JPH07502653A

JPH07502653A - 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｈｂｖ増幅プローブ

Info

Publication number: JPH07502653A
Application number: JP5511870A
Authority: JP
Inventors: アービン，ブルース　ディー．; コルバーグ，ジャニス　エイ．; ラニング，ジョイス　エイ．; アーデア，マイケル　エス．
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1991-12-23
Filing date: 1992-12-22
Publication date: 1995-03-23
Also published as: US5736316A; WO1993013120A1; EP0618924A4; ATE199158T1; EP0618924B1; DE69231693D1; TW293845B; DE69231693T2; CA2124928C; EP0618924A1; CA2124928A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】゛　サンドイッチハイブリダイゼーションアノ（エニいるためのＨＢＶ　プローブ皮推分厨本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの分野に属する。より詳細には、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を検出するための新規な核酸プローブに関する。

腎聚技歪ウィルス性肝炎は、はとんどの場合、血清または潜伏期間の長い肝炎が主な原因であるＨＢＶによる、主として肝臓を包含する全身系の疾患である。

）ＩＢＶの抗原の特徴は、ウィルスの表面上に見い出される複合タンパク貫に由来する。示された１つの抗原特異性（よ、全てのＩＩＢＹ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に共通であり、互％ｚに排他的な決定基の異なる２つのセットは、ＨＢｓＡｇの４つの主な亜型（ａｄｗ、　ａｙｗ、　ａｄｒ、およびａｙｒ）を生じる。

Ｐａ５ｅｋら　（Ｎａｔｕｒｅ、２８２：　５７５〜５７９．１９７９）　は、亜型ａｙｖ　ＨＢ■ゲノムＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を開示しｔこ。

Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｆｉｅｌｄら＠、Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓＳＮＹ、　１９８＋）は、亜型ａｄｗ２　ＨＢＶ　ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を報告した。

ＥＰＡ公開第００６８７１９号には、ａｄｖセロタイプからのｌ（ＢｓＡｇの配列および発現が開示されていた。

Ｆｕｊ　ｉｙａｍａら　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１１：　４６０１〜４６１０．　１９８３）は、セロタイプａｄｒ　ＨＢＶ　ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を開示した。

英国特許出願第２０３４３２３Ａ号、１９８０年６月４日公開には、血清中のＨＢＶを検出するためのＨＢＶゲノムの単離およびクローン化ならびにその使用が記載されている。

Ｂｅｒｎｉｎｇｅｒら　（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、９：５７〜６８．１９１１２）　は、プローブとして完全なＨＢＶゲノムを用いて血清中でＨＢＶを検出および定量する核酸ハイブリダイゼーションに基づくアッセイを開示している。

米国特許第４，５６２．１５９号では、プローブとしてクローン化したゲノムＨＢＶ　ＤＮＡを用いてＤＮＡハイブリダイゼーションにょるＨＢＶ検出のための方法、および試験キットについて開示されている。

同一人に譲渡された米国特許第４．８６８．１０５号には、溶液相核酸サントイ、チハイブリダイゼーションアノセイが開示されている。このアッセイでは、分析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブのセットとハイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセットとハイブリダイズされる。次いで、ブローブー分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに実質的に相補的である固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブにハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定住複合体の形態で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。最終的に、標識化プローブのセットの一末鎖セグメントは標識プローブにハイブリダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じたシグナルによって検出され得る。

同一人に譲渡された欧州特許出願（ＥＰＡ）第８８３０９６９７６号には、米国特許第４．８６８．１０５号に記載のアッセイの変形が開示されており、ここでは、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌクレオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結合した核酸（分枝または直鎖状）に特異的にハイブリダイズするセグメント、ならびに標識プローブに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。マルチマーを用いるアッセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリダイズさせ、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントとハイブリダイズする固定化核酸を含む池の容器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にノ・イブリダイズされ、さらに標識プローブはマルチマーの第二のセグメントの反復にハイブリダイズされる。マルチマーは、１ｍプローブが付着する多数の部位を提供するので、シグナルが増幅される。増幅および捕獲プローブ配列は、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ、ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのペニシリンおよびテトラサイクリン耐性、およびｑｂジηｉａ　ｔｒ＋□Ｉｍａｔｉｓについて開示されている。

１９９０年７月２７日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願筒５５８．８９７号には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチマーよりも強くシグナルを増強する。

良匪旦皿示本発明の１つの局面は、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントおよびオリゴヌクレオチドマルチマーに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＢｖに対するサンドイッチハイブリダイゼ−７ヨンアノセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントおよび固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＢＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、試料中のＨＢＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、このアッセイは以下の工程を包含する：（ａ）　該試料を、過剰の（ｉ）ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的：こ相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、増幅プローブオリゴヌクレオチド、および、（ｉｉ）ＩＩＢＹ核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチド名ご実質的に相補的である第二セグメントを含む、増幅プローブ第１ノゴヌクレオチドと、ノ）イブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｂ）　工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該第１ノゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）　その後、固相に結合していなしＸ物質を分離する工程；（ｄ）　工程（Ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ノ＼イプリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチド（こ実質的（こヰ目補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程（ｅ）　非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）　工程（ｅ）の固相複合体生成物を、該標識第１ノゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）　非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｈ）　工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。

本発明の別の局面は、試料中のＨＢＶの検出のためのキットを含むＨＢＶの検出のためのキットであって、このキットは以下の組合せを含む：メントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントとを含む、セット；（ｉｉ＞　捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、）ＩＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セット：（ｉｉｉ）　核酸マルチマーであって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、マルチマー；および（ｉｖ）　標識オリゴヌクレオチド。

これらおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮して通常の技術で容易に生じ得る。

日を、るため」Ｊ定員本発明を明確にするにあたり、次の用語が用いられ、そして以下に示したように定義することとする。

「溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ」とは、同一人に譲渡された米国特許第４．８６８．１０５号、およびＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載およびクレームされているアッセイ法を意味する。

「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、付加的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味する。好ましくは、改変ヌクレオチドは、そのＮ′位が機能的ヒドロキシ基を提供するように改変されている５゜−／チジンである。

「増幅マルチマー」とは、分析される核酸と、多数のポリヌクレオチド反復（すなわち、他のマルチマーの反復または標識プローブの反復のいずれか）とに、同時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマーの分枝は共有結合によりつくられ、マルチマーは、２つの型のオリゴヌクレオチド単位から構成されている。これらのオリゴヌクレオチド単位は、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズする核酸に、および多数の標識プローブにハイブリダイズし得る。このようなマルチマーの組成物および油製は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号、および１９９０年７月２７日に出願された米国特許出願第５５８．８９７号に記載されており、その開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。

用語「増幅プローブ」は、分析される核酸に特異的にハイブリダイズするセグメントと、増幅マルチマーに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復とを有するように構築された、分枝または直鎖状のポリヌクレオチドとして意図される。

