JPS63117262A - 核酸を結合してなる担体並びに核酸の検出法および分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 崖１ユＪ冴Ｕ助を狂 本発明は、核酸を結合してなる水不溶性担体に関し、特
に、相補的な塩基配列を含む核酸間のハイブリッド形成
を利用する核酸の検出および分離、精製に有用である、
少なくとも部分的に一本鎖である核酸を結合してなる水
不溶性担体並びにそれを利用する核酸の検出方法および
分離方法に関する。

狐沸ヱυ支祈 検体試料中の目的とする特定塩基配列を有する核酸を検
出する方法として、核酸のハイブリッド形成分析が利用
されている。

この分析法は、組み換えＤＮＡ技術の分野の研究者等に
よって開発された方法で、−末鎖に変性されたＤＮＡま
たはＲＮＡの核酸が適当な条件下で相補的な塩基配列を
含む別の一本鎖核酸と塩基間の水素結合を介してハイブ
リッドを形成することを利用するものである。

従来の核酸のハイブリッド形成分析は通常、以下の方法
で行われている。

まず、検体試料中の核酸を変性して一本鎖とした後、支
持体であるニトロセルロース類やナイロン類のメンブラ
ンフィルタ−に８０℃で３時間程度焼き付は固定化する
。

次に、標識プローブの非特異的吸着を抑えるためにプレ
ハイブリダイゼーションを行う。プレハイブリダイゼー
ションは通常３７℃で３０分以上を要する。ここで、標
識プローブとは、トレーサーとして検出の目的となる、
特定塩基配列を含む一本鎖核酸からなり、容易に検出で
きる標識を付したものである。プレハイブリダイゼーシ
ョンの後、標識プローブを、試料の核酸を固定したメン
ブランフィルタ−に添加し、ハイブリッド形成に適する
溶液、例えば、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、
ドデシル硫酸ナトリウム、サケ精子ＤＮＡおよびホルム
アミドを含むトリス塩酸緩衝液中で一晩インキュベーシ
ョンを行う。次いで、標識プローブの非特異的な吸着を
除去するために特定塩化合物の溶液中で２時間程度加温
することによりフィルターの洗浄を実施する。

この後、フィルターに固定化された一本鎖核酸とハイブ
リッドを形成している標識プローブの標識をトレーサー
として検出することにより検体試料の核酸中の特定塩基
配列を検出する。

■が”決しようとする間　へ このように、従来のフィルターを支持体とした核酸のハ
イブリッド形成分析では、検体試料中の核酸の同定、プ
レハイブリダイゼーション、標識プローブとのハイブリ
ッド形成、洗浄、検出という一連の操作を必要とするの
で時間がかかり、例えば臨床実験で日常的に用いるのに
は適さないという問題を有する。

特に核酸の固定化における焼き付け、プレハイブリダイ
ゼーション、洗浄という操作は煩雑で、分析に要する時
間を長くする原因となっている。

（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｔ、：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、５５＋５０９ページ（１９
８５）　）。

また、フィルター上でのハイブリッド形成は、固相の一
本鎖核酸と液相の標識プローブとの反応が溶液中で不均
一な状態で実施されるため、ハイブリッドの形成速度が
遅いという問題を有する。

しかもハイブリッド形成効率は極めて低く、通常、添加
された標識プローブのうち計算上期待される値の数％が
ハイブリッド形成に利用されるにすぎない。

さらに、フィルターを支持体とした核酸のハイブリッド
形成分析は、感度や精度が低いという問題もある。

本発明の目的は、前記の従来技術の問題点を解決し、特
定の塩基配列を含む核酸の検出を短時間でかつ簡便な操
作で行うことができ、ハイブリッド形成効率が高く、し
かも高感度かつ高精度の測定を実現し得る新規なハイブ
リッド形成用担体を提供することにある。

５　を１ンするための 本発明は、前記の問題点を解決する手段として、有機高
分子物質からなり表面が非多孔質の粒径０．０１〜５０
μｍの粒子の表面に、少なくとも部分的に一本鎖である
核酸を結合してなるハイブリッド形成用水不溶性担体を
提供するものである。

