JPS6188883A - 発現系におけるタンパク質輸送のための合成シグナル配列 - Google Patents
発現系におけるタンパク質輸送のための合成シグナル配列Info
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- JPS6188883A JPS6188883A JP60221120A JP22112085A JPS6188883A JP S6188883 A JPS6188883 A JP S6188883A JP 60221120 A JP60221120 A JP 60221120A JP 22112085 A JP22112085 A JP 22112085A JP S6188883 A JPS6188883 A JP S6188883A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
細胞において、タンパク質は細胞質に存在するリポソー
ムで合成される。細胞質から運ばれろタンパク質は、細
胞質膜の通過中に酵素的に切り離される比較的短いペプ
チド鎖をアミノ末端に保有しており、該膜上において成
熟タンパク質が産生される。この短ペプチド配列は「シ
グナルペプチド」またはプレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎ
ｃ ｅ ）またはリーダー配列と呼ばれる。
ムで合成される。細胞質から運ばれろタンパク質は、細
胞質膜の通過中に酵素的に切り離される比較的短いペプ
チド鎖をアミノ末端に保有しており、該膜上において成
熟タンパク質が産生される。この短ペプチド配列は「シ
グナルペプチド」またはプレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎ
ｃ ｅ ）またはリーダー配列と呼ばれる。
アミノ末九”シに位置するシグナル配列は、すでに多数
の分泌タンパク質について特徴が示されてきた。一般に
、それはコア（ｃｏｒｅ） と称される約１０〜２０
個のアミノ酸の疎水性軸域からなり、そのアミノ末端に
は短ペプチド配列［フレーコア（ｐｒｅ−ｃｏｒｅ）
］が結合し、これは通常一つ（またはいくつか）の正荷
電アミノ酸欠有している。疎水性傾城のカルボキシ末端
と成熟輸送タンパク質のアミノ末端との間には知ペプチ
ド配列〔ポスト−コア（ｐｏｓｔ −ｃｏｒｅ ） ］
が存在し、これはスズライス部位を有していて、空間的
配列が有利になることを確保している。
の分泌タンパク質について特徴が示されてきた。一般に
、それはコア（ｃｏｒｅ） と称される約１０〜２０
個のアミノ酸の疎水性軸域からなり、そのアミノ末端に
は短ペプチド配列［フレーコア（ｐｒｅ−ｃｏｒｅ）
］が結合し、これは通常一つ（またはいくつか）の正荷
電アミノ酸欠有している。疎水性傾城のカルボキシ末端
と成熟輸送タンパク質のアミノ末端との間には知ペプチ
ド配列〔ポスト−コア（ｐｏｓｔ −ｃｏｒｅ ） ］
が存在し、これはスズライス部位を有していて、空間的
配列が有利になることを確保している。
米国特許第４，４１１，９９４号明細書によって、細胞
質から所望のタンパク質を輸送するために、発現させる
べきタンパク質の遺伝子ケ、細胞外またはべりブラズム
の押体タンパク質をコードする細菌遺伝子と結合させる
ことが知られている。この方法では、ペリプラズム、外
膜タンパク質または細胞外タンパク質についての宿主個
有のＩ￥Ｉｎ菌遺伝子を単離することが必要である。こ
の遺伝子を次いで制限酵素により切断し、ｆ翁送すべき
タンパク質の遺伝子をこの切断部に挿入し、このように
して形成された融合遺伝子を有するベクターによって宿
主細胞を形質転換させる。天然遺伝子の単シ゛１および
適切な切断部位の選択に要するその特性は著しく複雑で
ある。
質から所望のタンパク質を輸送するために、発現させる
べきタンパク質の遺伝子ケ、細胞外またはべりブラズム
の押体タンパク質をコードする細菌遺伝子と結合させる
ことが知られている。この方法では、ペリプラズム、外
膜タンパク質または細胞外タンパク質についての宿主個
有のＩ￥Ｉｎ菌遺伝子を単離することが必要である。こ
の遺伝子を次いで制限酵素により切断し、ｆ翁送すべき
タンパク質の遺伝子をこの切断部に挿入し、このように
して形成された融合遺伝子を有するベクターによって宿
主細胞を形質転換させる。天然遺伝子の単シ゛１および
適切な切断部位の選択に要するその特性は著しく複雑で
ある。
問題点を解決するための手段
この複雑性は、本発明により合成シグナル配列を使用す
ることにより解消される。
ることにより解消される。
ｆなわち、本発明は、実質的に天然シグナル配列と一致
するが、該天然ＤＮＡには存在しないエンドヌクレアー
ゼによる少なくとも１個切断部位を有するＤＮＡからな
る、発現系におけろタンパク質輸送のための合成シグナ
ル配列に関する。
するが、該天然ＤＮＡには存在しないエンドヌクレアー
ゼによる少なくとも１個切断部位を有するＤＮＡからな
る、発現系におけろタンパク質輸送のための合成シグナ
ル配列に関する。
本発明の他の側面および好ましい態様は、以下に掲載さ
れているか、あるいは特許請求の範囲の項に述べられて
いる。これらは、具体的には、特許請求の範囲第２〜７
項に記載したシグナル配列、同第８項に記載したＤＮＡ
、同第９〜１０項に記載したタンパク質の輸送発現方法
、同第１１−１２項に記載のハイブリッドベクター、同
第１３〜１６項に記載の宿主生物、である。
れているか、あるいは特許請求の範囲の項に述べられて
いる。これらは、具体的には、特許請求の範囲第２〜７
項に記載したシグナル配列、同第８項に記載したＤＮＡ
、同第９〜１０項に記載したタンパク質の輸送発現方法
、同第１１−１２項に記載のハイブリッドベクター、同
第１３〜１６項に記載の宿主生物、である。
このＤＮＡは、「実質的に」天然シグナル配列のそれと
一致しているべきである。このことは、発現シグナルペ
プチドが天然シグナルペプチドと実質的にまたは完全に
一致することを意味すると理解されたい。そして、後者
の場合においては、したがって、ＤＮＡレベルで存在す
る唯一の差異は、天然ＤＮＡ配列が有さない少なくとも
１個の切断部位を合成ＤＮＡが有しているということで
ある。本発明におけるこの切断部位の組込みは、したが
って、天然配列との間に多少は大きな差異があるという
ことを意味しており、特定の宿主生物にとってはより好
ましくないと知られているコードンヶ用いることがある
種の環境下では必要になるのである。しかしながら、驚
くべきことに、これはいかなる発現上の不利益とも結び
つかない。逆に、特定の「注文あつらえの」合成遺伝子
は多くの利益と結びつくため、「非天然」コードンの使
用による不利益が一般には充分すぎるほど相殺される。
一致しているべきである。このことは、発現シグナルペ
プチドが天然シグナルペプチドと実質的にまたは完全に
一致することを意味すると理解されたい。そして、後者
の場合においては、したがって、ＤＮＡレベルで存在す
る唯一の差異は、天然ＤＮＡ配列が有さない少なくとも
１個の切断部位を合成ＤＮＡが有しているということで
ある。本発明におけるこの切断部位の組込みは、したが
って、天然配列との間に多少は大きな差異があるという
ことを意味しており、特定の宿主生物にとってはより好
ましくないと知られているコードンヶ用いることがある
種の環境下では必要になるのである。しかしながら、驚
くべきことに、これはいかなる発現上の不利益とも結び
つかない。逆に、特定の「注文あつらえの」合成遺伝子
は多くの利益と結びつくため、「非天然」コードンの使
用による不利益が一般には充分すぎるほど相殺される。
実際、大腸菌アルカリホスファターゼの遺伝子に存在す
る開始コードンＧＴＧをＡＴＧで置換すると、発現量が
著しく増大することが明らかになった。
る開始コードンＧＴＧをＡＴＧで置換すると、発現量が
著しく増大することが明らかになった。
本発明に特有の利点は、宿主細胞がバラスト（ｂａユ１
ａｓｔ ） タンパク質をさほど産生する必要がない
ことにあり、その理由は発現させるべき遺伝子が合成Ｄ
ＮＡシグナル配列の３１末端に直接結合できるからであ
る。更には、配列のクローニングが可能で、しかも別の
認識部位ではクローニングベクターとの所定の結合が可
能ないくつかの制限詔識部位を有ｊる、末端にはみ出し
たＤＮＡ配列を作出することが、合成ＤＮＡの造成の際
に可能である限り、利点は自すと生じる。これは、［調
節構造原理Ｊ （ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）によって所望のベクター
との結合を可峠にするものである。
ａｓｔ ） タンパク質をさほど産生する必要がない
ことにあり、その理由は発現させるべき遺伝子が合成Ｄ
ＮＡシグナル配列の３１末端に直接結合できるからであ
る。更には、配列のクローニングが可能で、しかも別の
認識部位ではクローニングベクターとの所定の結合が可
能ないくつかの制限詔識部位を有ｊる、末端にはみ出し
たＤＮＡ配列を作出することが、合成ＤＮＡの造成の際
に可能である限り、利点は自すと生じる。これは、［調
節構造原理Ｊ （ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）によって所望のベクター
との結合を可峠にするものである。
制限酵素の内置１５認識部位によって、すべての相同ま
たは異’７ｆ’＋ｊｔ伝子の正確な読取り枠内での結合