用語「捕獲プローブ」は、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に実質的に相補的なセグメントと、固相固定化プローブのヌクレオチド配列に実質的に相補的であるセグメントとを有するオリゴヌクレオチドとして意図される。

本明細書中で本発明のコーム型分枝ポリヌクレオチドを記載するのに用いられる［大きな（Ｌａｒｇｅ）Ｊとは、少なくとも約１５個の分枝部位と、標識プローブ結合配列の少なくとも約２０個の反復とを有する分子を意味する。

本明細書中で本発明の分枝ポリヌクレオチドの構造を記載するのに用いられる「コーム型」とは、バックボーンがら伸長している多数の側鎖を有する直鎖状のバックボーンを有するポリヌクレオチドを意味する。

「切断可能なリンカ−分子」とは、ポリヌクレオチド鎖に安定して取り込まれ得て、化学的処理または物理的処理（例えば、放射線照射）により破壊または切断され得る共有結合を含む分子を意味する。

本明細書中に開示された全ての核酸配列は、他に指示がない限り、５°から３° への方向に記載されている。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名によって推奨されたヌクレオチド記号に従って示す。

゛　バイブ２ダイゼーシヨンア・セイ溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションの一般的なプロトコルを以下に示す。分析される核酸を、過剰量の以下に示す２つの一末鎖核酸ブローブセットを入れたマイクロタイターウェル中に入れる：（１）捕獲プローブのセット、それぞれ、分析物に実質的に相補的な第一結合配列、および、固体支持体く例えばウェル表面またはビーズ）に結合した核酸に実質的に相補的である第二結合配列を有する、および（２）増幅プローブ（分枝または直鎖状）のセット、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有する。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物にハイブリダイズした２つのプローブからなる３成分の核酸複合体である。プローブの第二結合配列は、分析物と相補的ではないので、一本鎖セグメントのままで残っている。この複合体は、固体表面上の固定化プローブに、捕獲プローブの第二結合配列によって・・イブリダイズする。得られた生成物は、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形成された二重鎖によって、固体表面に結合した複合体を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面から除去する。

次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーシぢン条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列にハイブリダイズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーからも分離する。次いで、標識オリゴヌクレオチドを、マルチマーの実質的に相補的なオリゴヌクレオチド単位にハイブリダイズさせるような条件下で加える。次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取る。

分析される核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体）由来であり得、種々の手段（例えば、ブロティナーゼに／　ＳＤＳ、カオトロピック塩など）によりハイブリダイゼーション分析のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または化学的手段（例えば、ル１限酵素、音波処理、化学分解（例えば、金属イオン）など）によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フラグメントは、Ｏ，ｌｋｂ程に小さくあり得、通常少なくとも約０．５ｋｂであり、そしてｌｋｂまたはそれ以上であり得る。分析される配列は、分析のため一本鎖形態で提供される。配列が天然に一本鎖形態で存在する場合、変性は必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、配列を変性すべきである。変性は種々の技法（例えば、アルカリ、一般的には約０１０５〜Ｏ，ＺＭの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、酵素、またはそれらの組合せ）により行われ得る。

分析される配列に実質的に相補的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも１５ヌクレオチド、通常少なくとも２５ヌクレオチド、そして約５ｋｂ以下、通常約１．ｋｂ以下、好ましくは約１００ヌクレオチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約３０ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。

第一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コンセンサス配列、冬型性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連し得る。

用いられる種々の増幅プローブおよび捕獲プローブの数は、アッセイの感度に影響する。なぜなら、これは用（為られるプローブ配列が多いほど、アッセイ系で提供されるシグナルカｆ強くなるからである。さらに、プローブ配列を多く用（ＡるＩｔど、よりストリンジェントな〕＼イブリダイゼーション条件力（用いられるようになり、それによって偽陽性結果の発生率力（減少する。従って、セット中のプローブ数は、少なくとも１つの捕獲プローブおよび少なくとも１つの増幅プローブ、より好ましくは２つの捕獲プローブおよび２つの増幅プローブ、そして最も好ましくは５〜１００個の捕獲プローブ′および５〜１００個の増幅プローブである。

ＨＢＶのためのプローブは、次のように設計された。ＥＰＡ第８８３０９６７６号には、ＧｅｎＢａｎｋで報告された９つの）ＩＢＶ亜型のＤＮＡ配列を比較することにより設計されたーセットのＨＢＶプローブが開示されている。その後の実験的分析では、これらのプローブがＨＢＶの不完全な二本鎖領域のサブゲノムの鎖（すなわち、プラスセンス）と相補的であり、従ってサブゲノム鎖の長さが、株の間で変化するために、異なるウィルスにハイブリダイズしたこれらのプローブの異なるサブセットであることを説明した。従って、プローブのセクトは再設計され、ＨＢＶのゲノム−長の鎖（すなわち、マイナスセンス）に実質的に相補的な配列を含み、そしてプローブのセットの中でより多くのオリゴヌクレオチドを含有するように、より少ないスペーサー領域を含有しており、そのため、アッセイ系の感度が増加した。

一般に、ＨＢＶ単離株の間の最も大きい相同領域は、より小さい相同領域が増幅プローブとして選択される間、捕獲プローブとして選択された。従って、ＨＢＶの追加の株または単離株が利用可能に製造されるとき、適当なプローブは、本発明のプローブを設計するのに用いられたヌクレオチド配列を有する新規の株または単離株の配列を並べること、および増幅プローブとして選択されたより小さい相同領域と、捕獲プローブとして用いる最も大きい相同領域とを選択することにより設計された。現在好ましいプローブの七ノド、およびそれらの捕獲または増幅の突出領域（ｏｖｅｒｈａｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）、すなわち、固形支持体上または増幅マルチマーに固定化した配列にＢイブリダイズする領域、を実施例に記載する。

捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、実質的に相補的であるように、そして試料／分析物の内在性配列に遭遇することのないように選択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。

捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングにより調製され得るが、前者ｈ＜好ましい。

結合配列は、完全に相補的であってホモ二本鎖を提供する必要はない。多くの瑞合では、５個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約１０％未満の塩基力ｆスマ・ノチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中で用いられる用語「相補的」とは、結合領域内の各塩基力（正確に対応するような正確な相補性を意味し、「実質的に相補的」とは、９０％またはそれ以上の相同性を有することを意味する。

標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的な配列を含む。標３１第１ノゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の分子（ｒｔＬＨｔＪ’）を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供する。標識は、実質的に相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端メンバ←または末端テイルとして存在し得る。オリゴヌクレオチド配列に結合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告されている。例えば、Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　（１９８３）　８０：４０４５；　ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚ、ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）　ｕ：３４３ｓ；　ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＧｕｍｐｏｒｔｓ　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ’ｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９８３）　１１：６１６７：　Ｓ＋ａｔｔｈら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、ｅｓ、（１９８５）　ｌｉ：２３９９；　ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、　ｎａ　Ｂ　ａｃｈｅｓ、（１９８４）　ｌｊｉ：２６７を参照のこと。標識は、実質的に相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニ、２ト、金属イオンなどが包含される。例示の特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ）、フイコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、ＮＡＤＰＨ，α−β−ガラクトンダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが包含される。

