JP2634132B2 - 新規ペプチド - Google Patents
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- Japan
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- dna
- plasmid
- leu
- motilin
- peptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/575—Hormones
- C07K14/63—Motilins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、モチリンの１３位メチ
オニン(Met) をロイシン(Leu) に置換した新規ペプチ
ド、該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組
換え体ＤＮＡおよびこれらの製造法に関する。本発明の
新規ペプチド（以下13Leu-モチリンという）は、天然の
モチリンと同等の活性を有するので医薬品としての用途
が期待できる。
オニン(Met) をロイシン(Leu) に置換した新規ペプチ
ド、該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組
換え体ＤＮＡおよびこれらの製造法に関する。本発明の
新規ペプチド（以下13Leu-モチリンという）は、天然の
モチリンと同等の活性を有するので医薬品としての用途
が期待できる。
【０００２】
【従来技術】モチリン(Motilin) は哺乳類の血中に存在
する生理活性ペプチドで腸管蠕動を活発にする作用を持
つことが知られている〔W. Y. Cheyおよび K.Y. Lee,ク
リニックス・イン・ガストロエンテロロジイ(Clinics i
n Gastroenterology, ３, 645(1980) 〕。開腹手術を受
けた患者の血中モチリン濃度は低下する。術後の血中モ
チリン濃度の正常値への復帰は患者の腸管の蠕動運動の
回復と相関関係があり、術後にモチリンを投与すると腸
の蠕動運動が活発化することが知られている。
する生理活性ペプチドで腸管蠕動を活発にする作用を持
つことが知られている〔W. Y. Cheyおよび K.Y. Lee,ク
リニックス・イン・ガストロエンテロロジイ(Clinics i
n Gastroenterology, ３, 645(1980) 〕。開腹手術を受
けた患者の血中モチリン濃度は低下する。術後の血中モ
チリン濃度の正常値への復帰は患者の腸管の蠕動運動の
回復と相関関係があり、術後にモチリンを投与すると腸
の蠕動運動が活発化することが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】天然のモチリンは動物
臓器から抽出する方法で得ることができるが、この方法
では量的に不十分である。そこで、現在用いられている
モチリンは大部分がペプチド化学合成法で作られたもの
である。しかし、この方法では、モチリンがアミノ酸２
２個からなる比較的長鎖のペプチドであるため高価にな
らざるをえない。従って、モチリンの活性を有する物質
を安価に大量に供給することが望まれている。
臓器から抽出する方法で得ることができるが、この方法
では量的に不十分である。そこで、現在用いられている
モチリンは大部分がペプチド化学合成法で作られたもの
である。しかし、この方法では、モチリンがアミノ酸２
２個からなる比較的長鎖のペプチドであるため高価にな
らざるをえない。従って、モチリンの活性を有する物質
を安価に大量に供給することが望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】モチリンの１３位アミノ
酸は Metであって、これは酸化されやすく、酸化されて
スルホキシド体になるとモチリンの活性は低下する〔M.
Fujino ら、ケミカル・ファーマシューティカル・ブリ
テン (Chem. Pharm. Bull.), 26 , 101(1978)〕。
酸は Metであって、これは酸化されやすく、酸化されて
スルホキシド体になるとモチリンの活性は低下する〔M.
Fujino ら、ケミカル・ファーマシューティカル・ブリ
テン (Chem. Pharm. Bull.), 26 , 101(1978)〕。
【０００５】本発明者は、活性低下を防ぐ方法について
研究を行った結果、モチリンの１３位 Metを Leuに変換
したペプチド（13Leu-モチリン）がモチリンと同等の活
性を有し、酸化による活性の低下がないことを見出し
た。さらにこの13Leu-モチリンを安価に大量に供給する
方法について研究した結果、遺伝子組換え技法で供給す
ることができることを見出した。
研究を行った結果、モチリンの１３位 Metを Leuに変換
したペプチド（13Leu-モチリン）がモチリンと同等の活
性を有し、酸化による活性の低下がないことを見出し
た。さらにこの13Leu-モチリンを安価に大量に供給する
方法について研究した結果、遺伝子組換え技法で供給す
ることができることを見出した。
【０００６】遺伝子組換え技法で小分子のペプチドを大
量生産することは一般に困難とされている。その理由
は、微生物などの宿主細胞中で作られた小分子のペプチ
ドは細胞中で酵素作用により容易に分解されてしまうた
めであると考えられている。この分解を防ぐために、他
の蛋白質と目的ペプチドとを融合させ高分子量の融合蛋
白質として生産させ、ついでこれを酵素的または化学的
方法で分解して目的のペプチドを得る方法が報告されて
いる〔三国俊亮ら、生化学、57，854(1985) 〕。
量生産することは一般に困難とされている。その理由
は、微生物などの宿主細胞中で作られた小分子のペプチ
ドは細胞中で酵素作用により容易に分解されてしまうた
めであると考えられている。この分解を防ぐために、他
の蛋白質と目的ペプチドとを融合させ高分子量の融合蛋
白質として生産させ、ついでこれを酵素的または化学的
方法で分解して目的のペプチドを得る方法が報告されて
いる〔三国俊亮ら、生化学、57，854(1985) 〕。
【０００７】しかし、この方法では、生産される融合蛋
白質中の目的ペプチドはごく一部分であるため、目的ペ
プチドの生産量は低くならざるを得ない。本発明者は、
目的ペプチドをコードする遺伝子を複数個連結してベク
ターに組み込み、得られる組換え体ＤＮＡを大腸菌に入
れ、形質転換体を培養する方法によれば、目的ペプチド
が重合した高分子ペプチドとして得られ、この重合ペプ
チドを切断することにより目的ペプチドを製造すること
ができることを見出した。
白質中の目的ペプチドはごく一部分であるため、目的ペ
プチドの生産量は低くならざるを得ない。本発明者は、
目的ペプチドをコードする遺伝子を複数個連結してベク
ターに組み込み、得られる組換え体ＤＮＡを大腸菌に入
れ、形質転換体を培養する方法によれば、目的ペプチド
が重合した高分子ペプチドとして得られ、この重合ペプ
チドを切断することにより目的ペプチドを製造すること
ができることを見出した。
【０００８】以下本発明を詳細に説明する。本発明は下
記式１のアミノ酸配列（配列番号１）を有する新規ペプ
チド（13Leu-モチリン）を提供する。
記式１のアミノ酸配列（配列番号１）を有する新規ペプ
チド（13Leu-モチリン）を提供する。
【０００９】
【化７】
【００１０】（式中、記号は下記アミノ酸残基を示す。 Phe : フェニルアラニン、Val : バリン、Pro : プロリ
ン、Ile : イソロイシン、Thr : スレオニン、Tyr : チ
ロシン、Gly : グリシン、 Glu：グルタミン酸、Leu：
ロイシン、Gln : グルタミン、Arg : アルギニン、 Ly
s：リジン、Asn ：アスパラギン。以下同じ）13 Leu-モチリンは、ペプチド固相合成法〔G.Barangら、
ザ・ペプチド：アナリシス・シンセシス・バイオロジイ
("The Peptide:Analysis, Synthesis, Biology") 、E.
Grossおよび J. Meienhofen編、Vol.2, pl, Academic
Press (1982)〕によりペプチド自動合成機( Beckman 99
0B型）を用いて合成することができる。
ン、Ile : イソロイシン、Thr : スレオニン、Tyr : チ
ロシン、Gly : グリシン、 Glu：グルタミン酸、Leu：
ロイシン、Gln : グルタミン、Arg : アルギニン、 Ly
s：リジン、Asn ：アスパラギン。以下同じ）13 Leu-モチリンは、ペプチド固相合成法〔G.Barangら、
ザ・ペプチド：アナリシス・シンセシス・バイオロジイ
("The Peptide:Analysis, Synthesis, Biology") 、E.
Grossおよび J. Meienhofen編、Vol.2, pl, Academic
Press (1982)〕によりペプチド自動合成機( Beckman 99
0B型）を用いて合成することができる。
【００１１】遺伝子組換え法による13Leu-モチリンの製
造は下記のとおり行うことができる。 工程１（図１参照） まず、下記式３，４，５および６で示されるＤＮＡを化
学合成する。
造は下記のとおり行うことができる。 工程１（図１参照） まず、下記式３，４，５および６で示されるＤＮＡを化
学合成する。
【００１２】
【化８】
【００１３】（式中、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃはそれぞれヌクレ
オチド中の塩基アデニン、チミン、グアニン、シトシン
を示す。以下同じ） これらＤＮＡの合成は、リン酸アミダイド法による固相
合成法に従い、ＤＮＡ自動合成機により行う。式３で示
されるＤＮＡ（配列番号４、以下ＤＮＡ３という）と式
４で示されるＤＮＡ（配列番号５、以下ＤＮＡ４とい
う）および式５で示されるＤＮＡ（配列番号６、以下Ｄ
ＮＡ５という）と式６で示されるＤＮＡ（配列番号７、
以下ＤＮＡ６という）から形成される二重鎖ＤＮＡ断片
をリガーゼで結合して下記式２で示される二重鎖ＤＮＡ
断片（配列番号２，３、以下遺伝子２という）を造成す
る。
オチド中の塩基アデニン、チミン、グアニン、シトシン
を示す。以下同じ） これらＤＮＡの合成は、リン酸アミダイド法による固相
合成法に従い、ＤＮＡ自動合成機により行う。式３で示
されるＤＮＡ（配列番号４、以下ＤＮＡ３という）と式
４で示されるＤＮＡ（配列番号５、以下ＤＮＡ４とい
う）および式５で示されるＤＮＡ（配列番号６、以下Ｄ
ＮＡ５という）と式６で示されるＤＮＡ（配列番号７、
以下ＤＮＡ６という）から形成される二重鎖ＤＮＡ断片
をリガーゼで結合して下記式２で示される二重鎖ＤＮＡ
断片（配列番号２，３、以下遺伝子２という）を造成す
る。
【００１４】
【化９】
【００１５】（式中ＣｌａＩ、ＢｇｌII、ＢａｍＨＩ、
ＳａｃＩに向かう引き出し線は、これら制限酵素による
切断部位を示す。） この遺伝子２は13Leu-モチリンのアミノ末端側にアスパ
ラギン酸(Asp) −グルタミン(Gln) −イソロイシン(Il
e) −フェニルアラニン(Phe) −メチオニン(Met) が、
カルボキシル末端側にアルギニン(Arg) −イソロイシン
(Ile) −ロイシン(Leu) が結合した３０個のアミノ酸か
らなるペプチドをコードする塩基配列を持っている。こ
のアミノ末端側およびカルボキシル末端側に結合したア
ミノ酸をコードするＤＮＡには、遺伝子２を用いて13Le
u-モチリン重合体をコードする遺伝子を作るために制限
酵素BgｌIIとBamHＩの認識部位が配置されている。また
その遺伝子により生産される重合体中の13Leu-モチリン
単量体間はArg-Ile-Phe-Metの４アミノ酸からなるペプ
チド（スペーサーペプチド）で連結するように設計され
ている。このスペーサーペプチドは臭化シアン、カルボ
キシペプチダーゼＡおよびＢで順次処理することにより
除去され、13Leu-モチリン単量体を与える。遺伝子２の
両端には、ベクターへの導入のため制限酵素ＣｌａＩと
ＳａｃＩの認識部位を配置してある。遺伝子２のＤＮＡ
コドンは、大腸菌で大量に生産される蛋白質の遺伝子に
高頻度で出現するコドン〔M. Goug ら、Nucleic Acids
Res.) ,10 , 7055(1982)〕を主として用いてある。ま
た、遺伝子２はＤＮＡ３とＤＮＡ４との二重鎖ＤＮＡ断
片およびＤＮＡ５とＤＮＡ６との二重鎖ＤＮＡ断片をリ
ガーゼで結合して合成するが、この結合反応が効率よく
進行するように遺伝子２の塩基配列にある長さ以上の同
一の配列が存在しないように設計してある。
ＳａｃＩに向かう引き出し線は、これら制限酵素による
切断部位を示す。） この遺伝子２は13Leu-モチリンのアミノ末端側にアスパ
ラギン酸(Asp) −グルタミン(Gln) −イソロイシン(Il
e) −フェニルアラニン(Phe) −メチオニン(Met) が、
カルボキシル末端側にアルギニン(Arg) −イソロイシン
(Ile) −ロイシン(Leu) が結合した３０個のアミノ酸か
らなるペプチドをコードする塩基配列を持っている。こ
のアミノ末端側およびカルボキシル末端側に結合したア
ミノ酸をコードするＤＮＡには、遺伝子２を用いて13Le
u-モチリン重合体をコードする遺伝子を作るために制限
酵素BgｌIIとBamHＩの認識部位が配置されている。また
その遺伝子により生産される重合体中の13Leu-モチリン
単量体間はArg-Ile-Phe-Metの４アミノ酸からなるペプ
チド（スペーサーペプチド）で連結するように設計され
ている。このスペーサーペプチドは臭化シアン、カルボ
キシペプチダーゼＡおよびＢで順次処理することにより
除去され、13Leu-モチリン単量体を与える。遺伝子２の
両端には、ベクターへの導入のため制限酵素ＣｌａＩと
ＳａｃＩの認識部位を配置してある。遺伝子２のＤＮＡ
コドンは、大腸菌で大量に生産される蛋白質の遺伝子に
高頻度で出現するコドン〔M. Goug ら、Nucleic Acids
Res.) ,10 , 7055(1982)〕を主として用いてある。ま
た、遺伝子２はＤＮＡ３とＤＮＡ４との二重鎖ＤＮＡ断
片およびＤＮＡ５とＤＮＡ６との二重鎖ＤＮＡ断片をリ
ガーゼで結合して合成するが、この結合反応が効率よく
進行するように遺伝子２の塩基配列にある長さ以上の同
一の配列が存在しないように設計してある。
【００１６】工程２（図１参照） 遺伝子２を含むプラスミドの造成：プラスミドｐＴｒＳ
２０（参考例１の方法で製造）を制限酵素ＣｌａＩとＳ
ａｃＩとで切断後、大きい方のＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ
７という）を単離する。ＤＮＡ７と工程１で得た遺伝子
をリガーゼで結合してプラスミドｐＭＴＡ１を造成す
る。
２０（参考例１の方法で製造）を制限酵素ＣｌａＩとＳ
ａｃＩとで切断後、大きい方のＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ
７という）を単離する。ＤＮＡ７と工程１で得た遺伝子
をリガーゼで結合してプラスミドｐＭＴＡ１を造成す
る。
【００１７】工程３（図２参照）13 Leu-モチリン遺伝子を２個含むプラスミドの造成：プ
ラスミドｐＭＴＡ１を制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌIIで切
断し、13Leu-モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片８（以下
ＤＮＡ８という）を単離する。別にｐＭＴＡ１をＰｓｔ
ＩとＢａｍＨＩで切断し、13Leu-モチリン遺伝子を含む
ＤＮＡ断片９（以下ＤＮＡ９という）を単離する。ＤＮ
Ａ８とＤＮＡ９とをリガーゼで結合することにより13Le
u-モチリン遺伝子を２個含むプラスミドｐＭＴＡ２を得
る。制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩとは同一の切断末端
を生じるため結合することができるが、結合部位（図２
中Ｂｇ／Ｂａｍと表示）は両制限酵素の認識部位と異な
る塩基配列となるため、いずれの制限酵素でも切断され
ない。
ラスミドｐＭＴＡ１を制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌIIで切
断し、13Leu-モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片８（以下
ＤＮＡ８という）を単離する。別にｐＭＴＡ１をＰｓｔ
ＩとＢａｍＨＩで切断し、13Leu-モチリン遺伝子を含む
ＤＮＡ断片９（以下ＤＮＡ９という）を単離する。ＤＮ
Ａ８とＤＮＡ９とをリガーゼで結合することにより13Le
u-モチリン遺伝子を２個含むプラスミドｐＭＴＡ２を得
る。制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩとは同一の切断末端
を生じるため結合することができるが、結合部位（図２
中Ｂｇ／Ｂａｍと表示）は両制限酵素の認識部位と異な
る塩基配列となるため、いずれの制限酵素でも切断され
ない。
【００１８】工程４（図３参照）13 Leu-モチリン遺伝子を４個含むプラスミドの造成：ｐ
ＭＴＡ２をＰｓｔＩとＢｇｌIIで切断する。前述のとお
りＢｇ／Ｂａｍの部位は切断されないので２個の13Leu-
モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。別にｐＭ
ＴＡ２をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断して同様に13Leu-
モチリン遺伝子２個を含むＤＮＡ断片が得られる。両Ｄ
ＮＡ断片をリガーゼで結合すると13Leu-モチリン遺伝子
を４個含むプラスミドｐＭＴＡ４が得られる。
ＭＴＡ２をＰｓｔＩとＢｇｌIIで切断する。前述のとお
りＢｇ／Ｂａｍの部位は切断されないので２個の13Leu-
モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。別にｐＭ
ＴＡ２をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断して同様に13Leu-
モチリン遺伝子２個を含むＤＮＡ断片が得られる。両Ｄ
