨＸと呼ばれる２種のプラスミドを得
た。

Ｌｂｃ、ｉ　　分子からの５′末端配置のサブクローニ
ング このために、第２図に示すようにｐＬｐＨＨを用いた。

このプラスミドをＰｖｕ　Ｉ　Ｉにより開裂し、エキソ
ヌクレアーゼＢａ１３１で処理した。

この反応を種々の時間で停止し、短くなったプラスミド
をｐＢＲ３２２からの断片に連結させた。

これらの断片を第２図に示すように予め処理し、これら
の断片が一端においてＤＮＡ配列ＴＣ−−− ＡＧ−一− を有するようにした。

連結反応の後、Ｅｃ　ｏＲＩで切断し、５′末端配列を
有する断片をＥＣ０ＲＩで切断されたｐＢＲ３２２に連
結させた。これらのプラスミドを大腸菌に８０３株中に
形質転換させ、形質転換細胞中のプラスミドを配列分析
により試験した。形質転換細胞の１つから分離したプラ
スミドｐ２１３５’　Ｌｂは、配列が以下に示すように
なるように、Ｌｂ　　ＡＴＧ開始コドンの７ｂｐ前で終
結する５′末端配列を有していた： Ｋｂ −５′末端・・・ＡＡＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＩ、ｂｃ、
配列 ＬｂＣ３゛　云　からの３′　◇：令すのサブクローニ
ング このために、ＸｈｏＩＩで切断したｐＬｐＨＸを使用し
た。第３図に示すように両端を部分的に満たし、過剰Ｄ
ＮＡを除去した。図示した断片を、図示のように予備処
理したｐＢＲ３２２に連結させた。この生成物を大腸菌
に８０３株中に形質転換させた。形質転換細胞の１つは
Ｘｈｏ２ａ−３’　　Ｌｂと呼ばれるプラスミドを含ん
でいた。

ＸｈｏＩＩ認識配列はＬｂ停止コドンの直後に位置して
いるので（第１図参照）、このプラスミドは約９００ｂ
ｐの３′末端領域を含んでおり、配列はＧＡＡＴＴＣＴ
ＡＣＡＡ・・・で開始されていた。

Ｌｂ　　プロモーター　カセット（ｃａｓｓｅむｔ）の
Ｘｈｏ２ａ−３′ＬｂからのＥｃｏＲＩ／５ｐＨＩ断片
を、ｐ２１３−５′　ＬｂからのＢａｍＨＩ　／ＥＣｏ
　ＲＩ断片と混合した。これらの２種の断片をＢａｍＨ
Ｉ／５ｐｈＩ開裂点を介してｐＢＲ３２２誘導体に連結
させた。ｐＢＲ３２２誘導体ではＥＣ０ＲＩ認識配列が
除去されていた（第３図参照）。連結したプラスミドを
大腸菌に８０３株中に形質転換させた。形質転換細胞の
１つにおけるプラスミドは正確な（ｃｏｒｒｅｃ　ｔ）
断片を有していた。これをｐＩＪＬｂ５′−３’　−１
と呼んだ。

キメラＬｂ／ＣＡＴ’　云　の 第４図に示すようにｐＢＲ３２２のＣＡＴＩｔ伝子から
いくつかの小さい制限断片を分離した。５′暗号づけ領
域からＡ１ｕＩ断片を分離し、次いでこれを図示のよう
に処理したｐＢＲ３２２に連結させた。これを大腸菌に
８０３株中に形質転換させた。選択した形質転換細胞は
ＡｌｕＩ■と呼ばれるプラスミドを含んでいた。３′暗
号づけ領域からＴａｑｌ断片を分離した。この断片をエ
キソヌクレアーゼＢａ１３１で処理し、しかる後にＥｃ
ｏＲＩリンカ−を加えた。次いで、ＥｃｏＲＩによる切
断およびＥｃｏＲＩで切断されたｐＢＲ３２２への連結
反応を行った。これを大腸菌に８０３株中に形質転換さ
せ、形質転換細胞を分析した。プラスミドＴａｑ１２は
ＣＡＴ遺伝子の３′暗号づけ領域および２３ｔｚ）３’
末端配列を含み、次の配列ＣＣＣＣＧＡＡＴＴ（４’終
端していた。次いで、次の断片： ＡｌｕｌからのＥｃ　ｏＲＩ／Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ断片、ｐ
ＢＲ３２２からのＰｖｕＩＩ／Ｄｄｅｌ断片および Ｔａｑ１２からのＤｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片を一諸に、
ＥｃｏＲＩ断片で切断されたｐＥＪＬｂ５’　−３’−
１に連結させた。この連結混合物を大腸菌に８０３株中
に形質転換させた。

