JPS5939899A - 新規ベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は大腸菌のアルカリフォスファターゼ遺伝子（ｐ
ｈｏＡ）のプロモーターの下流に３つの読み取り枠に対
応するクローニング部位を有するように構築した新規ベ
クターに関する。

先に本発明者らは、組換えＤＮＡ技術による異種蛋白の
陶体外生産をめざし、ｐｈｏ　Ａのプロモーター配列、
シャゝイン・ダルガーノ配列（ＳＤ配列）、シグナル配
列を有するＤＮＡ断片をクローン化しその塩基配列を決
定した。

これによりｐｈｏＡプロモーターの下流に所望のペプチ
ドをコードする遺伝子を結合し、その強力な発現を図る
ことを可能にした。゛またｐｈｏＡ’のシグナル配列の
下流に所望の遺伝子を発根させるように槓々の方法で絖
み取り枠（ｒｅａｄｉｎｇｆ　ｒ　ａｍｅ　）を１４節
して結合することが可能となり所望のベプタイド、ポリ
ペブタイドを分泌する手段を提供した（特願昭５６−１
６６３６７）。

この発明による塩基配列の決定、ｆｉｌｌＪ限地図の作
成により多くの制限部位が所望の遺伝子の結合部位とし
て利用可能となった。

本発明者らは、所望ＤＮＡの一発現の為にさらに便利に
用いることができる発現ベクターについて研究した結果
、一般によく用いられる制限酵素切断部位（制限部位）
に対応したクローニング部位を有し、しかも３つの読み
取り枠に対応しうる発現ベクターがＤＮＡ発現に便利に
使用できること全見出し本発明を完成するに至りた。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明は、大腸菌のアルカリフォスファターゼ遺伝子（
ｐｈｏＡ）のプロモーターの下ｆｉに３つの読み取り枠
に対応したクローニング部位を有する新規発現ベクター
を提供する。

本発明の発現ベクターは、大腸菌のアルカルフォスファ
ターゼ遺伝子のプロモーターの下流に存在する制限酵素
ＦＪＪ断部位に３つの読み取り枠に対応したクロー二／
グ部位を造成することにより製造することができる。

ベクター中に所望Ｄ　Ｎ　Ａをクローニングするのに利
用する制限部位の位置としては、■シグナル配列の直前
；■シグナル配列の終り、ないしＡＰａ　ｓ　ｅ構造遺
伝子のＮ末端；■構造遺伝子中；と一応３つの位置が考
えられる。菌体夕１に異種蛋白を大量に生産するために
は、第２の位置が最も好適と考えられるが、その他の位
置本それぞれ以下と？”！　Ｉｔｆ、同様な工夫で利用
可能である。

通常目的の遺伝子のクローニング部位としては、使用す
るプロモーターの下流に元来ある制限部位、あるいはこ
れに適当な合成リンカ−を付け、新しく造成した制限部
位を利用する。ただし、この制限部位は、目的遺伝子に
は含まれていないこと、発現ベクター上で他に同一制限
部位がないこと、クローン化しである目的遺伝子の切り
出しにより生ずる末端に相補性のあることなどを考慮し
て選択される。

大腸−のアルカリフォスファターゼ遺伝子のプロモータ
ー下に大蓋生産・分路を目的として目的遺伝子をクロー
ニングするには、先に述べた如くシグナル配列の最後の
アミノ酸であるアラニンと成熟アルカリフォスファター
ゼイソ酵素１のサフ゛ユニットの一番目のアミノ酸であ
るアルギニンをコードするトリプレットの間にあるＨｐ
ａ１部位を利用するのが最も容易である。

この部位をそのまま利用することも可能であるが、クロ
ーニングを容、易にするために繁用される制限部位に相
当する合成リンカ−Ａｌｕ　Ｊ＋ＢａｎｄＩｌ＋ＲＣＩ
Ｉ＊　Ｂｇｌｌｌ＋　Ｃｆｏｌ＋　ＣＪａｌ（Ｔａｑｉ
）、　ＥｃｏＲｌ　＋　ＦｎｕＤＩＩ。

Ｈａｅｉ＋　ＨｂａＪ＋　Ｈｉｎｄｌ＋　ＨｐａＬ　Ｈ
ｐａｌＬ　Ｈｐｃｌｌ（Ｍｓｐｌ）。

Ｋｐｎ）＋　Ｍｓｐｌ　ｒ　Ｐｓｔｌ＋　５ａｃｉ＋　
ＳａＡ’ｌ、　Ｓｍａｌ（Ｘｍａｌ）。

５ａｔＬ　Ｔ’ｈａｌ、　ＸｂａｉおよびＸｈｏ　１（
Ｔａｑ　Ｉ、Ａｖａ　ｌ　）などを付着せしめることが
望ましい。

合成リンカ−の付層は例えば以下のごとく行なえる。

ｐｈｏＡ　のプロそ一ター・シグナル部分を含んだＤＮ
Ａ断片は、例えばｐＹＫｉ９０（特願昭５６−１６６３
６７　）にクロークしであるので、これより適当な制限
酵紫を用いて切り出す。たとえば、ＰａｔｌとＢａｍＨ
）の二重消化を行ない、アガロースゲル電気泳動により
、約１．３　ＫｂｐのＤＮＡの断片を単離する。単離後
、Ｈｐａｌで適、当な条件で消化し、加熱により反応を
停止する。

反応液にデオキシアデノシン三燐酸（以下ｄＡＴＰと略
記する）、デオキシグアンシ／三燐酸（゛以下ｄＧＴＰ
と略記する）、デオキシシチジン三燐酸（以下ｄＣＴＰ
と略記する）、デオキシチミジン三燐酸（以下ｄＴＴＰ
と略記する）および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを反応
させ、埋め込み（ｆｉ＃　ｉｎ　）反応を行なう。反応
液にエタノールを加えＤＮＡを沈殿として回収する。