が可能となる。自然界では生じないプレ配列に到る、シ
グナル配列のＤＮＡにおける直接的方法での改変χなす
ことも、これらの内部切断部位により凸丁能である。
たは異’７ｆ’＋ｊｔ伝子の正確な読取り枠内での結合
が可能となる。自然界では生じないプレ配列に到る、シ
グナル配列のＤＮＡにおける直接的方法での改変χなす
ことも、これらの内部切断部位により凸丁能である。
これらの内部切断部位は、有利なことに、疎水ゼＬ領域
の上流および下流頓域、特にボスト−コア仰域、に位置
しているため、スプライス部位および（または）その隣
接傾城を改変することが可能である。勿論、それ自体公
知の方法によりコア傾城を改変することも可能である。
の上流および下流頓域、特にボスト−コア仰域、に位置
しているため、スプライス部位および（または）その隣
接傾城を改変することが可能である。勿論、それ自体公
知の方法によりコア傾城を改変することも可能である。
公知の規則を考慮に入れるならば〔ゲー・７オン・ハイ
ネ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、
第１７３巻、１９８４年、第２４３−２５１頁（Ｇ、
ｖｏｎ Ｈｅ１ｊｎｅ ： Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ
、 １７３（１９８４）２４３−２５１） ］、グレベ
グチド（ｐｒｅｐｅｐｔｉｄｅ） のカルボキシ末端
部をコードする遺伝子区画の適切な切断部位により、融
合タンパク質のみならず、所望の、一般には真核生物の
ペプチドがその天然型のままで直接に発現されるような
方法で、シグナルペブチターゼ・スプライス部位を設け
ることが可能である。一般に、天然由来の遺伝子は、こ
の１重のフ゛ロセッシングをすることができない。
ネ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、
第１７３巻、１９８４年、第２４３−２５１頁（Ｇ、
ｖｏｎ Ｈｅ１ｊｎｅ ： Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ
、 １７３（１９８４）２４３−２５１） ］、グレベ
グチド（ｐｒｅｐｅｐｔｉｄｅ） のカルボキシ末端
部をコードする遺伝子区画の適切な切断部位により、融
合タンパク質のみならず、所望の、一般には真核生物の
ペプチドがその天然型のままで直接に発現されるような
方法で、シグナルペブチターゼ・スプライス部位を設け
ることが可能である。一般に、天然由来の遺伝子は、こ
の１重のフ゛ロセッシングをすることができない。
適切なシグナル配列は、原則的にすべて、文献公知のシ
グナル配列〔二ム・イー・イー・ワトソン、ヌクレイツ
ク・アシッズ・リサーチ、第１２巻、１９８４年、第５
１４５−５１６４頁（Ｍ−Ｅ、Ｅ、 Ｗａｔｓｏｎ ：
Ｎｕｃユｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １２
（１９８４）、 ５１４５ − ５１６４）］、その
改変物およびそれらから得られろ「観念的に考えられた
」シグナル配列〔ディー・バールマンら、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１６７巻、１９
８３年、第３９１−４０９頁（Ｄ。
グナル配列〔二ム・イー・イー・ワトソン、ヌクレイツ
ク・アシッズ・リサーチ、第１２巻、１９８４年、第５
１４５−５１６４頁（Ｍ−Ｅ、Ｅ、 Ｗａｔｓｏｎ ：
Ｎｕｃユｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １２
（１９８４）、 ５１４５ − ５１６４）］、その
改変物およびそれらから得られろ「観念的に考えられた
」シグナル配列〔ディー・バールマンら、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１６７巻、１９
８３年、第３９１−４０９頁（Ｄ。
Ｐｅｒｌｍａｎ ａｎｄ Ｈ，Ｏ，Ｈａｌｖｏｒａ
ｏｎ ； Ｊ、 Ｍｏユ、 Ｂ１０ユ。
ｏｎ ； Ｊ、 Ｍｏユ、 Ｂ１０ユ。
１６７ （１９８４）、３９１−４０９） ：］である
。
。
好ましい宿主生物は、エシェリキア・コリ（Ｌｃｏｌｉ
）、ストレプトミセス（８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｓｓ ）
、 スタフィロコックス（ｓｔａｐｈｙｘｏｃｏｃｃｕ
ｓ）種、例えばスタフィロコックス・アウレウス（Ｓ、
ａｕｒｅｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉユｌｕａ ）
種、例えばバチルス・スプテリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、 バチルス・アミロリキファシエンス（Ｂ、 ａ
ｍｙユｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ） 、バチルスの
セレウス（Ｂ、 ｃｅｒｅｕθ）もしくはバチリス・リ
ケニホルミ、ｘ、 （Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ日） 、
サッカロミセｙ、 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、
スポドブテラ・フルギベルダ（Ｓｐｏｃｉｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉ−ｐＯｒｄａ） および植物もしくは動
物細胞、のような高等生物の細胞系である。
）、ストレプトミセス（８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｓｓ ）
、 スタフィロコックス（ｓｔａｐｈｙｘｏｃｏｃｃｕ
ｓ）種、例えばスタフィロコックス・アウレウス（Ｓ、
ａｕｒｅｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉユｌｕａ ）
種、例えばバチルス・スプテリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、 バチルス・アミロリキファシエンス（Ｂ、 ａ
ｍｙユｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ） 、バチルスの
セレウス（Ｂ、 ｃｅｒｅｕθ）もしくはバチリス・リ
ケニホルミ、ｘ、 （Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ日） 、
サッカロミセｙ、 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、
スポドブテラ・フルギベルダ（Ｓｐｏｃｉｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉ−ｐＯｒｄａ） および植物もしくは動
物細胞、のような高等生物の細胞系である。
原則的に、輸送発現によって、膜な通過することができ
石原核または真核生物起源のすべてのそれらのタンパク
質を得ることが可能になる。しかしながら、例えばホル
モン、す／ホカイン、インターフェロン、血液凝固因子
およびワクチンのように、薬学的に重要であり、しかも
アミノ末端プレ配列と一緒にペプチドとして自然界では
コードされているペプチド産物、が好ましい。ところが
、原核宿主生物においては、この真核生物のプレ配列が
宿主に内在するシグナルペプチターゼによって規則どお
りには切り離されないのである。
石原核または真核生物起源のすべてのそれらのタンパク
質を得ることが可能になる。しかしながら、例えばホル
モン、す／ホカイン、インターフェロン、血液凝固因子
およびワクチンのように、薬学的に重要であり、しかも
アミノ末端プレ配列と一緒にペプチドとして自然界では
コードされているペプチド産物、が好ましい。ところが
、原核宿主生物においては、この真核生物のプレ配列が
宿主に内在するシグナルペプチターゼによって規則どお
りには切り離されないのである。
大腸菌において、ペリプラズムおよび外膜のタンパク質
に関する遺伝子が輸送発現のためには適切である。前者
は産物をペリプラズム中に放出するのに対し、後者は外
膜上に放出する。
に関する遺伝子が輸送発現のためには適切である。前者
は産物をペリプラズム中に放出するのに対し、後者は外
膜上に放出する。
掲載した例は、大腸菌において極めて容易に発現される
ペリプラズムタンパクＴたるアルカリホスファターゼの
ＤＮＡシグナル配列である。（たｙし、本発明をこれに
制限するという意図はない）。
ペリプラズムタンパクＴたるアルカリホスファターゼの
ＤＮＡシグナル配列である。（たｙし、本発明をこれに
制限するという意図はない）。
大腸菌アルカリホスファターゼの最初の２０個のアミノ
酸を含む配列は以下に示されている。
酸を含む配列は以下に示されている。
Ｍｅ ｔ−Ｌｙｓ＝Ｇ１ｎ−Ｓｅ ｒ−Ｔｈ ｒ−工１
ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１・ ↑＝シグナルペブチターゼの好ましいスズライス部位 成熟タンパク質に約４０個まで、通常は約２０個まで、
の結合アミノ酸があれば、正確なプロセッシングには充
分であることが明らかになった。しかしながら、多くの