分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少なくとも約１．５＝１であり、より好ましくは少なくとも２：　ｌである。通例、２：１から１０６：１の範囲内である。各プローブの濃度は、−般的に約１０−５〜１０−’Ｍの範囲であり、試料の核酸濃度は、１０−２１〜１０−”Ｍまでの種々の範囲をとる。アッセイのノ＼イブリダイゼーンヲン工程は、一般的に約１０分から２０時間までを要し、多くは約１時間で完了する。ハイブリダイゼーションは、やや高めのａ度で、一般的には約２０℃から８０℃の範囲で、より通常には約３５℃から７０℃までで、特に６５℃で行われ得る。

ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加剤を含有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデタージエント（０，０１〜１％）、塩類（例えば、クエン酸ナトリウム（０，０１７〜ｏ、ｔ７Ｍ＞）、フィコール、ポリビニルピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含される。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドである。これらの池の溶媒は、一般的に２〜５０％の範囲内の量で存在する。

ハイブリダイゼーション媒体のストリジエンシーは、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ストリジエンシーを変化させる。

標識の存在を検出するためには、Ｉ識の性質に依存して、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に対しては、ルミノメータ−またはフィルムが有用である。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミ／メーター、分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、本アッセイに用いられ得る。

本発明に記載の増幅された核酸ハイブリダイゼーションアッセイを行うためのキットは、次の試薬の−まとめの組合せを含む：増幅プローブまたはプローブのセット；捕獲プローブまたはプローブのセット；増幅マルチマー；および適当な標識オリゴヌクレオチド。これらの試薬は、典型的にキット内の分離容器中にある。そのキットはまた、分析物を変性するための変性試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄溶液、酵素基質、陰性および陽性のコントロール、およびアッセイを行うための記述された指示書を含み得る。

以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。

１搭■ 支立拠ユコームリ　ポリヌクレオチドの４本実施例は、１５個の分枝部位と、３つの標識プローブ結合部位を有する側鎖伸長とを有する、コーム型分枝ポリヌクレオチドの合成を例示する。このポリヌクレオチドは、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載の溶液相ハイブリダイゼーションに用いられるように設計した。

オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｎ＋ｓ、Ｉｎｃ、、（ＡＢＩ）モデル３８０Ｂ）で行った。

βンアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用Ｉ、また。これ（こは、Ｐｈｏｓｔｅｌ”試薬（ＡＢＮ）を用いる５°リン酸化が包含される。

示したこと以外は、標準的なＡＢ＋プロトコルを用（また。複数のサイクルを用いた（例えば、１２サイクル）と示されている場合、Ａ旧により推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられた。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０ＢＤＮＡ合成機で行われる、サイクル１．２および６．４を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。

以下の構造のコーム体を最初に調製した：３　’　Ｔ、８（Ｔｒ’Ｘ’　］　、５ＧＴＴＴＧＴＧＧ−５’Ｉ　ＲＧＴＣＡＧＴｐ　−５’　）　１５ここで、Ｘ゛は分枝モノマーであり、そしてＲζよ過ヨウ素酸切断可能リンカ−である。

１５個の（ＴＴＸ’）繰り返しによるコーム体の部分を、３３．８ｎ＋ｇのアミノプロピル誘導体化チミジンの調整孔ガラス（ＣＰＧ）　（２０００ス、支持体１グラム当り７．４マイクロモルチミジン）を用０て１２サイクルプロトコルで最初に合成する。分枝部位ヌクレオチドは、下式であった：コーム体（側鎖を含まない）の合成に関して、βシア／エチルホスホルアミダイトモノマーの濃度は、Ａ、　Ｃ，Ｇ、およびＴがＯ，ＩＭ、分枝部位モノマーＥが０．１５Ｍ、およびＰｈｏｓｔｅｌＴ″試薬が０．２Ｍであった。脱トリチル化は、脱保護期間中に階段フロースルー（ｓｔｅｐｐｅｄ　ｆｌｏｖｔｈｒｏｕ５ｈ）を用いて、塩化メチレン中の３％トリクロロ酢酸で行った。最終的に、５ ’ＤＭＴをアセチル基で置換した。

切断可能リンカ−Ｒおよび式３−ＲＧＴＣＡＧＴｐ　（配列番号　ｌ）の６塩基の側鎖伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位で合成した。塩基保護基（上式のＲ２）の除去は、コーム体の合成に用いたのと同じカラム中にＣＰＧ支持体を保持している間に、手動的に行った。Ｒ２がレブリニルである場合、０．５Ｍヒドラジン水和物のピリジン／氷酢酸（１：１　ｖ／ｖ）溶液を加え、１５分ごとに液体を取り替えながら９０分間ＣＰＧ支持体と接触させておき、続いてピリジン、／氷酢酸（１：１　ｖ／ｖ）で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄した。脱保護を行った後、切断可能リンカ−Ｒおよび６塩基側鎖伸長を、６．４サイクルを用いて加えた。

これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度は、０゜１Ｍであった（０．２ＭのＲおよびＰｈｏｓｔｅｌ”″試薬を除く；Ｒは、２−（４−（４−（２− ジメトキントリチルオキシ）エチル−）フェノキシ２゜３−ジ（ベンゾイルオキシ）−ブチルオキシ）フェニル）エチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトであった）。

脱トリチル化は、３％トリクロロ酢酸の塩化メチレン溶液で連続フロースルーを用いて行い、次いでトルエン／クロロメタン（１：１　ｖ／ｖ）の溶液でリンスする。分枝ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクルｒｃＥＮＨ３Ｊを用いて３８０Ｂで自動的に除去した。水酸化アンモニウム溶液を４ｍｌのスクリューキャップＷｈｅａｔｏｎバイアルに集め、６０℃で１２時間加熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒を５ｐｅｅｄ−Ｖａｃエバポレーターで除去し、残渣を１００μｌの水に溶解した。

以下の構造の３°バツクボーン伸長（セグメントＡ）、側鎖伸長、および連結反応テンプレート／リンカ−もまた、自動合成機を用いて作成した。

（以下余白）４ｆｉ攪−，１ξ３　’　−ＧＡＴＧＣＧ　（πα渾−藻工謔）３−５’　（藍 ■も、３）粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法（７％、７Ｍ尿素および１ｘ丁ＢＥランニング緩衝液を含む）により精製した。