次にこの埋め込みを行なったＤＮＡのＨｐａｌ末端に所
望のリンカ−１例えばＥｃｏＲ１＋　Ｈｌｎｄ　ＩＢａ
ｍＨｌなどを尋人する。すなわち、Ｅｃ　ｏＲｌリンカ
−を例に述べると、まずリンカ−の５１末端をｄＡＴＰ
とＴ４ポリヌクレオチド・痺ナーゼを用いて予めリン酸
化し、このリン酸化したリンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用い、上記Ｈｐａｌ断片の両端にプラント・エンド連
結（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄＪｉｇａｔｉｏｎ）により付着
せしめる。この連結反応は、１〜５０ｍＭ　　Ｔｒｉａ
−ＨＣＩＩ（ｐＨ７〜８）、　１〜５０ｍＭ　ＭｇＣＪ
？２　＊　１〜２０　ｍＭジチオスレイトール。

０、１〜２　ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐの存在下、４〜２０℃で
１〜２０時間行なう。エタノールを添加し、ＤＮＡを沈
殿として回収する。

次に回収したＤＮＡとプラスミドｐＢＲ３２７［Ｇｅｎ
ａ　ＩＬ　２５〜３５　（１９８１）＋　Ｌｕ１ｓ　Ｃ
ｏｖａｒｒｕｂｉａｓ躬１．〕をＨｉｎｄｌｌとＥｃ　
ｏＲ（により二重消化する。反応はＨｉｎｄｌ用緩衝液
中３０〜３７℃で１〜３時間行ない、加熱により反応を
停止する。。

次にＴ４ＤＮＡリガーゼを用い、上記Ｈｉｎｄｌ−Ｅｃ
ｏＲ１反応液にジチオスレイトール（５〜１０ｍＭ）、
　Ａ　Ｔ　Ｐ　（０，１〜１ｍＭ）を添加し、４〜２０
℃で１〜２０時間連結反応を行なう。連結反応後、大腸
菌の適当な菌株を反応液で形質転換し、アンピシリンを
含んだブイヨン培地でアンビシ性 リン抵ＫＡＣＡｐ　”　）株を選択した。形質転換はマ
ンデルとヒガ（Ｍａｎｄｅ　ｌ　ａｎｄ　Ｉｌｉｇａ　
）の方法［Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂ＋ｏ４　　ｓａ、　１５９（１９７０）’）に準じて
行なう（遺伝子操作実験法、高木康敬編著、講談社、　
１９８０参照）。

得られたＡ、ｎ株を、テトラサイクリン（Ｔｃ）を含ん
だブイヨン培地に塗布して、Ｔｃ感受性を調べ、Ｔｃ感
受性（Ｔｃ”）株を候補として残す。

そのうち−株の所有するプラスミド（ｐＹＫ２５４）は
第１図に示す制限地図を有し、目的の構造のものである
ことを確認した。

後の操作の便利のためにｐＢＲ３２７に挿入したｐｈｏ
Ａ　プロモーターの向きを変えるため、上記プラスミド
（ｐＹＫ　２５４）をＥｃｏＲｌとＨｉｎｃ　ｌで二重
消化して９７１Ｅ）ｐのｐｈｏＡプロモーターヲ甘ム断
せをアガロースゲル電気泳動により単離する。

二重消化は例えば１−５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ（
ｐＨ７〜８．５　）　＋　　１〜２０ｍＭ　ｂｌｇｃｌ
ｉ　＊　１〜２０ｍＭ　２−メルカプトエタノール、　
１−１００ｍＭ　ＮａＣ１中で、３０〜３７℃、１〜３
時間行なう。

一方プラスミドｐＢＲ３２８（Ｇｅｎｅ　１３　、２５
〜３５（１９８１）、　Ｌｕ１ｓ　Ｃｏｖａｒｒｕｂｉ
ａａ　ｄ　Ｊ、　）をＥｃ　ｏＲ■とＰｖｕｌで二重消
化する。反応は例えば１〜５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ
’　（ｐＨ７〜８）、　１〜２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜１
０〜１００ｍＭ　ＮａＣ１，１〜２０ｍＭ　２−メルカ
プトエタノール中で３０〜３７℃、１〜４時間行なう。

アガロースゲル電気泳動により４．８　ＫｂのｐＢＲ３
２８ベクターバックボー／を単離し、上記の９７１ｂｐ
断片と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼにより両者を連結さ
せ、大腸ｍ１株を形質転換し、アンピシリンを含むブイ
ヨン・プレートによりＡｐＲ株を選択するｇ得られるＡ
ｐＨ株のＴｃクロラムフェニコール（Ｃｍ）への感受性
’ｔｘぺ、ＡｐＲＴｃ”ａ（Ｃｍｉ受性）株を選択する
。得られるＡｐ”ｌ”ｃヤＩｎ”株の一株の有するプラ
スミド（ｐＹＫ２５９）は第２図の如くで目的の構造を
有している。

プラスミドの読み取り枠の変換は以下のごとく行なう。

（１）ｍｌみ取り枠−１の形成 ｐＹＫ２５９をＳｍａ）で消化する。反応は例えば１〜
５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（ｐＨ７〜８．５　）
、　１〜２０ｒｎＭｉ　ＭｇＣＡ、５〜５０ｍＭ　ＫＣ
Ｉ　＋　１〜２０　ＴｄＶＬ　２−メルカプトエタノー
ル存在下３０〜３７℃、１〜４時間行なう。反応を加熱
によりとめ、次にＡｖａｌにより消化する。反応は例え
ば１０〜２０　ｒｒ＃ｆ　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣＪ（ｐＨ７
，４）、　２．５−２５ｒｒＭｈ’１ｇＣ１２゜２　（
１−５０ｒｎＭ　ＮａＣ１の存在下３０〜３７℃、１〜
３時間行なう。反応を加熱によりとめ、次に大腸菌のＤ
ＮＡポリメラーゼＩを用い前記と同様な条件で埋め込み
反応を行ない、エタノールを加えＤＮＡを沈殿として回
収する。