本発明の担体に用いられる有機高分子物質としては、例
えば、スチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレ
ン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレン
スルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）
アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ
）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−
ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチ
レン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコ
ール−ジー（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アク
リル酸トリブロモフェニル、（メタ）アクリロニトリル
、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メ
チレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジェン、イソ
プレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロ
リドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合
物、α、β−不飽和カルボン酸のエステル類もしくはア
ミド類、α、β−不飽和二トリル化合物、ハロゲン化ビ
ニル化合物、共役ジエン化合物、ならびに低級脂肪酸ビ
ニルエステルからなるビニル系単量体の一種以上を重合
して得られる水不溶性の有機高分子物質や該有機高分子
物質を化学的に変性して得られる水不溶性の有機高分子
物質、もしくはアガロース、デキストラン、セルロース
、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体やメ
チル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等
のタンパク質の架橋体をあげることができる。

これらの有機高分子物質からなる粒子（以下、単に「粒
子」と称する）は、乳化重合、感温重合、溶液沈殿重合
等によって製造することができる。

また、有機高分子物質溶液を非溶媒中に分散し架橋した
り、または溶媒を揮散させること等によって該粒子を得
ることができるが、粒子の製造方法はこれらに限定され
るものではない。

なお、この粒子には、必要に応じて充填剤、例えば、磁
性粉等を含有させてもよい。

本発明に用いられる粒子の表面は非多孔質でなければな
らない。ここで、粒子の表面が「非多孔質」であるとは
、長径が１００Å以上である孔を粒子の表面に有しない
ことを意味する。粒子の表面が非多孔質でないと、即ち
、長径で１００Å以上である孔が粒子の表面に存在する
と、後述の核酸検出法などで用いられる標識プローブが
粒子の内部に捕捉される等の原因によりハイブリッド形
成分析の感度や精度の向上が望めない。

なお、このように、粒子の表面は非多孔質であることが
必要であるが、粒子の内部に独立気泡等が存在してもよ
い。

本発明に使用する粒子の粒径は、遠心分離等の簡便な操
作で粒子を回収するために０．０１μｍ以上、好ましく
は０．０５μｍ以上である必要がある。また、粒子の単
位沈降体積当りの表面積を大きくし、かつハイブリッド
形成に適当な条件下で担体が均一に分散する状態を保つ
ことによって高いハイブリッド形成効率を達成するため
に、５０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以下である必要
がある。

さらに、本発明に用いる粒子は、水性媒体中で使用する
ために、水不溶性でなければならない。

本発明において、核酸を粒子に結合させる方法としては
、共有結合、静電的結合、物理吸着を利用することがで
きるが、結合された核酸の安定性、および試料中の核酸
や標識プローブのハイブリッド形成によらない非特異的
吸着を防ぐことが必要な場合の粒子表面のブロックの簡
便さを考慮すると、共有結合が好ましい。

したがって、粒子はその表面に、カルボキシル基、アミ
ノ基（−ＮＨｚ）、ヒドロキシル基、ホルミド基等の核
酸と共有結合を形成するのに利用しうる官能基を粒子表
面積１　ｎｍ”当り１ヶ以上有することが望ましい。核
酸を粒子に共有結合により結合させる方法としては、例
えば、「固定化酵素」（千畑一部編、講談社出版、　１
９７５）に記載されている、カルボジイミド活性化法、
臭化シアン法、ジアゾ化法、トリアジン活性化法、イソ
シアナート活性化法、アルキル化法等の結合法における
リガンドの代りに核酸を用いることで利用することがで
きる。