３°バ、クボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した。コーム体（４ｐ＋ｍｏｌ／μｌ）、３°バツクボーン伸長（６，２５ｐｍｏｌ／　ｕ　ｌ）、側鎖伸長（９３，７５ｐｍｏ＋／　１１１）、側鎖連結テンプレート（７５ｐ＋ｇｏｌ／μｌ）およびバックボーン連結テンプレート（５ｐｍｏｌ／　μｌ）を、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ／　５　ｍＭ　ＤＴＴ／　５０＋ｎＭ）リスＨＣＩ、　ｐＨ８，０／　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２／　２　ｍＭススペルミジン中、０．５単位／μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと合わせた。この混合物を３７°Ｃで２時間インキユイートシ、次いで水浴中で９５℃に加熱し、次いで１時間かけて３５℃未満までゆっくりと冷却した。２＋ｎＭ　ＡＴＰ、１０１Ｍ　ＤＴＴ、　１４％ポリエチレングリコール、および０．２１単位／μｌ　Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３゛°Ｃで１６〜２４時間インキュベートした。ＤＮＡをＨａｃｌ／エタノール中で沈澱させ、水中に再懸濁し、そして以下のような２回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、１ｍＭ　ＡＴＰ、　５ｍＭ　ＤＴＴ、１４％ポリエチレングリフール、５０ｍＭ　）リス）ＩｃＬ　ｐｌ＋７．３．１０ｍＭＭｇＣ１２，２１スペルミジン、０．５単位／μＩＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、および０．２１単位／μＩ　Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。次いで、淳結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。

連結反応および精製を行った後、生成物の一部を３２ｐで標識し、Ｒ部位での切断を行い、これは、水性Ｎａ　Ｉｏｎで１時間酸化することにより達成された。

次いで、試料をＰＡＧＥにより分析して、取り込まれた側鎖伸長数を、ゲル上のバンドの放射性標識を定量することにより測定した。生成物は、全部で４５個の標識プローブ結合部位を有していることが分かった。

支立亘１ＨＢＶ　ＤＮＡのハイブリ　イゼーンヨンアノセイ「１５ｘ３」増幅溶液相核酸サンドイノチノ・イブリダイゼーションアノセイ形式を、本実施例で用いた。ｒ１５Ｘ３Ｊの呼称は、この形式が２つのマルチマーを用いることに由来する＝（１）増幅プローブは、）ＩＢＶ核酸に結合する第一セグメント（Ａ）と、（２）増幅マルチマーにｌ＼イブリダイズする第二セグメント（Ｂ）とを有し、（２）増幅マルチマーは、セグメント（Ｂ）にＩ・イブリダイズする第一セグメン）（Ｂ杓と、セグメント（Ｃ）の１５個の反復とを有し、ここでセグメントＣは、３つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。

本ア、セイで用いた増幅プローブおよび捕獲プローブのセグメント、およびそれらの個々の名称は以下の通りであった。

■！エニエｙｖ、１ｏ＜会　＜　Ｍｌ’も　：６）ＨＢＶ、８７會　（信ｋＡ−４ｒ−８，＝９）ＧＣＹＴＡＹＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣｒＡＴＣＹＴ入ＨＢＶ、４Ｓ會　（め（？ｌｌ場−ら　：１０）ｙｖ、９９會　ｔ　＊ｒｒＡＡ　＝１２）ＴＣＣＴＧＧＹＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＩ（Ｂｖ、７ｓ會　＜　＠ｌｌ’１番％：１３＞ＧＧＣＧＣＴＧＭＴＣＣＹＧＣＧＧＡＣにＡＣＣＣＢＴＣＴＣＧｈＢｖ、ａ１會　ｔ、１ｌｌｊ己ナハ！Ｓ　＝１４＞ＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＨＧＣＡ２Ｉ（Ｂｖ、７３＊ｏｔｏｓｃ＋ｏ−ｃ　ｔ　Ｋ’９’晶”７　：１５）ＭＣＣＴｃｒＧＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＴｅＴＷＣＡＴＧＴＣＨＩ］ｖ−７９会　（Ｂしｆｉ’ａ”Ｊ３　：１８１ＣＧＡＣＣＡＣＧＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴｒＴＡＣＧＣＧＧＩ（Ｂｖ、Ｃ２會　［ｉ１＋で９’１ｍ’ｖ　：１９１ＴＧＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴｒ’ＡＣＡＹＡＡＧＡＧＧＡＣＴＣＴＴＧＨＢｖ、７１會　（％ｌｆ１＊８　＝２０１ＣＧＴＣＡＡＴＣｒＹＣＫＣＧＡＧＧＡＣｒＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＨＢｖ、１ｏ２會　（＠？ｌ＃％　：２１＞ＡＴＧＴｒＧＣＣＣＧＴｒＴＧＴＣＣＴＣＴＡＫｒＴＣＣＡＧＧＡＨＢｖ、１ｏ１會　（４にΔすｉも　：２２）ＡＴＣＴＴＣＴｒＲＴｒＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＹＴＡＹＣＡＡｌ（ＢＶ、１ＯＯ１１＜　憔に〃Ｑ％”）　：：ＤＩＡＴＣＡＴＭｎ’ＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＣｘｖ、９ｓ會　（＃１’Ｉ會％　：２４）ＣＡＡＴＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣｒＣｎ’ＧＴＣＣｒＣＣＡＡＹＦロヨｖ、９７會　（ａり己２−１１シも　：２５ンＧＴＧＴＣＹＴＧＧＣＣＡＡＡＡＴｒＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡＣ）（ＢＶ、９６会　（ＭＦ）４％　：２６１ＣｒＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＨＢＶ、９Ｓ會　（配列番号　：２７）ＧＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣｒＣＡＣＡＡＴＡＣＣＲＣＡＧＡＧＴＣｒＨＢｖ、９２舎　＋　！！ｎＪ’）ｉら　：２８）ＴＴＴＩ工；ＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＫＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＲｌ（ＥＶ、９１・（部す肩も２２９）ＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＫＣｒＡＣＡＧＣＨＥＶ、８８會　（世に沿１ｎ　：３０１ＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡＲＡＣｒＡＣＴ’ＧＴｒＧＴＴＡＧＡＣＧＡ！（ＢＶ、８６＊　（＃＋４’ｖ　：３１１ＧＴＶＴＣＴＴｒＹＧＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣｒ１（ＢＶ、Ｄ４７会　（１ｌｉｉ１１［：３２１τＴＧＧＡＧＣＷＷＣＴ’ＧＴＧＧＡＧＴｒＡＣＴＣＴＣＫＴＴｒＴ１（ＢＶ−Ｄ４６會、＋［ケ）番Ｓ　：３３１７０ヮズ℃ＣｘＴＧＧＡＣＡＴＹＧＡＹＣＣＫＴＡＴＡＡＡＧＨＢｖ、Ｃ５會（断ｊ’ｌ帯ろ：３４）ＡＡＷＧＲＴＣＴＴｒＧＴＡＹＴＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＡＧＧＣＡＨＢｙ、８４”　（Ｆｊｌ己ケ１１命ろ：３５）ＲＧＡσ℃α連Ω■ＣＹ７に０χ℃Ｎ℃超八貫超ＫＢＶ、８３會　（＃□”ｖ　：３６）ＣＣｒＴＧＡＧＧＯｆｒＡＣＴｒＣＡＡＡＧＡＣＴＧＴＫＴＧＴｒＲＢｖ、ａｏ会　＜　１ｕｌｌ；ら　：３刀ＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＣＧＧＷＣＣＧＴＧＴＨＢｖ−７ｓ會　ｔ　ｉＫＪ乙り１８％　：３Ｂ）ＡＧＣＭＧＣＴｒＧＴＴ了ｆ’ＧＣＴＣＧＣＡＧＳＫＥＧ３ＨＥＶ、７４豐　（［Ｆ］し列番ろ　：３９）ＧＧＣ’ｒＣ５ＴＣＴＧＣＣＧＡＴαスＴＡＣ］℃αｘｙｃｒＨＢｖ、７２會　ｔ　Ｋテμｂら　：４ｏ）ＭＴＸＡＡＣＣＴＴｒＡＣＣＣαＺＣテα℃ａ漬α℃ＨＢｖ、Ｃ１會　＜　＠ｌｌ’ｋ”）　：４１）ＫＡＡＲＣＡＧＧＣｒＴＴＹＡＣＩＴＴＣＴＣＧＣＣＡＡＣＴＴＡＨＢｖ、７ｏ会　０６２Ｂ９０−Ａ　（Ｉ！ロビー’ｒＸ＄′ｉＩ：Ｊ　：４３１ＡＣＣＪυＪＴ「■πＴ口℃Ｔσｒ”ＹＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＫＢｖ、６４會　＜　徴ヒｌ挿’ｙ　：４６）ＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＡ＄ＣＣＡＡＧ）ｉＢｖ−６３＊　（＠、ｑＱｆＢ’ｉ１．　：４７１ＣＧＴＡＧＧＧＣＴＩＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＴｒＧＧＣＴＴＴＣＨＢＶ−６２８（ｐｊｉＪｒｌｉ’ｉ　：４８）ＧＣＴＣＡＧＴＴｒＡσｒ＜’ｒｃｃＯ■Ｔ７万Ｔｏ＜’ｒｅＨＩ］Ｖ、６１会　（配テ）１８弓　：４９）ＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＫＧＧＧＣＣＴＣＡＧＹＣＣＧＴＴＴＣｒＣＫＢＶ、８９會’　ｔ　町ａケＩ肴１ち　：５０）ＧＴＣＣＣＣｒＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣｒＣＣＣｒＣＧＣＣｒＣＧｙｖ、９ｏ會　（口己ゲｚ４　＝５１１ＡＣＧＭＡＧＲＴＣＴＯ！ＡＴＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＭＧＡＩ（Ｂｖ、ｃｎ３會　（Ｍ７ａｌ’＞　：５２１ＣＡＡＴＣＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴＹＣＣＨＢｖ、ｐ１４會　（ｌＥＦ’庸”ｊ　：５３１ＧＡＣＴＣＡＴＭＧＧＴＳＧＧＲＡＡＣＴＴｒＡＩＪＧＧＧＣＴ各増幅プローブは、ＨＢＶ配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、増幅マルチマーのセグメントに相補的な以下の５゜伸長を含んでいた：各捕獲プローブは、ＨＢＶ　ＤＮＡに対して実質的に相補的な配列に加えて、固相に結合したＤＮＡに対して相補的な以下の下流配列（すなわち、ＸＴｌ参に対して相補的）を含んでいた：ＣＴＴ　ＴＧＧＴＧ　（断万１１らも：５５）　。