前記と同様にリン酸化したＥｃｏＲ１リンカ−をＴ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼを用いて上と同様に両末端に付着せしめ
る。反応を加熱によりとめ、ＮａＣＡ’を補い、Ｅｃｏ
ＲＩにより消化し、加熱により反応を停止する。Ｔ　４
　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを用い環化して、大腸−を形
質転換し、Ａ　ｐＨ株を選択する。

そのうちの少なくとも一株が、目的とする第３図の、ご
とき制限地図を有するプラスミドを含むことを確認した
。その接合点の構造は下記のごとくである。このプラス
ミドをｐＹＫ２６４と名付ける。

（２）読み取り枠Ｏの形成 ＰＹＫ　２６４をＥｃｏＲＩ　−Ｐｇ　ｔ　Ｉで二重消
化し、小さい方の断片（１１０Ｋｂｐ）をアガロース電
気泳動で巣離する。二重消化は２０〜】００ｒｒＭ　Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，４）、　５−７　ｒｒ
ＭＭｇｃｌ、　。

５０〜６０　ｍＭ　ＮａＣ！Ｉの存在下３０−３７℃で
１〜３時間行々う。

同様にｐＹＫ　２５９をＥｃｏＲｌ　−Ｐｓ　ｔ　ｌで
二重消化し、小さい方の断片（２，０４Ｋｂｐ）を得る
。

両断片をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて連結用緩衝液中
４〜１５℃で３〜２０時間反応させ連結する。

この反応混合物を用い、大腸菌―株を形質転換し、Ａ　
Ｐ　Ｒ株を得る。そのうちの１株が有するプラスミドの
構造は第３図のごとくである。そのｐｈｏＡ　近傍の接
合部位の構造は下記のごとくであり、 ｐＹＫ　２６４の構造に対し「Ｇ」が１箇余分に挿入さ
れている。

（３）　　読み取り枠＋１の形成 Ｐ）’ｋ　２５９を制限酵素Ａｖａ　ｌで上記と同様の
条件で消化する。反応を加熱で停止し、犬ｒＪＩＪｗｉ
ＤＮＡポリメラーゼＩを用い、上記と同様の条件で埋め
込み反応を行ない、エタノールを加えてＤＮＡを沈殿と
して回収する。

これにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＥｃ　ｏＲ（リンカ
−を両端に付着せしめる。ＥｃｏＲｌを用いて粘着末端
とし、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて環化する。以上は
的項の操作と同様に行なう。環化したプラスミドＤＮＡ
を用い大腸菌を形質転換しｔＡｐ　Ｆ株を選択する。そ
のうちの−株が有するプラスミドの構造は第３図の如く
であり、その接合部位の配列は下記のごとくであり、ｐ
ＹＫ　２６４の構造に対しｒＧＪが２箇余分に挿入され
ている。

以上のごとくして、クローニング部位としてＥｃｏＲＩ
部位、Ａｖａ１部位を有し、３つの絖み取り枠に対応し
たクローニングベクターが作成される。

先に述べたごとく、とのＨｐａ１部位にはＥｃ　ｏＲＩ
リンカ−以外のリンカ−の導入も可能であり、はぼ同様
の方法で導入し３つの読み取り枠に対応したクローニン
グベクターを作成することができる。また、完成したｐ
ＹＫ　２６４　ｒ　２７８゜２６６（これらをＰｓｉ　
ｔｏｏ−ｖｅｃｔｏｒａと呼ぶ）からさらに異なるクロ
ーニング部位を有する酵導体を作成することも可能であ
る。例えば、これらＰｓｉ　１ａｏ−ｖｅｃｔｏｒｓを
ＥｃｏＲｌ　−Ｐｓｔ　Ｉで二重消化しｐｈｏＡ’グロ
七−ターを含む方の断片（２，０４ｘｂｐ）を同様に処
理したプラスミドｐＭＣ１４０３の大きい方の断片（９
，１ａＫｂｐ）のＰｓｔｌ、ＥｃｏＲｉ末端に挿入する
と新たに３つの絖み取り枠に対応するＢａｍＨＩクロー
ニング部位を有する一部のベクターを造成できる。

以下その方法を示す。

プラスミドｐ　ＭＣ１４０３［Ｍ、Ｃａａａｄａｂａｎ
ｅｔａ！、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ４　１４３．９７１
〜９８０（１９８０）］をＰａｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩによ
り二重消化し、大きい方。

の断片（９，１ａ　ｉ＜ｂｐ）をアガロースゲルで単離
する。以上はｐＹＫ　２７８造成の場合と同様に行なう
（、Ｐｓｉ　１ｓｏ−ｖｅｃｔｏｒｓの方も同様にＥｃ
ｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉで二重消化し、アガロースゲル電
気泳動により大きい方の断片（２，０４Ｋｂｐ）を単離
する。両断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い連結用緩衝液
中で連結し、太賜凶を形質転換し　ＡＰ　Ｒ株をアンピ
シリンを含むブイヨンプレートで選択する。得たＡｐＲ
株ニつキ目的の大きさと構造を有するプラスミドを検索
する。以上の操作の概要を第５図に示す。このようにし
てｐＹＫ２６．４とｐＭｃ１４０３からｐＹＫ２６８　
＋　ｐＹＫ　２７８とｐＭｃ１４０３からｐＹＫ２６７
゜ｐＹＫ２６９とｐＭｃ１４０３からｐＹＫ２６９がそ
れぞれ得られる。これらの接合部の塩基配列とプラスミ
ドの制限地図は＃ｇ６図のごとくである。この修飾によ
りＢａｍＨ１部位が新たなりローニング部位としてＰｓ
ｉ　ｌ５ｏ−ｖｅｃｔｏｒＢにつけ加えられる。