場合は、例えば約１０個、有利には約５個、のより少な
い結合アミノ酸でも充分である。より短いタンパク質鎖
は宿主細胞のタンパク質生合成系にストレスをさほど加
えなくなるため、本発明の有利な態様としては、アルカ
リホスファターゼのプレ配列および完全なタンパク質に
結合する５個のアミノ酸をブードするＤＮＡ配列工（後
記）が挙げられる。いくつかのトリプレットを改変（即
ち、独特な制限酵素切断部位を組込み、かつ開始コード
ンＧＴＧをＡＴＧで置換する改変）したことは除き、Ｄ
ＮＡ配列工はアルカリホスファタ”−ゼの天然配列と一
致する。コードクｈの末端には、２慣用的なりローニン
グベクター、例えば１）ＢＲ３２２，９口０８またはｐ
Ｏ（ｊ １２のような市販プラスミドと結合することが
可能な制限エンドヌクレアーゼＲｃＯ史 に相当する、
突出ＤＮＡ配列が位置している。
ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１・ ↑＝シグナルペブチターゼの好ましいスズライス部位 成熟タンパク質に約４０個まで、通常は約２０個まで、
の結合アミノ酸があれば、正確なプロセッシングには充
分であることが明らかになった。しかしながら、多くの
場合は、例えば約１０個、有利には約５個、のより少な
い結合アミノ酸でも充分である。より短いタンパク質鎖
は宿主細胞のタンパク質生合成系にストレスをさほど加
えなくなるため、本発明の有利な態様としては、アルカ
リホスファターゼのプレ配列および完全なタンパク質に
結合する５個のアミノ酸をブードするＤＮＡ配列工（後
記）が挙げられる。いくつかのトリプレットを改変（即
ち、独特な制限酵素切断部位を組込み、かつ開始コード
ンＧＴＧをＡＴＧで置換する改変）したことは除き、Ｄ
ＮＡ配列工はアルカリホスファタ”−ゼの天然配列と一
致する。コードクｈの末端には、２慣用的なりローニン
グベクター、例えば１）ＢＲ３２２，９口０８またはｐ
Ｏ（ｊ １２のような市販プラスミドと結合することが
可能な制限エンドヌクレアーゼＲｃＯ史 に相当する、
突出ＤＮＡ配列が位置している。
更に、いくつかの独＊な制限酵素切断部位がＤＮＡ配列
工の遺伝子内に組込まれており、これらによって一方で
は異質遺伝子を正確な部位に所望の読取り枠内で結合さ
せることが可能となり、他方では改変が可能となってい
る。
工の遺伝子内に組込まれており、これらによって一方で
は異質遺伝子を正確な部位に所望の読取り枠内で結合さ
せることが可能となり、他方では改変が可能となってい
る。
制限酵素 （コード細巾の）ヌクレオチド番
号の後で切断 Ｓａｕ ３ Ａ １９
Ｐｖｕ Ｉ ２２Ｈｐａ ＩＩ
５４ ） （天然遺伝子にＮｃｉ
Ｉ ５４ ） 存在する）ｎｕ
Ｉ ６６Ｈｐｈ
Ｉ ６８Ａｖａ ＩＩ
７０勿論、突出配列をそれが他
の制限酵素と対応するような方法で造成することも可能
であり、それによって所定方向で適切なベクターへの組
込みが可能となっている。これに関連して、専門家は、
遺伝子の造成に関連した複雑性およびその特異的な結合
性は、突出末端が同一である際に結合が両方向で生じろ
ことに関連して更に迷択という作娑をな−ｆ場合よりも
重要であるかどうかについて考慮するであろう。
号の後で切断 Ｓａｕ ３ Ａ １９
Ｐｖｕ Ｉ ２２Ｈｐａ ＩＩ
５４ ） （天然遺伝子にＮｃｉ
Ｉ ５４ ） 存在する）ｎｕ
Ｉ ６６Ｈｐｈ
Ｉ ６８Ａｖａ ＩＩ
７０勿論、突出配列をそれが他
の制限酵素と対応するような方法で造成することも可能
であり、それによって所定方向で適切なベクターへの組
込みが可能となっている。これに関連して、専門家は、
遺伝子の造成に関連した複雑性およびその特異的な結合
性は、突出末端が同一である際に結合が両方向で生じろ
ことに関連して更に迷択という作娑をな−ｆ場合よりも
重要であるかどうかについて考慮するであろう。
ＤＮＡ Ｑ Ｉは、長さが２６〜３１の塩基からなる６
個のオリゴヌクレオチドケ、まずそれらを化学的に合が
ｉし、次いで６個のヌクレオチドの粘着末端を介してそ
れらを酵素的に結合させることにより造成することがで
きろ。クローニングベクター、例えば前記市販グラスミ
ド、へのこの合成遺伝子の組込みは、それ自体公知の方
法で行なわれる。
個のオリゴヌクレオチドケ、まずそれらを化学的に合が
ｉし、次いで６個のヌクレオチドの粘着末端を介してそ
れらを酵素的に結合させることにより造成することがで
きろ。クローニングベクター、例えば前記市販グラスミ
ド、へのこの合成遺伝子の組込みは、それ自体公知の方
法で行なわれる。
本発明によるプレ配列を用いた大腸菌における真核遺伝
子が発現する例としては、下記のサルグロインシーリン
の合成がある。すなわち、プロインシュリン遺伝子〔ダ
ブリュー・ウエテカムら、遺伝子、第１９巻、１９８２
年、第１７９−１８３頁（Ｗ。
子が発現する例としては、下記のサルグロインシーリン
の合成がある。すなわち、プロインシュリン遺伝子〔ダ
ブリュー・ウエテカムら、遺伝子、第１９巻、１９８２
年、第１７９−１８３頁（Ｗ。
Ｗｅｔｅｋａｍ ｅｔ ａユ＋＠ Ｇｅｎｅ
１９（１９８２） １７９ − １８３） ］の付
随したＤＮＡ配列工がＲｃｏ ＲＩ の連結認識部位で
かつ化学的に合成された調節領域の下流に位Ｉトするよ
うにＤＮＡ配列を造成する。ここで該調節領域は細菌プ
ロモーター、 ｌａｃオペレーター、リポソーム結合部
位（西独特許出願１） ３４３０６８３．８ ）および
リポソーム結合部位から離れた６〜１４のヌクレオチド
からなるものである。発現したプロインシュリン融合ペ
プチドはアミノ末端に更に９個のアばノ酸を有している
が、これらは酵素的にまたは化学的に切り離すことがで
きろ。
１９（１９８２） １７９ − １８３） ］の付
随したＤＮＡ配列工がＲｃｏ ＲＩ の連結認識部位で
かつ化学的に合成された調節領域の下流に位Ｉトするよ
うにＤＮＡ配列を造成する。ここで該調節領域は細菌プ
ロモーター、 ｌａｃオペレーター、リポソーム結合部
位（西独特許出願１） ３４３０６８３．８ ）および
リポソーム結合部位から離れた６〜１４のヌクレオチド
からなるものである。発現したプロインシュリン融合ペ
プチドはアミノ末端に更に９個のアばノ酸を有している
が、これらは酵素的にまたは化学的に切り離すことがで
きろ。
合成遺伝子のｐＤｏ ｓへの組込みと、ＤＮＡ配列工に
結合した真核生物遺伝子を有する発現プラスミドの造成
とは、それ自体公知の方法によって行なわれる。これに
関しては、マニアティスによる教科＝Ｉｆ’（モレキュ
ラー・クローニング、マニアティスら、コールド・スプ
リング・ハーバ−、１９８２年（Ｍｏｌｅｃｕユａｒ
Ｏユｏｎｉｎｇ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ、、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
１９８２） ：）を参考にすることができる。このよう
にして得られたハイブリッドプラスミドの適切な宿主生
物、有利には大腸菌、への形質転換も同様にそれ自体公
知であり、上記教科書に詳ｎ日に記載されている。発現
タンパク質の単離およびそれらの精製も同じく記載され
ている。
結合した真核生物遺伝子を有する発現プラスミドの造成
とは、それ自体公知の方法によって行なわれる。これに
関しては、マニアティスによる教科＝Ｉｆ’（モレキュ
ラー・クローニング、マニアティスら、コールド・スプ
リング・ハーバ−、１９８２年（Ｍｏｌｅｃｕユａｒ
Ｏユｏｎｉｎｇ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ、、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
１９８２） ：）を参考にすることができる。このよう
にして得られたハイブリッドプラスミドの適切な宿主生
物、有利には大腸菌、への形質転換も同様にそれ自体公
知であり、上記教科書に詳ｎ日に記載されている。発現
タンパク質の単離およびそれらの精製も同じく記載され
ている。
下記語例には、本発明の更にいくつかの態様が具体的に
説明されており、それにより専門家であれば多数の可能
な改変（および組合せ）が明らかとなる。特記しない限
り、これら語例中のパーセントデータは重ｂ：に関する
。
説明されており、それにより専門家であれば多数の可能
な改変（および組合せ）が明らかとなる。特記しない限
り、これら語例中のパーセントデータは重ｂ：に関する
。
例
１、一本釦オリゴヌクレオテドの化学的合成遺伝子構造
単位の合成は、遺伝子の構造単位Ｉａの具体例によって
説明される。ここで、単位Ｉａは、コード細巾すヌクレ
オチド１〜２９よりｔ、ｃ ’Ｄ。３１末端のヌクレオ
シド、したがってこの場合のグアノシン（ヌクレオチド
番号２９）は、３１水酸基を介して、公知の方法〔エム
・ジェイ・ゲイトら、ヌクレイツク・アシッズ・リサー
チ、第８巻、１９８０年、ＯＬ、１０８１−１０９６頁
（ｋ＋、 Ｊ、Ｇａ１ｔ ｅｔ ａｌ−、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 ８ （１９８０） １０８１
−１０９６）］により、シリカゲル〔［フラクトシルＪ
（ＦＲＡＯＴＯ８工Ｌ）、メルク社製〕に共有結合さ
せる。このためには、まずシリカゲルに３−トリエトキ
シシリルプロビルアミノを反応させて、エタノールを除
去して５ｌ−０−８ｌ結合を形成させる。グアノシンを