また、結合法として静電的結合または物理吸着を利用す
る場合は、標識プローブ等の非特異的吸着を抑えるため
に、プレハイブリダイゼーションを実施する必要がある
。

本発明における核酸としては、高等動物、高等植物、カ
ビ類、バクテリア、ウィルス等に由来する遺伝子、メツ
センジャーＲＮＡ　、クローン化Ｉ）ＮＡおよび合成ヌ
クレオチドを例示することができ、検出、精製等の目的
または手段となる核酸が有する特定塩基配列の少なくと
も一部と実質的に相補的な塩基配列の部分を、−末鎖の
状態で、少なくとも一部に含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ
分子である。

このように、この核酸は、全体が一本鎖であるか、また
は少なくともハイブリッド形成に必要な部分が部分的に
一本鎖化されているものであればよい。

本発明において、粒子に核酸を結合させる条件は、その
方法によって異なるが、粒子１■に対する核酸の使用量
は、通常１μｇ以下である。

また、本発明は、特定の塩基配列を含む核酸の分析方法
に関する。

すなわち、本発明は、 検体試料中の特定の塩基配列を含む核酸の検出方法であ
って、 前記核酸を、少なくとも前記の特定の塩基配列の部分が
一本鎖である状態で、有機高分子物質からなり表面が非
多孔質の粒径０．０１〜５０μｍの粒子の表面に結合し
てハイブリッド形成用水不溶性担体を形成し、 次に、該担体と、前記の特定の塩基配列の少なくとも一
部に対して相補的な塩基配列を含む標識核酸プローブと
をハイブリッド形成せしめ、次に、前記担体とハイブリ
ッド形成した標識核酸プローブを検出することからなる
核酸の検出方法をも提供する。

上記核酸の検出方法に用いられる標識核酸プローブとは
、直接の検出対象となる一本鎖核酸からなり、容易に検
出できる標識を付したものである。

また、用いられる標識は、酵素学的に活性な基、螢光体
、発色団、発光体、特異的な結合が可能な配位子、重金
属および放射性同位元素のような、トレーサーとして容
易に検出することができる物質であり、このためにハイ
ブリッド形成によって担体上にトラップされた標識プロ
ーブは容易に検出することができる。

上記の検出方法は、直接法というべき方法で、より具体
的には、例えば、次のように実施される。

まず、検体試料に含まれている核酸をアルカリ処理や熱
処理により少なくとも゛部分的に一本鎖化した後、有機
高分子物質からなる粒子に結合してハイブリッド形成用
担体を得る。次に、この担体をハイブリッド形成に適し
た緩衝液に懸濁し、標識核酸プローブを添加して粒子に
結合された核酸とハイブリッド形成させ、次いでハイブ
リッドした標識プローブを検出する。

ハイブリッド形成に適当な緩衝液としては、例えば、１
０＋ｎＭのトリス−塩酸緩衝液に０．５（ｗ／ｖ）％と
なる量のドデシル硫酸ナトリウム、７５ｍＭとなる量の
クエン酸ナトリウム、７５０ｍＮとなる量の塩化ナトリ
ウム、５０　（ｖ／ｖ）％となる量のホルムアミド、お
よび１０（ｗ／ｖ）％となる量のサケ精子ＤＮＡを混合
した水溶液などが挙げられるが、この組成に限定される
ものではない。

ハイブリッド形成の際の反応温度は通常０〜７０℃の範
囲であり、反応時間は通常２時間以内で十分である。

前記本発明のハイブリッド形成用水不溶性担体は、前記
の直接法のほかに、サンドインチ法および競合法として
も核酸の検出方法に利用することができる。

サンドインチ法によると、まず、検体試料から検出すべ
き核酸が有する塩基配列の中から、異なりかつ重複しな
い２つの特定塩基配列を選択す、る。

それぞれの特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する２
種類の核酸のうち、一方を粒子に結合してハイブリッド
形成用水不溶性担体とし、他方を適当な標識でラベルし
て標識核酸プローブとする。

これらの担体および標識核酸プローブを、検体試料中の
核酸とのハイブリッド形成に供すると、検体試料中に検
出すべき特定の塩基配列を含む核酸が存在すれば、担体
の核酸と標識核酸プローブとが検体試料中の該核酸を挟
む形でハイブリッド形成により結合する。次に、担体に
対して結合した標識核酸プローブをトレーサーとして検
出することにより、特定の塩基配列を含む核酸を検出す
ることができる。