こうして造成されたＰｓｉ　１ｓｏ−ｖｅｃｔｏｒｓｐ
ＹＫ２６８．２６７、Ｚ６９はいずれもＡＰａｓｅのＩ
プロモーターシグナル配列の後にＮ末端の８個のアミノ
酸を欠（ｔａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼの構造
遺伝子）を有している。上記ベクター＃−ｉ３つの読み
取シ粋に対応しているので必ず一つのベクターがリン酸
の制御下にＮ末端の８個のアミノ醒の代わシにシグナル
ベプタイド由来のアミノ酸の全部あるいは一部とリンカ
−由来のアミノ酸を含んだβ−ガラクトシダーゼを発現
するはずである。この発現は、β−ガラクトシダーゼを
欠く大腸菌のこれらプラスミドによる形質転換株を５−
ブロモ、４−クロロ、３−インドーリルーローガラクト
シド（Ｘ−ｇａｔ）を含んだ培地１２１［１７中に寒天
１５ｖ、グルコース４ｖ１塩化ナトリウム４．６８　Ｆ
、塩化カリウム１．５ｙ、塩化アンモニウム１．０８Ｆ
。

硫酸ソーダ０．３５Ｆ、塩化マグネシウム０．２ｆ。

塩化カルシウム０．０２９Ｆ、塩化第二鉄８，５１９゜
塩化亜鉛０．２７ｆｉｐ、）リスヒドロキシメナルアミ
ノメタン１２１を含み、塩酸でｐ　Ｈ７，５に―整した
もの〕を含んだプレートに塗布し、生ずる肯いｔａｅ＋
コロニーより容易に知ることができる。また培地１２１
（寒天は含まない）でそれぞれのプラスミドを含んだ菌
株を培誉し、菌体を集め、その全抽出物（リゾチーム破
砕あるいは音波破砕による）の５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲルＷ気泳動を行うと、リン酸欠乏培地で％異的に
分子量約１２０Ｘ１０”の蛋白質のバンドの生成が認め
られ、リン酸制御下にβ−ガラクトシダーゼとほぼ同じ
大きさの蛋白質の発現を知ることができる。

以上から、これらバクターが目的遺伝子のクローニング
発現に便利に使えることは明らかである。

以上のようにして造成された各種発現ベクターはいずれ
も元のアルカリフォスファターゼ（ＡＰａｇｅ　）のシ
グナル配列とＡＰａｓｅ　１ｓｏ−１のサブユニットの
Ｎ末端であるアルギニンに相当するトリプレットを保存
している。ＥｃｏＲＩ、Ａｖａｌ、ＢａｍＨＩ々どを利
用して目的遺伝子をクローニングした場合、目的遺伝子
はＡＰａｓｅのシグナル配列の後に少なくともアルギニ
ンを含んで発現される。一方ＡＰａθθはこのアルギニ
ンのアミノ基側でプロセシング（分節の過程におけるシ
グナル配列の除去）を受けるので、発現された目的遺伝
子のコードするペプタイドはリーダー配列のｉｔのアミ
ノ酸のアラニンとＡＰａｓｅのＮ末端のアルギニンの間
で同様にプロセシングされ分瀦される可能性があシ、こ
れらはその意味で発現分節ベクターと呼べる。

以下実施例をあげて本発明の詳細な説明する。

実施例１ ｐｙｘｘ９ｏ（特願昭５６−１６６３６７）をＰｓｔ　
ｌ　（ＰｓｅｕｄｏｍＯｎａ８’　５ｔｕａｒｔｉ１の
制限酵素、全酒造社製）とＢａｍ）■（Ｂａ　ｃ　ｉ　
１１　ｕ　ｓ　ｌ１ｕｖ１ｏ１１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
Ｈの制限酵素、全酒造社製）の二重消化を以下の条件で
行う。ｐＹＫ１９０　２０１１ｆ　Ｋ　Ｐｓｔ　Ｉ　４
０単位とＢａｍＨＩ　４０単位を１００μｇの２０　ｍ
ＭＴｒｉａ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７゜４　）、　７　　ｍ
ＭＭ？ｃ１２．６　０　　ＪＩＩｋｌＮａＣｌおよび２
　ｍＭ　２−メルカプトエタノールの存在下で３７℃　
１時間反応させた。加熱（７０℃、５分）して反応を停
止し、反応液をアガロース電気泳動にかけ約１．３に１
）ｐのＤ　ＩＪ　Ａ断片１μ２を単離した。アガロース
′成気泳励は、１．０％のアガロースゲル（２０Ｘ１５
Ｘ０．５ｃａ）を用い、１５０ボルトで２時ｒ＃ＪＪ′
＃！を気泳動〔緩衝液；４０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ａｃ
ｅｔａｔｅ　（ｐＨ７，８）　）にかけ、ついで０．５
μｙ／ｍｔのエチジウムブロマイドで５〜１０分間染色
する。染色後、紫外線照射下で当該１．３　Ｋｂｐ部分
を切υ出し、内径５１ＬＩＩのパイレックス管に入れ、
下面に透析膜をっけ、電気泳動（ｓ　ｍＭ／管、１時間
、同上緩衝液）して抽出した。

