JPS6319560A - 免疫反応におけるプロゾ−ン判定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は免疫反応におけるプロゾーン判定方法に関す
る。さらに詳しくは免疫比濁法における抗原抗体複合物
を含有する被検液のプロゾーン検出に関する。

（ロ）従来の技術 血清中の抗原を定量する方法として免疫比濁法かある。

これは試薬中に含有される抗体が測定目的物質である抗
原と特異的に結合しその結果生成する抗原抗体複合物に
よる被検液の濁度を吸光度として測定する方法である。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 しかしながら上記方法において、一般に濁度は抗原濃度
の上昇に伴い上昇するはずであるが、実際には高濃度側
で逆に濁度が低くなっていく現象が見られる（第５図参
照）。すなわち血清中に含まれる抗原濃度が高いのに対
し、試薬中の抗原濃度が見かけ上低く測定されることに
なる現象でこれはプロゾーンと呼ばれている。このプロ
ゾーンは抗体よりも抗原が多い状態つまり抗原過剰状態
を意味し、この状態では抗原濃度は高くても抗体が不足
していて適当な大きさの抗原抗体複合物を生成できずそ
の結果濁度が低下することとなる。

プロゾーンが生じると１つの測定吸光度（見かけの吸光
度）に対し２つの抗原濃度が測定されるという問題が生
じる。従って免疫比濁法では被検液がプロゾーン域であ
るかどうかをチェックすることが必要になる。このため
従来で；は抗原濃度を何段階かに希釈していき、低い濃
度でより高い吸光度を示す所がないかどうかを確認した
り、反応液に再度抗原を分注して反応させ吸光度が下が
ったらプロゾーン域であると判断したり、抗体分注直後
の吸光度の変化率がある値以上であるならばプロゾーン
域であると判断する等の方法が行われてきた。しかじ前
１者は希釈系列を調製しそれぞれを反応させるので手間
とコストがかかり、また後２者は自動分析装置でないと
チェックが難しくかつ抗体分注直後の濁度の測定は液の
ゆらぎ等の影響で正確な測定が困難である等それぞれに
問題点がある。

この発明はかかる状況に鑑み為されたものであり、こと
に被検液がプロゾーン域にあるかどうかを簡便に判定す
る方法を提供しようとするものである。

（ニ）問題点を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、抗原抗体複合物を含有する
被検液に光を照射してその見かけの吸光度を可視領域の
長波長側と短波長側との異なる２種の波長について測定
し、得られた２種の吸光度の比に基づいて被検液のプロ
ゾーンを判定することを特徴とする免疫反応におけるプ
ロゾーン判定方法が提供される。

この発明の方法の最も特徴とする点は、異なる２種の波
長による見かけ吸光度の比が被検液中に懸濁する抗原抗
体捏合物粒子の粒径のパラメータとなることを利用する
ものであり、該吸光度比と予め設定されている判定レベ
ル値との大小関係によりプロゾーンであるか否かの判定
をするものである。

プロゾーン域では抗原過剰状態になっており、抗体価の
低い試薬を使用したときには粒径の小さい抗原抗体複合
物が多数生じて抗原が過剰になっている状態のもの（第
６図（ａ）参照）と、抗体価の高い試薬を用いたときに
は粒径の大きい抗原抗体複合物が少数で生じている状態
のもの（第６図（ｂ）参照）とがある。従ってプロゾー
ン域では生じている抗原抗体捏合物粒子の粒径が極端に
小さいものまたは大きいものが混在していて粒径に大き
なバラツキが生じており、換言すれば生成する抗原抗体
捏合物粒子の粒径がほぼ均一な状態（通常、０．５〜１
．０μｍ程度）にあるときは最適な状態（第６図（ｃ）
参照）で免疫反応が進行しており、プロゾーン域ではな
いことを意味することとなる。

このことから被検液中で生成する抗原抗体捏合物粒子の
粒径変化が見かけの吸光度の比め変化と対応することを
見いだして、該吸光度の比をプロゾーンの判定要素とし
て用いていることがこの発明の方法の特徴である。

異なる２種の波長に基づく吸光度の比が、被検液中に懸
濁する粒子の粒径の関数となることは次ぎにより説明さ
れる。すなわち、ある波長の光を、懸濁粒子を含む液媒
体に照射した際に得られる透過光の強度（吸光度は透過
光強度の逆数の対数）は、液媒体自体の吸収以外に懸濁
粒子の散乱作用によって減少し、液媒体自体の吸光度を
０として計算される！！局液の吸光度は見かけ上増加す
る。

