JPS611391A - 牛の成長ホルモン誘導体を発現するベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、選択的かつ自律的に複製を行なう新規な組換
えＤＮＡ発現ベクターに関し、ｌ）牛の成長ホルモン（
ｂＧＨ）の生物活性誘導体を暗号化している遺伝子の読
み取り枠内にある、転写および翻訳活性化ヌクレオチド
配列、および、２）誘導状態においてコピー数抑制能を
失うレプリコン（複製単位）、を含んでいるベクターに
関する。さらに本発明は、該ベクターの新規な形質転換
体、牛の成長ホルモン誘導体、および用途に関する。

従来技祈 ｂＧＨを生産するための組換えＤＮＡ技術の開発と進展
は、遺伝子発現の問題により、著しく阻害されてきた。

これらの問題には、機能的に次善のｍＲＮＡの転写に関
するものがあり、これは欧州特許出願公開Ｎｏ、００７
５４４４に詳述されている。このようなｍＲＮＡは、正
常なりボゾーム結合を妨げるステム・アンド・ループニ
次構造を有し、したがって、ｂＧＩ（の発現を甚だしく
減じ、または阻害さえする。

発明の目的および構成 本発明は、ｂＧＨ誘導体を高レベルで発現するベクター
を提供することによって、この問題を克服するものであ
る。

本発明書中に開示し、特許請求の範囲に記載した本発明
の理解を助けるために、以下のごとく用語を定義する 組換えＤＮＡクローニングベクター：プラスミドを包含
するがこれに限定されない、あらゆる自律的複製体であ
って、１個のＤＮＡ分子を含み、これには１またはそれ
以上の新たなりＮＡセグメントが加えられているか、ま
たは加えることができる。

組換えＤＮ、Ａ発現ベクター：ｌまたはそれ以上の転写
および翻訳活性化配列が組み込まれた、組換えＤＮＡク
ローニングベクター。

転写活性化配列・ＤＮＡからｍＲＮＡ転写体への転写を
指令する、またはその転写を提供するＤＮＡ配列。

翻訳活性化配列：ｍＲＮΔ転写体からペプチドまたはポ
リペプチドへの翻訳を指令する、またはその翻訳を提供
するＤＮＡ配列。

翻訳開始信号：翻訳開始コドンを暗号化しているＤＮＡ
のトリプレット（３つの組）。

翻訳停止信号：翻訳停止コドンを暗号化しているＤＮ’
Ａの３つの組。

形質転換：遺伝子型を変化させる受容宿主細胞へのＤＮ
Ａの導入。

形質転換体形質転換を受けた受容宿主細胞。

制限フラグメント、ｌまたはそれ以上の制限酵素の作用
により生成した線状のＤＮＡ配列。

レプリコン：組換えＤＮＡクローニングベクターおよび
発現ベクターの複製を支配するＤＮＡ配列。

ランチウェイ（暴走）レプリコン：コピー数抑制能を欠
く、または、これを透導により失うレプリコンであって
、かかる欠失は、このレプリコンが組み込まれたＤＮＡ
を非抑制下に複製し、そのコピー数を著しく増大させる
。

機能的ポリペプチド：回収可能な、生物学的に活性な外
来性ポリペプチドまたは前駆体、外来性ポリペプチドお
よび内性ポリペプチドの一部または全体からなる、回収
可能な生物学的に活性なポリペプチド、または、外来性
ポリペプチドおよび特異的に開裂可能な生物学的に不活
性化するポリペプチドからなる、回収可能な生物学的に
からなる、回収可能な生物学的に活性な融合ポリペプチ
ド。

融合遺伝子産物・内性ポリペプチドの一部または全体を
含む、回収可能な外来性ポリペプチド。

図面の説懸 第１図〜第４図ニブラスミドルＮＭ５７５の組み立て方
法の概略図。

第５図〜第８図、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂの組み立て
方法の概略図。

第９図；プラスミドｐＣＺＩ９２０およびｐ、ＪＲｌの
制限サイト地図。

第１０図ニブラスーミドｐＣＺ１１２の制限サイト地図
。

第１＋図、チモシンアルファ１合成遺伝子。

第１２図：ヌクレオヂドフラグメントＴＩ５の合成方法
。

第１３図；プラスミドｐ’ｒｈａｉの組み立て方法。

第１４図プロインシュリン合成遺伝子。アミノ酸１〜３
０はＢ鎖、３１〜６５はＣ鎖、６６〜８６はＡ鎖である
。

第１５図・プラスミドｐＨｌ７△４△１の組み立て方法
。

第１６図ニブラスミドルＩ（Ｉ２Ｏ３の組み立て力木発
明は、選択的かつ自律的に複製を行なう組換えＩ）ＮＡ
発発現ツクター提供するものであり、該ベクターは、 ａ）ランチウェイ（暴走）レプリコン、および、ｂ）生
物学的に活性な牛の成長ホルモン誘導体を暗号化しいる
遺伝子の読み取り枠内にある、転写および翻訳活性化配
列、 を含み、この遺伝子は、 ＴＣＴ　　ＡＴＧ　　ＧＣＣＴＴＣ Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ＩｌｌＡ
ＧＡ　　ＴＡＣＣＧＧ　　ＡＡＧ ＡＡＡ　　ＧＧＣＣＧＡ　　ＴＡＣ ＴＣＴ　　　ＣＴＧ　　　ＴＣＣ Ｉ’ｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＡＧＡ　　　Ｇ
ＡＣＡＧＧ （３）５’　　ＡＴＧ　　ＴＴＴ　　ＣＣＡ　　ＧＣＣ
Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１１３°　Ｔ
ＡＣＡＡＡ　　ＧＧＴ　ＣＧＧ（４）５’　　ＡＴＧ　
　ＴＴＣＣＣＡ　　ＧＣＴＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　
　Ｉｌｌ　　　ｌ１１３’　　ＴＡＣＡＡＧ　　ＧＧＴ
　　ＣＧＡＡＴＧ　　　ＴＣＴ　　　ＣＴＡ　　ＴＣＴ
Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＴＡ
ＣＡＧＡ　　ＧＡＴ　　ＡＧＡ ＡＧＧ　　ＣＣＧ　　　　　　　　５゜（６）５°ＡＴ
Ｇ　　Ｔ’ＴＴ　　ＣＣＡ　　ＧＣＴ３’　　ＴＡＣＡ
ＡＡ　　ＧＧＴ　　ＣＧＡＡＴＧ　　ＴＣＴ　　ＣＴＡ
　　ＴＣＴ　　　　　　’Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　
　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＴＡＣＡＧＡ、　　ＧＡＴ　　
ＡＧＡ ３’　　ＴＡＣＣＡＡ　　ＡＡＡ　　ＧＧＣＧＣＴ　　
ＡＴＧ　　ＴＣＴ　　ＣＴＧＩｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　
Ｉｌｌ　　　１１＋ＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡ　　ＧＡＣ ＡＧＧ　　ＣＣＧ　　　　　　５°、または３’　　Ｔ
ＡＣＣＧＡ　　ＡＡＡ　　ＧＧＣＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧ
Ａ　　ＧＡＣ ＡＧＧ　　ＣＡＧ　　　　　　　５゜ ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、Ｒは中成長ホ
ルモンのアミノ酸の９番（ロイシン）から１９１番（フ
ェニルアラニン）までを暗号化しているＤＮＡ配列であ
り、Ｒ１は翻訳停止信号をにより示される。

本発明は、さらに上記ベクターの新規な形質転換体、化
合物、顆粒および用途に関する。

本発明は、以下のＸｂａｌ　−ＨｇｉＡ　Ｉ　ＤＮＡリ
ン、カー配列： ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴ ＴＡＣＴＴＴ　　ＣＣＣＴＴＡ ＡＧＡ　　ＴＡＣＣＧＧ　　　ＡＡＧ ＣＣＡ　　　ＧＣＣＡＴＧ　　　ＴＣＣＩｌｌ　　　　
Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ＩＩＩＧＧＴ　　’ＣＧ
Ｇ　　ＴＡＣＡＧＧ ＴＴＧ　　　ＴＣＣＧＧＣＣＴＧ １！ｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１１Ａ
ＡＣＡＧＧ　　　ＣＣＧ　　　ＧＡＣＴＴＴ　　　ＧＣ
ＣＡＡＣＧＣＴ Ｉｌｌ　　　　１１１　　　１１１　　　　ｌ１ｌＡＡ
Ａ　　　ＣＧＧ　　　ＴＴＧ　　　ＣＧＡＧＴＧＣＴ　
　　　３゜ ０　　　　　　　　５２、 ｂ）　　５°　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡ＋　
　１　１　１　１’　　ｌ　　ｌ　　ｌ　　ｌ　　ｌ　
　ｌ　　１３°　　　　　　ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴ
ＡＴＧ　　　ＴＴＴ　　　ＣＣＡ　　　ＧＣＣＩｌｌ　
　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ＩＩＩＴＡＣＡＡ
Ａ　　　ＧＧＴ　　　ＣＧＧＡＴＧ　　　ＧＣＴ　　　
ＣＴＡ　　　ＴＣＴＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ＩＩ
Ｉ　　　　ｌ１ｌＴＡＣＣＧＡ　　’ＧＡ’！’　　Ａ
、ＧＡＧＧＴ　　　ＣＴＧ　　　ＴＴＴ　　　ＧＣＣＩ
ｌｌ　　　　ＩＩＩ　　　　Ｉ’ｌｌ　　　　ｌ１１Ｃ
ＣＡ　　　ＧＡＣＡＡＡ　　　ＣＧＧＡＡＣＧＣＴ　　
ＧＴＧＣＴ　　　　３゜Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　
１ ＴＴＧ　　ＣＧＡ　　Ｃ５２、 ｃ）　　５’　　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡｌ
ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ ３’　　　　　　　ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴＡＴＧ　
　　ＴＴＴ　　　ＣＣＡ　　　ＧＣＴＩｌｌ　　　　Ｉ
ｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＴＡＣＡＡＡ　　　
ＧＧＴ　　　ＣＧＡＡＴＧ’ＴＣＴ　　　ＣＴＡ　　　
ＴＣＴＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ
１１ＴＡＣＡＧＡ　　　ＧＡＴ　　　ＡＧＡＧＧＴ　　
　ＣＴＧ　　　ＴＴＴ　　　ＧＣＣＩｌｌ　　　　１１
１　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＣＣＡ　　　ＧＡＣＡ
ＡＡ　　　ＣＧＧＡＡＣＧＣＴ　　ＧＴＧＣＴ　　　　
３’Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ ＴＴＧ　　　ＣＧＡ　　　Ｃ５’ を、プラスミドｐＣＺ１０１の〜ｌ　０　、２　ｋｂＢ
ａｍＨｌ−Ｘｂａｌおよび〜０　、６　ｋｂ１３　ａｍ
ＨＩ　−１１ｇ１．Ａ　Ｉフラグメントに個別にライゲ
ーション（結紮）することによって組み立てられろ。各
々プラスミドｐ（，７，１９２０、ｐ、ＪＲＩおよびｐ
ＡＴ２と称Ｕらイする得られたプラスミドは、ｌ）生物
学的に活性な牛の成長ホルモン誘導体を暗号化する配列
の読み取り枠内にある、Ｅ、Ｃ０１ｌリポ蛋白遺伝子の
転写および翻訳活性化配列（ナカムラ（Ｎ　ａＫ　ａｍ
ｕｒａ）およびイノウニ（Ｉｎｏｕｅ）、１９７９．セ
ル（Ｃｅｌｌ）１Ｂ＋ＬＩ０９）、２）適当に配置され
た翻訳停止信号、および３）ランナウェイレプリコン、
を含む。

プラスミドｐＣＺ１９２０．１）ＪＲＩおよびｐＡＴ２
により形質転換された細胞は、各々ＭＥＴ−ＬＹＳ−Ｇ
ＬＹ−ＡＳＰＮ−ＳＥＲ−ＭＥＴ−ＡＬＡ−ｂＧＨｌＭ
ＥＴ−ＰＨＥ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−１’４ＥＴ−ＡＬＡ−
Ｒ２およびＭＥＴ−ｂＧＨ［式中、ＭＥＴはメチオニン
、ＬＹＳはリジン、Ｇ　Ｌ　Ｙはグリシン、ＡＳＰＮは
アスパラギン、ＳＥＲはセリン、ＡＬＡはアラニン、Ｐ
ＨＥはフェニルアラニン、ＰＲＯはプロリン、ｂＧＨは
Ｎ末端（最初）のフェニルアラニンで始まる牛成長ホル
モンの天然アミノ酸配列であり、Ｒ２はＮ末端から６番
目のアミノ酸（ロイシン）で始まる牛成長ホルモンの天
然アミノ酸配列である］を発現する。プラスミドｐＣＺ
１９２０およびｐＪＲｌの各々の制限サイト地図を、添
付の第９図に示す。

これもまた本発明の範囲内にある、別のプラスミドが、
以下のＴａｇＩ−ＨｇｉＡＩＤＮＡリンカ−配列： ３°　　　ＴＧＧ　　ＴＡＣＣＴＡ　　ＣＴＡΔＡＧ　
　　ＴＴＴ　　　ＣＣＧ　　　ＧＣＴＩｌｌ　　　　１
１１’　　　１１１．１１１ＴＴＣＡＡＡ　　　ＧＧＣ
ＣＣＡ ＴＡＣＡＧＡ　　　ＧＡＣＡＧＧ ＧＧＣＣ，ＴＧ　　　ＴＴＴ　　　ＧＣＣＩｌｌ　　　
　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＣＣＧ　　　Ｇ
ＡＣＡＡＡ　　　ＣＧＧＡＡＣＧＣＴ　　ＧＴＧＣＴ　
　３゜ Ｉ’ｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ ＴＴＧ　　ＣＧＡ　　Ｃ５°、 ｂ）　　５°　ＣＧＡＣＡ　　ＡＴＧ　　ＴＴＣＣＣＡ
ｌ１１　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１１３
°　　　　ＴＧＴ　　ＴＡＣＡ、ＡＧ　　ＧＧＴＧＣＴ
　　　ＡＴＧ　　　ＴＣＴ　　　ＣＴＡＩｌｌ　　　　
Ｉｌｌ　　　　１１１　　　　ｌ１ｌＣＧＡ　　　ＴＡ
ＣＡＧＡ　　　ＧＡＴＴＣＴ　　　ＧＧＴ　　　ＣＴＧ
　　　ＴＴＴＩ’ｌｌ　Ｉｌｌ　Ｉｌｌ　１１１ ＡＧΔ　　ＣＣＡ　　　ＧＡＧ　　　ＡＡＡＣＣＧ　　
ＡＡＣＧＣＴ　　Ｇ’ｌ”ＧＣＴ　　３゜Ｉｌｌ　　　
　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　ＩＣＧＧ　　ＴＴＧ　　
ＣＧＡ　　Ｃ５°、ｃ）　　５’　　ＣＧＡＣＣＡＴＧ
　　ＧＡＴ　　ＴＴＴ’Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　
Ｉｌｌ　　　　ｌ１１３”　　　ＴＧＧ　　ＴＡＣＣＴ
Ａ　　ＡＡＡＣＣＧ　　　ＧＣ’ｒＡＴＧ　　　ＴＣＴ
Ｉｌｌ　　　　ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　１１．ｊ
ＧＧＣＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡ ＣＴＧ　　ＴＣＣＧＧＣＣＴＧ Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＧＡＣＡ
ＧＧ　　ＣＣＧ　　Ｇ、ＡＣ ＡＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡＧＴＧＣＴ　　
３゜ 噸 ｃ　　　　　　　５２、 ｄ）　　５’　　ＣＧＡＴＣＡＴＧ　　ＣＡＴ　　ＴＴ
ＴＩｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１１３°　
　　ＴＡＧ　　ＴＡＣＣＴＡ　　ＡＡＡＣＣＧ　　ＧＣ
Ｔ　　ＡＴＣＴＣＴ Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ＩｌｌＧＧＣＣ
ＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡ ＧＡＣＡＧＧ　　ＣＣＧ　　ＧＡＣ ＡＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡＧＴＧＣＴ　　
　３’ 「 Ｃ５°、 ＧＧＣＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡ ＣＴＧ　　　ＴＣＣＧＧＣＣＴＧ Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　１１１Ｇ
ＡＣ八〇〇　　　ＣＯＧ　　ＧＡＣ ＴＴ’ｌ”　　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＡＡＡ　
　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡＧＴＧＣＴ　　　ｓ’ □ Ｃ５２、 ｆ）　　５’　　ＣＧＡＴＣＡＴＧ　　ＧＣＴ　　ＴＴ
ＴＩｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１１３’　
　　　ＴＧＧ　　ＴＡＣＣＧＡ　　ＡＡＡＣＣＧ　　Ｇ
ＣＴ　　ＡＴＧ　　ＴＣＴＩｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉ
ｌｌ　　　ｌ１１ＧＧＣＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡ ＣＴＧ　　ＴＣＣＧＴＣＣＴＧ Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＧＡＣＡ
ＧＧ　　ＣＡＧ　　ＧＡＣ ＴＴＴ　　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＡＡＡ　
　Ｃ，ＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡＧＴＧＣＴ　　　３’ ０５°、　および ｇ）　　５’　　ＣＧＡＴＡ　　ＡＴＧ　　ＧＡＴ　　
ＴＴＴｌｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ｌ１１３°　　
ＴＡＴ　　ＴＡＧ　　ＣＴＡ　　ＡＡＡＣＣＧ　　ＧＣ
Ｔ　　ＡＴＧ　　ＴＣＴＩｌｌ　　Ｉｌｌ　　１１１　
１１１ ＧＧＣＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡ ＣＴＧ　　ＴＣＣＧＧＣＣＴＧ ｌ　１１　　　Ｉ　Ｉ　１　　　ｊ　ｌ　１　　　ｌ　
Ｉ　ＩＧＡＣＡＧＧ　　　ＣＣＧ　　ＧＡＣ ＴＴＴ　　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＡ
ＡＡ　　　ＣＯＧ　　　ＴＴＧ　　　ＣＧＡＧ１’ＧＣ
Ｔ　　　３’ □ Ｃ５’ ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシアデル、そしてＴはチミジルである。］ を、プラスミドｐｃｚｔｏｔの〜１０　ｋｂＥｃｏＲＥ
−ＢａｍＨｆおよび〜０　、６　ｋｂＢａｍＨＩ　−Ｈ
ｇ１Ａ　ＩフラグメントならびにプラスミドｐＮＭ６０
８の−０，２９ｋｂＥｃｏＲＴ−Ｃ１！ａＩフラグメン
トに、個別にライゲーションすることによって組み立て
られる。各々プラスミドｐＣＺＩ１２、ｐＡＴＩ。

ｐＡＳＰ　Ｌ　’ｐＡＳＰ　２、ｐＣＺ１５４、ｐＣＺ
１５５およびｐＣＺ１５６と称せられる得られたプラス
ミドは、ｌ）生物学的に活性な牛の成長ホルモン誘導体
を暗号化する配列の読み取り枠内にある、Ｅ、ｃｏｌｉ
）リプトファン遺伝子の転写および翻訳活性化配列（ホ
ールウェル（Ｈａｌ　Ｊｅｗｅｌ　ｌ）およびエムター
ジ（Ｅｍｔａｇｅ）、　Ｉ　９８０　、ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）９．Ｈｇ７）、２）適当に配置された翻訳停止信号
、および３）暴走レプリコン、を含む。プラスミドｐＣ
Ｚ１１２、ｐＡＴ鎖、ｐＡＳＰ１．ｐＡＳＰ２、ｐＣＺ
＋５４、ｐｃｚ＋５５およびｐＣＺ１５６によって形質
転換された細胞は、各々ＭＥＴ−ＡＳＰ−ＡＳＰ−ＬＹ
Ｓ−ｂＧＨ，ＭＥＴ−−ｂＧＨ，ＭＥＴ−ＡＳ＋”−ｂ
ＧＩ−Ｔ、ＭＥＴ−ＡＳＰ−ｂＧｌ−１，ＭＥＴ　−Ｖ
　Ａ　Ｌ　−ｂ　Ｇ　ＨｌＭＥＴ−ＡＬＡ−ＰＨＥ−Ｐ
ＲＯ−ＡＬＡ−ＭＥＴ−８ＥＲ−ＬＥＵ−，５ＥＲ−Ｖ
ＡＬ−ｂ’ＧＨ、およびＭ　Ｅ　’Ｉ”　　Ａ　Ｓ　Ｐ
　−ｂＧＨ［式中、ＭＥＴはメチオニン、ＡＳＰはアス
パラギン酸、ＬＥＵはロイシン、ＳＥＲはセリン、１）
　ＲＯはプロリン、ＰＨＥはフェニルアラニン、ＬＹＳ
はリジン、Ｖ　Ａ　Ｌはバリン、Ａ　Ｌ　Ａはアラニン
、６″ＧＨは９番目のアミノ酸ロイシンで始まる牛成長
ホルモンの天然アミノ酸配列であり、ｂＧＨはＮ末端か
ら（最初）のフェニルアラニンで始まる牛成長ホルモン
の天然アミノ酸配列である］を発現する。代表的なプラ
スミドｐｃｚｚ２の制限サイト地図を、添付の第１０図
に示す。

出発物質のプラスミドｐＣＺ１０＋は、〜１０゜８ｋｂ
てあって、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂの〜０゜６ｋｂＸ
ｂａｌ　−ＢａｍＴ−Ｔ　Ｉフラグメントを、同様に消
化したプラスミドｐ１Ｍ−Ｉ’−Ａ３にライゲーション
することにより、組み立てられる。Ｅ、ｃｏＨリポ蛋白
遺伝子の転写および翻訳活性化配列と共に暴走レプリコ
ンを含む、後者のプラスミドは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　
Ｒｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ（Ｐｅｏｒｉａ、　　Ｉ　１ｌｉｎｏｉｓ　
　在）に寄託され、永久ストック・カルチャー・コレク
ノヨンの一部となっている菌株Ｅ、　ｃｏｌｉＫ　Ｉ　
２　ＲＶ　３０８／ｐＩ　Ｍ　−１’−Ａ３から得るこ
とができる。この菌株は、プラスミドの好ましい供給源
および保管形態として、受理番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７
３３の下に入手可能である。出発物質のプラスミドｐＮ
Ｍ７８９Ｂは、第１図〜第８図および後述の実施例１に
図示および記載した手順に従って、プラスミドｐＫＥＮ
Ｉ　Ｉ　１から誘導する。プラスミドｆｌＫＥＮＩＩＩ
は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ５
ｅａｒ’ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　　（Ｐｅｏｒｉａ
、　　ｒ　ｌ１ｉｎｏｉｓ在）に寄託され、永久ストッ
ク・カルチャー・コレクションの一部となっている菌株
Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　ＣＣ６２０／ｐＫＥＮＩ
１１より得ることができる。この菌株は、このプラスミ
ドの好ましい供給源および保管形態として、受理番号Ｎ
ＲＲ１、Ｂ−＋５０ＩＬの下に人手可能である。さらに
プラスミドｐＮＭ７８９Ｂは、Ｅ、ｃｏｌｉリポ蛋白遺
伝子の転写および翻訳活性化配列、およびこれに加えて
、適当に配置された翻訳停止信号を含む、ｂＧＩ−１お
よびｂＧＨのＮ末端にある員数９のポリペプチドからな
る融合蛋白質を暗号化する配列を含む。Ｘ　ｂａ　Ｉ−
Ｂ　ａｍｌ−（Ｉフラグメントに含まれる、この融合蛋
白質暗号化配列を、適当に開裂させたプラスミＦ’ｐ　
ｒ　Ｍ　−１−Ａ３にライゲーションオろ結果、前述の
出発物質プラスミドｐＣＺ＋０１か生成する。