得られた１、　３　ＫｂｐのＩ）ＮＡ断片にＨｐａ　１
（）（ａｅｍｏｐｈｉｌｕｅ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｓの制限酵素、全酒造社製）２単位を５０μｌの１
０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＡ！（ｐＨ７，５）、　　７　
ｍＭ）＃Ｃ１２および７ｍＭ２−メルカプトエタノール
の存在下で３７℃、１時間反応させて消化した。７０℃
、５分間加熱で反応を止め、反応液を５０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ７，８）６、６　ｍＭＩＪ’ｃ
ＡＩ　２および１　ｍ１ｖｆ　２−メルカプトエタノー
ルの組成になるように適尚に調整し、各２０μＭのｄＡ
’ｌ°Ｐ、ｄＧＴ’Ｐ％ｄｃ’、ＴＰおよびｄ、　Ｔ　
Ｔ　Ｐと大腸菌Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　’（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１単位とを加え
、３０℃、６０分反応させｆｉｌｌｔｎ　（埋め込み）
反応を行った。反応液にエタノールを加えＨｐａｌ末端
の埋め込みを行なったＤ　ｉＪ　Ａを沈殿として回収し
た。

この埋め込みを行なったＨＰａｌｌ末端にＥｃｏＲＩリ
ンカ−を以下の条件で継げる。ｇｃｏＲＩリンカ−（全
酒造社製）１ｏｐｙに１００／ｊＭＡＴＰを５０　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐｉｌ　７．６　）、１０　ｎａ
１ＭＷｃｔ１２１０　ｍＭ　２−メルカプトエタノール
およびＴ　４１ζリヌクレオナドキナーゼ（全酒造社製
）の存在下で予めリン酸化した。

リン酸化し−に、ＥａｏＲｌリンカ−約０２μ？をＴ　
、ＩＤ　Ｎ　Ａリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ社製）を用い、上記ＤＮＡ（Ｈｐａｌｌ末
夕ＩＭに埋め込みをした）の両端に耐着させた。この連
結反応は２　０　　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ｕｃＪ　　（ｐ
Ｈ７，６）、　１　０　　面、（）Ｊｓ／Ｃｇ２．１０
ｒｎＭジチオスレイトールおよび０．５　ｍＭＡ’Ｉ”
Ｐの存在下、１５℃、４時間行う。反応液にエタノール
を添加し、Ｄ　Ｎ　Ａ　０．７μ２を沈殿として回収し
た。

回収したＤ　ＩＪ　Ａ　０．７μ？および２μ２のプッ
スミ　ド　ｐＢＲ３２７（Ｇｅｎｅ　、１３　．２５〜
３５（１９８１）　　にｇ己戟の方法によりｓ造する〕
をＨｌｎｄ　Ｉｌｌ［Ｈａｅｎ＋ｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａｓ　Ｒｄの制限酵素、宝？Ｗ　’ｒｆｉ社
製〕とＥｃｏＲＩ　［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　ｌｌｉ’　１３のｆｂｌＪ限酵素、全酒造社製〕に
゛よシニ重消化する。反応は４単位の各酵素を含む１（
ｉｎｄ　１１用緩衝液［２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７，４）、７　ｍＭＭｒｃ１２．６０　ｍＭＬＪａＣ
Ａｉ　］中３７℃、１時間行う。７０℃、５分間加熱し
て反応を停止させた。上記反応液にＴ０ｎ　ＩＪ　Ａリ
ガーゼ１０単位、ジチオスレイトール１ｏｍ＞ｉおよび
ＡＴＰｏ、５ｍＭを添加し、１５℃、４時間連結反応を
行った。連結後、大腸菌λ（０１０６１株（Δ１ａｃ　
Ｚ　）（Ｃａ５ａｄａｂａｎ　ａｔ　ａｈ、　Ｊ。

ＢａＣ１；ｆｉｌｒｉｏｌ、＋　！旦、　９１１−’１
８０（１９８０）：）を連結反応混合物と接触させて形
質転換し、アンピシリン（Ａｐ’）ｘｏＯμｆ／ｍｌを
含むブイヨン培地（栄研化学社製）でアンピシリン抵抗
性（ＡｐＲ）株を選択した。形質転換はＭａｎｄθ１と
Ｈｌｇａの方法（Ｊ、ＭＯ１９，Ｂ１０１−＋　！ｉＪ
＋　１５９　（１９７０））に準じて行なった。得られ
たＡｐＲ株をテトラサイクリン（Ｔｃ　）　２０μｙ／
ｍｌを含んだブイヨン培地に塗布してテトラサイクリン
感受性（Ｔ、）株を選択した。Ｔｃ８株のうちの１株の
所有するプラスミドｐＹＫ２５４は第１図に示した制限
地図を有し、目的の構造のものであることを確認した。

ついで、後の操作の便利のためにｐＢＲ３２７に挿入し
たｐｈ　ｏＡプロモーターの向きを変えるため、ｐＹＫ
２５４をＥｃｏＲｌとＨｌｎｃ　ｌ（Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ消化し−（９７１ｂｐのｐｈｏ　Ａプロモーター
を含むＤＮＡＶｒ片をアガロースゲル電気泳動によシ単
離した。二重消化は、５０μ〕の１　Ｏｎ＋Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　、　７　ｍＭ　ＭｆＣＩ
２．７　ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび６０　
ｍＭ　ＮｍＣｌのｌ下ｐＹＫ２５４の４μＶと両制限酵
累それぞれ８単位　　　　゛を３７℃、１時間反応させ
ることにより行った。

一方、プラスミドｐＢＲ３２８（Ｇｅｎｅ、　１３　、
２５〜３５（ｘｅｓ、ｔ）〕１μｙを２単位のＥｇｏＲ
ｌとＰｖｕ　１（Ｐｒ０ｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓの
制限酵素、全酒造社製）で二＄Ｘｆ４化した。反応は、
２０μｌの１０ｍＭＴｒｉｏ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５
）、７　ｍＭ　ＭｆｌＣ６！、６０ｍＭｔＪａｃＪおよ
び７　ｍＭ　２−メルカプトエタノールの存在下で３７
℃、１時間行った。力ｎ熱にょシ反応停止後、アガロー
ス電気泳動により４．８　Ｋ−Ｌ）のｐＢＲ３２８ペタ
ターバックボーンを樋離し、先に＄離した９７１ｂｐ断
片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより両者を連結させ
、大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換し、アンピシリンｉｏ
’ｏμｆＡＩ　ヲ含んだブイヨンプレートにより　Ａｐ
Ｒ株を選択した。