Ｎ２１−インブチル−３１−０−スクシンイル−５１−
ジメトキシトリチルエーテルの形で、ｐ−ニトロフェノ
ールおよびＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド
の存在下に該改、変担体と反応させて、スクシノイル基
の遊離カルボキシ基でプロピルアミノ基のアミノ基をア
シル化させる。
単位の合成は、遺伝子の構造単位Ｉａの具体例によって
説明される。ここで、単位Ｉａは、コード細巾すヌクレ
オチド１〜２９よりｔ、ｃ ’Ｄ。３１末端のヌクレオ
シド、したがってこの場合のグアノシン（ヌクレオチド
番号２９）は、３１水酸基を介して、公知の方法〔エム
・ジェイ・ゲイトら、ヌクレイツク・アシッズ・リサー
チ、第８巻、１９８０年、ＯＬ、１０８１−１０９６頁
（ｋ＋、 Ｊ、Ｇａ１ｔ ｅｔ ａｌ−、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 ８ （１９８０） １０８１
−１０９６）］により、シリカゲル〔［フラクトシルＪ
（ＦＲＡＯＴＯ８工Ｌ）、メルク社製〕に共有結合さ
せる。このためには、まずシリカゲルに３−トリエトキ
シシリルプロビルアミノを反応させて、エタノールを除
去して５ｌ−０−８ｌ結合を形成させる。グアノシンを
Ｎ２１−インブチル−３１−０−スクシンイル−５１−
ジメトキシトリチルエーテルの形で、ｐ−ニトロフェノ
ールおよびＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド
の存在下に該改、変担体と反応させて、スクシノイル基
の遊離カルボキシ基でプロピルアミノ基のアミノ基をア
シル化させる。
次の合成過程では、塩基成分は５１−０−ジメトキシト
リチルヌクレオシド−３′−亜リン酸ジアルキルアミド
もしくはクロリドのモノメチルエステルとして使用され
、更にアデニンはＮ６−ベンゾイル化合物の形、ントシ
ンはＮ４−ベンゾイル化合物の形、グアニンはＮ２−イ
ンブチリル化合物の形で使用されるが、チミンはアミノ
基乞有していないため保護基なしで使用される。
リチルヌクレオシド−３′−亜リン酸ジアルキルアミド
もしくはクロリドのモノメチルエステルとして使用され
、更にアデニンはＮ６−ベンゾイル化合物の形、ントシ
ンはＮ４−ベンゾイル化合物の形、グアニンはＮ２−イ
ンブチリル化合物の形で使用されるが、チミンはアミノ
基乞有していないため保護基なしで使用される。
２μｍｏ１の結合グアノシンを含有するポリマー担体５
０ ｍｇを、下記試薬にて連続的に処理″ｆる。
０ ｍｇを、下記試薬にて連続的に処理″ｆる。
ａ）ニトロメタン
ｂ）水１％含有ニトロメタン中の飽和臭化能鉛溶直
Ｃ）メタノール
ｄ）テトラヒドロフラン
ｅ）アセトニトリル
ｆ）４’ｆｆ水アセトニトリル０．５ ｍｌ 中の適
切なヌクレオシド亜リン酸エステル４０Ｉｔｍｏユおよ
びテトラゾール２００μｍｏｌ （５分間） ｇ）ルチジン４０％およびジメチルアミノピリジン１０
％含有テトラヒドロフラン中の２０係無水酢酸（２分間
） ｈ）テトラヒドロフラン １）水２０％およびルチジン４０％含有テトラヒドロフ
ラン ｊ）容積比５：４：１のコリジン／水／テトラヒドロフ
ラン中の３鴫ヨウ素 ｋ）テトラヒドロフラン、および １）メタノール これに関して、用語［亜リン酸エステル（ｐｈｏｓｐｈ
ｉｔｅ ）Ｊとは、デオキシリボース−３’−％／亜リ
ン酸のモノメチルエステルであると理解されたいが、そ
の三番目の原子価はクロリドまたは第三アミノ基、例え
ばモルホリノ基、で充足されている。各合成過程での収
率は、脱トリチル化反応（１））の後に、それぞれの場
合において分光測定法によって、波長４９６ ｎｍ に
おけるジメトキシトリチル陽イオンの吸収を辿ｌ定する
ことにより調べることができろ。
切なヌクレオシド亜リン酸エステル４０Ｉｔｍｏユおよ
びテトラゾール２００μｍｏｌ （５分間） ｇ）ルチジン４０％およびジメチルアミノピリジン１０
％含有テトラヒドロフラン中の２０係無水酢酸（２分間
） ｈ）テトラヒドロフラン １）水２０％およびルチジン４０％含有テトラヒドロフ
ラン ｊ）容積比５：４：１のコリジン／水／テトラヒドロフ
ラン中の３鴫ヨウ素 ｋ）テトラヒドロフラン、および １）メタノール これに関して、用語［亜リン酸エステル（ｐｈｏｓｐｈ
ｉｔｅ ）Ｊとは、デオキシリボース−３’−％／亜リ
ン酸のモノメチルエステルであると理解されたいが、そ
の三番目の原子価はクロリドまたは第三アミノ基、例え
ばモルホリノ基、で充足されている。各合成過程での収
率は、脱トリチル化反応（１））の後に、それぞれの場
合において分光測定法によって、波長４９６ ｎｍ に
おけるジメトキシトリチル陽イオンの吸収を辿ｌ定する
ことにより調べることができろ。
オリゴヌクレオチドの合成が完成したら、オリゴマーの
メチルリン酸エステル保護基をｐ−チオクレゾールおよ
びトリエチルアミノを用いて脱離させる。オリゴヌクレ
オチドは、次いで、アンモニアで３時間処理することに
より、固体担体から外ｆ。オリゴマーを濃アンモニアで
２〜３日間処理すれは、塩基上のアミノ保護基が定を的
に除去される。このようにして得られた粗生成物は、甚
圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＯ） またはポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製されろ。
メチルリン酸エステル保護基をｐ−チオクレゾールおよ
びトリエチルアミノを用いて脱離させる。オリゴヌクレ
オチドは、次いで、アンモニアで３時間処理することに
より、固体担体から外ｆ。オリゴマーを濃アンモニアで
２〜３日間処理すれは、塩基上のアミノ保護基が定を的
に除去される。このようにして得られた粗生成物は、甚
圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＯ） またはポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製されろ。
声転子におけろ他の構造単位Ｉｔ） −Ｉｆは全く同様
にして合成されるが、それらのヌクレオチド配列はＤＮ
Ａ配列ＩＩ （後記）から明らかとなる。
にして合成されるが、それらのヌクレオチド配列はＤＮ
Ａ配列ＩＩ （後記）から明らかとなる。
２、 ＤＮＡ配列■を得ろための一本釦オリゴヌクレ
オチドの酵素的結合 末端オリゴヌクレオチド１ａおよび工ｆはリン酸イヒさ
れない。そのことによって、突出末端を介するオリゴマ
ー化が防止される。オリゴヌクレオチドＩｔ）、Ｉｃ、
ＩｄおよびＩｅのリン酸化のために、各場合において、
これらの化合物１ｎｍｏｌ ヲ、３７℃で３０分間、ア
デノシンニリン９５ｎｍｏユ並びにＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ４単位（２０μユの５０ｍＭ ）リスＨＣ１
緩衝液（ｐＨ７，６）、ＩＱ ｍＭ ｑ化マグネシウム
およびｌＱｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ ）中）と
−緒に処理ｊる。酢非を、９５°Ｃで５分間加熱するこ
とによって不活化させる。オリゴヌクレオチドＩａ −
Ｉｆ ′？：、２０ ｍ１ｆｔ ＫＯ，ｌ溶液中でそれ
らを加熱し、しかる後徐々に（２時間以上かけて）１６
℃まで冷却ｆることにより、結合させかつハイブリダイ
ズさせて、二本鎖とする。ＤＮＡ配列Ｉに従うＤＮＡ断
片を得る上での連結は５０ＩｌｎＭトリスＨＣ１緩衝液
（２０ｍＭ Ｑ化マグネシウムおよび１０ ｍＭ ＤＴ
Ｔ ）４０μｍ中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ１００単位を
用い、１５℃にて１８Ｆ１５間以上反応させることによ
り行なう。遺伝子断片の精製は、１０％ポリアクリルア
ミドゲル（尿素非添加、２０Ｘ４０ ｃｍ、 １ ｍｍ
厚）上でのゲル電気泳動により行なわれるが、ここで使
用されるマーカー物ケはＨｌｎｆ Ｉで切断されたφＸ
１７４ＤＮＡ（ＥＲＬ社！！Ａ）またはＨａｅ Ｉｌｌ
で切断されたｐＢＲ３２２である。
オチドの酵素的結合 末端オリゴヌクレオチド１ａおよび工ｆはリン酸イヒさ
れない。そのことによって、突出末端を介するオリゴマ
ー化が防止される。オリゴヌクレオチドＩｔ）、Ｉｃ、
ＩｄおよびＩｅのリン酸化のために、各場合において、
これらの化合物１ｎｍｏｌ ヲ、３７℃で３０分間、ア
デノシンニリン９５ｎｍｏユ並びにＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ４単位（２０μユの５０ｍＭ ）リスＨＣ１
緩衝液（ｐＨ７，６）、ＩＱ ｍＭ ｑ化マグネシウム
およびｌＱｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ ）中）と
−緒に処理ｊる。酢非を、９５°Ｃで５分間加熱するこ
とによって不活化させる。オリゴヌクレオチドＩａ −
Ｉｆ ′？：、２０ ｍ１ｆｔ ＫＯ，ｌ溶液中でそれ
らを加熱し、しかる後徐々に（２時間以上かけて）１６
℃まで冷却ｆることにより、結合させかつハイブリダイ
ズさせて、二本鎖とする。ＤＮＡ配列Ｉに従うＤＮＡ断
片を得る上での連結は５０ＩｌｎＭトリスＨＣ１緩衝液
（２０ｍＭ Ｑ化マグネシウムおよび１０ ｍＭ ＤＴ
Ｔ ）４０μｍ中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ１００単位を