ＮＡ断片をリガーゼで結合すると13Leu-モチリン遺伝子
を４個含むプラスミドｐＭＴＡ４が得られる。
【００１９】ｐＭＴＡ２からｐＭＴＡ４を作製するのと
同様の方法で13Leu-モチリン遺伝子を８個、１６個、３
２個含むプラスミドｐＭＴＡ８、ｐＭＴＡ１６およびｐ
ＭＴＡ３２を得る。これらを以下 pMTA と総称する。
同様の方法で13Leu-モチリン遺伝子を８個、１６個、３
２個含むプラスミドｐＭＴＡ８、ｐＭＴＡ１６およびｐ
ＭＴＡ３２を得る。これらを以下 pMTA と総称する。
【００２０】工程５（図４参照）13 Leu-モチリン遺伝子の蛋白質発現用ベクターへの組み
込み：シロザケ成長ホルモン（ＳＧＨ）遺伝子の発現に
用いたプラスミドｐｓＧＨＩＭ１（参考例２の方法で製
造）を制限酵素ＢｇｌIIとＳａｃＩで切断し、大きい方
のＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１０という）を単離する。別
にプラスミドｐＭＴＡ４をＢｇｌIIとＳａｃＩで切断
し、13Leu-モチリンを４個含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ
１１という）を単離する。ＤＮＡ１０とＤＮＡ１１とを
リガーゼで結合して発現プラスミドｐＭＴＫ４を得る。
込み：シロザケ成長ホルモン（ＳＧＨ）遺伝子の発現に
用いたプラスミドｐｓＧＨＩＭ１（参考例２の方法で製
造）を制限酵素ＢｇｌIIとＳａｃＩで切断し、大きい方
のＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１０という）を単離する。別
にプラスミドｐＭＴＡ４をＢｇｌIIとＳａｃＩで切断
し、13Leu-モチリンを４個含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ
１１という）を単離する。ＤＮＡ１０とＤＮＡ１１とを
リガーゼで結合して発現プラスミドｐＭＴＫ４を得る。
【００２１】ｐＭＴＡ４に替えてｐＭＴＡ８またはｐＭ
ＴＡ16を用いて同様に行うことにより13Leu-モチリン遺
伝子を８個または１６個含む発現プラスミドｐＭＴＫ８
またはｐＭＴＫ１６を得ることができる。これらを以下
ｐＭＴＫと総称する。
ＴＡ16を用いて同様に行うことにより13Leu-モチリン遺
伝子を８個または１６個含む発現プラスミドｐＭＴＫ８
またはｐＭＴＫ１６を得ることができる。これらを以下
ｐＭＴＫと総称する。
【００２２】工程６（図５参照） 発現プラスミドへのターミネーターの導入：プラスミド
ｐｓＧＨＩＭ１を制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断
してプロモーターを含むＤＮＡ断片を得る。別にプラス
ミドｐＧＨＤ７（参考例４）をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで
切断してターミネーターを含むＤＮＡ断片を得る。両Ｄ
ＮＡ断片をリガーゼで結合して、ターミネーターの下流
に制限酵素ＢｇｌIIの認識部位を持たず、ＭｌｕＩの認
識部位を持つプラスミドｐｓＧＨＩＭＥ１を造成する。
ｐｓＧＨＩＭ１を制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断
してプロモーターを含むＤＮＡ断片を得る。別にプラス
ミドｐＧＨＤ７（参考例４）をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで
切断してターミネーターを含むＤＮＡ断片を得る。両Ｄ
ＮＡ断片をリガーゼで結合して、ターミネーターの下流
に制限酵素ＢｇｌIIの認識部位を持たず、ＭｌｕＩの認
識部位を持つプラスミドｐｓＧＨＩＭＥ１を造成する。
【００２３】ｐｓＧＨＩＭＥ１をＢｇｌIIとＳａｃＩで
切断して得た大きい方のＤＮＡ断片とプラスミドｐＭＴ
Ａ４をＢｇｌIIとＳａｃＩで切断して得た13Leu-モチリ
ン遺伝子を含むＤＮＡ切断とをリガーゼで結合して13Le
u-モチリン遺伝子を４個含むプラスミドｐＭＴＬ４を得
る。ｐＭＴＡ４に替えてｐＭＴＫ８またはｐＭＴＫ１６
を用いて同様に行い、13Leu-モチリン遺伝子を８個また
は１６個有するプラスミドｐＭＴＬ８またはｐＭＴＬ１
６を得る。これらを以下ｐＭＴＬと総称する。
切断して得た大きい方のＤＮＡ断片とプラスミドｐＭＴ
Ａ４をＢｇｌIIとＳａｃＩで切断して得た13Leu-モチリ
ン遺伝子を含むＤＮＡ切断とをリガーゼで結合して13Le
u-モチリン遺伝子を４個含むプラスミドｐＭＴＬ４を得
る。ｐＭＴＡ４に替えてｐＭＴＫ８またはｐＭＴＫ１６
を用いて同様に行い、13Leu-モチリン遺伝子を８個また
は１６個有するプラスミドｐＭＴＬ８またはｐＭＴＬ１
６を得る。これらを以下ｐＭＴＬと総称する。
【００２４】プラスミドｐＭＴＫおよびｐＭＴＬには各
々トリプトファンプロモーターの下流にシロザケ成長ホ
ルモンのアミノ末端から１０４個のアミノ酸をコードす
る遺伝子があり、この遺伝子の下流に13Leu-モチリン遺
伝子を含む遺伝子が連結している。また13Leu-モチリン
遺伝子の下流にリポ蛋白質遺伝子のターミネーターが導
入されている。プラスミドｐＭＴＫとｐＭＴＬとの相違
は、ｐＭＴＫはターミネーターの下流に制限酵素Ｂｇｌ
IIの認識部位を持つがｐＭＴＬはこれを持たないことに
ある。
々トリプトファンプロモーターの下流にシロザケ成長ホ
ルモンのアミノ末端から１０４個のアミノ酸をコードす
る遺伝子があり、この遺伝子の下流に13Leu-モチリン遺
伝子を含む遺伝子が連結している。また13Leu-モチリン
遺伝子の下流にリポ蛋白質遺伝子のターミネーターが導
入されている。プラスミドｐＭＴＫとｐＭＴＬとの相違
は、ｐＭＴＫはターミネーターの下流に制限酵素Ｂｇｌ
IIの認識部位を持つがｐＭＴＬはこれを持たないことに
ある。
【００２５】工程７13 Leu-モチリン遺伝子の発現：13Leu-モチリン遺伝子発
現プラスミドｐＭＴＫおよびｐＭＴＬを大腸菌に導入す
る。形質転換株は、13Leu-モチリンの４，８または１６
量体とシロザケ成長ホルモンとの融合蛋白質を生産す
る。これら融合蛋白質は、いずれも大腸菌内で顆粒とし
て存在している。13Leu-モチリンの４量体の融合蛋白の
生産量が最も多く、全菌体蛋白質の約10％程度である。
顆粒中の13Leu-モチリンの割合はそれぞれｐＭＴＬ４：
４２％、ｐＭＴＬ８：56％、ｐＭＴＬ１６：６８％であ
る。
現プラスミドｐＭＴＫおよびｐＭＴＬを大腸菌に導入す
る。形質転換株は、13Leu-モチリンの４，８または１６
量体とシロザケ成長ホルモンとの融合蛋白質を生産す
る。これら融合蛋白質は、いずれも大腸菌内で顆粒とし
て存在している。13Leu-モチリンの４量体の融合蛋白の
生産量が最も多く、全菌体蛋白質の約10％程度である。
顆粒中の13Leu-モチリンの割合はそれぞれｐＭＴＬ４：
４２％、ｐＭＴＬ８：56％、ｐＭＴＬ１６：６８％であ
る。
【００２６】工程８（図６参照）13 Leu-モチリン生産量の向上(1)：プラスミドｐＭＴＫ
およびｐＭＴＬを用いる上記方法においては、シロザケ
成長ホルモンの 104個アミノ酸からなる蛋白質との融合
蛋白質として生産される。このシロザケ成長ホルモン部
分はより小さいことが望まれる。下記の方法によってシ
ロザケ成長ホルモン部分をより小さくしたプラスミド
を造成し、13Leu-モチリンの製造を行うことができる。
およびｐＭＴＬを用いる上記方法においては、シロザケ
成長ホルモンの 104個アミノ酸からなる蛋白質との融合
蛋白質として生産される。このシロザケ成長ホルモン部
分はより小さいことが望まれる。下記の方法によってシ
ロザケ成長ホルモン部分をより小さくしたプラスミド
を造成し、13Leu-モチリンの製造を行うことができる。
【００２７】下記式１３で示されるデオキシオリゴヌク
レオチド（配列番号８、以下ＤＮＡ１３という）と式１
４で示されるデオキシオリゴヌクレオチド（配列番号
９、以下ＤＮＡ１４という）を化学合成する。合成はリ
ン酸アミダイト法による固相合成法に従い、ＤＮＡ自動
合成機 により行う。
レオチド（配列番号８、以下ＤＮＡ１３という）と式１
４で示されるデオキシオリゴヌクレオチド（配列番号
９、以下ＤＮＡ１４という）を化学合成する。合成はリ
ン酸アミダイト法による固相合成法に従い、ＤＮＡ自動
合成機 により行う。
【００２８】
【化１０】
【００２９】両ＤＮＡを混合して下記式１２で示される
リンカー１２を造成する。
リンカー１２を造成する。
【００３０】
【化１１】
【００３１】リンカー１２はシロザケ成長ホルモンのア
ミノ末端から８番目までのアミノ酸をコードする遺伝子
とこの遺伝子の両側に制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢｇｌII
の切断末端を持っている。13Leu-モチリン遺伝子４個を
持つプラスミドｐＭＴＬ４を制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌ
IIで切断し、13Leu-モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片
（以下ＤＮＡ１５という）を単離する。別にpMTL４を制
限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄIIIで切断し、プロモーター
を含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１６という）を単離す
る。ＤＮＡ１５，ＤＮＡ１６およびリンカー１２をリガ
ーゼで結合してプラスミドpMTN4 を造成する。
ミノ末端から８番目までのアミノ酸をコードする遺伝子
とこの遺伝子の両側に制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢｇｌII
の切断末端を持っている。13Leu-モチリン遺伝子４個を
持つプラスミドｐＭＴＬ４を制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌ
IIで切断し、13Leu-モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片
（以下ＤＮＡ１５という）を単離する。別にpMTL４を制
限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄIIIで切断し、プロモーター
を含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１６という）を単離す
る。ＤＮＡ１５，ＤＮＡ１６およびリンカー１２をリガ
ーゼで結合してプラスミドpMTN4 を造成する。
【００３２】ｐＭＴＬ４に替えてｐＭＴＬ８を用いて上
記と同様に行い、ｐＭＴＮ８を作製する。プラスミドｐ
ＭＴＮ４とｐＭＴＮ８はともに13Leu-モチリン重合体の
アミノ末端に Met-Ile-Gln-Asn-Gln-Arg-Leu-Phe-Gln-I
le-Phe-Metの１２個のアミノ酸が結合した蛋白質をコー
ドする遺伝子を持ち、pMTN4 は13Leu-モチリン遺伝子を
４個、ｐＭＴＮ８は13Leu-モチリン遺伝子を８個持つ。
プラスミドｐＭＴＮ４およびｐＭＴＮ８を大腸菌に導入
する。これら形質転換株はプラスミドｐＭＴＫまたはｐ
ＭＴＬを含む形質転換株と同程度の蛋白質を生産する。
これら蛋白質は大腸菌中で顆粒の状態で存在し、この顆
粒中の13Leu-モチリンの含量は77−８０％でｐＭＴＫお
よびｐＭＴＬを含む形質転換株の生産量を大きく越えて
いる。
記と同様に行い、ｐＭＴＮ８を作製する。プラスミドｐ
ＭＴＮ４とｐＭＴＮ８はともに13Leu-モチリン重合体の
アミノ末端に Met-Ile-Gln-Asn-Gln-Arg-Leu-Phe-Gln-I
le-Phe-Metの１２個のアミノ酸が結合した蛋白質をコー
ドする遺伝子を持ち、pMTN4 は13Leu-モチリン遺伝子を
４個、ｐＭＴＮ８は13Leu-モチリン遺伝子を８個持つ。
プラスミドｐＭＴＮ４およびｐＭＴＮ８を大腸菌に導入
する。これら形質転換株はプラスミドｐＭＴＫまたはｐ
ＭＴＬを含む形質転換株と同程度の蛋白質を生産する。
これら蛋白質は大腸菌中で顆粒の状態で存在し、この顆
粒中の13Leu-モチリンの含量は77−８０％でｐＭＴＫお
よびｐＭＴＬを含む形質転換株の生産量を大きく越えて
いる。
【００３３】工程８（図７参照）13 Leu-モチリン生産量の向上(2)：プラスミドｐＭＴ
Ｋ、ｐＭＴＬ、ｐＭＴＮを大腸菌に導入して13Leu-モチ
リンを大量に生産することができるが、プラスミド中の
一部のＤＮＡを除去することによりさらに高生産できる
方法を下記に示す。
Ｋ、ｐＭＴＬ、ｐＭＴＮを大腸菌に導入して13Leu-モチ
リンを大量に生産することができるが、プラスミド中の
一部のＤＮＡを除去することによりさらに高生産できる
方法を下記に示す。
【００３４】プラスミドｐＭＴＬは13Leu-モチリン遺伝
子の下流にターミネーターを持つ。このターミネーター
と13Leu-モチリンの間にある非翻訳領域のＤＮＡを除去
したプラスミドを造成する。プラスミドｐＡｒｇ４（参
考例５）を制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断してプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片を得る。別にプラスミドｐ
ＧＨＤ７をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断してターミネー
ターを含むＤＮＡ断片を得る。両ＤＮＡ断片をリガーゼ
で結合して、ターミネーターの下流にＢｇｌIIの認識部
位を持たないプラスミドｐＡｒｇＥ１を造成する。
子の下流にターミネーターを持つ。このターミネーター
と13Leu-モチリンの間にある非翻訳領域のＤＮＡを除去
したプラスミドを造成する。プラスミドｐＡｒｇ４（参
考例５）を制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断してプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片を得る。別にプラスミドｐ
ＧＨＤ７をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断してターミネー
ターを含むＤＮＡ断片を得る。両ＤＮＡ断片をリガーゼ
で結合して、ターミネーターの下流にＢｇｌIIの認識部
位を持たないプラスミドｐＡｒｇＥ１を造成する。
【００３５】ｐＡｒｇＥ１をＰｓｔＩとＥｃｏＲＶで切
断してターミネーターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１
７という）を単離する。プラスミドｐＭＴＫ４を制限酵
素ＳａｃＩで切断し、切断部分の一本鎖領域をＤＮＡポ
リメラーゼＩの Klenow フラグメントを用いて加水分解
し、平滑末端（Blunt end)とする。さらにこのＤＮＡ断
片をＰｓｔＩで切断後、13Leu-モチリン遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片（以下ＤＮＡ１８という）を単離する。ＤＮＡ
１７とＤＮＡ１８をリガーゼで結合してプラスミドｐＭ
ＴＭ４を得る。
断してターミネーターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１
７という）を単離する。プラスミドｐＭＴＫ４を制限酵
素ＳａｃＩで切断し、切断部分の一本鎖領域をＤＮＡポ
リメラーゼＩの Klenow フラグメントを用いて加水分解
し、平滑末端（Blunt end)とする。さらにこのＤＮＡ断
片をＰｓｔＩで切断後、13Leu-モチリン遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片（以下ＤＮＡ１８という）を単離する。ＤＮＡ
１７とＤＮＡ１８をリガーゼで結合してプラスミドｐＭ
ＴＭ４を得る。
【００３６】プラスミドｐＭＴＫ４の代わりにｐＭＴＬ
４を用いて同様に行ってｐＭＴＭ４が得られる。ｐＭＴ
Ｋ４に替えてｐＭＴＬ８を用いて同様に行って13Leu-モ
チリン遺伝子８個を有するプラスミドｐＭＴＭ８が得ら
れる。ｐＭＴＡ４からｐＭＴＡ８を作製したのと同様の
方法でｐＭＴＭ４からｐＭＴＭ８を造成することができ
る。すなわち、ｐＭＴＭ４を制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌ
IIで切断して13Leu-モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片を
単離し、このＤＮＡ断片をｐＭＴＭ４をＰｓｔＩとＢａ
ｍＨＩで切断して得られる13Leu-モチリン遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とリガーゼで結合してｐＭＴＭ８を得る。
４を用いて同様に行ってｐＭＴＭ４が得られる。ｐＭＴ
Ｋ４に替えてｐＭＴＬ８を用いて同様に行って13Leu-モ
チリン遺伝子８個を有するプラスミドｐＭＴＭ８が得ら
れる。ｐＭＴＡ４からｐＭＴＡ８を作製したのと同様の
方法でｐＭＴＭ４からｐＭＴＭ８を造成することができ
る。すなわち、ｐＭＴＭ４を制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌ
IIで切断して13Leu-モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片を
単離し、このＤＮＡ断片をｐＭＴＭ４をＰｓｔＩとＢａ
ｍＨＩで切断して得られる13Leu-モチリン遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とリガーゼで結合してｐＭＴＭ８を得る。
【００３７】さらにプラスミドｐＡｒｇＥ１に替えてｐ
Ａｒｇ４を用いて、ｐＭＴＭ４、ｐＭＴＭ８の造成と同
様に行ってプラスミドｐＭＴｍ４、ｐＭＴｍ８を造成す
る。ｐＭＴＭとｐＭＴｍの相違は、ｐＭＴＭはターミネ
ーターの下流に制限酵素ＢｇｌIIの認識部位を持つがｐ
ＭＴｍはこれを持たないことである。
Ａｒｇ４を用いて、ｐＭＴＭ４、ｐＭＴＭ８の造成と同
様に行ってプラスミドｐＭＴｍ４、ｐＭＴｍ８を造成す
る。ｐＭＴＭとｐＭＴｍの相違は、ｐＭＴＭはターミネ