得られたＡｐＲ株のＴｃ　２０１’ｆ／’ｍｌ　、クロ
ラムフェニコール（Ｃｍ’）２５μｙｅｔに対する感受
性を調へ、Ａｐｌｌ、′ＰｃＲおよびクロラムフェニコ
ール感受性（Ｃ１１１８）の三性質を有する株を選択し
た。

得られたＡＩ、ｌ’ＴｃＲｃ］１１８株のうち一株の有
するプラスミド（ｐＹＫ２５９　）は第２図に示したご
とき目的の構造を有していた。

実施例２ ＴＩＹＫ２５９の読み取り枠の変換 ＋１）ＴＩＹＫ　２６４　（読み取り枠−１）の造成１
μＶのｐＹＫ２５９にＳｍａ　ｌ　（Ｓａｒｒａｔｉａ
ｎ＋ａｒｃｅｓｃｅｎｓ　Ｓｂの制限酵素、全酒造社製
）２単位を２０μｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ
　（ｐ　Ｈ８，０）７　ｍＭ　）ｉｔ’ｃｌ　２．２０
　ｒｎｌｌＫｃｌおよび７　ｍＭ　２−メルカプトエタ
ノールの存在下３７℃で１時間反応させｐＹＫｚｓｏを
消化した。７０’Ｃ１５分間の加熱で反応を止め、反応
液の組成を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　、　１０　ｍ
Ｍ　Ｍ？Ｃ１ｇおよび２０ｍＭＮａＣｌ　Ｋ　ｔｌｊｌ
　整し、これにＡｖａ　ｌ　［Ａｎａｂａｅｎａｖａｒ
ｉａｂｉｌｉｓ　の制限酵素、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（以下ＢＲＬ
という）製〕２単位を加え、３７℃で１時間反応させ消
化した。７０℃、５分間加熱で反応を止め、大腸菌のＤ
ＮＡポリメラーゼ１１単位を用いて、前記と同様な条件
で埋め込みを行った。反応後エタノールを加えＤＮＡを
沈殿として回収した。

前記と同様にリン酸化したＢｃｏＲＩリンカ−０、１μ
２　をＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いてＡｔｌ　Ｈ
己と同様にＤ　）Ｊ　Ａの両末端に付層させた。反応を
加熱（７０℃、５分）によシ止め、５０　ｎｑＭＮａＣ
ＪになるようにＮａＣ１を補い、ＥｃｏＲｌによりＥｃ
ｏＲＩリンカ−の付着しｆｃＤ’ＮＡを消化した。加熱
により反応を停止後Ｔ’　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用
いてＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡを猿化し、大腸菌ＭＣ１
０６１を形質転換し、ＡｐＲ株を選択した。

そのうちの−株が有するプラスミドｐＹＫ２６４は第３
図に示す制限酵素地図を有し、プロモーターとシグナル
との接合点の構造は第４図のとおりである。

＋ｚ＋　　ｐＹＫ　２７８　（読み収り枠０）の造成１
μＶのｐＹＫ２６４をＥｃｏＲｌおよびＰｓｔ　１２単
位で二重消化し、小さい方の断片（１，１０Ｋｂｐ　）
をアガロース電気泳動で単離した。二重消化は、２０μ
Ｉの２０ｍＭ　Ｔｒ’１ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）、７
　ｍ’Ｍ　ＭｆＣ１１２，５０ｍＭ　Ｍａｃｌの存在下
３０℃、２時間行った。

ｉμｒのｐＹＫ２５９を同様にＥｃＯＲＩ　−Ｐａｔ　
ｌ消化し、小さい方の断片（２，０４Ｋｂｐ）を得る。

両断片をＴ　４　Ｄ　ＩＪ　Ａ　１７ガーゼｏ、　ｉ単
位を用いて連結用緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ
（ｐＨ７，６）、１０　ｍＭ　ＭｆＣｌｚ、１０ｍＭジ
チオスレイトール、０．５１［＋ＭＡＴＰ］中で１５℃
、４時間連結反応させた。反応混合物を用い、大腸菌゛
ＭＣ１０６１を形質転換し、ＡｐＨの形質転換株を得た
。

そのうちの−株が有するプラスミドｐＹＫ２７８は第３
図に示す制限酵素地図を有し、プロモーターとシグナル
との接合点の構造は第４図のとおりである。ｐＹＫ　２
７８はｐＹＫ２６４に「Ｇ」が１個余分に挿入されてい
ることがわかる。

＋３１　　ｐＹＫ　２６６　（読み取シ枠＋１）の造成
１μｔのｐＹＫ２５９をＡｖａ１２単６’Ｌで＋１１項
のＡｖａ　ｌ消化と同様に消化した。反応を加熱（７０
℃、５分）で停止し、大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ夏
を用い、上記と同様に埋め込み反応を行ない、エタノー
ルを加えてＤＮＡを沈殿として得た。

ｐＹＫ２６４造成と同様にして、ｏ、　ｉμ２のＥｃ　
ｏＲｌ　１Ｊンカーを用い埋め込みを行なっだＡｖａ　
１断片ＤＮＡの両端にＥｃｏＲＩ　！ｊンヵーを付＞７
１させ、ＥＣＯＲＩを用いて粘着末端とし、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて環化した。環化したプラスミドＤ　？
（Ａを用いて大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換し、Ａ　ｐ
　Ｒの形質転換株を得た。

そのうちの−株が有するプラスミドｐＹＫ２６６は第３
図に示す制限酵素地図を有し、プロモーターとシグナル
との接合点の構造は第・４図のとおりである。ｐＹＫ２
６６はｐＹＫ　２６４に「Ｇ」が２個余分に挿入されて
いることがわかる。