マイクロタイタープレートを以下のようにして調製した。

Ｗｈｉｔｅ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　Ｉ　Ｒｅｍｏｖａｖｅｌｌストリップ（ポリスチレンマイクロタイタープレート、９６ウエル／プレート）を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、から購入した。各ウェルに２００μｌのＩ　Ｎ　ＨＣＩを満たし、室温で１５〜２０分間イン手コベートした。次いで、このプレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いでウェルに２００μｍのＩ　ＨＮａＯＨを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。プレートを再びＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。

ポリ（ｐｈｅ−１ｙｓ）をＳｉｇｍａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ、Ｉｎｃから購入した。このポリペプチドは、ｐｈｅ：　ｌｙｓを１：１のモル比で有しており、平均分子量は４７．９００ｇｍ／ｍａｔである。平均長さは３０９アミノ酸であり、１５５アミン／ｌ１ｏｌを含む。ポリペプチドのＩｍｇ／ｍｌ溶液を、２Ｍ　ＮａＣ１／ＩＸ　ＰＢＳと混合し、最終濃度ｏ、　１ｍｇ／ｍ１（ｐＨ６，０＞ニした。

各ウェルに、この溶液を１００μｌずっ加えた。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、３０″Ｃで一晩インキユベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。

プレートにオリコヌクレオチドＸＴＩ中をカップリングするのに、以下の手順を用いた。ＸＴ１．＊の合成は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号１こｇ８載された。２０ｍｇのジスクシンイミジルスベレートを、３゜Ｏμｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ＸＴＩ孝の２６０Ｄ２６ｆｌ単位を、１００μｍカップソング緩衝液（５０＋ｗＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，８）に加えた。次いで、カップリング混合物をＤＳＳ−ＤＭＦ溶液に加え、マグ不チノクスターラーで３０分間攪拌した。

ＮＡＰ−２５カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５で平衡化した。

カップリング混合物ＤＳＳ−ＤＭＦ溶液を２＋ｉｌの１０＋ｎＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５に４℃で加えた。この混合物をポルテックスにかけて混合し、平衡化したＮＡＰ−２５カラムにかけた。ＤＳＳ活性化ＸＴＩ＊　ＤＮＡを、３．５ｍｌのｌ０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐｎｓ、ｓでカラムがら溶出した。溶出したＤＳＳ活性化ＸＴＩ参ＤＮＡの５．６０Ｄ２ａｅ単位を、１５００ｍ　ｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，８に加えた。各ウェルに、この溶液を５０μ ｍずっ加え、プレートを一晩インキユベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。

プレートの最終的なストリッピングは、以下のようにして行った。０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを含有する２０ｏμＬの０．２Ｎ　ＮａＯＨを各ウェルに加えた。

プレートをプラスチックで包み、６５℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。ストリッピングしたプレートを、２〜８°Ｃで乾燥剤ビーズと共に貯蔵した。