用い、１５℃にて１８Ｆ１５間以上反応させることによ
り行なう。遺伝子断片の精製は、１０％ポリアクリルア
ミドゲル（尿素非添加、２０Ｘ４０ ｃｍ、 １ ｍｍ
厚）上でのゲル電気泳動により行なわれるが、ここで使
用されるマーカー物ケはＨｌｎｆ Ｉで切断されたφＸ
１７４ＤＮＡ（ＥＲＬ社！！Ａ）またはＨａｅ Ｉｌｌ
で切断されたｐＢＲ３２２である。
３、ｐ００８への遺伝子断片の組込み
市販プラスミドｐＯＣ８を、公知の方法で、しかも制限
エンドヌクレアーゼＦ、ｃｏ Ｒ１を用いた製造者のデ
ータに基づき開環させる。消化混合物を５係ポリアクリ
ルアミドゲル上での電気泳動により、公知の方法で分別
し、ＤＮＡは臭化エチジウムで着色するか、または放射
活性標識法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の 「
ニックトランスレーション」法（前出文献）〕により視
認できるようにする。プラスミド帯は次いでアクリルア
ミドゲルから切出し、電気泳動法によりポリアクリルア
ミドから分離する。
エンドヌクレアーゼＦ、ｃｏ Ｒ１を用いた製造者のデ
ータに基づき開環させる。消化混合物を５係ポリアクリ
ルアミドゲル上での電気泳動により、公知の方法で分別
し、ＤＮＡは臭化エチジウムで着色するか、または放射
活性標識法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の 「
ニックトランスレーション」法（前出文献）〕により視
認できるようにする。プラスミド帯は次いでアクリルア
ミドゲルから切出し、電気泳動法によりポリアクリルア
ミドから分離する。
４、ＤＮＡ配列Ｉの発現プラスミドへの組込みサルプロ
インシュリンの情報を有する発現プラスミドｐＷＩ ６
は下記の通りに造成される。
インシュリンの情報を有する発現プラスミドｐＷＩ ６
は下記の通りに造成される。
１０μｇのプラスミドｐＢＲ３２２を制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏ ＲＩおよびＰｖｕ ＩＩで消化し、次い
でＥｃｏ Ｒ１切断部位を「埋填反応Ｊ （ｆｉｌｌ−
１ｎ ｒｅａｃ−ｔｉｏｎ）によってフレノウポリメラ
ーゼを用いて埋填する。５％ポリアクリルアミドゲルで
のゲル電気法ｙｊによる分別に続き、電気溶出法によっ
て長’１ｇ２２９３Ｂｐのプラスミド断片を得ることが
できる（第１図（Ｆ工Ｇ １） ）。
アーゼＥｃｏ ＲＩおよびＰｖｕ ＩＩで消化し、次い
でＥｃｏ Ｒ１切断部位を「埋填反応Ｊ （ｆｉｌｌ−
１ｎ ｒｅａｃ−ｔｉｏｎ）によってフレノウポリメラ
ーゼを用いて埋填する。５％ポリアクリルアミドゲルで
のゲル電気法ｙｊによる分別に続き、電気溶出法によっ
て長’１ｇ２２９３Ｂｐのプラスミド断片を得ることが
できる（第１図（Ｆ工Ｇ １） ）。
プラスミドｐＢＲ３２２に組込まれたサルプレプロイン
シュリンＤＮＡ （ウェテカムら、遺伝子、第１９巻、
１９８２年、第１７９−１８３頁（Ｗｅｔｅｋａｍ ｅ
ｔ ａｌ、 。
シュリンＤＮＡ （ウェテカムら、遺伝子、第１９巻、
１９８２年、第１７９−１８３頁（Ｗｅｔｅｋａｍ ｅ
ｔ ａｌ、 。
ｏｅｎｅ １９ （１９８２） １７９−１８３） ］
Ｙ、制限エンドヌクレアーゼＨ１ｎｄ Ｉｎおよびル
狛ｔＨを用いて切断することにより（約１２５０ Ｂｐ
の断片として〕単離し、続いて下記のようにしてプラス
ミドｐＯＣ９に再クローン化する。丁なわち、プラスミ
ドｐ［ＪＯ９を酵素ＢにＨ工で切断し、切断部位を標漁
埋垣反応によりフレノウポリメラーゼの使用により埋填
しく「大断片」）、それに続いて制限酵素Ｈ１ｎｄ Ｉ
Ｔ！ による切断を行ない、このＤＮＡを５幅ポリアク
リルアミドゲルでのゲル電気泳動により他のＤＮＡ断片
から分離する。分離された長さ約１２５０ Ｂｐのイン
シュリンＤＮＡ断片をこの開環プラスミドに糾込む。
Ｙ、制限エンドヌクレアーゼＨ１ｎｄ Ｉｎおよびル
狛ｔＨを用いて切断することにより（約１２５０ Ｂｐ
の断片として〕単離し、続いて下記のようにしてプラス
ミドｐＯＣ９に再クローン化する。丁なわち、プラスミ
ドｐ［ＪＯ９を酵素ＢにＨ工で切断し、切断部位を標漁
埋垣反応によりフレノウポリメラーゼの使用により埋填
しく「大断片」）、それに続いて制限酵素Ｈ１ｎｄ Ｉ
Ｔ！ による切断を行ない、このＤＮＡを５幅ポリアク
リルアミドゲルでのゲル電気泳動により他のＤＮＡ断片
から分離する。分離された長さ約１２５０ Ｂｐのイン
シュリンＤＮＡ断片をこの開環プラスミドに糾込む。
翻訳されない傾城およびプレ配列を除去￥るために、こ
のようにして改変したｐＯＣ９プラスミドをＨａｅｌｌ
ｌで消化し、更にプレ配列から最後の二つのヌクレオチ
ドを切り離すために、長さ１４３ Ｂｐの断片を一定の
酵素条件下で、Ｂａｄ ３１で消化する。
のようにして改変したｐＯＣ９プラスミドをＨａｅｌｌ
ｌで消化し、更にプレ配列から最後の二つのヌクレオチ
ドを切り離すために、長さ１４３ Ｂｐの断片を一定の
酵素条件下で、Ｂａｄ ３１で消化する。
これにより、アミノ末端の最初のコードンがＴＴＴとな
るが、これはＢ釦の最初のアミノ酸たるフェニルアラニ
ンを表わす。
るが、これはＢ釦の最初のアミノ酸たるフェニルアラニ
ンを表わす。
Ｂｃｏ ＲＩ に特異的なアダプターを、プラントエ
ンド連結反応によりこの断片上に連結する：ａ） ５”
ＡＡＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＯＧＯＡ ＡＴＧ
Ｒｃｏ ＲＩ ＴＡ ＯＴＴ ＡＡＧ ＯＧ
Ｔ ＴＡＯ’Ｉ）） ５’ ＡＡＴ ＴＡＴ
ＧＡＡ ＴＴＯＧＯＡ ＡＧＡＥｃｏ ＰＩ
ＴＡ ＯＴＴ ＡＡＧ ＯＧＴ ＴＯＴアダプター
の重合乞防止するため、それらは連結反応ではリン酸化
しないで使用する（これは、例えば埋填によって不活化
された認識配列と同様に、図中Ｒｃｏ ＲＩ−で、示さ
れている）。アダプターａ）は末端にメチオニンのコー
ドンを有し、アダプター ｂ）はアルギニンのコードン
を有している。
ンド連結反応によりこの断片上に連結する：ａ） ５”
ＡＡＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＯＧＯＡ ＡＴＧ
Ｒｃｏ ＲＩ ＴＡ ＯＴＴ ＡＡＧ ＯＧ
Ｔ ＴＡＯ’Ｉ）） ５’ ＡＡＴ ＴＡＴ
ＧＡＡ ＴＴＯＧＯＡ ＡＧＡＥｃｏ ＰＩ
ＴＡ ＯＴＴ ＡＡＧ ＯＧＴ ＴＯＴアダプター
の重合乞防止するため、それらは連結反応ではリン酸化
しないで使用する（これは、例えば埋填によって不活化
された認識配列と同様に、図中Ｒｃｏ ＲＩ−で、示さ
れている）。アダプターａ）は末端にメチオニンのコー
ドンを有し、アダプター ｂ）はアルギニンのコードン
を有している。
このようにして、ａ）により得られた遺伝子生成物は細
菌由来の部分を臭化シアンによる切断によって切り離ス
ことができ、一方ｂ）による場合はトリプシン切ｎが可
能である。
菌由来の部分を臭化シアンによる切断によって切り離ス
ことができ、一方ｂ）による場合はトリプシン切ｎが可
能である。
′連結生成物を、ＭｂＯ［で消化する。ゲル電気泳動で
の分別後、Ｂ釦アミノ酸１〜２１番の情＠７有する長さ
７９ ＢｐのＤＮＡ断片が得られる。
の分別後、Ｂ釦アミノ酸１〜２１番の情＠７有する長さ
７９ ＢｐのＤＮＡ断片が得られる。
プロインシュリン分子に関して残余の情報を有する遺伝
子（クローニングからのＯ−Ｃ配列と、停止コー・トン
に連結したｐＢＲ３２２による２１塩基対とを含む）は
、サルプレグロインシュリンの完全な情報を有するｐＵ
Ｃｅプラスミドから、ｕｂｏ ■／Ｂｍｈ Ｉで切断し
、更に長さ約２４０ ＢｐのＤＮＡ断片を単離すること
により得られる。長さ約３２０ Ｂｐの正確な連結生成
物（１８Ｂｐのアダプターを有する）は、二つのプロイ
ンシュリン断片を連結してイ５られる。このようにして
造成されたこのプロインシュリンＤＮＡ １ｆＦＩ片は
、Ｔｂｃｏ ＲＩ非切断部位を介して、調節傾城と互い
に連結することができる。
子（クローニングからのＯ−Ｃ配列と、停止コー・トン
に連結したｐＢＲ３２２による２１塩基対とを含む）は
、サルプレグロインシュリンの完全な情報を有するｐＵ
Ｃｅプラスミドから、ｕｂｏ ■／Ｂｍｈ Ｉで切断し
、更に長さ約２４０ ＢｐのＤＮＡ断片を単離すること
により得られる。長さ約３２０ Ｂｐの正確な連結生成
物（１８Ｂｐのアダプターを有する）は、二つのプロイ
ンシュリン断片を連結してイ５られる。このようにして
造成されたこのプロインシュリンＤＮＡ １ｆＦＩ片は
、Ｔｂｃｏ ＲＩ非切断部位を介して、調節傾城と互い
に連結することができる。
第２図は全反■杼過を示しているが、そこでＡ、Ｂおよ
びＣはプロインシュＩＪ ７分子の特定のペプチド鎖に
ついてのＤＮＡ ９示し、Ａｄは（脱リン酸化）アダプ
ター（ａまたはｂ）を示し、Ｐｒｏはサルプレプロイン
シュリンのプレ配列についてのＤＮＡを示す。
びＣはプロインシュＩＪ ７分子の特定のペプチド鎖に
ついてのＤＮＡ ９示し、Ａｄは（脱リン酸化）アダプ
ター（ａまたはｂ）を示し、Ｐｒｏはサルプレプロイン
シュリンのプレ配列についてのＤＮＡを示す。
化学的に合成された調節頓域はＢａｍ Ｈ工、ｌａｃオ
ペレーター（０〕、細菌プロモーター（Ｐ）およびリボ
ンーム結合部位（ＲＢ）についての認識配列かＩ−）な
り、ＡＴＧ開始コードンをＲＢから６〜１４ヌクレオチ