（１）〜（３）により、クローニング部位としてＥｃｏ
Ｒｌ　％　Ａｖｕ　１部位を有し、３個の読み取り枠（
ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　）に対応したクローニン
グ０ベクターが作成された。ｐＹＫ２６４、ｐＹＫ２７
８およびｐＹＫ２６６を含む菌株はそれぞれＦＥＲＭＰ
−６６５４、同６６５５および同６６５６として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

実施例３ ｐＹＫ２６４．２７８．２６６　　の線導体の造成：ｐ
ＹＫ２７８造成のときと同様にして１μＩのプラスミド
ｐＭＣ１４０３（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ’ｒｉｏＬ上土且。

９７１〜９８０．　（１９８０）　）をｐａｔ　ｌ、　
１ｃｏＨｌの各２単位を用いて二重消化し、大きい方の
断片（９，１６Ｋｂｐ　）をアガロースゲル電気泳動で
単離した。

ロースゲル電気泳動により大きい方の断片（２０４ｘｂ
ｐ　）を単離した。

両断片をＴ４ＤＮＡ’１７ガーゼを用い、実施例２と同
様の条件で連結反応を行った。反応液を用いて大腸菌Ｍ
ＣＩ（１６１を形質転換し、ＡｐＲの形質転換株をアン
ピシリン１００　Ｉｌｌ／ｍｌを含むブイヨンプレート
で選択した。得られｆＣＡｐＲ株につき目的の大きさと
構造を有するシラスミドを検索した。給５図はこの方法
の工程を示す。

このようにしてｐＹＫ２６４とｐＭｃ：　１４０３から
１）ＹＫ２６８１１）ＹＫ２７８とｐＭＣ’１４０３か
らｐＹＫ２６７、Ｉ）ＹＫ２６６とｐ）ｖｆｃ　１４０
３から、ＹＫ　２６９がイυられた。第６図はこれらの
接合部の塩基配列とプラスミドの制限地図を示す。この
修飾によりＢａｍＨＩ　部位が”４丁だなりローニング
部位としてｐＢｉ　工ｓｏ　−ｖｅｃｔｏｒｓ　につけ
加えられたことになる。これらのｐＹＫ２６７＋　ＰＹ
Ｋ２６８　　およびｐＹＫ２６９を含む菌株は、それぞ
れＦ　Ｋ　ＲＭＰ−６６５２，同６６５１および６６５
３として微工研に寄託されている。

実施例４゜ ｐＹＫ２６７．２６８，２６９上の１ａδ′２遺伝子（
Ｎ末端の８個のアミノ酸を欠いた大腸菌β−ガラクトシ
ターゼの構造遺伝子）は、実施例３のｍ　成によりｐｈ
ｏＡのプロモーター、シグナル配列の直後に連結されて
いる。このｌ　ａ　（ｉ　’Ｚ遺伝子は、３つのプラス
ミドのいずれかの上でリン酸制御下に発現されているは
ずである。この発現をまずＸ　−ｇａｐを含んだ培地１
２１プレート上で観察した。上ｌ己３つのプラスミドで
形質転換した大腸菌ＭＣ１０６１（Δ１ａＣＺ）を塗布
して３７°Ｃ１１日培養すると、プラスミドｐＹＫ２６
９で形質転換した場合のみ肯いコロニーを生じた。

次にこれら３つのプラスミドを含む大腸菌ムイＣ１０６
１を、培地１２１（−ｐ培地）とこハにリン酸１　ｍＭ
を補った培地（＋ｐ培地）に３０℃で一晩培養した菌体
を５０　ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣＪ（１）Ｈ８，０）で洗滌
後、２０μｌの緩価液（５％グリセロール、１俤ドデシ
ル硫酸ナトリウム、５％２−メルカプトエタノールｒ　
　０．０６２５ＭＴｒｉｓ・ＨＯ２，１）Ｈ６，８）に
融濁後、１００℃で５０秒間加熱した。

次にこの抽出液２０μｌをＳ　Ｄ　Ｆ３−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動［Ｕ、　Ｋ、Ｌａ６ｍｒｎｌｉ。

１４ａｔｕｒｅ　２２ユ、６８０＝６８５（１９７０）
）（泳動条件：　２．５％アクリルアミドゲル、０．１
％Ｓ　Ｄ　Ｓ＋　　１６ｃ１ｎＸ　１４ｃｍＸ　０−１
ａ１ｓ＋　１ｓ縮ゲル内は定電流で２０ｍＡ＋分離ゲル
にマーカー色素が入って後３０ｍＡで泳動し７’（、、
）にかけ、泳動後０．０５％クマーシイーブリリアント
プル−Ｒ２５０（シグマ社）で染色し、蛋白質をαφ Ｆａ１ｒｂａｎｋ５ａｔ　ｈｌ、、　Ｂｉｏ騰ｃｈｅＢ
ｊｓｔｒｙ　Ｌｆｌ。