プラスミドｐＮＭ６０８出発物質は〜４．６ｋｂであっ
て、プラスミドｐＨｌ７△４△ｌのＥｃｏＲＩ−ＣＱａ
ｌフラグメントを、ＥｃｏＲｌ−ＣＣａ１で消化したプ
ラスミドｐＢＲ３２２にライゲーションすることにより
組み立てられる。プラスミドＩ）ＨＩ７△４△１は、後
述の実施例５の示すところに従って組み立てることがで
きる。プラスミドｐＨｌ７△４△１のＴａｇｌ制限サイ
トは数多くあるため、所望のＥｃｏＲＩ　−Ｔａｇ　Ｉ
フラグメントは、ｐＨｌ７△４△１のＥｃｏＲＩ　−Ｈ
ｌ）ａ　ＩおよびＨｐａＩ−Ｔａｇｌフラグメントの二
次クローン化によって最もよく生産できる。プラスミド
ｐＮＭ６０８はＥ、ｃｏｌｉｌ−リプトファン転写活性
化配列を含み、したがって本発明の構成に有用である。

当業者は、上に記載した種々のＤ　Ｎ　Ａリンカ−が本
発明の重要な構成要素であると認識できるであろう。こ
れらの配列は、完全に保護したジデオキンリポヌクレオ
チド構築ブロンクを用いる改良ホスホトリエステル法に
より、常套に合成することができる。かかる合成方法は
、当分野でよく知られており、イタクラ（Ｉ　ｔａｋｕ
ｒａ）等、１９７７、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　
Ｉ　９８　：　１０５６およびフレア（Ｃｒｅａ）等、
Ｉ９７’８．プロナス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）Ｕ　Ｓ　Ａ　７５　：５７６５
の方法と実質的に同様にして実施することができる。さ
らに、とりわけ好ましい方法が、ノウング（Ｈｓｉｕｎ
ｇ）等。

＋９８３．ヌクレイツク・アンラド・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｒｓｅａｒｃｈ）　Ｉ　Ｉ　：
３２２７およびナラング（Ｎａｒａｎｇ）等、１９８０
．メソッド・イン・エンサイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６８：９０に開示され
ている。このリンカ−は、翻訳活性化配列および、前記
ｂＧＨ誘導体化合物の最初の部分（Ｎ末端領域）を含む
アミノ酸をも暗号化している。ｂＧＨ暗号化配列の残部
（適当に配置された翻訳停止信号を含む）および転写活
性化配列もまた、プラスミドｐｃｚ＋ｏ＋の適当なフラ
グメントのライゲーションによ−）で提供される。

こうしたライゲーションの結果、本発明に係る代表的な
牛成長ホルモン誘導体発現プラスミドが生成する。

プラスミドｐＣＺ１０＋の〜９００　ｂｐＢｓｔＥ　１
１制限フラグメントを除去し、続いて再環化すると、プ
ラスミドｐｃｚｔｏａが生成する。ＲｓｔＥＨの除去は
、プラスミドｐＣＺ１０１のｂＧＨ暗号化領域には影響
を及ぼさない。上記の組み立てにおいて、プラスミドｐ
ＣＺ１０＋の代わりにプラスミドｐｃ２．＋０３を使用
すると、同様の、ただし９００ｂｐたけ小さいプラスミ
ドが生成する。したがって、これらのｐＣＺ１０３由来
のプラスミドにより発現されろｂＧＨ誘導体は、ｐＣＺ
１０１由来のプラスミドにより発現される誘導体と同一
である。

したがって、前記のプラスミドｐＪＲ１およびｐＡＴ２
の組み立てにおいて、プラスミドｐＣＺＩＯ１の〜１０
．２ｋｂＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌおよび０．６ｋｂＢａｍ
ＨＩ　−ＨｇｉＡ　Ｉ制限フラグメントの代わりに、プ
ラスミドｐＣＺ＋０３の〜９　、３　ｋｂＢａｍＨ１−
”　Ｘ　ｂａ　Ｉおよび〜０　、６　ｋｂＢａｍＨＩ　
−ＨｇｉＡ　Ｉ制限フラグメントを使用する結果、誘導
体プラスミドｐＪＲ１，３およびｐＡＴ２．３がそれぞ
れ組み立てられる。前記のプラスミドｐＡＴ　Ｌ　ｐＡ
ｓＰ　１１ｐＡ　Ｓ　Ｐ　２、ｐＣＺ１５４、ｐＣＺＩ
５５、およびｐＣＺＩ５６の組み立てにおいて、プラス
ミドｐＣＺＩＯＩの〜Ｉ０．２ｋｂＢａｍＨＩ−Ｅｃｏ
ＲＩおよび〜０　、６　ｋｂＢ　ａｍＨＩ　−ＨｇｉΔ
■制限フラクメントの代わりに、プラスミドｐＣＺ１０
３の〜９．３ｋｂＢ　ａｍＨＩ　−Ｅ　ｃｏＲＩおよび
〜０　、６　ｋｂＢ　ａｍｒ−１１−１−ｌ−１−ｌ制
限フラグメントを使用する結果、誘導体プラスミドｐＡ
Ｔ１．３、ｐＡＳＰ２．３、ｐＣＺ＋５４．３、ｐＣＺ
Ｉ５５．３、およびｐＣＺＩ５６．３がそれぞれ組み立
てられる。

ある特別の配列の選択が本発明の実施可能性に対し、決
定的であることはないので、本発明は、いかなるやり方
においても特定の転写活性化配列の使用に限定されるこ
とはない。前に例示したリポ蛋白およびトリプトファン
活性化配列から置き換えることのできる転写活性化配列
には、Ｅ、ｃ。

１１ラクトース（Ｑ、ａｃ）、バクテリオファーンλＰ
Ｈ７Ｏ１、およびバタテリオファーンλＰＨ０ｐ転写活
性化配列が含まれるが、これらに限定される訳ではない
。さらに、■もしくはそれ以上の転写活性化配列または
それらの一部を縦につないで、たとえばｔｒｐおよびＱ
ａｃまたはｔａｃ転写活性化配列というよ、うに使用す
ることもできる。前述の配列は、全て前もってその性質
か決定されているものであり、合成により、または既知
のプラスミドから組み立てることができる。

本明細書中に記載した特別の態様によれば、プラスミド
の複製は、英国特許公開番号１，５５７゜７７４および
ウーリン（Ｕｈｉｌｉｎ）等、１９７９．ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）６・９１の両者に開示されている温度誘導性暴走
レプリコンによって決定される。３０℃以下、とりわけ
２５℃の温度では、このレプリコンは、細胞当たり約ｌ
Ｏ〜Ｉ５コピーという比較的低いコピー数を維持する。

温度か３７℃まで」１昇すると、コピー数抑制が失われ
、このレプリコンを含むプラスミドは、細胞当たりｔｏ
ｏｏ〜２０００コピーを複製する。本明細書中に例示す
る、この暴走レプリコンは、前述のプラスミドｐＴＭ−
Ｔ’−Δ３出発物質１こ含まれる。当業者には、本発明
が特定の暴走レプリコンまたはコピー数変異体の使用に
限定されないことが理解できるであろう。その他の誘導
性の暴走または高コピー数レプリコンは、適当な選択に
より得られ、または国際公開番号ＷＯ３２１０２９０＋
に開示の方法にしたがって組み立てられる。このような
レプリコンは、これもまた本発明の範囲内にある発現ベ
クターを組み立てるのに使用することができる。

外来遺伝子を暴走レプリコンを含むベクターにクローン
すると、その結果、誘導およびコピー数抑制の消失時に
は、蛋白合成速度が著しく増大し、また同時に今まで未
知かつ未確認の種類の細胞内蛋白顆粒が形成される。や
はりこれらまた本発明に包含される、この顆粒は、その
蛋白組成か高度に均質であり、したがって既知の高分子
量集合体および組換えＤＮＡ含有宿主細胞中に時折出現
する内容物と識別が可能である。後者の内容物は異成分
から成り、通常、核酸、炭水化物、脂質およびペプチド
といった−揃いの細胞構成成分を含有し、特定の蛋白生
成物を１０〜２０％含むのみである。本発明に係る顆粒
は高度に均質であり、当該顆粒の少なくとも５０％、し
ばしば８０％を超えて含有される所望の蛋白生成物を伴
う。

本発明の新規な種類の顆粒は、細胞溶解物から容易に単
離することができ、また低濃度の尿素また洗浄剤中での
洗浄に対して安定である。洗浄によって、この顆粒と非
特異的に結合している蛋白質が除去される。高度に特異
的な活性物質を産む単離は、外来蛋白質の精製における
有用な第一段階を構成する。したがって、これに続く全
ての精製工程は簡略化できる。特に役立つのは、細胞壁
構成成分が顆粒から容易に分離できることである。

本発明に係る顆粒の形成により、正常な細胞の代謝の崩
壊および未熟な細胞の死が起こらないよう、外来蛋白質
が隔離されると考えられている。　　　・ヒトのプロイ
ンシュリンのようなある種の蛋白質は、Ｅ、ｃｏｌｉ中
で速やかに分解し、蓄積しない。

しかしながら、このような蛋白質が暴走レプリコンを含
むベクター中で暗号化された場合、プロインノコリンの
蛋白質は、通常の不安定な蛋白質を分解から保護する不
溶性の顆粒を形成する。したがってこの種の顆粒の形成
は、不安定な蛋白質の蓄積のためのみならず、遺伝子産
物の分離精製方法の簡略化のためにも有用である。

したがって本発明はさらに、高度に均質な細胞内外来性
蛋白質顆粒を生産する方法てあ−て、１　）ａ）ランナ
ウェイレプリコン、およびｂ）機能的ポリペプチドを暗
号化しているヌクレオチド配列の読み取り枠内にある転
写および翻訳活性化配列（ただし、該機能的ポリペプチ
ド暗号化配列は、この機能的ポリペプチドのカルボキン
末端を暗号化しているヌクレオチドのトリプレットに直
接隣接し、かつこれより下流に位置する翻訳停止信号を
含む）、を含む、選択的かつ自律的に複製する組換えＤ
ＮＡ発現ベクターでコンピテントな細胞を形質転換゛し
、そして、２）形質転換した細胞を、遺伝子の発現およ
び前述のランナウェイレプリコンの誘導または活性化に
好適な生育条件下で培養する、 ことからなる方法を包含する。

本明細書中にこれまで記載した全てのランチウェイ（暴
走）レプリコンならびに転写および翻訳活性化配列、な
らびに機能的ポリペプチドまたは融合遺伝子産物を暗号
化している実質上全てのヌクレオチド配列は、上に定義
した方法に使用するベクターの組み立てに使用すること
ができる。このような暗号化配列には、牛の成長ホルモ
ン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒトのプ
レ成長ホルモン（ｐｒｅ−ｈＧＨ）、豚の成長ホルモン
（ｐＧＨ）；哺乳類の成長ホルモン、鳥類の成長ホルモ
ン、成長ホルモン放出因子、ヒトのインシュリンＡ鎖、
ヒトのインノコ＋１ンＢ鎖、ヒトのプロインシュリン、
ヒトのプＬノブロインツユリン、ヒトおよびヒト以外の
インターフェロン、ウロキナーゼ、組織プラスミ７ノー
ゲノ活性化物質、インターロイキン■、全てのポリベプ
ヂトホルモン、全てのポリペプチド酵素、および研究ま
たは商業的価値を有する全ての生物学的に活性なポリペ
プチドを暗号化する配列が含まれるが、これらに限定さ
れる訳ではない。

」二に、定義した方法に従って培養した場合、本発明の
種類の顆粒の生成を具現する形質転換細胞には、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋｌ２　　ＲＶ３０８／ｐＣＺ１９２０、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２　ＲＶ３０８／１）ＪＲ１、Ｅｃｏ
ｌｉ　　Ｋ　ｌ　２　　ＲＶ　３０８／ｐＡＳｒ’　１
、Ｆ：、ｃｏｌｉＫ１２　　ＲＶ３０８／Ｉ）ＣＺＩ　
　１２、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　　ｒ（Ｖ３０
８／１）ＡＳＰ２　、　　Ｔ）、、　　ｃｏｌｉＫ　　
！　　２ｒｔｖ３ｏｓ／ｐΔＴ鎖、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ
Ｉ２ＲＶ３０８　／ｐＡ　Ｔ　２、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　
Ｋ　Ｉ　２　　ＲＶ３０８／ｐＣＺＩ５４、Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　　Ｋ　ｌ　２　　ＲＶ　３０８／ＴＩＣＺ１５６
、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋｌ　２　　ＲＶ３０８／Ｉ）ＪＲ
Ｉ３、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／１）ＡＳ
Ｐ鎖、３、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　ＲＶ　３０８
／ｐＡｓ　Ｐ　２．３、Ｅｃｏｌｉ　　Ｋ　１２　　Ｒ
Ｖ　３０８／ｐＡＴ　Ｉ　、３、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２　
　ＲＶ３０８／ｐＡＴ２．３、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２
　ＲＶ３０８／ｐＣＺ１．５４．３、およびＥｃｏｌｉ
　Ｋｌ２　　ＲＶ３０８／ｐＣＺ１５６．３が含まれて
いるが、これらに限定される訳ではない。

高度に均質な種類の顆粒を生産４−るための本発明方法
は、牛またはヒトの成長ホルモンを暗号化する上記のプ
ラスミドの使用に限定されない。前述の方法に従い、ヒ
トのプロインンユリン暗号化配列を含むベクターを含む
細胞を培養することによって、ヒトのプロインシュリン
顆粒を生産することもてきる１、このようなベクターは
、第１５図に、ｔｒｐＬＥ’−プロインンユリン融合配
列を含むＥ　ｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントを、
プラスミドｐＣＺ＋０１のＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ大
フラグメントにライゲーションすることにより組み立て
ることができる。プラスミドｐＣＺ２０＋と命名された
この得られたプラスミドは、常套の形質転換方法に従っ
て、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ２　ＲＶ３０８のごときＥ、ｃ
ｏｌｉを形質転換できる。この場合ヒトのプロインシュ
リンを包含する本発明の顆粒は、次いてこのＥ、ｃｏｌ
ｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／ｐＣＺ２０１形質転換体を３
７℃で培養することにより生産することができる。

本発明の例示ＤＮＡ配列およびプラスミドには、置換で
きるだけでなく、全ポリペプチド暗号化領域を通じてヌ
クレオチドの置換をすることができる。したがって、前
記で定義したＲは、ｂＧＨのアミノ酸番号９（ロイシン
）から１９１（フェニルアラニン）までを暗号化する、
かなり多くの可能なりＮＡ配列のうちの１個とすること
ができる。

このような配列は、知られているｂＧＩｒのアミノ酸配
列から導き出すことができ、以下に述べろ常套の合成法
によって組み立てることができろ。しかしながら、ｍＲ
ＮＡ中で相補塩基が生ずるのを回避するため、ヌクレオ
チドのトリプレットは、ラッカー（Ｚ　ｕｋｅｒ）およ
びステ、イーグラ−（Ｓｔｉｃｇｌｅｒ）、　　１９８
１　、ヌクレイツク・アノノド、リザーヂ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　９（１）
１３３に概説されている既知の原則および敷ｔｔテにし
たがって選択されるべきである。こうした相補塩基間の
水素結合（対合）は、翻訳の効率を減退させる折りたた
みおよびステム・アント・ロープ構造を産む結果となる
。」二に開示した全ての改良および変化は、前に引用し
た合成方法と実質的に同様にして、常套に合成できるこ
とが“、当業者には理解できるであろう。したがって本
発明は、いかなる場合においてら、特に例示したＤＮＡ
配列およびプラスミドに限定されることはない。

本発明に係る発現ベクターおよび方法は、広範な宿主生
物、例えばＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ、　Ｅ、
ｃｏｌｉ″に＋２、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ２　ＲＶ３０８
、Ｅ、Ｃ０１ｉＫＩ２ＨＢＩ０１、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ
ｌ　２　　Ｃ６００、Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｋ　Ｉ　２　　
Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ−１Ｅ、ｃｏｌｉＫｌ　２　ＲＲ１
、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２　ＭＭ２９４等のような
ダラム陰性原核生物に適用することができる。本発明の
態様は全て有用であるが、ベクターおよび形質転換体の
うち幾つかがより好ましい。

好ましいベクターには、ｐＣＺ１９２０、ｐＪＲｌ。

ｐＪＲ鎖、３、ｐＣＺＩ＋２、ｐＡＴ　１、ｐＡＴ鎖、
３、ｐＡＴ２、ｐＡＴ２．３．１）ＡＳＰ　Ｌ　ｐＡＳ
Ｐ　＋　、３、ｐＣＺ１５４、ｐＣＺＩ５４．３、ｐＣ
Ｚ１５６、ｐＣＺＩ５６．３、ｐＡＳＰ２．３、および
ｐＡＳＰ２が含まれ、好ましい形質転換体には、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ１２ＲＶ３０８／１）ＣＺＩ　９２０、Ｅ、
　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＲＶ３０８／Ｉ）ＪＲ１、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／ｐＪＲ！、３、Ｅ、　
ｃｏｌｔ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＣＺＩＩ２、Ｅ、
　ｃｏｌｔ　Ｋｌ　２　ＲＶ３０８／ｐＡＴ　Ｌ　Ｅ、
　ｃｏｌｉＫ　１２ＲＶ　３０８／ｐＡＴ　１　。

３、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＡＴ２、
Ｅ。

ｃｏｌｉＫ　１２　ＲＶ　３０８／１）ＡＴ　２．３、
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２ＲＶ３０８／ＩＩＡＳＰ１、Ｅ、
　ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２ＲＶ３０８／Ｉ）Ａｓｐ　１．
３、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２　　Ｒｖ３０８／ｐＣＺ
Ｉ５４、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２　　ＲＶ３０　ｓ
／ｐｃｚ　＋　５４．３、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　
　ＲＶ３０８／Ｉ）ＣＺＩ５６、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ
　２　　ＲＶ３０８／ｐＣＺ　ｌ　５６．３、Ｅ、　ｃ
ｏｌｔ　Ｋ　Ｉ　２　　ＲＶ　３０８／Ｉ）ＡＳＰ２．
３、およびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　　ＲＶ３０８
／ｐＡＳＰ２が含まれる。この好ましい群のうち、プラ
スミドｐＣＺ１１２、ｐＣＺ＋５４、ｐＣＺ］５４゜３
、ｐＣＺ１５６、ｐＣＺ＋５６．３、ｐＡＳＰ２．３、
およびｐＡＳＰ２、ならびに形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ
　Ｋ　１２　ｒｌｌ　３０８／ｐＣ７，ｌ　Ｉ２、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＣＺ＋５４、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＣＺｌ　５４．３
、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ２　ＲＶ３０８／ｐＣＺＩ５６、
Ｅｃｏｌｉ　Ｋｌ２　ＲＶ３０８／ｐＣＺ１５６．３、
Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０Ｂ／ｐＡＳＰ２．３、およ
びＥ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ２　ＲＶ３０８／ｐＡｓＰ２が特
に好ましい。

当業者は、本発明の発現ベクターが、標準的発現酵条件
を用いて牛成長ホルモン誘導体産物が発現されるように
、適当な宿主生物を形質転換するために使用されること
が認識できるであろう、高度に均質な顆粒として発現さ
れ、得られた細胞溶解物から常法により、単離されるこ
の生成物は、乳の産生を増加させ、牛の成長を全体的に
刺激するのに有用である。牛に対する使用、投与および
好適な要領の方式は既知であり、ここに参照のために記
載する欧州特許公開００８５０３６．７〜９ページに開
示されている。以下の実施例は、本明細書中に開示した
発明をさらに詳述するものである。発明の解説および発
明を構成する実際の方法を、適当な箇所に記載する。

寒輿辺±　プラスミドｐＮＭ７８９Ｂの゛組立てＡ、プ
ラスミドｐＫＥＮＯ２１およびそのＸｂａｌ−Ｂ　ａｍ
ＨＩフラグメントの組立て プラスミドｐＫＥＮＯ２＋（第３図における１０６）の
Ｘｂａｌ−ＢａｍＨＩによる開裂で得られた〜５．１ｋ
ｂフラグメントを出発物質として用いた。プラスミドｐ
ＫＥＮＯ２＋は、ｐＫＥＮＩＩＩ［第１図におけるＩ　
０１　（Ｌｅｅら、ｌ　９８１．　．１．１３ａｃＬ、
　　１４６：８６１−８６６およびＺ　ｗｉｅｂｅｌら
、１９８１、Ｊ、Ｂａｃｔ１４５：６５４−６５Ｇに記
載）であって、寄託微生物Ｅ、ｃｏｌｉＣＣ６２０（Ｎ
ＲＲＬ寄託番号＋５０’１１）から得ることのできるプ
ラスミドであり、Ｅ、ｃｏｌｉのりボタンバク質遺伝子
を含有する〜２　、８　ｋｂフラグメントを有する〕の
誘導体である。このフラグメントに関しては、Ｎａｋａ
ｍｕｒａおよびＩｎｏｕｅ（１９７９、Ｃｅ１ｌｌ　８
：Ｉ　Ｉ　０９−ＡＩＩ７′）Ｍ言及しティる。Ｉ）Ｋ
ＥＮＯ２１’Ｔ：ハ、ｐＢＲ３２２の単一のＥｃｏＲＩ
と５ａｉｌ制限部位との間のａ　５０　ｂｐ（塩基対）
配列がＥ、ｃ＜山のりボタンバク質遺伝子からの配列で
置換されている。