ーターの下流に制限酵素ＢｇｌIIの認識部位を持つがｐ
ＭＴｍはこれを持たないことである。
【００３８】工程９ ｐＭＴＭを用いる13Leu-モチリン遺伝子の発現：プラス
ミドｐＭＴＭとｐＭＴｍはｐＭＴＫおよびｐＭＴＬのタ
ーミネーター上流の非翻訳領域の遺伝子が約１６０塩基
対（以下ｂｐという）除去された構造を持つ。
ミドｐＭＴＭとｐＭＴｍはｐＭＴＫおよびｐＭＴＬのタ
ーミネーター上流の非翻訳領域の遺伝子が約１６０塩基
対（以下ｂｐという）除去された構造を持つ。
【００３９】ｐＭＴＭ４を大腸菌ＨＢ１０１に導入した
場合、13Leu-モチリン重合体の蛋白質量は全蛋白質量の
１７％を占める。
場合、13Leu-モチリン重合体の蛋白質量は全蛋白質量の
１７％を占める。
【００４０】工程１０（図８参照）13 Leu-モチリン生産の向上(3)：プラスミドｐＭＴＮは
13Leu-モチリン遺伝子の下流にターミネーターを持つ。
このターミネーターと13Leu-モチリンの間にある非翻訳
領域の遺伝子を除去したプラスミドを以下の通り作製す
る。プラスミドｐＡｒｇＥ１をＰｓｔＩとＥｃｏＲＶで
切断してターミネーターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ
１９という）を単離する。プラスミドｐＭＴＮ４を制限
酵素ＳａｃＩで切断し、切断末端の一本鎖領域をＤＮＡ
ポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを用いて加水分解
して平滑末端とし、さらに制限酵素ＰｓｔＩで切断後、
13Leu-モチリンを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ２０とい
う）を単離する。両ＤＮＡ断片をリガーゼで結合するこ
とによりプラスミドｐＭＴＯ４を得る。
13Leu-モチリン遺伝子の下流にターミネーターを持つ。
このターミネーターと13Leu-モチリンの間にある非翻訳
領域の遺伝子を除去したプラスミドを以下の通り作製す
る。プラスミドｐＡｒｇＥ１をＰｓｔＩとＥｃｏＲＶで
切断してターミネーターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ
１９という）を単離する。プラスミドｐＭＴＮ４を制限
酵素ＳａｃＩで切断し、切断末端の一本鎖領域をＤＮＡ
ポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを用いて加水分解
して平滑末端とし、さらに制限酵素ＰｓｔＩで切断後、
13Leu-モチリンを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ２０とい
う）を単離する。両ＤＮＡ断片をリガーゼで結合するこ
とによりプラスミドｐＭＴＯ４を得る。
【００４１】ｐＭＴＮ４に替えてｐＭＴＮ８を用いて同
様に行うことによりｐＭＴＯ８を造成する。ｐＭＴＯ８
はｐＭＴＭ８と同様に、ｐＭＴＡ４からｐＭＴＡ８を造
成した方法でも作れる。ｐＡｒｇＥ１に替えてｐＡｒｇ
４を用いて同様に行いｐＭＴｏを造成する。ｐＭＴＯと
ｐＭＴｏとの違いは、ｐＭＴｏはターミネーターの下流
に制限酵素ＢｇｌIIの認識部位を持つが、ｐＭＴＯはこ
れを持たないことにある。
様に行うことによりｐＭＴＯ８を造成する。ｐＭＴＯ８
はｐＭＴＭ８と同様に、ｐＭＴＡ４からｐＭＴＡ８を造
成した方法でも作れる。ｐＡｒｇＥ１に替えてｐＡｒｇ
４を用いて同様に行いｐＭＴｏを造成する。ｐＭＴＯと
ｐＭＴｏとの違いは、ｐＭＴｏはターミネーターの下流
に制限酵素ＢｇｌIIの認識部位を持つが、ｐＭＴＯはこ
れを持たないことにある。
【００４２】プラスミドｐＭＴＯとｐＭＴｏはｐＭＴＮ
のターミネーター上流の非翻訳領域の遺伝子が約 160ｂ
ｐ除去された構造を持っている。ｐＭＴＯ４を大腸菌に
導入して蛋白質を発現させる。形質転換株は、ｐＭＴＮ
４を用いる場合と同程度の大量の蛋白質を生産する。該
蛋白質は形質転換株中で顆粒の状態で存在し、顆粒中の
13Leu-モチリン含量は７７％である。
のターミネーター上流の非翻訳領域の遺伝子が約 160ｂ
ｐ除去された構造を持っている。ｐＭＴＯ４を大腸菌に
導入して蛋白質を発現させる。形質転換株は、ｐＭＴＮ
４を用いる場合と同程度の大量の蛋白質を生産する。該
蛋白質は形質転換株中で顆粒の状態で存在し、顆粒中の
13Leu-モチリン含量は７７％である。
【００４３】工程１１ プロモーターの変換 プラスミドｐＭＴＯ４はシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配
列と開始コドン（ＡＴＧ）の距離（SD−ＡＴＧ）が１０
塩基で二連結のトリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ
×２）を持っている。プラスミドｐＭＴＯ４を制限酵素
ＨｉｎｄIIIとPstＩで切断して13Leu-モチリンを含むＤ
ＮＡ断片（以下ＤＮＡ21という）を単離する。別にプラ
スミドｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）を制
限酵素ＨｉｎｄIIIとＰｓｔＩで切断してプロモーター
を含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ22という）を単離する。
ＤＮＡ２１とＤＮＡ２２とをリガーゼで結合してプラス
ミドｐＭＴＯＩ４を得る（図９参照）。プラスミドｐＭ
ＴＯＩ４は一つのトリプトファンプロモーター（Ｐｔｒ
ｐ）とＳＤ−ＡＴＧ間が１４塩基である。
列と開始コドン（ＡＴＧ）の距離（SD−ＡＴＧ）が１０
塩基で二連結のトリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ
×２）を持っている。プラスミドｐＭＴＯ４を制限酵素
ＨｉｎｄIIIとPstＩで切断して13Leu-モチリンを含むＤ
ＮＡ断片（以下ＤＮＡ21という）を単離する。別にプラ
スミドｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）を制
限酵素ＨｉｎｄIIIとＰｓｔＩで切断してプロモーター
を含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ22という）を単離する。
ＤＮＡ２１とＤＮＡ２２とをリガーゼで結合してプラス
ミドｐＭＴＯＩ４を得る（図９参照）。プラスミドｐＭ
ＴＯＩ４は一つのトリプトファンプロモーター（Ｐｔｒ
ｐ）とＳＤ−ＡＴＧ間が１４塩基である。
【００４４】プラスミドｐＫＹＰ１０にかえてプラスミ
ドｐＧＥＬ１（特開昭６１−９３１９７、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６１２）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＰｓｔＩで切断
してプロモーターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ２３と
いう）を単離する。プラスミドｐＭＴＯ４より得たＤＮ
Ａ２１とＤＮＡ２３をリガーゼで結合してプラスミドｐ
ＭＴＯII４を得る（図１０参照）。プラスミドｐＭＴＯ
II４はプロモーターＰｒｔｐ×２を持ちＳＤ−ＡＴＧ間
は１４塩基である。
ドｐＧＥＬ１（特開昭６１−９３１９７、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６１２）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＰｓｔＩで切断
してプロモーターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ２３と
いう）を単離する。プラスミドｐＭＴＯ４より得たＤＮ
Ａ２１とＤＮＡ２３をリガーゼで結合してプラスミドｐ
ＭＴＯII４を得る（図１０参照）。プラスミドｐＭＴＯ
II４はプロモーターＰｒｔｐ×２を持ちＳＤ−ＡＴＧ間
は１４塩基である。
【００４５】プラスミドｐＧＥＬにかえてプラスミドpG
HA2 （特開昭６０−２２１０９１、IGHA2 FERM BP-400)
を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＰｓｔＩで切断してプロモー
ターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ２４という）を単離
する。プラスミドｐＭＴＯ４より得たＤＮＡ２１とＤＮ
Ａ２４をリガーゼで結合してプラスミドｐＭＴＯIII４
を得る（図１１）。プラスミドｐＭＴＯIII４はレット
プロモーター(Plet)を持ちＳＤ−ＡＴＧ間は１４塩基で
ある。
HA2 （特開昭６０−２２１０９１、IGHA2 FERM BP-400)
を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＰｓｔＩで切断してプロモー
ターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ２４という）を単離
する。プラスミドｐＭＴＯ４より得たＤＮＡ２１とＤＮ
Ａ２４をリガーゼで結合してプラスミドｐＭＴＯIII４
を得る（図１１）。プラスミドｐＭＴＯIII４はレット
プロモーター(Plet)を持ちＳＤ−ＡＴＧ間は１４塩基で
ある。
【００４６】以上の遺伝子組換え手法を用いて多量に生
産された13Leu-モチリン重合体は菌体内に顆粒として蓄
積している。菌体を破砕後、遠心分離にかけると膜成分
と可溶性画分から顆粒が容易に分離され、13Leu-モチリ
ン重合体が高純度で収率良く得られる。この13Leu-モチ
リン重合体の顆粒を臭化シアンで分解するとスペーサー
ペプチドのメチオニンの部分で切断され、13Leu-モチリ
ン単量体のカルボキシル側にArg-Ile-Phe-Hse 〔メチオ
ニンが分解してホモセリン(Hse) に変換した〕の結合し
た２６アミノ酸からペプチド２５（配列番号１０）が得
られる。このペプチド２５をカルボキシペプチダーゼＡ
で消化するとカルボキシル側から順次水解され Hse,Ph
e, Ile が除去され13Leu-モチリンのカルボキシル基末
端にＡｒｇの結合したペプチド２６（配列番号１１）が
単一の生成物として得られる。
産された13Leu-モチリン重合体は菌体内に顆粒として蓄
積している。菌体を破砕後、遠心分離にかけると膜成分
と可溶性画分から顆粒が容易に分離され、13Leu-モチリ
ン重合体が高純度で収率良く得られる。この13Leu-モチ
リン重合体の顆粒を臭化シアンで分解するとスペーサー
ペプチドのメチオニンの部分で切断され、13Leu-モチリ
ン単量体のカルボキシル側にArg-Ile-Phe-Hse 〔メチオ
ニンが分解してホモセリン(Hse) に変換した〕の結合し
た２６アミノ酸からペプチド２５（配列番号１０）が得
られる。このペプチド２５をカルボキシペプチダーゼＡ
で消化するとカルボキシル側から順次水解され Hse,Ph
e, Ile が除去され13Leu-モチリンのカルボキシル基末
端にＡｒｇの結合したペプチド２６（配列番号１１）が
単一の生成物として得られる。
【００４７】次にペプチドをカルボキシペプチダーゼＢ
で消化するとＡｒｇが除去され13Leu-モチリン（式２）
が単一の生成物として高収率で得られる。
で消化するとＡｒｇが除去され13Leu-モチリン（式２）
が単一の生成物として高収率で得られる。
【００４８】
【化１２】
【００４９】以上の如く本発明の製造により13Leu-モチ
リン法が遺伝子組換え手法により極めて高い生産量で製
造される。本発明の製造法は化学的、酵素的に除去でき
るスペーサーペプチドを介して目的のペプチドを連結し
たペプチド重合体をコードする遺伝子を作製し、この遺
伝子を有効なプロモーターとターミネーターを持ったプ
ラスミドに挿入し、このプラスミドを微生物に導入して
ペプチド重合体を著量生産させ、得られたペプチド重合
体を化学的、酵素的に処理して高収率で単量体ペプチド
に変換する方法である。スペーサーペプチドの除去に本
発明では臭化シアン、カルボキシペプチダーゼＡおよび
Ｂを用いたが、生産を目的とするペプチドを分解しない
方法であればいかなる除去法も用いることができる。化
学的分解法としては例えばギ酸を用いるとＡｓｐ−Ｐｒ
ｏ結合が切断され、ヒドロキシルアミンでＡｓｎ−Ｘ
（ＸはGly, Leu, Ala)結合が切断される。酵素的分解法
としてはエンテロキナーゼによる(Asp)n−Lys(ｎ＝２〜
４）の切断、コラゲナーゼによるPro-X-Gly-Pro （Ｘは
任意のアミノ酸残基）、カリクレインＢによる Phe-Arg
結合の切断が例としてあげられる。本発明のスペーサー
ペプチドはこれらの切断法のうち生産を目的とするペプ
チドを分解しない切断法により切断される構造を持ち、
その結果生じたスペーサーペプチドの断片を別の方法で
除去しうる構造であれば良い。ペプチドを連結した重合
体を生産し、これを切断してペプチド単量体を得る製造
法において一般にスペーサーペプチドは必須である。ス
ペーサーペプチドを必要としない場合は生産しようとす
るペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端のアミノ酸
の間を切る選択的な切断法がある場合で、例えばアミノ
末端が Proでカルボキシル末端が Aspであればこのペプ
チド重合体は単量体が Asp-Proで連結しているのでギ酸
で処理すれば単量体が得られるが、このような構造を持
ったペプチドは極めて稀である。従ってスペーサーペプ
チドが一般に必須であり、その設計は切断と除去が高収
率で容易に行なえるものでなくてはならない。本発明に
用いたスペーサーペプチドはメチオニンを含有しない全
てのペプチドの生産に用いることができる。すなわち目
的ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸が塩基性アミ
ノ酸以外の場合には本発明のスペーサーペプチドを用い
ることができ、切断、除去も本発明の方法で実施され
る。ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸が塩基性ア
ミノ酸 Lysまたは Argの場合には本発明のスペーサーペ
プチド中の塩基性アミノ酸 Argは不要で臭化シアンによ
る切断後のスペーサーペプチドの除去反応はカルボキシ
ペプチダーゼＡのみでよくＢは必要ない。本発明のスペ
ーサーペプチドをコードする遺伝子には制限酵素Ｂｇｌ
IIとＢａｍＨＩの認識部位があり、この同一の切断末端
を生じる酵素を用いた遺伝子を多数個連結する方法の有
用性が実証された。遺伝子を多数個連結する際に用いる
制限酵素は本発明 BglIIとBamHI の組合せの他に多数の
酵素の利用が可能で、上記の切断と除去の条件を満足す
るスペーサーペプチドをコードする塩基配列にそれらの
制限酵素の切断部位を作ることができれば良い。本発明
では13Leu-モチリン遺伝子が１，２，４, ８，16, 32個
と２n ( ｎ＝０〜５）個連結した遺伝子の製造法を例示
したが、本発明の方法を用いたペプチドをコードする遺
伝子を任意の個数連結することが容易なことは明らかで
ある。本発明で13Leu-モチリン重合体の遺伝子はシロザ
ケ成長ホルモンのアミノ末端側の一部の遺伝子やＩＦＮ
−γのアミノ末端側の一部の遺伝子の下流に連結し、融
合型の蛋白質として生産させたが、シロザケ成長ホルモ
ンやＩＦＮ−γの一部の遺伝子は目的とする13Leu-モチ
リン重合体の生産に必須ではない。
リン法が遺伝子組換え手法により極めて高い生産量で製
造される。本発明の製造法は化学的、酵素的に除去でき
るスペーサーペプチドを介して目的のペプチドを連結し
たペプチド重合体をコードする遺伝子を作製し、この遺
伝子を有効なプロモーターとターミネーターを持ったプ
ラスミドに挿入し、このプラスミドを微生物に導入して
ペプチド重合体を著量生産させ、得られたペプチド重合
体を化学的、酵素的に処理して高収率で単量体ペプチド
に変換する方法である。スペーサーペプチドの除去に本
発明では臭化シアン、カルボキシペプチダーゼＡおよび
Ｂを用いたが、生産を目的とするペプチドを分解しない
方法であればいかなる除去法も用いることができる。化
学的分解法としては例えばギ酸を用いるとＡｓｐ−Ｐｒ
ｏ結合が切断され、ヒドロキシルアミンでＡｓｎ−Ｘ
（ＸはGly, Leu, Ala)結合が切断される。酵素的分解法
としてはエンテロキナーゼによる(Asp)n−Lys(ｎ＝２〜
４）の切断、コラゲナーゼによるPro-X-Gly-Pro （Ｘは
任意のアミノ酸残基）、カリクレインＢによる Phe-Arg
結合の切断が例としてあげられる。本発明のスペーサー
ペプチドはこれらの切断法のうち生産を目的とするペプ
チドを分解しない切断法により切断される構造を持ち、
その結果生じたスペーサーペプチドの断片を別の方法で
除去しうる構造であれば良い。ペプチドを連結した重合
体を生産し、これを切断してペプチド単量体を得る製造
法において一般にスペーサーペプチドは必須である。ス
ペーサーペプチドを必要としない場合は生産しようとす
るペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端のアミノ酸
の間を切る選択的な切断法がある場合で、例えばアミノ
末端が Proでカルボキシル末端が Aspであればこのペプ
チド重合体は単量体が Asp-Proで連結しているのでギ酸
で処理すれば単量体が得られるが、このような構造を持
ったペプチドは極めて稀である。従ってスペーサーペプ
チドが一般に必須であり、その設計は切断と除去が高収
率で容易に行なえるものでなくてはならない。本発明に
用いたスペーサーペプチドはメチオニンを含有しない全
てのペプチドの生産に用いることができる。すなわち目
的ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸が塩基性アミ
ノ酸以外の場合には本発明のスペーサーペプチドを用い
ることができ、切断、除去も本発明の方法で実施され
る。ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸が塩基性ア
ミノ酸 Lysまたは Argの場合には本発明のスペーサーペ
プチド中の塩基性アミノ酸 Argは不要で臭化シアンによ