競合法によると、まず、検体試料中の検出すべき核酸の
特定塩基配列に相補的な塩基配列を含む少なくとも部分
的に一本鎖である核酸を粒子に結合してハイブリッド形
成用水不溶性担体とする。

一方、検体試料中の検出すべき核酸と実質的に同等な特
定塩基配列を含む核酸に標識を付し、プローブとする。

次にハイブリッド形成用水不溶性担体と検体試料とプロ
ーブを混合してハイブリッド形成反応に供すると、試料
中に検出すべき特定の塩基配列を有する核酸が存在すれ
ば、該核酸はハイブリッド形成用水不溶性担体に結合し
ている一本鎖部分を有する核酸とのハイブリッド形成を
プローブと競合する。試料中に検出すべき核酸が存在し
ない場合には、プローブのみが担体上の一本鎖部分を有
する核酸とハイブリッドを形成する。試料中に存在する
検出すべき核酸の量に応じて担体上の一本鎖部分を有す
る核酸とハイブリッドを形成するプローブの量が減少す
るのでこのプローブを検出することにより、特定の塩基
配列を含む核酸を特異的に定量することができる。

サンドインチ法と競合法では、核酸を結合した粒子に核
酸を含む検体試料と標識核酸プローブとハイブリッド形
成に適当な緩衝液とを添加し、適当な温度下に２時間程
度放置することによってハイブリッドを形成させる。次
いで遠心分離等によって過剰の標識核酸プローブを除去
し、担体に結合された標識を分析によって検出する。

上記の本発明の核酸の検出方法は、バクテリア、ウィル
ス等の病原体の検出、抗生物質や抗ウィルス剤のスクリ
ーニング、遺伝障害の診断およびガン細胞の検出に利用
することができる。

さらに、本発明は、核酸の分離方法にも関する。

すなわち、本発明は、 核酸試料中から特定の塩基配列を含む核酸を分離する方
法であって、 前記特定の塩基配列の少なくとも一部に対して相補的な
塩基配列を含む核酸を、少なくとも該相補的な塩基配列
の部分が一本鎖である状態で、有機高分子物質からなり
表面が非多孔質の粒径０．０１〜５０μｍの粒子の表面
に結合してハイブリッド形成用水不溶性担体を形成し、 次に、該担体と、前記の核酸試料中の特定の塩基配列を
含む核酸とをハイブリッド形成せしめ、次に、前記担体
とハイブリッド形成した核酸を分離することからなる核
酸の分離方法を提供するものである。

この方法において、分離しようとする核酸を前記担体と
のハイブリッドとして、担体上の核酸とハイブリッド形
成しなかった核酸その他の夾雑物から分離するには、こ
れらの不要な核酸等を遠心分離法等により除去した後、
ハイブリッドを構成している核酸分子間の水素結合を切
るような熱処理、あるいはアルカリ、ホルムアミド、尿
素、もしくは硫酸グアニジンによる処理などを行って、
目的とする特定塩基配列をもつ核酸を回収することによ
り核酸を精製することができる。

この核酸の分離方法は、例えば、細胞の粗抽出物等の試
料から、ヒト、動物、植物あるいは微生物にとって有用
なタンパク質の合成をコードするメツセンジャーＲＮＡ
　、　ＤＮＡ等の特定塩基配列を有する核酸を分離し、
あるいは精製するのに有用である。ＤＮＡのクローン化
等の核酸の分離、精製は特にＤＮＡのクローン化など遺
伝子組換えの研究分野で重要な技術であり、簡便かつ信
頼できる技術の開発が望まれているが、上記の方法はこ
の要請に応えるものである。

遺」１舛 以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説明する。但
し、本発明は、実施例に限定されるものではない。