このリポタンパク遺伝子配列は、該リポタンパク質遺伝
子の最初のトリプレット（メヂオニン）の」１流側に、
プロモーター、５°非翻訳領域、およびリポゾーム結合
部位を含む４６２ｂｐのＡｌｕＴフラクメントを含有し
ている（Ｎａｋａｍｕｒａおよびｒ　ｎｏｕｅ１１９７
９）。単一のＸｂａｌ制限部位はメヂオニン翻訳開始信
号の＋６ｂｐ前方、リポゾーム結合部位　内に位置して
いる。構造遺伝子の翻訳終止コドンからＩ　０５　ｂｐ
Ｊｚ流に位置しているｐｖｕＩＩ制限部位は、合成１）
　Ｎ　Ａリンカ−（５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３２、Ｃ
ｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ供給）
を付加することにより、ＢａｍＨＩ制限部位に変換され
た。

このＢａｍＨ１部位に続いて、リポタンパク質の最後の
３５アミノ酸に関する暗号配列、翻訳終止信号、および
メヅセンジャーＲＮＡの３゛非翻訳領域に相当する配列
がある。プラスミドｐＫＥＮ。

２１はリポタンパク質遺伝子と無関係な、約８５０ｂｐ
の余分な配列を、Ｅ、ｃｏｌｉ染色体中の、上記遺伝子
から下流位置に含有している。これらの配列は、最初に
遺伝子を単離するために用いた方法および制限酵素部位
に起因して含有されてしまったのである。

第１，２および３図に従って、プラスミドｐＫＥＮＯ２
＋はｐＫＥＮｌｌｌから、以下の方法で導かれる・ 約５０μ２のＩ）ＫＥＮＩＩ＋（第１図におけるＩＯ２
ンを、３００ｔｔＱの緩衝液（２０ｍＭ）リス−ＭＣＩ
。

ｐＨ７，４、Ｉ　Ｏｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ’ＣＩ　、および６
ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有）中で２５単位の
ｌ−１ｐａｎ制限酵素により、３７℃で２時間、消化す
る。この混合物をフェノール：クロロホルム（’５０：
５０）の混合物３００μｇで２回抽出し、回収した水層
に２．５容量のエタノールと０１容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムを加えて沈殿させる。Ｉ）　Ｎ　、Ａペレットを１
００１１１２の電気泳動用緩衝液に溶かし、５％ポリア
クリルアミドゲル（アタリルアミド・ビス化合物の比率
は、明記しない限り、全てのゲルに関して２９：１であ
る）上で分画する。このゲルを、臭化エチジウム０５μ
ｑ／ｙＱを含有する溶液中で染色し、長波長の紫外光に
よってバンドを検出する。

９５０ｂｐのバンドをゲルから単離し、透析袋中で電気
溶離して回収する。フェノール／ＣＨＣ１ａ抽出および
エタノール沈殿に付した後回収したＤＮＡ（約２．５μ
ｇ）を２５７ｚ９のＴＥＮ（１０＋ｎＭＮａＣ１、ｌ０
ｍＭトリス−ＨＣＩ（１）Ｈ７，４）および１ｍＭエチ
レンジニトリロ四酢酸ナトリウム（ＥＤ　Ｔ　Ａ　。

ｐ■−ｒ８．０））に溶かす。

約２１ｔｇの９５０　ｂｐＨｐａＩ［フラグメントを、
２００μρの緩衝液（ｊＯｍＭＮａｃＬ　　６ｍＭ）リ
ス・ＨＣＩ（１１Ｈ７，６）、６ｍＭＭｇＣＩ２および
６＋ｎＭβ−メルカプトエタノールを含有）中で、３７
℃において２時間、ＡｌｕＩ制限酵素で消化する。この
ＤＮＡをポリアクリルアミドゲル上で分画して生成され
た４　６２ｂｐ　　Ａｌｕｌフラグメントを回収し、前
述の方法で精製する。この４６２ｂｐ　　Ａｌｕｒフラ
グメント（約ｌμｇ）を、１５０ピコモルのリン酸化さ
れたＥｃｏＲｆリンカ−（５°ＧＧＡＡＴＴＣＣ３°：
Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ供給）
と２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する１０μＱのＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６６ｍＭ）リス・ＨＣ１（ｐ
Ｈ７６）、Ｉ　ＯｍＭＭｇｃ　１！、１０ｍＭジチオト
レイトールおよび０．４＋ｎＭＡＴＰ）に溶かす。４℃
で１６時間インキュベートした後、この混合物を６５℃
で１０分間加熱し、ＥＣ０ＲＩ緩衝液（１００ｍＭトリ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，２）、５０ｍＭＮａＣ１゜１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣ鎖、および６ｍＭβ−メルカプ１−エタノー
ル）と４０単位のＥｃｏＲＴ酵素を加えて１００μｇに
希釈する。３７℃で２時間処理した後、この試料を常法
通りフェノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール沈殿
に付す。次いてこのＤＮＡを、０．１単位のＴ／ｌＤＮ
Ａリガーゼと０．１μｇのｒｌＢＲ３２２（第１図にお
ける＋０２、Ｅｃｏｆｌｌで線状にした後、アルカリ性
ホスファターゼて処理したもの）０１μ９を含有するＴ
４ＤＮＡリカ−ゼ緩衝液に溶かず。４℃で１６時間ライ
ゲーンヨンした後、得られたＤＮＡを用いてＦ：、ｃｏ
ｉｉ菌株Ｋ１２ＨＢＩ０１を常法通り形質転換する。形
質転換体をテトラサイクリンＩ　２　Ｉｔ　ｆｔ／　ｍ
Ｑを含んノこ寒天平板」−で選択し、高速アルＪノリ性
抽出法（バーンボイム（Ｂ　ｉｒｎｂｏｉｍ）およびド
ーリイー（Ｄｏｌｙ）、１９７９、ヌクレイツク・アン
ット・リザーヂ（１＜１１ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）７　：Ｉ　５１３〜Ｉ　５２３記載）
によって耐性コロニーからプラスミドを単離する。４６
６ｂｐＸｈａＩ　−Ｂａｍｌ−１１７ラグメントを含有
するプラスミド（第１図におけるｌ０３）を選択し、下
記の工程における出発物質とする。

このプラスミド（第２図におけるｌ０３）約２μ９を５
０μ夕のｌ−１ｉｎｄｌｌ！緩衝液（６０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｌ。

１０ｍＭトリス・ＭＣＩ（ｐＨ７、４）、１０ｍＭＭｇ
Ｃ鎖、およびｆｌｚｎＭメルカプトエタノール）中で、
Ｈｉｎｄｒｌｌ酵素２単位により、３７℃で１時間、消
化する。フェノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール
沈殿の後、Ｄ　Ｎ　Ａを２００μρの緩衝液（３００ｍ
Ｍ　　ＮａＣ鎖、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（＋）Ｈ４，
２５）、ＩｍＭ　　ＺｎＣＬおよび２００単位の８１ヌ
クレアーゼ（Ｍｉｌｅｓ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ供給
））に溶かす。１５℃で１時間処理した後、フェノール
／ＣＨＣｌ３抽出して反応を止め、エタノール沈殿に付
す。得られたＤＮＡを２ピコモルのりん酸化された１Ｂ
ａｍＨ■リンカー（５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３°Ｃｏ
１１ａｂ−ｏｒａＬ　ｉｖｅ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ供給
）と２単位のＴ４ＤＮＡリガ−セを含をするＴ４ＤＮＡ
リガーゼ緩衝液１０μＱに溶かず。４℃で１６時間処理
した後、反応混合物を６５℃ＩＯ分間加熱してリガーゼ
を不活化し、次いてＢａｍＨＩ酵素２０単位を含有する
Ｂａｍ１−（１緩衝ｉ夜（＋　５０ｍＭＮａＣ鎖、２０
ｍＭトリス・ＨＣＩ（１）Ｈ８，０）ｌ　０ｍＭＭｇＣ
鎖、および６ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有）で
１００μρに希釈する。３７℃で２時間処理した後、こ
の混合物を１％アガロースゲル上で精製する。このケル
を染色し、凍結処理の後、大きい方のフラグメント（〜
４．５ｋｂ）を溶離、回収し、次いてフェノール／ＣＨ
Ｃｌ３抽出およびエタノール沈殿にＪ：、−Ｔで精製す
る。回収したフラグメントはＢａｍ１ｌｌ枯７１９末端
を有しており、これを０．１単位のＴ　４　Ｄ　ＮΔリ
カ二ゼを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｇに溶か
ず。４℃で１６時間処理した後、このＤＮＡを用いてＥ
、ｃｏｌｉＨＢ　Ｉ　Ｏｌを形質転換する。

形質転換体を１００μｇ／＝夕におけろアンピノリン耐
性（Ａｐγ）に関して選択し、１０μ’ｊ／ＭＱのテト
ラサイクリンに対する感受性（Ｔｃ”）に基づいてスク
リーンする。ＡＩ）γＴｃ”を示すコロニーから前記Ｂ
　ｉｒｎｂｏｉｍ法で調製した数個のプラスミドを、Ｈ
ｉｎｄＩ［１部位の不存在と単一のＢａｍＨ１部位の存
在とに関して調べろ。ＥｃｏＲ１、５ａｌｌ連続消化に
より４６６ｂｐフラグメントと３．０５ｂｐフラグメン
トを得る。これらの特徴を有するプラスミド（第２図に
おけろ１０４）を選択し、次いで、ｌｐｐプロモーター
の」二流に位置するＥｃｏＲ１部位をＨｉｎｄｌｌｌ制
限部位に変換すべく、修飾する。

２μこのプラスミド（第２図における１０４）を１００
μｌ！のＥｃｏＲＩ緩衝液中で、３７℃において１０分
間、ＥｃｏＲＩＯ，２単位で消化する。６５℃で１０分
間加熱することにより反応を停止した後、フエ、ノール
／ＣＩ−（Ｃ１，抽出、およびエタノール沈殿に付し、
得られたＤＮＡを１０００単位／！ＩＱのＳｌヌクレア
ーゼを含有する２００μρのＳ１ヌクレアーゼ緩衝液に
溶かし、１２℃で１時間反応さＨる。フェノール／ＣＨ
Ｃｌ３抽出して反応を止め、エタノール沈殿に付す。得
られたＤＮＡを２０ピコモルのりん酸化されたＨｉｎｄ
Ｉ［［リンカ−（５°ＣＣＡＡＧＣＴＴ（１；Ｇ３°、
Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ供給）と
２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液ｌＯμａに再懸濁する。４℃で１６時間処理
した後、この混合物を６５６Ｃで１０分間加熱し、１０
単位のｌ−１ｉｎｄ■酵素を含有するＨｉｎｄＩＩＩ緩
衝液により１５０７１１！に希釈して３７℃で２時間イ
ンギュベートし、次いで１％アガロースゲル」二て分画
する。最大のバンド（１箇所切断されたプラスミドに相
当）を常法通り回収して精製し、Ｔ４リガーゼ０２単゛
位を含有するＴ４リガーゼ緩衝液２０μρに溶かし、４
℃で１６時間インキュベートした後、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢ
ＩＯＩの形質転換に用いる。アンピシリン耐性に関して
形質転換体を選択し、単離しノープラスミドを制限酵素
分析によって常法通り分析ずろ。

５００ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌＩ［フラグメン
トを有するプラスミド（第２図にお１Ｊろ１０５）を選
択し、１ｐｐ遺伝子の３′領域付加物のためのクローニ
ングベクターとして用いる。

約２μりのプラスミド（第２図にお（」る１０５）を５
０μＱの５ａｌＩ制限緩衝液（１５０ｍＭＮａＣ１，６
ｍＭトリス・ＨＣＩ（１）Ｉ−（７，９）、６　ｍＭ　
Ｍｇ　Ｃｌ　２および６ｍＭＢ−メルカプトエタノール
）中で、ＳａｌＩ２単位により、３７℃で１時間消化し
、ＢａｍＨ１２単位を含むＢａｍＨＩ緩衝液中で１．５
０μρに希釈する。３７℃で１時間処理した後、アルカ
リ性ボスファターゼ２．５単位を加え、次いで６５℃に
おいて１時間、インキュヘ−ノヨンを続ける。

目的物フェノール／ＣＨＣ鎖、抽出、エタノール沈殿に
付し、ＴＥＮに溶かして＋ｐｐ　３°フラグメントのた
めのクローニングベクターとして用いる。

１ｐｐ３’領域を含むフラグメントを得るために、ｐＫ
ＥＮｌｌｌ（第３図における１０１）を２００μＱのＨ
ｐａｌ緩衝液（２０ｍＭＫＣ１、ｌ０ｍＭトリス・ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，４）、］　ＯｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２およ
び６ｍＭメルカプトエタノール）中で、ＨｐａｌｌＯ単
位により、３７℃で２時間消化する。フェノール／ＣＨ
Ｃｌ３抽出、エタノール沈殿の後、得られたＤＮＡを２
０ピコモルのりん酸化された５ａｌｌリンカ−（５’Ｇ
ＧＴＣＧＡＣＣ３２、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ提供）とＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を含
んたＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液ＩＯμσに溶かし、次い
で４℃で１６時間インキュベートする。６５℃て１０分
間加熱してリガーゼを不活化ずろ。得られた物質を５ａ
ｌｌｌＯ単位を含んた５ａｌｌ緩衝液で１００μρに希
釈し、３７℃で１時間インキコヘートシた後、Ｐｖｕ１
７制限酵素ｌＯ単位を含んだＰｖｕｎ緩衝液（６０ｍＭ
ＮａＣ１、６ｍＭ１□リス・ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６
ｍＭＭｇＣＩ２および６ｍ＋〜４メルカプトエタノール
）中で３００μρに希釈する。３７℃で１時間処理した
後、ＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル上で分画する
。約０５μ７の９５０ｂｐフラグメノトを回収して精製
し、Ｔ　Ｅ　Ｎに溶かす。このフラグメント０　、２　
／１ｇを２０ピコモルのりん酸化されたＢａｍＨｌリン
カ−（５’ＣＣＧＧＡ′ｌ″ＣＣＧＧ３２、Ｃｏ１１ａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｔｑａｒｃｈ供給）およびＴ
４１）　Ｎ　Ａリガーゼ２中位を含（ｆ４−ろ１゛１Ｉ
ＤＮΔリガーゼ緩衝液中て２０μ夕に希釈し、４０Ｃで
１６時間インキコベートする。次いて、得られたＤＮＡ
を６５℃で１０分間加熱し、ＢａｍＨ１２０単位を含ん
たＢａｍＨＩ緩衝液中で１００ＩＩＲに希釈して３７℃
で２時間インギコヘートした後、５％ポリアクリルアミ
ドゲル−にで分画して過剰のリンカ−分子を除く。得ら
れた、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ粘着末端を有する９５
０ｂｐフラグメントを常法通り精製し、前述のクローニ
ングベクタ−０゜２μ９とＴ’ｌ　ＤＮＡリガーゼ０２
単位とを含有ずろＴ／ｌＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μσ
に溶かす。

４℃で１６時間インキユベーンヨンした後、このＤＮＡ
を用いてＥ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２１４８　＋　０１を形
質転換する。アンピシリン耐性の形質転換体からブチス
ミ１−を調製し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに
ついて常法通り分析する。得られた所望のブラフ、ミ）
”（〜５．２ｋｂ）をｐＫＥＮＯ２！（第３図における
１０６）と称する。

ＩＯμ９のｐＫＥＮＯ２＋を３７℃において、２００μ
ρのＸ　ｂａＩ　／　ＢａｍＨｌ緩衝液（１５０ｍＭＮ
ａＣ１、ｌ０ｍＭ１−リス・Ｉ−１ＣＩ（ｐｌ（８）、
ｌ０ｍＭＭｇＣ鎖、および６ｍＭメルカプトエタノール
）中で、ＩＯ単位のＢａｍＨｉにより、１時間、次いて
１０単位のＸ　ｈａ　ｌにより、更に１時間（３７℃）
消化する。

次イテ、所望ノＸｂａｌ　−ＢａｍＨ＋／ｌ！ｉ化ＤＮ
Ａ全ＤＮＡリ性ボスファターゼ２．５単位により、６５
°Ｃて１５時間処理し、フェノール／ＣＨＣｌ３抽出し
てエタノール沈殿に付して集め、以後の使用に備えて’
Ｉ”ＥＮ５０μＱに溶かず（第３図におけるｌ０７）。

Ｂ、プラスミドｌ）ＮＭ５７５の組立てプラスミドｐｔ
ｒｐＥＤ５０ｃｈＧ１４８００（第４図にお（Ｊる１０
８、マーノヤル（Ｍａｒｔｉａｌ）ら、１つ７９、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０５：６０２−６０７に記
載）を、ヒト成長ホルモン遺伝子部分の暗号配列を含有
するＤＮＡフラグメントの供給源として用いた。このフ
ラグメントは合成的に組立てるごと乙てき（イタクラ（
Ｔ　Ｌａｋｕｒａ）ら、１９７７、およびフレア（Ｃｒ
ｅａ）ら、＋９７８）、あるいはクソドマン（Ｇ　ｏｏ
ｄｍａｎ）ら（＋９”／９、メ、・ソド・イン・エンサ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ）６８　ニア　５−９０）の示した周知の方法
論に従い、ヒト脳下垂体から、ヒト成長ホルモンを暗号
化しているｍＲＮＡを単離する方法によっても得ること
ができる。プラスミド阻ｒｐＥ　Ｄ　５０　ＣｈＧｌ（
３００のヒト成長ホルモン遺伝子部分は、該遺伝子の翻
訳終止コドンからｅｂｐ下流に単一のＳｍａｌ制限部位
を含有している。この部位を、以下の方法でＢａｍ１−
１１部位に変換した。即ち、このプラスミド６μりを、
２００μＱのＳｍａｌ制限緩衝液（１５ｍＭｔ・リス−
ＨＣＩ（＋）８８．０）、６　ｍＭＭｇＣＩ２．１５ｍ
ＭＫＣｌおよび６ｍＭβ−メルカプトエタノール）中で
３７°Ｃにおいて１．５時間、Ｓｍａ１６単位で消化し
た。消化完了後、フェノール／ＣＨＣｌ。

抽出を行い、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収し、
次イテＴ　ＥＮ　２４７ｚＱ１．：溶かした。Ｔ４Ｄト
ＪΔリガーゼ２単位を含むリガーゼ′緩衝液＋６７ＩＱ
中に上記の消化プラスミド０．５μｇ（０２ピコモルと
なる）を入れ、４０ピコモルのりん酸化されたＢａｍＨ
Ｉアダプターフラクメント（Ｇｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖ
ｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ提供）を加えた。この混合物を
２２°Ｃて２時間、４℃で１６時間インキユヘートし、
更に６５°Ｃで１０分間加熱した。ＢａｍＨＩ制限酵素
て常法通り・消化することにより、ＢａｍＨＩ粘着末端
を生成させた。この酵素は該リンカ−配列およびクロー
ンされたヒト成長ホルモンｃＤＮＡ配列の開始部分にあ
るＩ３ａｍｌ−１ｆ部位の両者を開裂する。こうして得
たＢａｍｔｌｌｆＴ！ｉ着末端を有ｉ′る６９１ｂｐフ
ラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル」二で分離し
、次いて常法通り回収した。回収したＤＮＡフラグメン
トを（緩衝液２０）ｔＣ！中てＴ４ＤＮＡリガーセ０２
単位により、前記の条件下において）、ＢａｍＨＩ消化
およびアルカ−り性ホスファターゼ処理を施したｒ＋Ｂ
Ｒ３２２（第４図における１０２）０．２μ９にライゲ
ー　トした。４℃で１６時間処理した後、この物質を使
用し、ウエンンンク（Ｗｅｎｓｉｎｋ）ら（＋９７／１
、セル（Ｃｅｌｌ）３：３］５−３２５）の方法に実質
上従って、Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＪＡ２２１（ＮＲＲＬ　Ｎ
ｏ、Ｂ−１５０１４）を形質転換した。形質転換体をア
ンピノリン１００μｇ／ｗＱを含む寒天平板−にで選択
した後、常法通りプラスミドを単離し、制限酵素分析並
びに電気泳動分析により、同定した。所望のプラスミド
（ｐＮＭ５７５と呼称、第４図における１０９）は、約
７００ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントを含有しており、
これを以後の使用に備えて常法通り増幅させＣプラスミ
ｌ；’ｐＮ　Ｍ　７０２の組立て成熟ヒト成長ホルモン
のＤＮＡ配列は、第１番ｌ」のヌクレオチドから４．７
ｂｐの位置に１個のＦｎｕＤＩ部位を有する。２５μ９
のｐＮＭ５７５をＢａｎ１（１緩衝液中てＢａｍ）ｆ　
Ｉ　２５単位により、３７８Ｃで１時間消化した。６％
ポリアクリルアミドゲルからＢａｍ１（Ｉ粘着末端を有
する６９１ｂｐフラグメントを常法通り単離し、精製し
た。精製後、ｌ／３の該フラグメント（プラスミド８μ
９に相当）をＩ００μＣのＦｎｕｌ’ＮＩ緩衝液（６ｍ
ＭＮａＣ１，６ｍＭトリス−ＭＣＩ（１）Ｈ７，４）、
６ｍＭＭ　ｇＣＩ２および６ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール）中において、ＦｎｕＤ１１２．５単位により、３
７℃で１５時間消化した。６％ポリアクリルアミドゲル
」二で電気泳動し、標準的な回収方法に従って、遺伝子
の後方の１７５アミノ酸の暗号配列を含有し、翻訳終止
信号が後続している５３８ｂｐのＤＮＡフラグメントを
単離した。

１１）Ｉ）プロモーター領域とヒト成長ホルモンの暗骨
領域とを結合さ仕るたぬに、ホスホトリエステル法によ
って二重鎖ＤＮＡフラクメント（第５図における１１０
）を合成した。この二重鎖ＤＮＡフラグメント（第５図
にお（Ｊる１１０）は、以下に示す配列を有する： Ｌ堕Ｉ ５°　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴ１＋１１
１１１１１１１１１１ ３″　　　　　ＴＣ（、ＣＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡ−Ｇ　
Ｔ　Ｔ　ＣＣＣＡ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　ｉ’　Ｃ；　
Ａ　ＴＧΔＴ　Ｇ　Ａ　’Ｉ’　−ＣＡＡＧＧＧＴＡＡ
Ｃ；ＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴΔ−ＡＡＧＴＴＣＣＣＡＡ
ＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴ−ＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＧＧ
丁ＡΔＧＧＧΔＡＴＡ−ＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣ
ＡＡＣＧＣＴＡＴ−ＧＧＴＣＣＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴ
ＧＣＧＡＴＡ−ＧＣＴＣＣＧ　　３°　ＦｎｕＤＩ１ ＣＧＡＧＧＣ５゜ このフラグメントは認められている方法論、ホスホトリ
エステル法に従って以下のセグメント。

