DE68928907T2

DE68928907T2 - Verfahren zur kovalenten oberflächen-modifikation hydrophober polymere und erzeugnisse daraus

Info

Publication number: DE68928907T2
Application number: DE68928907T
Authority: DE
Inventors: A. Azad; Randal Goffe
Original assignee: Hemasure Inc
Current assignee: Hemasure Inc
Priority date: 1988-10-17
Filing date: 1989-10-16
Publication date: 1999-09-16
Anticipated expiration: 2009-10-17
Also published as: WO1990004609A1; ATE175681T1; US5462867A; AU4529289A; EP0520979B1; DE68928907D1; EP0520979A4; EP0520979A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften einer hydrophoben Polysulfon- oder Polyethersulfonoberfläche. Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften der hydrophoben synthetischen Polymere unter heterogenen Bedingungen. Durch Umsetzung der Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung können die Oberflächeneigenschaften von aus den obengenannten hydrophoben Polymeren hergestellten Erzeugnissen entsprechend dem Verwendungszweck dieser Erzeugnisse verändert werden, ohne daß hierdurch die erwünschten Masseneigenschaften beeinträchtigt werden. Die Oberflächenmodifikation hydrophober Polyethersulfon- oder Polysulfonoberflächen im allgemeinen kann durch das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren ohne weiteres erreicht werden.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Synthetische Polymere und technische Kunststoffe spielen aufgrund ihrer hervorragenden Verarbeitungsfähigkeit und ihrer Masseneigenschaften seit langem eine wichtige Rolle in der Fertigungsindustrie. Die meisten Polymere zeichnen sich durch erwünschte physikalische Eigenschaften wie z. B. thermische und Dauerbeständigkeit, Strahlungsbeständigkeit, Beständigkeit gegen Verschleiß, Abrieb, chemische Lösungsmittel sowie geringe Toxizität aus. Die meisten Polymere zeichnen sich außerdem durch gute mechanische Festigkeit aus, andere weisen günstige elektrische Eigenschaften auf. Synthetische Werkstoffe sind heute in großer Vielfalt anzutreffen und werden in unterschiedlichsten fabrikmäßig hergestellten Gegenständen von Säuglingsflaschen und Ummantelungen bis hin zu Kraftfahrzeugkarosserien und mechanischen Bauteilen verwendet.
Je nach Endverwendungszweck weisen die meisten technischen Polymere allerdings unerwünschte Eigenschaften an der Polymeroberfläche oder - anlagefläche auf. Insbesondere sind die Oberflächen der aus der überwiegenden Mehrheit synthetischer technischer Kunststoffe hergestellten Erzeugnisse hydrophob, nicht benetzbar, nur in geringem Maße bioverträglich und zeigen unerwünschte unspezifische Proteinbindungseigenschaften. Daher wurde in der Polymerforschung nach Möglichkeiten gesucht, die Oberflächeneigenschaften und - merkmale synthetischer Werkstoffe so zu modifizieren, daß eine bessere Eignung für ihren vorgesehenen Verwendungszweck erreicht wird. Diese Bestrebungen sind insbesondere im Bereich bioverträglicher Polymere und Membranen festzustellen, in denen die Oberflächeneigenschaften der Membran von besonderer Bedeutung für die Bestimmung der Eignung und Leistungsfähigkeit eines bestimmten Filterungs-, Dialyse-, Separierungs- oder Reinigungsverfahren sind.

2. 1 FRÜHERE VERFAHREN ZUR MODIFIZIERUNG VON POLYMER- ODER MEMBRANOBERFLÄCHEN

Ein klassisches Verfahren, die häufig zur Modifizierung oder Derivatisierung von Polymeroberflächen eingesetzt wird, sieht die Einführung eines Comonomers, das erwünschte funktionelle Gruppen enthält, zum Monomervorläufer des primären hydrophoben technischen Polymers vor. Dieses Verfahren ergibt notwendigerweise ein Copolymer, dessen Gerüst sich nachhaltig vom Homopolymer unterscheidet, und resultiert häufig in einem Werkstoff mit nicht optimalen Betriebseigenschaften. Dieses Verfahren wird in den Arbeiten von Gregor et al. (J. Applied Polymer Sci. 1985 30, 1113-1132; U. S. Patent Nr. 4,705,753 und US 3 847 851) beschrieben.
Ein grundlegenderes Verfahren sieht die Verwendung einer physikalischen Mischung aus Polymeren vor, wovon eines das sogenannte "funktionelle" Polymer ist, dessen erwünschte Eigenschaften und angehängte funktionelle Gruppen hoffentlich in der Massenpolymeroberflächen oder, falls das Polymer zu einem fabrikmäßig hergestellten Artikel (z. B. einer Membran) umgestaltet wird, an der Oberfläche des betreffenden Artikels zutage treten. Dieses Verfahren führt nicht nur unvermeidlich zu einem in seinen Leistungseigenschaften anderen Werkstoff, sondern zeigt auch in der physikalischen Verträglichkeit der beiden Polymersorten Einschränkungen. Nur wenige Polymerpaare sind ausreichend verträglich für eine erfolgreiche Durchmischung. In dieser Hinsicht kann selbst die Verteilung der relativen Molekülmasse eines der beiden Komponenten eine kritische Rolle spielen. Selbst nachdem ein geeignetes Paar festgestellt wurde, ist die Verteilung der funktionellen Polymerkomponente an der Polymeroberfläche nur schwer vorherzusagen oder zu beherrschen. Darüber hinaus unterliegen derartige Mischungen einer Phasenseparation, die zum Entzug der funktionellen Komponente im Laufe der Gebrauchsdauer des Artikels führt. In verschiedenen erteilten Patenten werden unterschiedliche Mischverfahren beschrieben (Siehe z. B. U. S. Patent Nr. 3,629,170, erteilt an Uniroyal; 3,781,381, erteilt an Union Carbide; sowie 4,387,187, erteilt an ICI). Eine Variante unter Einbeziehung eines zusätzlichen Vernetzungsschritts wird in U. S. Patent Nr. 4,596,858, erteilt an Gregor, und in einem Artikel von Gryte et al. in J. Applied Polymer Sci. 1979, 23, 2611-2625, behandelt.
Bei einem weiteren Verfahren wird versucht, ein zweites Polymer an der Oberfläche des technischen Polymers anzuhängen (d. h. an die Oberfläche des fabrikmäßig hergestellten Artikels). Ein derartiges Verfahren setzt die Polymerisierung des Monomervorläufers des zweiten Polymers und die anschließende Bestrahlung der Oberfläche des technischen Polymers mit Gamma-, Elektronenstrahl- oder ultravioletter Strahlung voraus. Im British Patent Nr. 801,479 wird beispielsweise ein Verfahren beschrieben, bei dem ein Beschichtungswerkstoff auf eine strukturelle Oberfläche aufgetragen wird, die anschließend der Bestrahlung mit geladenen Partikeln ausgesetzt wird, um eine Verbindung der beiden Materialien auszulösen. Eine Variante dieses Verfahrens wird in einem weiteren United Kingdom Patent (Nr. 839,483) beschrieben, in dem das Massenpolymer zuerst einer ionisierenden Strahlung ausgesetzt wird und damit anschließend die strukturelle Oberfläche aktiviert und mit einem andersartigen organischen Beschichtungswerkstoff behandelt wird. Diese Strahlenbehandlung kann die Werkstoffe in erheblicher Tiefe durchdringen und schädigt deren strukturelle Intaktheit. Durch die hohe Strahlenenergie kann außerdem eine Alterung des Polymers und eine Kettenspaltung ausgelöst werden.
Als weitere Alternative ist das sogenannte "Verbund"- oder Mehrschichtenverfahren zu nennen. Die Strategie dieses Grundkonzepts sieht die Erhaltung der Masseneigenschaften der Membran oder anderer Fertigungserzeugnisse und deren primärer Polymerkomponenten vor, wobei gleichzeitig die gewünschten Anlageflächen- oder Oberflächeneigenschaften mit Hilfe eines Modifikators eingebracht werden, der auf der Werkstoffoberfläche "aufgeschichtet" wird. Die Verfahren für eine derartige "Schichtung" sind unterschiedlicher Art, aber nicht immer einfach umzusetzen. In der Praxis ist das Verbundkonzept zwar das potentiell aussichtsreichste Verfahren, ist allerdings durch eine flüchtige, schwache Verbindung des Massenpolymers und des Modifikators an der Oberfläche gekennzeichnet. Diese Instabilität tritt insbesondere dort zutage, wo die beiden Werkstoffe lediglich durch Adsorptionskräfte zusammengehalten werden. So wird z. B. in den beiden Wrasidlo et al. erteilten U. S. -Patenten Nr. 4,413,074 und 4,432,875 ein Verfahren beschrieben, bei dem ein Modifikator in Form eines Tensids oder eines Zellulosederivats in Gegenwart eines Perfluorkohlenstofftensids in eine Membranoberfläche eingebrannt wird. Diese Interaktion ist allerdings nur schwach und die Beschichtung kann mit einem geeigneten Lösungsmittel abgewaschen werden. Ein weiteres Beispiel einer adsorptiven Beschichtung wird in der Europäischen Patentanmeldung 0 221 046 von Henis et al. beschrieben. Hierin wird zwar behauptet, daß die Oberflächenmodifizierung "unumkehrbar ist", doch ist sie in Wahrheit nur unter Bedingungen stabil, die der ursprünglichen Oberflächenbehandlung nahekommen.
Eine vorgebliche stärkere Bindung kann durch Polymerisierung eines Monomers auf der Massenpolymeroberfläche und anschließende Vernetzung des resultierenden zweiten Polymers in situ erreicht werden. Dieses Verfahren wird in US. Patent Nr. 4,618,533, erteilt an Steuck, beschrieben. Die mechanische Trennung der beiden Schichten ist jedoch weiterhin möglich. Als sehr drastisches Verfahren wird in U. S. Patent Nr. 4,340,482 ein Verfahren beschrieben, in dem die chemische Einpflanzung einer Aminosäure in die Oberfläche einer vorgeformten Poly(vinylidendifluorid)membran den Ausführungen nach erreicht wird, indem die Membran in einer Lösung aus 57% Glycin, 23% Natriumhydroxid und 20% Wasser über eine Dauer von 1 h 15 min auf 120ºC erhitzt wird. Details zu den chemischen Vorgängen dieses Verfahrens liegen nicht vor. Derartige heftige Reaktionsbedingungen bringen zweifellos eine Art reaktiver funktioneller Gruppe in das Gerüst des hydrophoben Polymers ein. Die neu eingebrachte funktionelle Gruppe bzw. Gruppen können dann mit der Trägerschicht oder dem Reagens über einen unbekannten Mechanismus verbunden werden und hieraus die "eingepflanzten" Aminosäureeinheiten hergestellt werden. Ob es erwünscht und nützlich ist, Fertigungserzeugnisse derart korrosiven Bedingungen auszusetzen, und ob das beschriebene Verfahren allgemein und in vielseitiger Form anwendbar ist, ist außerordentlich fragwürdig. Bei weiteren bekannten Verfahren besteht derselbe grundsätzliche Nachteil und die Notwendigkeit, reaktive funktionelle Gruppen einleitend in die funktionelle Polymeroberfläche einzubringen (Siehe z. B. Manaka und Tomioka, J. Applied Polymer Sci., 1965, 9 3635; Iwakura et al., J. Polmyer Sci. 1963, C4, 673).
In einer Reihe von U. S. -Patenten, Nr. 4,473,474, 4,473,475 und 4,673,504, wird ein Verfahren zur Ladungsänderung einer hydrophilen benetzungsfähigen Membranoberfläche beschrieben, die mit Hilfe von Vernetzungsmitteln eine kovalente Bindung mit den "Hydroxyl-, Carboxyl- und Primär- und Sekundäraminen herstellt, die sich auf der hydrophilen mikroporösen Membran und dem kationischen Ladungsänderungsmittel" befinden. In diesen Patenten wird zwar ausgeführt, daß sich eine kovalente Bindung zwischen den Amino- und Carboxylgruppen auf der Oberfläche der bevorzugten Nylon 66- (einem Polyhexamethylenadipamid)membran und einer Epoxygruppe des Vernetzungsmittels bilden kann, doch werden die Quelle und der Ursprung dieser funktionellen Gruppen nicht offengelegt und es wird angedeutet, daß auf allen hydrophilen Oberflächen einschließlich des Nylon 66 die Hydroxyl-, Carboxyl- und Aminogruppen einfach vorhanden sind. Polyamide können jedoch keine funktionellen Hydroxylgruppen enthalten. In allen drei Patenten wird ausdrücklich ausgeführt, daß diese Hydrophilität ein notwendiger Bestandteil dieser Erfindung ist, und im zuletzt erteilten Patent wird ebenfalls ausdrücklich ausgeführt, daß hydrophobe Polymermembranen nicht für eine Ladungsänderung durch die Verfahren dieser Erfindung geeignet sind. Die Ostreicher et al. erteilten U. S. -Patente Nr. 4,711,793 und 4,708,803 beziehen sich auf dasselbe Thema.
In den vor kurzem Barnes et al. erteilten U. S. Patenten (Nr. 4,743,418 und 4,737,291) und der Europäischen Patentanmeldung 0 066 814 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem 1,4-Butanedioldiglycidylether gezielt als Vernetzungsmittel zur Modifikation der Ladung einer mikroporösen Nylonmembran eingesetzt wird. Auch in diesen Quellen werden Ursprung und Art der "hydrophilen" funktionellen Gruppen auf der Membranoberfläche nicht erläutert oder beschrieben.
In U. S. Patent Nr. 4,693,985 beschreiben Degen et al. die kovalente Bindung eines Makromoleküls an der Oberfläche von Polyamidmembranen. Ähnlich den Offenlegungen von Barnes (siehe oben) ist dieses Verfahren auf hydrophile Nylonwerkstoffe beschränkt. Die bevorzugt zu verwendenden Membranen bestehen aus nicht näher beschriebenen oberflächenmodifizierenden Polymeren, die offensichtlich einfach an der Membranoberfläche, dem Polyamidpolymer selbst und einem Trägerpolymer adsorbiert werden. Die Erkenntnisse aus diesem Patent scheinen die vorherrschende Meinung fortzuführen, wonach Polyamidpolymere "reaktiv und funktionalisierbar" sind, während hydrophobe Polymere wie z. B. Polysulfone lediglich "inert" und unreaktiv sind.
U. S. Patent Nr. 4,279,787, an Huizinga erteilt, beschreibt ein Verfahren zur Bindung antigenaktiver Materialien an der Oberfläche wasserunlöslicher hydrophober Polymersubstanzen. Laut diesem Verfahren wurden Polypropylen-, Polystyrol-, Polycarbonat-, Polyethylen- und Polyamidsubsträte mit Dialdehyden und anschließend mit Pollenextrakten behandelt, so daß hieraus ein antigenaktives Material entsteht. Die Bindung antigenaktiver Materialien an das Polymer entsprechend dem Verfahren der Erfindung wird jedoch in diesem Dokument nicht erläutert.
Somit besteht weiterhin Bedarf für die kovalente Derivatisierung oder Modifizierung hydrophober Polymeroberflächen, insbesondere von Oberflächen von hieraus hergestellten Artikeln unter relativ milden Reaktionsbedingungen. Darüber hinaus wäre es sehr vorteilhaft, wenn eine derartige Modifizierung unter heterogenen Bedingungen ablaufen könnte, bei denen der hydrophobe Polymerwerkstoff zuerst hergestellt und anschließend verarbeitet wird, so daß dessen erwünschte technische Eigenschaften genutzt werden können, und er anschließend einer Behandlung unterzogen wird, durch die versucht wird, die Oberflächeneigenschaften des vorgeformten Artikels zu modifizieren, ohne seine strukturellen Grundeigenschaften zu verändern.
Materialien oder Polymere, die für die Herstellung von Membranen verwendet werden, wurden allgemein, wie oben ausgeführt, in zwei Hauptgruppen unterteilt: reaktiv oder hydrophil einerseits und inert andererseits (siehe z. B. Cabasso, I. in "Membranes", Encyclopedia of Polymer Science and Eng, 1987, 9 509-579, Wiley Interscience Publication; Kesting, R. E., Synthetic Polymeric Membranes, 1985, 2nd Ed., Wiley; Pusch, W. und Walch, A., Angew. Chem.. Int. Ed. Engl., 1982, 21(9), 660-685). Beispiele der ersteren Gruppe sind entweder von sich aus hydrophil oder können auf einfache Weise modifiziert und dadurch mit hydrophilen Eigenschaften versehen werden. Bei hoher Hydrophilität nimmt die unspezifische Bindung von Proteinen an der Polymeroberfläche auf ein Minimum ab. Der Hauptnachteil von sich aus hydrophiler Membranen, insbesondere von Membranen aus Werkstoffen wie Zellulose, liegt in ihren eingeschränkten mechanischen und thermischen Eigenschaften. Membranen, die andererseits der letzteren "inerten" Gruppe angehören, aber eine höhere physikalische, thermische und chemische Beständigkeit aufweisen, sind außerordentlich hydrophob und sind daher anfällig gegen unspezifische Bindung von Proteinen und Verschmutzen oder Zusetzen der Membran.
Als reaktives/hydrophiles Material findet Zellulose in vielen seiner Formen in großem Maße Verwendung, weist jedoch verschiedene gravierende Nachteile auf. Zu diesen Nachteilen zählen begrenzte pH- und chemische Beständigkeit (z. B. gegen chlorhaltige Sanitärreinigungsmittel) sowie im allgemeinen das Fehlen der bei vielen Anwendungen erforderlichen physikalischen Eigenschaften (Siehe Kesting, Syn. Polym. Memb. oben).
Polysulfon (PS) ist die bei Ultrafiltrierungsmembranen (UF) am häufigsten verwendete Polymersorte, da sie in ihren physikalischen/chemischen Eigenschaften und ihrer Verarbeitungsfähigkeit zu vielfältigen Strukturen und Porengrößen relativ vielseitig ist (d. h. bei Molekulargewichtsgrenzen (MWc) von ca. 2000 kD bis ca. 1 kD). Polysulfone wurden erst in den letzten Jahren zu einem wichtigen Polymer für die Herstellung von Mikrofiltermembranen (MF). Diese MF-Membranen sind in Blattform weiter verbreitet, sind als Hohlfasern allerdings noch relativ selten. Im allgemeinen neigen Polysulfonmembranen jedoch sehr leicht zum Verstopfen, außerdem wurden noch keine Verfahren zur kovalenten Modifizierung dieser Membranoberflächen entwickelt. Darüber hinaus sind diese Membranen durchweg anisotrop.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Modifizierung der Oberfläche eines hydrophoben Polysulfons oder Polyethersulfons gemäß Anspruch 1 offengelegt, bei dem die funktionalisierbaren endständigen Gruppen des Polymers genutzt werden. Dieses Verfahren wird unter heterogenen Bedingungen durchgeführt, vorzugsweise an einem Polymer, das zu einem fabrikmäßig hergestellten Gegenstand vorgeformt wurde. Indem also eine kovalente Bindung zwischen dem funktionalisierbaren endständigen Polymer, das an der Polymeroberfläche vorliegt, und einem Verbindungsmolekül, das als kovalente Brücke dienen kann, zur Verfügung steht, kann ein Ligand oder Makromolekül, das die Anlageflächen- oder Oberflächeneigenschaften des Polymers verändern kann, über im wesentlichen sämtliche Verbindungsflächengrenzen des Polymers eingeführt werden. Das offengelegte Verfahren eignet sich insbesondere für die Modifizierung der Oberflächen von Artikeln, die aus den erwähnten hydrophoben Polymeren hergestellt wurden.
Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere für die Oberflächenmodifizierung von Membranen, die aus hydrophobem Polysulfon oder Polyethersulfon bestehen. Eine aus Polyethersulfon hergestellte Membran, einem hydrophoben technischen Werkstoff, der günstige Verarbeitungseigenschaften und nützliche Masseneigenschaften aufweist, aber in unerwünschter Form durch Adsorption Proteine in unspezifischer Form an sich bindet, kann somit mit Hilfe der in jeder Polymerkette vorhandenen Phenol-Endgruppe derivatisiert oder kovalent modifiziert werden. In Fällen, in denen die Polymer-Endgruppen weniger reaktiv sind, können diese Kettenenden durch ein geeignetes Reagens in reaktivere funktionelle Gruppen umgewandelt werden (Siehe z. B. die Umwandlung terminaler Chloridgruppen in terminale Hydroxylgruppen in Fig. 1). Ein nützlicher Teil dieser Gruppen liegt an der Membranoberfläche offen vor; indem die Membran in Kontakt mit einer Lösung gebracht wird, die eine Verbindungseinheit enthält, wobei diese Verbindungseinheit eine kovalente Bindung mit der endständigen Polymergruppe sowie mindestens eine funktionelle Gruppe einer makromolekularen oder Ligandensorte bilden kann, wird die Polymeroberfäche für die Modifizierung vorbereitet, die durch die nachfolgende Einbringung des erwähnten Makromoleküls oder Liganden erreicht wird, das nach seiner Fähigkeit zur Veränderung der Oberflächeneigenschaften des Massenpolymers ausgewählt wurde. Nachfolgende Lagen einer Variante makromolekularer oder Ligandenformen können anschließend durch Wiederholung dieses Vorgangs kovalent eingebracht werden; allerdings ist die Verwendung der Verbindungseinheit in diesen zusätzlichen Lagen nicht immer notwendig.
Als bevorzugte Verbindungseinheit dient ein Diepoxyd, ein Epoxyhalid oder ein Dihalid, während als Makromolekül oder Ligand eine hydrophile oder hydrophobe Synthese- oder Naturpolymersubstanz oder sogar eine Verbindung mit niedriger rel. Molekülmasse Verwendung finden kann. Biologisch aktive Proteine, Polypeptide und Polynukleotide können ebenfalls auf gleiche Weise kovalent mit der Polymeroberfläche verbunden werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 zeigt eine Schemazeichnung der Reaktionsfolge bei der Derivatisierung von Polymerverbindungsflächen.
Fig. 2 zeigt eine mögliche Kombination von Ligandensorten mit Hydroxyethylzellulose- und Protein-A-Molekülen.
Fig. 3 zeigt die SDS-PAGE-Ergebnisse von Immunoglobulin G-Proben, die nach einem in der Erfindung beschriebenen Verfahren aus einem Proteingemisch isoliert wurden.
Fig. 4 zeigt ein Phasenschaubild einer PES/PEO-Dope-Mittel-Zusammensetzung.
Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung der Spinndüse.
Fig. 6 zeigt eine alternative Ausführung der Coextrudierspinndüse mit Doppelring.
Fig. 7 zeigt eine grafische Darstellung der hydraulischen Permeabilität als Funktion der extraannularen Durchflußmenge bei der Faserherstellung.
Fig. 8 ist eine grafische Darstellung der Differenzdurchflußverteilung einer bestimmten Membranprobe als Funktion der Porengröße zur Ermittlung der Porengrößenverteilung.
Fig. 9 zeigt vergrößerte Abbildungen unterschiedlicher Teile der isotropen Hohlfasermembranen der vorliegenden Erfindung.