選択した形質転換細胞はｐＥＪＬｂ５’　−３′　ＣＡ
Ｔ１５と呼ばれる正確なプラスミドを含んでいた。

ニー、リゾゲネス１５８３４ｐＲｉプラスミドのＴＬ　
ＤＮＡ領域の２つのＥＣＯＲＩ断片を「組込み部位」と
して使用した。次いで、上記ＥＣ０ＲＩ断片を有する２
個のベクターｐＡＲ１およびｐＡＲ２２に、Ｌｂｃ、−
５”　−３’　−ＣＡＴ遺伝子（３，６ＫｈａｍＨＩ／
Ｓａ　１１断片として）を、サブクローニングした。ｐ
ＡＲ２９およびｐＡＲ３０のいずれもアグロバクテリウ
ムにおいて複製することができなかった。従って、リフ
ァンピシン１００μｇ／−とプラスミド環ｉ（ｍａｒｋ
ｅｒ）スペクチノマイシン１００μｇ／−、ストレプト
マイシン１００μｇ／−またはカナマイシン３００μｇ
／ｉとによる選択法により、ＥｃｏＲＩ断片３６または
４０を介して相同組換えによって組込まれたプラスミド
を有するニー・リゾゲネス菌を選択することにした。形
質転換された植物系統Ｌ５−９およびＬ６−２３に転移
された生成ＴＬＤＮＡ領域の構造を第５凹の下部に示す
。さらに、この図には、ｌｂｃ、−５”　　　３’　　
−ＣＡＴ遺伝子を有し、従って放射性元素で標識づけし
たＬｂ　Ｃ３５”　　　３’　−ＣＡＴ　　ＤＮＡとハ
イブリッド形成するＥＣ０ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断
片を、Ｌ６−２３系統について示す（実施例４ａ参照）
。

立 ＥＣ０ＲＩ断片隘４０を「組込み部位」として用いた。

従って、Ｌｂｃ３遺伝子を（３，６ＫｂＢａｍＨＩ断片
として）ｐＡＲ１ベクターにサブクローニングし、実施
例３ａに説明したようにＴｔＤＮＡ領域に転移させた。

形質転換された植物系統Ｌ８−３５に転移させたＴＬＤ
ＮＡ領域の構造を第６図の下部に示す。さらに、この図
には、１、ｂｃｌ遺伝子を有し、従って放射性元素で標
識づけしたＬｂ　ｃ３ＤＮＡとハイブリッド形成するＥ
ｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩ断片を示す（実施例４ｂ
参照）。

形質転換された系統（Ｌ６−２３）または形質転換され
てないコントロールの植物から抽出され、かつ制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩによって開裂されたＤ
ＮＡ断片をサチン−ハイブリッド形成法により分析した
。放射性元素で標識づけしたＬｂＣｓ　　５”　　　３
′　ＣＡＴ遺伝子を、形質転換された系統における対応
する配列を検出するために使用した。第７図において、
数字を付したバンドは、実施例３ａの制限マツプ（第５
図）に示すようなＬ　ｂ　Ｃ３５’　　　３　’　　　
ＣＡ　Ｔ遺伝子の部分を構成する制限断片に対応するも
のである。

１、ｂｃ３ｉ　　云　゛の石育り刃 形質転換された系統（Ｌ８−３５）または形質転換され
ていないコントロールの植物から抽出され、かつ制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ１１Ｉで開裂されたＤＮＡ
をサチン−ハイブリッド形成法により分析した。放射性
元素で標識づけしたＬｂｃ、遺伝子を、形質転換された
系統における対応する配列を検出するために使用した。