る切断後のスペーサーペプチドの除去反応はカルボキシ
ペプチダーゼＡのみでよくＢは必要ない。本発明のスペ
ーサーペプチドをコードする遺伝子には制限酵素Ｂｇｌ
IIとＢａｍＨＩの認識部位があり、この同一の切断末端
を生じる酵素を用いた遺伝子を多数個連結する方法の有
用性が実証された。遺伝子を多数個連結する際に用いる
制限酵素は本発明 BglIIとBamHI の組合せの他に多数の
酵素の利用が可能で、上記の切断と除去の条件を満足す
るスペーサーペプチドをコードする塩基配列にそれらの
制限酵素の切断部位を作ることができれば良い。本発明
では13Leu-モチリン遺伝子が１，２，４, ８，16, 32個
と２n ( ｎ＝０〜５）個連結した遺伝子の製造法を例示
したが、本発明の方法を用いたペプチドをコードする遺
伝子を任意の個数連結することが容易なことは明らかで
ある。本発明で13Leu-モチリン重合体の遺伝子はシロザ
ケ成長ホルモンのアミノ末端側の一部の遺伝子やＩＦＮ
−γのアミノ末端側の一部の遺伝子の下流に連結し、融
合型の蛋白質として生産させたが、シロザケ成長ホルモ
ンやＩＦＮ−γの一部の遺伝子は目的とする13Leu-モチ
リン重合体の生産に必須ではない。
【００５０】しかし、遺伝子の開始コドン、ＡＴＧ周辺
の塩基配列が蛋白質の生産量に大きな影響を与えるため
高い生産量が得られているシロザケ成長ホルモン遺伝子
の開始コドンのＡＴＧ周辺の塩基配列を持った遺伝子を
用いて13Leu-モチリン重合体遺伝子を高発現させること
ができる。この方法は13Leu-モチリン以外のペプチド重
合体の遺伝子を用いても高発現が可能で一般性の高い製
造法である。
の塩基配列が蛋白質の生産量に大きな影響を与えるため
高い生産量が得られているシロザケ成長ホルモン遺伝子
の開始コドンのＡＴＧ周辺の塩基配列を持った遺伝子を
用いて13Leu-モチリン重合体遺伝子を高発現させること
ができる。この方法は13Leu-モチリン以外のペプチド重
合体の遺伝子を用いても高発現が可能で一般性の高い製
造法である。
【００５１】上記組換え技法における反応の条件は、一
般的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素による消
化反応は、通常0.１〜２０μｇのＤＮＡを２〜２００mM
（好ましくは10〜４０mM）のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ6.０
〜9.５好ましくはpH7.０〜8.０）、０〜２００mMのＮａ
ＣｌまたはＫＣｌ、２〜３０mM（好ましくは５〜１０m
M）のＭｇＣｌ2 、０〜２０mMのメルカプトエタノール
を含む反応液中で、制限酵素0.１〜１００単位（好まし
くは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位）を用い、２０
〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異なる）に
おいて、１５分間〜２４時間行う。
般的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素による消
化反応は、通常0.１〜２０μｇのＤＮＡを２〜２００mM
（好ましくは10〜４０mM）のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ6.０
〜9.５好ましくはpH7.０〜8.０）、０〜２００mMのＮａ
ＣｌまたはＫＣｌ、２〜３０mM（好ましくは５〜１０m
M）のＭｇＣｌ2 、０〜２０mMのメルカプトエタノール
を含む反応液中で、制限酵素0.１〜１００単位（好まし
くは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位）を用い、２０
〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異なる）に
おいて、１５分間〜２４時間行う。
【００５２】制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の
精製は、ＬＧＴ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などによって行う。ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２０
０mM（好ましくは１０〜４０mM）のトリス−ＨＣｌ（pH
6.１〜9.５、好ましくはｐＨ7.０〜8.０）、２〜２０mM
（好ましくは５〜１０mM）のＭｇＣｌ2 、0.１〜１０mM
（好ましくは0.５〜2.０mM）のＡＴＰ、１〜５０mM（好
ましくは５〜１０mM）のジチオスレイトールを含む反応
液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ0.３〜１０単位を用い、１
〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時
間（好ましくは２〜２０時間）行う。
精製は、ＬＧＴ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などによって行う。ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２０
０mM（好ましくは１０〜４０mM）のトリス−ＨＣｌ（pH
6.１〜9.５、好ましくはｐＨ7.０〜8.０）、２〜２０mM
（好ましくは５〜１０mM）のＭｇＣｌ2 、0.１〜１０mM
（好ましくは0.５〜2.０mM）のＡＴＰ、１〜５０mM（好
ましくは５〜１０mM）のジチオスレイトールを含む反応
液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ0.３〜１０単位を用い、１
〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時
間（好ましくは２〜２０時間）行う。
【００５３】結合反応によって生じた組換え体プラスミ
ドＤＮＡは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン(S.N. Cohen)ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci.)、USA, 69 , 2110(1972)〕に
よって、大腸菌に導入する。組換え体プラスミドＤＮＡ
を持つ大腸菌から該ＤＮＡの単離は、セシウム・クロラ
イド−エチジウム・ブロミド密度勾配超遠心法〔ディー
・ビー・クレウェル(D. B. Clewell) ら：プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)、USA 、62, 1159(196
9)〕あるいはバーンボイム(Birnboim)らの方法〔エイチ
・シー・バーンボイム(H.C.Birnboim)ら：ヌクレイック
・アシド・リサーチ(Nucleic Acids Res.) 7 , 1513(1
979)〕などを用いて行う。
ドＤＮＡは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン(S.N. Cohen)ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci.)、USA, 69 , 2110(1972)〕に
よって、大腸菌に導入する。組換え体プラスミドＤＮＡ
を持つ大腸菌から該ＤＮＡの単離は、セシウム・クロラ
イド−エチジウム・ブロミド密度勾配超遠心法〔ディー
・ビー・クレウェル(D. B. Clewell) ら：プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)、USA 、62, 1159(196
9)〕あるいはバーンボイム(Birnboim)らの方法〔エイチ
・シー・バーンボイム(H.C.Birnboim)ら：ヌクレイック
・アシド・リサーチ(Nucleic Acids Res.) 7 , 1513(1
979)〕などを用いて行う。
【００５４】プラスミドＤＮＡを制限酵素で消化後アガ
ロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電
気泳動により切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配
列を決定する必要がある時はマキサム・ギルバート法
〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス(Proc.Natl. Acad. Sci.), 74 ,5
60(1977) 〕またはＭ13ファージを用いたサンガー(Sang
er)法〔サンガー(Sanger)ら：プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Pro
c.Natl. Acad. Sci.), USA, 74, 5463(1977): アマーシ
ャム（Amersham)社 M13クローニング・アンド・シーク
エンシング・ハンドブック(cloning andsequencing ha
ndbook)〕によって決定する。本発明のペプチドは以下
のとおりに製造できる。すなわち、プラスミドを用いて
大腸菌Ｋ−１２、ｃ６００やＨＢ１０１を形質転換さ
せ、アンピシリン耐性のコロニーの中からプラスミドを
有する大腸菌を選びだす。プラスミドを有する大腸菌を
培地に培養することにより培養物中にペプチドを生成さ
せることができる。
ロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電
気泳動により切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配
列を決定する必要がある時はマキサム・ギルバート法
〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス(Proc.Natl. Acad. Sci.), 74 ,5
60(1977) 〕またはＭ13ファージを用いたサンガー(Sang
er)法〔サンガー(Sanger)ら：プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Pro
c.Natl. Acad. Sci.), USA, 74, 5463(1977): アマーシ
ャム（Amersham)社 M13クローニング・アンド・シーク
エンシング・ハンドブック(cloning andsequencing ha
ndbook)〕によって決定する。本発明のペプチドは以下
のとおりに製造できる。すなわち、プラスミドを用いて
大腸菌Ｋ−１２、ｃ６００やＨＢ１０１を形質転換さ
せ、アンピシリン耐性のコロニーの中からプラスミドを
有する大腸菌を選びだす。プラスミドを有する大腸菌を
培地に培養することにより培養物中にペプチドを生成さ
せることができる。
【００５５】ここで用いる培地としては大腸菌の生育な
らびにペプチドの生産に好適なものならば合成培地、天
然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、グルコ
ース、フラクトース、ラクトース、グリセロール、マン
ニトール、ソルビトールなどが、窒素源としては、ＮＨ
4Ｃｌ、（ＮＨ4)2ＳＯ 4 、カザミノ酸、酵母エキス、ポ
リペプトン、肉エキス、バクトトリプトン、コーン・ス
ティープ・リカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ
2ＨＰＯ4 、ＫＨ2ＰＯ4 、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ4 、ビタ
ミンＢ1 、ＭｇＣｌ2などが使用できる。
らびにペプチドの生産に好適なものならば合成培地、天
然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、グルコ
ース、フラクトース、ラクトース、グリセロール、マン
ニトール、ソルビトールなどが、窒素源としては、ＮＨ
4Ｃｌ、（ＮＨ4)2ＳＯ 4 、カザミノ酸、酵母エキス、ポ
リペプトン、肉エキス、バクトトリプトン、コーン・ス
ティープ・リカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ
2ＨＰＯ4 、ＫＨ2ＰＯ4 、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ4 、ビタ
ミンＢ1 、ＭｇＣｌ2などが使用できる。
【００５６】培養はｐＨ5.５〜8.５、温度１８〜４０℃
で通気撹拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培
養菌体中にペプチドが蓄積するので、培養物から菌体を
集菌し、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰り返
して菌体を破砕し、遠心して得られる上清から通常のペ
プチドの抽出方法に従ってペプチドを採取する。また該
ペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ(Laemmli) のサ
ンプルバッファー〔レムリ(Laemmli) 、ネイチャー(Nat
ure)、227 , 680 (1970)〕に加熱、溶解後、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル〔レムリ(Laemmli) の方法：同上
文献〕にかけ、クマシブリリアントブルー(Coomassie
Brilliant Blue) 色素〔バイオ・ラッド(Bio-Rad) 社
製）を用いて染色して行った。
で通気撹拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培
養菌体中にペプチドが蓄積するので、培養物から菌体を
集菌し、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰り返
して菌体を破砕し、遠心して得られる上清から通常のペ
プチドの抽出方法に従ってペプチドを採取する。また該
ペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ(Laemmli) のサ
ンプルバッファー〔レムリ(Laemmli) 、ネイチャー(Nat
ure)、227 , 680 (1970)〕に加熱、溶解後、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル〔レムリ(Laemmli) の方法：同上
文献〕にかけ、クマシブリリアントブルー(Coomassie
Brilliant Blue) 色素〔バイオ・ラッド(Bio-Rad) 社
製）を用いて染色して行った。
【００５７】以下に本発明の実施例を示す。 実施例1. ＤＮＡ３〜６、１３および１４の製造：ＤＮＡ３〜６、
１３および１４の合成はリン酸アミダイド法による固相
合成法〔S. L. Beaucageら、テトラヘドロン・レターズ
〔Tetrahedron Lett.) 22 ,1859(1981)、L.J. McBrie
ら、同24, 245(1983) 〕に従い、アプライドバイオシ
ステム社のＤＮＡ自動合成機３８０Ａを用いて下記のと
おり行った。
１３および１４の合成はリン酸アミダイド法による固相
合成法〔S. L. Beaucageら、テトラヘドロン・レターズ
〔Tetrahedron Lett.) 22 ,1859(1981)、L.J. McBrie
ら、同24, 245(1983) 〕に従い、アプライドバイオシ
ステム社のＤＮＡ自動合成機３８０Ａを用いて下記のと
おり行った。
【００５８】シリカゲルを固相担体とし、これに３’水
酸基を介して結合したヌクレオチドの５’水酸基に(1)
ヌクレオチドをリン酸アミダイド法で縮合し、(2)縮合
したヌクレオチドの亜リン酸結合を沃素で酸化してリン
酸結合にし、(3)縮合したヌクレオチドの５’水酸基上
の保護基をトリフルオロ酢酸で除去した。次に(1)の工
程に戻って次のヌクレオチドを同様に縮合した。こうし
て(1)〜(3)の工程が繰り返されてＤＮＡが担体上に合成
された。合成終了後、ＤＮＡの結合した担体をチオフェ
ノール溶液中に室温で１時間放置してリン酸の保護基を
除去した後、濃アンモニア水中に室温で１時間放置して
ＤＮＡを担体から遊離させた。ＤＮＡを含む濃アンモニ
ア水を密封容器中６０℃にて１２時間加熱して塩基上の
保護基を除去した。
酸基を介して結合したヌクレオチドの５’水酸基に(1)
ヌクレオチドをリン酸アミダイド法で縮合し、(2)縮合
したヌクレオチドの亜リン酸結合を沃素で酸化してリン
酸結合にし、(3)縮合したヌクレオチドの５’水酸基上
の保護基をトリフルオロ酢酸で除去した。次に(1)の工
程に戻って次のヌクレオチドを同様に縮合した。こうし
て(1)〜(3)の工程が繰り返されてＤＮＡが担体上に合成
された。合成終了後、ＤＮＡの結合した担体をチオフェ
ノール溶液中に室温で１時間放置してリン酸の保護基を
除去した後、濃アンモニア水中に室温で１時間放置して
ＤＮＡを担体から遊離させた。ＤＮＡを含む濃アンモニ
ア水を密封容器中６０℃にて１２時間加熱して塩基上の
保護基を除去した。
【００５９】ＤＮＡ３を例にとると、１μM のヌクレオ
チドの結合した担体を用いて合成を行い通算収率８１％
で縮合反応を完了し、次いで保護基の除去と固相からの
遊離反応を行ってＤＮＡ３の粗生成物242 0.D.単位（２
６０nmで測定）を得た。この粗生成物の22 0.D.単位を
７Ｍ尿素を含むトリス−硼酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて
１０％ポリアクリルアミドゲル（２mm厚、１３cm×１３
cm）の電気泳動で精製し、ＤＮＡ３を含むゲルの領域を
とり、0.2 Ｍ炭酸トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ８）
（以下ＴＥＡＢという）１mlでＤＮＡ３を１８時間かけ
て抽出し、ついでその抽出液をセファデックス ＤＥ５
２のカラム（径６mm、長さ５mm）に通してＤＮＡ３を吸
着させた。２Ｍ ＴＥＡＢ２mlで溶出して3.９ 0.D.単
位のＤＮＡ３の純品を得た。
チドの結合した担体を用いて合成を行い通算収率８１％
