JPS6283885A - 酵素固定膜及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は酵素固定膜及びその製造方法に関するものであ
る。

〈従来の技術〉 近年、酵素反応を利用した工業的規模での実施は医薬品
や食品工業の分野で盛んに行なわれているが、酵素自体
の価格が高価なことや、溶液状態にて使用した場合に反
応後における生成物と酵素の分離や回収が困難であるこ
となどの問題点から、担持体に酵素を固定する、所謂固
定化酵素の手法が柚々検討されている〇 反応生成物と酵素の分離を酵素反応と同時に処理できる
方法として限外濾過膜の如き膜を利用した方法が研究さ
れており、精密分離精製の前処理として分子分画による
粗分離処理が極めて容易になるものとして注目されてい
る。その一つとして、酵素を固定したメンブレンリアク
ターが提案され、酵素を異方性限外ｄ［１の多孔質部に
閉じ込めて被覆を施こす方法（特開昭５９−２５６８６
号公報）や、多孔質部に酵素をゲルと共に封入包括する
方法（特公昭５７−４１２３８号公報）などが開示され
ているが、いずれも酵素を安定に保持することができず
、安定に保持できる膜が開発されていないのが現状であ
る。

〈発明が解決しようとする問題点〉 従−・て）本発明の第１の目的は、酵素の固定化量が多
く、且つ高活性（／Ｃ維持出来て基質との反応生成物、
特に高分子基質との反応生成物である低分子生成物の分
離機能に優れた酵素固定膜−を提供することにある。

本発明の第２の目的は、上記酵素固定膜を効率よく製造
するための方法を提供することにある。

く問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を行
−２た結果、異方性限外濾過膜の多孔質層に、加圧条件
下にて特定の水溶性高分子を透過、含浸させ、架橋剤に
よって架橋せしめた後、酵素の溶液を透過、含浸させて
固定化された酵素が自由度に優れ、酵素活性が非常に高
い酵素固定膜が得られることを見い出し、本発明に至−
１たものである０ 即ち、本発明の酵素固定膜は、異方性限外濾過膜の多孔
質層に、少なくとも２個の官能基を有する水溶性高分子
が架橋状態にて保持されており、且つ該官能基を介して
酵素が共有結合されていることを特徴とするものである
。

さらに、かかる酵素固定膜を得る好適な製造態様は、異
方性限外濾過膜の多孔質層側から少なくとも２個の官能
基を有する水溶性高分子浴液を０．１〜１．０　ｋｇ／
ＣＭ”の加圧条件下にて含浸、洗浄した仮、架橋剤＃液
を前記加圧条件範囲内にて多孔質層１１（■から透過さ
せて前記水溶性高分子を架橋−Ｃしわ、ざらに未架橋の
水溶性高分子を緻密層１１ｉ１１からの逆洗浄ｒ（よっ
て除去し、次いでｒ＃索浴欣を多孔質５層側から前記加
圧条件以下で透過させて水溶性＾分子の官能基を介して
酵素を共有結合さぜりことを特徴とするものであめ。

本発明において用いられる異方性限外濾過膜は、分画分
子量が１０００〜１，０００，０００の性能を有する緻
密層と、該層を担持する孔径が数μ７７／　＝　ｆｏｒ
ｉｌｍの多孔質層とからなるものであり、その形状ｔま
平板状、管状、中空糸状など任意に選択することができ
る。１．好ましくはイ」効膜面積を大さくＬ、１．３１
定化された酵素と基質との接触面積を大きくするために
中空糸状膜とすることが望ましい。

上記限外濾過膜を製造するに際して用いる材料としては
、例えはポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリア
ミド、ポリイミド、酢酸セルロース、ポリアクリルニト
リルなどが挙げられ、これらの材料は後述する水溶性高
分子や酵素と反応するよりな官能基を特に有する必要は
なく、異方性限外濾過膜として製膜できるものであれば
特に制限はない。これらの膜材料のうち、食品や医薬品
の製造工程において要求される厳格な分画分子量を満足
するものとして、ポリスルホン、ポリアミド、ポリイミ
ドを用いることが好ましく、耐熱件や機械的強度の面で
、ｔ￥ｊにポリスルホンが好適に使用できる。

上記異方性限外濾過膜は既知の方法で製造することがで
きる。その−例としては上記膜材料を水と混和しうる極
性有機溶剤、例えはジメチルスルホキシド、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルアセドアｉド、フェノール、クレ
ゾール、エチレンクロルヒドリン、エチレングリコール
、プロピレングリコール、セルソルブ、グリセリン、メ
タノール、エタノール、グロパノール、ブタノール、ア
セトン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのうち一
種以上に溶解せしめたのち、主として水からなる凝固液
と接触させることによ−７て接触界面に緻密層を有する
各種形状の異方性限外濾過膜とすることができるが、緻
密層と多孔質層を有する異方性限外濾過膜であれば如何
なる方法、形状のものであ−５ても本発明の技術を適用
することができる。