5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bei dieser Erfindung werden die funktionalisierbaren Kettenenden in Polyethersulfon- oder Polysulfonwerkstoffe genutzt. Die vorliegende Erfindung sieht vor, daß durch die Behandlung von Polyethersulfon- oder Polysulfonpolymerproben unter heterogenen Bedingungen mit Verbindungseinheiten, die eine kovalente Bindung mit den hydrophoben Polymerendgruppen eingehen können, eine Modifikation der Oberflächeneigenschaften des Polymers bei gleichzeitiger Erhaltung der gewünschten Masseneigenschaften möglich ist. Unter Anwendung der Verfahren der Erfindung können die Oberflächeneigenschaften jedes beliebigen aus dem Polymer, das Gegenstand dieser Erfindung ist, hergestellten Gegenstand modifiziert und gleichzeitig Form und Mikrostruktur des fabrikmäßig hergestellten Gegenstands beibehalten werden. Massenpolymere mit funktionalisierbaren endständigen Gruppen können also unter heterogenen Bedingungen derivatisiert oder modifiziert werden, und zwar unabhängig davon, ob das Polymer in Pulverform, als extrudierte Faser, als mikroporöse Membran, als massiver Streifen vorliegt, in ein Rohr eingebettet oder in ein künstliches Organ, Haut oder Prothese eingearbeitet ist. Derartige Gegenstände können nach den in der Fachwelt bekannten Verfahren hergestellt werden. Zu den Beispielen für diese Fertigungsverfahren zählen (ohne hierauf beschränkt zu sein) Spritzgießen, Formpressen, Blasformen, Blasen, Kalandrieren, Gießen, Beschichten, Formen, Schichtstoffherstellung und Strangpressen.

MODIFIZIEREN VON HYDROPHOBEN POLYMEROBERFLÄCHEN

Nahezu sämtliche bekannten Polymere weisen mindestens eine funktionalisierbare endständige Gruppe auf, die ursprünglich im Monomervorläufer vorhanden oder durch den Polymerisierungsprozeß eingeführt wird. Polyethersulfone weisen dementsprechend am einen Ende ein Halid und am anderen Ende ein substituiertes Phenol auf.
Die vorliegende Erfindung zielt auf die in den Polysulfon- oder Polyethersulfonkettenenden bereits inhärent vorhanden funktionalisierbaren Gruppen ab. Darüber hinaus liegt der wichtigste Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung in der Derivatisierung dieser hydrophoben technischen Homopolymere, Copolymere oder Mischungen hiervon, die relativ inerte Monomereinheiten im Polymergerüst aufweisen. Diese Polymersorten werden im allgemeinen durch Stufen-, Radikal-Ketten-, Ionische Ketten-, Ringöffnungs- und Ziegler-Natta-Polymerisierung hergestellt und gelten im allgemeinen als vollständig inert und ungeeignet für Derivatisierung oder Modifizierung durch die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen milden Bedingungen. Zu diesen Polymeren zählen Polysulfone und Polyethersulfone.
Obwohl außerdem nur eine einzige funktionalisierbare Endgruppe in einer Polymerkette vorhanden sein muß, läßt sich die Zahl der verfügbaren Gruppen erhöhen, indem inhärent weniger reaktive oder weniger nützliche Endgruppen chemisch in nützlichere Funktionalitäten umgewandelt werden. So können z. B. terminale Nitrilgruppen, die durch die Polymerisierung mit freien Radikalen unter Verwendung von nitrilhaltigen Initiatoren eingebracht werden, mit Hilfe einer der zahlreichen in der Praxis verfügbaren Reduktionsmittel zu Aminen reduziert werden. Metallhydridreagentien sind beispielsweise für diesen Zweck geeignet. Aromatische Halidgruppen von Polyarylsulfonen können in Aryloxygruppen umgewandelt werden, indem sie mit wäßrigen Basen behandelt werden. Auf diese Weise kann die Zahl der nutzbaren terminalen Gruppen erhöht werden, ohne die Stabilität des Polymergerüsts zu beeinträchtigen.
Darüber hinaus wurde festgestellt, daß sich durch die Vorbehandlung von Polymerproben oder hieraus hergestellten Gegenständen durch Waschen oder Erwärmen der Proben in wäßrigen oder nichtlösenden organischen Lösungsmitteln die Wirksamkeit der nachfolgenden Derivatisierungsschritte steigern läßt. Ohne sich durch die Theorie einschränken zu lassen, wird angenommen, daß die Polymergrenzfläche bzw. die Oberfläche des Fertigungsteils möglicherweise durch Fremdkörper oder Prozeßflüssigkeiten verunreinigt und damit die funktionalisierbaren Endgruppen abgeschirmt werden. Durch Waschen der Polymerproben ließen sich diese Verunreinigungen mechanisch entfernen und weitere auf der Oberfläche oder an Grenzflächen vorhandene Polymerkettenenden freilegen. Zu den vorzugsweise zu verwendenden organischen Lösungsmitteln zählen (ohne hierauf beschränkt zu sein) Acetonitril und Isopropanol. Wäßrige Lösungen dieser Lösungsmittel können ebenfalls verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden mikroporöse blattförmige Membranen, die aus Polyethersulfon (PES) als Primär- oder Massenpolymerbestandteil bestehen, über Nacht bei Raumtemperatur in einer basischen wäßrigen Lösung eingelegt, die eine Diepoxyd-Verbindungseinheit enthält. Als Option können die Membranproben auch durch Erwärmen in wäßrigen Lösungen oder durch Waschen in Acetonitril oder Isopropanol vorkonditioniert werden. Den substituierten Phenolgruppen der an der Membranoberfläche offenliegenden Kettenenden werden durch die Basis Protonen entzogen, so daß eine nukleophile Phenoxidgruppe entsteht. Dieses Nukleophil greift eine Epoxidgruppe der Verbindungseinheit an und bildet eine kovalent gebundene Verbindungseinheit (d. h. eine Ätherbindung). Da kovalent gebundene Verbindungseinheiten mindestens eine weitere kovalente Bindung mit einer anderen chemischen Einheit bilden können (z. B. über eine zweite Epoxidgruppe), kann anschließend jedes Molekül, Makromolekül oder jeder Ligand kovalent an die Membranoberfläche gebunden werden. Das kovalent gebundene Makromolekül wird damit sehr fest gebunden und kann nicht durch Abwaschen oder andere mechanische Verfahren entfernt werden.
Es wird davon ausgegangen, daß die Verbindungseinheit kovalent die verfügbaren funktionalisierbaren Polymerkettenenden mit funktionellen Gruppen überbrückt, die in dem gewählten Makromolekül vorhanden sind. Als Verbindungsmittel kann also bevorzugt ein beliebiges polyfunktionelles organisches Molekül wie z. B. aliphatische oder aromatische Verbindungen verwendet werden, die aus Epoxid, Carbonyl, Carboxyl, Amino, Halogenid, Hydroxyl, Sulfonylhaliden, Acylhaliden, Isocyanat oder Kombinationen hieraus oder anderen funktionellen Gruppen bestehen, solange die Verbindungseinheit stabil und verträglich ist und kovalente Bindungen mit dem Massenpolymer und Makromolekularformen oder Liganden eingehen kann. Die Verbindungseinheit kann sogar anorganische Funktionalitäten wie z. B. Silizium-, Bor-, Aluminium-, Zinn-, Phosphor-, Schwefel- oder Stickstoffgruppen enthalten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, daß andere Varianten, die z. B. Silikate, Aluminate, Borate, Stannate, Phosphate oder Sulfonate enthalten, als primäre Überbrückungsgruppe verwendet werden können. Als bevorzugte Ausführungen der Verbindungseinheit gelten jedoch Ethylglykoldiglycidylether (EGDGE), 1,4-Butanediol-Diglycidylether, Epichlorhydrin, aliphatische Dihalide, Diacide, Diacidhalide, Disulfonylhalide und Triazine.
Wie oben erwähnt, muß die Makromolekül- oder Ligandensorte, die für die Modifizierung der Membranoberfläche ausgewählt, wird, imstande sein, die Oberflächeneigenschaften der hydrophoben PES- oder PS-Membran oder des Fertigungsgegenstands zu verändern und muß mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, die eine kovalente Bindung mit der Verbindungseinheit eingehen kann. In bestimmten Fällen kann eine einzige Funktionalitätsart genügen. So verleihen z. B. die -OH-Gruppen der Hydroxyethylcellulose (HEC) der hydrophoben Membranoberfläche hydrophile Eigenschaften und bilden außerdem Ätherbindungen mit den entsprechenden Epoxidgruppen des kovalent gebundenen EGDGE. Je nach Endanwendungszweck kann das Makromolekül also aus Molekülen mit niedriger rel. Molekülmasse, Oligomeren mit mittlerer rel. Molekülmasse oder polymeren Substanzen mit hoher rel. Molekülmasse bestehen. Vorzugsweise besteht das Makromolekül aus hoher rel. Molekülmasse und kann (ohne hierauf beschränkt zu sein) Tenside, Kohlehydrate, Lectine, Polypeptide, Polysaccharide, Liposomen, Proteine, Glycoproteine, Oligonukleotide, synthetische Farbstoffe, natürliche Farbstoffe, Polynukleotide, Derivate oder Mischungen hieraus enthalten. Moleküle oder Polymere, die kationische oder anionische Ladungen aufnehmen können, oder solche, die nicht ionisierbare Gruppen enthalten, sind ebenfalls nützlich. Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Teils des grundlegenden Verfahrens dieser Erfindung.
Zu den bevorzugten Makromolekülsorten zählen Polysilane, Polysiloxane, Hydroxyalkylcellulose, Dextran, Carboxymethylcellulose, Pol(ethylimin), Pol(carboxymethylethylimin), Pol(vinylalkohol), Derivate, Gemenge oder Mischungen oder Copolymere hiervon. Bei den Makromolekülen kann es sich auch um biologisch wichtige Moleküle handeln; hierzu können (ohne hierauf beschränkt zu sein) monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Antigene, Enzyme, Trägerproteine, Koagulationsfaktoren, Kofaktoren, Inhibitoren, Hormone, Immunoglobuline, Histone, Plasmide und deren Derivate oder Mischungen zählen.
Es dürfte offenkundig sein, daß der Prozeß der kovalenten Bindung des Makromoleküls an die Polymer-Kettenenden mehrere Male wiederholt werden kann. In nachfolgenden Anwendungsfällen dürften jedoch funktionalisierbare Gruppen der ersten makromolekularen Lage verwendet werden, da diese Gruppen in wesentlich höheren Konzentrationen als die übrigen nicht verwendeten Polymerkettenenden vorhanden sind. Bei jeder nachfolgenden Bindung wird daher die Zahl der Verbindungseinheiten erhöht und eine stärkere Bindung hergestellt sowie die Ladung an der Membranoberfläche erhöht. Aus diesem Grund ist es in bestimmten Fällen möglicherweise vorteilhafter, die auf einer Membranoberfläche vorhandenen oberflächenfunktionalisierbaren Gruppen zu "verstärken", indem zuerst eine oder mehrere Lagen einer ohne weiteres verfügbaren makromolekularen Sorte aufgebracht werden, bevor eine wertvollere Ligandensorte auf der obersten Schicht aufgebracht wird. In Fällen, in denen Lagen hydrophiler Makromoleküle kovalent aneinander gebunden sind, nimmt die unspezifische Proteinbindung der modifizierten Oberfläche im Vergleich zur unveränderten hydrophoben Oberfläche deutlich ab.
Die kovalente Bindung der Oberflächenligandenlagen muß nicht unbedingt eine Zwischenlage einer Verbindungseinheit umfassen, doch sollte zweckmäßigerweise in bestimmten Fällen ein "Verbindungsmolekül" verwendet werden. Es ist beispielsweise möglich, bestimmten funktionellen Gruppen von Makromolekülen, die bereits an die Polymeroberfläche gebunden sind, durch Einsatz von Aktivierungsreagentien eine höhere Reaktivität gegenüber den funktionellen Gruppen eines zusätzlichen Liganden zu verleihen. Diese Verfahren, die aktive Plätze auf dem Makromolekül produzieren, sind in Fachkreisen allgemein bekannt; hierzu zählen die Verwendung von Reagentien wie Dialkylcarbodümiden (zur Bildung von Aminbindungen), Diazotisierung (zur Kopplung aromatischer Gruppen), Cyanogenbromid (häufig zur Aktivierung von Feststoffirägerschichten verwendet), Epoxide, Sulfonylchloride oder andere Verfahren, z. B. die Verwendung von 2-Fluoro- 1-Methylpyridinium p-Toluolsulfonat (FMP), das die Kopplungsreaktion durch Einführung einer höheren Austrittsgruppe erleichtert. Zu weiteren nichtlimitierenden Reagentien, die für die kovalente Bindung des Liganden am Makromolekül oder an der Polymeroberfläche eingesetzt werden können, zählen Diepoxide, Haloepoxide, 2,4,6-Trichloro-S-Triazine, Diacidechlorine, Dialdehyde, Diisocyanate oder Haloalkylcarboxylsäuren.
In einer spezifischen bevorzugten Ausführung der Erfindung können Protein-A- Moleküle direkt mit Hilfe von EGDGE als Verbindungseinheit mit den Polymerkettenenden einer hydrophoben PES-Membran verbunden werden. Vorzugsweise wird die PES-Membran als erste durch Aufbringen mehrerer Lagen Hydroxyethylcellulose modifiziert. Weitere hydroxylhaltige Makromoleküle wie Dextran, Agarose, Hydroxypropylcellulose oder Poly(vinylalkohol) können mit gleicher Wirkung verwendet werden. Nachdem auf diese Weise die Zahl der Hydroxylgrupen auf der Membranoberfläche "verstärkt" wurde, wird die Membran mit FMP behandelt und hieraus aktive Plätze auf der Membranoberfläche gebildet. Diese Reaktionsfolge wird am besten anhand von Fig. 2 dargestellt. Die Membranen werden anschließend einer geringfügig gepufferten Lösung von Protein A ausgesetzt, um eine wirksame kovalente Bindung dieses wichtigen Liganden zu erreichen.
Membranproben mit kovalent gebundenem Protein A sind z. B. nützlich für die selektive Bindung und Isolation von Humanimmunoglobulin G (IgG) aus einer Mischung von Serumproteinen. Dieser Nutzen wird im Beispielteil dieser Spezifikation dargestellt.
Es ist offenkundig, daß durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung zahlreiche Typen von Liganden an die hydrophobe Membran gebunden werden können.
Naturprodukte und biologisch aktive Komponenten sowie synthetische Polymerwerkstoffe können verwendet werden. Sämtliche oben z. B. als mögliche Makromolekülsorten aufgeführten Molekülarten können auch die Ligandensorte umfassen. Als zusätzliche Beispiele (ohne Ausschließlichkeitscharakter) sind Färbemittel, Enzyminhibitoren, amphotere, ionisierbare Moleküle, hydrophobe langkettige aliphatische Kohlenwasserstoffe sowie aromatische Kohlenwasserstoffe zu nennen. Silanderivate sind ggf. ebenfalls nicht nur als einfache Liganden, sondern auch als potentielle polymerisierbare Sorten nützlich. Zu den Beispielen dieser Silane zählen (ohne hierauf beschränkt zu sein) terminale aminoaliphatische Kohlenwasserstoff-Trialkyloxysilane, z. B. Aminoethyl-Aminopropyl-Trimethoxysilan, carboxylsubstituierte Silane, langkettige aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffsilane. Viele Arten funktioneller Gruppen können natürlich auch in den Silanverbindungen vorhanden sein.
Zu den bevorzugten Liganden zählen natürliches oder rekombinantes Protein A, Avidin, Biotin, Heparin, tierische, pflanzliche, bakterielle Zellenoberflächenrezeptoren, Antikörper gegen IgG, IgM, IgA, IgE, Gewebeplasmogenaktivator (TPA), humane Interleukin- (IL)proteine, humanes chorionisches Gonadotropin (HCG), thyrotropes Hormon (TSH), carcinoembryonisches Antigen (CEA), α-Fetoprotein, Umwandlungswachstumsfaktor (TGF), Interferone sowie Blutkoagulationsfaktoren wie Faktor VIII oder IX. Im allgemeinen werden Liganden bevorzugt, die zur Bindung spezifischer Ligate aus einer Musterlösung oder -gemisch mit einer Dissoziierungskonstanten von ca. 10² - 10&supmin;¹² M in der Lage sind. Liganden mit Bindungskonstanten unter ca. 10&supmin;&sup6; M sind eindeutig zu bevorzugen. Weitere bevorzugte Liganden sowie mögliche Substrate oder Ligate sind in U. S. Patent Nr. 4,693,985 ausgeführt.
Noch weitere Beispiele nützlicher Liganden sind aus Katalogen für Produkte für die Molekularbiologieforschung zu entnehmen (Siehe z. B. Ligandenindex im hierin durch Verweis aufgenommenen Pharmacia Affinity and Chromatography Media-Katalog).
Eine kurze Liste möge dies verdeutlichen: Acetylglucosamin, Anti-A-Lectin, Arginin, Butylamin, Rizinusbohnenlectin, Cibacron-Blau, Coenzym A, Decylamin, Diadenosinpentaphosphat, Gelatine, Hämoglobin, Iminodiessigsäure, HMG-CoA, Lysin, NADP, Oligo(dA, dC, dG, dI oder dT), PHA-L, Polyriboguanylicsäure, Poly(I)poly(C), Procion-Rot, Uridinnukleotid oder Konjugate hieraus. Die einzige Einschränkung der Ligandensorte besteht darin, daß zumindest eine funktionelle Gruppe vorhanden sein muß, mit der eine kovalente Bindung mit der Verbindungseinheit oder den aktiven Plätzen auf dem Makromolekül gebildet werden kann.
Darüber hinaus kann potentiell jeder aus einem hydrophoben Polysulfon oder Polyethersulfon hergestellte Artikel, der funktionalisierbare Kettenenden enthält, durch den in der Erfindung beschriebenen Vorgang modifiziert werden. Insbesondere können Kunststoffkomponenten oder künstliche Organe, Gewebe oder Prothesevorrichtungen in jede beliebige Form gebracht und dadurch die Verarbeitungsmöglichkeiten und Festigkeit des technischen Polymers in vollem Umfang genutzt werden. Diesen Materialien kann anschließend eine bessere Bioverträglichkeit verliehen werden, indem ihre Oberflächeneigenschaften durch das hierin beschriebene Verfahren modifiziert werden. Natürlich werden auch die allgemeinen Bereiche der Reinhaltung, Separierung, Filterung und insbesondere der Membrantechnologie durch die vorliegenden Verfahren wesentlich weiterentwickelt.