第８図において、数字を付したバンドは、実施例３ｂの
制限マツプ（第６図）に示すようなＬｂｃ３遺伝子の部
分を構成する制限断片に対応するものである。

クロロアンフェニコール　アセチル転移酵素（ＣＡＴ）
の活性を、”ｃ−クロロアンフェニコールから生成した
アセチル化クロロアンフェニコール（ＡｃＣ，）Ｒとし
て測定した。本実施例５ａにおいては、アセチル化形態
のＩＡｃＣ，および３ＡｃＣ，が現れ、これらをクロロ
ホルム／メタノール（９５：　５）中で薄層クロマトグ
ラフィーによりＣ１から分離した。第９図において、カ
ラム１〜３は、形質転換されてないミヤコグサ植物の葉
＋茎（ＬＳ）と同様に、根（Ｒ）、根粒（Ｎ）において
もＣＡＴ活性が生じていないことを示す。また、カラム
４〜６および７〜９は、Ｌｂ　ｃｓ　−５’　　　３’
　　ＣＡＴで形質転換されたＬＳ−２３およびＬＳ−９
植物の対応するｍ織におけるＣＡＴ活性を示す。カラム
５および′８におけるクロロアンフェニコールの転化は
、根粒におけるＬｂｃ＝　　ｓ”　　　３’　　ＣＡＴ
遺伝子の組織に特異的な発現を示す。カラム１０〜１２
は、野性種のニー・リゾゲネスにより形質転換された植
物におけるＣＡＴ活性の不足を示す。

ス上」ＬＬｙ ＬＳ−２３Ｌ５−９ ＣＡＴ活性　　　　　　　　ＣＡＴ活性根　　　　　０
０ 根粒６８，８３０ｃｐｍ／　μｇ　Ｗ白質・時１５４．
０００ｃｐｍ／　μｇ蛋白質・時葉＋茎　　　００ 第２表では、ｌ、ｂｅ３　ｓ′　３”　　ＣＡＴで形質
転換されたＬＳ−９およびＬＳ−２３植物におけるＣＡ
Ｔ活性を、アセチル化誘導体に転化した１４ｃｍクロロ
アンフェニコール量として示した。

アセチル化誘導体における放射能量を液体シンチレーシ
ョンにより測定し、ｃｐｍ／μｇ蛋白質・時で示した。

根（Ｒ）、根粒（Ｎ）または葉＋茎（ＬＳ）から抽出さ
れかつホルムアルデヒドアガロースゲル中で分離された
全ＲＮＡ５μｇをニトロセルロースに転移させた。第１
０図において、カラム１はコントロール植物の大豆から
の全ＲＮＡ５μｇを含んでいる。カラム２〜４および５
〜７は、Ｉ、ｂｃ＝−５’　　　３″　−ＣＡＴで形質
転換された系統Ｌ５−９およびＬＳ−２３のそれぞれの
根、根粒または葉＋茎からの全ＲＮＡを含んでいる。

カラム８〜１０は、野性種のニー・リゾゲネスにより形
質転換されたミヤコグサの対応する組織からのＲＮＡを
含んでいる。第１０図のａ）では、ＣＡＴ暗号づけ配列
の、放射性元素で標識づけしたＤＮＡを、パイプリフト
形成のために使用した。

ＬＳ−９およびＬＳ−２３からの根粒におけるＬｂＣｚ
　　５’　　　３’　　ＣＡＴ遺伝子の組織に特異的な
転写はカラム３および６に現れている。第１０図のｂ）
では、ユビキチン遺伝子の構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉ
ｖｅ）発現が現れている。ヒトのｃＤＮＡをハイブリッ
ド形成のために使用した。

第１０図のＣ）では、ミヤコグサ自身のレグヘモグロビ
ン遺伝子の組織に特異的な発現が示されている。大豆の
Ｌｂａ遺伝子のｃＤＮＡをこのハイブリッド形成のため
に使用した。

ｒＣＡＰ部位」の位置をプライマー・エクステンション
によりヌクレオチドレベルにおいて決定した。ＣＡＴ遺
伝子の暗号づけ配列における１５〜３４個のヌクレオチ
ドに対応する短いオリゴヌクレオチドを、酵素の逆転写
のためのプライマーとして使用した。この結果、単鎖Ｄ
　Ｎ　Ａであって、その長さがプライマーの５′末端と
プライムド（ｐｒｉｍｅｄ）　ｍ　ＲＮ　Ａの５′末端
との距離に対応するものが形成した。大豆のＬｂｃ、遺
伝子の転写開始部位に関する情報に基づいて８３個のヌ
クレオチドを有するＤＮＡストランドが予想された。第
１１図において左から右に示すカラム２，３および４は
それぞれ、プライマー・エクステンション法を、ミヤコ
グサの形質転換された根粒、ミヤコグサの形質転換され
た葉と茎、およびミヤコグサの形質転換されてない根粒
からのポリＡ゛−精製ｍ　ＲＮ　Ａについて行った場合
に生成したＤＮＡストランドを示す。カラム２に示す８
５，８６゜８７．８８および９０個のヌクレオチドを有
する長いＤＮＡストランドの結果から、ミヤコグサにお
けるＬｂＣ３プロモーターの機能が正確に分る。