この見かけ上の吸光度は懸濁粒子の散乱作用によって異
なり、ことに照射光の波長により散乱光強度の角度分布
が異なる傾向があるため、懸濁粒子の粒径のみならず照
射波長によって計測吸光度は変化する。かかる関係下、
粒径２μｍ以下の懸濁粒子を対象とした際に、異なる２
波長の見かけ吸光度の比が、粒径の関数となる。

この発明の方法に用いる２種の波長光は、生じる抗原抗
体捏合物粒子に対して異なる散乱作用を受けるものであ
ればよく、通常、汎用されている可視光領域（約３４０
〜７００ｎｍ）の異なる２種の波長を選択するのが便利
である。２種の波長としては、吸光度検出器側の精度や
測定粒径範囲を適合化することにより近接した異波長の
ものを用いることもできるが、通常、それぞれ３４０〜
４５０ｎｍと６００〜７５０ｎｍの２種の波長を選択す
るのが適している。

この発明の方法においてプロゾーンであるかどうかの判
定基準に用いられる判定レベルとしては、予め被検液を
各測定項呂に応じて高感度側の波長により吸光度を測定
して検量線を作成し、この検量線のプロゾーン域境界の
濃度において、上記具なる２種の波長について吸光度を
測定して得られる比が用いられる。

この発明の方法において、プロゾーンかどうかの判定は
、上記判定レベルと見かけ吸光度の比との大小を比較す
ることにより行われる。試薬が抗体価の高いものを使用
しているときは上記比の値が判定レベルよりも小さいと
ころがプロゾーンと判定され、試薬が抗体価の低いもの
を使用しているときは上記比の値が判定レベルよりも大
きいところをプロゾーン′と判定する。

この発明の方法は、通常の吸光光度計、光電比色計等を
用いて行うことができ、光散乱光度計などの特殊な装置
を用いる必要はない。従って測定セルも通常の角セルを
用いることができ、セル厚も通常のものを使用すること
ができるが、多重散乱を防止すべくセル厚は薄いものを
用いるのが好ましく、通常、５〜１０ｏｍ程度のものを
用いるのが適している。ただし、透過光を対象とするた
め多重散乱の影響は少なくセル厚みに従来のごとき厳密
さは要求されない。

ただし、この発明の方法の実施は、２波長の吸光度計測
手段を有しこれらの吸光度比を出力できる装置を用いて
行うのが適している。なお、この計測手段は連続波長光
源を用い照射光または透過光を分光して少なくとも２つ
の波長についての見　−かけ吸光度を計測できるよう構
成されたものが適している。

（ホ）作用 この発明によれば、プロゾーン境界近傍での生成する抗
原抗体後合物粒子の大きな粒径変化がプロゾーンの判定
要素となるので、粒径のパラメーターとなる２種の波長
に基づく見かけ吸光度の比を計測して、予め設定されて
いるプロゾーン境界付近の見かけ吸光度の比との大小を
比較することによりその被検液がプロゾーンであるかど
うかが判定されることとなる。

以下実施例によりこの発明の詳細な説明するが、これに
よりこの発明は限定されるものではない。

（へ）実施例 第１図は、この発明の方法の実施に用いる測定装置の一
例の構成説明図である。図においてこの測定装置は、角
型測定セル（３；　ｌｈａ厚）と、光源（１）、コリメ
ータレンズ（２）、集光レンズ（４）、入射スリット（
５）、回折格子（６）、２個の充電変換素子（７）（７
°）、２個のプリアンプ（８）（８°）、および２個の
吸光度算出回路（９）（９°）からなる光学測定系と、
比較測定回路（１０）からなる比較器とから構成されて
いる。そして素子（７）（７°）は所定の波長λ、。

λ、に対応するように配置されている。

かかる装置において、光源（１）からの白色光はレンズ
（２）により平行光束となって角型測定セル（３）に照
射され、セル（３）を透過した光束は集光レンズ（４）
により入射スリット（５）に集光され、スリット（５）
を通った光は回折格子（６）によって分光される。分光
された光のうち波長λ１．λ、の光りは対応する素子（
７）（７°）に照射し、プリアンプ（８）（３’）の出
力が算出回路（９）（９’　）に入るよう設定されてい
る。

まずセル（３）に純水を入れてそのプリアンプ（８）（
８′）の出力■。（λ、）、■。（λ、ンを算出回路（
９Ｘ９°）に記憶する。次いで目的とする試料をセル（
３）に入れ、そのプリアンプ出力！（λＩ）、■（λ、
）を用いて、算出回路（９）（９°）でそれぞれの吸光
度：Ａ（λ＋）　＝　　−１ｏｇＣＩ　（λ１）／１０
（λ、）〕Ａ（１ｇ）　＝　　−１ｏｇ（１（λｔ）／
　ＩＯ（λ、）〕をそれぞれ算出する。