ド離れて有し、史にＫｃｏ ＲＩ の連結望詭配列を有
しているところ（第３図）、この傾城乞、前記の例によ
り得られたプロインシュリン遺伝子断片と、共通のＥｃ
ｏ ＲＩ ＠複頌城を介して連結させろ。
ペレーター（０〕、細菌プロモーター（Ｐ）およびリボ
ンーム結合部位（ＲＢ）についての認識配列かＩ−）な
り、ＡＴＧ開始コードンをＲＢから６〜１４ヌクレオチ
ド離れて有し、史にＫｃｏ ＲＩ の連結望詭配列を有
しているところ（第３図）、この傾城乞、前記の例によ
り得られたプロインシュリン遺伝子断片と、共通のＥｃ
ｏ ＲＩ ＠複頌城を介して連結させろ。
下記の合成した調節傾城（第１表のＤＮＡ配列［ａ、西
独特許量〆）ｐ、 ｐ ３４３０６８３．８号に対応）
を選択することが有利である。
独特許量〆）ｐ、 ｐ ３４３０６８３．８号に対応）
を選択することが有利である。
５’ ＧＡＴＣＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＣ
ＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡ ３’３’ ＧＡＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＡＧＡＡＣＴＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴ ５’（
ＢａｍＨ工） Ｐ５’
ＴＡＡＴＴＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴ
ＧＴＧＡＧＣＧ ３’３’ ＡＴＴＡＡＡＣＣＡＴＡ
ＴＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣ５’５’
ＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴ
ＡＧ ３’３’ ＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡ
ＧＴＧＴＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡ ５マＲＢ
（Ｅｃｏ ＲＩ） 第１表に示した別の合成調節傾城も同様に使用すること
ができる。しかしながら、文献公知の天然または誘導さ
れた〔パールマンら、前出文献（Ｐｅｒｌｍａｎ ｅｔ
ａｌ、、 ｌｏｃ、ｃｉｔ、） ］シグナル配列を選
択してもよい。
ＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡ ３’３’ ＧＡＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＡＧＡＡＣＴＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴ ５’（
ＢａｍＨ工） Ｐ５’
ＴＡＡＴＴＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴ
ＧＴＧＡＧＣＧ ３’３’ ＡＴＴＡＡＡＣＣＡＴＡ
ＴＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣ５’５’
ＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴ
ＡＧ ３’３’ ＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡ
ＧＴＧＴＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡ ５マＲＢ
（Ｅｃｏ ＲＩ） 第１表に示した別の合成調節傾城も同様に使用すること
ができる。しかしながら、文献公知の天然または誘導さ
れた〔パールマンら、前出文献（Ｐｅｒｌｍａｎ ｅｔ
ａｌ、、 ｌｏｃ、ｃｉｔ、） ］シグナル配列を選
択してもよい。
Ｓｍａ Ｉ ／ Ｂａｎ Ｈｌでの二重消化およびＢａ
ｎ ＨＩ 切断部位のフレノウ断片による埋填反応に続
いて、連結生成物（約４２０ Ｂｐ ）をゲル電気泳動
により単離する。
ｎ ＨＩ 切断部位のフレノウ断片による埋填反応に続
いて、連結生成物（約４２０ Ｂｐ ）をゲル電気泳動
により単離する。
このようにして得られた断片は次いで、プラントエンド
連結によって、第１図のｐＢＲ３２２部分プラスミド中
に連結することができろ（第４図）・・イブリットプラ
スミドｐｗｒ ｓが得られる。
連結によって、第１図のｐＢＲ３２２部分プラスミド中
に連結することができろ（第４図）・・イブリットプラ
スミドｐｗｒ ｓが得られる。
大腸菌ＨＢ １０１ 株での形質転換とアンピシリンプ
レートでの選別との後に、それぞれのクローンのプラス
ミドＤＮＡに関し、調節領域を有する４２０Ｂｐの断片
とＢａｌ ３１で短縮化されたプロインシュリン遺伝子
との連結性について試験した。Ｂａｌ ３１によるプロ
インシーリン遺伝子の正確な短縮化（第２図）を調べる
ために、連結されたプロインシュリン遺伝子断片を有す
るプラスミドを、Ｅｃｏ Ｒ工切断部位から順番に兼べ
た。霊べられた６０のクローンの中で、三つが、二つの
ヌクレオチドによる望ましい短縮体（第４図）を有して
いた。
レートでの選別との後に、それぞれのクローンのプラス
ミドＤＮＡに関し、調節領域を有する４２０Ｂｐの断片
とＢａｌ ３１で短縮化されたプロインシュリン遺伝子
との連結性について試験した。Ｂａｌ ３１によるプロ
インシーリン遺伝子の正確な短縮化（第２図）を調べる
ために、連結されたプロインシュリン遺伝子断片を有す
るプラスミドを、Ｅｃｏ Ｒ工切断部位から順番に兼べ
た。霊べられた６０のクローンの中で、三つが、二つの
ヌクレオチドによる望ましい短縮体（第４図）を有して
いた。
ｌμｇのプラスミドｐＷＩ ６を制限酵素Ｋｃｏ Ｒ工
で切断し、次いで３０ ｎｇのＤ）ＪＡ配列工の存在下
、１６℃で６時間互いに連結させる。大腸菌ＨＢＩＯＩ
での形質転換後、プラスミドを各クローンから単離し、
制限酵素分析によってＤＮＡ配列Ｉが入っているか否か
を試験する。７％のクローンが、連結したＤ！ＪＡ配列
Ｉを有するプラスミドを含有していた。
で切断し、次いで３０ ｎｇのＤ）ＪＡ配列工の存在下
、１６℃で６時間互いに連結させる。大腸菌ＨＢＩＯＩ
での形質転換後、プラスミドを各クローンから単離し、
制限酵素分析によってＤＮＡ配列Ｉが入っているか否か
を試験する。７％のクローンが、連結したＤ！ＪＡ配列
Ｉを有するプラスミドを含有していた。
この連結反応の方向性は、Ｈｌｎｄ ｌ［／ ｐｖｕ
Ｉでの二重消化による制限酵素標準分析法によって確実
に測定することができる。プロインシュリン遺伝子が正
確な続取り方向で連結されたＤＮＡ配列工を有するプラ
スミドｐＷＩ ６は、第５図にｐＷＩＰ １ として
示されている。
Ｉでの二重消化による制限酵素標準分析法によって確実
に測定することができる。プロインシュリン遺伝子が正
確な続取り方向で連結されたＤＮＡ配列工を有するプラ
スミドｐＷＩ ６は、第５図にｐＷＩＰ １ として
示されている。
このプラスミドは、次いで、６株の合成能力を調べるた
めに、各種の大腸菌株に形質転換することができる。
めに、各種の大腸菌株に形質転換することができる。
プレ配列−プロインシュリン遺伝子融合体の大腸菌での
発現は、下記のように決定される。
発現は、下記のように決定される。
ＩＰＴＧ （イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド）で誘導された細菌培地１ ｍｌを、ＯＤ ６００
の光学濃度が１．０で誘導時間が１時間のときにおける
最終濃度が５Ｘ １０” Ｍの時点で、ＰＭＳＦ （フ
ェニルメチルスルホニルフルオリド）を用いテ停止させ
、氷冷し、遠心分離する。細胞沈降物を次いで緩衝液（
１０ｍＭトリス）（ＣＩ 、 ｐ）Ｔ ７，６ ； ４
０ｍＭＮａ（：Ｌ ） １ ｍｌで洗浄し、遠心分離し
、緩衝液２０チスクロース； ２０ ｍＭ ）リスＭＣ
Ｉ、ｐＨ８，０； ２ｍＭ Ｅｌ）ＴＡ ） ２００
μｌに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートし、
遠心分離して、直ちに二重蒸留水５００μｍに再懸濁す
る。氷中ｌＯ分間インキエベートした後、ショック溶菌
した（ ５ｈｏｃｋ−１ｙｓｅｄ ）細菌を遠心分離し
、上澄を凍結する。この上澄のプロインシュリン含量を
標準インシュリンＲＩＡ ［アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ ） ］で調べる０細菌沈降物を再度、リゾチー
ム緩衝液（２０％スクロース；２ｍｇ／ｍｌリゾチーム
；２０ｍＭ）リス）［：ｌ 、 ｐＨ８，０； ２ ｍ
Ｍ ＦｉＤＴＡ ） ２００ μｌに再懸濁させ、水中
で３０分間インキュベートし、１０秒で三回超音波処理
し、次いで遠心分離する。これにより得られる上澄につ
いて放射免疫試験でプロインシュリン含１％１：（「プ
ラズマ画分」）を調べる。
シド）で誘導された細菌培地１ ｍｌを、ＯＤ ６００
の光学濃度が１．０で誘導時間が１時間のときにおける
最終濃度が５Ｘ １０” Ｍの時点で、ＰＭＳＦ （フ
ェニルメチルスルホニルフルオリド）を用いテ停止させ
、氷冷し、遠心分離する。細胞沈降物を次いで緩衝液（
１０ｍＭトリス）（ＣＩ 、 ｐ）Ｔ ７，６ ； ４
０ｍＭＮａ（：Ｌ ） １ ｍｌで洗浄し、遠心分離し