１）ＣＴＡＧΔＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴΔＡ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　’Ｉ”　ＣＧ３）ＣＡ
ＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣ ６）ＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣ ７）ＴＴＴＴ　Ｔ　ＧＡＣＡＡＣＧ ８）ＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧ ９）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ｌｏ）ＡＴＧＧＧＡＡ １１）ＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ １２）ＧＧＴＴＧＧＧＡＡ １３）ＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ １４）ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴ ＋５）ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴ を調製し、それによって製造した。

上記の如く調製したセグメントを使用し、Ｔ４リカーゼ
を触媒とする結合反応を、以下の如く段階的に行った： ａ）　　５”−非りん酸化セグメントｌを５°−りん酸
化セグメント２に、５゛−りん酸化セグメント９の存在
下、Ｔ４リガーゼを用いて結合させ、ＤＮＡ二重鎖構造
ｌを得た（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、１９７９、メソ
ッド・イン・エンサイモロノ−（Ｍｅｔｈａｄｓ　　ｉ
ｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６８：Ｉ　ＯＬ−１５１
）。

この二重鎖構造を、１５％ポリアクリルアミドケル−１
−、プレパラティブーゲル電気泳動によって単離しノこ
。

ｂ）５′−りん酸化セグメント３を５′−りん酸化セグ
メント４に、５°−りん酸化セグメントＩＩの存在下、
Ｔ４リカーゼを用いて結合させてＤＮＡ二重鎖構造２を
得、次いでこれを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動て精製した。。

ｃ）　　５”−りん酸化セグメント５を５°りん酸化セ
グメント６に、５゛−りん酸化セグメント１２および１
３の存在下、Ｔ４リガーゼて結合さＵてＤＮΔ二二二鎖
重鎖構造３、次いてこイ１を１５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で精製した。

ｄ）　　５°−りん酸化セフメン！・７を５°りん酸化
セグメント８に、５゛　りん酸化セフメン）・１４およ
び５′−非りん酸化セグメント１５の存在下、Ｔ４リカ
−ゼて結合さＵ″てＤＮΔ二゛二鎖重鎖構造４、次いで
これを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し
た。

ｅ）次いてＤ　Ｎ　Ａ二重鎖構造２．３および４をＴ４
リガーゼて結合させてＤＮＡ二重鎖構造５を得、次いで
これを１５％アクリルアミドゲル電気泳動で精製した。

ｆ）　　５′−リン酸化セグメ：／　ｌ−１０、！：Ｄ
ＮＡ二重鎖構造５を、１゛４リガーゼの存在下、ＤＮＡ
二重鎖構造１に加えた。得られたＤ　Ｎ　Ａ二重鎖構造
（第５図におけろ１１０）を１０％ポリアクリルアミド
ケル電気泳動によって精製した。次に、このＤＮＡ二重
鎖構造を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ−３２Ｐ ゼと〔γ　　　）ＡＴＰとにより、確立されている方法
に従って酵素的にりん酸化した。

発現プラスミドｐＮＭ７０２は、プラスミドＩ）Ｋ［う
ＮＯ２＋（第５図における１０７）のＸｂａｌ　−Ｂａ
ｍＨＩフラクメノト０．１ピコモル（０，４７Ｂ）、合
成り　Ｎ　Ａフラグメント（第５図における１１０）０
．０２５ピコモル、および５３８ｂｐフラグメント（第
５図における１０９）０．３ビニ＋モル（０，０８μい
をライケーノヨノ用緩衝液２４μρ中て、′ｒ４ＤＮΔ
リカーゼ１５単位をＩＴＩＬＩて結合さＵ−ることによ
り、組立てた。４℃で１６時間インキユヘートした後、
この混合物を用いてＥ、Ｃｏ１１ＪＡ２２１を前記の如
く形質転換した。形質転換体を１００μｇ／ｍＱのアン
ピシリンを含んだ寒天平板−１−で選択し、所望の発現
プラスミドの好ましい供給源として常法通り培養した。

ヒト成長ホルモンの発現を標準的なラジオイムノアッセ
イ法（Ｔｗｏｍｅｙら、ｌ９７４、ＣＣ１１ｎＣｈｅ、
２０：３８９−３９１）によって検出したところ、細胞
当たり、少なくとも２百万分子、ｒＴ在することか分か
った。

Ｄ、プラスミドｐＮＭ７８９の組立て ヒト成長ホルモンのための発現プラスミドであるプラス
ミドｐＮＭ７０２（第６図にお（ＪるＩＩ＋）を、Ｍｅ
ｔ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ｂＧＨのための発現プラスミド
の組立てにおける出発物質として用いた。

プラスミドｐＢＰ３４８（第６図における＋１２、Ｍｉ
ｌｌｅｒら、１９８０１．１．　　Ｂｉｏ鎖、　　Ｃｈ
ｅｍ、２５５７５２１〜７５２４に記載）を、ウシ成長
ホルモノ遺伝子の部分的な暗号配列を含む２つのＤＮＡ
セグメントの供給源として用いた。このプラスミドは、
ｐＢＲ３２２のＰｓｔｌ制限部位に８３１ｂｐのウシ成
長ホルモンの暗号配列がクローンされたものである。Ｍ
ｉｌｌｅｒらの方法以外に、このウシ成長ホルモンのた
めの配列は、合成法（Ｔ　ｔａｋｕｒａら、１９７７、
およびＣｒｅａら、＋９７８）あるいは、今日では日常
的に行なわれているＧｏｏｄｍａｎら（＋　９７９）の
、ウシの脳下垂体から単離したメツセンジャーＲＮＡを
用いる方法によって得られる。

ヒト成長ホルモンの暗号配列とウシ成長ホルモンの暗号
配列とは非常によく似ており、多くのホモロジーを示す
。ウシ成長ホルモンのための発現プラスミドを組立てる
上で特に有用なフラグメントはＰｖｕＩＩ制限酵素消化
によって生成したフラグメントである。生成したフラグ
メントの大きさは、ヒト成長ホルモンの場合は４９　’
７　ｂｐ出あり、ウソ成長ホルモンの場合は４９４ｂｐ
であって、これら両開列の、同し解読フレーム内に、対
応上る制限部位が現れる。

ｐＮＭ７０２（第６図におけるＩ　Ｉ　Ｉ）Ｉ　ＯＲ３
を、Ｐｖｕｌｌ緩衝液（６０Ｉｌ１ＭＮａＣＬ　６ｍＭ
　）リス・ＨＣｌ（１）Ｈ７，５）、６ｍＭＭｇＣＩ２
および６ｍＭβ−メルカプトエタノール）中てＰｖｕＩ
ＩＲ４ｊ−位により、３７℃において１０分間部分消化
した。６５°Ｃて１０分間加熱して反応を停止させた後
、Ｄ　Ｎ　Ａをアルカリ性ホスファターゼで処理し、フ
ラグメントを１％アガロースゲル上で分離さＵろ。４９
７ｂｐのＰｖｕＵフラクメントを失ったＤ　Ｎ　Ａに相
当する大きさの線状ＤＮＡフラグメント（第６図にお；
）る１１３）（切断部位が１個のプラスミドよりもやや
叩く移動する）を常法通り分離して精製し、中間体プラ
スミド（第６図におけろｌｌ４）の組立てに用いた。

プラスミドｐＢＰ３４６の４９４　ｂｐＰ　ｖｕｌｌフ
ラグメントは、このプラスミドを、ＰｖｕＴＩＩＯ単位
を含有するｐｖｕｌｌ緩衝液２００μσ中で３７℃にお
いて１時間消化ずろことにより、調製した。このフラグ
メントを６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、所望
の４９４．ｂｐフラグメント（第６図における＋１２よ
り）を常法通り検出し、精製した。

中間体プラスミド（第６図における１１４）を、プラス
ミドｐＮＭ７０２のＰｖｕｌｌフラグメント０２μ９と
４９’４ｂｐフラグメント００５μ９とを、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ２単位を含有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２
０μσ中で４℃において１６時間反応させることによっ
て組立てた。形質転換、アンピシリン耐性に基づく形質
転換体の選択の後、このプラスミドを、４９４　ｂｐＰ
ｖｕｒｌフラグメントの存在および適切な方向性に関し
、常法通り分析した。４９４　ｂｐＰｖｕＴＩフラグメ
ントと４４０ｂｐＸｂａｌ−９ｍａＩフラグメントとを
含有するプラスミドを以後の使用のために選択した。

中間体プラスミド（第７図における＋１４）ｔ。

１１９を、ｐｖｕｌｌ緩衝液２００　μｒｌ中てｐｖｕ
ｌＩＩ単位により、３７℃において５分間消化した。６
５℃で１０分間加熱した後、この混合物を１％アガロ−
スゲル上に展開させ、１分子中に唯１個のＰｖａ■切断
部位を有する線状ＤＮＡを回収し、精製した。この回収
物（約３μｇ）をＸｂａ１５１位で完全に消化し、アル
カリ性ボスファターゼで処理した。

これらフラグメントを１％アガロースゲル」二に展開さ
Ｕ、最も大きいフラグメント（Ｘ　ｂａ　１部位から、
ヒトおよびウシ成長ホルモンに関する配列中の最初のＰ
ｖｕ１１部位に至る、ｌ０９ｂｐフラクメントが失われ
たものに相当する）を常法通り回収した（第７図におけ
る１１５）。

最初のＰｖｕＵ部位までの、ウシ成長ホルモンの初めの
部分の２３アミノ酸１こついてのＤＮＡ配列（６９ｂｐ
）は２個のＨｐａ１１部位を含有しており、それらの内
、初めの部位は、暗号配列中第１番目から数えて２３ｂ
ｐの位置にある。一方、６３ｂｐフラグメント（第７図
にお１プる１１６）を、ポスホトリエステル法で合成し
た。このフラグメントはｌｐｐリポゾーム結合部位中の
Ｘｂａ１部位からΔＴＧ翻訳開姶信号までの１９．ｂｐ
の配列と、それに続／　））ｈｅ−Ｐ　ｒｏ−１，、ｅ
ｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの暗号配
列（２４ｂｐ）およびウソ成長ホルモンの暗号配列中、
Ｐｈｅから最初のＨｐａ１１部位までの２０個のヌクレ
オチドに相当する。このフラグメントは以下の配列を有
する。

ｂａ１ ５’　　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧ−３
’　　　　　　ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣ−ＴＴ
ＣＣＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡ−ＡＡＧＧ
ＧＴＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＴ−ＴＣＡＡＧＧ
ＧＴＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧ−３′　旦照■ （、Ｃ５’ この６３ｈｐのフラグメントを合成するために、下記の
９セクメントを調製した。

１）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ／Ｉ）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣ６）ΔＴ　Ｇ　
Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＣＡ　’Ｉ’　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ａ　
Ａ　Ｔ　Ａ　ＧＣＣＴ’ ７）ＴＴΔＴ　ＣＡ　ｉ”　ＣＡ　１”　ＣＡ　Ｔ　Ｃ
ＣＡ８）Ａ　Ｔ（’；　Ｇ　ＣＴ　Ｇ　ＧＧΔΔＣ９）
ＣＧＧΔＣＡＡＧＧΔＣ 」二重の如く調製したセグメントを使用し、Ｔ１リガ−
セで触媒される結合反応を下δ己の様に段階的に行った
。

ａ）５’Ｊｌりん酸化セタ゛メントＩを５′　りん酸化
セグメント２に、５°−りん酸化セグメント６の（−Ｆ
、ζ［下、′Ｉ゛４リガーゼを用いて結合さＵてｒ）Ｎ
Ａ二重鎖構造１を形成させ、これを１５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動て精製した。

ｂ）　　５°−りん酸化セグメント３．４および５を、
５”　りん酸化セグメント７および８、並ひに５”−非
りん酸化セグメント９の存在下、Ｔ４リガ・−ゼを用い
で結合させてＤ　Ｎ　、／’に重鎖構造２を形成させ、
こイ１を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動て精製
する。

Ｃ）次いて、二重鎖構造ｌおよび２をＴ４リガーゼで結
合させてＤ　Ｎ　Ａ二重鎖構造（第７図における１１６
）を得、これを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
て精製した。次に、このＤＮＡ二重鎖構造を、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナ〜ゼと〔γ−Ｐ３２〕ＡＴＰとを使用
し、確立されている方法に従って酵素的にりん酸化した
。

４−記のＨｐａ１１部位からｐｖｕ１１部位に至る４６
ｂｐのＤＮＡフラグメントは、合成的に組立てるか１、
ｆらろい（Ｊ、九）ｌ（））供給ｌＩ＋ｉｉであるプラ
スミドｐＢＰ３４８から得ろことがてきる。そこで、１
００μｇのプラスミ＋：’ｐ１３Ｐ　３４８をＰｖｕＵ
緩衝液４００１ｉＱ中てＰｖｕｌ１５０単（ガにより、
３７℃において２時間消化した。）Ｓムール抽出および
エタノール沈殿の後、このＤＮＡをＰｓＬＩ緩衝液（５
０ｍＭＮａＣ鎖、６ｍＭ）リス・ＨＣＩ（＋）８７．４
）、６ｍＭＭｇＣ］２および６ｍＭβ−メルカプトエタ
ノール）４００μ夕中に溶かしＰｓｔＩ５０単位で３７
℃において２時間処理した。これらＤＮＡフラグメント
を６％ポリアクリルアミドゲルしに展開し、所望の４６
ｂｐ配列を含有する＋３５ｂｐのセグメントを回収し、
標準的な方法に従って精製した。回収した１）　Ｎ　Ａ
のＩ　／　３　（３３ｔｔ”ｉに相当）を、Ｈｐａｎｌ
衝液（２０ＴＩＭ）リス弓−１ｃＩ（ｌｌｌＨ７／Ｉ）
、７ｍＭＭｇＣｌ７．６ＴＩＭβ−メルカプトエタノー
ル）１００ｍ（中、Ｔ−（ｐａ　Ｈ制限酵素１単位にＪ
、す、３７℃で４０分間、限定的に消化した。６．５℃
で１０分間加熱した後、このＤＮＡフラグメントを適当
なサイズマーカーと一緒に５％アクリルアミドゲル（ア
クリルアミド、ビス化合物の比率−１９：Ｉ）ｔ−に展
開させた。この＋３５ｈｐフラグメント（第７図におけ
る＋１２から得たもの）のＨｐａｎ部分消化で得た所望
の４６１＋ｐフラグメントを、標準的な方法で精製した
。

プラスミドベクターのＸｂａｌ−Ｐｖｕｎ　’：’ラク
メント（第７図におけるＩ　１５）０．２μ９．６３ｂ
ｐの合成フラグメント（第７図におけるＩ　＋　６）３
．２ピコモルおよび４６ｂｐフラグメント（第７図にお
ける１１２から得たもの）０．５ピコモルを、ライゲー
ション用緩衝液１０μρ中でＴ　４　Ｄ　ＮΔリガーゼ
２単位と共に、４℃において１６６時間インキュベート
た。このライゲーンヨノミソクスを用いてＥ、ｃｏｌｉ
　　、Ｉ　Ａ　２２１を形質転換し、得られた形質転換
体（所望のプラスミドｐＮＭ７８９を含むらの）をアン
ピノリン耐性に基づいて選択した。

プラスミドｐＮＭ７８９（第７図における１１７）の同
定は、４９４ｂｐのＰｖｕＩＩフラグメントと１０９ｂ
ｐのＸｂａｌ−ＰｖｕＩＩフラグメントの両者の存在を
常法通リスクリーニングずろことによって行っノこ。

Ｅ　プラスミドｐＮＭ７８９．Ｂの最終的な組立てプラ
スミドｐＮＭ７８９（第８図における１１７）を完全に
ウシ成長ホルモンのものに変換するには、１個のアミノ
酸コドンを変える必要がある。このことは、ｐＮＭ７８
９のＰｖｕＩＩからＢａｍＨＩまての２８ｂｐフラグメ
ントを除去して配列５″　　　　　　　　　　　　　３
゜ ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧ ＧＡＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＧ ３゛５ を有する合成二重鎖フラグメント（第８図における＋１
８）に置換えることにより、行うことができる。

ｐＮＭ７８９１０μ９をＰｖｕｌ緩衝液２００μＣ中で
、ＰｖｕＩ１１単位により、３７℃で５分間消化した。

６５℃で１０分間加熱した後、この混合物にＢａｍ１−
ＩＴ緩衝液を加えて３００７１（ｉに希釈し、ＢａｍＨ
Ｉ　１０単位により、３７℃で１時間処理して完全に消
化し、アルカリ性ホスファターゼ５単位で処理した後、
６５℃で１時間インキュベートした。これらＤＮＡフラ
グメントを１％アガロースゲル」−で分離し、１箇所を
切断されたプラスミドｐＮＭ７８９の大きさのＤＮＡフ
ラグメント（第８図における１１９）を常法通り精製し
た。このフラグメント０２μ９と合成フラグメントとを
リガーゼ緩衝液２０μρ中でＴ４リガーゼ２単位により
ライゲートした。このライゲーションは４°Ｃで１夜行
なわれた。形質転換した後、数個のプラスミドを単離し
、適切なＰｖｕｎフラグメント（４９４ｂｐ）とＸ　ｂ
ａ　ｌ　−ＢａｍＨＩフラグメント（６２８ｂｐ）との
存在に関してスクリーニングした。上記のフラグメント
を含有するプラスミドは、所望のプラスミド、ｐＮＭ７
８９Ｂ（第８図における１２０）を構成していた。

害施例２　プラスミドｐＣＺＩ０１およびＥ、ｃ。

１ｉＫ　Ｉ　２ＲＶ　３０８．／ｐＣＺ　Ｉ　ＯＩの組
立てＡ　プラスミドｐ１Ｍ−１’−Ａ３の単離細菌Ｅ、
ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２／ｐ１Ｍ　−Ｉ’−Ａ３（ＮＲＲＬ
Ｂ１５７３３）をＴＹブロス（１％トリプトン、０．５
％酵母エキスおよび０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７，
４）中で、カナマイシン５０μ９の存在下、微生物学的
な常法に従い、２５℃において培養した。調製したばか
りのブロスによってこの培養物を１・ＩＯの割合で希釈
した後、３７℃で３時間インキュベートし、次いで、培
養物約０　、５　ａＱを１．５ｆｆＱのエソペンドルフ
チューブに移し、約１５秒間遠心した。特に明記しない
限り、全ての操作は室温で行ったものとする。得られた
上澄を先端の細いアスピレータ−て注意深く取除き、細
胞ペレットを調製したばかりのりゾヂーム溶液（２ｍｇ
／ｍｃＸ２ｍｌＩ／ｘρリゾデーム、５０ｍＭグルコー
ス、１０ｍＭＥＤＴＡ（ジアミン四酢酸）および２５ｍ
Ｍトリス・ＨＣ１（ｐＨ８））約１００μρに再懸局し
た。

約２００μＱのアルカリ性５ＤＳ（ドデンル硫酸ナトリ
ウム、）溶液（０，２ＮＮａＯＨ，１％５ＤＳ）を加え
、このチューブを静かに転倒させた後、０℃で完全に溶
解するまで保持した（〜５分間）。次いで、３Ｍ酢酸ナ
トリウム約１５０μｅを加え、数秒間転倒させることに
より、デユープの内容物を静かに混合した。

このチューブを少なくとも６０分間、０℃に保持した後
、１５分間遠心することにより、殆んど透明な上澄液を
得た。この」二澄液を第２の遠心管に移し、３倍容量の
冷１００％エタノールを加えた。このチューブをドライ
アイス−エタ５ノール」二に５分間載置した後、析出し
た沈殿を遠心して集め（５分間）、上澄液を吸引除去し
た。集めたべＬノットをＴＥ（ＩＯｍＭ）リス・ＨＣｌ
（ｐＩ］８０）および１ｍＭＥＩ）ＴＡ）１００μσに
溶かした。これは所望のプラスミドｐＩＭ−Ｆ−Ａ３Ｄ
ＮＡで構成されていた。

Ｂ　プラスミドｐＮＭ７８９ＢのＸ　ｂａ　ｌ　−Ｂａ
ｍＨＩ消化、および〜０．６ｋｂ　　ＸｂａＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントの生成 プラスミドｐＮＭ７８９ＢＤＮＡ約５μ２のＨｉ　　’
Ｓ　ａｌｔ緩衝液※５０μρ中溶液を、各々ＩＯ単位の
ＢａｍＨ制限酵素およびＸｂａｌ制限酵素と共に３７℃
で約１時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐＨ７，０）５μｇを加えた後、１００％エタノール３
倍容量を加えてＤＮＡを析出させた。

所望のＤＮＡ消化物をＴＥ緩衝液１００μρに溶かし、
以後の使用に備えて０℃で保存した。

※ＨｉＳａｌｔ緩衝液は次の各成分から常法通り調製し
た＋ｌ　Ｏ０ｍＭＮａＣ１，２０ｍＭトリス−ＨＣＩ（
ｐＴ（８、０’）、ｌ　０ｍＭＭｇＣＩ２および５ｍＭ
β−メルカプトエタノール。

ＣプラスミドｐｒＭ−ビーＡ３のＸｂａｌ　−ＢａｍＨ
１消化 所望の消化は、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂのかわりにプ
ラスミドｐ１Ｍ−１’−Ａ３を用いる外は実質上、実施
例２Ｂと同様にして行った。所望のＤＮＡをＴＥ緩衝液
１００μｇに溶かし、以後の使用に備えて０℃で保存し
た。

Ｄ　ライゲーション並びに形質転換 ゛　　プラスミドｐ１Ｍ−ビーム３消化物約ＩＢ９、プ
ラスミドｐＮＭ７８９ＢのＸ　ｔ＋ａ　ｌ　−１３ａｍ
ｌ−１１ｔｔ’ｉ化物１μ９、水ｉｏμｃ、Δｉ”　Ｐ
　５　μ＆（５ｍＭ）、ライケーンヨンミックス※５μ
ＱおＪ：びＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリカ−ゼ５単位を２０℃
で２時間インキコベートした。６５℃で２分間インギコ
ベー１・し、水冷した後、得られたライゲーノヨン混合
物を用いて実質−ｔ：Ｗｅｉｎｓｉｎｋ（＋　９７４、
Ｃｅ１１３　：３１５）の方法に従い、カナマイシン５
０７１ｇ／ｆｆρを含んた′ＦＹ平板（１％ｌ・リプト
ン、０５％酵母エキス、０５％塩化ナトリウムおよび１
５％寒天、ｐＨ７ｉ）上でＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０
８を形質転換した。細菌、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３（
１８菌株はＮｏｒｔｈｅｒｎ　　　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　
　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　　Ｌａｂ　０ｒａＬｏｒ）’
（Ｐｅｏｒｉａ、　　Ｉ　１ｌｉｎｏｉｓ）に寄託され
、その永久ストツタカルチャーコレクンコンの一部を構
成しており、受託番号ＮＲＲＬ、　　Ｂ−１５６２４の
下、誰でも利用することができる。