BESTIMMUNG DER VERFÜGBAREN HYDROXYLGRUPPEN UND DIE AUSWIRKUNGEN UNTERSCHIEDLICHER BEHANDLUNGEN

6. 1. 1 ALLGEMEINES VERFAHREN

Das nachstehende Verfahren stellt eine Modifizierung des von Ngo in Biotechnology. 1986, 4, 134 zur Analyse aliphatischer Alkohole beschriebenen Verfahrens dar. Die gesamte Offenlegung dieses Bezugsdokuments wird hiermit durch Verweis hierin aufgenommen.
Eine mikroporöse blattförmige PES/PEO-Membran (Nr. 1600-1), die nach dem in Beispiel 7.14 (unten) beschriebenen Verfahren aus Polyethersulfon (PES, Victrex, Imperial Chemical Industries, USA) hergestellt wurde, als Polymer-Hauptbestandteil sowie Poly(ethylenoxid) (PEO, Union Carbide) als untergeordneter Bestandteil werden 2,5-cm-Scheiben geschnitten. Zwei der Scheiben werden mit 10 ml einer Acetonitrillösung mit 2 Gewichts-% 2-Fluoro-1-Methylpyridinium p-Toluolsulfonat (FMP, Aldrich Chemical Co., USA) und 1 Gewichts-% Triethylamin bei Raumtemperatur 15 Minuten lang behandelt. Die behandelten Proben werden mit frischem Acetonitril abgewaschen und in 5 mM wäßriger Salzsäurelösung eingelagert. Membranproben mit Stirnflächen zwischen 1 und 5 cm² werden 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in 1 M Ethanolamin eingetaucht. Die Menge an Iminchromophor, 2, die sich aus der Verdrängung des inhärent vorhandenen Phenoxid aus den mit FMP behandelten Proben ergibt, wird durch Spektrofotometrie bei ca. 301 nm (Extinktionskoeffizient E ~ 5900 M&supmin;¹ cm&supmin;¹) überwacht. Die Reaktion der mit FMP behandelten Polymerproben, die aliphatische Alkohole mit Ethanolamin enthalten, liefert entsprechend der Beschreibung in Ngo (~λmax ~ 296 nm, E ~ 5900 M&supmin;¹cm&supmin;¹) -Methyl-2-Pyridon als Chromophor. Die verfügbare Hydroxylkonzentration wird als umol - OH/mL Membran ausgedrückt. Einige Proben werden durch Waschen mit Isopropanol und Acetonitril vor der Behandlung mit FMP vorkonditioniert. Andere werden in einer basischen Lösung (5 N NaOH) 4 Stunden bei 80-90ºC aufbewahrt und anschließend gründlich mit Wasser abgewaschen, bevor die Reaktion mit FMP abläuft. Die Ergebnisse der verschiedenen Proben sind in Tabelle I zusammengestellt; hieraus ist zu entnehmen, daß die Zahl der verfügbaren Hydroxylgruppen durch das Waschen mit Lösungsmitteln und die basische Behandlung zunimmt.

6. 1. 2 ERGEBNISSE FÜR ANDERE MEMBRANEN

Eine zweite zu Experimentalzwecken vorbereitete PES-Membran (Nr. 1700-5) in Blattform wird aus einer herkömmlichen, mit 3 Komponenten gedopten Zusammensetzung entsprechend dem in U. S. Patent Nr. 4,364,759 und U. K. Patentanmeldung GB 2 047 162 vorbereitet. Die -OH-Gruppen der Membran werden wie oben analysiert. Einige Proben werden durch 16stündiges Eintauchen in Isopropanol bei Raumtemperatur vorgewaschen, andere werden hingegen mit einer wäßrigen Base (5 N NaO, 95-100ºC, 24 h) vorbehandelt und vor der FMP-Analyse mit entionisiertem Wasser abgespült.
Als weitere Proben wird eine blattförmige Membran HT-200 aus handelsüblichem Polysulfon von Gelman Sciences, Ann Arbor, Ml (USA), (Porengröße 0,2 um, Durchmesser 25 mm) verwendet, die in entionisiertem Wasser und Isopropanol gründlich gewaschen wird, um die Benetzungsmittel zu entfernen. Als hydrophile Bezugsmembran wird außerdem eine handelsübliche 0,22 um Hydrophilic Durapore(R) GVWP Membran (Millipore Corp., MA, USA) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. TABELLE I Verfügbare Hydroxylgruppen in verschiedenen Membranproben entsprechend den Ergebnissen der FMP-Analyse
a Durchschnitt aus mindestens zwei separaten Ermittlungen
b Keine Daten verfügbar

6. 1. 3 AUSWIRKUNG HÖHERER VORKONDITIONIERUNGSTEMPERATUREN UND DER BEHANDLUNGSDAUER AUF DIE VERFÜGBAREN -OH-GRUPPEN

PES/PEO-Membranen in Blattform (Nr. 1600-5) werden nach dem unten in Beispiel 7.14 beschriebenen Standardverfahren vorbereitet. Ein Teil der Membranen wird nur mit entionisiertem Wasser (unbehandelt) gewaschen, während ein weiterer Teil zusätzlich mit Isopropanol und anschließend mit Acetonitril gewaschen wird. Beide Teile werden separat mit wäßriger Natriumhydroxydlösung unter unterschiedlichen Bedingungen behandelt. Die Ergebnisse der Ermittlung der Hydroxylgruppen sind in Tabelle II zusammengestellt und lassen erkennen, daß bei längerer, intensiverer NaOH-Behandlung die Zahl der verfügbaren -OH-Gruppen zunimmt. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß terminale Chlorphenylgruppen des PES-Polymers in terminale Phenoxygruppen umgewandelt werden, was in etwa zu einer Verdoppelung der verfügbaren Hydroxylfunktionalitäten führt. TABELLE II Verfügbare Hydroxylgruppen in PES/PEO-Membranproben (Nr. 1600-5), mit 5 N NaOHa behandelt
a Analyse von hydrophilem Durapor(R), das 16 Stunden mit kaltem Wasser bei 22ºC gewaschen wurde, ergibt eine -OH-Konzentration von 58,1 umol/mL Membran bei λmax = 296 nm.

6. 2 REAKTION UNTERSCHIEDLICHER MEMBRANOBERFLÄCHEN MIT ETHYLENGLYKOLDIGLYCIDYLETHER (EGDGE)

Jede der mit Nr. 1600-1 bezeichneten Membranen, die in Beispiel 6.1.1 beschrieben wurden und in Tabelle I aufgeführt sind, wird 24 Stunden lang mit 5 N wäßrigem NaOH bei 95-100ºC behandelt. Die Membranen werden in entionisiertem Wasser gespült und auf dieses Weise überschüssige Basen entfernt und die Membranen anschließend 16 h bei Raumtemperatur in 20 mL einer 0,6 N wäßrigen Lösung Natriumhydroxid mit 10% EGDGE (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) eingetaucht. Anschließend werden die Membranproben mit frischen entionisiertem Wasser gewaschen, um nicht reagiertes EGDGE zu entfernen, und danach 24 h bei Raumtemperatur einer 0,1 N wäßrigen NaOH-Lösung ausgesetzt, die 1 Gewichts-% Mercaptoethanol enthält. Die hieraus resultierenden Proben werden nochmals mit Wasser gespült, um überschüssige Reagentien zu entfernen, mit FMP behandelt und entsprechend Beispiel 6.1 auf -OH-Gruppen analysiert. Die Ergebnisse dieser Bestimmung der OH-Gruppen sind in Tabelle III zusammengefaßt. TABELLE III Verfügbare Hydroxylgruppen in mit EGDGE behandelten und mit Mercaptoethanol bedeckten PES/PEO-Membranen
Die vorstehenden Beispiele zeigen, daß die inhärent vorhandenen funktionellen Kettenenden eines hydrophoben Polymers wie z. B. PES unter heterogenen Bedingungen zugänglich sind und deriviert oder mit einer poly- oder multifunktionalen Verbindungseinheit wie z. B. einem Diepoxid zu einer Reaktion gebracht werden können. Zu den weiteren geeigneten Reagentien zählen (ohne hierauf beschränkt zu sein) Epichlorhydrin, sämtliche Alkylendiglycidylether, Dihalid oder auch ein Haloalkylen-Trialkyloxysilan. Selbst einfachere Verbindungseinheiten wie z. B. Sulfate, Sulfonate, Phosphate, Borate, Aluminate oder Silikate können in Erwägung gezogen werden.

6. 3 KOVALENTES AUFPFROPFEN VON HYDROXYETHYLCELLULOSE (HEC) IN VERSCHIEDENEN MEMBRANPROBEN

PES/PEO-Membranen in Blattform (Nr.1800-5) werden entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 7.15 vorbereitet. Eine Gruppe kreisrunder Scheiben (mit einem Außendurchmesser von 1,25 und 2,5 cm) wird ausgestanzt. Die Proben werden in fünf Gruppen unterteilt, die wie folgt behandelt werden:
1. in unbehandeltem Zustand belassen
2. 16 h bei 95ºC in entionisiertem H&sub2;O aufbewahrt
3. im Gehäuse unter Dampf 15 Minuten lang bei 121ºC behandelt, anschließend 16 h bei 95ºC in entionisiertem H&sub2;O aufbewahrt
4. 16 h bei 95ºC mit 5 N NaOH behandelt
5. im Gehäuse unter Dampf 15 Minuten lang bei 121ºC behandelt, anschließend 16 h mit 5 N NaOH behandelt
Proben aus jeder der fünf obigen Gruppen werden zur Analyse (Bestimmung der - OH-Gruppen, unspezifische Proteinbindung (NSB) sowie hydraulische Permeabilität (Lp), siehe Erläuterungen unten) beiseitegelegt. Die übrigen Proben werden wie folgt weiterbehandelt:
Aus jeder der fünf Gruppen werden Membranproben 4 h lang bei Raumtemperatur mit einer 0,1 N NaOH-Lösung, die 10 Gewichts-% EGDGE enthält, in Reaktion gebracht. Die Membranen werden anschließend isoliert und vorzugsweise mit frischem kaltem Wasser gewaschen, um nicht reagiertes EGDGE und überschüssige Basen vollständig zu entfernen. Anschließend werden die Proben in eine 0,6 N NaOH-Lösung eingetaucht, die 2 Gewichts-% Hydroxyethylcellulose (HEC, Natrosol 250 JR, Aqualon Company, Wilmington, DE, USA) enthält, und 16 h lang auf 60ºC erwärmt. Danach werden die Proben bei auf 60ºG erwärmtem H&sub2;O abgespült, um ungebundene Komponenten zu entfernen. Das hieraus entstehende Material wird als 1X HEC bezeichnet. Proben der 1X HEC-Materialien werden nacheinander mit EGDGE-Lösungen, frischem kaltem Wasser und frischem warmem Wasser entsprechend obiger Beschreibung behandelt; hieraus entstehen 2X, 3X, 4X und 5X HEC entsprechend der Gesamtzahl der durchlaufenen Zyklen. Aus jeder Gruppe werden Proben zur weiteren Analyse beiseitegelegt.

6. 3. 1 ERMITTLUNG DER VERFÜGBAREN -OH-GRUPPEN

Die Konzentration der verfügbaren Hydroxylgruppen wird anschließend entsprechend dem in Beispiel 6.1 beschriebenen FMP-Verfahren ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt. TABELLE IV Verfügbare Hydroxylgrupen in PES/PEO-Membranen vor und nach dem kovalenten Anbinden von HECa
a Sämtliche Werte in umol -OH/mL Membran
b Siehe Text zu Beispiel 6.3 für Vorkonditionierungsprotokolle Hydrophiles Durapore(R) (0,22 um, im Eingangszustand) ergibt einen Wert von 78,5 umol -OH/mL Membran.
Diese Daten lassen erkennen, daß aufeinanderfolgende Lagen von HEC zunehmende Konzentrationen an verfügbaren Hydroxylgruppen enthalten. Die Daten zeigen außerdem, daß eine Erwärmung in H&sub2;O oder in wäßrigem NaOH die Anzahl der verfügbaren Hydroxylgruppen vor dem Aufpfropfen von HEC erhöht, daß dies aber für die nachfolgende Anbindung von HEC nicht erforderlich ist.