実施例１゜ ヒ）Ｒｏｔａウィルス遺伝子第１０分節をクローン化し
て得たｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＢＲ３２２（
ｐＢＲ３２２−ＲｏｔａウィルスｃＤＮＡ）　　（Ｉｍ
ａｉ　ｅｔ　ａｌ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ
　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅ
ｎｃｅｓ、　Ｖｏｌ、８０＋３７３頁（１９８３）　）
とｆｆ！ｐで標識したヒトＲｏ　ｔａウィルス遺伝子第
１０分節のクローン化ＤＮＡ　（ヒトＲｏ　ｔａウィル
スｃＤＮＡ）からなる標識ＤＮＡプローブとのハイブリ
ッド形成 （１１−本言゛′化したｐＢＲ３２２−Ｒｏｔａウィル
スｃＤＮＡを粒径０．３７２　ｐｍ、表面荷電０．１３
４ｍｅｑ／ｇなるカルボキシ変性ラテックスイムテック
ス［Ｆ］ＧＯ３０３（日本合成ゴム■製）の１　（ｗ／
ｖ）％懸濁液（ｐ）１３．５）　１００　ｐｌと、水溶
性カルボジイミドの２．５ｑ／ｍβの水溶液（ｐＨ３，
５）　１００μｌと、９５℃で５分間加熱後水浴中で急
冷して一本鎖化したｐＢＲ３２２−Ｒｏｔａウィルスｃ
ＤＮＡの１５０μｇ／ｍ／の水溶液１　ｐ　１　（ｐＢ
Ｒ３２２−ＲｏｔａウィルスｃＤＮＡとして０．１５μ
ｇ）とを遠心分離用試験管中で混合し、室温で５分間放
置した汲水１ｍｌを添加して１０．ＯＯＯｒｐｍで５分
間遠心してラテックスの固形分を回収した。

次いで、ラテックス固形分に洗浄のために下記組成； ５ｍＭ）リス−塩酸緩衝液。

０．５（ｗ／ｖ）％、ドデシル硫酸ナトリウム。

７５ｍＭクエン酸ナトリウム。

７５０ｍＭ塩化ナトリウム５０　（ｖ／ｖ）％ホルムア
ミドのハイブリッド形成用緩衝液１００μｌを添加し、
攪拌した後すぐに水１ｍＪを添加して、１０．ＯＯＯｒ
ｐｍで５分間遠心し、ラテックス固形分を回収して１重
鎖ｐＢＲ３２２−Ｒｏ　ｔａウィルスｃＤＮ＾を結合し
た担体１■を得た。

ｐＢＲ３２２−Ｒｏｔａ　ウィルスｃＤＮへのラテック
スへの結合率を、ｐＢＲ３２２−ＲｏｔａウィルスｃＤ
Ｎへのかわりに、ニックトランスレーション法により２
２ｐ標識を付したｐＢＲ３２２−Ｒｏ　ｔａ　ウィルス
ｃＤＮＡ（”Ｐ−ｐＢＲ３２２−ＲｏｔａウィルスｃＤ
Ｎへ）を用いた以外は上記と同様に処理して求めた結果
、９２％という高い値であった。

また、”Ｐ−ｐＢＲ３２２−ＲｏｔａウィルスｃＤＮＡ
の添加量を０．１５μｇでなり１５μｇに増加させた場
合について、他は上記と同様に処理したところ、室温下
、５分間で”Ｐ−ｐＢＲ３２２−ＲｏｔａウィルスｃＤ
ＮＡの９０％以上をラテックスに結合することができた
。

（２１、−、ＤＮＡプローブの調＋１ ヒトＲｏ　ｔａウィルスｃＤＮＡ　１μｇを二ツクトラ
ンスレーション法を用いて〔α−３２Ｐ　）　ＣＴＰ（
シチジン５′−二リン酸−。５０μキュリー、比放射活
性３０００キューリー／ｍ　ｍｏｌｅ）で標識した。こ
れにより、１５℃、３０分間の反応で１６％のα−３２
Ｐ−ＣＴＰが、ヒトＲｏｔａウィルスｃＤＮＡに取り込
まれ、２．５　Ｘ　１０’ｃｐｍ　／μｇのカウントを
もつヒトＲｏ　ｔａウィルスｃＤＮＡからなる標識ＤＮ
Ａプローブを得た。