アカロースケル電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉｓ６．　　＋
　９８２）等、日常的な試験法により、得られた形質転
換体の内のあろらのは所望の〜Ｉ０．８ｋｂプラスミド
のみを含有していることが示された。その様な形質転換
体（Ｅ　、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　Ｒ■３０８／ｐＣＺｌ
ｏｌという）を選択し、適当な抗生物質を含有するＴＹ
寒天」二におき、微生物学的な常法に従って培養した。

得られた細胞を、実質上実施例２Ａと同様な、プラスミ
ドｐＣＺ１０１の単離に用いた。

※ライゲーノヨンミックスは次の各成分から調製した　
５００ｍＭトリス・ＭＣＩ（＋）Ｈ７，８）、２００ｍ
Ｍノチオトレイトールおよび１００ｍＭＭｇＣｌ９゜ 実施例鼾　プラスミドｐＣＺ１９２０およびＥｃｏｌｉ
Ｋ　Ｉ　２ＲＶ３０　ｓ／ｐｃｚ　ｌ　９２０の組立て
Ａ　プラスミドｐＣＺＩ０１の〜ｌ　Ｏ，２ｋｂＢａｍ
Ｈ１−Ｘｂａｌフラグメントの組立て プラスミドｐＮＭ７８９Ｂの代わりにプラスミドｐＣＺ
ＩＯＩを用いる外は、実質上実施例２Ｂと同様にして所
望のフラグメン）・を組立てた。所望の〜Ｉ　０．２ｋ
ｂＢａｍＨＩ　−Ｘｂａｌ制限フラグメントをアガロー
スゲル電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）によ
って常法通り分離して単離し、次いでＴＥ緩衝液約１０
０μａに溶かし、以後の使用に備えて０℃で保存した。

Ｂ、プラスミドｐＣＺ１０＋の〜０　、６　ｋｂＢａｍ
Ｈｒｉ（ｇｉＡＩフラグメントの組立て プラスミドｐＮＭ７８９ＢおよびＸｂａｌ制限酵素の代
わりにプラスミドｐＣＺ１０１およびＩ（ｇｉＡＩ制限
酵素をそれぞれ使用する外は、実質」二、実施例２Ｂと
同様にして所望のフラグメントを組立てた。所望の−０
、６ｋｂＢａｍＨｌ−１４ｇ１Ａ　Ｉ制限フラグメント
をアガロースケル電気泳動（Ｍａｎｉ−ａｔｉｓら、１
９８２）によって常法通り分離して単離し、ＴＥ緩衝液
約１００μＱに溶かして以後の使用のために０℃で保存
した。

Ｃ，ＤＮＡリンカ−配列の組立て ５’　　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡ　　ＡＴＧ
ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ　　　、１１１３°　　　　
　ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴ　　ＴＡＣＡＡＡ　　ＧＧ
Ｇ　　ＡＡＴ　　ＴＣＴ　　ＡＴＧＴＴＴ　　　ＣＣＣ
ＴＴＡ　　　ＡＧＡ　　ＴＡＧＣＧＧ　　ＡＡＧ　　　
ＧＧＴ　　ＣＧＧ　　　ＴＡＣＡＧＧ　　ＡＡＣＡＧＧ
　　　ＣＯＧ　　ＧＡＣＴＴＴ　　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ
　　ＧＴＧＣＴ３’Ｉｌｌ　　　　１１１．１１１　　
　　Ｉｌｌ　　　　ＩＡＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　
　ＣＧＡ　　　Ｃ５’所望のリンカ−配列を、実質上、
Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）およびＣｒｅａら（１
９７８）らの教示した方法に従い、改良ホスホトリエス
テル法によって常法通り合成した。上記の合成法は実施
例１に詳しく示されている。

Ｄ　ライゲーションおよび形質転換 実施例３ＣのＤＮＡリンカ−約２０ピコモル、プラスミ
ドｐＣＺ１０１の〜１０．２ｋｂＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ
ｌフラグメント！μ２およびプラスミドｐＣＺ１０１の
−０，６ｋｂＢａｍＨＩ−ＨｇｉＡＩフラグメント０．
５μ２をライゲートし、得られたプラスミドを用いて実
質上、実施例２Ｄと同様にしてＥ、ｃｏ１ｉＫ１２ＲＶ
３０Ｂを形質転換した。

得られた形質転換体の内あるものは、アガロースゲル電
気泳動（ＭａｎｉａＬｉｓら、１９８２）等の通常の試
験により、所望の〜１０．８ｋｂプラスミドのみを含有
していることが示された。その様な形質転換体（Ｅ、ｃ
ｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺＩ９２０という）を選
択し、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にのせ、微
生物学的な常法を用いて培養した。得られた細胞は、Ｓ
ＤＳゲル電気泳動、ＲＩＡおよび他の試験によって、先
に定義したＭＥＴ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＳＰＮ−５ＥＲ
−ＭＥＴ−ＡＬＡ−ｂＧＨ誘導体本高レヘしベル現する
ことがわかった。プラスミドｐＣ７，１９２０は熱的に
誘導可能なランナウェイレプリコンを含有しているので
、所望のｂＧＨ誘導体生成物の発現は、培養温度約３７
°Ｃで最大となる。

実施例４　プラスミドｐ、ＬＲＩおよびＥ、ｃｏｌｉＫ
１２ＲＶ３０８／Ｉ）ＪＲｌの組立て 実施例３Ｃのリンカ−配列の代わりに、配列：５°　Ｃ
ＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡ　　ＡＴＧＩｌｌ　　
　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１
１ＡＡＡ’ＧＧＴ　　　ＣＧＧ　　　ＴＡＣＣＧＡＧＡ
Ｔ　　ＡＧＡ　　　ＣＣＡ　　　ＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡ
ＡＣＧＣＴ　　ＧＴＧＣＴ　　３゜Ｉｌｌ　　　　Ｉｌ
ｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ＩＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧ
Ａ　　Ｃ５゜で示されるＤＮリンカ−配列を用いる外は
、実質上、実施例３表同様にして所望の組立てを行った
。

上で特定したリンカ−配列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１
９７７）およびＣｒｅａら（＋９７８）の常法に実質上
従って組立てることができる。上記の合成法は実施例１
に示されている。

所望の形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２ＲＶ３０８
／ｐＪＲ＋という）を適当な抗生物質を含んだＴＹ寒天
上にのせ、以後のプラスミドｐＪ　ＲＩの生産および単
離のために常法通り培養した。この形質転換体もまた、
ＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験により、上に
定義したＭＥＴ−ＰＨＥ−ＰＲＯ−Ａ１、Ａ−ＭＥＴ−
ＡＬＡ−Ｒ２牛成長ホルモン誘導体を高レベルで発現す
ることが示された。

プラスミドｐＪ　ｒ（１は熱的に誘導可能なランナウェ
イレプリコンを含有しているので、所望のｂＧＨ誘導体
生成物の発現は、培養温度約３７℃で最大となる。

実施例５　プラスミドｐＨｌ７△４へ１の組立て プラスミドｐ■］Ｉ７△４△１の組立て模式図の一部は
添（−１の第１５図に示されている、。

Ａ、プラスミドｐ１３　ＲＨｔｒｐの組ｑてプラスミド
ｐＧＭＩは△ＬＥＩ４１３欠損を含むＥ、ｃｏｌｉｌ−
リプトファンオペロン（ミオザリ（Ｍｉｏｚｚａｒｉ）
ら、１９７８、Ｊ。ハイテリオロジ−（ＪＢａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）、Ｉ／１５７〜Ｉ／１６６）を担持して
おり、従って、Ｌｒ＋）リーダー配列の最初の６個のア
ミノ酸およびｔｒｐＥボリペプヂドの終わりの３分の１
を含んでいろ融合蛋白質（以後これらを合わせてＬＥ’
という）、並びにｔｒｐＤポリペプチドの全配列を、い
ずれもｔｒｐプロモーター７７オペレーター系のコント
ロール下で発現させる。Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　Ｗ３
１１０　ｔｎａ２　ｔｒｐ△Ｉ０２／ｐＧＭｌは、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ７こ寄託され（ＡＴＣＣＮｏ、３１６
２２）でおり、ｐＧＭＩはこの菌株から下記の如く、常
法に従って分離することができる。

約２０７ｇ／のこのプラスミドを、このプラスミドを５
箇所で切断する制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。

次いでこの遺伝子フラグメントを、後にＥｃｏＲＩ開裂
部位を含有するプラスミドヘクローンするために、Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−（配列：ｐｃＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴにて
示される自己相補性（ｓｅｌｆ　　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｒｙ）オリゴヌクレオヂド）と結合させてＥｃｏＲ
Ｉ開裂部位を作成した。ＩＩＩＧＭＩから得たＤＮＡフ
ラグメント２０μ了を、５′−リン酸化合成オリゴヌク
レオヂドｐＣＡＴＧＡＡＴＴＣ’ＡＴＧ（２００ピコモ
ル）の存在下、２０μｅのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（
２０ｍＭトリス、ｐＨ７，６，０、５ｍＭＡＴＰ、Ｉ　
０ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭジチオトレイトール）中、４
℃で一夜、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１０単位）で処理した
。次いで、溶液を７０℃で１０分間加熱してライゲーシ
ョンを停止させた。このリンカ−をＥｃｏＲＩ消化によ
って開裂し、そのＥｃｏＲＩ末端を有オろフラグメント
を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以後［ＰΔ
ＧＥＪと呼称）で分離した。まず最初にエチノウムブロ
マイドにより染色し、次いで紫外光によってフラグメン
トの位置を定め、所望の部分をゲルから切り取ることに
より、３つの最も大きいフラグメントをゲルから分離し
た。各ゲルフラグメントを３００μＱの、０．Ｉ　ＸＴ
ＢＥと共に透析袋に入れ、０１ＸＴＢＥ緩衝液中（ＴＢ
Ｅ緩衝緩衝液水中７中リス塩基Ｉ　Ｏ，Ｓｇ、ホウ酸５
．５Ｌ！およびＮ　ａｚＥ　Ｄ　ＴＡｏ、０９ｉ＋を含
有）１時間、１００■にお（Ｊろ電気泳動に付した。透
析袋中の水溶液を集め、フェノール抽出並びにクロロホ
ルム抽出を行い、塩化ナトリウム濃度を、０．２Ｍに調
節した。次いて、エタノール沈殿の後、ＤＮＡを水中に
回収した。

このＥｃｏＲ１粘着末端を持ったｔｒｐプロモーター／
オペレーター−含有フラグメントをテトラサイクリン感
受性プラスミドに該プロモーター／オペレーターを挿入
し、テトラサイクリン感受性プラスミドをテトラサイク
リン耐性プラスミドにすることにより、同定した。以後
に述べるＤＮＡフラクメントの単離は全て」−記の如く
、ＰＡＧＥを行い、次いで電気溶離する方法て行った。

１Ｂ、ｔｒｐプロモーター／オペレーターのコントロー
ル下でテトラサイクリン耐性を発現するプラスミドｐ１
３ＲＨ１ｒｐの組立て、並びに」二重ｒＡＪで単離した
ｔｒｐプロモーター／オペレーター含ｆＤＮＡフラクメ
ントの同定および増幅 プラスミドｐＢＲＨＩ（ｃ＋トリゲッツクＲｏｄｒｉｇ
ｕｅＺ）ら、１９７９、ヌクレイツク・アンット・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）６．３２６’ｌ−３２８７、ＡＴＣＣＮｏ、３７
０７０）はアンピノリン耐性を発現すると共に、テトラ
サイクリン耐性遺伝子を含有しているが、これはプロモ
ーターを伴っていないので、その耐性を発現するこ七は
ない。従って、このプラスミドはテトラサイクリン感受
性である。そのＥ　ｃｏ　Ｒ１部位にブロモーター／オ
ペレーター系を導入してこのプラスミドをテトラサイク
リン耐性にすることができる。

プラスミドｐＢＲＨ１をＥｃｏＲＩて消化した。

フェノール抽出、次いてクロロホルム抽出することによ
り酵素を除去し、エタノール沈殿の後、ＤＮＡを水中に
回収した。得られたＤＮＡ分子を、実施例５Ａで得た３
種のＤＮＡフラグメントの各々と、別々の反応混合物中
で混合し、前述の如くにしてＴ４ＤＮＡリガーゼでライ
ゲートした。この反応混合物中のＤＮＡを用いて標阜的
手法（ハーソフィールド（１−Ｉ　ｅｒｓｈｆ　１ｅｌ
ｄ）ら、１９７４、プロナス（Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＡｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７！：３４５５−３４５９）
に従い、コンピテントＥｃｏｌｉＫ　ｌ　２菌株２９４
（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５６２５）を形質転換し、次いで
この細菌を、アンピノリン２０μｇ／ｍＩ２およびテト
ラサイクリン５μｇ／ｐＱを含んだＬＢ平板上においた
（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。

数個のテトラサイクリン耐性コロニーを選択し、そのプ
ラスミドＤＮＡを分離してｐＢ　ＲＨｔｒｐと命名した
。所望のフラグメントの存在を制限酵素分析で確認した
。プラスミドｐＢ　ＲＨｔｒｐはβ−ラクタマーゼを発
現し、アンピンリン耐性を与え、さ−らにｔｒｐプロモ
ーター／オペレーターを含むＤＮＡフラグメントを含有
している。このＤＮＡフラグメントはまた、ｔｒｐリー
ダー配列の最初の６個のアミノ酸とｔｒｐＥポリベプヂ
ドの後方のおよそ３分の１の融合物である第１番目のタ
ンパク質（ＬＥ゛と呼称）、ｔｒｐＤポリペプチドのお
よそ前半分に対応する第２番目のタンパク質（Ｄ’と呼
称）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子によって暗号
化された第３番目のタンパク質、をも暗号化している。

ＣプラスミドｐＳＯＭ７△２の組立て プラスミドｐＢ　ＲＨｔｒｐをＥｃｏＲＩ制限酵素で消
化し、得られたフラグメントをＰＡＧＥおよび電気溶離
法で単離し、ＥＣ０ＲＴ消化プラスミドｐｓＯＭ　Ｉ　
ｌ　（Ｉ　ｔａｋｕｒａら、１９７７、Ｓｃｉ、、１９
８：ｌ０５６、アメリカ特許番号第４３６６２４６号、
イギリス特許出願公告番号第２．００７，６７６Ａ号）
と混合した。この混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲ
ートしそのＤＮＡで前述の如くにしてＥ、ｃｏｌｉＫ　
Ｉ　２菌株２９４を形質転換した。

形質転換した細菌をアンピンリンを含有する平板」二て
選択し、得られたアンピシリン耐性コロニーを、コロニ
ーハイブリダイゼーンヨン（グルエンスティン（Ｇ　ｒ
ｕｅｎｓｔｅｉｎ）ら、１９７５、プロナス（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳΔ７２：３
（＋５１−．３９６５）によってスクリーニングした。

Ｉ）ＢＲｏｔｒｐから単離し、３２ｐで放射活性なよう
標識したｔｒｐプロモーター／′オペレーター含有フラ
グメントを上記の実験でプローブとして用いた。コロニ
ーハイブリダイゼーンロンで陽性を示した数個のコロニ
ーを選択した。プラスミドＤ〜へを単離し、Ｂｇｌｌｌ
およびＢａｍＨＩ酵素を用いて二重消化して行う制限酵
素分析により、挿入フラグメントの方向性を決定した。

適切な方向性のｔｒｐプロモーター／オペレーターフラ
グメントを持った所望のプラスミドを含むコロニーをＩ
　Ｏｔｔ　Ｌ／　ｙＱのアンピノリンを含んだＬＢ培地
で増殖させた。所望のプラスミドをｐｓＯＭ７△２と命
名し、以下に述べる組立てに用いた。

Ｄ、プラスミドｐＴｒｐ２４の組立て １）ＬＥ’ポリペプチドの遠位領域を暗号化している遺
伝子フラグメントてあって、その暗号鎖の５°並びに３
′末端にそれぞれＢｇｌＩＩおよびＥｃ。

Ｒ１制限部位を有するフラグメントの組立てプラスミド
ｐｓＯＭ７△２をＨ４ｎｄＩＩＩ消化した後、ＬＥ’暗
号領域内のＢｇｌＩＩ制限部位を越えて消化か行なわれ
る様な条件を選んでラムダエキソヌクレアーゼ（５゛か
ら３゛へのエキソヌクレアーゼ）で消化した。約２０１
１ｇのＨｉｎｄｌｌｌ消化ｐＳＯＭ７△２を緩衝液（２
０ｍＭグリンン緩衝液、ｐＨ９、６、Ｉ　ｍＭＭｇｃ１
２、ＩｍＭβ−メルカプトエタノール）に溶かした。得
られた混合物をラムダエキソヌクレアーゼ５単位により
、室温で６０分間処理した。

得られた反応混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽
出した後、エタノール沈殿を行った。

ＬＥ’遺伝子フラグメントの遠位末端にＥｃｏＲ１残分
（ｒｅｓｉｄｕｅ）を形成するために、改良ホスホトリ
エステル法（Ｃｒｅａら、＋９７８）に従ってプライマ
ー、３２ｐＣＣＴＧＴＧＣＡＴＧ、ＡＴを合成し、ラム
ダエキソヌクレアーゼ消化によって生成したＬＥ’遺伝
子フラクメントの１本鎖末端にハイブリダイズさ且た。

このハイブリダイゼーションは、エキソヌクレアーゼ処
理したプラスミドｐＳＯＭ７△２のｌ１ｉｎｄｌｌ消化
物２０ｔｔｇを水２　（１７ｚρに溶解し、上記の５°
−りん酸化オリゴヌクレオチド約８０ピコモルを含有す
る６μＱの溶液と混合することにより行った。合成フラ
グメントは１７Ｅ°暗号配列の３゛末端に結合し、残る
ＬｌΣ゛フラグメントの１本鎖を、ｄＡＴＰ、ｄＴ’ｌ
”Ｐ、ｄＧ’ＦＰおよびｄＣＴＰを用いてクレノーポリ
メラーゼＩで充填した。クレノーポリメラーゼＩはＤＮ
ＡポリメラーゼＩのタンパク分解的開裂で得られるフラ
グメントである。これは５°→３’（５’から３への）
ポリメラーゼ作用および３°→５′工キソヌクレアーゼ
作用を有するか、親酵素の有する５゜→３°エキソヌク
レアーゼ作用は持たない（ＫｏｒｎｂｅｒｇＳ　１９７
４、Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　　ａｎｄ　　ｃｏ　　
、５ＦＯ１９８）。

すなわち、反応混合物を５０℃に加熱し、徐々に１０℃
まで冷却し、その後４μｇのクレノー酵素を加えた。室
温で１５分間インキュベーションした後、３７℃で３０
分間インキユベーノヨンし、０．２５ＭＥＤＴＡ５μＱ
を加えて反応を停止させた。反応混合物をフＪノール抽
出、クロロポルム抽出した後、エタ７ノール沈殿に付し
た。次いでＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＴＩで開裂させ、フ
ラグメントをＰＡＧＥで分離した。ゲルをオートラジオ
グラムにかけたところ、約４７０ｂｐという予測された
長さの３２ｐラベル−フラグメントが存在することがわ
かった。これを電気溶出（溶離）法で回収した。

概説した様に、このフラグメントＬＥ’（ｄ）はＢｇｌ
■末端と、プライマーの開始点に符号する平滑末端とを
有している。

２）プラスミドｐＴｈα１の組立て プラスミドｐＴｈα１は、デモシン（サイモシン）アル
ファｌのための合成遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２に
挿入することにより、組立てた。デモノンアルファｌ暗
号ＤＮＡは、添付の第１１図において両頭矢印（・−一
）で指示した１６個のオリゴヌクレオチド（Ｔ　Ｉ−Ｔ
　Ｉ６）の合成、およびそれらのライゲーションにより
合成した。Ｎ末端にｍｅｔ　（メチオニン）ＡＴＧを挿
入し、５゛末端を、ＢｃｏＲｌとＢａｍＨＩで開裂した
プラスミドに結合し易くするために、−１本鎖粘着末端
を持つ様に調整した。

容易に理解されるであろうが、組換えプラスミドの分析
（同定）には、遺伝子の中心にあるＢｇｌｌＪ部位が役
立つ。

オリゴデオキシリポヌクレオチド′Ｉ′１〜Ｔｌｏは、
完全に保護されたトリデオキンリポヌクレオヂド組立て
ブロックを用いて、改良ホスホトリエステル法（ｒ　ｔ
ａｋｕｒａら、ｌ９７７およびＣｒｅａら、ｌ９７８）
に従って合成された。種々のオリゴデオキシリポヌクレ
オチドを表１に示す。

上記の化合物の合成は、添付の第１２図に総括した、下
記のフラグメントＴ＋５に関する合成方法で代表される
。Ｔ’＋ｓの合成に用いた種々のヌクレオチドフラグメ
ントを、図面に数字で表した。また、採用した略号は次
の通りである：Ｔ　Ｐ　Ｓ　Ｔｅ＝２．４．６−トリイ
ソプロビルベンゼンスルホニルテトラゾール、ＢＳＡ−
ベンゼンスルホン酸：ＴＩ′。

Ｃ−薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ−高速液体クロ
マトグラフィー；’ＤＭＴ＝４，４°−ジメトキシトリ
チル、ＣＥ＝２−ンアノエチル；Ｒ＝Ｉ）−クロロフェ
ニル；ＢＺ−ベンゾイル、Ａｎ−アニソイル：１Ｂｕ−
イソブヂリル；Ｐｙ−ピリンン；Ａｃ０Ｈ＝酢酸；Ｅｔ
３Ｎ−トリエチルアミン。