6. 3. 2 ERMITTLUNG UNSPEZIFISCHER BINDUNG (NSB)

Proben der einzelnen in Beispiel 6.3 beschriebenen vorkonditionierten und mit HEC aufgepfropften Membranen (insgesamt 30) werden wie folgt auf die unspezifische Bindung von Rinderserum-Albumin (BSA) analysiert:
Eine BSA-Stammlösung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wird vorbereitet, indem 50 mg BSA (monomeres BSA, ICN Biomedical, IN, USA) in 100 ml PBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) gelöst werden. Die Probenscheiben (1,25 cm Durchmesser) werden 2 h bei Raumtemperatur in 2,0 ml der Stammlösung geschüttelt. Die verbrauchte Proteinlösung wird abgeschüttet und die Membranproben 15 min mit frischem PBS (5 ml) gewaschen, um lose gebundenes BSA zu entfernen. Dieser Waschschritt wird zweimal mit frischem PBS wiederholt. Die Membranproben werden anschließend in 5 ml-Glasröhrchen gegeben und mit 1,0 ml BCA Assay Reagent (Pierce Chemical Co., IL, USA) inkubiert. Die Analysereaktion kann anschließend 16 h lang in einer Schüttelvorrichtung ablaufen. Die optische Absorptionsfähigkeit des Überstands jeder Probe bei 552 nm wird direkt abgelesen und mit einer aus den Absorptionswerten einer Anzahl Lösungen mit bekannter BSA-Konzentration generierten Standardkennlinie verglichen. Der Betrag der an die Membran gebundenen BSA wird anschließend unter der Annahme berechnet, daß die Reaktivität der an der Oberfläche gebundenen BSA gegenüber dem BCA-Reagens im wesentlichen mit der Reaktivität des frei in Lösung gehaltenen BSA identisch ist. Die Ergebnisse werden in Einheiten umol BSA/mL Membran ausgedrückt. Die in Tabelle V aufgeführten Ergebnisse lassen eindeutig einen deutlichen Rückgang der NSB bei den aufgepfropften Proben im Vergleich zu den nicht aufgepfropften Proben erkennen. Darüber hinaus geht aus den Ergebnissen der verschiedenen vorkonditionierten Proben hervor, daß durch die Aufheizung und eine basische Behandlung eine günstige Wirkung bei höheren Niveaus der HEC-Aufpfropfung erreicht werden kann (d. h. bei 4X oder 5X HEC). Die NSB-Ergebnisse für handelsübliche hydrophile und hydrophobe Membranen wurden als Bezugsdokumente mit aufgenommen. TABELLE V Unspezifische Bindung von Rinderserum-Albumin an verschiedene PES/PEO- Membran-Blattprobena
a Sämtliche Werte in ug BSA/mL Membran und werden als Durchschnittswerte aus 4 oder 5 Messungen angegeben
b Siehe Fußnote zu Tabelle IV
c Anlieferungszustand.
Eine grafische Darstellung der -OH-Konzentration in Abhängigkeit vom NSB läßt eine lineare Abhängigkeit und eine gute Korrelation der beiden Parameter erkennen.

6. 3. 3 ERMITTLUNG DER HYDRAULISCHEN PERMEABILITÄTEN (Lp) VERSCHIEDENER MEMBRANPROBEN

Mit Hilfe einer Standard-Permeabilitätszelle wird die Wasserpermeabilität von gemäß Beispiel 6.3 hergestellten 2,5-cm-Membranen bei einem Stickstoffzellendruck von 10 psig ermittelt. Die erforderliche Zeitdauer für den Durchfluß von 3-5 ml Wasser durch jede Probe wird mit einer Stoppuhr gemessen. Anhand des je Zeiteinheit angesammelten Wasservolumens und den Membranabmessungen kann die Lp als 10&sup9; cm³/Dyne sec berechnet werden. Die in Tabelle VI tabellarisch zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß die Membranporen offen und unverstopft bleiben und daß bei den Proben, die mit bis zu 5 Lagen HEC aufgepfropft worden waren, ein erheblicher Teil ihrer ursprünglichen hydraulischen Permeabilität erhalten geblieben war. TABELLE VI Hydraulische Permeabilität verschiedener PES/PEO-Membranprobena
a Sämtliche Werte in Einheiten ·10&supmin;&sup9; cm³ / Dyne sec
b Siehe Fußnote b in Tabelle IV
c Nicht gemessen.

6. 4 KOVALENTE ANBINDUNG VON PROTEIN A UND ANSCHLIESSENDE AUFNAHME VON IgG AUS DER LÖSUNG

Eine bestimmte Anzahl von gemäß Beispiel 6.3 hergestellten Membranscheiben wird weiter für die kovalente Anbindung von rekombinantem Protein A behandelt. Danach wird nachgewiesen, daß die mit Protein A behandelten Membranen humanes IgG binden.

6. 4. 1 ANBINDUNG VON PROTEIN A

Eine Stammlösung aus rekombinantem Protein A wird durch Kombination von 1,5 ml einer 10 mg/ml Protein A-Lösung in entionisiertem Wasser (Repligen Corp., Cambridge, MA, USA) mit 23,5 ml von 30 mM NaHCO&sub3; Puffer mit pH-Wert 8,1 (hergestellt durch Mischen von 0,637 g festem NaHCO&sub3;, 0,055 g festem NaN&sub3; und 0,26 g Tween 80 (Sigma) in 250 ml entionisiertem Wasser) vorbereitet. Die 2,5-cm- Membranscheiben aus Beispiel 6.3 werden in Viertel unterteilt und gemäß Beschreibung in Beispiel 6.1 mit FMP behandelt. Polypropylenrohre, die je 2 der geviertelten FMP aktivierten Membranstücke aufnehmen, werden mit 0,9 ml der gepufferten Protein-A-Stammlösung gefüllt, versiegelt und 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend werden die verbrauchten Protein-A-Lösungen abgeschüttet und zur Proteinanalyse aufbewahrt. Die Membranproben werden zweimal mit frischer 30 mM NaHCO&sub3; Pufferlösung (2 ml) gewaschen, um lose gebundenes Protein zu entfernen, und anschließend bei Raumtemperatur 16 h mit 4 ml einer 30 mM NaHCO&sub3; Pufferlösung geschüttelt, die 1 Gewichts-% Mercaptoethanol enthält, um etwaige nicht reagierte FMP-aktivierte Gruppen zu verbrauchen. Die hieraus entstehenden Proben werden isoliert und zweimal mit 5 ml der nachfolgenden Pufferlösungen gewaschen, die jeweils ebenfalls 0,1 Gewichts-% Tween 80 enthalten: 0,1 M NaHCO&sub3; (pH 8,1), 0,1 M HCL (pH 8,0), 0,1 M Tris HCl mit 0,5 M NaCl (ph 8,0), 0,1 M Glycin HCl mit 0,5 M NaCl (pH 2,5). Anschließend werden sie in 0,1 M PBS (pH 7,4) gelagert, das 0,02 Gewichts-% Natriumazid enthält, bis dieses verbraucht ist (siehe Beschreibung im nachfolgenden Abschnitt).
Die Menge an Protein A, der kovalent an die modifizierten Membranen angebunden ist, kann aus der Menge des in den verbrauchten Protein-A-Lösungen verbleibenden Proteins ermittelt werden. Diese Mengen sind in Tabelle VII aufgeführt. TABELLE VII Menge an gebundenem Protein A an verschiedenen PES/PEO-Membranena
a Sämtliche Werte in Einheiten in mg/mL Membran
b Siehe Fußnote b in Tabelle IV
Die Ergebnisse lassen erkennen, daß die Menge an gebundenem Protein A durch Binden von mehr als einer Schicht HEC an der Menbran zunimmt.

6. 4. 2 BINDEN VON HUMANEM IdG

Mit Membranproben mit angebundenem Protein A, die im vorigen Abschnitt hergestellt wurden, werden wie folgt auf ihre Fähigkeit zur Bindung von humanen IgG untersucht:
Eine Lösung aus Phosphatpufferlösung mit Tween (PBST) mit ph-Wert 7,4 wird hergestellt, indem 8,7 g Trockenphosphatpufferpulver (Kat. Nr. 1000-3, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) und 1 g Tween 80 (Sigma Chemicals) in 1000 ml Wasser gelöst werden. Der pH-Wert der PBST-Lösung wird durch Zusatz von konzentriertem NaOH auf 8,0 eingestellt. Eine Stammlösung mit humanem IgG (Sigma) wird vorbereitet, indem 9,8 mg humanes IgG in 49 ml PBST-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst wird. Jede der in Viertel geschnittenen Scheiben aus Beispiel 6.4.1 wird zusammen mit 1,0 ml der humanen IgG-Stammlösung in ein 4 ml-Propylenrohr eingelegt. Anschließend werden die Röhrchen 2 h lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wird die verbrauchte IgG-Lösung weggeschüttet und die Membranscheiben mit 2 ml PBST mit einem ph-Wert von 7,4 fünfmal in Intervallen von 2 bis 5 min gewaschen, um lose gebundenes IgG zu entfernen. Überschüssiges PBST wird danach entfernt und 0,5 ml einer 0,3 M Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,0 in die Röhrchen gegeben. Danach werden die Röhrchen erneut bei Raumtemperatur 2 h lang geschüttelt, um etwaiges gebundenes IgG zu eluieren.
Am Eluat wird anschließend eine Lowry-Proteinanalyse zusammen mit den zugehörigen Prüfproben durchgeführt. Das aus zwei Stichproben ermittelte Durchschnittsergebnis ist in Tabelle VIII zusammengefaßt. TABELLE VIII Menge an aus mit Protein A modifizierten PES/PEO-Membranproben eluiertem humanem IgGa
a Sämtliche Werte in Einheiten in mg/mL Membran
b Siehe Fußnote b in Tabelle IV
c Nicht gemessen
d Nur eine Messung
Die Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die mit Protein A modifizierte Membran zur wirksamen Bindung von IgG-Molekülen imstande ist. Im Vergleich hierzu ergibt die Durapor(R)-Membran aus dem vorherigen Abschnitt 4,12 mg gebundenes IgG/mL Membran.

6. 5 ERGEBNISSE ZUSÄTZLICHER EXPERIMENTE

6. 5. 1 ERMITTLUNG DER KONZENTRATIONEN DER -OH-GRUPPEN UND NSB

Die PES/PEO-Membranproben, die in Blattform (Nr. 1900-2) nach den in Beispiel 7.13-7.16 (siehe unten) beschriebenen Verfahren vorbereitet wurden, werden in drei Teile untergliedert. Die erste Probe wird in unbehandeltem Zustand belassen, die zweite wird 16 h lang in Wasser bei 95ºC eingelegt und die dritte wird 16 h lang in Wasser bei 95ºC eingelegt und anschließend 16 h lang mit 5 N wäßrigem NaOH bei 95ºC weiterbehandelt. Jede Gruppe wird ihrerseits in drei zusätzliche Gruppen unterteilt: Zustand wie behandelt, 16 h in Acetonitril gewaschen bzw. 16 h in Isopropanol gewaschen. Sämtliche Stichproben werden anschließend mit bis zu vier HEC-Behandlungen (4X) aufgepfropft. Nach jeder Behandlungsphase werden Stichproben zur Ermittlung der -OH-Gruppenkonzentrationen und der NSB-Analysen aufbewahrt.
Separat werden PES/PEO-Hohlfasermembranen, die nach den in Beispiel 7.7. beschriebenen Verfahren vorbereitet wurden, zunächst 16 h lang bei 95ºC in H&sub2;O aufbewahrt, anschließend 16 h bei 95ºC mit 5 N NaOH behandelt und abschließend 15 min bei 121ºC unter Dampf in einem Druckbehälter erhitzt. Danach werden die Fasern in drei Gruppen unterteilt: Zustand wie behandelt, in Acetonitril gewaschen bzw. in Isopropanol gewaschen. Nach dem oben beschriebenen Verfahren werden die einzelnen Fasergruppen anschließend mit bis zu vier Lagen HEC (4X) aufgepfropft. Auch hier werden wiederum Stichproben zur Ermittlung der -OH- Gruppenkonzentrationen und der NSB-Analysen aufbewahrt.
Die Ergebnisse der obigen Experimente sind in Tabelle IX zusammengestellt. TABELLE IX Zusammenfassung der Ergebnisse der Bestimmung der -OH-Gruppen und NSB in verschiedenen Blatt- und Hohlfaser-PESIPEO-Membranprobena
a Sämtliche Werte werden als umol OH oder ug BSA/mL Membran angegeben
b Vorkonditionierungsprotokolle siehe Text in Beispiel 6.5
c Die Ergebnisse werden als Durchschnittswert von drei separaten Proben aufgezeichnet
d entf = nicht gemessen
Entsprechend den zuvor gewonnenen Erkenntnissen ist eine strenge Vorkonditionierung nicht immer erforderlich, um gute Ergebnisse zu erzielen, allerdings lassen sich durch Waschen der Proben in Acetonitril oder Isopropanol bessere Ergebnisse als ohne diese Waschschritte erzielen.

6. 5. 2 ERMITTLUNG DER KONZENTRATIONEN DER -OH-GRUPPEN UND DER Lp

PES/PEO-Blattmembranen aus Chargen-Nr. 2000-8 werden in auf 95ºC erhitztem Wasser und auf 95ºC erhitztem 5 N NaOH 16 Stunden lang entsprechend den obigen Beschreibungen gewaschen. Die Membranen werden anschließend in 10 Gewichts-% EGDGE 4 h lang bei Raumtemperatur in 0,1 M NaOH aktiviert und danach dreimal je 15 Minuten lang mit kaltem Wasser abgewaschen, um nicht reagierendes EGDGE und überschüssiges NaOH zu entfernen. Unterschiedliche Konzentrationen (in Gew.-Prozent) der wasserlöslichen Polymere Hydroxyethylcellulose (HEC) (Natrosol 250 JR, rel. Molekülmasse ca. 100 000, Aqualon Company, Wilmington, Delaware), Hydroxypropylcellulose (HPC) (ref. Molekülmasse ca. 110 000, Aldrich Chemical Co.) und Dextran (Dextran T-70, rel. Molekülmasse 70 000, Pharmacia, Piscataway, NJ, USA), die 0,6 N NaOH und 2 mg Natriumborhydrid/ml Lösung enthalten, werden hergestellt, indem die entsprechenden Bestandteile bei Raumtemperatur gemischt werden und damit eine Lösung hergestellt wird. Zehn blattförmige Membranscheiben mit 2,5 cm Durchmesser, die mit EGDGE behandelt und gewaschen wurden, werden anschließend in 20 bis 25 ml der betreffenden, in Glasprobenflaschen aufbewahrten wasserlöslichen Polymerlösungen gegeben und durch Verwirbeln vorsichtig durchmischt. Das kovalente Aufpfropfen der wasserlöslichen Polymere in die Membranoberfläche bei 60ºC und 90ºC erfolgt, indem die Glasflaschen bei 60ºC bzw. 90ºC 16 Stunden in Öfen eingelegt werden. Außerdem werden Kontrollen durchgeführt, bei denen die Ausgangsmembranen (nur mit Wasser und NaOH behandelt) und die mit EGDGE aktivierten Membranen in Wasser eingetaucht und bei 60 bis 90ºC behandelt werden. Anschließend werden die Glasflaschen aus dem Ofen entnommen; sie kühlen daraufhin ab und werden nacheinander zweimal je 15 Minuten bei Raumtemperatur mit Wasser sowie fünfmal je 15 Minuten bei 65ºC mit heißem entionisiertem Wasser gewaschen, um nicht reagierte wasserlösliche Polymere und überschüssiges NaOH zu entfernen. Die Hydroxylkonzentrationen an den Membranen werden danach in der oben beschriebenen Form ermittelt und die hydraulischen Permeabilitäten gemäß Beschreibung in Beispiel 6. 3. 3 gemessen. Die Ergebnisse sind in der Übersicht in Tabelle X zusammengestellt. TABELLE X Gesamtkonzentration der Hydroxylgruppen und hydraulischen Permeabilitäten von PES/PEO-Blattmembranen (2000-8) nach verschiedenen Oberflächenbehandlungen
a Sämtliche wasserlöslichen Polymere werden in 0,6 N NaOH gegeben; -OH-Konzentrationen in umol -OH/mL; Membran-Lp-Werte in x 10&supmin;&sup9; cm³ /Dyne sec
Die Ergebnisse zeigen, daß entsprechend den Messungen anhand der Hydroxylgruppenkonzentration ein kovalentes Aufpfropfen mit HEC, HPC und Dextran als wasserlösliche Polymere möglich ist. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, daß nach der kovalenten Aufpfropfung in die Membranoberfläche kein nennenswerter Verlust an hydraulischer Permeabilität der Membranen eintritt. Außerdem kann EGDGE durch 1,4-Butanediol-Diglycidylether (BDE), Epichlorhydrin (ECH) oder ähnliche Verbindungseinheiten ersetzt und denselben oben beschriebenen Oberflächen-Aufpfropfverfahren mit oder ohne zusätzlichem Natriumborhydrid unterzogen werden. Eine Analyse der dabei entstehenden Membranen zeigt erneut einen erheblichen Anstieg der -OH-Konzentration sowie eine geringe Änderung des Lp unabhängig vom Vorhandensein von Natriumborhydrid.