本発明の酵素固定膜は上記で得られた異方性限外ｅ１過
膜の多孔質層に、少なくとも２個の官能基を有する水溶
性高分子物質を加圧条件下にて含浸し、架橋剤によ−、
て架橋せしめるが、このような水溶性高分子としては、
例えばポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポ
リブチレンイミンの如きポリアルキレンイミン、ポリエ
チレンｆ　ＩＪコール、ポリプロピレングリコールの如
きポリアルキレングリコール、ポリリジン、ポリアルギ
ニンの如きポリアミノ酸、ボリアリールアミンなどが挙
けられ、通常、重量平均分子量が約１０００〜２０００
００　、官能基数が数十〜数百のものが好ましく、使用
する酵素の種類や膜材料の種類、膜の形状に応じて適宜
選択することが出来る。これらの水溶性高分子のうち、
ポリエチレンイミンやポリアリールアミンは官能基数の
調節が容易で、反応性も高いので好適に用いることがで
きる。

上記水溶性高分子の浴液を異方性限外濾過膜の多孔質層
ＶＣＣ浸没るＫあたり、該溶液の溶質濃度はＩＭｔｋ％
以下、好ましくは０．０５〜０．２５重址チの範囲に設
定する。溶質濃度が１重ｔｉｆ％を超えた場合は溶液粘
度が高くなり、含浸した水溶性高分子が膜孔を閉塞し、
基質浴液の透過水量が低下して限外濾過性能が低下する
ことがある。

また、水溶性高分子の溶液を含浸する場合の加圧条件と
しては限外濾過膜の多孔質／ｍ側と緻密層の圧力差が０
．１〜１　ｋｑ／ｃｍ”、さらに０．１〜０．５欧−の
範囲が好ましく、高加圧下での含浸では多孔質層内部、
特に緻密層側に水溶性高分子の圧密化が生じ、膜孔を閉
塞する恐れがある。また加圧条件が低くすぎると水溶性
高分子の多孔質層への含浸に時間がかかったり、多孔質
層全体への均一な含浸を行ない稚く、表層部のみへの含
浸となり酵素の結合量の低下を招く恐れがある。

上記の如く含浸を行なった水溶性高分子は異方性限外濾
過膜の多孔質層に保持されるが、数回の膜洗浄操作によ
って不純物質や極匿に低分子量の水溶性高分子が除去さ
れる。しかるのち架橋剤溶液を前Ｂピ水溶性高分子溶液
含浸時の加圧条件範囲内、通常は前記と同条件下にて多
孔質層側から透過せしめて前記水溶性高分子を架橋せし
める。このような架橋手段を施こすことによって水溶性
高分子は三次元化して不溶化し、分子のかさばりゃ立体
障害が大きくなるので、異方性限外濾過膜の膜自体に結
合せずとも多孔質層の孔内に保持することができ、後の
逆洗浄によっても流出しないものとなる。

このような架橋剤としては、グリオキサール、グルタル
アルデヒド、アジピンアルデヒド、マロンジアルデ、ヒ
ト、ジアルデヒド澱粉の如きジアルデヒド類、ヘキサメ
チレンジイソシアネート、トルエンジイソシア不一トの
如きジイソシアネート類、ヘキサメチレンジインチオシ
アネートの如きジインチオシアネート類などが挙げられ
、水溶性高分子にポリアミノ酸を使用した場合には水溶
性カルボジイミドなどの縮合試薬を用いることもできる
。これらのうち、特にジアルデヒド類やジイソシアネー
ト類は水溶液中で比較的安定で反応性も高いために好適
に用いることができる。

上記架橋剤は溶液状態で使用するが、水溶性高分子中の
官能基量と縫架橋剤中の官能Ｍ　蛍とのモル濃度比を２
〜５０、好ましく　ｆ１６〜２０とすることによって、
のちに酵素と結合する官能基量を充分に残存させること
ができる。また、用いた架橋剤の官能基を一部利用して
のちに酵素を結合させることもできるが、この場合は上
記量の１．５〜２０倍址の架橋剤を用いることが望まし
い。

次に異方性限外濾過膜の多孔質層に水溶性高分子を含浸
、架橋したのち、緻密層側から通常の洗浄処理である逆
洗浄によ−、て多孔質層に残存する未架橋の水溶性高分
子を除去する。しかるのち酵索浴液を多孔質層側より透
過させて前記水溶性高分子の官能基を介して共有結合さ
せる。