ｆｉｌで調製したＰＢＲ３２２−Ｒｏｔａ　ウィルスｃ
ＤＮＡを結合した担体に、前記ハイブリッド形成用緩衝
液１００μｌと（２）で調製した標識ＤＮＡプローブを
カウント数が１００．０００ｃｐｍ相当になる量添加し
、攪拌後、３７°Ｃで１．５時間放置しハイブリッド形
成反応を行なわせた。その後、水ｌｌｌ１ｌを添加して
ＬＯ，ＯＱＯｒｐｍで５分間遠心し、担体を回収して担
体上にハイブリッド形成によってトラップされた標識Ｄ
ＮＡプローブのカウント数を測定した。

この結果、ハイブリッド形成効率は７７％と高いもので
あった。

ここで、ハイブリッド形成効率は、ハイブリッド形成に
用いた標識ＤＮＡプローブのカウント数（１００，ＯＯ
Ｏｃｐｍ）に対する担体上にトラップされた標ｉ　ＤＮ
Ａプローブのカウント数の割合を示すものである。また
、ハイブリッド形成反応の時間を２〜１８時間に変えて
もハイブリッド形成効率に変化は認められなかった。

なお、ｐＢＲ３２２−ＲｏｔａウィルスｃＤＮＡを結合
していないラテックス、すなわちイムテックス［Ｆ］Ｇ
Ｏ３０３をｐＢＲ３２２−ＲｏｔａウィルスｃＤＮＡを
結合した担体の代りに用いた以外は上記と同様に操作し
ても、該ラテックス粒子上にトラップされた標１ｌｌ）
ＮＡプローブのカウント数は２．０００ｃｐｍにすぎな
がった。

比較例１ 実施例日１）で用いた一本鎖化したｐＢＲ３２２−Ｒｏ
ｔａウィルスｃＤＮＡの１５０　ｔｔ　ｇ／ｍｌ水溶液
１ｐｌを、常法どおりニトロセルロースメンブランフィ
ルタ−にスポットしくスポットの面稙は約０．８ｍ”）
、８０’Ｃで３時間真空下で加熱後、プラスチックバッ
グに入れてプレハイブリダイゼーション（１０（ｗ／ν
）％の細断化した仔ウシ胸腺ＤＮＡを添加したハイブリ
ッド形成用緩衝液中で３７℃、１時間のインキュベーシ
ョン）を行い、溶液を除去した。

次いで、プラスチックバッグに実施例１（３）で用いた
ハイブリッド形成用緩衝液１００．ｃｒｙと標識ＤＮへ
プローブをカウント数が１００　、０００ｃｐｍ相当に
なる量添加し、３７℃で１８時間インキュベーションし
た後、バッグから取り出したフィルターを２倍濃度ＳＳ
Ｃ溶液中５５℃で２時間洗浄した。フィルターに残った
標識ＤＮＡプローブのカウントを測定して実施例１（３
）と同様にして求めたハイブリッド形成効率は６％にす
ぎなかった。

実施例２ ヒ）Ｒｏｔａウィルスの第１０遺伝子分節に対応するメ
ツセンジャーＲＮＡの分離および精製粒径０．３７２μ
ｍ、表面荷電０．１３４ｍｅｑ／ｇであるカルボキシ変
性ラテックス、イムテックス［Ｆ］ＧＯ３０３（日本合
成ゴム側製）の１　（ｗ／ｖ）％懸濁液（ｐＨ３，５）
２００μｌと、水溶性カルボジイミドの２．５■／１Ｉ
１１の水溶１（ｐＨ３，５）２００μｌと、９５℃で５
分間加熱後急冷して一本鎖化したｐＢＲ３２２−Ｒｏｔ
ａウィルスｃＤＮＡの２■／ｍｌの水溶液５μｌとを、
遠心分離用試験管中で混合し、室温で５分間放置した後
、水１ｍｌを添加して１０．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心
してラテックスの固形分を回収した。次いでラテックス
固形分に洗浄のために実施例１と同様のハイブリッド形
成用緩衝液２００μｌを添加し、攪拌した後すぐに水１
　ｍ　ｌを添加して１０．　ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心
・しラテックスの固形分を回収して一本鎖のｐＢＲ３２
２−Ｒｏ　ｔａウィルスｃＤＮＡを結合した担体２■を
得た。