この出力Ａ（λ１）およびＡ（λ、）が比測定回路（ｌ
Ｏ）に入力され、その比Ａ（λ、）／Ａ（λ、）が出力
されることとなる。

項目としてはＩｇＡおよびＩｇＧを選び、試料としては
標準血清を用いた。また、試薬としては免疫比濁用Ｉｇ
Ａ、ＩｇＧおよびネフェロメトリ用工ｇＧを用い、免疫
比濁用１ｇＡに対しては９３００ｍｇ／ｄ１、ＩｇＧに
対しては４３０００ｍｇ／　ｄＱ、ネフｚロメトリ用１
ｇＧに対しては９００ｒＤｇ／ｄ（！の試料を用いて希
釈系列を作り、λ、＝３４０ｎｍ、λ、＝７００ｎｍの
場合のＡ（λＩ）、Ａ（λ、）、Ａ（λ、）、／Ａ（λ
２）を測定した。第２．３および４図に測定結果を示す
。

第２図において、３４０ｎｍでの吸光度（Ａ、４゜）で
はプロゾーン現象が起こっているが７００ｎｍの吸光度
（Ａ？。。）ではまだプロゾーン現象は起こりていない
。ここで吸光度の比（、Ａ　ｙ−ｏ／　Ａ　７００）の
値を計算してプロットしたもの（×印）が、判定レベル
〔図中の点線（Ａ３４０の検量線に基づいて算出したも
の〕〕以下であれば、プロゾーン現象が起こっていると
判定され、これはＡ３４゜より指摘されるプロゾーン域
とよく一致している。

第３図において、３４０ｎ　ｍ、　７００ｎ　ｍの吸光
度ともにプロゾーン現象が起こっているが、この場合も
吸光度の比（Ａ３４゜／Ａ？。。）の値を計算してプロ
ットしたもの（×印）が、判定レベル〔図中の点線（Ａ
ｓ４ｏの検量線に基づいて算出したもの）〕以下であれ
ば、プロゾーン現象が起こっていると判定され、これは
Ａ　ｓａｏより指摘されるプロゾーン域とよく一致して
いる。

第４図において、３４０ｎ　ｍ、　７００ｎ　ｍの吸光
度ともにプロゾーン現象が起こっているが、この場合は
吸光度の比（Ａ３４゜／Ａ？。。）の値を計算してプロ
ットしたもの（×印）が、判定レベル〔図中の点線ＣＡ
ｓ４ｏの検量線に基づいて算出したもの）〕以上であれ
ば、プロゾーン現象が起こっていると判定され、これは
Ａｓ４゜より指摘されるプロゾーン域とよく一致してい
る。

（ト）発明の効果 この発明によれば、ある濃度において異なる２波長で測
定した見かけの吸光度の比を、予め設定した判定レベル
と大小を比較することにより簡便に被検液がプロゾーン
現象を起こしているかどうかの判定ができ、希釈検体に
よるチェックまたは抗原再添加によるチェック等煩雑な
手間が不要となる。また反応の終点での吸光度を計測す
るので、常に安定した測定ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の方法の実施に用いる測定装置の一
例の構成説明図、第２．３図はそれぞれ第１図の装置に
より各標準血清を各免疫比濁用試薬で測定したときの結
果および測定値に基づいて求めた吸光度比と判定レベル
を示すグラフ図、第４図は標準血清をネフェロメトリ用
試薬で測定したときの第２弗Φ舎略図相当図、第５図は
プロゾーン現象を説明するグラフ図、第６図は被検液中
に生成する抗原抗体複合物の粒子の状態を説明する模式
図である。 （１）・・・・−・光源、　　　（２）・・・・・・コ
リメータレンズ、（３）・・・・・・角型測定セル、（
４）・・・・・・集光レンズ、（５）・・・・・・入射
スリット、（６）・・・・・・回折格子、（７）（７’
　）・・・・・・光電変換素子、（８）（８’　）・・
・・・・プリアンプ、（９）Ｃ９°）・・・・・・吸光
度算出回路、（１０）・・・・・・比較測定回路。 第２図 ×Ａ３１Ｑ／Ａ７（イ） ４５釈系列 第３図 ｗＡ３４０／Ａ７００ 第４図 廊釈系列

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、抗原抗体複合物を含有する被検液に光を照射してそ
   の見かけの吸光度を可視領域の長波長側と短波長側との
   異なる２種の波長について測定し、得られた２種の吸光
   度の比に基づいて被検液のプロゾーンを判定することを
   特徴とする免疫反応におけるプロゾーン判定方法。