、緩衝液２０チスクロース； ２０ ｍＭ ）リスＭＣ
Ｉ、ｐＨ８，０； ２ｍＭ Ｅｌ）ＴＡ ） ２００
μｌに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートし、
遠心分離して、直ちに二重蒸留水５００μｍに再懸濁す
る。氷中ｌＯ分間インキエベートした後、ショック溶菌
した（ ５ｈｏｃｋ−１ｙｓｅｄ ）細菌を遠心分離し
、上澄を凍結する。この上澄のプロインシュリン含量を
標準インシュリンＲＩＡ ［アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ ） ］で調べる０細菌沈降物を再度、リゾチー
ム緩衝液（２０％スクロース；２ｍｇ／ｍｌリゾチーム
；２０ｍＭ）リス）［：ｌ 、 ｐＨ８，０； ２ ｍ
Ｍ ＦｉＤＴＡ ） ２００ μｌに再懸濁させ、水中
で３０分間インキュベートし、１０秒で三回超音波処理
し、次いで遠心分離する。これにより得られる上澄につ
いて放射免疫試験でプロインシュリン含１％１：（「プ
ラズマ画分」）を調べる。
プラスミドｐＷＴＰ １を含む各細菌クローンに関し、
それらの合成能力およびプロインシュリン−プレ配列生
成物のそれらの輸送能力てついて調験した。予期したよ
うに、全ての細菌クローンについて、９０％の産生プロ
インシュリンがペリプラズム空間に輸送されたことを証
明することができたつ約１０チのプロインシュリンのＲ
ＩＡ活性はプラズマ画分中にまだ見出された。
それらの合成能力およびプロインシュリン−プレ配列生
成物のそれらの輸送能力てついて調験した。予期したよ
うに、全ての細菌クローンについて、９０％の産生プロ
インシュリンがペリプラズム空間に輸送されたことを証
明することができたつ約１０チのプロインシュリンのＲ
ＩＡ活性はプラズマ画分中にまだ見出された。
ツＩＡ 配列 工
１リプレットＮｏ、１ ２ ３７ミ）９
Ｎｏ、 Ｍ＝ｔ Ｌｙｓ
Ｇｌｎヌクレオチド＋ Ｎｃ、
５ ＩＱコート与肖５’ＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＡ非コード領
３° Ｇ ＴＡＣＴＴＴ ＣＴＴム
５ ６ ７ ８ ９
１０ １１ １２ １３Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｉｌ＝ Ａｌａ Ｌｅｔｉ
Ａｌａ Ｌｅｌ」 Ｌｅｕ Ｐ
ｒｏ ＬＩ？すＡＧＣＡＣＧ ＡＴＣＧＣＡ
ＣＴＧ ＧＣＡ ＣＴＣＴＴＡ ＣＣＧ
ＴＴＡＴＣＧ ＴＧＣＴＡＧ ＣＧＴ Ｇ
ＡＣＣＯＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＧＣＡＡＴ
１ム １５ １６ １７ １８ １９ ２
０ ２１ ２２ ２３Ｌｅｕ Ｐｈ＝ Ｔｈ
ｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｒｇ Ｔｈｒ＋＋５ ５０
５５ ６０ ６５ ７０ＣＴＧ
ＴＴＴ ＡＣＣＣＣＧ ＧＴＯＡＣＡ ＡＡ
Ａ ＱＣＴ ＣＯＧ ＡＣＣＧＡＣＡＡＡ τ
ＯＧ ＧＧＣＣＡＣＴＧＴ ＴＴＴ ＣＧＡ
ＧＣＣＴＧＧ２＋＋ ２５ ２６ ＰｒｏｃｌｕＭｅｅ ７５ ８０ ８１＋ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＴＯＧ ３’ＧＧＴ
ＣＴＴ ＴＡＣＣＴＴ ＡＡ ５’Ｄに一配
列 工＝・ Ｉ＆ − ５リ ＡＡ ＴτＣＡ′Ｔ口 Ａ憂 Ｃ咥 −Ｇ
ｏ ＡＣＣなＴＣＧ謬 Ｃ”りＧ τλＣＴＴ
Ｔ Ｑτワ τに τりＣτＡＧ
ＣＯ二 ＧμＣＥ：ＯＦ、二
□ １り □
Ｎｏ、 Ｍ＝ｔ Ｌｙｓ
Ｇｌｎヌクレオチド＋ Ｎｃ、
５ ＩＱコート与肖５’ＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＡ非コード領
３° Ｇ ＴＡＣＴＴＴ ＣＴＴム
５ ６ ７ ８ ９
１０ １１ １２ １３Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｉｌ＝ Ａｌａ Ｌｅｔｉ
Ａｌａ Ｌｅｌ」 Ｌｅｕ Ｐ
ｒｏ ＬＩ？すＡＧＣＡＣＧ ＡＴＣＧＣＡ
ＣＴＧ ＧＣＡ ＣＴＣＴＴＡ ＣＣＧ
ＴＴＡＴＣＧ ＴＧＣＴＡＧ ＣＧＴ Ｇ
ＡＣＣＯＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＧＣＡＡＴ
１ム １５ １６ １７ １８ １９ ２
０ ２１ ２２ ２３Ｌｅｕ Ｐｈ＝ Ｔｈ
ｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｒｇ Ｔｈｒ＋＋５ ５０
５５ ６０ ６５ ７０ＣＴＧ
ＴＴＴ ＡＣＣＣＣＧ ＧＴＯＡＣＡ ＡＡ
Ａ ＱＣＴ ＣＯＧ ＡＣＣＧＡＣＡＡＡ τ
ＯＧ ＧＧＣＣＡＣＴＧＴ ＴＴＴ ＣＧＡ
ＧＣＣＴＧＧ２＋＋ ２５ ２６ ＰｒｏｃｌｕＭｅｅ ７５ ８０ ８１＋ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＴＯＧ ３’ＧＧＴ
ＣＴＴ ＴＡＣＣＴＴ ＡＡ ５’Ｄに一配
列 工＝・ Ｉ＆ − ５リ ＡＡ ＴτＣＡ′Ｔ口 Ａ憂 Ｃ咥 −Ｇ
ｏ ＡＣＣなＴＣＧ謬 Ｃ”りＧ τλＣＴＴ
Ｔ Ｑτワ τに τりＣτＡＧ
ＣＯ二 ＧμＣＥ：ＯＦ、二
□ １り □
第１図は、プラスミドｐＢＲ３２２から長さ２２９３Ｂ
ｐの断片を得る工程を示す説明図である。 第２図は、全反応経過を示す説明図である。 第３図は、合成調節領域にプロインシュリン断片を連結
する工程を示す説明図である。 第４図は、第１図の工程で得た）、ＩＩＲ３２２部分プ
ラスミドと第３図の工程で得た断片とを連結してバイブ
リドプラスミドｐＷＩ ６を造成する工程を示す説明図
である。 第５図は、プラスミドｐＷＩＰ１を示す説明図であるっ 出願人代理人 佐 藤 −雄 Ｌ−一」轡御 Ａｄ Ｂ ＣＡ ｙ ＦＩＧ、３
ｐの断片を得る工程を示す説明図である。 第２図は、全反応経過を示す説明図である。 第３図は、合成調節領域にプロインシュリン断片を連結
する工程を示す説明図である。 第４図は、第１図の工程で得た）、ＩＩＲ３２２部分プ
ラスミドと第３図の工程で得た断片とを連結してバイブ
リドプラスミドｐＷＩ ６を造成する工程を示す説明図
である。 第５図は、プラスミドｐＷＩＰ１を示す説明図であるっ 出願人代理人 佐 藤 −雄 Ｌ−一」轡御 Ａｄ Ｂ ＣＡ ｙ ＦＩＧ、３
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、実質的に天然シグナル配列と一致するが、天然ＤＮ
Ａが有さないエンドヌクレアーゼによる少なくとも一つ
の切断部位を有するＤＮＡからなる、発現系におけるタ
ンパク質輸送のための合成シグナル配列。 ２、疎水性領域の上流および（または）下流に内部切断
部位を有する、特許請求の範囲第１項記載のシグナル配
列。 ３、実質的に大腸菌アルカリホスファターゼの天然シグ
ナル配列と一致する、特許請求の範囲第１項または第２
項記載のシグナル配列。 ４、３′末端において、約４０個までの構造遺伝子のア
ミノ末端コードンを下流に隣接して有する、特許請求の
範囲第１項記載のシグナル配列。 ５、実質的に大腸菌アルカリホスファターゼの天然シグ
ナル配列と一致する、特許請求の範囲第２項記載のシグ
ナル配列。 ６、３′末端において、約４０個までの構造遺伝子のア
ミノ末端コードンを下流に隣接して有する、特許請求の
範囲第２項記載のシグナル配列。 ７、３′末端において、約４０個までの構造遺伝子のア
ミノ末端コードンを下流に隣接して有する、特許請求の
範囲第３項記載のシグナル配列。 ８、下式で表わされるＤＮＡ。 ￥ＤＮＡ配列 I ￥ 【遺伝子配列があります】 ９、下記の工程を含むことを特徴とする、原核および真
核細胞における真核、原核またはウイルスタンパク質の
輸送発現方法。 （イ）実質的に天然シグナル配列と一致するが、天然Ｄ
ＮＡが有さないエンドヌクレアーゼによる少なくとも一
つの切断部位を有するＤＮＡからなる、発現系における
タンパク質輸送のための合成シグナル配列に輸送すべき
タンパク質の遺伝子を結合させる工程。 （ロ）この融合遺伝子をベクターに組込む工程。 （ハ）この組込体によつて、発現タンパク質を細胞質外
へ輸送する細胞を形質転換させる工程。 １０、合成ＤＮＡシグナル配列が宿主に個有のタンパク
質をコードするものである、特許請求の範囲第９項の方
法。 １１、実質的に天然シグナル配列と一致するが、天然Ｄ
ＮＡが有さないエンドヌクレアーゼによる少なくとも一
つの切断部位を有するＤＮＡからなる、発現系における
タンパク質輸送のための合成シグナル配列を組込んだハ
イブリツドベクター。 １２、下式で表わされるＤＮＡ配列をＥｃｏＲＩ切断部
位に有するハイブリツドプラスミドである、特許請求の
範囲第１１項のハイブリツドベクター。 ￥ＤＮＡ配列 I ￥ 【遺伝子配列があります】 １３、実質的に天然シグナル配列と一致するが、天然Ｄ
ＮＡが有さないエンドヌクレアーゼによる少なくとも一
つの切断部位を有するＤＮＡからなる、発現系における
タンパク質輸送のための合成シグナル配列を組込んだハ
イブリツドベクターを含有する宿主生物。 １４、下式で表わされるＤＮＡ配列をＥｃｏＲＩ切断部
位に有するハイブリツドプラスミドであるところのハイ
ブリツドベクターを含有する宿主生物。 ￥ＤＮＡ配列 I ￥ 【遺伝子配列があります】 １５、大腸菌種（Ｅ．ｃｏｌｉ）のものである、特許請