（２）　　標シしたヒトＲｏ　ｔａウィルスのメツセン
ジャーＲＮＡの調製 ヒトＲｏｔａウィルスを感染したアフリカミドリザル腎
臓細胞からウィルスを精製し、このＲｏ　ｔａウィルス
をＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸）で処理して得
たコア（ｃｏｒｅ）粒子を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ρｌｌ８）中で、１０ｍＭとなる量の塩化マグネシウ
ム、２ｍＭとなる量のアデノシン５′−三リン酸、２ｍ
Ｍとなる量のシチジン５′−三リン酸、２ｍＭとなる量
のグアノシン５′−三リン酸、０．２ｍＭとなる量のウ
リジン５′−三リン酸、５０μキユーリーとなる量の〔
α−”Ｐ　）　ＵＴＰウリジン５′−三リン酸、および
１７５ｕｎｉｔのＲＮ　ａｓｉｎ■（プロメガバイオチ
ック社製造、　ＲＮＡの分解酵素の阻害剤）とともに、
３７℃で４時間インキュベーションし、遠心分離の後上
清を回収した。この上清をフェノールで抽出し、セファ
デックス■Ｇ−１００（ファルマシア社製）のカラムに
通して、素通り分画を回収した。この画分には、ヒ）Ｒ
ｏｔａウィルスの第１遺伝子分節から第１１遺伝子分節
に対応する１１種類のメソセンジャーＲＮＡが含まれて
いる。

得られた回収液は、１μ！当り３０ｎｇのメッセンジ＋
−ＲＮＡを含み、５０．ＯＯＯｃｐｍのカウントをもっ
ていた。

（１）で調製したｐＢＲ３２２−Ｒｏ　ｔａウィルスｃ
ＤＮＡを結合した担体に、実施例１と同様のハイブリッ
ド形成用緩衝液２００μｌと、（２）で調製した標識し
たメツセンジャーＲＮ＾２０μｌとを混合し、３７°Ｃ
でインキュベーションし、ハイブリッドを形成せしめた
。

インキュベーション開始後、０分３３０分、６０分。

９０分、１２０分および１８０分の時点で２５μβずつ
抜きとり、２倍濃度ＳＳＣ溶液３００μβを添加して１
０、　ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心した。

遠心分離した後、上清を回収し、メツセンジャー　ＲＮ
Ａをエタノール中で沈殿させたくこのサンプルを、以下
「サンプル（Ｕ）」と呼ぶ：Ｕはｕｎｂｏｕｎｄ　（結
合していないことを示す英語）に由来する）。

また、前記遠心分離で回収した担体に、９０（ｖ／ｖ）
％ホルムアミド、１０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液、１ｍ
ＭＥＤＴＡおよび０．１（Ｗ／Ｖ）％ドデシル硫酸ナト
リウムからなる水溶液５０μｌを添加し、攪拌後室温で
５分間放置してから２倍濃度ＳＳＣ溶液２５０μ！を添
加した。これを１０．　ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心し、
上清中に溶離したメソセンジャーＲＮＡをエタノール中
で沈殿させたくこのサンプルを、以下、「サンプル（Ｂ
）」と呼ぶ二Ｂはｂｏｕｎｄ　（結合していることを示
す英語）に由来する）。