試料の調製は、１２．５μｌのＰ−に緩衝１（１０ｍＭ）リスｌｌＣｌ、ｐｌ＋８．０中の２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼに／　０．１５Ｍ　ＮａＣ１／　１１０１Ｉ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８，０／　１％ＳＤＳ／　４０Ｍｇ／ｍｌの音波処理サケ精子ＤＮＡ）を各ウェルに配付することから成り立った。ＨＢＶ　ＤＮＡの標準曲線をクローン化した）ＩＢＶ、亜型ａｄｖ、　ＨＢＶ陰性ヒト血清中のＤＮＡを希釈すること、および各ウェルに１０００．３０００．１０，０００．３０，０００、または１００．０００個の分子に相当する希釈物のアリコートを配付することにより調製した。異形ＤＮＡへの異型ハイブリダイゼーションのテストを、各ウェルに精製ＤＮＡまたは感染細胞のいずれかを添加することにより行った。それぞれの生物体の量を表に示す。

プレートを覆い、攪拌して試料を混合し、次いで６５°Ｃでインキュベートし、核酸を遊離させた。

上記に挙げたＨＢＶ特異的増幅プローブおよび捕獲プローブの反応混液を各ウェルに加えた（ウェル当り各プローブ５ｆｍｏｌ、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨで希釈した）。プレートを覆い、穏やかに攪拌して試薬を混合し、次いで６５℃で３０分間インキュベートした。

次いで、中和緩衝液を各ウェルに加えた（０．７７Ｍ　３−（Ｎ−モルホリ／）プロパンスルホン酸／　１．１１４５Ｍ　ＮａＣ１／　０．１８５　’ｙ　ｘ　：／酸ナトリウム）。プレートを覆い、６５℃で１２〜１８時間インキュベートした。

さらに室温で１０分間おいた後に各ウェルの内容物をアスピレートして、全ての流体を除去し、モしてウェルを洗浄緩衝液（０，１％ＳＤＳ／　０．０１５Ｍ　ＮａＣｌ／　Ｏ，００１５クエン酸ナトリウム）で２回洗浄した。

次いで、増幅マルチマーを各ウェルに加えた（　３０　ｆｌｏ　ｌｅ／ウェル）。プレートを覆い、攪拌してウェル中の内容物を混合した後、このプレートを５５℃で３０分間インキュベートした。

室温でさらに５〜１ｏ分間おいた後、ウェルを上記のように洗浄した。

次いで、アルカリホスファターゼ標識プローブ（ＥＰ第８８３０９６９７６号に開示されている）を、各ウェルに加えた（　２．５Ｌｍｏｌ／μｌを４０μ！／ウエル）。５５°Ｃで１５分間インキコベートした後、室温で５分間おき、ウェルを、上記のように２回洗浄し、次いで０．０１５Ｍ　ＮａＣｌ／　Ｏ，００１５Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄した。

酵素のトリガーとなるジオキセタン（５ｃｈａａｐら、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、（１９８７）　２８：１１５９−１１６２およびＥＰＡ公開第０２５４０５１号）をＬｕｍ　ｉｇｅＱ、Ｉｎｃから得、これを用いた。２０μｍのＬｕｍ１ｐｈｏｓ　５３０　（Ｌｕ＋Ｉｌｉｇｅｎ）を各ウェルに加えた。ウェルを軽く叩いて試薬を底まで落し、緩やかに回転させて試薬を底まで均等に分散させた。

ウェルを覆い、３７℃で４０分間インキュベートした。

次いで、プレートをＤｙｎａｔｅｃｈ　ＭＬ　１０００ルミノメータ−で読み取った。出力を、反応の間に生じた光の総積分として示した。

ＨＢＶプローブの独占的な研究の結果を以下の表に示す。各標準試料に対する結果は、陰性コントロールの平均値プラス２倍の標準偏差値と、試料の平均値マイナス２倍の標準偏差値との差（デルタ）として表す。デルタがＯより大きい場合、試料は陽性であるとみなされる。これらの結果より、）ＩＢＹ　ＤＮＡを異型生物体と区分するこれらのブロープセ、）の能力、および約１０００〜３０００　）ＩＢＶ分子の感度を示す。

”’Ｖ　３　Ｘ　１．０’　６．５Ｌ ””　１　Ｘ　１．０４３．００肛■３　Ｘ　１０３０．９３旧Ｖ　ｉ　Ｘ　１０３−０．２０ＣＭＶ”　３．３　Ｘ　１０６−０．４８）ｍ、Ｖ−ｒ１２１　Ｘ　１０５−０．０７ＨＴＬＶ−工２１　Ｘ　１０５−０．２３ＨｒＶ　１　Ｘ　１０’　−０ｊｌｌ　Ｘ　１０７ｐＢＲ３２ｓ　−０，２７ｓｅｒｅｐｅＯｃＯｃｃｕ９　ｓａｎｇｕｉｓ　ｌ　Ｘ　１０７−０＋３１Ｓｅｒｅｐｃｏｃｏｃｃｕ９ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＩＸ　１０’　−０，３６Ｓｅｒｅｐｃｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＩＸ　１０’　−０，３８Ｓセｒｅｐｅｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｅｃａｌｉｓ　Ｉ　Ｘ　１０フ　−０．２８Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｅｉａｅ　Ｌ　Ｘ　１０７−０．２６Ｓセｒｅｐｅｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ　ＩＸ　１ｏ７；０ｊｌＳｅａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＩＸ　１０７−０−３４Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ＋　ＩＸ　１０７−０．３０Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＩＸ　１０７−０−２３Ｐｒｏｃｅｕｓ　＋ｎｉｒ＆ｂｉｌｉｓ　ＩＸ　１０７−０．４３Ｐｅｐｅｏｓｅｒｅｐｅｏｃｏｃｃｕｓ　ｌ　Ｘ　１０７−０．４６ａｎｅｒｏｂｉｕｓＬａｃセｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　Ｉ　Ｘ　１０７−０．３３Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＩＸ　１０７−０．１２１（ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ｌ　Ｘ　１０７−０．３４Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＸ　１０７−０．４４Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｅｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　ＩＸ　１０７−０．２３Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｅｐｒａｅ　ＩＸ　１０７−０．１８２　７６０う４ルス９）し−乙ネ９上記の本発明を実施するための態様について、生化学、核酸ハイブリダイゼーションアツセイ、および関連分野における当業者に明らかな改変は、以下の請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。

（１）出願人：アービノブルースディー。

（ｉｉｉ）配列数＝５５（１ｖ）連絡住所：（Ｄ）州：カリフォルニア（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：　９４３０４−１０１８（Ｄ）ソフトウェア：パテ／トインリリース＃１ｏ１バージ１ンＩ１１．２５（ｖｉ）現在の出願データ・（ｖｉｉｉ）代理人／事務所情報：（Ａ）氏名ニド−マス　イー、　ノオ、ティ（Ｂ）登録番号：　２１，０１３（Ｃ）照会／記録番号：　２２３００−２０２３４．００（ｉｘ）電話回線情報：（Ａ）電話：　４１５−８１３−５６００（Ｂ）テレファックス：　４１５−４９４−０７９２（Ｃ）テレックス・７０６１４１（２）配列番号１の情報：（１）配列の特色：（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トヂロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１：（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ：２４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号２゜ｏテ仄Ｘ−５講ＣＡＣＧＧＣ；ＴＣＣ丁Ａ丁ＣＣＣτハ（２）配列番号３の情報：（Ｉ）配列の特色＝（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）を：核酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列・配列番号３：融τに石ππ７Ａａ↑ス四πζππご八−ππＣππばにｉ父７Ｍ　、。