で縮合反応を完了し、次いで保護基の除去と固相からの
遊離反応を行ってＤＮＡ３の粗生成物242 0.D.単位（２
６０nmで測定）を得た。この粗生成物の22 0.D.単位を
７Ｍ尿素を含むトリス−硼酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて
１０％ポリアクリルアミドゲル（２mm厚、１３cm×１３
cm）の電気泳動で精製し、ＤＮＡ３を含むゲルの領域を
とり、0.2 Ｍ炭酸トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ８）
（以下ＴＥＡＢという）１mlでＤＮＡ３を１８時間かけ
て抽出し、ついでその抽出液をセファデックス ＤＥ５
２のカラム（径６mm、長さ５mm）に通してＤＮＡ３を吸
着させた。２Ｍ ＴＥＡＢ２mlで溶出して3.９ 0.D.単
位のＤＮＡ３の純品を得た。
【００６０】ＤＮＡ３以外のＤＮＡも同程度の収率で合
成された。これらＤＮＡの５’水酸基をファージＴ４ポ
リヌチレオチドキナーゼと〔γ− 32Ｐ〕ＡＴＰを用いる
常法〔A. M. Maxam ら、メソッヅ・イン・エンチモロジ
イ（“Methods in Enzymology") Vol.65, PartＩ，p. 4
99, Academic Press(1980)〕でリン酸化して放射性ラベ
ルをつけた。ラベルをつけたＤＮＡを７Ｍ尿素を含むト
リス−硼酸緩衝液で２０％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、ＤＮＡの純度と鎖長を確認した。さらにラ
ベルをつけたＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバート
(Maxam-Gilbert) 法（前記文献）で決定し、各ＤＮＡが
所望の塩基配列を持つことを確認した。
成された。これらＤＮＡの５’水酸基をファージＴ４ポ
リヌチレオチドキナーゼと〔γ− 32Ｐ〕ＡＴＰを用いる
常法〔A. M. Maxam ら、メソッヅ・イン・エンチモロジ
イ（“Methods in Enzymology") Vol.65, PartＩ，p. 4
99, Academic Press(1980)〕でリン酸化して放射性ラベ
ルをつけた。ラベルをつけたＤＮＡを７Ｍ尿素を含むト
リス−硼酸緩衝液で２０％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、ＤＮＡの純度と鎖長を確認した。さらにラ
ベルをつけたＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバート
(Maxam-Gilbert) 法（前記文献）で決定し、各ＤＮＡが
所望の塩基配列を持つことを確認した。
【００６１】実施例2. プラスミドｐＭＴＡ１の作製： プラスミドｐＴｒＳ２０ ２μｇを制限酵素 ClaＩ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）１０単位、ＳａｃＩ（宝
酒造社製）１５単位を含む溶液〔10mMトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ7.５）、７mM ＭｇＣｌ2 、６mM ２−メルカプ
トエタノール〕３０μｌに溶解し、３７℃、２時間消化
反応を行った。この反応液をエチジウムブロミドを含む
アガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３０２n
m) で検出して約3.８kbのＤＮＡ７を含むゲル片を切り
出した。ゲル片にフェノール0.５mlを加えて凍結・溶解
し、水層をクロロホルム洗浄後、エタノール沈澱により
ＤＮＡ７を回収した。
ーリンガー・マンハイム社製）１０単位、ＳａｃＩ（宝
酒造社製）１５単位を含む溶液〔10mMトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ7.５）、７mM ＭｇＣｌ2 、６mM ２−メルカプ
トエタノール〕３０μｌに溶解し、３７℃、２時間消化
反応を行った。この反応液をエチジウムブロミドを含む
アガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３０２n
m) で検出して約3.８kbのＤＮＡ７を含むゲル片を切り
出した。ゲル片にフェノール0.５mlを加えて凍結・溶解
し、水層をクロロホルム洗浄後、エタノール沈澱により
ＤＮＡ７を回収した。
【００６２】ＤＮＡ３〜６各10pmole を各々Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ反応用緩衝液〔５０mM トリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ7.５）、10mM ＭｇＣｌ2 、５mMジチオスレ
イトール（以下ＤＴＴと略記する）、１mM ＡＴＰ、0.
１mMスペルミジン、0.１mMEDTA〕３０μｌに溶解し、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）３単位を加
え、３７℃４０分間にリン酸化反応を行った後、６５℃
で１５分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を４
μｌずつ混合し、上記で得たＤＮＡ７ 0.０８pmole を
加え、２８mM トリス−ＨＣｌ（pH7.５）、９mM Ｍｇ
Ｃｌ2 、１０mM ＤＴＴ、0.０３mM EDTA、0.７mM Ａ
ＴＰ、0.０３mM スペルミジンの組成になるよう調整
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）２単位を加え、
５０μｌとした。４℃で１６時間結合反応を行った。
クレオチドキナーゼ反応用緩衝液〔５０mM トリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ7.５）、10mM ＭｇＣｌ2 、５mMジチオスレ
イトール（以下ＤＴＴと略記する）、１mM ＡＴＰ、0.
１mMスペルミジン、0.１mMEDTA〕３０μｌに溶解し、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）３単位を加
え、３７℃４０分間にリン酸化反応を行った後、６５℃
で１５分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を４
μｌずつ混合し、上記で得たＤＮＡ７ 0.０８pmole を
加え、２８mM トリス−ＨＣｌ（pH7.５）、９mM Ｍｇ
Ｃｌ2 、１０mM ＤＴＴ、0.０３mM EDTA、0.７mM Ａ
ＴＰ、0.０３mM スペルミジンの組成になるよう調整
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）２単位を加え、
５０μｌとした。４℃で１６時間結合反応を行った。
【００６３】この反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株
〔ボリバー(Bolivar) ら；ジーン(Gene)、２、75(197
7)〕を Cohenらの方法〔エス・エヌ・コーエン(S. N.Co
hen)ら；プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i)、USA 69, 2110(1972)〕により形質転換し、アンピシ
リン耐性 (Apr) のコロニーを得た。このコロニーより
アルカリ処理法〔マニアティス(Maniatis)ら編；モレキ
ュラー・クローニング(Molecular Cloning) 、P. 368,
コールド・スプリングハーバー(Cold Spring Harbor)社
刊〕によってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴＡ１を
得た。ｐＭＴＡ１の構造は、ＢｇｌII、ＰｓｔＩ、Ｓａ
ｃＩ、ＢａｍＨＩで切断してアガロースゲル電気泳動に
より確認した。制限酵素の切断反応は 10mMトリス−Ｈ
Ｃｌ（pH7.５）、７mM ＭｇＣｌ2 、６mM ２−メルカ
プトエタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になる
よう０〜２００mM ＮａＣｌあるいはＫＣｌを加えて反
応液（制限酵素用反応液、以下ＮａＣｌまたはＫＣｌの
濃度だけを示す。）とした。
〔ボリバー(Bolivar) ら；ジーン(Gene)、２、75(197
7)〕を Cohenらの方法〔エス・エヌ・コーエン(S. N.Co
hen)ら；プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i)、USA 69, 2110(1972)〕により形質転換し、アンピシ
リン耐性 (Apr) のコロニーを得た。このコロニーより
アルカリ処理法〔マニアティス(Maniatis)ら編；モレキ
ュラー・クローニング(Molecular Cloning) 、P. 368,
コールド・スプリングハーバー(Cold Spring Harbor)社
刊〕によってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴＡ１を
得た。ｐＭＴＡ１の構造は、ＢｇｌII、ＰｓｔＩ、Ｓａ
ｃＩ、ＢａｍＨＩで切断してアガロースゲル電気泳動に
より確認した。制限酵素の切断反応は 10mMトリス−Ｈ
Ｃｌ（pH7.５）、７mM ＭｇＣｌ2 、６mM ２−メルカ
プトエタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になる
よう０〜２００mM ＮａＣｌあるいはＫＣｌを加えて反
応液（制限酵素用反応液、以下ＮａＣｌまたはＫＣｌの
濃度だけを示す。）とした。
【００６４】さらに、文献〔A. J. H. Smith、メソッヅ
・イン・エンチモロジイ("Methodsin Enzymology") 、e
d. by L. Grossmen and K. Moldave Vol. 65, p. 560(1
980) 、Academic Press) 記載の方法によって、ＤＮＡ
３〜６に由来する部分を含む１１５塩基の配列を決定し
て、目的とする13Leu-モチリン遺伝子を確認した。
・イン・エンチモロジイ("Methodsin Enzymology") 、e
d. by L. Grossmen and K. Moldave Vol. 65, p. 560(1
980) 、Academic Press) 記載の方法によって、ＤＮＡ
３〜６に由来する部分を含む１１５塩基の配列を決定し
て、目的とする13Leu-モチリン遺伝子を確認した。
【００６５】実施例3. プラスミドｐＭＴＡ２の作製： 実施例２で得たプラスミドｐＭＴＡ１ 0.２μｇを実施
例２に示した制限酵素用反応液（１００mM ＮａＣｌ）
１５μｌに溶解し、ＰｓｔＩ（宝酒造社製）６単位、Ｂ
ｇｌII（東洋醸造社製）６単位を加え３７℃で２時間消
化反応を行った。これを実施例２と同様のアガロースゲ
ル電気泳動で分画し、約2.８kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ
８）を得た。
例２に示した制限酵素用反応液（１００mM ＮａＣｌ）
１５μｌに溶解し、ＰｓｔＩ（宝酒造社製）６単位、Ｂ
ｇｌII（東洋醸造社製）６単位を加え３７℃で２時間消
化反応を行った。これを実施例２と同様のアガロースゲ
ル電気泳動で分画し、約2.８kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ
８）を得た。
【００６６】別にｐＭＴＡｌ 0.2μｇを制限酵素用反応
液（100 mM ＫＣｌ）１５μｌに溶解し、ＰｓｔＩ ６
単位、ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）６単位を加え３７℃で
２時間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動によ
りこれを分画し、約1.２kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ９）を
得た。こうして得たＤＮＡ８とＤＮＡ９を各々５０ngず
つ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液〔２０mM トリ
ス−ＨＣｌ（pH7.５）、10mM ＭｇＣｌ2 、10mM ＤＴ
Ｔ、0.３mMＡＴＰ〕３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）１単位を加えて４℃１８時間結合反
応を行った。この反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を
形質転換し、Apr のコロニーを得た。このコロニーより
プラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴＡ２を得た。このプ
ラスミドの構造は、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌIIで
切断し、アガロースゲル電気泳動により確認した。
液（100 mM ＫＣｌ）１５μｌに溶解し、ＰｓｔＩ ６
単位、ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）６単位を加え３７℃で
２時間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動によ
りこれを分画し、約1.２kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ９）を
得た。こうして得たＤＮＡ８とＤＮＡ９を各々５０ngず
つ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液〔２０mM トリ
ス−ＨＣｌ（pH7.５）、10mM ＭｇＣｌ2 、10mM ＤＴ
Ｔ、0.３mMＡＴＰ〕３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）１単位を加えて４℃１８時間結合反
応を行った。この反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を
形質転換し、Apr のコロニーを得た。このコロニーより
プラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴＡ２を得た。このプ
ラスミドの構造は、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌIIで
切断し、アガロースゲル電気泳動により確認した。
【００６７】実施例4. プラスミドｐＭＴＡ４の作製： 実施例３で得たプラスミドｐＭＴＡ２ 0.２μｇを実施
例３と同様に実施例２に示した制限酵素用反応液（100
mM ＮａＣｌ）１５μｌに溶解し、ＰｓｔＩ６単位、Ｂ
ｇｌII６単位を加え３７℃で２時間消化し、アガロース
ゲル電気泳動で分画し約2.８kbのＤＮＡ断片を得た。ま
た、ｐＭＴＡ２ 0.２μｇを制限酵素用反応液（100mM
ＫＣｌ）１５μｌに溶解し、ＰｓｔＩ６単位、ＢａｍＨ
Ｉ６単位を加え37℃で２時間消化し、アガロースゲル電
気泳動により分画して約1.3kb のＤＮＡ断片を得た。こ
れらのＤＮＡ断片を各々0.２pmole ずつ混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ用反応液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ１単位を加えて４℃１８時間結合反応させた。こ
の反応液で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Aprのコ
ロニーを得、プラスミドＤＮＡを回収しｐＭＴＡ４を得
た。このプラスミドの構造はＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂ
ｇｌIIで切断し、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。
例３と同様に実施例２に示した制限酵素用反応液（100
mM ＮａＣｌ）１５μｌに溶解し、ＰｓｔＩ６単位、Ｂ
ｇｌII６単位を加え３７℃で２時間消化し、アガロース
ゲル電気泳動で分画し約2.８kbのＤＮＡ断片を得た。ま
た、ｐＭＴＡ２ 0.２μｇを制限酵素用反応液（100mM
ＫＣｌ）１５μｌに溶解し、ＰｓｔＩ６単位、ＢａｍＨ
Ｉ６単位を加え37℃で２時間消化し、アガロースゲル電
気泳動により分画して約1.3kb のＤＮＡ断片を得た。こ
れらのＤＮＡ断片を各々0.２pmole ずつ混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ用反応液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ１単位を加えて４℃１８時間結合反応させた。こ
の反応液で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Aprのコ
ロニーを得、プラスミドＤＮＡを回収しｐＭＴＡ４を得
た。このプラスミドの構造はＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂ
ｇｌIIで切断し、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。
【００６８】実施例5. プラスミドｐＭＴＬ４の作製： プラスミドｐｓＧＨＩＭ１ １μｇを制限酵素用反応液
（100mM ＫＣｌ）３０μｌに溶解し、 PstＩ６単位、Ｂ
ａｍＨＩ６単位を加え、３７℃２時間消化反応させ、ア
ガロースゲル電気泳動で約2.1 kbのＤＮＡ断片を分画し
て回収した。
（100mM ＫＣｌ）３０μｌに溶解し、 PstＩ６単位、Ｂ
ａｍＨＩ６単位を加え、３７℃２時間消化反応させ、ア
ガロースゲル電気泳動で約2.1 kbのＤＮＡ断片を分画し
て回収した。
【００６９】プラスミドｐＧＨＤ７ １μｇをｐｓＧＨ
ＩＭ１と同様にＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩで消化し、約1.7