完全に保護されたトリデオギンリポヌクレオチド（４’
８８５ｍｇ、０．０５ｍＭ）および（２）（１８０Ｈ１
０、１ｍＭ）を、７：３（■／ｖ）のりｃｏｏポルム／
メタノール中で２％Ｂ　Ｓ　Ａ’（それぞれ１０および
２０酎）により、０℃で１０分間処理し、５゛の水酸基
を脱保護した。重炭酸アンモニウム飽和水溶液（２ｄ）
を加えて反応を止め、クロロホルム（２５ｄ）で抽出し
た後、水洗した（２ｘｌＯ扉Ｑ）。有機層を硫酸マグネ
シウムで乾燥し、少量（約５ＲＱ）になるまで濃縮した
後、石油エーテル（３５゛〜６０℃留分）を加えて沈殿
させた。無色の沈殿を遠心分離して集め、真空デシケー
タ内で乾燥すると、いずれもシリカゲルＴ　Ｌ　Ｃ（Ｍ
ｅｒｃｋ６０　Ｆ　２５４、クロロポルム／メタノール
、９：１）でホモジーニアス（均一）な（６）および（
８）を得た。

トリマー（三量体）（１）および（３Ｘ２７０ｔｉｇ、
０．１５ｍＭ＋１４５６．０．０７５ｍＭ）をトリエチ
ルアミン／ピリジン／水（１：３：１、ｖ／ｖ、　　１
０ｒｌＱ）により室温で２５分間処理することにより、
ホスホジエステル、（５）および（７）に変換した。ロ
ータリーエバポレーターを用いて反応剤を留去し、残留
物を無水ピリジンと共に繰返し蒸留することにより（３
Ｘ　Ｉ　ＯｍＱ）乾燥した。トリ？−（８００゜０５ｍ
Ｍ）とトリマー（７）とを無水ピリジン（３吋）中でＴ
ＰＳＴｅ（５’Ｏｚ９．０．１５ｍＭ）と混合し、この
反応混合物を、減圧下に、室温で２時間放置した。Ｔ　
Ｌ　Ｃ分析の結果、トリマー（８）の９５％がヘキサマ
ー生成物に変換していることがわかった（１０％硫酸水
溶液を噴霧し、６０℃に加熱することにより、ＤＭＴ基
を検出して観察した）。

この反応物に水（１πのを加えてクエンチングし、溶媒
を減圧蒸留した。トルエンと共に共沸蒸留してピリジン
を除いた後、トリマー（４）および（２）に関して記述
した如く、２％ＢＳＡ（８ｔ（２）でごのヘキサマーの
５゛位を脱保護した。この生成物（１０）をシリカゲル
カラム（Ｍｅｒｃｋ　　６０　Ｈ２Ｓ、５ｘ　５　Ｃ１
１）にかけ、クロロホルム／メタノール（９８：２〜９
５　：５　、ｖ／ｖ）による段階的傾斜溶出により精製
した。生成物（１０）を含む両分を蒸発乾固した。同様
に、トリマー（５）を（６）につなぎ、完全に保護され
た生成物を直接、シリカゲルで精製した。この生成物の
３゛末端を、トリエチルアミン／ピリジン／水を用いて
前述の如く脱保護してフラグメント（９）を得た。

最後に、ヘキサマ−（９）と（Ｉ　Ｏ）とを、無水ピリ
ジン（２ｘＱ）中、ＴＰＳＴｅ（７５ｍ？、０２２５ｍ
Ｍ）を縮合剤として用いて結合させた。反応完了後（周
囲温度で４時間）、混合物をロータリーエバポし・−タ
ーで蒸留し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーに
かけた。石油エーテルを加えると′生成物（ＩＩＸ１６
０肩ｇ）が析出した。こうして得たものはＴＬＣでホモ
ジーニアスであった。化合物（１１）の一部（２０１１
Ｉｇ）をピリジン（０，５３１１２）に入れ、濃水酸化
アンモニウム処理（７１，８時間、６０℃）および８０
％酢酸処理（１５分間、周囲温度）をこの順序で行うこ
とにより、完全に脱保護した。酢酸を留去した後、固型
残留物を４％水酸化アンモニウム水溶液（ｖ／ｖ、４ｉ
（りに溶かし、エヂルエーテル（３Ｘ２ｉ（２）で抽出
した。水層を１〜２ｍ（ｌに濃縮し、その一部をＨＰＬ
Ｃにかけて（１２）を精製した。主ピークに相当する画
分をプールしく約２Ａ２５４単位）、約５　ｒｒｒ、Ｑ
に濃縮した。この最終生成物（１２）を、Ｂｉｏ−ｇｅ
ｌ　　Ｐ−２（１，５ｘ１００ｃｍ）にかけ、２０％エ
タノール水溶液で溶離して脱塩処理し、減圧上乾固した
後、水（２０゜μＱ）に再懸濁してＡ２５４＝１０の溶
液とした。化合物（Ｉ２）の配列を２次元配列決定法で
確認した。

ソマトスタチン（Ｉ　ｔａｋｕｒａら、＋９７７）、イ
ンシュリン（Ｇｏｅｄｄｅｌら、＋９７９）および成長
ホルモン（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９、Ｎａｔｕｒｅ
２８１　：　５４４）に関して既に詳細に述べられてい
る方法に従って、１６個の合成オリゴヌクし・オチドか
ら、完全なデモノンα１遺伝子を組立てた。ｌ０７１ｇ
づつのオリゴヌクレオチドＴ、〜Ｔ１５を、Ｔ４ボリヌ
クレオチドギナ−ゼ（Ｇｏｅｒｌｄｅｌら、＋９７９）
のＰ３２ ＴＹ存在下（７：ｌ−ＡＴＰ（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄＮｕｃｌｅａｒ）で定量的にリン酸化し、比活性約ｌ
Ｃ１／ｍｍｏｌのものを得た。この放射性同位元素でラ
ベルしたフラグメントを２０％ポリアクリルアミド／７
Ｍ尿素ゲル電気泳動法で精製し、溶出したフラグメント
の配列を、２次元電気泳動法／部分的ヘビ毒消化物のホ
モクロマトグラフィー法（Ｊａｙら、１９７４、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　ｌ　：３３１
）に従って確認した。フラグメントＴ１及びＴ、６は、
以後のライゲーション反応に伴う望ましくない重合反応
を最小限度にとどめるため、りん酸化せずにおいた。こ
れらのオリゴヌクし・オチド（各２μ９を、公知の手法
（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）に従い、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼによって、４フラグメントからなる４つのグルー
プに組立てた（第１３図参照）。こうして得た生成物を
７Ｍの尿素を含んだ１５％ポリアクリルアミドゲルによ
るゲル電気泳動法で精製した（マクサム（Ｍａｘａｍ）
およびギルバート（Ｇ　Ｎｂｅｒｔ）、１９７７、プロ
ナス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７１：３４５
５）。単離した４種の生成物をライゲートし、反応混合
物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析し
た。チモシンアルファ＋ｎ伝子の大きさく９０〜１０５
塩基対）のＤＮＡを電気溶離して得た。

プラスミド１）ＢＲ３２２（０，５μ９）をＢａｍＨＩ
およびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで処理し、生
成したフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動
法で分離した。大きいフラグメントを電気溶離したゲル
から回収し、組立てた合成りＮＡとライケートした（ゲ
ラデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、１９７９、ネイチ＋−（
Ｎａｔｕｒｅ）２８１　：５４４　１９７９）。この混
合物をＥ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２菌株２９４（ＡＴＣＣＮ
ｏ、３１４４６）の形質転換に用いた。この形質転換混
合物の５％を２０μ汁へρのアンピッリンを含んだＬＢ
平板上においた。得られた４つのアンピシリン耐性コロ
ニーはテトラサイクリン感受性であり、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子への挿入を示唆した。これらのコロニーか
ら得られたプラスミドを分析した結果、どの場合にも、
このプラスミド（１）Ｔｈαｌと命名）は、（ａ）ｐＢ
　Ｒ３２２自身には含まれていないＢｇ１１１部位を含
んでおり（第１１図に示すデモシンアルファ１遺伝子の
存在を示唆している）、（ｂ）Ｂ　ａｍＨＩ　／　Ｅｃ
ｏＲＩ開裂で生じた約１０５個の塩基対から成るフラグ
メントを含んでいた。プラスミドｐＴｈα１の組立て図
（縮尺通りでない）を添付の第１３図に示す。図中、黒
点（）は５°−ホスフェート括を表している。

３）処理ｐＴｈα１とｒ、Ｅ’（ｄ）フラグメントの反
応 プラスミドｐＴｈα１は、アンピシリン耐性を特定する
遺伝子と、その５°暗号鎖末端がＥｃｏＲ１部位に、ま
たその３”末端がＢａｍＨＴ部位にクローンされた、ヂ
モンンα１を特定する構造遺伝子を含有している。この
デモノン遺伝子はＢｇｌＩＩ部位をも有している。先に
調製したＬＥ’（ｄ）フラグメントを受は入れることが
できるプラスミドを調製するために、このｐＴｈαｌを
ＥｃｏＲＩ消化し、次いで、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰを
加えてクレノーポリメラーゼ■反応に付し、ＥｃｏＲＩ
残分を平滑化した。得られた生成物をＢｇｌＩＩ消化す
ると、アンピンリン耐性に関する遺伝子と、その両方の
末端に、ＢｇｌＩＩ粘着残分と平滑末端とを有する直線
状ＤＮＡフラグメントが得られた。得られた生成物をＴ
４リガーゼの存在下、ＢｇｌｌＩ粘着末端と平滑末端と
を有するＬＥ’（ｄ）フラグメントと反応させることに
より再環化し、プラスミドｐＴｒｐ２４を得た。この様
にして、平滑末端結合が行なわれた箇所にＥｃｏＲＴ部
位が再生成される。

Ｅ　プラスミドｐＳＯＭ７△２へ４の組立てｐＴｒｐ２
４をＢｇｌＩＩとＥＣ０ＲＩで順次消化し、次いでＰＡ
ＧＥにかけ、電気溶離することにより、ｒ、Ｅ’（ｄ）
ポリペプチドのコドンであって、その暗号鎖の３゛末端
に隣接するＥｃｏＲＩ粘着末端と、Ｂｇｌｒｌ粘着末端
を有するコドンを持ったフラグメントを得た。このＬＥ
’（ｄ）フラグメントをプラスミドｐｓＯＭ７△２のＢ
ｇｌ１１部位にクローンして、トリプトファンプロモー
ター／オペレーターのコントロール下に発現されるＬＥ
’ポリペプヂド／ソマトスタヂン融合タンパク質を形成
させることができる。そのためには、（１）トリプトフ
ァンプロモーター／オペレーターから遠位のＥＣｏＲｌ
部位を開裂するためにｐｓＯＭ７△７の部分的Ｅｃ。

Ｒ１消化を行う、（２）コドンの解読フし・−ムを適切
に保持すると共にＥｃｏＲ’ｌ開裂部位を再生成する様
なプライマー配列の適切な選択が必要である。

すなわち、プラスミドｐｓＯＭ７△２（１６μｇ）を、
２０ｍＭ）リス（ｐＨ７、５）、５ｍＭＭｇＣｌ７．０
．０２％ＮＰ４０洗浄剤およびＩ　００ｍＭＮａＣｌを
含む緩衝液２００μｑで希釈し、０．５単位のＥｃｏＲ
Ｉで処理した。３７℃で１５分経過した後、反応混合物
をフェノール抽出、クロロポルム抽出およびエタノール
沈殿に付し、次いてＢｇｌｌＴで消化した。得られたフ
ラグメントの大きい方をＰＡＧＥ法および電気溶離法で
単離した。このフラグメントはＬＥ’ポリペブヂドの近
位の末端（ｐｒｏｘｉｍａｌ　　ｅｎｄ）部分、即ち、
Ｂｇ１１１部位の上流部分に関するコドンｒＬｐ’（ｐ
）Ｊを含んでいる。次いでこのフラグメントを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下、上記ＬＥ”（ｄ）にライゲート
し、プラスミドｐＳＯＭ７△２△４を形成させ、これを
Ｅ、ｃｏｌｉ菌株２９４に導入すると、トリプトファン
プロモーター／オペレーターのコントロール下に、完全
に再構成されたＬＥボリペブヂドとソマトスタチンから
成る融合タンパク質が効率良く生産された。

Ｆ　テトラサイクリン耐性を特定する遺伝子を囲んで３
゛末端にＰｓｔｌ残基を、またその５°末端にＢｇｌＩ
Ｉ残基を有する線状ＤＮＡの組立てプラスミドｐＢＲ３
２２をＨ４ｎｄｌＩＩ消化し、突出したＨｉｎｄｌＴｌ
末端をＳｌヌクレアーゼで消化した。

このＳ１ヌクし・アーゼ消化は、ＩＯμｌｊのＨｉｎｄ
ｌｎ開裂ｐＢＲ３２２をＳ１緩衝液（０，３ＭＮａＣ１
，１ｍＭＺｎＣ１７，２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４
，５）３０μｇ中、３００単位のＳ１ヌクし・アーゼて
、１５℃において３０分間処理することにより行−１た
。３０ｘＳＩヌクレアーゼ停止溶液（０，８Ｍ＋−リス
塩基、５０ｍＭＥＤＴＡ月μρを加えることにより反応
を終了させた。この混合物をフェノール抽出、クロロホ
ルム抽出、およびエタノ−＝ル沈殿に付し、次いで既述
した様にしてＩ　ｃｏＲＩ消化した。ＰＡＧＥ法、次い
で電気溶離法を適用して得られたフラグメントは、ＥＣ
０ＲＩ粘着末端と平滑末端を有し、その暗号鎖がヌクレ
オチド、デミジンから開始されるものであった。この、
デミノンから始まるＳ１消化１−１ｉｎ旧■残分をタレ
ノーポリメラーゼｌ処理Ｂｇｌｎ残分と混合し、ライゲ
ーションすることによってＢｇｌｌｌ制限部位を再構成
することができる。

そこで、実施例５Ｃで得たプラスミドｐＳ　ＯＭ７△２
をＢｇｌｌｌ消化し、得られたＢｇｌｌＴ粘着末端を、
４種のデオキンヌクレオチトトリホスフエート全てを使
用し、クレノーポリメラーゼｌで処理することにより二
重鎖とした。この生成物をＥｃ。

Ｒ１て開裂し、Ｐ　、Ａ　Ｇ　Ｅにかけ、小さいフラグ
メントを電気溶離すると、トリプトファンプロモーター
７７オペし・　ターと、Ｂｇｌ１１部位からに流の、Ｌ
Ｅ’ｒ近位１配列に関するコドン（ｒ　鎖、　Ｅ　’　
（ｐ）Ｊ）を持った直線状ＤＮＡ片が得られた。この生
成物はＥｃｏＲＩ末端と、ＢｇｌｌＩ部位の充填により
生成した平滑末端とを何する。しかしながら、このＢｇ
１■部位は、該平滑末端を」二足Ｓ１消化１−１ｉｎｄ
ＴＩｌフラグメントの平滑末端にライゲートすることに
より再構成される。すなわち、これら２種のフラグメン
トをＴ　４．　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼのγｒ存在下ライゲ
ートシて再環化したプラスミドｐＨＫＹＩｏを形成さＨ
ｏ、コンビチットＥ、ｃｏｌｉ菌株２９４細胞に導入し
、形質転換することにより、増幅させた。組換えプラス
ミドｐＨＫＹｌＯを担持しているテトラサイクリン耐性
細胞を選択し、そのプラスミドＤＮＡを抽出した。Ｂｇ
ｌｌｌおよびＰｓｔｌ消化、次いでＰＡＧＥ法および電
気溶離法により大きいフラグメントを単離し、Ｐｓｔｌ
およびＢｇｌＩＩ両帖着末端を有ずろ所望の直線状ＤＮ
Ａ片を得た。こうしてｐＨＫＹＩＯから調製されたＤＮ
Ａフラグメントは複製起源を有しており、従って、ｔｒ
ｐＬＩつ’ポリペプチド融合タンパク質の暗号遺伝子お
よびテトラサイクリン耐性に関４−る暗号遺伝子の両方
がｔｒｐプロモーター／オペレーターてコントロールさ
れる、プラスミドｐ＋−１１７△４△ｌの組立て要素の
１つとして有用である。

Ｇ、ｔｒｐプロモーター／オペレーターを有する直線状
ＤＮＡの組立て 実施例５Ｅで得たプラスミドｐｓＯＭ７△２△４をＥｃ
ｏＲ１部分消化、次いてｐｓＬｌ消化に付した。得られ
たフラグメントはｔｒｐプロモーター／オペレーターを
含有しており、これをＰＡＧＥ法にかけ、電気溶離する
ことにより単離した。ソマトスタヂン遺伝子の５゛末端
に隣接したＥｃｏＲ１部位で開裂され、アンピシリン耐
性遺伝子と、［ｒｐプロモーター／オペレーターとの間
にあるＥｃ。

Ｒ１部位では開裂されていないフラグメントを得るため
に、ＥｃｏＲＩ部分消化か必要であった。アンピシリン
耐性遺伝子中のｐｓｔｒ部位を切断することにより失わ
れたアンピシリン耐性は、上記実施例５Ｆで得た最終的
なｐＨＫＹ１０直線状ＤＮＡ誘導体とのライゲーノヨン
によって回復することができろ。

１（、プロインノコリンの３２Ｎ＝末端アミノ酸を暗号
化している合成遺伝子の製造 プロインノコリンの最初の３２アミノ酸の暗号遺伝子を
組立てろために、第１段階として表２に示す１８個のオ
リゴヌクレオチドを調製した。最終的に組立てられた遺
伝子の全ヌクレオチド配列を第１４図に示す。

表ん ヒトプロインシュリンのための合成オリゴヌクレオチド 合成ヌクレオチドは、第１４図において角括弧で囲み、
アンダーラインを付して示されている。

これらのオリゴヌクレオチドは、Ｃｒｅａら（］９７８
）１．１　、　Ｂｉｏ鎖、　Ｃｈｅｍ、　２５０　：４
５９２および１１ａｋｕｒａら（＋９７５）、Ｊ、　Ａ
ｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ。

９７・７３２７の常法に従って合成された。これらオリ
ゴヌクレオチドの内規つかは、Ｃｒｅａら（１９７８）
およびＧ　ｏｅｄｄｅｌら（１９７９）によって以前に
示された、ヒトーインシュリンＢ鎖のための遺伝子の組
立てに用いられたものである。２個のオリゴヌクレオチ
ド（Ｂ５′とＢＩＯｏ）は、ＨｐａＩＩと末端のＢａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を与える。この末端部位
はクローニングにおいて特に有用である。

Ｈ１−Ｈ８の８個のオリゴヌクレオチドはヒトインシュ
リンＢ鎖遺伝子の左側半分を組立てるのに既に用いられ
ており（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）、Ｂ鎖遺伝子の
１−１３アミノ酸を有し、Ｎ末端に付加的なメチオニン
の暗号配列を含有している。

Ｂ鎖遺伝子の右半分は、オリゴヌクレオチドＢ１、Ｂ６
、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂｅ、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９およびＢ
ＩＯを、実質」二、Ｇ（＋ｅｄｄｅｌら（１９７９）の
教示した方法に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼにより、ライ
ゲーションすることによって組立てられた。得られた遺
伝子フラグメントは、ヒトーインシュリンＢ鎖の１４−
３０アミノ酸単位および架橋鎖の最初のアルギニンを暗
号化している。この遺伝子配列には、ヒトインシコリン
遺伝子配列中のＨｐａ口部口部間じ解読フレーム内の同
じ位置に、Ｈｐａ■が組込まれている。ライゲートした
遺伝子フレームをポリアクリルアミドゲル電気泳動法て
精製した後、最も大きいＤＮＡのバンドを溶離し、この
フラグメントをＨ１ｎｄｌＩｌ　−Ｂ　ａｍＨＩ切断プ
ラスミドｐＢＲ３２２に挿入した。得らイまたプラスミ
ド（ｐＢ３と命名）を形質転換によってＦ、　、ｃｏｌ
ｉＫ　Ｉ２２９４内に挿入した。ごのプラスミドは抗生
物質アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性
を付与し、従って、所望のヌクレオチド配列を含有して
いることがわかった。

ｐＢ３の５８塩基対Ｈ１ｎｄｌＩｌ　−Ｂ　ａｍｌ（Ｉ
フラグメントと、ｐＢ　）ｌ　Ｉ　（Ｇ　ｏｅｄｄｅｌ
らにより開示、＋９７９）の４６塩基対ＥｃｏＲＴ−Ｈ
ｉｎｄＩ［Ｉ７ラグメントとをライゲートし、ＢｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩ末端。

を有するフラグメントを得た。このフラグメントを常法
通り、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限プラスミドｐＢ
Ｒ３２２にライゲートし、得られたプラスミド（１）Ｉ
Ｂ３と命名）を、次いでＥ、ｃｏｌｉＫ　１２２９４に
クローンした。常法通り増幅させて単離した後、プラス
ミドｐＴＢ３をＥｃｏＲＩとＨｐａＩＩて消化すること
により、メチオニンによって先行されているプロインン
コリンのＮ末端アミノ酸を暗号化している合成遺伝子フ
ラグメント（第１５図におけるフラグメントｌ）が得ら
れた。この合成遺伝子をポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により、常法通り単離した。

！、ヒトープロインシュリンの５Ｏ−Ｃ末端アミノ酸を
暗号化しているｃＤＮＡの単離 所望のｃＤＮＡを得るための反応式は添付の第１６図に
示されている。この図に従って説明すると、ＢａｍＨＩ
認識配列と約２０残基からなる３゛ボリチミノル酸トラ
クトの両者を含有するＤＮＡ配列、ｐＣＣＧＧＡＴＣＣ
ＧＧＴＴＴ、２、Ｔを合成し、ｃＤＮＡの合成における
ＡＭＶ逆転写酵素用のプライマーとして用いた。このプ
ライマーは、ＴＰＴ鎖、５ｘｌＯ’μｍｏｌを含有する
反応液０．６ｚＱ中で、Ｂａｍ１−１１デ力ヌクレオチ
ドＩＩＬｍｏｌに・デオキシヌクレオチド末端転移酵素
（ターミナルトランスフェラーゼＸＥｎｚｏ　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、２００単位）を作用し、調製した。この反応
は、チャン（Ｃｈａｎｇ）ら（＋９７８、ネイヂャ−（
Ｎ　ａｔｕｒＣ）　２７５　：　６１７）の緩衝系にお
いて３７℃て１時間を要して行った。