（２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ：１６塩基対（Ｂ）梨：核酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号４：（２）配列番号５の情報・（１）配列の特色：（Ａ）長さ、１２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号５・ＣＡＧＴＣＡＣτＡＣＧＣ（２）配列番号６の情報（１）配列の特色：（Ｃ）鎖の数；一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号６゜（２）配列番号７の情報（ｉ）配フ１１の特色。

（Ａ）長さ・３ｏ塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｌ）配列・配列番号７゜Ｃフσ四１π芝関Ｚηでｒ　、。

（２）配列番号８の情報（ｉ）配列の特色・（Ａ）長さ　３０塩基２１（Ｒ）型・核酸（Ｃ）鎖の数・一本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（旧）配列：配列番号８： π０π公πロαＳコσズ男工　〕０（２）配列番号９の情報（ｉ）配列の特色。

（Ａ）長さ二３０塩基対（Ｒ）丁＝核酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トボロノー二百鎖状（ｘｌ）配列：配列番号９：。−８７−、。−−０゜−８−４゛。

（２）配列番号１０の情報・（＋）配列の特色：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）梨：核酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ））、ｔ！ロノーー直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号１０：。。っＡＧＣπ二μズππα胃弱Ｇ？　１０（２）配列番号１１の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ　３０塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列　配列番号１１：コＯ ’１ＡＴＧりＪば１λ只ｃＡＹ！イＡＣＡＴＣＡＧ（ＪＬτＴＣＣτＡＧＧ（２）配列番号１２の情報：（ｉ）配列の特色・（Ａ）長さ、３１塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（Ｘｌ）配り１１：配列番号１２： τ二ごＴ汀ＡＴＣＧＣ７ツ込＝７０’ｃｃ安ＧＴ　”（２）配列番号１３の情報：（ｘｉ）配列：配列番号１６：（１）配列の特色；（Ａ）長さ、３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トボロノー：直鎖状（ｘｉ＞配列：配列番号２♂：（２）配列番号２９の情報。

（＋）配列の特色：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トボロノー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号２９・（２）配列番号３０の情報：（ｉ）配列の特色；（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トボロノー：１１！鎖状（ｘｉ）配列、配列番号３０：（２）配列番号３１の情報：（ｉ）配列の特色；（Ａ）長さ、３０塩基対ＣＢ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号３１：Ｇｆ、ＴＣ”ｍ’ＹＧ　ｒ、ＣＡＴπＧＣＡＣＴＯＣＴ　３０（２）配列番号、３２の情報；（１）配列の特色：（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状ｔｘｔ）配列：配列番号３２゜】０＄Ｃ’Ｉ’＋ア■χＪ−了丁ＡＣ■コ℃ｒロ１丁（２）配列番号３３の情報：（ｉ）配列の特色；（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号３３＝ｍＴ　［ＴＹＣＡＹ　ＣＣＫＴｋＴｍ　１Ｇ（２）配列番号３４の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号、３４：ＡＡＷＧｆｒＣＴＩＴ　（ｉＡＹＴｊＪχ逮ＣＧＣＴＧＴＡＧＧＣＡ（２）配列番号３５の情報：（＋）配列の特色：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（買１）配列、配列番号３５゜ｐｔｘコ℃α−６０すＹに０α石Ｎズリ６Ａ宵超　３０（２）配列番号３６の情報：（ｉ）配列の特色；（Ａ）長さ：３０塩基対（８１型；核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トボロノー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号３６・Ｃτ２αατをホンにλ口ａ７７゜　１０（２）配列番号３７の情報・ｍ配列の特色：（Ａ）長さ、３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）Ｆａの数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列；配列番号３７；（２）配列番号、３８の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー。直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号３８：（２）配列番号３９の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ＝３０塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トイロジー：直１阻Ｒ（菫ｉ）配列：配列番号３９：３； αズゴＣ３ＴＣ７；　Ｃα込７ズスτＡα℃αｔＡｋゴ（２）配列番号４０のｔ／１報。

（１）配列の特色：（Ａ）長さ＝３０塩基スｊ（Ｂ）梨：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ＸＩ）配列：配列番号４０ニドｎ罎ＡＣσ口Ｔにｃｃｃｃｙ口℃ζ−ズ石（へＭＸ心　１０（２）配列番号、４１の情報：（ｉ）配列の特色：（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号、４１： αｃ’ｒｃつ）π白刃緑Ｑσ劫に匡π　１０（２）配列番号４２の情報＝（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ＝３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ〉トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号４２：ｌＣＡＡＲＣＡＧＧｗ−ＴＴＹｘｃ’ｒｒｒｃ’ｒ　ｃｃｃ↓ｃ’ｒｒｘ　１０（２）配列番号、４３の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ＝３０塩基対（Ｂ）梨：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号４３；ＣＣＴＣＣＸＣＣＴＧ　ＣＣｒＣＹＡＣ（ＪＪＬ　ＥＧＳｏｌｏ（２）配列番号４４の情報：（１）配列の特色：（＾）長さ：３０塩基対（Ｂ）ヤニ核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本望（Ｄ）トポロジー：直鎖状（頁１）配列・配列番号４４：（２）配列番号４５の情報：（＋）配列の特色：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）梨：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本望ＣＤ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号４５： τＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＲＴＣＣｒ　ＧＧＧσ貫（’ａｓ（２）配列番号４６の情報：（１）配列の特色：（＾）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本望（Ｄ）トヂロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号４６：（２）配列番号４７の情報：（１）配列の特色：、。　（Ｄ）トポロジー：直鎖状（菫１）配列：配列番号４７；ｃｃ’ｔｍ　ｔｃｃｃｃＯＶ７℃ｍ＜２＞配列番号、４８の情報：（ｘｌ）配列：配列番号・４８：Ｇ５でτ丁ＡＣ丁ＡＧＴつＣＣＡτ　ｍ丁〒（ＡＧτＣり２）配列番号、４９の情報：（ｉ）配列の特色：（買Ｉ）配列：配列番号４９：（２）配列番号：５０の情報：（ｉ）配列の特色：（Ｃ）鎖の数ニ一本望（Ｄ）トポロジー：直鎖状１０　（ｘｉ）配列：配列番号・５ｏ：ｃｗｃｃｃｒ、ケ、。ににｃｃｒｃＧｃ σＧ（２）配列番号５１の情報：（ｉ）配列の特色：＜Ａ＞長さ一３１塩基ｚ１（８）型：核酸（×１）配列：配列番号５１：Ａｃｔ−ヤヘア、。工□１１゛（２）配列番号５２の情報：（ｉ＞配列の特色：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（ｘｉ）配列：配列番号５２：ＣＡＡＴ口２ηＬ緑ππ融ππＮπＡ宵工（２）配列番号、５３の情報：（ｉ）配列の特色：（Ｃ）鎖の数、−重鎖ＣＤ）トポロジー・直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号５３：ＧｘＣｒＣＡＴＡＭ；ＧＴＳＯＣＲＡＡＣＴＴＴＡＣＫＧＯＧＣＴ（２）配列番号５４の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ＝２０塩基対（Ｂｌ型：核酸 λＧＧＣＡＴ；１５ｃＡ　ＣＣＣσマσＴＣＴＴ　２０（２）配列番号５５の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ＝２０塩基対（８）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本望（Ｄ）トポロジー二ＩＩＩ鎖状（ｘｉ）配列：配列番号、５５： σππ−ひＣ結石Ｔ司　２゜２び改り、　盛イ２アノ２．＜　イＩＡ２　７仁Ｑｋイー　眉（わろ丁）しス　イを戊１フγ４．し乃フイフ′　：　才〉入　ずＩイフｔし７＋−イルうクイフ゛　二　Ａ；゛［・しく−＃七−トｌｌざ１々イ心リタイア　゛　手早５　子３１）向７？４ｔｈ７４７′　：　Ｍ〃ａヂＰ、ＳＴＯＰ”ｌεＦ　２８　２−、、＋９９＋　＠８　２７．　Ｉ！’ＩＩ　ｏｎｅｓ凹３　ｉ　ｉｌｌ、１９１６　ｅフ　ａｌ、＋９８６７杯レク／Ｃし　、用キ会九つ゛’ｌｌＮ１３ズリ　ｉ１８　ニア、１９９１　１１９　２７．　１９引　＋＝ｘ−１１！ｅ　２７．　ｌ”！＋　ａ！ｉ　２７．　１９３１、　；匙ＦＩＬに圭むり、）（又丸ｌ−荀（、。