kbのＤＮＡ断片を回収した。これらのＤＮＡ断片を0.０
３pmole ずつ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０
μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加えて４℃
１８時間結合反応させ、この反応液で大腸菌ＨＢ１０１
株を形質転換し、Apr のコロニーを得てプラスミドＤＮ
Ａを回収しｐｓＧＨＩＭＥ１を得た。
ＩＭ１と同様にＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩで消化し、約1.7
kbのＤＮＡ断片を回収した。これらのＤＮＡ断片を0.０
３pmole ずつ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０
μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加えて４℃
１８時間結合反応させ、この反応液で大腸菌ＨＢ１０１
株を形質転換し、Apr のコロニーを得てプラスミドＤＮ
Ａを回収しｐｓＧＨＩＭＥ１を得た。
【００７０】こうして得たプラスミドｐｓＧＨＩＭＥ１
0.5μｇを制限酵素用反応液（ＮａＣｌ、ＫＣｌは加え
ない）３０μｌに溶解し、ＳａｃＩ（宝酒造社製）50単
位を加え、３７℃で２時間消化反応させた。次に２Ｍ
ＮａＣｌを２μｌ添加し、ＢｇｌII 15単位を加え３７
℃で２時間消化反応を続けた。これをアガロースゲル電
気泳動で分画し、約3.２kbのＤＮＡ断片を回収した。
0.5μｇを制限酵素用反応液（ＮａＣｌ、ＫＣｌは加え
ない）３０μｌに溶解し、ＳａｃＩ（宝酒造社製）50単
位を加え、３７℃で２時間消化反応させた。次に２Ｍ
ＮａＣｌを２μｌ添加し、ＢｇｌII 15単位を加え３７
℃で２時間消化反応を続けた。これをアガロースゲル電
気泳動で分画し、約3.２kbのＤＮＡ断片を回収した。
【００７１】実施例４で得たｐＭＴＡ４ 0.５μｇをｐ
ｓＧＨＩＭＥ１と全く同様にＳａｃＩ消化後ＢｇｌII消
化し、アガロースゲル電気泳動で約0.３kbのＤＮＡ断片
を回収した。これらのＤＮＡ断片を0.０３pmole ずつ混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０μｌに溶解し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加えて４℃１５時間結合反
応を行い、この反応液で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
しApr のコロニーを得てプラスミドＤＮＡを回収しｐＭ
ＴＬ４を得た。
ｓＧＨＩＭＥ１と全く同様にＳａｃＩ消化後ＢｇｌII消
化し、アガロースゲル電気泳動で約0.３kbのＤＮＡ断片
を回収した。これらのＤＮＡ断片を0.０３pmole ずつ混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０μｌに溶解し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加えて４℃１５時間結合反
応を行い、この反応液で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
しApr のコロニーを得てプラスミドＤＮＡを回収しｐＭ
ＴＬ４を得た。
【００７２】実施例6. プラスミドｐＭＴＮ４の作製： 実施例５で得たプラスミドｐＭＴＬ４の1.５μｇを制限
酵素用反応液（100mMＮａＣｌ）２０μｌに溶解し、Ｐ
ｓｔＩ ８単位、ＢｇｌII ７単位を加え、３７℃で２
時間消化反応させ、アガロースゲル電気泳動で分画して
約2.２kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ１５）を回収した。ま
た、ｐＭＴＬ４を制限酵素用反応液（100mM ＮａＣｌ）
２０μｌに溶解し、ＰｓｔＩ８単位とＨｉｎｄIII（宝
酒造社製）６単位を加えて３７℃で２時間消化反応さ
せ、アガロースゲル電気泳動で分画し約1.０kbのＤＮＡ
断片（ＤＮＡ１６）を回収した。
酵素用反応液（100mMＮａＣｌ）２０μｌに溶解し、Ｐ
ｓｔＩ ８単位、ＢｇｌII ７単位を加え、３７℃で２
時間消化反応させ、アガロースゲル電気泳動で分画して
約2.２kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ１５）を回収した。ま
た、ｐＭＴＬ４を制限酵素用反応液（100mM ＮａＣｌ）
２０μｌに溶解し、ＰｓｔＩ８単位とＨｉｎｄIII（宝
酒造社製）６単位を加えて３７℃で２時間消化反応さ
せ、アガロースゲル電気泳動で分画し約1.０kbのＤＮＡ
断片（ＤＮＡ１６）を回収した。
【００７３】ＤＮＡ１５とＤＮＡ１６の各２１pmole を
実施例２に示したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応用
緩衝液５０μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ４単位を加え、３７℃４０分間リン酸化反応を行った
後、６５℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。この
反応液２μｌずつを混合し、ＤＮＡ１５および１６を加
え、２８mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５）、９mM ＭｇＣ
ｌ2 、１０mM ＤＴＴ、0.０３mM ＥＤＴＡ、0.７mM
ＡＴＰ、0.０３mMスペルミジンの組成になるよう調整
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４０μｌとし
た。４℃で１６時間結合反応を行った。この反応液を用
いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Aprコロニーを
得てプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴＮ４を得た。
実施例２に示したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応用
緩衝液５０μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ４単位を加え、３７℃４０分間リン酸化反応を行った
後、６５℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。この
反応液２μｌずつを混合し、ＤＮＡ１５および１６を加
え、２８mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５）、９mM ＭｇＣ
ｌ2 、１０mM ＤＴＴ、0.０３mM ＥＤＴＡ、0.７mM
ＡＴＰ、0.０３mMスペルミジンの組成になるよう調整
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４０μｌとし
た。４℃で１６時間結合反応を行った。この反応液を用
いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Aprコロニーを
得てプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴＮ４を得た。
【００７４】実施例7. プラスミドｐＭＴＯ４の作製： プラスミドｐＭＴＮ４ 2.5μｇをTritonX 0.01％を含
む制限酵素用反応液（ＮａＣｌ、ＫＣｌは加えない）４
０μｌに溶解し、ＳａｃＩ １２単位を加え、３７℃２
時間消化反応を行った。この反応液をフェノール−クロ
ロホルム抽出後エタノール沈澱によりＳａｃＩ切断した
ｐＭＴＮ４を回収し、20mMトリス−ＨＣｌ（pH7.８）、
７mM ＭｇＣｌ2、６mM ２−メルカプトエタノール、ｄ
ＮＴＰ（dATP、dTTP、dCTP、dGTP) 各0.２５mMの組成の
溶液40μｌに溶解し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Kl
enowフラグメント（宝酒造社製）４単位を加えて２０
℃，１時間反応を行った。この反応液をフェノール−ク
ロロホルム抽出後、エタノール沈澱でポリメラーゼ処理
したｐＭＴＮ４断片を回収した。これを制限酵素用反応
液（100mM ＮａＣｌ）３０μｌに溶解し、ＰｓｔＩ ５
単位を加え２時間消化反応を行い、アガロースゲル電気
泳動により分画して約1.３kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２
０）を得た。
む制限酵素用反応液（ＮａＣｌ、ＫＣｌは加えない）４
０μｌに溶解し、ＳａｃＩ １２単位を加え、３７℃２
時間消化反応を行った。この反応液をフェノール−クロ
ロホルム抽出後エタノール沈澱によりＳａｃＩ切断した
ｐＭＴＮ４を回収し、20mMトリス−ＨＣｌ（pH7.８）、
７mM ＭｇＣｌ2、６mM ２−メルカプトエタノール、ｄ
ＮＴＰ（dATP、dTTP、dCTP、dGTP) 各0.２５mMの組成の
溶液40μｌに溶解し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Kl
enowフラグメント（宝酒造社製）４単位を加えて２０
℃，１時間反応を行った。この反応液をフェノール−ク
ロロホルム抽出後、エタノール沈澱でポリメラーゼ処理
したｐＭＴＮ４断片を回収した。これを制限酵素用反応
液（100mM ＮａＣｌ）３０μｌに溶解し、ＰｓｔＩ ５
単位を加え２時間消化反応を行い、アガロースゲル電気
泳動により分画して約1.３kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２
０）を得た。
【００７５】プラスミドｐＡｒｇＥｌ ２μｇを制限酵
素用反応液（150mM ＮａＣｌ）２０μｌに溶解し、 Pst
Ｉ １０単位、EcoRＶ（宝酒造社製）１０単位を加えて
３７℃２時間消化反応を行い、アガロースゲル電気泳動
により分画して約1.７kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ１９）を
得た。このＤＮＡ１９とＤＮＡ２０を各々0.０６pmole
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液２５μｌに溶解
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３単位を加え４℃２０時間結合
反応させた。この反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を
形質転換し、Apr のコロニーを得た。このコロニーより
プラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴＯ４を得た。ｐＭＴ
Ｏ４の構造はＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、Ｓ
ａｌＩ、ＢｇｌII、ＭｌｕＩで切断して確認した。
素用反応液（150mM ＮａＣｌ）２０μｌに溶解し、 Pst
Ｉ １０単位、EcoRＶ（宝酒造社製）１０単位を加えて
３７℃２時間消化反応を行い、アガロースゲル電気泳動
により分画して約1.７kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ１９）を
得た。このＤＮＡ１９とＤＮＡ２０を各々0.０６pmole
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液２５μｌに溶解
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３単位を加え４℃２０時間結合
反応させた。この反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を
形質転換し、Apr のコロニーを得た。このコロニーより
プラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴＯ４を得た。ｐＭＴ
Ｏ４の構造はＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、Ｓ
ａｌＩ、ＢｇｌII、ＭｌｕＩで切断して確認した。
【００７６】実施例8. プラスミドｐＭＴＯＩ４の作
製： プラスミドｐＭＴＯ４ ２μｇを制限酵素反応液（100m
M ＮａＣｌ）３０μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII６単位、
ｐｓｔＩ６単位を加え、３７℃２時間消化反応させ、ア
ガロースゲル電気泳動で分画し、13Leu-モチリン重合体
遺伝子を含む約3.０kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２１）を回
収した。また、プラスミドｐＫＹＰ１０（特開昭５８−
110600) ３μｇを制限酵素反応液（100mM ＮａＣｌ）３
０μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII９単位およびＰｓｔＩ９
単位を加え、３７℃２時間消化反応を行い、アガロース
ゲル電気泳動で分画し、プロモーターを含む約1.１kbの
ＤＮＡ断片（ＤＮＡ２２）を回収した。これらのＤＮＡ
断片約0.１μｇずつをＴ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０
μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加えて４℃
１８時間結合反応させた。この反応液で大腸菌ＨＢ１０
１株を形質転換し、得られたApr のコロニーからプラス
ミドＤＮＡを回収し、トリプトファンプロモーターをも
つ13Leu −モチリン重合体発現プラスミドｐＭＴＯＩ４
を得た。ｐＭＴＯＩ４の構造は、ＰｓｔＩ、ＢａｎII
I、ＨｉｎｄIII、ＭｌｕＩで切断して確認した。図９参
照
製： プラスミドｐＭＴＯ４ ２μｇを制限酵素反応液（100m
M ＮａＣｌ）３０μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII６単位、
ｐｓｔＩ６単位を加え、３７℃２時間消化反応させ、ア
ガロースゲル電気泳動で分画し、13Leu-モチリン重合体
遺伝子を含む約3.０kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２１）を回
収した。また、プラスミドｐＫＹＰ１０（特開昭５８−
110600) ３μｇを制限酵素反応液（100mM ＮａＣｌ）３
０μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII９単位およびＰｓｔＩ９
単位を加え、３７℃２時間消化反応を行い、アガロース
ゲル電気泳動で分画し、プロモーターを含む約1.１kbの
ＤＮＡ断片（ＤＮＡ２２）を回収した。これらのＤＮＡ
断片約0.１μｇずつをＴ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０
μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加えて４℃
１８時間結合反応させた。この反応液で大腸菌ＨＢ１０
１株を形質転換し、得られたApr のコロニーからプラス
ミドＤＮＡを回収し、トリプトファンプロモーターをも
つ13Leu −モチリン重合体発現プラスミドｐＭＴＯＩ４
を得た。ｐＭＴＯＩ４の構造は、ＰｓｔＩ、ＢａｎII
I、ＨｉｎｄIII、ＭｌｕＩで切断して確認した。図９参
照
【００７７】実施例9. プラスミドｐＭＴＯII４の作
製： プラスミドｐＭＴＯ４ ２μｇを制限酵素反応液（100m
M ＮａＣｌ）３０μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII６単位お
よびＰｓｔＩ６単位を加え、３７℃２時間消化反応させ
た。アガロースゲル電気泳動で分画し、13Leu-モチリン
重合体遺伝子を含む約3.０kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２
１）を回収した。また、プラスミドｐＧＥＬ１（特開昭
６１−９３１９７）３μｇを制限酵素反応液（100 mM
ＮａＣｌ）３０μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII９単位およ
びＰｓｔＩ９単位を加え、３７℃２時間消化反応を行っ
た。アガロースゲル電気泳動で分画し、プロモーターを
含む約1.１kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２３）を回収した。
これらのＤＨＡ断片約0.１μｇずつをＴ４ＤＮＡリガー
ゼ用反応液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単
位を加えて４℃１８時間結合反応させた。この反応液で
大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られたApr のコロ
ニーからプラスミドＤＮＡを回収し、２連結トリプトフ
ァンプロモーターをもちＳＤ配列と ATG開始コドンの間
の距離が１４塩基の13Leu-モチリン重合体発現プラスミ
ドｐＭＴＯII４を得た。pMTOII４の構造はＰｓｔＩ、Ｂ
ａｎIII、ＨｉｎｄIII、ＭｌｕＩで切断して確認した。
図１０参照。
製： プラスミドｐＭＴＯ４ ２μｇを制限酵素反応液（100m
M ＮａＣｌ）３０μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII６単位お
よびＰｓｔＩ６単位を加え、３７℃２時間消化反応させ
た。アガロースゲル電気泳動で分画し、13Leu-モチリン
重合体遺伝子を含む約3.０kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２
１）を回収した。また、プラスミドｐＧＥＬ１（特開昭
６１−９３１９７）３μｇを制限酵素反応液（100 mM