前記水溶性高分子はその分子末端や側鎖にアミン基、カ
ルボキシル基、ヒドロキシル基すどの官能基を有してい
るので、既知の手法を用いて酵素が有する官能基と直接
、または前記架橋剤やカップリング剤によって間接的に
共有結合させる。さらに、固定化された酵素の可動件を
大きくシ、酵素反応を旨めるためにヌベーサーを介在さ
せることもできる。

本発明に用いられる酵素としては特に限定されるもので
はないが、本発明の酵素固定）臭を用いて限外濾過膜と
しての特性を充分に発揮するためには多糖類や蛋白質の
加水分解に用いることが有用であり、例えばα−アミラ
ーゼ、グルコアミ７−ゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、
ムラミダーゼの如き多糖類加水分解酵素、パパイン、ペ
プシン、トリプシン、キモトリプシン、フロメライン、
プロテアーゼの如き蛋白質加水分解酵素などが茜分子基
質から低分子物質を生成するものとして挙げられる。

上記酵素を含む溶液を透過させるに際しての加圧条件は
、前記水溶性高分子や／ｉ倫剤を含浸する時の条件、即
ち０．１−１ｋｇ／（ｘ″の範囲に設定し１且つ前記含
授時の加圧条件以下とする。加圧度合が大きすぎると、
既に保持されている水溶性高分子が圧密化されたＪ−を
新たに形成するために、基質溶液を透過させて酵素反応
をさせる場合に、基質の透過Ｓ動の障害となり、固定化
した酵素を反応に有効活用することができなくなる。

〈発明の効果〉 以上のように本発明の酵素固定膜は、異方性限、外植過
膜の多孔質層に、架橋された水溶性高分子が保持され、
該高分子の官能基を介して酵素が共有結合によ−、て固
定化されているので、酵素は高活性を有するように自白
度が確保されており、且つ酵素反応を行なっても長時間
に亘って酵素の離脱がなく使用できうるものである。ま
た本発明の製造方法によれば、加圧条件下にて含浸、透
過させるので短時間での製造ができ、基質溶液の透過経
路である孔内に酵素を保持しているので接触機会が確実
に多くなり、基質溶液の大量処理及び分離を短時間で達
成できるものである。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、さらに詳細に説明するが
、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で種々の応用が
可能である。

実施例１ ポリスルホン製限外濾適用中空糸状膜（日本電工■製、
ＮＴＵ　−３０５０）の小型モジ、−ル（２φ×２０１
．２００本人、膜面積約５ｏｏａｚ’）の多孔質側から
０．１％重量％濃度のポリエチレンイミン水溶液（重量
平均分子ｉ　７０，０００．　１分子当りのアミン基数
的４００）を０．３　ｋｑ／ｌｖの加圧下にて約３０分
透過させた。

さらに大量の水を用い同圧下にて洗浄したのち、モジュ
ール全体を４０°Ｃに維持しながら架橋剤として０．０
５ｆｆｉｉ１％のグルタルアルデヒド溶液（りん酸緩衝
液ｐＨ７，０）を同加圧下で透過し、多孔質層に保持さ
れているポリエチレンイミンを架橋した０ 室温下にて逆洗浄を行ない多孔質層に保持されないポリ
エチレンイミンを除去し、次に４０℃にて多孔質層側か
ら２．５重量子のグルタルアルデヒド溶液（りん酸緩衝
液ｐＨ７，０）を０．１　ｋＶ／１Ｍ″の加圧条件にて
透過し、ポリエチレンイミンのアミン基を活性化した。

同加圧条件にて洗浄したのち２．５Ｊｎ４／／’ｍｔの
α−アミラーゼ溶液（三共製、コクラーゼ、酢酸緩衝液
ｐ！（６，０）を前記加圧下にて透過し共有結合によ−
７て固定化を行ない、本発明の酵素固定膜を得た。

比較例１ 架橋剤としてのグルタルアルデヒド溶液を透過せず、ポ
リエチレンイミンの架橋処理を行なわなかった以外は実
施例１と同様の操作を行ない酵素固定膜を得た。

実施例１及び比較例１にて得られた酵素固定膜に１重量
％の可溶性澱粉溶ｇ（酢酸緩衝液ｐＨ６，０）を０．５
　ｋｑ／ｙ’の加圧下で供給し、一定期間毎に緻密層側
からの逆洗浄を行ないながら４０℃にて酵素反応を続け
、透過液中の還元糖の量を測定した。