ヒトー島細胞腫（インスリノーマ）組織はＩｎ５ｔｉｕ
ｔｅ　ｆｉｉｒ　Ｄｉａｂｅｔｅｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ
（ＭｕｅｎｃｈｅｎＳＷｅｓｔＧ　ｅｒｍａｎｙ）から
供給された。当業晋ならば理解し得る様に、ヒト島細胞
腫（インスリノーマ）組織は容易に入手でき、また、そ
の他数多くの医療関係の機関から得ることができる。ヒ
ト島細胞腫組織のポリＡｍＲＮＡ（２，５μｇ）を、ウ
ールリッヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）ら（１９７７、サイエン
ス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）　Ｉ　９６：ｌ３１３）の方法
と実質上同様にして単離し、次いでウィッケンス（Ｗ　
１ｃｋｅｎｓ）ら（１９７８、Ｊ。

バイオロジカル・ケミストリ＝（Ｊ、　Ｂｉｏ鎖、　Ｃ
ｈｅｍ、）２５３：２４８３）の方法と実質上同様にし
て二重鎖ｃＤＮＡに変換した。即ち、反応容量８０７１
中に１５ｍＭ）リス−Ｈ（，１（４２℃におけるｐＨ＝
８．３）、２１　ｍＭＫ　ＣＬ　８　ｍＭＭｇＣＩ２．
３０ｍＭＴ−メルカプトエタノール、２ｍＭのプライマ
ーｄ　ＣＣＧ　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＧ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　＋　
ａ　Ｔおよび１ｍＭｄＮ　Ｔ　Ｐ　ｓを含有する反応液
を、０℃でブレインキュベートした。ＡＭＶ逆転写酵素
を加えてからこの混合物を４２℃で１５分間インキュベ
ートした。

次いて得られたＲＮＡ／ＤＮＡを常法通り変性した。

補助ｃＤＮＡ鎖の合成は、２５ｍＭ　）リス・ＨＣｌ（
ｐＨ８，３）、３５　ｍＭＫ　ＣＬ　４　ｍＭＭｇｃ　
鎖、、１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、１ｍＭｄＮ
ＴＰｓおよび９単位のクレノーポリメラーゼ１を含有す
る容量１５０μＱの反応液中で行った。この混合物を１
５℃で９０分、次いで４℃で１５時間インキュへ−トし
た。次いて、Ｓ１ヌクレアーゼ（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｅｌｋｈａｒｔ、　　Ｉ　ｎｄｉａ
ｎａ）　Ｉ　ＯＯ単位により、実質上Ｗ　１ｃｋｅｎｓ
ら（＋９７８）の方法に従い、３７℃で２時間Ｓｌヌク
レアーゼ消化を行った。、二重鎖ｃＤＮＡ（０，３７μ
ｇ）を８％ポリアクリルアミドゲル上での重鎖泳動に付
し、５００塩基対より大きいＤＮＡフラグメントを溶離
した。

実質」ニマイゼル（ＭａｉｚｅｌＸ＋　９７１、メッソ
ド・イン・ヴアイａａシイ−（Ｍｅｓｈ、　Ｖ　１ｒｏ
１．　）　５　：　１８０）の方法に従い、デオキンヌ
クし・オチド末端転移酵素を使用してこのフラグメント
の３′末端にオリゴデオキノンチノル酸残基を付加した
。次いで、このｄＣ末端を有するｃＤＮＡフラグメント
を、まずＰｓｔｌ制限酵素で消化し、次いで、デオキシ
ヌクレオチド末端転移酵素を用いてデオキングアニノル
酸を末端に付加しておいたｐＢＲ３２２にアニールした
。得られたプラスミドを用いてＥｃｏｌｉＫＩ２　２９
４を形質転換し、生産された細胞をＬＢおよびＴ　Ｅ　
Ｔ培地にのせた。テトラサイクリン耐性でアンシピリン
感受性のコロニーを単離し、３個のｐｓｔｌ制限部位を
存するプラスミド′をスクリーンしノこ。この様な制限
部位型は、プロインシュリン遺伝子であることを示すも
のである（ンコアース（Ｓ　ｕｒｅｓ）ら、１９８０、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０８　：５７）。１つ
のプラスミド（ｐＨ１１０４と命名）は、６００塩基対
の挿入部分ををし、−予期されるＰｓＬＩ制限型を示し
、かっ３°ポリＡとｃＤＮＡの製造中に導入されたポリ
ＧＣとの間に１個のＢａｍＩ−ＩＩ部位を含有している
。挿入体のある、ヌクレオチド配列を第１４図に示す。

９■　　ヒトプロインシュリンの暗号遺伝子の組立て ヒト−プロインシュリンの暗号遺伝子の組立て模式図は
添付の第１５図に示されている。

プロインシュリンの最初の３１アミノ酸を暗号化してい
る合成遺伝子セグメント（第１５図におけるフラグメン
ト１）は、前記の如く、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩおよびＨｐａｌｌを使用し、５０μ９のプラスミド
Ｉ）ＩＢ３から回収した。このフラグメントはプロイン
シュリンの“プレ配列”の代わりにメヂオニンのＡＴＧ
配列をも含有している。

アミノ酸３２〜８６を暗号化しているｃＤＮΔ遺伝子セ
グメント、並びにｍＲＮＡの翻訳停止信号および３°非
翻訳領域は、プラスミドｐｌ（ｌ　ｌ　Ｏ４を、まずＢ
ａｍＨ１、次いて）Ｉ　ｐａ　ＩＩ制限酵素で処理する
ことにより、該プラスミドから回収した。

この２つのフラグメントを、ポリアクリルアミドケル電
気泳動法および電気溶離法によって単離した。これらの
遺伝子フラグメントを、リカーゼ緩衝液２０μσ中でＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて、４℃で２４時間処理ずろこ
とにより結合さＵた。

この混合物を水５０μＱで希釈し、フェノールおよびク
ロロホルムの各々で抽出してエタノール沈殿に付した。

得られたＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素
で処理し、これらの部位を再生させろと共に、遺伝子ポ
リマーを除去した。組立てら２１にプロインシュリン遺
伝子をポリアクリルアミドケル電気泳動によって単離し
、Ｅ　ＣＯＲｌおよびＢａｍＨｌて消化したプラスミド
ｐＢＲ３２２にライゲートした（Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
使用）。得られたＤＮＡを用いてＥ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　
２　２９４を形質転換し、生成したコロニーをテトラサ
イクリン感受性とアンシピリン耐性とに関してスクリー
ンした。その様なコロニーから単離されたプラスミドｐ
ＨＩ　３は、後のヌクレオチド配列決定によって確認さ
れた所望のプロインシュリン遺伝子を含有していた。

Ｋ、ヒト−プロインシュリンを含有するキメラタンパク
質の発現のためのプラスミドの組立てメヂオニンを暗号
化しているＮ末端コドンを持つ完全なヒトプロインシュ
リン遺伝子を、プラスミドｐ）（Ｉ　３のＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩ制限酵素処理により、該プラスミドから
回収した。所望のフラグメントをゲル電気泳動法で精製
し、次いて、プラスミドｐＳＯＭ７△２△４のｐ　ｓｔ
　Ｉ　　Ｅ　ＣｏＲ１部分消化物（実、施例５Ｇで調製
したもの）とプラスミドｐｌ−ＩＫＹＩＯのＰｓｔｌ−
ＢｇｌＩＩフラグメントの内大きい方のもの（実施例５
Ｆで調製したもの）とに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
ライゲートした。即ち、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ末
端を有する完全なヒトブロインンコリン遺伝子約１μり
、Ｐｓｔ　ｌ　−ＥｃｏＲＩ　（部分消化）ｐｓＯＭ７
△２△４フラグメント４μ９およびｐＩ−ＩＫＹＩＯの
Ｐｓｔ　ｌ−Ｂｇｌ　Ｈフラグメント約１μ９を、ライ
ゲーンヨン緩衝液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し、４
℃で２４時間ライゲートした。ライゲートしたＤＮＡ混
合物を用いてＥ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　２９４を形質転
換した。アンノビリンおよびテトラサイクリンのいずれ
に対しても増殖したコロニーを選択すると、これは所望
のプラスミドｐＨＩ　７△４△１を含有しており、かつ
ｔｒｌＥ’−プロインノコリン融合タンパク質に関して
予想される分子量のタンパク質を発現していることが見
出された。このタンパク質を発現するプロインンユリン
、ｐＨ１７△４△ｌは、挿入遺伝子およびベクターの両
者に関し、そのＤＮＡ配列並びに制限部位を完全に確認
された。プラスミドｐＨｒ７△４△Ｉは添□付の第１５
図に示されており、これはアンノビリンおよびテトラサ
イクリン耐性が回復されているのて選択が容易である。

実施例６−　プラスミドｐＮＭ６０８およびＥ、ｃ。

＋ｉＫ　１２ＲＶ　３０８／Ｉ）ＮＭ６０８の組立てＡ
、プラスミドｐＨＴ　７△４△１の〜２５３ｂｐＥｃｏ
Ｒｌ　−Ｈｐａ　Ｉフラグメントの組立てプラスミドｐ
ＨＩ　７△４△Ｉ　ＤＮＡ約５μｇ、（１０Ｘ）制限緩
衝液※１０μｇ、水８０μＱおよびＨｐａｌ制限酵素５
μｆ２（５単位）を３７℃で約１時間インキュベートし
た。７０℃で５分間、インキュベーソヨンオることによ
り、反応を停止した。混合物を氷上で冷却した後、１Ｍ
トリス・ＨＣＩ（１）Ｈ７２）約１２μ＆、水７μ（ｌ
およびＥｃｏＲ１制限酵素１μＱ（１０単位）を加えた
。得られた混合物を、まず３７℃て１時間、次いで７０
℃で５分間インキュベートした。水上で冷却した後、得
られたＤＮＡをフェノール、およびクロロホルム：イソ
アミルアルコール（２４：ｌ）混液の各々で抽出し、次
いてエタノール沈殿に付した。所望の〜２５３ｂｐＥｃ
ｏＲＩ　−Ｈｐａ　Ｉフラグメントを常法通り、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で分離し、電気溶離法て回
収してエタノール沈殿に付し、次いでＴＥ緩衝液約１０
μρに溶かし、以後の使用に、備えて０℃で保存した。

※　Ｉ（ｐａｌ制限酵素用の制限緩衝液（ＩＱＸ）は次
の成分から調製される：１００ｍＭ）リス・ＨＣｌ（１
）Ｈ７）、１００ｍＭＭｇＣＬ、６０ｍＭβ−メルカプ
トエタノールおよび２００ｍＭＫＣｌ。

Ｂ　プラスミドｐＨｌ７△４△１の〜３４　ｂｐＨｐａ
［−Ｔ　ａｇＩフラグメントの組立て プラスミドｐＨＩ　７△４△１約４△μｇの（５Ｘ）Ｅ
ｃｏＲ）制限緩衝液※３２μρ中溶液、水１２４μＱお
よびＥＣ０ＲＩ制限酵素４μＣ（２０単位）を３７℃で
約１時間インキュベートした。７０℃で５分間インキュ
ベートして反応を止めた。得られノコ８６２　ｂｌ）Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル上
電気泳動、次いで電気溶離にかけて単離し、エタノール
沈殿に付した。次いでこのフラグメントをＨｐａＩ制限
酵素１６単位を含有するＨｐａＩ緩衝液約１００μＱに
溶かした。３７℃で１．５時間処理した後、Ｔａｇ＋制
限酵素７．５単位を加え、得られたフラグメントを７．
５％ポリアクリルアミドゲル」二で常法通り分離した。

電気溶離法によって所望の〜３４　ｂｐＨｐａ　Ｉ　−
Ｔａｇ　ｒフラ・グメントを回収し、エタノール沈殿に
付した後、ＴＥ緩衝液５μＱに溶かした。

※　Ｅ、ｃｏＲｌ制限酵素用の制限緩衝ｉ’１Ｋ（５Ｘ
）は次の成分から調製された：２５０ｍＭＮａＣ１，５
００ｍＭトリス・ＨＣＩ（ｐＨ７，２）、２５ｍＭＭｇ
Ｃ鎖、および３０ｍＭβ−メルカプトエタノール。

ＣプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ　−Ｃ１ａ　Ｉ
消化 プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ約５μ２、ＣｌａＩ反応
ミックス※ｌＯμＱ、水７７．５μＱおよびＣ１ａＩ制
限酵素７．５μ（！（１５単位）を３７℃で約１時間イ
ンキュベートした。７０℃で５分間インキュベートして
反応を止めた。この混合物を水上で冷却した後、１Ｍト
リス・ＭＣＩ（ｐＨ７，２）約１２゜５ｔｔＱ−１ＭＮ
ａＣ１６，２５ｕＱ、０．１Ｍ　Ｍｇ０Ｌ２．５μＱお
よびＥｃｏＲＩ制限酵素ｌμＱ（ＩＯ単位）を加えた。

得られた混合物をまず３７℃で１時間、次いで７０°Ｃ
て５分間インキコベートした。水冷後、得られたＤＮＡ
を１％アガロースゲル−に電気泳動にかけた。大きいフ
ラグメントを溶離して回収し、エタノール沈殿に付した
後、約２０μａのＴＥ緩衝液に溶かし、以後の使用に備
えて０℃で保存した。

※　Ｃ１ａｌ制限酵素のための制限ミックス（］ＯＸ）
は次の成分から調製した　ｌｏｏｍＭ）リス・Ｈｃｌ（
ｐＨ７，４）、１００ｍＭＭｇＣ鎖、および６０ｍＭβ
−メルカプトエタノール。

Ｄ４ライゲージ式ンおよび形質転換 実施例２Ｄと実質上同様にして、実施例６Δの〜２５３
　ｂｐＥｃｏＲＩ　−Ｈｐａ　ｌフラグメント約０２μ
９、実施例６ＢのＨｐａ　Ｉ　−Ｔａｇ　ｒフラグメン
ト０５μ９および実施例６ＣのＥｃｏＲＩ−Ｃｌａ　Ｉ
消化物０．１μ９をライゲートし、Ｅ　、ｃｏｌｉＫ　
Ｉ　２　ＲＶ３０８の形質転換に用いた。得られた形質
転換体の内、あるものは、通常のアガロースゲル電気泳
動法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、＋９８２）等の試験の結果
、所望の〜４．６ｋｂプラスミドのみを含有していた。

その様な形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２ＲＶ３０
８／ｐＮＭ６０８と命名）を選択し、適当な抗生物質を
含有するＴＹ寒天上にのせ、微生物学上の常法に従って
培養した。プラスミドｐＮＭ６０８は、プラスミドｐＩ
−ｒ＋７△４△ｌの〜２８７　ｂｐＥｃｏＲ１−Ｃ１−
Ｃ１ａｌ（Ｔａフラグメントを含有しており、その好ま
しい供給源である。

実施例７　プラスミドｐＣＺ１１２およびＥ、ｃ。

１ｉＫＩ２ＲＶ３０８／ｐＣＺＩ　１２の組立てＡ、プ
ラスミドｐＮＭ６０８のＥｃｏＲＩ−ＣＩａｌｌ肖化お
よび〜０　、２８８ｋｂＥｃｏＲＩ−ＴａｇＩフラグメ
ント（プラスミドｐＨｌ７△４△Ｉの０．２８８ｋｂＥ
ｃｏＲＩ　−Ｔａｇ　Ｉフラグメントと同一）の生成Ｍ
ｅｄｉｕｍ　　５ａｌｔ緩衝液※５０μσ中に入れたプ
ラスミドｐＮＭ６０８ＤＮＡ約５μ９を各ＩＯ単位のＥ
ｃｏＲＩ制限酵素お上びＣ１ａｒ制限酵素と一緒に３７
℃で約１時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ７，０）５μｅを加えた後、３倍容の１００％エ
タノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。所望のＤＮＡ消
化物をＴＥ緩衝液１００μρに溶かし、以後の使用に備
えて０℃で保存した。

※　Ｍｅｄｉｕｍ　　５ａｌｌ緩衝液は次の成分から調
製した：５０ｍＭＮａＣ１，１００ｍＭ）リス弓−ＩＣ
Ｉ（ｐＨ７、５）、６ｍＭＭｇＣＬおよび２ｍＭβメル
カプトエタノール。

１３、ＤＮＡリンカ−配列の組立て ５°　ＣＧＡＣＣＡＴＧ　　ＧＡＴ　　ＧＡＴＩｌｌ　
　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１１３°　　　Ｔ
ＧＧ　　ＴＡＣＧＴＡ　　ＣＴＡＡＡＧ　　ＴＴＴ　　
ＣＣＧ　　ＧＣＴ’　　ＡＴＧＩｌｌ　　　Ｉｌｌ　　
　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＴ’Ｉ’ＣＡＡＡ　
　ＧＧＣＣＧＡ　　ＴＡＣＴＣＴ　　Ｃ’ｌ’Ｇ　　Ｔ
ＣＣＧＧＣＣＴＧＩｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　
　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＡＧＡ　　ＧＡＣΔＧＧ　　’Ｃ
ＣＧ　　ＧＡＣＴＴＴ　　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ　　ＧＴ
ＧＣＴ３’Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌ
ｌ　　　１１１１１ＡΔＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　Ｃ
ＧＡ　０５゜所望のリンカ−配列を、Ｉ　ｔａｋｕｒａ
ら（＋９７７）およびＣｒｅａら（１９７Ｂ）の方法に
実質１−従一て改良ホスホトリエステル法により、常法
通り合成した。

Ｃ，ライゲーションおよび形質転換 実施例２Ｄと実質上同様にして、実施例７ＢのＤＮＡリ
ンカ−約２０ピコモル、実施例７ＡのｐＮＭ６０８消化
物ｌｌ１ｇ、プラスミドｐＣＺＩｏＩの〜Ｉ　Ｏ、２ｋ
ｂＢａｍＨ−１−ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｘｂａｌ制
限酵素とその緩衝液の代わりにＥｃｏＲＩ制限酵素と適
当な緩衝液を用いる外は実施例２Ｂと同様にして調製し
たもの）０．５μ９および実施例３ＢのプラスミドｐＣ
Ｚ１０１の〜０　、６　ｋｂＢａｍＨ［−ＨｇｉＡ　Ｉ
フラグメント１μ９をライゲートし、得られたプラスミ
ドを用いてＥ、ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８を形質転換し
た。

得られた形質転換体の内いくつかは、通常のアガロース
ゲル電気泳動法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）その
他の試験の結果、所望の〜１０．８ｋｂプラスミドのみ
を含有していた。その様な形質転換体（ＥｃｏｌｉＫＩ
２ＲＶ３０８／ｐＣＺ１　＋２と命名）を選択し、適当
な抗生物質を含んだＴＹ寒天上にのせ、微生物学上の常
法に従って培養した。得られた細胞は、ＳＤＳゲル電気
泳動およびＲＩＡ等の試験により、前述のＭＥＴ−ＡＳ
Ｐ−ＡＳＰ−Ｌｙ５−ｂｃｒ（誘導体を高レベルで発現
することが示された。プラスミドｐＣＺ１１２は熱誘導
性のランナウェイレプリコンを含有しているので、所望
のｂＧＩ−１誘導体生産物の発現は培養温度約３７℃の
とき、最大となる。

１ｍ％Ｉ８　　プラスミドｐＡＴＩおよびＥ、ｃｏｌｉ
Ｋｌ　２ＲＶ３０８／ｌ）Ａ’ｌ’Ｉの組立て実施例７
におけるリンカ−配列の代わりに配列５°　ＣＧＡＣＡ
　　ＡＴＧ　　Ｔ”Ｉ’ＣＣＣＡｌ１１　　　　Ｉｌｌ
　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１１３’　　　　ＴＧＴ−Ｔ
ＡＣＡＡＧ　　ＧＧＴＧＣＴ　　ＡＴＧ　　ＴＣＴ　　
ＣＴＡ　　ＴＣＴＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ
　　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡ　
　’ＧＡＴ　　ＡＧＡＧＧＴ　　ＣＴＧ　　’Ｉ’ＴＴ
　　ＧＣＣＡΔＣ１１１Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　
Ｉｌｌ　　　　１１１ＣＣＡ　　ＧＡＣＡＡＡ　　ＣＧ
Ｇ　　ＴＴＧＧＣＴ　　ＧＴＧＣＴ　３゜ １１　！　　　Ｉ ＣＧＡ　　Ｃ５’ で示されるＤＮＡリンカ−配列を用いる外は実施例７と
実質上同様にして所望の組立てを行う。」−記の特定の
リンカ−配列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）およ
びＣｒｅａら（１９７８）の通常の方法と実質上同様に
して組立てることができる。上記の合成法も実施例１に
示されている。

以後のｐＡ’ｒｌの生産および単離のために、所望の形
質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　１２　ＲＶ　３０８／ｐＡ
Ｔ１と称する）を適当な抗生物質を含んだＴＹ寒天上に
のせ、常法通り培養した。この形質転換体もＳＤＳゲル
電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結果、前記のＭＥ’ｌ
’−ｂＧＨを高レベルに発現することが示された。プラ
スミドｐＡＴ＋は熱的に誘導可能なランナウェイレプリ
コンを含有しているので、所でのｂＧＨの発現は培養温
度約３７℃のとき、最大となる。

寒嵐鰺９　　プラスミドｐＡｓＰ＋およびＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＲＶ３０８／ＭＳＰＩの組立て 実施例７におけるリンカ−配列の代わりに配列３’　　
　　ＴＧＧ　　ＴＡＣＣＴＡ　　ＡＡＡＧＧＣＣＧＡ　
　ＴＡＣＡＧＣＧＡＣ ＴＣＣＧＧＣＣＴＧ　　　ＴＴＴ　　　ＧＣＣＩｌｌ　
　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ
ｌｌΔＧＧ　　　ＣＣＧ　　　ＧＡＣＡＡＡ　　ｃ　Ｇ
　にＡＡＣＧＣＴ　　Ｇ’ｒＧＣＴ　　　３゜Ｉｌｌ　
　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ ＴＴＧ　　　ＣＧＡ　　　Ｃ５’ て示されるＤＮＡ配列を用いる外は実施例７と実質上同
様にして所望の組立てを行う。」１記の特定のリンカ−
配列は、Ｔ　ｔａｋｕｒａら（＋９７７）およびＣｒｅ
ａら（＋　９７８）の通常の方法と実質上同様にして組
立てることができる。−１１記の合成法ら実施例１に示
されている。

以後のＭＳＩ’ｌの生産および単離のために、所望の形
質転換体（Ｅ　、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ　３０８　
、／ｐＡＳＰ　Ｉと称する）を適当な抗生物質を含んだ
ＴＹ寒天」二にのせ、常法通り培養した。この形質転換
体もＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩ　Ａ等の試験の結果
、前記のＭＥＴ−ＡＳＰ−ｂＧＩ−１誘導体を高レベル
に発現することが示された。プラスミドｐＡｓＰ＋は熱
的に誘導可能なランチウエイしノプリコンを含有してい
るので、所望のｂＧ’Ｈの発現は培養温度約３７℃のと
き、最大となる。