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ｌ　犬メ（１−４さしく、）（ｐｋ千類い）、二丸史ｔ４＜−１（水千兆〇）（１−へ千永い）嘗９２７ｔｈｅＴａＣｏｉｌａｅｔ１４Ｙ＠５ＹｅｓＹ＠５ＹｅｓＹａｓマｅ１マｏｓＹｅｓＳ’−６ａＴ　ＧＴ７　Ｔｉ６　ＴＴｅ　ＴＴｉ　ＴＨＴＴｉ　ＴＴ；　ＴＴ５　ＴＴｉ　Ｔ７＋　ＴＴｉ５’　−７７７６ＡＣＴ６Ｓ　Ｔ　−３ ’フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５６６　９０１５−２Ｊ３３１５７４　Ｂ　９０１５−２Ｊ（７２）発明者　ラニング、ジョイス　エイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５１９゜コンコード、フィッツパトリック　ドライＩ（７２）発明者　アーデア、マイケル　ニス。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５０７゜アラモ、バンス　メドウ　ロード　１００

Claims

【特許請求の範囲】１．以下を包含するＨＢＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーシヨンァッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、オリゴヌクレオチドマルチマーに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＢＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチド：【配列があります】（配列番号：６）【配列があります】（配列番号：７）【配列があります】（配列番号：８）【配列があります】（配列番号：９）【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１）【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３）【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５）【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７）【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９）【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１）【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３）【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５）【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７）【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９）【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１）【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３）【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５）【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７）【配列があります】（配列番号：３８）【配列があります】（配列番号：３９）【配列があります】（配列番号：４０）【配列があります】（配列番号：４１）【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３）【配列があります】（配列番号：４４）２．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５４）を含む、請求項１に記載の合成オリゴヌクレオチド。３．以下を包含するＨＢＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーシヨンアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＢＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチド：【配列があります】（配列番号：４５）【配列があります】（配列番号：４６）【配列があります】（配列番号：４７）【配列があります】（配列番号：４８）【配列があります】（配列番号：４９）【配列があります】（配列番号：５０）【配列があります】（配列番号：５１）【配列があります】（配列番号：５２）【配列があります】（配列番号：５３）４．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５５）である、請求項３に記載の合成オリゴヌクレオチド。５．ＨＢＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションァッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセツトであって、該セットは２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該セットの各メンバーが、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、オリゴヌクレオチドマルチマーに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、核ＨＢＶ核酸セグメントが、以下の配列である、合成オリゴヌクレオチドのセット：【配列があります】（配列番号：６）【配列があります】（配列番号：７）【配列があります】（配列番号：８）【配列があります】（配列番号：９）【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１）【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３）【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５）【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７）【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９）【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１）【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３）【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５）【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７）【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９）【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１）【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３）【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５）【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７）【配列があります】（配列番号：３８）【配列があります】（配列番号：３９）【配列があります】（配列番号：４０）【配列があります】（配列番号：４１）【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３）【配列があります】（配列番号：４４）６．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５４）を含む、請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチドのセット。７．ＨＢＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーシヨンアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセツトであって、該セットは２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該セットの各メンバーが、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＢＶ核酸セグメントが、以下の配列である、合成オリゴヌクレオチドのセット：【配列があります】（配列番号：４５）【配列があります】（配列番号：４６）【配列があります】（配列番号：４７）【配列があります】（配列番号：４８）【配列があります】（配列番号：４９）【配列があります】（配列番号：５０）【配列があります】（配列番号：５１）【配列があります】（配列番号：５２）【配列があります】（配列番号：５３）８．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５５）を含む、請求項７に記載の合成オリゴヌクレオチドのセット。９．試料中のＨＢＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーシヨンアッセイであって、以下の工程を包含するアッセイ：（ａ）該試料を、過剰の（ｉ）請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチドのセツトを含む増幅プローブ、および、（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットと、ハイプリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、工程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイプリダイズする条件下で接触させる工程；（９）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程；１０．試料中のＨＢＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーシヨンアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ：（ａ）該試料を、過剰の（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットおよび（ｉｉ）請求項７に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む捕獲プローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、核増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、工程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した核オリゴヌクレオチドと、ハイプリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーシヨン条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイプリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。１１．試料中のＨＢＶの検出のためのキットであって、以下の組み合わせを含む、キット：（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで、該増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＢＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、セット；（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで、捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＢＶＤＮＡのセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セット；（ｉｉｉ）核酸マルチマーであって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、核酸マルチマー；および（ｉｖ）標識オリゴヌクレオチド。１２．前記増幅プローブオリゴヌクレオチドが、請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む、請求項１１に記載のキット。１３．前記捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、請求項７に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む、請求項１１に記載のキット。１４．それらの使用のための指示書をさらに含む、請求項１０に記載のキット。