第１１図に一緒に示すＤＮＡ配列では、ミヤコグサにお
ける７−メチルＧＴＰの付加されているヌクレオチド（
ｒＣＡＰ部位」）を（＊）の印で示した。大豆ではヌク
レオチドの＋１の位置に７−メチルＧＴＰが付加されて
いる。この配列において、ｌｂｃ、プロモーターのＴＡ
ＴＡＡボックスおよび対応する翻訳開始コドンに下線を
引いた。

？生　御（ｄｅｖｅｌｏ　ｉｎ　　ｃｏｎｔｒｏｌ）の
′Ｆ１に第一１−表 ＊基質は制限されており、実際の活性は約６８０００ｃ
ｐｍ／μｇ蛋白質・時クロロアンフェニコールアセチル
転移酵素およびニトロゲナーゼを、第３表に示す発生段
階において、根粒を有する根の切断片について測定した
。

ＣＡＴ活性は明瞭な白色根粒において検出することがで
き、他方、ニトロゲナーゼ活性は小さい赤色根粒が発生
するまで現われなかった。後者の発生は、コントロール
植物の大豆から知られている発生に相当するものであり
、マーカー等により「エンボ　ジェ−（ＥＭＢＯＪ、）
　Ｊ　　（１９８４）　、ユ。

１６９１−９５に示されている。ＣＡＴ活性は実施例５
で求めた。また、ニトロゲナーゼ活性は、アセチレンの
還元後に、ガスクロマトグラフィーによってエチレンを
測定することより測定した。

Ｌｂｃ、で形質転換された植物（Ｌ８−３５）、Ｌ　ｂ
　Ｃ３５′３　′ＣＡ　Ｔで形質転換された植物および
形質転換されてない植物の根粒から抽出した蛋白質を等
電点電気泳動法により４から５のｐＨ勾配で分離した。

第１２図に示すカラム１゜３．５．７および９は、大豆
コントロールの根粒、において合成されたＬｂａ蛋白質
を示す。またカラム２はＬｂ　Ｃ１５′　　３′−〇Ａ
Ｔで形質転換されたＬ６−２３−ミヤコグサ植物の根粒
からの蛋白質を示し、他方カラム６および８は形質転換
されてない植物からの蛋白質を示す。さらに、カラム４
および１０は、Ｌｂｃ、ｉｉｉ伝子で形質転換されたミ
ヤコグサ植物（Ｌ８−３５）の根粒において合成された
大豆のｌ、ｂｃｌ蛋白質を示す。

１、ｂｃｌ蛋白質のバンドは矢で示されている。

下記のＬｂｃ３−ＣＡＴ遺伝子の構造は２Ｋｂ５′　Ｌ
ｂｃ３プロモーター領域を有する。

この領域の５′末端から配列を段階的に除去することに
より、このプロモーター領域が１ｂｃ３−ＣＡＴ遺伝子
の特徴的発現のために必要であることが証明された。

このＬｂｃ３−ＣＡＴ遺伝子の構造を、上に示す非反覆
（ｕｎｉｑｕｅ）　Ｘ　ｂ　ａ　１部位において開裂し
、エキソヌクレアーゼＢａ１３１で切断した。

５ａ１１リンカ−断片を生成したプラント末端に連結し
、Ｌ　ｂ　Ｃ３ＣＡ　Ｔ遺伝子を有する短かくなった５
ａｌＩ断片をエル、コルニクラッスに転移させた。プロ
モーター配列の除去効果をＣＡＴ活性として測定した。

除去された５′領域の終点をヌクレオチドにおけるＣ　
Ａ　Ｐ部位からの距離として示した。

〜９５０■０１０００００ 〜４７４　　　ヒーー回１：−−−←　０　３０００　
　０〜２３０　　　　←口司　　　　　　０　３０００
　　０〜７８）−回引　　　　　　０　　　００第４表
から分るように、ヌクレオチドが２３０まで減少したし
ｂＣ３プロモーターにより発現されるＣＡＴ活性は著し
く低下したレベルを示し、ヌクレオチドが７８まで減少
したプロモーターにおける活性がゼロであることは、Ｌ
ｂｃ３プロモーター領域がＬｂＣ３ＣＡＴ遺伝子の根粒
における特異的発現のために必要であることを示すもの
である。