6. 6 EXPERIMENTE MIT ZUSÄTZLICHER PROTEINBINDUNG

6. 6. 1 BINDUNG VON HUMANEM IgG AUS EINER MISCHUNG MIT FÖTALEM RINDERSERUM

Nach Beispiel 7. 15 bzw. 7. 6 wird auf die übliche Weise eine bestimmte Anzahl von PES/PEO-Blattmembranen mit 1 Zoll Durchmesser (Nr. 2100-F) und PES/PEO- Hohlfasern (2200-3, -4) hergestellt und 16 Stunden lang in Acetonitril gewaschen, um mit Acetonitril extrahierbare Substanzen zu entfernen. Anschließend werden die blattförmigen Membranen entsprechend der obigen Beschreibung kovalent in einem einzigen Durchgang mit HEC aufgepfropft (1X HEC). Die Hohlfasern werden in der gesponnenen Form ebenfalls in Acetonitril gewaschen, um extrahierbare Substanzen zu entfernen, und zweimal mit HEC beschichtet (2X HEC). Eine handelsübliche Nylon-Blattmembran (Ultipor(R) N&sub6;&sub6;TM Nylon 66, 0,2 Mikron, Los Nr. 301630, Pall Corp., Cortland, New York) wird ebenfalls einmal mit HEC beschichtet. Diese Membran ist nicht Teil der vorliegenden Erfindung. Ein Teil der Membranen wurde anschließend mit FMP aktiviert und bis zur Verwendung in 5 mM HCl gelagert. Rekombinantes Protein A wird nach dem in Beispiel 6. 4. 1 beschriebenen Verfahren auf die mit FMP aktivierten bzw. nicht aktivierten Membranen geladen, wobei der einzige Unterschied darin besteht, daß Tween 80 in der Protein-A-Ladungslösung fehlt. Die Wasch- und Bedeckungsverfahren stimmen mit den vorstehend beschriebenen Verfahren überein. Die Membranen werden anschließend auf ihre Fähigkeit zur Reinigung von humanem IgG aus einer Proteinmischung entsprechend nachstehender Beschreibung geprüft. Eine Stammproteinmischung mit 0,2 mg/ml humanem IgG, die ihrerseits 2% (in Vol.%) fötales Rinderserum (Kat.-Nr. F 4884, Sigma Diagnostics) in einer phosphatgepufferten Salzlösung mit 0,1% Tween 80 enthält, wird ähnlich wie nach dem in Beispiel 6. 4. 2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Membranen mit angehängtem Protein A werden anschließend in Polypropylenröhrchen eingelegt und auf ihre Fähigkeit zum Entzug von humanem IgG aus der Proteinmischung nach dem in Beispiel 6. 4. 2 beschriebenen Verfahren geprüft. Die Menge des aus den Membranen eluierten Proteins wird durch eine Protein-Lowry-Analyse gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß die mit FMP aktivierten Membranen in sämtlichen Fällen im Vergleich zu der nicht aktivierten Kontrollmembran in erheblicher Menge Protein eluiert haben. TABELLE XI Auf mit Protein A behandelten Membranen eluiertes humanes IgG bei der Reinigung von IgG aus einer Mischung von IgG und fötalem Rinderserum
a Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte aus zwei Messungen.

6. 6. 2 ERGEBNISSE MIT SDS-PAGE

Das im vorherigen Beispiel isolierte Protein wird mit Tris-Pufferlösung mit pH-Wert 8,0 (siehe Beispiel 6. 4) neutralisiert und mit Mercaptoethanol reduziert. Eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wird zur Beurteilung der Reinheit des zurückgewonnenen IgG durchgeführt. Jede Bahn des Elektrophoresegels wird mit 50 Mikrolitern der eluierten Lösungen und Kontrollmedien geladen. Fig. 3A-3D zeigen die Ergebnisse der SDS-PAGE nach der Mercaptoethanol-Reduktion und Silberfleckenbildung zusammen mit den Kontrollmedien. Die Kontrollmedien enthalten reines IgG.
Die Bahnen in Fig. 3A weisen folgende Merkmale auf:
Bahn 1: humanes Stamm-IgG 0,2 mg/ml PBST-Puffer; Bahn 2 : 2% fötales Rinderserumalbumin in PBST-Puffer; Bahnen 3 und 4 sind Duplikate der Proteine, die aus der HEC-beschichteten und einer Protein-A-Kopplung unterzogenen Kontrollmembran eluiert wurden; die Bahnen 5 und 6 sind Duplikate der Proteine, die aus der HEC-beschichteten, mit FMP aktivierten und einer Protein-A-Kopplung unterzogenen Membran eluiert wurden; Bahn 7 zeigt eine Stammischung aus humanem IgG und fötalem Rinderserum, bei der eine IgG-Reinigung versucht wurde; Bahn 8 zeigt die Protein-Molekulargewichtsnormale (Sigma Biochemicals). Diese Ergebnisse wurden von modifizierten Nylonmembranen abgeleitet; diese Membranen sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung (siehe Einträge 1 und 2 in Tabelle XI). Fig. 3B zeigt die Ergebnisse für PES-Membranen (Nr. 2200-3, -4). Die Kontroll- und Probenspuren entsprechen der Beschreibung in Fig. 3A. Analog sind die Ergebnisse für Membran 2100-F in Fig. 3C dargestellt (siehe Einträge 5 und 6 der Tabelle XI). Fig. 3D weicht insofern geringfügig von Fig. 3C ab, als die Bahnen 3 und 4 Duplikate der PES/PEO-Membranproben (Nr. 2100-F) darstellen, die vor der Behandlung mit Protein A nicht mit EGDGE aktiviert wurden. Außerdem sind die Bahnen 5 und 6 Duplikate der PES/PEO-Membranen, die mit EGDGE aktiviert und anschließend direkt mit Protein A gekoppelt wurden. Die Kontrollspuren entsprechen der Beschreibung in Fig. 3A.
Die nicht aktivierten Membranen zeigen, daß Proteine fehlen; dies deutet auf eine sehr geringe unspezifische Bindung hin. Diese Ergebnisse treffen für Nylon- PESIPEO-Blattmembranen sowie für Hohlfasern zu. Die kovalent aufgepfropften HEC-Membranen, die einen biologischen Liganden wie Protein A enthalten, können somit ein spezifisches Protein wie IgG aus einer Serummischung reinigend entziehen.

6. 7 DIREKTE KOVALENTE BINDUNG VON PROTEIN A AN MEMBRAN- POLYMERKETTENENDEN

Die PES/PEO-Blattmembran Nr. 2100-F wird mit Acetonitril behandelt und mit EGDGE entsprechend der obigen Beschreibung aktiviert. Die Membranen werden anschließend nach dem EGDGE-Aktivierungsschritt mit 0,6 mg rekombinantem Protein A in 0,1 M NaOH über Nacht bei Raumtemperatur behandelt, um die kovalente Bindung von Protein A an den eingeführten Epoxidgruppen zu erreichen. Eine nur mit Acetonitril behandelte Kontrollmembran wird ebenfalls derselben Protein A-Lösung in 0,1 N NaOH ausgesetzt. Die Membranen werden anschließend wie oben in Beispiel 6. 4 beschrieben gewaschen und zusammen mit den in Beispiel 6. 6 beschriebenen Proben auf ihre Fähigkeit geprüft, humanes IgG aus einem Gemisch von IgG und fötalem Rinderserum reinigend zu entziehen. Die Konzentration an eluiertem IgG entsprechend der Lowry-Analyse ist in Tabelle XII dargestellt. TABELLE XII Aus mit EGDGE aktivierten und mit Protein A geladenen Membranen und Kontrollmedien eluiertes humanes IgG
a Ergebnisse als Durchschnittswerte von zwei Proben
Die Ergebnisse zeigen, daß die mit EGDGE aktivierten Proben wesentlich mehr IgG als die Kontrollmembran binden konnten. Fig. 3D (oben) enthält die SDS-PAGE- Ergebnisse der aus der mit EGDGE aktivierten Membran, der Kontrollmembran und den Gel-Elektrophoresekontrollen eluierten Proteine. Die Ergebnisse zeigen eindeutig die Eluierung von IgG aus der mit EGDGE aktivierten Membran und verdeutlichen das relative Fehlen von IgG aus der Kontrollmembran.

6. 8 LADUNGSMODIFIZIERTE PES-MEMBRANOBERFLÄCHEN

Handelsübliche 2,5 cm-Polysulfonmembranscheiben (Tuffryn-Membranfilter, HT-200, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) werden dreimal mit kaltem Wasser gewaschen, um mit Wasser abwaschbare Substanzen zu entfernen, und anschließend nochmals dreimal mit Isopropanol gewaschen, um mit Isopropanol extrahierbare Substanzen zu entfernen. Die Membranen werden danach über Nacht gewaschen, um mit Acetonitril extrahierbare Substanzen zu entfernen. Danach werden die Membranen mit 10% EGDGE in 0,6 N NaOH vier Stunden lang aktiviert, so daß sich angehängte, kovalent gebundene Epoxidgruppen bilden. Nachdem das überschüssige EGDGE mit entionisiertem Wasser abgewaschen wird, werden einige der Membranen in 2%igem HEC in 0,6 N NaOH eingetaucht, andere in 2% Carboxymethylcellulose (CMC) (Cellulose Gum-CMC, Typ 7LF, Hercules Inc., Wilmington, Del.) in 0,6 N NaOH, wieder andere in 2% Poly(ethylenimin) (PEI) (rel. Molekülmasse 70 000, Aldrich Chemicals, Milwaukee, Wisconsin). Eine als Kontrolle extrahierte Tuffryn- Membran wird ebenfalls in entionisiertem Wasser eingelegt. Sämtliche Membranen werden danach in einem Wasserbad 16 Stunden lang bei 60ºC eingelegt, um die kovalente Aufpfropfung einzuleiten. Die Membranen werden anschließend mit heißem entionisiertem Wasser bei 60ºC gewaschen, um die nicht reagierenden wasserlöslichen Polymere zu entfernen. Danach werden die Membranen mit Hilfe des Standardprotokolls in Beispiel 6. 4. 2 auf ihre Fähigkeit zur Bindung und Eluierung von humanem IgG getestet; dabei gelten jedoch die nachstehenden Abweichungen: Das humane IgG wird in der phosphatgepufferten Salzlösung mit im Verhältnis 1 : 10 verdünntem Tween 80 gelöst. Die Waschvorgänge werden ebenfalls mit demselben verdünnten Puffermedium durchgeführt. Das Eluierungsprotokoll entspricht dem in Beispiel 6. 4. 2 beschriebenen Protokoll. Die Ergebnisse des Eluierungsvorgangs sind in Tabelle XIII dargestellt. TABELLE XIII Aus mit HEC, CMC und PEI behandelter handelsüblicher Tuffryn-Polysulfonmembran und Kontrollmembran eluiertes humanes IgG
a Ergebnisse als Durchschnittswerte von zwei Proben
Die Ergebnisse lassen erkennen, daß ladungsmodifizierte Membranen (Einträge 2 und 3 in Tabelle XIII) besser in der Lage sind, humanes IgG zu binden, als eine einfache hydrophile Oberfläche (HEC).

6. 9 VORBEREITUNG VON MODULEN. DIE MODIFIZIERTE HOHLFASERMEMBRANEN ENTHALTEN

Die PES/PEO-Hohlfasermembranen (Charge Nr. 2300-6) werden entsprechend der Beschreibung in Beispiel 7.2 hergestellt. Ca. 100 45,7-cm-Fasermembranen werden in einen 2-Liter-Becher gegeben. Anschließend werden die Membranen auf normale Weise mit heißem Wasser 16 Stunden bei 95ºC sowie anschließend mit 5 N NaOH 16 Stunden bei 95ºC gewaschen, um die funktionellen endständigen Gruppen an der Oberfläche zu maximieren. Proben der mit NaOH behandelten Faser werden zu Analysezwecken aufbewahrt. Die restlichen Fasern werden mit EGDGE aktiviert und in der oben beschriebenen Form einmal mit HEC (1X HEC) aufgepfropft. Nach dem Waschen mit heißem Wasser werden die Fasern in zwei Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe wird in kaltem Wasser gewaschen, die zweite Gruppe in Acetonitril. Die zweite Fasergruppe wird anschließend in kaltes Wasser eingelegt. Beide Fasergruppen werden danach ein zweites Mal mit HEC aufgepfropft, in heißem Wasser abgewaschen, um nicht reagierendes HEC zu entfernen, und anschließend in kaltem Wasser und Acetonitril in der oben beschriebenen Form gewaschen. Dieser Vorgang wird nochmals wiederholt, um eine dreimal mit HEC beschichtete (3X HEC) PES-Faser herzustellen. Danach werden die Proben nochmals in Wasser und Acetonitril gewaschen. Aus jeder Behandlungsphase werden Proben zur Ermittlung der Hydroxylgruppenkonzentration und unspezifischen Bindung sowie zur Ermittlung der Permeabilität und Protein-A-Kopplung bzw. Bindung und Eluierung von humanem IgG aufbewahrt. Die Ergebnisse der Hydroxylgruppe und der unspezifischen Bindung von Rinderserum-Albumin sind in Tabelle XIV angegeben. TABELLE XIV Hydroxylgruppen-Gesamtkonzentration (OH-Konz.) und unspezifische Bindung (NSB) von PES/PEO-Hohlfasern (2300-6) nach unterschiedlichen Oberflächenbehandlungen
* Die NSB war sehr gering, d. h. ihr konnte nur schwer ein quantitativer Wert zugewiesen werden. Die -OH-Konzentrationen werden als umol -OH/ml Membranvolumen angegeben, die NSB- Werte als ug Monomer-BSAImI Membranvolumen.
Die Fasern (2300-6) weisen vor dem Einbetten des HEC eine Ausgangspermeabilität im Bereich von 900 · 10&supmin;&sup9; cm³/Dyne sec auf. Nach der Einbettung von drei Lagen HEC liegt die Permeabilität immer noch im Bereich von 290 bis 300 · 10&supmin;&sup9; cm³/Dyne sec. Dieses Ergebnis verdeutlicht erneut die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung, bei der durchweg die kovalente Aufpfropfung in die Oberflächenschichten begrenzt wird und die Poren der Membran dabei jedoch nicht verstopft werden. Die Fasern, die dreimal mit HEC beschichtet wurden und dazwischen mit Acetonitril gewaschen wurden, werden anschließend in einem Becher mit FMP aktiviert und an der Luft getrocknet. Ein hohles Polysulfonmodul wird mit 0,5 ml der Membranen gefüllt. Anschließend wird rekombinantes Protein A mit dem Inhalt des Moduls gekoppelt. Das Modul wird dann auf seine Fähigkeit zur Aufnahme von humanem IgG aus der IgG-haltigen Phosphatpufferlösung untersucht. Nachdem das Modul mit humanem IgG gefüllt und das nicht gebundene IgG abgewaschen wurde, eluiert das Modul 4,0 mg IgG, was eine Membrankapazität von 8,0 mg IgG/ml Membranvolumen ergibt.

6. 9. 1 IMMUNAFFINITÄTSREINIGUNG VON FAKTOR VIII (FVIII)

Zweihundertsechzig 55,9-cm-Hohlfasermembranen (Charge Nr. 2400-5), die nach dem in Beispiel 7. 6 beschriebenen Verfahren vorbereitet werden und eine hydraulische Permeabilität von 500 · 10&supmin;&sup9; cm³/Dyne Sec aufweisen, werden 16 Stunden in zwei Litern heißem Wasser bei 95ºC getränkt. Danach werden die Fasern in einem Dampfkessel 15 min lang bei 121ºC dampfbehandelt. Anschließend werden sie 16 Stunden bei Raumtemperatur in Acetonitril getränkt, mit kaltem Wasser abgewaschen und 4 h mit 0,6 N NaOH behandelt, das 10% EGDGE enthält. Nachdem das überschüssige EGDGE mit kaltem entionisiertem Wasser abgewaschen wurde, werden die Fasern bei 75ºC 3 h lang in 0,6 N NaOH getränkt, das 2% HEC enthält, und danach mit heißem entionisiertem Wasser bei 55ºC (zur Entfernung von nicht reagierendem HEC und überschüssigem NaOH) gewaschen. Anschließend werden die Fasern entsprechend der Beschreibung in Beispiel 6. 1 mit FMP behandelt und an der Luft getrocknet. Die hydraulische Permeabilität der mit FMP aktivierten Fasern beträgt 138 · 10&supmin;&sup9; cm³/Dyne sec bei einem durchschnittlichen mittleren Porendurchmesser von 0,30 um (laut Messung mit einem Coulter(R) Porometer). Die Fasern weisen außerdem eine Hydroxylkonzentration von 32,4 umol/ml Membran auf. Anschließend wird ein Hohlfasermodul mit einem internen Volumen von 1,5 ml hergestellt, indem mehrere nach obigem Verfahren behandelte Fasern zu einem Polysulfonmodul gepackt werden. Das endgültige Fasermembranvolumen beträgt 0,5 ml.
Eine NaHCO&sub3; Pufferlösung (pH-Wert 8,1, 15 ml), die 0,3 mg Anti-FVIII-Antikörper/ml enthält, wird durch Verdünnen von Anti-FVIII-Antikörpern (die als Ascites-Flüssigkeit ESWF 7 von American Diagnostic, New York, NY, bezogen und mit einer Protein-A- Säule gereinigt wird) mit einem Bicarbonatpuffer (nach Beispiel 6. 4. 1 hergestellt) gereinigt, wobei die resultierende Lösung durch Ultrafiltrierung konzentriert und die konzentrierten Antikörper auf die geeignete Konzentration verdünnt wird. Die Antikörperlösung wird anschließend bei Raumtemperatur mit einer Peristaltikpumpe 16 Stunden durch das Fasermodul umgewälzt. Die lose gebundenen Antikörper werden durch Waschen des Moduls mit Natriumbicarbonat-Pufferlösung entzogen.
Nicht reagierende FMR-Gruppen werden mit dem für Protein A in Beispiel 6. 4. 1 beschriebenen Verfahren entzogen, außer daß die Pumpe zum Umwälzen von Lösungsmittel und Reagentien verwendet wird. Das Modul, das kovalent gebundene Antikörper enthält, wird danach in der nachstehend beschriebenen Weise auf seine Fähigkeit zur Aufnahme von FVIII geprüft.
FVIII-Konzentrat (1,3 U/mg Protein, Hyland Laboratories, Inc., Kalifornien) wird mit 0,015 M Citratpuffer (pH-Wert 7,0), die 0,15 M NaCl enthält, auf 0,76 U/ml verdünnt. Die verdünnte Pufferlösung wird mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min einmal durch das Fasermembranmodul geleitet. Insgesamt 22,9 ml (17,3 U) Pufferlösung werden durch das Modul geleitet. Das Filtrat wird zur Analyse des Proteingehalts aufbewahrt. Anschließend wird die Vorrichtung mit einer Pufferlösung ausgewaschen, die 0,015 M Natriumcitrat und 0,15 M NaCl (pH-Wert 7,0) enthält, bis die Absorptionsrate mit 280 nm während der Waschvorgänge vernachlässigbar ist, was darauf hindeutet, daß sich kein lose gebundenes Protein mehr vom Modul löst (ca. 30 ml). Das gebundene FVIII wird anschließend mit einer Pufferlösung eluiert, die 1 M Kl, 1 M Lysin, 20 nM Imidazol und 5 nM CaCl&sub2; (pH-Wert 6,5) enthält. Danach werden das Filtrat und Eluat separat unter Verwendung von Stratchrom(R) FVIII: C Anti-hemophilic Factor Chromogenic Assay (Diagnostica Stago, 6ter, rue Denis Papin, 92600 Asnieres, Frankreich) auf FVIII: C-Aktivität analysiert. Es wurde festgestellt, daß das Filtrat 3, 3 U enthält, was darauf hinweist, daß 81% der angelegten FVIII vom Modul zurückgehalten werden. Die Eluatfraktion (3,8 ml) enthielt insgesamt 8,0 U einer FVIII: C-Aktivität, was einer Gesamtrückgewinnungsrate von 46% FVIII: C-Aktivität entspricht. Es wird angenommen, daß sich die Differenzmenge der ursprünglich angelegten FVIII in den Pufferauswaschungen befindet. Spezifische FVIII: C-Aktivitäten des Ausgangsmaterials (1,3 U/mg Protein) und eluierten FVIII (150 U/mg Protein) werden anhand der FVIII-Aktivität und Proteinkonzentration entsprechend der Lowry- Proteinanalyse ermittelt und ergaben einen Reinigungsfaktor von 115. Das obige Verfahren wurde nicht optimiert und könnte sicherlich durch Absenkung der Durchflußmenge unter Umwälzung der gepufferten Proteinlösung oder z. B. durch Ändern der Pufferlösungsbestandteile verbessert werden.
Es gilt als festgelegt, daß die hierin beschriebene Erfindung, die Gegenstand der Ansprüche ist, nicht auf die Immunoaffinitätsreinigung von FVIII als Ligat beschränkt ist. Die Isolierung und Reinigung anderer Ligate, insbesondere solcher mit biologischer Bedeutung, durch Verfahren, die den oben beschriebenen Verfahren ähneln, sind im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen. Als Beispiele von Ligaten, die durch Immunoaffinität und biospezifische Erkennung gereinigt werden können, sind (ohne hierauf beschränkt zu sein) Gewebeplasminogen-Aktivator, humaner Koagulationsfaktor IX, Hormone, Interleukine sowie sonstige menschliche und tierische Proteine sowie weitere in Kapitel 5 beschriebene Substanzen zu nennen.