ＮａＣｌ）３０μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII９単位およ
びＰｓｔＩ９単位を加え、３７℃２時間消化反応を行っ
た。アガロースゲル電気泳動で分画し、プロモーターを
含む約1.１kbのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２３）を回収した。
これらのＤＨＡ断片約0.１μｇずつをＴ４ＤＮＡリガー
ゼ用反応液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単
位を加えて４℃１８時間結合反応させた。この反応液で
大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られたApr のコロ
ニーからプラスミドＤＮＡを回収し、２連結トリプトフ
ァンプロモーターをもちＳＤ配列と ATG開始コドンの間
の距離が１４塩基の13Leu-モチリン重合体発現プラスミ
ドｐＭＴＯII４を得た。pMTOII４の構造はＰｓｔＩ、Ｂ
ａｎIII、ＨｉｎｄIII、ＭｌｕＩで切断して確認した。
図１０参照。
【００７８】実施例１0. プラスミドｐＭＴＯIII４の
作製： プラスミドｐＭＴＯ４ ２μｇを制限酵素反応液 (100
mM ＮａＣｌ）30μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII６単位お
よびＰｓｔＩ６単位を加え、３７℃２時間消化反応させ
た。アガロースゲル電気泳動で分画し、13Leu-モチリン
重合体遺伝子を含む約3.０kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、プラスミドpGHA2 （特開昭６０−２２１０９１）
３μｇを制限酵素反応液（100mM ＮａＣｌ）３０に溶解
し、HindIII９単位およびＰｓｔＩ９単位を加え、３７
℃２時間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動で
分画し、プロモーターを含む約0.９kbのＤＮＡ断片を回
収した。これらのＤＮＡ断片約0.１μｇずつをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ用反応液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ１単位を加えて４℃１８時間結合反応させた。この
反応液で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られたAp
rのコロニーからプラスミドＤＮＡを回収し、ｌetプロ
モーターをもつ13Leu-モチリン重合体発現プラスミドｐ
ＭＴＯIII４を得た。ｐＭＴＯIII４の構造は、ｐｓｔ
Ｉ、ＢａｎIII、ＨｉｎｄIII、ＭｌｕＩ、ＢｇｌIIで切
断して確認した。図１１参照。
作製： プラスミドｐＭＴＯ４ ２μｇを制限酵素反応液 (100
mM ＮａＣｌ）30μｌに溶解し、ＨｉｎｄIII６単位お
よびＰｓｔＩ６単位を加え、３７℃２時間消化反応させ
た。アガロースゲル電気泳動で分画し、13Leu-モチリン
重合体遺伝子を含む約3.０kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、プラスミドpGHA2 （特開昭６０−２２１０９１）
３μｇを制限酵素反応液（100mM ＮａＣｌ）３０に溶解
し、HindIII９単位およびＰｓｔＩ９単位を加え、３７
℃２時間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動で
分画し、プロモーターを含む約0.９kbのＤＮＡ断片を回
収した。これらのＤＮＡ断片約0.１μｇずつをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ用反応液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ１単位を加えて４℃１８時間結合反応させた。この
反応液で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られたAp
rのコロニーからプラスミドＤＮＡを回収し、ｌetプロ
モーターをもつ13Leu-モチリン重合体発現プラスミドｐ
ＭＴＯIII４を得た。ｐＭＴＯIII４の構造は、ｐｓｔ
Ｉ、ＢａｎIII、ＨｉｎｄIII、ＭｌｕＩ、ＢｇｌIIで切
断して確認した。図１１参照。
【００７９】実施例１1. プラスミドｐＭＴＯ４を用い
た大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生産： 実施例７で得られたｐＭＴＯ４を用いて大腸菌Ｗ３１１
０ strA 株（FERM BP-732)を形質転換した。得られたAp
r コロニーを８mlのＬＧ培地（１％バクトトリプトン、
0.５％酵母エキス、0.５％ ＮａＣｌ、0.１％ グルコ
ース、５０μｇ／mlトリプトファン、50μｇ／ml アン
ピシリン、ｐＨ7.5) に接種し、30℃１６時間培養し
た。この培養液４００μｌを１０mlのMCG 培地（0.6％
Na2HPO4、0.3％ KH2PO4 、0.5 ％ ＮａＣｌ、0.1 ％
ＮＨ4Ｃｌ、0.5 ％グルコース、0.5 ％カザミノ酸、１
mM MgSO4 、４μｇ／ml ビタミンＢ1 、pH7.2) に５
０μｇ／mlトリプトファンおよび５０μｇ／mlのアンピ
シリンを添加した培地に接種し、３０℃で培養した。培
養液の濁度（ＯＤ550)を測定し0.９に達した時点（約４
時間後）で、インドール酢酸 200μｇを加え、さらに培
養を４時間継続した。培養液を7,000 rpm 、５分間遠心
して菌体を回収した。この菌体をレムリらの方法〔レム
リ(Laemmli) ら；ネイチャー(Nature), 227 , 680(197
0) 〕におけるサンプルバッファーに溶解、加熱後、同
法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した結
果、分子量約15,000の部位にポリペプチドバンドを検出
した。ｐＭＴＯ４を含まない大腸菌Ｗ３１１０strA株に
は相当するバンドは存在しなかったのでｐＭＴＯ４を保
有する大腸菌Ｗ３１１０ strA がシロザケ成長ホルモン
の一部分と融合した13Leu-モチリン重合体蛋白質を生産
していることが明らかになった。
た大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生産： 実施例７で得られたｐＭＴＯ４を用いて大腸菌Ｗ３１１
０ strA 株（FERM BP-732)を形質転換した。得られたAp
r コロニーを８mlのＬＧ培地（１％バクトトリプトン、
0.５％酵母エキス、0.５％ ＮａＣｌ、0.１％ グルコ
ース、５０μｇ／mlトリプトファン、50μｇ／ml アン
ピシリン、ｐＨ7.5) に接種し、30℃１６時間培養し
た。この培養液４００μｌを１０mlのMCG 培地（0.6％
Na2HPO4、0.3％ KH2PO4 、0.5 ％ ＮａＣｌ、0.1 ％
ＮＨ4Ｃｌ、0.5 ％グルコース、0.5 ％カザミノ酸、１
mM MgSO4 、４μｇ／ml ビタミンＢ1 、pH7.2) に５
０μｇ／mlトリプトファンおよび５０μｇ／mlのアンピ
シリンを添加した培地に接種し、３０℃で培養した。培
養液の濁度（ＯＤ550)を測定し0.９に達した時点（約４
時間後）で、インドール酢酸 200μｇを加え、さらに培
養を４時間継続した。培養液を7,000 rpm 、５分間遠心
して菌体を回収した。この菌体をレムリらの方法〔レム
リ(Laemmli) ら；ネイチャー(Nature), 227 , 680(197
0) 〕におけるサンプルバッファーに溶解、加熱後、同
法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した結
果、分子量約15,000の部位にポリペプチドバンドを検出
した。ｐＭＴＯ４を含まない大腸菌Ｗ３１１０strA株に
は相当するバンドは存在しなかったのでｐＭＴＯ４を保
有する大腸菌Ｗ３１１０ strA がシロザケ成長ホルモン
の一部分と融合した13Leu-モチリン重合体蛋白質を生産
していることが明らかになった。
【００８０】実施例１2. プラスミドｐＭＴＯＩ４を用
いた大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生産： 実施例８で得られたｐＭＴＯＩ４を用いて大腸菌Ｗ３１
１０strA株を形質転換した。得られたApr コロニーを実
施例１１と同様の培養方法で培養し、培養液を７０００
rpm ５分間遠心して菌体を回収した。この菌体をレムリ
らの方法におけるサンプルバッファーに溶解、加熱後、
同法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した
結果、分子量約15,000の部位にポリペプチドバンドを検
出した。ｐＭＴＯＩ４を含まない大腸菌Ｗ３１１０strA
株には相当するバンドは存在しなかったので、ｐＭＴＯ
４を保有する大腸菌Ｗ３１１０strAがシロザケ成長ホル
モンの一部分と融合した13Leu-モチリン重合体蛋白質を
生産していること明らかになった。
いた大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生産： 実施例８で得られたｐＭＴＯＩ４を用いて大腸菌Ｗ３１
１０strA株を形質転換した。得られたApr コロニーを実
施例１１と同様の培養方法で培養し、培養液を７０００
rpm ５分間遠心して菌体を回収した。この菌体をレムリ
らの方法におけるサンプルバッファーに溶解、加熱後、
同法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した
結果、分子量約15,000の部位にポリペプチドバンドを検
出した。ｐＭＴＯＩ４を含まない大腸菌Ｗ３１１０strA
株には相当するバンドは存在しなかったので、ｐＭＴＯ
４を保有する大腸菌Ｗ３１１０strAがシロザケ成長ホル
モンの一部分と融合した13Leu-モチリン重合体蛋白質を
生産していること明らかになった。
【００８１】実施例１3. プラスミドｐＭＴＯII４を用
いた大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生産： 実施例９で得られたｐＭＴＯII４を用いて大腸菌Ｗ３１
１０strA株を形質転換した。得られたApr コロニーを実
施例１２と同様の培養方法で培養し、培養液を７０００
rpm ５分間遠心して菌体を回収した。この菌体をレムリ
らの方法におけるサンプルバッファーに溶解、加熱後、
同法に従ってSDS −ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した結
果、分子量約15,000の部位にポリペプチドバンドを検出
した。ｐＭＴＯII４を含まない大腸菌W3110 strA 株に
は相当するバンドは存在しなかったので、ＰＭＴＯ４を
保有する大腸菌 W3110strAがシロザケ成長ホルモンの一
部分と融合した13Leu-モチリン重合体蛋白質を生産して
いることが明らかになった。
いた大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生産： 実施例９で得られたｐＭＴＯII４を用いて大腸菌Ｗ３１
１０strA株を形質転換した。得られたApr コロニーを実
施例１２と同様の培養方法で培養し、培養液を７０００
rpm ５分間遠心して菌体を回収した。この菌体をレムリ
らの方法におけるサンプルバッファーに溶解、加熱後、
同法に従ってSDS −ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した結
果、分子量約15,000の部位にポリペプチドバンドを検出
した。ｐＭＴＯII４を含まない大腸菌W3110 strA 株に
は相当するバンドは存在しなかったので、ＰＭＴＯ４を
保有する大腸菌 W3110strAがシロザケ成長ホルモンの一
部分と融合した13Leu-モチリン重合体蛋白質を生産して
いることが明らかになった。
【００８２】実施例１4. プラスミドｐＭＴＯIII４を
用いた大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生
産： 実施例１１で得られたｐＭＴＯIII４を用いて大腸菌 W3
110strA株を形質転換した。得られたApr コロニーを実
施例１２と同様の培養方法で培養し、培養液を７０００
rpm ５分間遠心して菌体を回収した。この菌体をレムリ
らの方法におけるサンプルバッファーに溶解、加熱後、
同法に従って SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した結
果、分子量約15,000の部位にポリペプチドバンドを検出
した。ｐＭＴＯIII４を含まない大腸菌W3110 strA株に
は相当するバンドは存在しなかったので、ｐＭＴＯ４を
保有する大腸菌 W3110strA株がシロザケ成長ホルモンの
一部分と融合した13Leu-モチリン重合体蛋白質を生産し
ていることが明らかになった。
用いた大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生
産： 実施例１１で得られたｐＭＴＯIII４を用いて大腸菌 W3
110strA株を形質転換した。得られたApr コロニーを実
施例１２と同様の培養方法で培養し、培養液を７０００
rpm ５分間遠心して菌体を回収した。この菌体をレムリ
らの方法におけるサンプルバッファーに溶解、加熱後、
同法に従って SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した結
果、分子量約15,000の部位にポリペプチドバンドを検出
した。ｐＭＴＯIII４を含まない大腸菌W3110 strA株に
は相当するバンドは存在しなかったので、ｐＭＴＯ４を
保有する大腸菌 W3110strA株がシロザケ成長ホルモンの
一部分と融合した13Leu-モチリン重合体蛋白質を生産し
ていることが明らかになった。
【００８３】実施例１5. プラスミドｐＭＴＮ４を用い
た大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生産と精
製： 実施例６によって得られたｐＭＴＮ４を用いて大腸 W31
10strA株を形質転換した。得られたApr のコロニーを８
mlのＬＧ培地に接種し、３０℃で８時間培養し、この一
部を１０mlのＬＧ培地に接種し、３０℃で１６時間培養
した。これを１lのＭＣＧ培地に１００μｇ／mlのトリ
プトファンおよび５０μｇ／mlのアンピシリンを添加し
た培地に接種し、ジャーファーメンターで３０℃４８時
間培養した。
た大腸菌による13Leu-モチリン重合体蛋白質の生産と精
製： 実施例６によって得られたｐＭＴＮ４を用いて大腸 W31
10strA株を形質転換した。得られたApr のコロニーを８
mlのＬＧ培地に接種し、３０℃で８時間培養し、この一
部を１０mlのＬＧ培地に接種し、３０℃で１６時間培養
した。これを１lのＭＣＧ培地に１００μｇ／mlのトリ
プトファンおよび５０μｇ／mlのアンピシリンを添加し
た培地に接種し、ジャーファーメンターで３０℃４８時
間培養した。
【００８４】この培養液１００mlをとり、７０００rpm
で遠心して菌体を回収した。この菌体をＰＳＧ（97mM
リン酸二ナトリウム、1.５mM リン酸二水素カリウム、
１３７mM ＮａＣｌ、2.７mM ＫＣｌ）で洗浄した後60
mlのＰＢＳに溶解し、超音波（30分間）により菌体を破
砕した。10,000rpm で４０分間遠心して沈澱をとり、２
０mMのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.０）3.４８mlに
溶し、蒸留水３ml、1.５Ｍ ＮａＣｌ 3.６ml、パーコ
ール（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）25ml
を加え、１５分間17,000rpm で遠心した。沈澱はパーコ
ールの密度勾配に従い２つに分画されるので、密度の高
い分画を回収した。これに蒸留水を５倍量加えて11,000
rpm で７分間遠心し沈澱を得、さらに蒸留水で洗浄し４
７mgの顆粒を得た。蛋白質はプロテイン・アッセイキッ
ト（バイオ・ラッド社製）を用いて定量した。
で遠心して菌体を回収した。この菌体をＰＳＧ（97mM
リン酸二ナトリウム、1.５mM リン酸二水素カリウム、
１３７mM ＮａＣｌ、2.７mM ＫＣｌ）で洗浄した後60
mlのＰＢＳに溶解し、超音波（30分間）により菌体を破
砕した。10,000rpm で４０分間遠心して沈澱をとり、２
０mMのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.０）3.４８mlに
溶し、蒸留水３ml、1.５Ｍ ＮａＣｌ 3.６ml、パーコ
ール（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）25ml
を加え、１５分間17,000rpm で遠心した。沈澱はパーコ
ールの密度勾配に従い２つに分画されるので、密度の高
い分画を回収した。これに蒸留水を５倍量加えて11,000
rpm で７分間遠心し沈澱を得、さらに蒸留水で洗浄し４
７mgの顆粒を得た。蛋白質はプロテイン・アッセイキッ
ト（バイオ・ラッド社製）を用いて定量した。
【００８５】実施例１6. 13Leu-モチリン単量体の製
造： 実施例９で得たモチリン重合体の顆粒約５mgを７０％ギ
酸2.０mlに溶解し、これに４２mgの臭化シアンを７０％
ギ酸0.４mlに溶解した溶液を加え３７℃で一日放置し
た。再び４２mgの臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液0.４
mlを加えた後、更に37℃で一夜放置した。生成したスペ
ーサーペプチドの結合した13Leu-モチリン単量体（ペプ
チド25）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
より単離した。単離したペプチド２５の一部約100 μｇ
を0.２ＭのＮ−エチルモルホリン・酢酸緩衝液（ｐＨ8.