実施例１０　プラスミドｐＡＳＰ２およびＥ、ｃ。

１ｉＫＩ２ＲＶ３０８／ｐＡＳＰ２の組立て実施例７に
おけるリンカ−配列の代わりに、配列 ５°　　ＣＧＡＴＣＡＴＧ　　ＧＡＴ　　ＴＴＴＩＭ　
　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１１３’　　　　　Ｔ
ＡＧ　　ＴＡＣＣＴＡ　　ＡＡＡＧＧＣＣＧＡ　　ＴＡ
ＣＡＧＡ　　ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧ　　ＴＴＴ　　
ＧＣＣＩｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　
　　ｌ１ｌＡＧＧ　　ＣＣＧ　　ＧＡＣＡＡＡ　　ＣＧ
ＧΔΔＣＧＣＴ　　ＧＴＧＣＴ　　　３’Ｉｌｌ　　　
　１１１　　　１ ＴＴＧ　　　ＣＧＡ　　Ｃ５’ て示されるＤＮＡ配列を用いる外は実施例７と実質上同
様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリンカ−配
列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）およびＣｒｅａ
ら（＋　９７８）の通常の方法と実質上同様にして組立
てることができる。上記の合成法も実施例１に示されて
いる。

以後のｐＡＳＰ２の生産および単離のために、所望の形
質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　１２　ＲＶ　３０　Ｂ／ｐ
ＡＳＰ２と称する）を適当な抗生物質を含んだＴＹ寒天
上にの且、常法通り培養した。この形質転換体もＳＤＳ
ゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結果、前記のＭＥ
Ｔ−ＡＳＰ−ｂＧＩ−１誘導体を高レベルに発現するこ
とが示された。プラスミドｐＡｓｌ’２は熱的に誘導可
能なランナウェイレプリコンを含有しているので、所望
のｂＧＨ誘導体生産物の発現は培養温度約３７℃のとき
、最大となる。

実施例Ｉ＋　　プラスミドｐＡＴ２およびＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＲＶ３０８／ｐＡＴ２の組立て 実施例３Ｃにおけるリンカ−配列の代わりに、配列。

５’　　ＣＴΔＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡ　　ＡＴＧ
ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ　　　ｌ１１３’　　　　　
　ＴＣＣＣΔＴＡＡＴＴＡＴ　　ＴＡＣ’Ｉ’ＴＴ　　
ＣＣＡ　　ＧＣＴ　　ＡＴＧ　　ＴＣＴｌｌｌ　　　１
ｊｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＡＡＡ　　
ＧＧＴ　　ＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡＣＴＡ　　ＴＣＴ　
　ＧＧＴ　　ＣＴＧ　　ＴＴＴＩｌｌ　　　Ｉｌｌ　　
　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１ｌＧＡＴ　　ＡＧＡ　
　ＣＣＡ　　ＧＡＣＡＡＡＧＣＣΔＡＣＧＣＴ　　　Ｇ
ＴＧＣＴ　　　　３゜Ｉｌｌ　１１１　リ１１ ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　　ＣＧＡ　　Ｃ５゜で示されるＤ
ＮＡ配列を用いる外は実施例３と実質上同様にして所望
の組立てを行う。上記の特定のリンカ−配列は、Ｔ　ｔ
ａｋｕｒａら（１９７７）およびＣｒｅａら（＋９７８
）の通常の方法と実質上同様にして組立てることができ
る。上記の合成法も実施例１に示されている。

以後のｐＡＴ２の生産および単離のために、所望の形質
転換体（Ｅ　、ｃｏｌｉＫ　１２　ＲＶ　３０８　／ｐ
ＡＴ２七称する）を適当な抗生物質を含んだＴＹ寒天上
にのせ、常法通り培養した。この形質転換体もＳＤＳゲ
ル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結果、先に定義した
ＭＥ’ｒ−ｂＧＨ誘導体を高レベルに発現することが示
された。プラスミドｐＡＴ２は熱的に誘導可能なランナ
ウェイレプリコンを含有しているので、所望の−ｂＧＨ
誘導体生産物の発現は培養温度約３７℃のとき、最大と
なる。

実施例１２−　プラスミドＩ）ＣＺ１５４およびＥ。

ｃｏｌｉＫＩ２ＲＶ３０Ｂ／ｐＣＺＩ５４の組立て実施
例７におけるリンカ−配列の代わりに、配列 ５’　　ＣＧＡＣＣＡＴＧ　　ＧＴＴ　　ＴＴＴＩｌｌ
　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ′３″　　　　
ＴＧＧ　　ＴＡＣＣΔΔ　ＡΔＡＣＣＧ　　Ｇ　ＣＴ　
　ＡＴＧ　　Ｔ　ＣＴ　　Ｃ’Ｉ”　ＧＩｌｌ　　　　
Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　１１１Ｇ
ＧＣ’　ＣＣＡ　ＴＡＣＡＧＡ　　　ＧＡＣＴＣＣＧＧ
ＣＣＴＧ　　ＴＴＴ　　ＧＣＣ１１’ｌ　　　Ｉｌｌ　
　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　’ＩＩΔＧＧ　　　ＣＣ
Ｇ　　ＧＡＣＡＡＡ　　　ＣＧＧＡＡＣＧＣ’ｒ　ＧＴ
ＧＣＴ　　３’ Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ ＴＴＧ　　　ＣＣＡ　　Ｃ５’ で示されろＤＮＡリンカ−配列を用いろ外は実施例７と
実質上同様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリ
ンカ−配列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）および
Ｃｒｃａら（＋９７８）の通常の方法と実質−１−同様
にして組立てることかできろ。」二足の合成法ら実施例
１に示されている。

以後のＩ）ＣＺＩ５４の生産および単離のために、所望
の形質転換体（Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣ７
，＋５４称する）を適当な抗生物質を含んだ、ＴＶ寒天
」−にのせ、常法通り培養した。この形質転換体らＳ　
ｌ）　Ｓゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結果、先
に定義したＭＥＴ−ＶＡＬ、−ｂＧＨ誘導体を高レベル
に発現することか示された。プラスミドｐＣＺＩ５４は
熱的に誘導可能なランナウェイレプリコンを含有してい
るので、所望のｌ＋ＧＨ誘導体生産物の発現は培養温度
約３７°Ｃのとき、最大となる。

衷廊剋士主　プラスミドｐＣＺＩ５５およびＥ。

ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２ＲＶ３０８／ｐＣＺ　Ｉ　５５の組
立て実施例７におけろリンカ−配列の代わりに、配列 ５°　ＣＧＡＣＣＡＴＧ　　　ＧＣＴ　　　ＴＴＴＩｌ
ｌ　　　Ｉｌｌ　　　１１１　　　ｌ１１３°　　　　
ＴＧＧ　　　ＴＡＣＣＧＡ　　ＡＡＡＣＣＧ　　　ＧＣ
Ｔ　　　ＡＴＧ　　　ＴＣＴ　　　ＣＴＧＩｌｌ　　　
ＭＩ　　　Ｉｌｌ　　　ＩＭ　　　１１１ＧＧＣＣＣＡ
　　ＴＡＣＡＧＡ　　　ＧＡＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧ　　
　ＴＴＴ　　　ＧＣＣ１１■１すＨｌｌｊｌｌ　ｌ１ｌ ＡＧＧ　　　ＣＡＧ　　　ＧＡＣＡＡＡ　　　ＣＧＧＡ
ＡＣＧＣＴ　　　ＧＴＧＣＴ　　３’Ｉｌｌ　　　　Ｉ
ｌｌ　　　　１ ＴＴＧ　　　ＣＧＡ　　　Ｃ５’ で示されるＤＮＡリンカ−配列を用いる外は実施例７と
実質上同様にして所望の組立てを行う。」二足の特定の
リンカ−配列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）およ
びＣｒｅａら（１９７８）の通常の方法と実質Ｊ１同様
にして組立てることができる。上記の合成法も実施例１
に示されている。

以後のｐＣＺ１５５の生産および単離のために、所望の
形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　ｌ　２ＲＶ３０８／ｐＣ
Ｚ＋５５と称する）を適当な抗生物質を含んだ’Ｉ’Ｙ
寒天」二にのせ、常法通り培養した。この形質転換体も
ＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結果、先に
定義したＭＥＴ−ＡＬＡ−ＰＨＥ−Ｐ　ＲＯ−Ａ　Ｌ　
Ａ　−Ｍ　Ｅ　Ｔ−Ｓ　Ｅ　Ｒ−Ｌ　Ｅ　Ｕ−９ＥＲ−
ＶＡＬ−ｂ’ＧＨ誘導体を高レベルに発現することが示
された。プラスミドｐＣＺ＋５５は熱的に誘導可能なラ
ンナウェイレプリコンを含有しているので、所望のｂＧ
Ｈ誘導体生産物の発現は培養温度約３７℃のとき、最大
となる。

実施例１（プラスミドｐＣＺ＋５６およびＥｃｏｌｉＫ
　１２ＲＶ　３０８／ｐＣＺ　Ｉ　５６の組立て実施例
７におけるリンカ−配列の代わりに、配５’　　ＣＧＡ
ＴＡ　　ＡＴＧ　　ＧＡＴ　　ＴＴＴｌｌｌ　　　　１
１Ｉ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ’ｌ１３’　　　　　Ｔ
ΔＴ　　ＴＡＣＧＴＡ　　ＡＡＡＣＣＧ　　　ＧＣＴ　
　ＡＴＧ　　　ＴＣＴ　　　ＣＴＧＩｌｌ　　　　Ｉｌ
ｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＧＧＣ
ＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＡ　　　ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴ
Ｇ　　　ＴＴＴ　　　ＧＣＣＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　
　　１１１　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＡＧＧ　　　
ＣＣＧ　　　ＧＡＣＡＡＡ　　　ＣＧＧＡＡＣＧＣＴ　
　ＧＴＧＣＴ　　３’ Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ ＴＴＧ　　　ＣＧＡ　　　Ｃ５’ て示されるＤＮＡリンカ−配列を用いる外は実施例７と
実質上同様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリ
ンカ−配列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）および
Ｃｒｅａら（＋９７８）の通常の方法と実質上同様にし
て組立てることができる。上記の合成法も実施例１に示
されている。

以後のｐＣＺ＋５６の生産および単離のために、所望の
形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺＩ
５６と称する）を適当な抗生物質を含んだＴＹ寒天上に
のせ、常法通り培養した。この形質転換体もＳＤＳゲル
電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結果、先に定義したＭ
　Ｅｉ’−ΔＳｌ−’−ｂＧＨ誘導体を高し・△、ルに
発現することが示された。プラスミドｐＣＺＩ５６は熱
的に誘導可能なランチウェイし・プリコノを含有してい
るので、所望のｂＧＨ誘導体の発現は培養温度約３７°
Ｃのとき、最大となる。

寒ｍ％ｌｌ５−　プラスミドｐＣＺＩ０３およびＥ。

ｃｏｌｉＫＩ２　　ＲＶ３０８／ｐＣＺ＋０３の組立て
プラスミドｐｃｚｌｏ１（１０μ９）を１０７ｚσの１
０ＸＢＳｔＥＩＩ反応緩衝液（１，５ＭＮａＣ鎖、６０
ｍＭ）リス−ＨＣＩ（＋）Ｈ＝７．９）、６０ｍＭＭｇ
ＣＬ、６０ｍＭ２−メルカプトエタノールおよびｌｌ１
ｇ／ｌｌ夕ＢＳＡ）、２μＱ（〜２０単位）の制限酵素
ＢｓｔＩε■、および８８μρの水に溶解し、得られた
反応液を６０８Ｃで２時間インキユヘートした。−７Ｊ
ノール、およびクロロポルム抽出の後、０．２５ＭＮａ
０ΔＣ溶液からＤＮＡのエタノール沈殿を数回行った。

ＢＳｔＥｌｌ消化プラスミドｐＣＺＩ　０１　ＤＮＡ約
０．１１１９をリガーゼ緩衝液１００ＩＩＱに懸濁した
。

Ｔ４＋）ＮＡリガーゼ１００単位を加え、１６℃で２時
間インキコヘートした後、この連結したＤＮＡを使って
、常法に従い、Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ　３０８
を形質転換した。Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ　３０
８／ｐＣＺ１０３形質転換体をカナマイノンで選択し、
そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。プラスミドｐＣＺ１０３は、実施例２Ａの方法に従っ
て、形質転換体から分離した。

実施例１６　生成長ホルモン誘導体を発現するためのプ
ラスミドｐｃ：Ｚ＋０３誘導ベクターの組立て プラスミド１）ＣＺＩ０３を組立てるために行ったＢｓ
ｔＥＩＩ削除は、ｂＧＨ蛋白質暗号領域に影響を与えな
いので、本発明に係るプラスミドｐＣＺ１０３誘導プラ
スミドは、プラスミドｐＣＺ１０１誘導対応物と同じｂ
ＧＨ誘導体を発現する。

本発明のｐＣＺ１０３誘導プラスミドは、ｐＣＺ１０１
誘導対応物誘導対立物た実施例群に教示された方法に従
って組み立てたので、ｐＣＺＩ０３誘導プラスミドの組
み立てについては、表３に簡単に要約するにとどめる。

表３には、ｐＣＺ＋０３誘導プラスミド、ｐＣＺｌｏＩ
誘導対応物誘導対立物を教示している相当する実施例番
号、および組み立てに関与した異なったＤＮΔフラグメ
ントのみの寸法を示した。

常法に従い、ｐＣＺ＋０３誘導プラスミドを使ってＥ、
ｃｏｌｉＫ　ｌ　２　ＲＶ　３０　Ｂを形質転換した。

得られた形質転換体は既述したｂＧＨ誘導体を発現する
。ｐＣＺＩ０３誘導プラスミドは熱誘導ランナウェイレ
プリコンを含んでいるので、約３７℃の培養温度で最大
の発現が達成される。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は、プラスミドｐＮＭ５７５の組み立て
方法を示す工程図、第５図〜第８図はプラスミドｐＮＭ
７８９Ｂの組み立て方法を示す工程図、第９図はプラス
ミドｒ）Ｃ７，１９２０およびｐＪＲＩの制限サイト地
図、第１０図はプラスミドｐＣＺＩ１２の制限サイト地
図、第１１図はサイモノンアルファ１の合成遺伝子配列
を示４−模式図、第１２図はヌクＬノアヂトフラグメン
ト′Ｆ１５の合成方法を示す工程図、第１３図はプラス
ミドｐＴｈα１の組み立て方法を示す工程図、第１４図
はプロインンユリンの合成遺伝子配列を示す模式図、第
１５図はプラスミドｐｌ−Ｌ１７△４△１の組みｑて方
法を示す工程図、第１６図はプラスミドｐＨ■！０４の
組み立て方法を示す工程図である。 特許出願人：イーライ・リリー・アンド・カンパニー 代　理　人・弁理士　青白　葆　（外１名）ＦＩＧ、１ ｐＫＥＮｌｌｌ　　　　　　　　　　　　ｐＢＲ３２２
ＦＩＧ、２ フ“ラス５）：１１０３（Ｆｉ　　　１）ＦＩＧ、３ ｉｌｌ　Ｉ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ａｌ　１ ＦＩＧ、７ １１４（Ｆｉｇ　　６） ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ９ｃ！１９２０ 旦畦ＥＩＩ ＦＩＧ、１０ Ｂｓｔ　ＥＩＩ 号コア ！

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞内の高度に均質な種類の蛋白質性顆粒を生産す
   る方法であって、 １）ａ）ランナウェイレプリコン、および ｂ）機能的ポリペプチドを暗号化しているヌクレオチド
   配列の読み取り枠内にある転写および翻訳活性化配列（
   ただし、該機能的ポリペプチド暗号化配列は、この機能
   的ポリペプチドのカルボキシ末端を暗号化するヌクレオ
   チドのトリプレットに直接隣接し、かつこれより下流に
   位置する、翻訳停止信号を含む）、 を含む、選択的かつ自律的に複製する組換えＤＮＡ発現
   ベクターでコンピテントな細胞を形質転換し、そして、 ２）形質転換した細胞を、遺伝子の発現および前述のラ
   ンナウェイレプリコンの誘導体または活性化に好適な生
   育条件下で培養する、 ことからなる方法。 ２、転写活性化配列が、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン転
   写活性化配列、Ｅ．ｃｏｌｉリポ蛋白転写活性化配列、
   Ｅ．ｃｏｌｉラクトース転写活性化配列、バクテリオフ
   ァージλＰ＿ＬＯ＿Ｌ転写活性化配列、またはバクテリ
   オファージλＰ＿ＲＯ＿Ｒ転写活性化配列である、第１
   項記載の方法。 ３、転写活性化配列が、縦につながった１またはそれ以
   上のＥ．ｃｏｌｉ転写活性化配列からなる第２項記載の
   方法。 ４、組換えＤＮＡ発現ベクターがプラスミドである、第
   １項、第２項または第３項に記載の方法。 ５、機能的ポリペプチド暗号化配列が、牛の成長ホルモ
   ン、ヒトの成長ホルモン、ヒトのプレ成長ホルモン、豚
   の成長ホルモン、哺乳類の成長ホルモン、鳥類の成長ホ
   ルモン、ヒトのインシュリンＡ鎖、ヒトのインシュリン
   Ｂ鎖、ヒトのプロインシュリン、ヒトのプレプロインシ
   ュリン、インターフェロン、ウロキナーゼ、ヒトの組織
   プラスミノーゲン活性化物質、成長ホルモン放出因子、
   またはインターロイキンIIである、第１項〜第４項のい
   ずれかに記載の方法。 ６、プラスミドが、生物学的に活性な牛の成長ホルモン
   誘導体を暗号化している機能的ポリペプチド暗号化配列
   を含む、第４項記載の方法。 ７、プラスミドが、プラスミドｐＪＲ１、ｐＣＺ１１２
   、ｐＡＴ１、ｐＡＴ２、ｐＡＳＰ１、ｐＡＳＰ２、ｐＣ
   Ｚ１９２０、ｐＪＲ１．３、ｐＡＴ１．３、ｐＡＴ２．
   ３、ｐＡＳＰ１．３、ｐＡＳＰ２．３、ｐＣＺ１５４．
   ３、ｐＣＺ１５５．３、またはｐＣＺ１５６．３である
   、第６項記載の方法。 ８、プラスミドが、ヒトのプロインシュリン暗号化配列
   を含んでいる機能的ポリペプチド配列を含む、第４項記
   載の方法。 ９、プラスミドがプラスミドｐＣＺ２０１である第８項
   記載の方法。 １０、形質転換された細胞が原核細胞である、第１項〜
   第９項のいずれかに記載の方法。 １１、形質転換された細胞がＥ．ｃｏｌｉである、第１
   ０項記載の方法。 １２、形質転換された細胞がＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３
   ０８である、第９項記載の方法。 １３、ａ）ランナウェイレプリコンおよび ｂ）生物学的に活性な牛の成長ホルモン誘導体 を暗号化している遺伝子であって、 （１）【遺伝子配列があります】 （２）【遺伝子配列があります】 （３）【遺伝子配列があります】 （４）【遺伝子配列があります】 （５）【遺伝子配列があります】 または （６）【遺伝子配列があります】 ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
   、Ｃはデオキシシトシル、Ｔはチミジル、Ｒは牛成長ホ
   ルモンのアミノ酸の９番（ロイシン）から１９１番（フ
   ェニルアラニン）までを暗号化しているＤＮＡ配列であ
   り、Ｒ＾１は翻訳停止信号を暗号化しているＤＮＡ配列
   、即ち、【遺伝子配列があります】、【遺伝子配列があ
   ります】または【遺伝子配列があります】である］で示
   される遺伝子の読み取り枠内にある、転写および翻訳活
   性化配列、 を含む、選択的かつ自律的に複製する組換えＤＮＡ発現
   ベクター。 １４、プラスミドである第１３項記載のベクター。 １５、転写活性化配列が、Ｅ．ｃｏｌｉラクトース、バ
   クテリオファージλＰ＿ＬＯ＿Ｌ、バクテリオファージ
   λＰ＿ＲＬ￥Ｒ、ｔａｃ、Ｅ．ｃｏｌｉリポ蛋白または
   Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン転写活性化配列である、第
   １３項または第１４項記載のベクター。 １６、プラスミドｐＣＺ１９２０、ｐＪＲ１、ｐＣＺ１
   １２、ｐＡＴ１、ｐＡＳＰ１、ｐＡＴ２、ｐＡＳＰ２、
   ｐＪＲ１．３、ｐＡＴ１．３、ｐＡＴ２．３、ｐＡＳＰ
   １．３、ｐＡＳＰ２．３、ｐＣＺ１５４．３、ｐＣＺ１
   ５５．３、またはｐＣＺ１５６．３である、第１３項、
   第１４項、または第１５項に記載のベクター。 １７、ＭＥＴ−ＰＨＥ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＭＥＴ−ＡＬ
   Ａ−Ｒ＾２、ＭＥＴ−ＡＳＰ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ｂＧＨ
   またはＭＥＴ−ＡＳＰ−ｂＧＨ［式中、ＭＥＴはメチオ
   ニン、ＰＨＥはフェニルアラニン、ＰＲＯはプロリン、
   ＡＬＡはアラニン、ＡＳＰはアスパラギン酸、ＬＹＳは
   リジン、Ｒ＾２はＮ末端から６番目のアミノ酸（ロイシ
   ン）で始まる牛成長ホルモンの天然アミノ酸配列であり
   、ｂＧＨはＮ末端（最初）のフェニルアラニンで始まる
   牛成長ホルモンの天然アミノ酸配列である］で示される
   、第１３項〜第１６項のいずれかに記載のベクターによ
   って暗号化された牛の成長ホルモン誘導体。 １８、第１３項〜第１６項のいずれかに記載の組換えＤ
   ＮＡ発現ベクターを含む宿主細胞。 １９、Ｅ．ｃｏｌｉである第１８項記載の細胞。 ２０、Ｅ．ｃｏｌｉに１２ＲＶ３０８である第１９項記
   載の細胞。 ２１、メチオニル牛成長ホルモンを除く、第１３項〜第
   １６項のいずれかに記載のベクターにより暗号化された
   牛の成長ホルモン誘導体の、乳の産生を増加させるのに
   有効な量を、乳牛に投与することからなる、乳牛の乳生
   産を増加させる方法。 ２２、投与する量が、動物１頭につき１日当たり０．０
   ５〜１００，０００μｇ、好ましくは５〜２５，０００
   μｇ、最も好ましくは５００〜５，０００μｇである、
   第２１項記載の方法。 ２３、プラスミドｐＣＺ１０３。