実施例１の酵素固定膜を用いた結果を第１図に示し、比
較例１の場合を第２図に示した。

実施例１の酵素固定膜を用いた場合は１回目の逆洗浄で
活性の低下が見られるが、未結合の酵素が洗浄によ−７
て流出した結果であり、以後活性の低下はほとんど見ら
れず、安定に酵素が固定されていることを示唆している
。

一方、比較例１の場合ｔｒｉ、ポリエチレンイミンが架
橋処理さｈていないので逆洗浄によって酵素の大半が流
出して活性の大幅低下が見られた。

実施例２ シート状ポリスルホン製限外濾過膜（日東電工■製、Ｎ
ＴＵ　−３１５０）を直径４３Ｍ０円型Ｋｌ’Ｄｌ！、
限外濾過用の透過セルに固定した。

次に該膜の多孔質層側から０．１重量％のボリアリール
アミン水溶液（Ｍ景平均分子［１０，０００，１分子轟
りのアミン基数約１７５０　）を０．２　ｋｖ／ｌｘ’
の加圧下にて約３０分間透過させた。

さらに大量の水を用い、同圧下にて洗浄したのち、架橋
剤として０．１重ｉ％のへキサメチレンジイソシアネー
ト水溶液を同加圧下にで透過し、多孔質層に保持されて
いるポリアリールアミンを架橋した。

次に逆洗浄によって水洗を充分に行ない、多孔質層に保
持されないポリアリールアミンを除去したのち、室温に
て多孔質層側から２．５重量％のグルグルアルデヒド溶
ｇ（！７ん酸緩衝液ｐＨ７，０）を０、１　＃／ｅｘ”
の加圧下にて透過させ、ポリアリールアミンの官能基を
活性化させた。同加圧条件下にて洗浄したのち３　ｑ／
ｍｌのグロテアーゼ（三共製、コクラーゼ・ＳＳ）のり
ん酸緩衝ｆｉ（ｐＨ７，ｓ）溶液をＱ、ｌ　ｋｇ／Ｉ”
の加圧下、４℃にて透過し、共有結合によって固定化を
行ない、本発明の酵素固定膜を得た。

得られた酵素固定膜をりん酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて
充分に逆洗浄したのち、１重量％のカゼイン溶液（りん
酸緩衝液、ｐＴ（７，５）を０．３噸ｊ′の加圧下にて
連続的に供給して酵素反応を行ない、透過液中の蛋白質
分解物をケルダール法、トリクロロ酢酸沈澱により測定
した。透過液はトリクロロ酢酸で沈澱を生じず、該液中
の窒素量から算出して０．８重量％の濃度の低分子ペプ
チドが連続して１０時間透過していることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１にて得られた酵素固定ＩＩ！４の活性
を測定した結果を示し、第２図は比較例１にて得られた
酵素固定膜の活性を測定した結果である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）異方性限外濾過膜の多孔質層に、少なくとも２個
   の官能基を有する水溶性高分子が架橋状態にて保持され
   ており、且つ該官能基を介して酵素が共有結合されてい
   ることを特徴とする酵素固定膜。
2. （２）異方性限外濾過膜がポリスルホン膜である特許請
   求の範囲第１項記載の酵素固定膜。
3. （３）水溶性高分子がポリエチレンイミンまたはポリア
   リールアミンである特許請求の範囲第１項記載の酵素固
   定膜。
4. （４）水溶性高分子がジアルデヒドまたはジイソシアネ
   ートにて架橋されている特許請求の範囲第１項記載の酵
   素固定膜。
5. （５）異方性限外濾過膜の多孔質層側から少なくとも２
   個の官能基を有する水溶性高分子溶液を０．１〜１．０
   ｋｇ／ｃｍ＾２の加圧条件下にて含浸、洗浄した後、架
   橋剤溶液を前記加圧条件範囲内にて多孔質層側から透過
   させて前記水溶性高分子を架橋せしめ、さらに未架橋の
   水溶性高分子を緻密層側からの逆洗浄によって除去し、
   次いで酵素溶液を多孔質層側から前記加圧条件以下で透
   過させて前記水溶性高分子の官能基を介して酵素を共有
   結合させることを特徴とする酵素固定膜の製造方法。
6. （６）異方性限外濾過膜がポリスルホン膜である特許請
   求の範囲第５項記載の酵素固定膜の製造方法。
7. （７）水溶性高分子がポリエチレンイミンまたはポリア
   リールアミンである特許請求の範囲第５項記載の酵素固
   定膜の製造方法。
8. （８）水溶性高分子がジアルデヒドまたはジイソシアネ
   ートにて架橋されている特許請求の範囲第５項記載の酵
   素固定膜の製造方法。