逃去１１ Ｎ２３遺伝子を、「ヌクレイツク　アシッドリサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）Ｊ　
　（オーフス大学）における論文のブリプリントに記載
されているようにして、大豆のＤＮＡライブラリーから
単離した。Ｎ２５−ＣＡＴ遺伝子は、本出願人が先に出
願した特許出願第６１−２５３５３０号明細書に記載さ
れているよにして、プラスミドｐＥＪ５’　　−３”　
　−ＣＡＴｌｏｌに１旦持されている修飾されたＬ　ｂ
　Ｃ３ＣＡ　Ｔと、Ｎ２３５’　プロモーター領域を有
するＩＫｂ、’ＥｃｏＲＩ。

ｐｄｅｌ断片とから作成した。Ｎ２３プロモーター領域
におけるＥｃｏＲＩおよびＤｄｅ１部位の位置を第１３
図に示すＤＮＡ配列に示した。用いたクローニング法の
概要をこの第１３図に示す。

なお、Ｎ２５−Ｃ’ＡＴ遺伝子は、Ｌｂｃ３−ＣＡＴ遺
伝子と同様な方法により植物に転移させた。

Ｎ２３遺伝子からの５′プロモーター領域のＤＮＡ配列
を次の第５表に示す。

１方」［Ｌム クロロアンフェニコールアセチル転１（ＣＡＴ）酵素の
活性を実施例５と同様にして測定し、ｃ　ｐ　ｍ　／μ
ｇ蛋白質／時の単位で示した。

１１１表 ＣＡＴ活性 Ｎ２５−ＣＡＴで形質転　　形質転換されて換された　
工）岬、フ）１ニクラツス　　　　ないエル、コルニク
ラツス根粒　　　　　８６１５０　　　　　　　　０↑
艮　　　　　　　　　　　　　　　　　ＯＯｕｎξ ＣＡＴ活性 Ｎ２５−ＣＡＴで形質転　　形質転換されて換されたテ
ィー、レベンス　　　　ないティー、レベンス根粒　　
　　　１４８０００　　　　　　　０↑艮　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　
　　　　０上述の第６ａおよび６ｂ表は、エル、コルニ
ク゛ンスおよびティー、レペンスのネ艮粒における２３
−ＣＡＴ遺伝子の特異的発現を示している。

ル、コルニクラツスにはりゾビウム・ロチを接種し、他
方、ティー、レベンスにはりゾビウム・トリフオリ−を
接種した。

上述のように、本発明においては、根粒の特定の遺伝子
は、他の植物、ここではロツス・コルニクラッスおよび
トリフオリラム・レペンスへの転移に際し、組織に特異
的に発現させることができることを確かめた。さらに、
プロモーターを有する５′末端領域は、転写レベルで起
こるロツス・コルニクラツスにおけるキメラＬｂｃ、遺
伝子の′！Ｊｉ織特異的制御のように、組織特異的調節
メカニズムにより制御される。従って一転移されたキメ
ラＬｂｃ、遺伝子は形質転換された植物の根粒にのみに
転写され、他の組織、例えば根、茎および葉には転写さ
れない。

また、形質転換された植物の根粒におけるキメラｌ、ｂ
ｃ３遺伝子の発現も、大豆の根粒から知られている発生
のタイミング（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｉ
ｎｇ）に従う。根または小さい白色根粒（実施例８）に
おいてはＣＡＴ活性を検出することはできなかった。さ
らに発育した明瞭な白色根粒には低い活性があり、他方
小さい赤色根粒および発育後期の成熟根粒には高い活性
を測定することができた。

転移された根粒の特定の遺伝子、例えばキメラＬｂｃ３
遺伝子の組織に特異的な発現および正確な発生発現は、
特別な効果として、マメ科植物以外の他の植物において
も、根粒の特定の遺伝子の機能的発現を可能にする。根
粒の形成に必要なすべての根粒の特定の植物遺伝子をマ
メ科植物から根粒非形成性植物種に転移させた場合には
、先に確認された正確な組織特異的発現は、リゾビウム
に感染させた際に、この種の植物における活性で機能的
な窒素固定根粒の生成を可能にする。このようにして、
窒素を供給せずにこれら植物を成長させることができる
。この場合には、転移させた遺伝子の発現を調節するた
めに、根粒の特定のプロモーター、例えばＬｂｃ３およ
びＮ　２３プロモーターを使用する必要がある。

上述のことにより、根粒の特定のプロモーターは遺伝子
、遺伝子生成物またはこの遺伝子生成物の機能を発現さ
せるために使用される。遺伝子生成物の機能とは、例え
ば酸素輸送、代謝、窒素固定または窒素吸収を変えるこ
とにより、根粒の機能を改善することである。