6. 10 MODIFIZIERUNG VON HANDELSÜBLICHEN BLATTÄHNLICHEN UND HOHLFASERMEMBRANEN

Handelsübliche Polysulfon-Blatt- und Hohlfasermembranen werden wie folgt zum Nachweis der allgemeinen Anwendbarkeit dieser Erfindung modifiziert.
Die 0,2-Mikron-Polysulfon-Hohlfasermembran (Modell CFP-2-E-4, AG Technology Corp., Needham, Mass.) wird aus dem Mikrofilterungsmodul entnommen und zwei Wochen in Isopropanol ausgewaschen, um mit Isopropanol extrahierbare Substanzen zu entfernen. Ein Teil der Membranen wird außerdem über Nacht 16 Stunden lang gewaschen, um mit Acetonitril extrahierbare Substanzen zu entfernen. Die handelsübliche 0,45-Mikron-Blatt-Polysulfonmembran (HT-450 Tuffryn, 25 mm Durchmesser, Produkt-Nr. 66221, Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan) wird zuerst mit Wasser gewaschen, um mit Wasser extrahierbare Substanzen zu entfernen, und über Nacht mit Isopropanol gewaschen, um mit Isopropanol extrahierbare Substanzen zu entfernen. Ein Teil der Membranen wird außerdem über Nacht 16 Stunden lang gewaschen, um mit Acetonitril extrahierbare Substanzen zu entfernen.
Ein Teil der Membranen aus jeder Behandlung wird anschließend, nachdem zuerst eine 16stündige Behandlung mit 10% EGDGE in 0,6 N NaOH erfolgt ist, mit HEC aufgepfropft. Danach werden die Proben mit heißem Wasser gewaschen und für die Bestimmung der Hydroxylgruppen und BSA-NSB aufbewahrt. Tabelle XV enthält die Ergebnisse der -OH-Gruppen-Konzentration und BSA-NSB dieser Membranen in unterschiedlichen Phasen der Oberflächenbehandlung. Sämtliche Messungen werden in einer einzigen Experimentalmatrix mit der handelsüblichen Kontrollmembran durchgeführt. TABELLE XV Hydroxylgruppen-Gesamtkonzentration (-OH Konz.) und unspezifische BSA-Bindung (NSB) an handelsüblichen Polysulfon-Fasermembranen (AG Technology) und handelsübliche Polysulfon-Blattmembran (TuffrynTM) nach unterschiedlichen Oberflächenbehandlungen
NM = nicht gemessen
OH-Konzentrationen in umol -OH/mL; Membranvolumen
NSB-Werte in ug monomeres BSA/ml Membranvolumen

7. PROZESSE FÜR DIE HERSTELLUNG VON MEMBRANEN

7. 1 VORBEREITEN DES DOPE-MITTELS UND POLYMERTROCKNUNGSVERFAHREN

Zum Vorbereiten des Dope-Mittels werden die beiden in der Mischung verwendeten Polymere gewichtet und vorbehandelt. PES, das auch als Victrex (ICI America, Sorte 5200P, in 15 kg-Säcken geliefert) bekannt ist, wird 3 h in einem Ofen bei 150ºC getrocknet und kann anschließend mehrere Stunden auf 60ºC abkühlen. Die Gesamterhitzungszeit im Ofen beträgt nicht weniger als 24 h. PEO (Polyox 301, MW 4000 kD, von Union Carbide Corp., wird in 140 lb-Fässern geliefert) wird in einem Vakuumofen ca. 24 h bei Raumtemperatur vorbehandelt. Dabei ist darauf zu achten, daß die vorbehandelten Polymere nicht längere Zeit an der offenen Luft verbleiben, bevor sie in den Mischapparat gegeben werden.
NMP (d. h. N-Pyrol, Kat. Nr. 1-3-72755/000 & 5-72, von GAF Chemicals Corp., in 55- Gallonen-Fässern geliefert) und Glycerin (Baxter Scientific Product Group, Mallincrodt, Katalog-Nr. 5092-4, Analytisches Reagens) werden im Anlieferungszustand verwendet, allerdings sind besondere Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, um die Aufnahme atmosphärischer Feuchtigkeit zu minimieren, indem diese Mittel dem Mischapparat unmittelbar nach der Entnahme aus den entsprechenden Behältern zugegeben werden. Wenn die Mittel nicht gebraucht werden, sind ihre Behälter dicht zu verschießen.

7. 1. 1 MISCHVERFAHREN

NMP (2812 g) und Glycerin (1128 g) werden in einem 1-Gallonen-Behälter vorgemischt, bevor sie bei Raumtemperatur in einen Ross-Mischapparat (Modell PVM2) gegeben werden. Der Ross-Mischapparat ist mit einer Quelle zum Spülen mit Stickstoff versehen. Die inerte Atmosphäre wird über sämtlichen Flüssigkeiten aufrechterhalten, bis das PEO zugegeben wurde. Nachdem vorgemischtes NMP/Glycerin in den Ross-Mischapparat gegeben wurde, werden zwei der Mischschaufeln in Betrieb gesetzt; die Ankerschaufel mit 135/min. die Dispersionsschaufel mit 3500/min. PEO (360 g) wird zugegeben, während der Mischvorgang bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von ca. 1 Minute abläuft. Anschließend wird ein 500-Gramm-Anteil des NMP zugesetzt, so daß das Dope-Mittel insgesamt 3312 Gramm NMP enthält. Jetzt wird die Dispersionsschaufel abgeschaltet und der Mokon-Wärmetauscher auf 120ºC eingestellt. Nach 3 h Mischdauer wird das PES (1200 g) über einen Zeitraum von 2-3 Minuten zugegeben und die Temperatur aufgezeichnet; die Ankerschaufeldrehzahl wird dabei auf 135/min gehalten. Nach weiteren 18 h wird ein stetiger Temperaturabfall eingeleitet, indem der Mokon-Wärmetauscher auf 60ºC eingestellt wird. Innerhalb von ca. 1,5 h nach Beginn dieser Temperaturänderung erreicht das Dope-Mittel im allgemeinen eine Temperatur von ca. 75 +/- 5ºC, wobei allmählich ein Vakuum angelegt und die Mischung entgast wird. Ein vollständiges Vakuum ist im allgemeinen innerhalb von 15 Minuten erreicht und wird weitere 5 Minuten aufrechterhalten. Anschließend wird der Mischapparat abgeschaltet und dabei die Entgasung fortgesetzt. Ein Vakuum wird noch weitere 1-2 Minuten aufrechterhalten, bevor Stickstoff zugesetzt und damit im Mischbehälter bei 60ºC wieder atmosphärischer Druck hergestellt wird.
Dieses vorbereitende Verfahren ergibt typischerweise eine Dope-Mittelviskosität von ca. 100 000 (+/- 20 000) cps bei 60ºC. Gelegentliche Abweichungen von den Sollwerten kommen jedoch vor, scheinen aber keine negativen Auswirkungen auf die Membraneigenschaften mit sich zu bringen. Ein derartiges Dope-Mittel weist gemäß Fig. 4 Phasengrenzen bei ca. 78ºC (LCST) und ca. 57ºC (UCST) auf.

7. 2 HOHLFASERSPINNEN VON RELATIV ISOTROPEN MIKROPORÖSEN MEMBRANEN, INSBESONDERE FÜR AFFINITÄTSANWENDUNGEN

Entsprechend den oben beschriebenen Grundzügen wird ein Dope-Mittel vorbereitet, dessen Viskosität mit 123 000 cps bei 60ºC ermittelt wurde. Dieses Dope-Mittel wird durch die in Fig. 5 schematisch dargestellte Coextrusions-Spinndüse extrudiert. Die Spinndüsentemperatur wird während der Dauer des Experiments auf 80ºC gehalten. Zu den weiteren unveränderlichen Parametern zählen vorzugsweise:
- Dope-Mittel-Pumpgeschwindigkeit - ca. 70/min
- Abschreckbadtemperatur - ca. 90ºC
- Zusammensetzung des Abschreckbades - entionisiertes Wasser (Dl- Wasser)
- Zusammensetzung der intraannularen Flüssigkeit - ca. 70% NMP: 30% Dl- Wasser (in Vol.%)
- Zusammensetzung der extraannularen Flüssigkeit - ca. 70% NMP: 30% Dl- Wasser (in Vol.%)
- Flüssigkeitsdurchflußmenge im Ring - ca. 30,2 (+/- 1, 2) ml/min
- Erste und zweite Godet-Badtemperaturen - ca. 42,5 (+/. 2,5)ºC
Weitere Parameter, die bei diesem Experiment ebenfalls variiert werden können, sind: Luftspalt bzw. Spinndüsenhöhe über dem Abschreckbad (was eine Veränderung der Faseraufnahmerate bzw. der Faserproduktionsrate in linear feet je Minute bewirkt) sowie Flüssigkeitsdurchsatzmenge außerhalb des Rings. Der letztere Wert variiert zwischen 0 und 66 mllmin, während die Spinndüsenhöhen zwischen 3 und 7 Zoll variieren. Hierbei ist zu beachten, daß die Spinnanlage nur zwei Godet-Bäder enthält. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 7 sowie in der Datentabelle dargestellt, die als Teil der Abbildung zu den Fasern 2500-1 bis -11 eingefügt wurde. Eine ausgeprägte Abhängigkeit der hydraulischen Permeabilität der Membran (Lp) für Dl-Wasser ist bei der extraannularen Flüssigkeitsdurchflußmenge offenkundig. Faser 2500-1, deren extraannulare Flüssigkeitsdurchflußmenge gleich Null ist, entspricht einer Faser, die mit einer herkömmlichen Spinndüse mit Hülse in der Düse hergestellt wurde.
Diese Abhängigkeit der Lp von der extraannularen Flüssigkeitsdurchflußmenge kann mit einem Teil desselben Dope-Mittels wie das in Fig. 7 verwendete Dope-Mittel reproduziert werden (siehe Tabelle XVI zu den Fasern 2600-1 bis -9). TABELLE XVI Hydraulische Permeabilität von Hohlfasern in Abhängigkeit von der extraannularen Durchflußmenge
Die Faserprobe 260-6 wird auf elektronenmikroskopischemm Wege untersucht; Poren im Bereich 1-3 um werden auf den beiden Oberflächen festgestellt (Siehe Fig. 9). Die Porengesamtverteilung in der Matrix der Faserwand (ca. 300 um) variiert innerhalb eines Bereichs von ca. 1-2 Größenordnungen, doch liegt die überwiegende Mehrheit der Poren größenmäßig innerhalb von ca. 1 Größenordnung zueinander. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß diese Membran ein Beispiel für eine im wesentlichen hautlose, relativ isotrope mikroporöse Membran ist. Demgegenüber weist Faser 2600-5 (die ohne die extraannulare Flüssigkeit hergestellt wird) eine weitaus ausgeprägtere anisotrope mikroporöse Membranstruktur auf.
Faser 2600-6 und weitere aus dieser Charge werden anschließend in einen Druckbehälter gegeben und durch Aufpfropfen einer Verbundbeschichtung auf den gesamten Innen- und Außenflächen mit hydrophilen Eigenschaften versehen; sie werden dann mit Erfolg in Experimenten zur Affinität und Bioseparierung eingesetzt. Die 1,5 ml-Hohlfasermodule, die ein Membranvolumen von 0,5 ml aufweisen, werden kovalent funktionalisiert, so daß der Protein-A-Ligand verknüpft werden kann. Die IgG-Kapazität derartiger Module wurde mit 7 und 8 mg/ml (für Module Nr. 13 bzw. 14) ermittelt, während die unspezifische Bindung von fötalen Kalbsserumproteinen eine Kapazität von ca. 1 mg/ml aufweist. Die unspezifisch gebundenen Proteine können aufgrund der hydrophilen Wirkung problemlos von den Membranoberflächen abgewaschen werden. Hohe Ladungskapazitäten können mit dieser Faser aufgrund der 300-Mikron-Wandstärke erreicht werden, während die hohe hydraulische Permeabilität für DI-Wasser sowohl nach der Hydrophilierung als auch nach der chemischen Aktivierung erhalten bleibt. Die Module Nr. 13 und 14 weisen beispielsweise Lp-Werte von 314 · 10&supmin;&sup9; bzw. 191 · 10&supmin;&sup9; cm³ /Dyne sec auf. Nachdem der Protein A-Ligand angelegt wird, beträgt der Lp-Wert 149 · 10&supmin;&sup9; cm³ /Dyne sec bei Modul Nr. 14.
Mit diesen Membranen kann ein breiter Bereich von Mikrofilterungs- und Ultrafeinfilterungsanwendungen abgedeckt werden (mit oder ohne weitere Oberflächenmodifikation oder Hydrophilierung), während die relativ geringen Proteinbindungsoberflächen ein Verstopfen oder Unbrauchbarwerden der Matrix minimieren. Von besonderer Bedeutung ist hierbei die Verwendung der relativ isotropen mikroporösen Fasern (z. B. Faser 2600-6) für die Zellseparierung. Diese Separierung der Zellen von der umgebenden Flüssigkeit ist bei sehr hohen Durchflußwerten ohne übermäßigen Abfall der hydraulischen Permeabilität erreichbar, wie es typischerweise bei handelsüblichen Hohlfasern zu beobachten ist. Zu den Beispielen dieser Zellenseparierung zählen: Klärung der Zellenbouillon und der konditionierten Medien (wobei die Affinitätsbindung und Klärung kombiniert und damit die Zahl der Operationen je Einheit bei der Proteinreinigung gesenkt werden kann), sowie Separierung der Blutzellen für medizinische Anwendungen.
Der Bereich der extraannularen Durchflußmenge, der in diesem Beispiel (d. h. Fig. 7) demonstriert wurde, wobei die Kombinationen von Dope-Mittel und extraannularer Ring-Flüssigkeit einen Viskositätsunterschied von mehr als fünf Größenordnungen abdecken, ist mit der in U. S. Patent Nr. 4,493,629 beschriebenen modularen Spinndüse nicht möglich.