２６０６−２６１７（１９７１）の方法に従って検出し
た。

第７図から明らかな如く、読み取り枠が＋１のｐＹＫ　
２６９プラスミドのみが、リン酸欠乏下で丸印で示した
約１２０Ｘ１０３の分子量の訳出を発現した。−またこ
の発現した蛋白の大部分は工／ベロープにあり、分泌の
過程を一部ないし全部通’ｒｊＡ　シたと７思われる（
第８図か照）。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＹＫ２５４の造成を示す。図中（１）はｐａ
ｔ　ｌ　＋、Ｂａ１ＨＩ　での切断、（２）は１．３に
１）断片のアガロースゲル電気泳動による分離、（３）
はＨｐａ　ＩＩでの切断、（４）はｐｏｌ　１での粘着
末端の埋め込み、（５）はＴ４リガーゼによるＥＯＯＩ
（ｌリンカ−の連結、（６）はＨｌｎｄ　ｌ　十Ｅｃｏ
　Ｒｌによる切断、（力はＴ　４１Ｊガーゼによる連結
、（８）は大腸菌ＭＣ’　１０６１の形質転換の工程を
それぞれ示す。 第２図＃１ＰＹＫ’；５９の造成を示す。図中（９）は
アガロースゲルによる分離、０υはＴ４リガーゼによる
連結をそれぞれ示す。 第３図は読み取り枠（ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ　）の
交換を示す。０２）はＳｎ＋ａ　ｌ消化の方法、（１３
）はｌ＞：Ｏｌ：ｉ　Ｉ−ｐｓｔ）断片の交換、ＩはＡ
ｖａｌ消化の方法を示す。 第４図はｐｓｉインベクターｐＹＫ２６４．　ｐＹＫ２
７８およびｐＹＫ２６６の制限軸図表クローニング部位
の配列を示す。 第５図はＥｃＯ＋ｌ（ｌ　−Ｐａｔ　ｌ断片の交換を示
す。 第６図はｐｓｉイソベクター１）ＹＫ２６８１　］；）
ＹＫ２６７およびｐＹＫ　２６９の制限地図とクローニ
ング部位の配列を示す。 第７図はｐＨｏ　Ａ’　−１ａ　ＣＩ　Ｚ融合の発現を
示す。 図中十Ｐ１はリン酸１ｍＭ存在下、−ｐｉはリン酸無添
加、Ｆ　（１）、（０）＋　（＋ｚ）はそれぞれ読み枢
シ枠（−１）、　（０）、　（＋１）を示す。Ｋは１０
３分子世を示す。 第８図は、ｐｈｏ　Ａ’−１ａｃ’ｚ　蛋白の細胞内分
布を示す。ｗｈｏｌｅは全抽出物、５ｏｌｕｂｌｅは可
溶性画分、ＥｎＶｅ１０ｐθはエンベロブにおける分布
を示す。＋は１　ｍ　Ｍ　＋）ン酸存在下、−はリン酸
無添加を示す。 Ｍ１〜８図中、制限酵素、遺伝子マーカーなどは明細書
に記載のとおｐＯ 同第７図およびＭ８図は蛋白質の検出に用いられた電気
泳動の写真で本発明の実施例における蛋白質の証明に欠
かすことのできないものです。これら電気泳動の写真は
臨界線がはっきりしてい々いため、−まだ多数の泳動パ
ターンが存。 在するために風聞として描き難いので写真で提出いたし
ます。 特許出願人　　、１）村　夢　造 第１図 第２図 ｐＹＫＺ５９（５，７７ｋｂ） 第３図 田慕亜４　　　　　　　ｐＹＫ２７６　　　　　　　シ
バ２６６第４図 第５図 Ｐ５ｉ　ｌ５ｏ−Ｖｅｃｔｏｒｓ 第６図 ＥｃｏＲＩ　３ｍａｒ　　　Ｂａｍｌ−１ｆギ　　フ　
　　１図 蜀２３ン 、孫ｑ・、。 １２図 第１頁の続き ［相］発　明　者　山崎眞狩 小金井市緑町４丁目１８−１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１，１大腸劇のアルカリフォスファターゼ遺伝子（ｐ
   ｈｏＡ）のプロモーターの下流に３つの読み取り枠に対
   応するクローニング部位を有するように構築した新規ベ
   クター。 （２＋　　大１１１ｍのアルカリフォスファターゼ遺伝
   子（ｐｈｏＡ）のプロモーターの下流に存在する各種制
   限酵素切断部位に３２の読み取り枠に対応したクローニ
   ング部位を造成する方法。 （３）本来存在する制限部位または人工的に設けた制限
   部位の当該制限酵素による切断および生成する粘着末端
   の部分的ある弓は完全な埋め込み反応により読み取り枠
   の調整を図ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 （４）銃み取り枠を調蛙した末端にＡｌｕＩ＋　Ｂａｍ
   ＨＬＫｐｎｌ＋　Ｍｓｐｌ＋　Ｐｓｔｌ＋　５ａｃｌ＋
   　Ｓａｌ　ｌ＋　Ｓｍａｌ（Ｘｍａｌ）。 ５ａｔＩ、Ｔｈａｌ、　ＸｂａｉおよびＸｈｏ　）（Ｔ
   ａｑ　１．　Ａｖａ　ｉ）のリンカ−から選ばれるリン
   カ−を付着させてクローニング部位を設けることを特徴
   とする特許請求の範囲第２項の方法。 （５）　　クローニング部位がｐｈｏＡのＨｐａ　１部
   位であることを特徴とする特許請求の範囲第１項のベク
   ター。 （６１Ｈｐａ１部位が、ｐｈｏＡのシグナル配列の最後
   のアミノ酸であるアラニンとアルカリフォスファターゼ
   （ＡＰａｓａ）イソ酵素１ａｏ−１のザブユニットのＮ
   末端であるアルギニンに相当するトリプレットの間にあ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のベクタ
   ー。 （力　ｐＹＫ２６４　、　ｐＹＫ２７８またはｐＹＫ　
   ２６６と名付けた特許請求の範囲第１項の発現ベクター
   。 （８）　　ｐＹＫ　２６８、ｐＹＫ２６７またはｐ■２
   ６９と名付けた特許請求の範囲第１項の発現ベクター。 （９）発現ベクターｐＹＫ２６４　、　ｐＹＫ　２７８
   ．　ｐＹＫ２６６゜ｐＹＫ　２６８　、　ｐＹＫ　２６
   シまたはｐＹＫ２６９を含む微生物。 ００）特許請求の範囲第１項記載の発現ベクターを用い
   て蛋白質を発現させる方法。 α］）特許請求の範囲落１項記載の発現ベクターを用い
   て蛋白質を分泌させる方法。