また上述のことにより、根粒は生物学的生成物の合成に
使用され、この生物学的生成物は植物自身を改善するか
、あるいはこの植物から後で抽出することができる。根
粒の特定のプロモーターは、遺伝子、遺伝子生成物、ま
たは所望の生成物を構成する前記遺伝子生成物によって
形成される化合物を発現させるために使用することがで
きる。

さらに本発明においては、大豆のＬｂｃ３レグヘモグロ
ビン蛋白質自体、すなわちｌ、ｂｃ、遺伝子生成物が、
Ｌｂｃ、プロモータの制御下にＬｂｃ、コード配列を発
現させるミヤコグサ植物の根粒中に高濃度で存在するこ
とを確かめた。このｌ、ｂｃ３プロモータは、大豆のゲ
ノムｌ、ｂｃ。

遺伝子を組込みベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｖ
ｅｔｏｒ）ｐＡＲｌにクローニングすることにより確認
された。なお、このゲノムＬｂｃ、遺伝子は暗号づけ配
列、介在配列並びに５′および３′末端領域を有する。

３．６ＫｂＢａｍＨＩ断片１ｂｃ３ＨＨ（実施例２参照
）をｐＡＲ１プラスミドにクローニングし、上述のよう
にミヤコグサに転移させた。

高レベルのｌ、ｂｃ、蛋白質（実施例９参照）がミヤコ
グサの形質転換された根粒に見い出され、かつ大豆の根
粒中のレベルに対応していることは二ミヤコグサにおけ
るＬｂｃ３プロモータの十分な転写、ならびにｌ、ｂｃ
３ｍＲＮＡの有効なプロセッシングおよび翻訳を示すも
のである。

形質転換された根粒に存在する高レベルのＣＡＴ活性も
また、キメラしｂＣ３遺伝子から形成されたｍＲＮＡの
有効な翻訳に起因するものである。ｌ、ｂｃ３遺伝子に
おけるリーダー配列は旨■訳開始を決定するものであり
、また最終的翻訳能力を決定する筈である。この能力は
、植物すなわち植物細胞における遺伝子生成物の効果的
合成に重要である。従って、Ｌｂｃ、または別のレグヘ
モグロビンリーダー配列を、所定の植物プロモーターの
最終的発現を高めるために使用することができる。第１
配列としてＬｂリーダー配列を有し：第２配列として任
意プロモーターを有するＤＮＡ断片の構造体は、この構
造体を植物に転移させかつ発現させる場合における本発
明の特別な用途である。

【図面の簡単な説明】

第１図はｌ、ｂｃ、遺伝子のサブクローニング工程を示
す説明図、 第２図はｌ、ｂｃ、遺伝子からの５゛末端領域のサブク
ローニング工程を示す説明図、 第３図はＬｂＣ３遺伝子からの３′末端領域のサブクロ
ーニング工程を示す説明図、 第４図はキメラＬｂ／ＣＡＴ遺伝子の作成工程を示す説
明図、 第５図はＬ　ｂ　Ｃ３５３’　　ＣＡ　Ｔ遺伝子。 のクローニングおよび組込み工程を示す説明図、第６図
は［、ｂｃ３遺伝子のクローニングおよび組込み工程を
示す説明図、 第７図は形質転換されたミヤコグサ植物における大豆Ｌ
ｂＣ３ｓ′　　３’　　ＣＡＴ遺伝子を確認するための
クロマトグラム、 第８図は形質転換されたミヤコグサ植物における大豆Ｌ
ｂｃ３遺伝子を確認するためのクロマトグラム、 第９図はミヤコグサの根粒における大豆ＬｂＣ３５’　
　　３′　ＣＡＴ遺伝子の組織ニ特異的な発現状態を示
すクロマトグラム、第１０図はＬ　ｂ　ｃ　ｙ　　５　
’　　　３　’および野生種のニー、リゾゲネスで形質
転換されたミヤコグサの組織における転写状態を示すク
ロマトグラム、第１１図はミヤコグサの形質転換された
根粒における大豆Ｌｂｃ３プロモーターの転写開始部位
（ＣＡＰ部位）を求めるためのクロマトグラム、第１２
図は形質転換された植物および形質転換されてない植物
の根粒から抽出した蛋白質の等電点電気永動法による分
離結果を示すクロマトグラム、第１３図はＮ２５−ＣＡ
Ｔ遺伝子の作成に用いたクローニング法の工程を示す説
明図である。 特許　出　願人　　　アクチェセルス力ベット・デ・ダ
ンスケ・スケルファプリケール ７′、； 代理人弁理士　　杉　　村　　暁　　秀、・符