7. 5 VERSUCH DER HERSTELLUNG EINER MEMBRAN MIT NIEDRIGEM FESTSTOFFGEHALT BEI UNTERSCHIEDLICHEN SPINNDÜSENTEMPERATUREN

Mit dem in Beispiel 7. 1 beschriebenen grundlegenden Basisprotokoll wird ein Dope- Mittel mit relativ niedrigem Gesamtfeststoffgehalt hergestellt, allerdings werden für das Dope-Mittel folgende Zutaten verwendet: 900,1 g PES: 193,8 g PEO (4000 kD); 1326,1 g Glycerin; sowie 3580,2 g NMP. Die Viskosität dieses Dope-Mittels beträgt 14 000 bei 60ºC. Es wurden folgende Trübungspunktgrenzen festgestellt: LCST ca. 68ºC, UCST ca. 55ºC. In diesem Experiment gilt besondere Aufmerksamkeit den Auswirkungen der Spinndüsentemperatur, der Zusammensetzung der extraannularen Flüssigkeit sowie der Durchflußrate auf die Fasereigenschaften und Spinnbarkeit (siehe Tabelle XX).
Bei niedrigen Spinndüsentemperaturen (38ºC) können keine geeigneten Fasern eingefangen werden, die auf Lp geprüft werden können. Diese Situation besteht sowohl mit als auch ohne eine Schwelle von 70% NMP in Wasser als extrannulare Flüssigkeit während der Dope-Mittel-Extrusion. Die Spinnbarkeit (Extrudierbarkeit) verbessert sich bei höheren Temperaturen (z. B. 49ºC) deutlich, die Faserqualität bleibt allerdings weiterhin mangelhaft. Bei Spinndüsentemperaturen im Bereich von 82ºC entstehen Fasern mit einer vollständig mikroporösen Wandstruktur (d. h. ohne Makroporen oder "Doppelwandstrukturen"). Der positive Effekt, eine extraannulare Flüssigkeit in Kombination mit hohen Spinndüsentemperaturen herzustellen, wird in exemplarischer Weise durch einen Vergleich der Faserproben 2900-13 und -14 deutlich. TABELLE XX Spinnparameter für die Faserherstellung mit Dope-Mitteln mit geringem Gesamtfeststoffgehalt

7. 6 DARSTELLUNG EINER EINHEITLICHEN PORENGRÖSSE MIT COULTER- POROMETER

Die bevorzugte Dope-Mittel-Zusammensetzung mit einer Viskosität von 135 000 cps bei 60ºC wird auf die übliche Weise vorbereitet. Dieses Dope-Mittel wird mit der Coextrudierspinndüse aus Fig. 5 zu Hohlfasern extrudiert. In Tabelle XXI sind die Fertigungsbedingungen für die Fasern 2200-1 bis -7 sowie die resultierenden Hohlfasermembran-Permeabilitäten und Faserabmessungen aufgeführt. In Fig. 8 sind die Porengrößenverteilungsdaten für Faserprobe 2200-3 und -4 angegeben, die mit einem Coulter-Porometer (Hersteller: Coulter Electronics Limited, UK; dieses Gerät basiert auf der Blasenpunkttechnologie für die Ermittlung der Porengröße) generiert werden. Der präzise Wert der maximalen Porengröße stimmt zwar nicht genau mit dem durch Sichtprüfung der Rasterelektronenmikrografien ermittelten Wert überein, bei dem Oberflächenporen mit einer Größe von 1-2 um festgestellt wurden, doch verdeutlicht Fig. 8 die relative isotropische Struktur dieser Membranen. Es liegt also eine sehr enge Porengrößenverteilung vor. TABELLE XXI Prozeßparameter für Membranen 2200-1 bis -7
Oberflächenmodifizierte Versionen der Faserproben 2200-3 und -4 werden als Affinitätsträgermedien für die IgG-Reinigung aus Proteingemischen mit Hilfe eines kovalent immobilisierten Protein-A-Liganden verwendet.

7. 13 GIESSEN VON BLATTFÖRMIGEN MEMBRANEN ZUR HERSTELLUNG GEEIGNETER STRUKTUREN FÜR UNTERSCHIEDLICHE ANWENDUNGSZWECKE

Eine Dope-Mittel-Zusammensetzung wird nach Beispiel 7. 5 hergestellt. Die Viskosität dieses Dope-Mittels beträgt 17 300 cps bei -60ºC. Blattmembranen werden auf einer Gießvorrichtung hergestellt, die mit einem Mylarband für kontinuierliche Fertigung ausgerüstet ist. Die wichtigsten Parameter im Gießprozeß sind auf die nachfolgenden Werte festgelegt:
- Dotiertiegel/-leitungstemperatur 70ºC
- Abschreckbadtemperatur 85-90ºC
Auffüllgeschwindigkeit für Abschreckbad 7,56 l/min
- Messerspalt 0,32 mm (das Messer wird vor der Verarbeitung jeder Charge in einem Ofen auf 70ºC aufgeheizt und während des Gießprozesses mit Aluminiumfolie abgedeckt, um die Feuchtigkeitsaufnahme durch im Hohlraum oder dem Messerfach verbleibendes Dope-Mittel zu minimieren)
- Zahnradpumpendrehzahl 108/min (für Förderung von Dope-Mittel in den Messerkasten)
- Wasserbadtemperatur 25ºC
- Waschbad-Auffüllgeschwindigkeit ca. 5 gal/min
- Verweildauer des Films im Waschbad ca. 15 min
- Chargen-Durchlaufzeit 2 min
- Luftspalt ca. 7,6 cm
- Zusätzliche (langsame) Waschzeit - über Nacht
Bei diesem Experiment werden drei Gießgeschwindigkeiten untersucht, um die Auswirkung dieses Parameters auf die Eigenschaften der blattförmigen Membranen 3700-1 bis -6 zu untersuchen. In Tabelle XXVII wird dieser Effekt dargestellt; hier ändern sich sowohl das Lp für Wasser als auch die Porengrößenverteilung (anhand von Porometrieexperimenten) in Abhängigkeit von der Gießgeschwindigkeit (zwischen 5 und 15 ft/min). Mit der Gießgeschwindigkeit kann somit die Porengröße und die Struktur dieser im wesentlichen hautlosen, relativ isotropen mikroporösen Membranen gesteuert werden. TABELLE XXVII Merkmale der Membranchargen-Nr. 3700-1 bis -6

7. 14 VORBEREITUNG DER MEMBRANCHARGE NR. 1600-1 BiS -6

Es werden blattförmige Membranen mit dem entsprechenden, im obigen Beispiel beschriebenen Dope-Mittel und Gießverfahren hergestellt. Die Membranchargen 1600-1 bis -6 werden mit einer Gießgeschwindigkeit von 152,5 cm/min hergestellt und in einer Reihe von Oberflächenmodifikations- und
Affinitätsreinigungsexperimenten verwendet. Die physikalischen und Leistungsdaten dieser Membranen sind in Tabelle XXVIII dargestellt. Die Ermittlung des Oberflächenquerschnitts durch BET und Quecksilberporosimetrieverfahren ist ebenfalls angegeben. TABELLE XXVIII PHYSIKALISCHE UND LEISTUNGSDATEN DER MEMBRANEN 1600-1 bis -6 Porengrößenverteilunpa
a Mit Coulter-Porometer ermittelt und in um angegeben.
b Quecksilber-Porosimeter-Methode
c Brunauer-Emett-Teller-Stickstoffadsorptionsverfahren

7. 15 ZUSÄTZLiCHE MEMBRANCHARGEN

Die blattförmigen Membranen 3800-1 bis -3 werden wie oben hergestellt, außer daß die Abschreckbadtemperatur auf 81ºC eingestellt ist. Die Lp für Dl-Wasser durch diese Membranen wurde im Bereich von 1000 · 10&supmin;&sup9; cm³/Dyne sec ermittelt. In ähnlicher Weise wurde für die Chargen-Nr. 2100-A bis -G eine Lp von 981 bei 1600 · 10&supmin;&sup9; cm³/Dyne sec ermittelt. Eine Abschreckbadtemperatur von 85ºC und eine Gießgeschwindigkeit von 5 ft/min werden eingehalten. Die Membranchargen Nr. 2000-1 bis -8 werden wie oben bei einer Abschreckbadtemperatur im Bereich zwischen 83 und 86ºC hergestellt. Es wurde eine hydraulische Permeabilität von 500-> 1000 · 10&supmin;&sup9; cm³/Dyne sec ermittelt. Darüber hinaus ergab sich bei der Porometeranalyse ein Porengrößenbereich von 0,14 bis 0,67 um.

7. 16 HERSTELLUNG AUSGEFÄLLTER DÜNNSCHICHTMEMBRANEN

Es wird ein 29 g-Dope-Mittel hergestellt, indem alle vier Bestandteile gewichtsmäßig direkt bei Raumtemperatur in einen 50 ml-Rundkolben gegeben werden. Der Inhalt dieses Kolbens wird mit Hilfe eines Motors mit hohem Drehmoment mit Glaswelle und Teflonrührschaufel über Nacht bei einer Temperatur zwischen 60 und 90ºC umgerührt. Die Entgasung erfolgt, indem das heiße Dope-Mittel einige Stunden stehengelassen wird. Vorzugsweise sollte das Entgasen bei 60ºC erfolgen, da die meisten Untersuchungen eingeleitet werden, wenn sich das Dope-Mittel in der Einphasenregion des Trübungspunktphasendiagramms befindet.
Derartige Dope-Mittel werden zur Ermittlung der Trübungspunktphasendiagramme verwendet, wobei die Viskositäten durch Auswahl der Spin-Dope-Mittel- Zusammensetzungen und Herstellung handgegossener Filme ermittelt werden. Zu letzterem Zweck werden der Rundkolben, der das Dope-Mittel enthält, eine transparente Glasplatte und eine Gardner-Schaufel in einem Ofen oder auf einer Heizplatte bei 60ºC konditioniert. Eine geringe Menge des Dope-Mittels wird auf die Glasplatte aufgestrichen und soweit ausgestrichen, daß noch bei 60ºC ein flüssiger Film mit einer Dicke von ca. 10 mil entsteht. Der Lösungsfilm auf der Glasplatte wird in einem Abschreckbad bei 85ºC rasch abgeschreckt. Es bildet sich sofort ein weißer ausgefällter Film, der typischerweise innerhalb etwa einer Minute von der Glasplatte abschwimmt. Dieser Film wird dann in laufendem, warmem Leitungswasser über Nacht abgewaschen, bevor weitere Tests durchgeführt werden.

7. 17 AUSWIRKUNG DER ABSCHRECKBADTEMPERATUR AUF DIE STRUKTUR DER AUSGEFÄLLTEN DÜNNFILMMEMBRAN

Nach der obigen Anweisung wird ein Vierkomponenten-Dope-Mittel mit folgender Zusammensetzung hergestellt:
PES (15 Gewichts-%). PEO (4000 kD, 4, 5 Gewichts-%), Gylcerin (20,4 Gewichts-%) und NMP (60,1 Gewichts-%). Die Filme werden handgegossen, um die Auswirkungen der Temperatur des wäßrigen Abschreckbades auf die Membraneigenschaften festzustellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle XXIX dargestellt. Die tiefgreifenden Auswirkungen der Abschrecktemperatur auf die Membranstruktur und Permeabilität/Selektivität werden hierbei offenkundig. TABELLE XXIX Auswirkungen der Temperatur des wäßrigen Koagulations- (Abschreck-)bades auf Membranverhalten und -struktur a
a LCST = 80ºC; UCST = 43ºC. Dope-Mitteltemperatur: 60ºC. MWc = Molekulargewichtsgrenze

7. 19 HERSTELLUNG VON SERUM AUS VOLLBLUT

Dope-Mittel der in Beispiel 7.1 beschriebenen Ausführung wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 7.16 handgegossen:
- Abschreckbadzusammensetzung 400 g NMP: 5 g Igepal CO-850 (von GAF): 95 g Wasser
- Gardner-Schaufeleinstellung 35 mil
- Verweildauer im Abschreckbad 3 min
- Nach drei Minuten wird dem Abschreckbad langsam Wasser zugesetzt, um ein vollständiges Ausfällen der Membranen zu erreichen, bevor diese unter fließendem Wasser gewaschen werden.
Mit Wanddicken von 300-350 um und einer Oberflächenporengröße von 10-30 um (auf der mit dem Abschreckmedium in Kontakt stehenden Oberfläche) sowie im Bereich von 3-8 um (auf der mit der flachen Oberfläche oder Glasplatte in Kontakt stehenden Fläche) sind die Membranen 3900-9 anisotrop. Die gesamten Innen- und Außenflächen dieser Membranen werden anschließend durch den in Beispiel 6.10 beschriebenen Prozeß modifiziert. Sie werden anschließend mit Vollblut bedeckt.
Wenn einige Milliliter Blut auf der Oberfläche dieser Membranen aufgebracht werden und rasch in die Matrix eindringen, tritt auf der gegenüberliegenden Seite nur strohfarbenes Blutplasma aus. Auf Elektronenmikrografien von Filmen, die auf diese Weise für die Separierung von Blutzellen eingesetzt werden, ist ein vollständiges Zusetzen mit Rückständen festzustellen. Dieses Ergebnis verdeutlicht, daß diese Membranen für eine Vielzahl unterschiedlicher Diagnoseanwendungen geeignet sind, z. B. zur Stichprobenverarbeitung für die Herstellung von Plasma ohne Einsatz einer Zentrifuge.
Die Menge des zurückgewonnenen Plasma ist offensichtlich ausreichend für eine Vielzahl möglicher Diagnoseprüfungen. So können beispielsweise die Glukoseniveaus ermittelt und eine DNA-Hybridisierungsanalyse durchgeführt werden, um eine etwaige mikrobielle Kontaminierung festzustellen.
Für Fachleute dürfte klar ersichtlich sein, daß die hier beschriebenen Membranen für unterschiedlichste Anwendungen im Bereich der Flüssigkeitsseparierung, u. a. in der Bioverfahrenstechnik, eingesetzt werden können, da sie anhand der erläuterten Kontrollprozeßparameter individuell angepaßt werden können. Außer für Affinitätsanwendungen sind diese Membranen fürvielfältige Formen von Mikrofilterungs- und Ultrafilterungsanwendungen mit oder ohne zusätzliche Herstellung hydrophiler Eigenschaften geeignet. Durch die relativ geringen Proteinbindeflächen ist das Verstopfungs- und Zusetzrisiko der Matrix auf ein Minimum beschränkt. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von relativ isotropen mikroporösen Fasern (z. B. Faser 2600-6) für die Zellseparierung. Die Separierung von Zellen aus einer begleitenden Flüssigkeit ist mit sehr hohen Durchflußwerten ohne völligen Abfall der hydraulischen Permeabilität der Membran möglich, wie er typischerweise bei handelsüblichen Hohlfasern festzustellen ist. Zu den Beispielen für derartige Zellenseparierungen zählen: Klärung von Zellbouillon und konditionierten Medien, wobei die Affinitätsbindung und Klärung kombiniert und damit die Zahl der Einzelarbeitsgänge bei der Proteinreinigung verringert werden kann; ferner für die Separierung von Blutzellen für medizinische Zwecke.

Ansprüche

Fig. 1
Membrane surfaces = Membranoberflächen
-OH terminus = -OH-Ende
-CL terminus = -CL-Ende
edge = Rand
-OH group determination = -OH-Gruppenbestimmung
Fig. 2
Pendant = angehängt
bulk = Masse
surface or interface = Oberfläche oder Anlagefläche
Fig. 4
Temperature ºC = Temperatur ºC
% Glycerin = % Glycerin
single phase = einphasig
UCST two phase = UCST zweiphasig
LCST two phase = LCST zweiphasig
Cloud point... = Trübungspunktphasendiagramm für Lösungen aus PES/PEO-Mischungen: 20% PES (7,5% PEO (4000 kd)): X% Glycerin in nmp)
Fig. 5
Dope = Dope-Mittel
Intraannular fluid = intraannulare Flüssigkeit
Extraannular fluid = extraannulare Flüssigkeit
Double annular... = Coextrudier-Spinndüse mit Doppelring
Fig. 6
Dope = Dope-Mittel
Intraannular fluid = intraannulare Flüssigkeit
Extraannular fluid = extraannulare Flüssigkeit
Interchangeable... = Spritzdüse mit auswechselbarer Bohrung
Alternative design... = Alternative Ausführung einer Coextrudier- Spinndüse mit Doppelring
Fig. 7
Lp as a function... = Lp als Funktion der extraannularen Durchflußmenge
Repeat data... = Datenpunkt wird am Ende des Durchgangs wiederholt
Extraannular... = extraannulare Durchflußmenge (cm³/min)
Fiber = Faser
Water = Wasser
Jet height = Düsenhöhe
Annular fluid flow = Annularer Durchfluß
OD = AD
ID = lD
ZERO = Null
Fig. 8
SAMPLE ID = Muster-1D
Diferential flow distr. = Differenzdurchflußverteilung
Min. size = Min. Größe
Max. size = Max. Größe
Mfp. size = Mittl. Größe
Differential flow = Differenzdurchfluß
Size at cursor = Größe an Zeiger
Pore size = Porengröße

Claims

1. Ein Verfahren für die Modifizierung von Oberfächeneigenschaften eines hydrophoben Polysulfons oder Polyethersulfons mit funktionalisierbaren endständigen Gruppen, die an der Polymeroberfläche ausgesetzt sind, umfassend

(a) in-Kontakt-bringen dieser hydrophoben Polymeroberfläche mit einer Lösung, die ein erstes nichtlösendes Lösungsmittel und eine Verbindungseinheit enthält, welche in der Lage ist, das hydrophobe Polymer mit einem Makromolekül für eine Zeitspanne kovalent zu verbrücken, die ausreicht, um eine kovalenten Bindung zwischen der funktionalisierbaren endständigen Gruppe des hydrophoben Polymers und der Verbindungseinheit zu bilden; und

(b) in-Kontakt-bringen der abreagierten Polymeroberfläche von Schritt (a) mit einer Lösung, die ein zweites nichtlösendes Lösungsmittel und das Makromolekül enthält, für eine Zeitspanne, die ausreicht, um das Makromolekül an die kovalent gebundene Verbindungseinheit kovalent zu binden, und damit eine gebildete Polymeroberfläche mit modifizierten Oberflächeneigenschaften zur Verfügung zu stellen.

2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, weiter umfassend die Schritte:

(c) in-Kontakt-bringen der abreagierten Polymeroberfläche von Schritt (b) des Anspruchs 1 mit einer Lösung, die ein drittes nichtlösendes Lösungsmittel und ein Reagens enthält, wobei das Reagens in der Lage ist, aktive Plätze auf dem kovalent gebundenen Makromolekül zu bilden; und

(d) in-Kontakt-bringen der abreagierten hydrophoben Polymeroberfläche von Schritt (c) mit einer Lösung, die ein viertes nichtlösendes Lösungsmittel und einen Liganden enthält, wobei der Ligand in der Lage ist, mit den aktiven Plätzen auf dem kovalent gebundenen Makromolekül zu reagieren, für eine Zeitspanne, die ausreicht, um den Liganden kovalent an das kovalent gebundene Makromolekül zu binden, um eine gebildete hydrophobe Polymeroberfläche mit modifizierten Oberflächeneigenschaften zur Verfügung zu stellen.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, das weiter umfasst, die hydrophobe Polymeroberfläche mit einer nichtlösenden Lösung zu behandeln, die in der Lage ist, die Anzahl von verfügbaren funktionalisierbaren endständigen Gruppen zu erhöhen, bevor Schritt (a) durchgeführt wird.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, das weiter umfasst, die hydrophobe Polymeroberfläche nach jedem Schritt mit frischem Lösungsmittel zu waschen, um alle Rückstände von ungebundenen Material zu entfernen.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, das weiter umfasst die mindestens einmalige Wiederholung aller angeführten Schritte, um den erwünschten Modifizierungsgrad zu erzielen.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, das weiter umfasst, die gebildete hydrophobe Polymeroberfläche Reaktionsbedingungen auszusetzen, die die Wirkung haben, daß sich die Moleküle des Makromoleküls untereinander vernetzen.

7. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, das weiter umfasst die gebildete hydrophobe Polymeroberfläche Reaktionsbedingungen auszusetzen, die die Wirkung haben, daß sich die sich Moleküle des Liganden untereinander vernetzen.

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das hydrophobe Polymer eine Membran ist.

9. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das hydrophobe Polymer eine im wesentlichen isotrope Membran ist.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das hydrophobe Polymer eine anisotrope Membran ist.

11. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das hydrophobe Polymer ein fabrikmäßig hergestellter Gegenstand ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Membran, einem chromatographischen Packungsmaterial, einem künstlichen Organ, und einer Prothesevorrichtung.

12. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das hydrophobe Polymer ein fabrikmäßig hergestellter Gegenstand ist, der mittels eines Verfahrens hergestellt ist, wobei das Verfahren ausgewählt ist aus der Gruppebestehend aus Spritzgießen, Formpressen, Blasformen, Blasen, Kalandrieren, Gießen, Beschichten, Formen, Schichtstoffherstellung, und Strangpressen.

13. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das hydrophobe Polymer hergestellt ist mittels eines Verfahrens, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stufen-, Radikal-Ketten-, Ionische Ketten-, Ringöffnungs-, und Ziegler-Natta-Polymerisierung.

14. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei eine funktionelle Gruppe der Verbindungseinheit eine kovalente Bindung mit den funktionalisierbaren Kettenenden der hydrophoben Polymeroberfläche bildet.

15. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindungseinheit ein Molekül ist, das mindestens zwei funktionelle Gruppen aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Epoxid, Carbonyl, Carboxy, Amin, so Halogenid, Sulfonyl, Hydroxy, und deren stabile Kombinationen.

16. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindungseinheit ein Molekulargewicht von weniger als 2000 aufweist.

17. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindungseinheit ein anorganische funktionelle Gruppe enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Silizium, Aluminium, Zinn, Bor, Phosphor, Schwefel, Stickstoff, Silikate, Aluminate, Borate, Stannate, Phosphate, und Sulfonate.

18. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindungseinheit ein Kohlenwasserstoffmolekül ist, das mindestens zwei terminale funktionelle Gruppen enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Halogenid, Carboxy Säurechlorid, Säureanhydrid, Carbonyl, Epoxy, Sulfonylchlorid, und deren stabile Kombinationen.

19. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Makromolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus natürlichem Polymer, synthetischem Polymer, deren Derivate, Mischpolymere, Mischungen, und Copolymere, Tensid, Kohlenhydrat, Lektin, Polypeptid, Polysaccharid, Liposom, Protein, Glykoprotein, Oligonukleotid, synthetischer Farbstoff, natürlicher Farbstoff, Polynukleotid, deren Derivate und Mischungen, monoklonaler Antikörper, polyklonaler Antikörper, Antigen, Rezeptor, Enzymsubstrat, Enzym. Trägerprotein, Koagulationsfaktor, Kofaktor, Inhibitor, Hormon, Immunoglobulin, Histon, Plasmid und ihre Derivate und Mischungen, und Polysilan, Polysiloxan, Polysulfonat, Polycarboxylat. Hydroxyalkylcellulose. Dextran, Diethylaminoethyldextran, Carboxylmethylcellulose Poly(ethylenimin), Poly(carboxymethylethylenimin) und Polyvinylalkohol, deren Derivate, Mischpolymere, Mischungen und Copolymere.

20. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus langkettigem aliphatischen Kohlenwasserstoffsilan, verzweigtem aliphatischen Kohlenwasserstoffsilan, aromatischen Kohlenwasserstoffsilan, und deren Mischungen, Tensid, Kohlenhydrat, Aminosäure, Lektin, Polypeptid, Polysaccharid, Liposom, Protein, Glykoprotein, Oligonukleotid, synthetischer Farbstoff, natürlicher Farbstoff, Polynukleotid, deren Derivate und Mischungen, monoklonaler Antikörper, polyklonaler Antikörper, Antigen, Rezeptor, Enzymsubstrat, Enzym, Trägerprotein, Koagulationsfaktor, Kofaktor, Inhibitor, Hormon, Immunoglobulin, Histon, Plasmid und deren Derivate und Mischungen, und natürliches Protein A, rekombinantes Protein A, Avidin, Biotin, Heparin, Oberflächenrezeptor von tierischen Zellen, Oberflächenrezeptor von pflanzlichen Zellen, und Oberflächenrezeptor von bakteriellen Zellen.

21. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Ligand ein Antikörper gegen ein Molekül ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Immunoglobulin G, Immunoglobulin M, Immunoglobulin A, Immunoglobulin E, Gewebeplasminogen-Aktivator, humanes Interleukin-Protein, Blutkoagulationsfaktor, humanes chorionisches Gonadotropin, thyrotropisches Hormon, carcinoembryonisches Antigen, a-Fetoprotein, transformierender Wachstumsfaktor, und Interferon.

22. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die nicht-lösenden Lösungsmittel verschieden sind.

23. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die nicht-lösenden Lösungsmittel für einige oder alle Schritte verschieden sind.

24. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die nicht-lösenden Lösungsmittel ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasser, wäßrige Puffer, wäßrige Basen und deren Mischungen.

25. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das nicht-lösende Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem geheizten wäßrigem Bad, einem geheizten basischen wäßrigem Bad, einem nicht-lösenden organischen Lösungsmittel und deren Mischungen.

26. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das nicht-lösende Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acetonitril, Isopropanol, und deren wäßrige Mischungen.

27. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Reagens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Diepoxid, Dihalogenid, Halogenepoxid, 2,4,6-Trichlor-S-triazin, Carbodiimid, 2-Fluor-1-Methyfpyridinium p-Toluolsulfonat, Disulfonylchloride, Cyanogenbromid, Disäurechloride, Chloressigsäure, Dialdehyde, und Diisoyanate.

28. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das hydrophobe Polymer im wesentlichen aus Polyethersulfon besteht; das erste nichtlösende Lösungsmittel ist wäßrige Base; die Verbindungseinheit ist Ethylenglykol-Diglycidylether; das zweite nichtlösende Lösungsmittel ist wäßrige Base; das Makromolekül ist eine Hydroxyalkylcellulose; das dritte nichtlösende Lösungsmittel ist Acetonitril; das Reagens ist 2-Fluoro-1-Methylpyridinium p-Toluolsulfonat; das vierte nichtlösende Lösungsmittel ist wäßriger Puffer; und der Ligand ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus natürlichem Protein A, rekombinantem Protein A, Avidin, Biotin, Heparin, anti-Faktor VIII, und anti-Faktor IX.

29. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Makromolekül hydrophil ist.

30. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Makromolekül hydrophob ist.

31. Ein Polysulfon oder Polyethersulfon mit modifizierten Oberflächeneigenschaften, umfassend:

(a) das hydrophobe Polymer mit funktionalisierbaren, an der Polymeroberfläche ausgesetzten endständigen Gruppen;

(b) ein Makromolekül, das in der Lage ist, die Oberflächeneigenschaften der hydrophoben Polymeroberfläche zu verändern; und

(c) eine eine endständige Gruppe des hydrophoben Polymers und das Makromolekül kovalent verbrückende Verbindungseinheit.

32. Das Polymer gemäß Anspruch 31, das außerdem mehrere Schichten von Makromolekülen umfaßt, wobei diese Schichten über kovalente Bindungen zusammengehalten werden.

33. Das Polymer gemäß Anspruch 31, das außerdem einen kovalent an das Makromolekül gebundenen Liganden umfaßt.

34. Das Polymer gemäß Anspruch 31, in dem die Verbindungseinheit ein Molekül mit mindestens zwei funktionelle Gruppen ist, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Epoxyd, Carbonyl, Carboxyl, Amin, Halogenid, Sulfonyl, Hydroxyl, und deren stabile Kombinationen.

35. Das Polymer gemäß Anspruch 31, in dem die Verbindungseinheit ein Molekulargewicht von weniger als 2000 aufweist.

36. Das Polymer gemäß Anspruch 31, in dem die Verbindungseinheit eine inorganische funktionelle Gruppe enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Silizium, Aluminium, Zinn, Bor. Phosphor, Schwefel, Stickstoff, Silikate, Aluminate, Borate, Stannate. Phosphate, und Sulfonate.

37. Das Polymer gemäß Anspruch 31, wobei die Verbindungseinheit ein Kohlenwasserstoffmolekül ist, das mindestens zwei terminale funktionelle Gruppen enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Halogenid, Carboxysäure, Säurechlorid, Säureanhydrid, Carbonyl, Epoxy, Sulfonylchlorid, und deren stabile Kombinationen.

38. Das Polymer gemäß Anspruch 31, wobei das Makromolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus natürlichem Polymer, synthetischem Polymer, deren Derivate, gemischte Polymere, Mischungen, und Copolymere, Tensid, Kohlenhydrat. Lektin, Polypeptid, Polysaccharid, Liposom, Protein, Glykoprotein, Oligonukleotid, synthetische Farbstoff, natürliche Farbstoff, Polynukleotid, deren Derivate und Mischungen, monoklonaler Antikörper, polyklonaler Antikörper, Antigen, Rezeptor, Enzymsubstrat. Enzym. Trägerprotein, Koagulationsfaktor, Kofaktor, Inhibitor, Hormon, Immunoglobulin, Histon, Plasmid und deren Derivate und Mischungen, und Polysulfonat, Polycarboxylat, Hydroxyalkylcellulose, Dextran. Diethylaminoethyldextran, Carboxylmethylcellulose, Poly(ethylenimin), Poly(carboxymethylethylenimin), Polyvinylalkohol, deren Derivate, Mischpolymere, Mischungen und Copolymere.

39. Das Polymer gemäß Anspruch 33, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus langkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffsilan, verzweigten aliphatischen Kohlenwasserstoffsilan, aromatischen Kohlenwasserstoffsilan und deren Mischungen, Tensid, Kohlenhydrat, Aminosäure, Lektin, Polypeptid, Polysaccharid, Liposom, Protein, Glykoprotein, Oligonukleotid, synthetischer Farbstoff, natürlicher Farbstoff, Polynukleotid, deren Derivate und Mischungen, monoklonaler Antikörper, polyklonaler Antikörper, Antigen, Rezeptor, Enzymsubstrat, Enzym, Trägerprotein, Koagulationsfaktor, Kofaktor, Inhibitor, Hormon, Immunoglobulin, Histon, Plasmid und deren Derivate und Mischungen, und natürliches Protein A, rekombinantes Protein A, Avidin, Biotin, Heparin, Oberflächenrezeptor von tierischen Zellen, Oberflächenrezeptor von pflanzlichen Zellen, und Oberflächenrezeptor von bakteriellen Zellen.

40. Das Polymer gemäß Anspruch 33, wobei der Ligand ein Antikörper gegen ein Molekül ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Immunoglobulin G, Immunoglobulin M, Immunoglobulin A, Immunoglobulin E, Gewebeplasminogen-Aktivator, humanes Interleukin-Protein, Blutkoagulationsfaktor, humanes chorionisches Gonadotropin, thyrotropisches Hormon, carcinoembryonisches Antigen, a-Fetoprotein, transformierender Wachstumsfaktor, und Interferon.

41. Das Polymer gemäß Anspruch 31 oder Anspruch 33 in Form einer blattförmigen mikroporösen Membran.

42. Die blattförmige mikroporöse Membran gemäß Anspruch 41, die weiter gekennzeichnet ist dadurch, daß sie selbsttragend ist.

43. Die blattförmige mikroporöse Membran gemäß Anspruch 41, die weiter gekennzeichnet ist dadurch; daß sie eine im wesentlichen isotrope Porengrößenverteilung aufweist.

44. Die blattförmige mikroporöse Membran gemäß Anspruch 41, die weiter gekennzeichnet ist dadurch, daß sie eine anisotrope Porengrößenverteilung aufweist von 50 Mikrometern auf einer Seite der Membran bis zu 1 Mikrometer auf der gegenüberliegenden Seite der Membran.

45. Die blattförmige mikroporöse Membran gemäß Anspruch 41, die weiter gekennzeichnet ist dadurch, daß sie eine Gesamtdicke von 250 bis 500 Mikrometern aufweist.

46. Eine im wesentlichen isotrope blattförmige mikroporöse Membran gemäß Anspruch 43, umfassend (a) ein Polyethersulfon als primäre hydrophobe Polymerkomponente mit funktionalisierbaren phenolischen endständigen Gruppen; (b)Hydroxyalkylcellulose mit funktionellen Hydroxylgruppen; und (c) eine Verbindungseinheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylen-Glykol-Diglycidylether, 1,4-Butandiol-Diglycidylether, Epichlorhydrin, und Chloressigsäure, wobei die Verbindungseinheit in der Lage ist, ein phenolisches Kettenende des Polyethersulfons mit mindestens einer Hydroxygruppe der Hydroxyalkylcellulose kovalent zu verbrücken.

47. Die im wesentlichen isotrope blattförmige mikroporöse Membran gemäß Anspruch 46, weiter umfassend einen kovalent an die Hydroxyalkylcellulose gebundenen Liganden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus natürlichem Protein A, rekombinantem Protein A, Avidin, Biotin, Heparin, einem Zelloberflächenrezeptor, einem Antikörper, einem Enzym, und einer Spezie, die in der Lage ist, eine Ladung zu tragen.

48. Ein Polymer gemäß Anspruch 31 oder Anspruch 33 in Form einer im wesentlichen isotropen mikroporösen Hohlfasermembran.

49. Die im wesentlichen isotrope mikroporöse Hohlfasermembran gemäß Anspruch 48, die weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Porengrößeverteilung innerhalb einer Größenordnung aufweist.

50. Die im wesentlichen isotrope mikroporöse Hohlfasermembran gemäß Anspruch 48, die weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Gesamtwanddicke von 50 bis 500 Mikrometern aufweist.

51. Eine im wesentlichen isotrope mikroporöse Hohlfasermembran gemäß Anspruch 48, umfassend (a) ein Polyethersulfon als primäre hydrophobe Polymerkomponente mit funktionalisierbaren phenolischen endständigen Gruppen; (b) Hydroxyalkylcellulose mit funktionellen Hydroxygruppen, und (c) eine Verbindungseinheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol-Diglycidylether, 1,4-Butandiol-Diglycidylether, Epichlorhydrin, und Chloressigsäure, wobei die Verbindungseinheit in der Lage ist, ein phenolisches Kettenende des Polyethersulfons mit mindestens einer Hydroxygruppe der Hydroxyalkylcellulose kovalent zu verbrücken.

52. Die im wesentlichen isotrope oberflächenmodifizierte mikroporöse Hohlfasermembran gemäß Anspruch 51, die weiter umfasst einen Liganden, der kovalent an die Hydroxyalkylcellulose gebunden ist, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus natürlichem Protein A, rekombinantem Protein A, Avidin, Biotin, Heparin, Lektin, einem Hormonrezeptor, einem Zelloberflächenrezeptor, einem Antikörper, einem Antigen, einem Histon, einem Trägerprotein, einem Kofaktor, einem Glycoprotein, einem Enzym, und einer Spezie, die in der Lage ist, eine Ladung zu tragen.

53. Eine Membran, bestehend aus einem hydrophoben Polysulfon oder Polyethersulfon, dessen Oberfläche nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 modifiziert worden ist.

54. Eine Membran, bestehend aus einem hydrophoben Polysulfon oder Polyethersulfon, dessen Oberfläche nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2 modifiziert worden ist.

55. Ein Verfahren zur Rückgewinnung eines Ligats aus einer das Ligat enthaltende Lösung oder Mischung, das umfasst:

(a) in-Kontakt-bringen einer einen Ligaten enthaltende Lösung oder Mischung mit der im wesentlichen isotropen Membran gemäß Anspruch 50, wobei die Membran das hydrophobe Polymer und einen kovalent an die Membranoberfläche gebundenen Liganden umfasst, wobei der Ligand in der Lage ist, das Ligat zu binden; und

(b) das Ligat an den kovalent gebundenen Liganden binden zu lassen, wodurch das Ligat von dem ungebundenen Teil der Lösung oder Mischung getrennt wird.

(c) Abtrennung des Ligats von dem kovalent gebundenen Ligat; und

(d) Rückgewinnung des abgetrennten Ligaten.

56. Das Verfahren gemäß Anspruch 55, wobei der Schritt (c) ausgeführt wird durch in-Kontakt-bringen der Membran mit dem zurückgewonnenen Ligat mit einem geeigneten Ligat-eluierendem Medium.

57. Das Verfahren gemäß Anspruch 55, wobei das Ligat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Immunoglobulin G. Faktor VIII, einem Blutkoagulierungsfaktor, einem Antikörper, einer Antigen-Substanz, einem Glykoprotein, einem Hormon, und einem Hormorezeptor, und der Ligand ist jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein A, anti-Faktor VIII, Heparin, einer Antigen-Substanz, einem Antikörper, einem Lektin, einem Hormon- Rezeptor und einem Hormon.

58. Das Verfahren gemäß Anspruch 55, wobei das Ligat ein Gewebeplasminogen-Aktivator ist und der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anti-Gewebeplasminogen Aktivator und Gewebeplasminogen-Aktivator- Rezeptor.