次いで、インキュベーション時間の異なる６種のサンプ
ル（Ｕ）と６種のサンプル（Ｂ）のそれぞれを５μｌの
積載用（ローディング）緩衝液（９５（ｖ／ｖ）％ホル
ムアミド、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．Ｈｗ／ｖ）％
キシレンシアツールおよび０．Ｈｗ／ｖ）％ブロモフェ
ノールブルーを含有）に溶解し、９０℃で２分加熱した
後水冷して７Ｍの尿素を含有する８　（ｗ／ｖ）％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲるの厚み０．
：ｈｎで１．０００　Ｖで２０時間泳動した後、Ｘ線フ
ィルムに感光させて泳動パターンの写真を得た。これら
の写真を参考図として本明細書に添付する。参考図の右
端に示す番号は、該当バンドの遺伝子分節番号である。

得られた泳動パターンの比較により、インキュベーショ
ン時間１２０分および１８０分のサンプル（Ｕ）からヒ
）Ｒｏｔａウィルス第１０遺伝子分節に対応するメツセ
ンジャーＲＮＡのバンドがハイブリッド形成により消失
していることを確認した。

また、インキュベーション時間が３０分以上のサンプル
（Ｂ）には、ヒトＲｏ　ｔａウィルス第１０遺伝子分節
に対応するメツセンジャーＲＮＡのバンドのみが観察さ
れ、ヒ）Ｒｏｔａウィルス第１０遺伝子分節に対応する
メツセンジャーＲＮＡが高純度で分離、精製されること
を確認した。

また、最終的に担体上に残留したカウント（これをカウ
ント（Ｌ）と呼ぶ）と、サンプル（Ｂ）のカウント（こ
れをカウント（Ｂ）と呼ぶ）から、の計算式により回収
率を求めたところ、回収率は、インキュベーション時間
３０分、　６０分、９０分、１２０分および１８０分の
すべてのサンプルについて８５％以上という高い値を示
した。

〔発明の効果〕

本発明の担体は核酸の特定の塩基配列を検出するに際し
て、ハイブリッド形成を短時間で筒便な操作で実施する
ことを可能とし、しかもハイブリッド形成効率を飛躍的
に高いものとすることができる。

また、ハイブリッド形成分析においては、検出の際の非
特異吸着が少な４、感度や精度を向上させることを可能
とするものである。

本発明の担体は、上記効果を有するものであることから
、ヰ★体中の微量の核酸のネ食出以外にも、試料中に大
量に存在する核酸の分離、精製等に好適に用いることが
できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有機高分子物質からなり表面が非多孔質の粒径０．
   ０１〜５０μｍの粒子の表面に、少なくとも部分的に一
   本鎖である核酸を結合してなるハイブリッド形成用水不
   溶性担体。 ２、検体試料中の特定の塩基配列を含む核酸の検出方法
   であって、 前記核酸を、少なくとも前記の特定の塩基配列の部分が
   一本鎖である状態で、有機高分子物質からなり表面が非
   多孔質の粒径０．０１〜５０μｍの粒子の表面に結合し
   てハイブリッド形成用水不溶性担体を形成し、 次に、該担体と、前記の特定の塩基配列の少なくとも一
   部に対して相補的な塩基配列を含む標識核酸プローブと
   をハイブリッド形成せしめ、次に、前記担体とハイブリ
   ッド形成した標識核酸プローブを検出することからなる
   核酸の検出方法。 ３、核酸試料中から特定の塩基配列を含む核酸を分離す
   る方法であって、 前記特定の塩基配列の少なくとも一部に対して相補的な
   塩基配列を含む核酸を、少なくとも該相補的な塩基配列
   の部分が一本鎖である状態で、有機高分子物質からなり
   表面が非多孔質の粒径０．０１〜５０μｍの粒子の表面
   に結合してハイブリッド形成用水不溶性担体を形成し、 次に、該担体と、前記の核酸試料中の特定の塩基配列を
   含む核酸とをハイブリッド形成せしめ、次に、前記担体
   とハイブリッド形成した核酸を分離することからなる核
   酸の分離方法。