【 同　　弁　　理　　士　　　　杉　　　　村　　　　興
　　　　作　ｅ”１１″Ｉり 第： ５′末塙＠低 ２図 第３ ３゛末塙領Ａ ）ｐｎｌ 図 しＢ　アロモーターｈセント 又 丁アーＤＮＡホ・・−処 区、ｑ 廂 ご 第７図 第８図 εε ＯＣ 第１θ図 一４Ｌｂ Ｃ】 、２８＄ １８ｓ 第１１図 −雫− ニ ０．＋、−１ 一−ニニ。（＝ニー４．上５−；＋ニー＾７Ｚ−６−−
−μｍ−、−−一−−４−−５−−−−−リ−ど１１−
一。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発現させる遺伝子とプロモーター配列を有する５′
   末端領域との双方、場合によっては３′末端領域を含有
   する組換え体ＤＮＡセグメントを植物細胞に導入し、こ
   の形質転換された植物細胞を増殖培地において培養する
   ことにより、植物、植物の部分、または植物の培養細胞
   において遺伝子を発現させるに当り、根粒の特定の遺伝
   子からの誘導植物プロモ ーターを有するＤＮＡ断片を組換え体ＤＮＡセグメント
   として使用することを特徴とする遺伝子の発現方法。 ２、誘導植物プロモーターを有し、根粒の特定の遺伝子
   の５′末端領域と同一であるか、該領域から誘導される
   か、あるいは該領域を有するＤＮＡ断片を使用する特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３、誘導植物プロモーターを有し、根粒の特定の遺伝子
   の５′末端領域と同一であるか、該領域から誘導される
   か、あるいは該領域を有するＤＮＡ断片を使用し、該Ｄ
   ＮＡ断片によって遺伝子を発現させ、この遺伝子を特定
   の発生段階において共生工程として根粒中に生じさせ、
   これにより窒素の固定を行わせる特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 ４、根粒の特定の遺伝子からの誘導植物プロモーターを
   有するＤＮＡ断片を使用することにより、根粒の特定の
   遺伝子を発現させる特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
   か一つの項に記載の方法。 ５、根粒の特定の遺伝子からの誘導植物プロモーターを
   有するＤＮＡ断片を使用することにより、マメ科植物、
   マメ科植物の部分およびマメ科植物の培養細胞において
   遺伝子を発現させる特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
   か一つの項に記載の方法。 ６、誘導植物プロモーターを有し、植物のレグヘモグロ
   ビン遺伝子の５′末端領域と同一であるか、該領域から
   誘導されるか、あるいは該領域を有するＤＮＡ断片を使
   用する特許請求の範囲第１〜５項のいずれか一つの項に
   記載の方法。 ７、誘導植物プロモーターを有し、大豆のレグヘモクロ
   ビン遺伝子の５′末端領域と同一であるか、該領域から
   誘導されるか、あるいは該領域を有するＤＮＡ断片を使
   用する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、誘導植物プロモーターを有し、次の配列：【遺伝子
   配列があります】 を有するＬｂａ遺伝子の５′末端領域と同一であるか、
   該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有するＤＮ
   Ａ断片を使用する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、誘導植物プロモーターを有し、次の配列：【遺伝子
   配列があります】 を有するＬｂｃ＿１遺伝子の５′末端領域と同一である
   か、該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有する
   ＤＮＡ断片を使用する特許請求の範囲第８項記載の方法
   。 １０、誘導プロモーターを有し、次の配列：【遺伝子配
   列があります】 を有するＬｂｃ＿２遺伝子の５′末端領域と同一である
   か、該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有する
   ＤＮＡ断片を使用する特許請求の範囲第８項記載の方法
   。 １１、誘導植物プロモーターを有し、次の配列：【遺伝
   子配列があります】 を有するＬｂｃ＿３遺伝子の５′末端領域と同一である
   か、該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有する
   ＤＮＡ断片を使用する特許請求の範囲第８項記載の方法
   。 １２、誘導植物プロモーターを有し、次の配列：【遺伝
   子配列があります】 を有するＬｂｃ＿３−５′−３′−ＣＡＴ遺伝子の５′
   末端領域と同一であるか、該領域から誘導されるか、あ
   るいは該領域を有する ＤＮＡ断片を使用する特許請求の範囲第８項記載の方法
   。 １３、誘導植物プロモーターを有し、次の配列：【遺伝
   子配列があります】 １５、３′末端領域がレグヘモグロビン遺伝子の３′末
   端領域である特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、３′末端領域が大豆のレグヘモグロビン遺伝子の
   ３′末端領域である特許請求の範囲第１４項記載の方法