求の範囲第１３項の宿主生物。 １６、大腸菌種（Ｅ．ｃｏｌｉ）のものである、特許請
求の範囲第１４項の宿主生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843436818 DE3436818A1 (de) | 1984-10-06 | 1984-10-06 | Synthetische signalsequenz zum transport von proteinen in expressionssystemen |
| DE3436818.3 | 1984-10-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188883A true JPS6188883A (ja) | 1986-05-07 |
Family
ID=6247347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60221120A Pending JPS6188883A (ja) | 1984-10-06 | 1985-10-03 | 発現系におけるタンパク質輸送のための合成シグナル配列 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0177827B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6188883A (ja) |
| AT (1) | ATE97445T1 (ja) |
| AU (1) | AU595486B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340280C (ja) |
| DE (2) | DE3436818A1 (ja) |
| DK (1) | DK175511B1 (ja) |
| ES (1) | ES8605579A1 (ja) |
| GR (1) | GR852405B (ja) |
| HU (1) | HU197355B (ja) |
| IE (1) | IE63262B1 (ja) |
| IL (1) | IL76573A (ja) |
| NZ (1) | NZ213717A (ja) |
| PH (1) | PH30819A (ja) |
| PT (1) | PT81253B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| EP0196864A3 (en) * | 1985-03-25 | 1988-03-23 | Cetus Corporation | Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences |
| IT1196484B (it) * | 1986-07-11 | 1988-11-16 | Sclavo Spa | Vettore ad espressione e secrezione in lieviti,utile per la preparazione di proteine eterologhe |
| US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
| DE68917759T2 (de) * | 1988-03-18 | 1995-04-27 | Wang Laboratories | Verteilte Referenz- und Änderungstabelle für ein virtuelles Speichersystem. |
| US20070020630A1 (en) | 2003-03-27 | 2007-01-25 | Trotta Christopher R | Methods of identifying compounds that target trna splicing endonuclease and uses of said compounds as anti-proliferative agents |
| WO2004087070A2 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ptc Therapeutics, Inc. | METHODS OF IDENTIFYING COMPOUNDS THAT TARGET tRNA SPLICING ENDONUCLEASE AND USES OF SAID COMPOUNDS AS ANTI-FUNGAL AGENTS |
| CA2531321A1 (en) | 2003-07-02 | 2005-01-13 | Ptc Therapeutics, Inc. | Rna processing protein complexes and uses thereof |
Family Cites Families (7)
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|---|---|---|---|---|
| JPS5939899A (ja) * | 1982-08-27 | 1984-03-05 | Gakuzo Tamura | 新規ベクタ− |
| US4711844A (en) * | 1983-03-09 | 1987-12-08 | Cetus Corporation | Modified signal peptides |
| NZ207925A (en) * | 1983-04-25 | 1988-05-30 | Genentech Inc | Yeast expression vehicle consisting of a yeast promoter and signal peptide encoding region linked to a heterologus peptide coding region; expression and culture |
| US4663280A (en) * | 1983-05-19 | 1987-05-05 | Public Health Research Institute Of The City Of New York | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors |
| AU3011684A (en) * | 1983-05-19 | 1984-12-04 | Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The | Expression and secretion vectors & method of constructing vectors |
| JPS6030687A (ja) * | 1983-08-01 | 1985-02-16 | Wakunaga Seiyaku Kk | Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド |
| EP0170266B1 (en) * | 1984-07-30 | 1993-03-24 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing protein, and vector, recombinant dna and transformant used therefor |
-
1984
- 1984-10-06 DE DE19843436818 patent/DE3436818A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-09-23 DE DE85112043T patent/DE3587660D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-23 EP EP85112043A patent/EP0177827B1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1985-10-04 CA CA000492345A patent/CA1340280C/en not_active Expired - Fee Related
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- 1985-10-04 IE IE244085A patent/IE63262B1/en not_active IP Right Cessation
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- 1985-10-04 GR GR852405A patent/GR852405B/el unknown
- 1985-10-04 IL IL76573A patent/IL76573A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-10-14 PH PH32879A patent/PH30819A/en unknown
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| IL76573A0 (en) | 1986-02-28 |
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