   。 １７、３′末端領域が、それぞれ次の配列：【遺伝子配
   列があります】 を有するＬａ、Ｌｂｃ＿１、Ｌｂｃ＿２、またはＬｂｃ
   ＿３遺伝子の３′末端領域である特許請求の範囲第１６
   項記載の方法。 １８、根粒の特定の遺伝子の誘導植物プロモーターを有
   するプラスミドを組換え体プラスミドとして使用し、こ
   の組換え体プラスミドを植物、植物の部分、または植物
   の培養細胞中に導入することによりポリペプチドを生成
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １９、特許請求の範囲第１〜１８項のいずれか一つの項
   に記載の方法を実施する際に使用される誘導植物プロモ
   ーターを有するＤＮＡ断片において、 任意の起源の根粒の特定の遺伝子の５′末 端領域と同一であるか、該領域から誘導されるか、ある
   いは該領域を有することを特徴とするＤＮＡ断片。 ２０、植物のレグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域と
   同一であるか、該領域から誘導されるか、あるいは該領
   域を有する特許請求の範囲第１９項記載のＤＮＡ断片。 ２１、大豆のレグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域と
   同一であるか、該領域から誘導されるか、あるいは該領
   域を有する特許請求の範囲第２０項記載のＤＮＡ断片。 ２２、次の配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂａ遺伝子の５′末端領域と同一であるか、
   該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有する特許
   請求の範囲第２１項記載のＤＮＡ断片。 ２３、次の配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ．遺伝子の５′末端領域と同一であるか
   、該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有する特
   許請求の範囲第２１項記載のＤＮＡ断片。 ２４、次の配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ＿２遺伝子の５′末端領域と同一である
   か、該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有する
   特許請求の範囲第２１項記載のＤＮＡ断片。 ２５、次の配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ＿３遺伝子の５′末端領域と同一である
   か、該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有する
   特許請求の範囲第２１項記載のＤＮＡ断片。 ２６、次の配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ＿３−５′−３′ＣＡＴ遺伝子の５′末
   端領域と同一であるか、該領域から誘導されるか、ある
   いは該領域を有する特許請求の範囲第２１項記載のＤＮ
   Ａ断片。 ２７、次の配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＮ２３遺伝子の５′末端領域と同一であるか、
   該領域から誘導されるか、あるいは該領域を有する特許
   請求の範囲第１９項記載のＤＮＡ断片。 ２８、特許請求の範囲第１〜１８項のいずれか一つの項
   に記載の方法を実施する際に使用できるプラスミドにお
   いて、 特許請求の範囲第１９〜２７項のいずれか 一つの項に記載のＤＮＡ断片を含有することを特徴とす
   るプラスミド。 ２９、ｐＡＲ２９である特許請求の範囲第２８項記載の
   プラスミド。 ３０、ｐＡＲ３０である特許請求の範囲第２８項記載の
   プラスミド。 ３１、ｐＡＲ１１である特許請求の範囲第２８項記載の
   プラスミド。 ３２、Ｎ２３−ＣＡＴである特許請求の範囲第２８項記
   載のプラスミド。 ３３、特許請求の範囲第１〜１８項のいずれか一つの項
   に記載の方法を実施する際に使用される組換え体アグロ
   バクテリウム・リゾジエネス１５８３４菌株において、 特許請求の範囲第２８〜３２項のいずれか 一つの項に記載のプラスミドによって形質転換された菌
   株であることを特徴とする組換え体アグロバクテリウム
   ・リゾジエネス１５８３４菌株。 ３４、ｐＡＲ２９によって形質転換され、ＡＲ１１２７
   と命名した菌株である特許請求の範囲第３３項記載の組
   換え体アグロバクテリウム・リゾジエネス１５８３４菌
   株。 ３５、ｐＡＲ３０によって形質転換され、ＡＲ１１３４
   と命名した菌株である特許請求の範囲第３３項記載の組
   換え体アグロバクテリウム・リゾジエネス１５８３４菌
   株。 ３６、ｐＡＲ１１によって形質転換され、ＡＲ１０００
   と命名した菌株である特許請求の範囲第３３項記載の組
   換え体アグロバクテリウム・リゾジエネス１５８３４菌
   株。 ３７、Ｎ２３−ＣＡＴによって形質転換され、ＡＲ２０
   ４−Ｎ２３−ＣＡＴと命名した菌株である特許請求の範
   囲第３３項記載の組換え体アグロバクテリウム・リゾジ
   エネス１５８３４菌株。