０）0.４mlに溶解し３７℃で２１時間放置してペプチド
２５のカルボキシル末端のホモセリンのラクトン環を開
裂させた後、２μｇのカルボキシペプチダーゼＡ(Sigma
社）を加え３７℃で30分放置して13Leu-モチリンのカル
ボキシル末端にアルギニンの結合したペプチド２６を得
た。このペプチド２６の一部約２２μｇを0.２Ｍ Ｎ−
エチルモルホリン・酢酸緩衝液（ｐＨ8.０）0.２mlに溶
解しカルボキシペプチダーゼＢ（Sigma 社）１μｇを加
え３７℃で１０分間放置した後、0.１％トリフルオロ酢
酸溶液0.２mlを加えて反応を停止して定量的収率で13Le
u-モチリンを得た。この13Leu-モチリンの構造はアミノ
酸配列の決定と質量分析により確認した。
造： 実施例９で得たモチリン重合体の顆粒約５mgを７０％ギ
酸2.０mlに溶解し、これに４２mgの臭化シアンを７０％
ギ酸0.４mlに溶解した溶液を加え３７℃で一日放置し
た。再び４２mgの臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液0.４
mlを加えた後、更に37℃で一夜放置した。生成したスペ
ーサーペプチドの結合した13Leu-モチリン単量体（ペプ
チド25）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
より単離した。単離したペプチド２５の一部約100 μｇ
を0.２ＭのＮ−エチルモルホリン・酢酸緩衝液（ｐＨ8.
０）0.４mlに溶解し３７℃で２１時間放置してペプチド
２５のカルボキシル末端のホモセリンのラクトン環を開
裂させた後、２μｇのカルボキシペプチダーゼＡ(Sigma
社）を加え３７℃で30分放置して13Leu-モチリンのカル
ボキシル末端にアルギニンの結合したペプチド２６を得
た。このペプチド２６の一部約２２μｇを0.２Ｍ Ｎ−
エチルモルホリン・酢酸緩衝液（ｐＨ8.０）0.２mlに溶
解しカルボキシペプチダーゼＢ（Sigma 社）１μｇを加
え３７℃で１０分間放置した後、0.１％トリフルオロ酢
酸溶液0.２mlを加えて反応を停止して定量的収率で13Le
u-モチリンを得た。この13Leu-モチリンの構造はアミノ
酸配列の決定と質量分析により確認した。
【００８６】実施例１７．13 Leu-モチリンの腸管収縮作用 体重2.３〜2.８kgの雄性ウサギを放血致死させてから十
二指腸を約1.５cm摘出した。これを３０mlのマグヌス(M
agnus)槽中に懸垂し、下端を等張性トランスデューサー
(isotonictransducer)（日本光電、TD−112S) に結び、
十二指腸の収縮反応を記録計（YOKOGAWA HOKUSHIN ELEC
TRIC、Type 3066)上に記録した。十二指腸には張力１ｇ
を負荷した。
二指腸を約1.５cm摘出した。これを３０mlのマグヌス(M
agnus)槽中に懸垂し、下端を等張性トランスデューサー
(isotonictransducer)（日本光電、TD−112S) に結び、
十二指腸の収縮反応を記録計（YOKOGAWA HOKUSHIN ELEC
TRIC、Type 3066)上に記録した。十二指腸には張力１ｇ
を負荷した。
【００８７】実験は、栄養液としてTyrode氏液（ＮａＣ
ｌ 8.０ｇ／ｌ、ＫＣｌ 0.２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 0.
２ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ2 0.１ｇ／ｌ、NaH2PO4 0.０５
ｇ、ＮａＨＣＯ3 1.０ｇ／ｌ、グルコース 1.０ｇ／
ｌ）を用い、温度２８±１℃で、９５％Ｏ2 と５％ＣＯ
2 との混合ガスを通気して行った。13Met-モチリンおよ
び 13Leu-モチリンの収縮作用は、これらを10-9〜３×10
-7ｇ／mlまでの濃度で累積的にTyrode液に添加して得ら
れる収縮張力を測定し、この測定値とアセチルコリン10
-5ｇ／mlを添加したときの収縮張力とを比較し、後者を
１００％として算出した。結果を図１７に示す。この結
果、13Leu-モチリンは天然型ウシモチリンと同等の腸管
収縮活性を示すことがわかった。
ｌ 8.０ｇ／ｌ、ＫＣｌ 0.２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 0.
２ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ2 0.１ｇ／ｌ、NaH2PO4 0.０５
ｇ、ＮａＨＣＯ3 1.０ｇ／ｌ、グルコース 1.０ｇ／
ｌ）を用い、温度２８±１℃で、９５％Ｏ2 と５％ＣＯ
2 との混合ガスを通気して行った。13Met-モチリンおよ
び 13Leu-モチリンの収縮作用は、これらを10-9〜３×10
-7ｇ／mlまでの濃度で累積的にTyrode液に添加して得ら
れる収縮張力を測定し、この測定値とアセチルコリン10
-5ｇ／mlを添加したときの収縮張力とを比較し、後者を
１００％として算出した。結果を図１７に示す。この結
果、13Leu-モチリンは天然型ウシモチリンと同等の腸管
収縮活性を示すことがわかった。
【００８８】参考例1. ＡＴＧベクターｐＴｒＳ２０の
造成： 図１２に示した手順に従い、ＳＤ配列と ATG開始コドン
の間の距離が１４塩基で、かつＡＴＧコドンの直後にＳ
ａｃＩサイトを有するＡＴＧベクターｐＴｒＳ２０を造
成した。
造成： 図１２に示した手順に従い、ＳＤ配列と ATG開始コドン
の間の距離が１４塩基で、かつＡＴＧコドンの直後にＳ
ａｃＩサイトを有するＡＴＧベクターｐＴｒＳ２０を造
成した。
【００８９】まず、特開昭５８−１１０６００号公報記
載の方法で調製したｐＫＹＰ１０３μｇをＹ−１００緩
衝液３０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｎIIIと制限酵素
ＮｒｕＩ（ニューイングランド・バイオラブズ社製）を
それぞれ６単位ずつ加え、３７℃で３時間切断反応を行
った。この反応液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約
3.８kbのＤＮＡ断片（ＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片）約0.
５μｇを得た。
載の方法で調製したｐＫＹＰ１０３μｇをＹ−１００緩
衝液３０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｎIIIと制限酵素
ＮｒｕＩ（ニューイングランド・バイオラブズ社製）を
それぞれ６単位ずつ加え、３７℃で３時間切断反応を行
った。この反応液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約
3.８kbのＤＮＡ断片（ＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片）約0.
５μｇを得た。
【００９０】一方、Ｐｔｒｐの下流にＡＴＧ開始コドン
を付与するために下記のＤＮＡリンカー（配列番号１
２，１３）をリン酸トリエステル法により合成した。
を付与するために下記のＤＮＡリンカー（配列番号１
２，１３）をリン酸トリエステル法により合成した。
【００９１】
【化１３】
【００９２】19-merと17-merの合成ＤＮＡ（各々１０ p
moleずつ）を５０mM トリス−ＨＣｌ（pH7.５）、１０
mM ＭｇＣｌ2 、５mMジチオスレイトール、0.１mM Ｅ
ＤＴＡおよび１mM ＡＴＰを含む全量 ２０μｌの溶液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３単位（宝酒
造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行
った。
moleずつ）を５０mM トリス−ＨＣｌ（pH7.５）、１０
mM ＭｇＣｌ2 、５mMジチオスレイトール、0.１mM Ｅ
ＤＴＡおよび１mM ＡＴＰを含む全量 ２０μｌの溶液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３単位（宝酒
造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行
った。
【００９３】次に上記で得たｐＫＹＰ１０由来のＢａｎ
III− ＮｒｕＩ断片（約3.８kb) 0.１μｇと上記のＤ
ＮＡリンカー約0.５ PmoleをＴ４リガーゼ緩衝液20μｌ
に溶かし、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４
℃で１８時間結合反応を行った。得られた組換え体プラ
スミドの混合物を用いて大腸菌ＨＢ１０１株〔ボリバー
(Boliver) ら：ジーン(Gene)２，75(1977)〕を形質転換
し、Apr のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体か
らプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドの
構造は制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｎIII、HindIII、Ｓａ
ｃＩ、ＮｒｕＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
り確認した。このプラスミドをpTrS20と名付けた。ｐＴ
ｒＳ２０のＢａｎIII、ＨｉｎｄIIIサイト付近の塩基配
列は下記のとおりであることをＭ１３ファージを用いた
ディデオキシ・シークエンス法を用い確認した（配列番
号１４）。
III− ＮｒｕＩ断片（約3.８kb) 0.１μｇと上記のＤ
ＮＡリンカー約0.５ PmoleをＴ４リガーゼ緩衝液20μｌ
に溶かし、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４
℃で１８時間結合反応を行った。得られた組換え体プラ
スミドの混合物を用いて大腸菌ＨＢ１０１株〔ボリバー
(Boliver) ら：ジーン(Gene)２，75(1977)〕を形質転換
し、Apr のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体か
らプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドの
構造は制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｎIII、HindIII、Ｓａ
ｃＩ、ＮｒｕＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
り確認した。このプラスミドをpTrS20と名付けた。ｐＴ
ｒＳ２０のＢａｎIII、ＨｉｎｄIIIサイト付近の塩基配
列は下記のとおりであることをＭ１３ファージを用いた
ディデオキシ・シークエンス法を用い確認した（配列番
号１４）。
【００９４】
【化１４】
【００９５】参考例2. サケ成長ホルモン発現プラスミ
ドｐｓＧＨＩＭ１の造成（第15、16図）： ｐＧＥＬ１（約3.４kb）３μｇを２０mMトリス−ＨＣｌ
（pH7.５）、１０mMＭｇＣｌ2 および１００mM ＮａＣ
ｌを含む溶液（以下“Ｙ−100 緩衝液”と略記する）４
０μｌに溶かし、ＢａｎIII（東洋紡績社製）５単位を
加え37℃、３時間消化反応を行った。該反応液をフェノ
ール抽出し、エタノール沈澱にてＢａｎIII部位一ケ所
で切断されたｐＧＥＬ１ 約2.４μｇを得た。このＤＮ
Ａ断片約2.４μｇを５０mMトリス−ＨＣｌ（pH7.８）、
７mM ＭｇＣｌ2 および６mMメルカプトエタノールを含
む溶液（以下“ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液”と略記す
る）５０μｌに溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ
１mMになるように加え、さらに５単位のDNA ポリメラー
ゼＩ（ニューイングランド・バイラブズ社製）を加え
て、３７℃、３０分間反応させて、突出末端を削った。
フェノール抽出、エタノール沈澱により、ＤＮＡ断片約
2.０μｇを回収した。該ＤＮＡ断片１μｇを２０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ7.６）、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
ジチオスレイトールおよび１mM ＡＴＰを含む緩衝液
（以下“Ｔ４リガーゼ緩衝液Ｉ”と略記する）30μｌに
溶かし、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製：以
下同じ）を加え４℃、１８時間結合反応を行った。該反
応液を用い、大腸菌ＨＢ１０１株〔Boliver et. al. :
Gene, ２，75(1977)〕をCohen らの方法〔S.N.Cohen e
t. al: Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 69, 2110(1972)〕
により形質転換し、Apr のコロニーを得た。この形質転
換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法〔H. C. Birnbo
im et. al. : Nucleic Acids Res. 7 , 1513(1979)〕
に従って分離し、ｐＧＥＬ10（約3.４kb）を得た。ｐＧ
ＥＬ１０の構造はＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄII
I、ＢａｍＨＩで切断してアガロースゲル電気泳動にて
確認した。またｔｒｐプロモーター下流のＳＤ配列から
インターフェロン−γ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに
至る塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Proc. Natl.
Acad. Sci.USA., 74 , 560(1977) 〕により決定し、
ドｐｓＧＨＩＭ１の造成（第15、16図）： ｐＧＥＬ１（約3.４kb）３μｇを２０mMトリス−ＨＣｌ
（pH7.５）、１０mMＭｇＣｌ2 および１００mM ＮａＣ
ｌを含む溶液（以下“Ｙ−100 緩衝液”と略記する）４
０μｌに溶かし、ＢａｎIII（東洋紡績社製）５単位を
加え37℃、３時間消化反応を行った。該反応液をフェノ
ール抽出し、エタノール沈澱にてＢａｎIII部位一ケ所
で切断されたｐＧＥＬ１ 約2.４μｇを得た。このＤＮ
Ａ断片約2.４μｇを５０mMトリス−ＨＣｌ（pH7.８）、
７mM ＭｇＣｌ2 および６mMメルカプトエタノールを含
む溶液（以下“ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液”と略記す
る）５０μｌに溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ
１mMになるように加え、さらに５単位のDNA ポリメラー
ゼＩ（ニューイングランド・バイラブズ社製）を加え
て、３７℃、３０分間反応させて、突出末端を削った。
フェノール抽出、エタノール沈澱により、ＤＮＡ断片約
2.０μｇを回収した。該ＤＮＡ断片１μｇを２０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ7.６）、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
ジチオスレイトールおよび１mM ＡＴＰを含む緩衝液
（以下“Ｔ４リガーゼ緩衝液Ｉ”と略記する）30μｌに
溶かし、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製：以
下同じ）を加え４℃、１８時間結合反応を行った。該反
応液を用い、大腸菌ＨＢ１０１株〔Boliver et. al. :
Gene, ２，75(1977)〕をCohen らの方法〔S.N.Cohen e
t. al: Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 69, 2110(1972)〕
により形質転換し、Apr のコロニーを得た。この形質転
換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法〔H. C. Birnbo
im et. al. : Nucleic Acids Res. 7 , 1513(1979)〕
に従って分離し、ｐＧＥＬ10（約3.４kb）を得た。ｐＧ
ＥＬ１０の構造はＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄII
I、ＢａｍＨＩで切断してアガロースゲル電気泳動にて
確認した。またｔｒｐプロモーター下流のＳＤ配列から
インターフェロン−γ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに
至る塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Proc. Natl.
Acad. Sci.USA., 74 , 560(1977) 〕により決定し、
【００９６】
【化１５】
【００９７】の１０bpであることが確認された（配列番
号１５）。上記で得たｐＧＥＬ10 ５μｇをＹ−１００
緩衝液４０μｌに溶かし、ＨｉｎｄIII、ＢａｍＨＩ各
々１０単位を加え３７℃３時間切断反応を行った。該反
応液からｔｒｐプロモーター部分および複製開始点、リ
ポプロテインターミネータを含む約2.7 kbのＤＮＡ断片
約２μｇを凍結融解法にて回収した。
号１５）。上記で得たｐＧＥＬ10 ５μｇをＹ−１００
緩衝液４０μｌに溶かし、ＨｉｎｄIII、ＢａｍＨＩ各
々１０単位を加え３７℃３時間切断反応を行った。該反
応液からｔｒｐプロモーター部分および複製開始点、リ
ポプロテインターミネータを含む約2.7 kbのＤＮＡ断片
約２μｇを凍結融解法にて回収した。
【００９８】別にｐｓＧＨＩＢ２〔参考例３の方法で製
造〕（約3.８kb) 約５μｇを４０μｌのＹ−１００緩衝
液に溶かし１０単位のＢａｍＨＩを加え３７℃３時間反
応を行い、完全に切断し、さらにＨｉｎｄIII １単位
を加え３７℃３０分間反応を行い HindIIIによる部分切
断を行った。該反応液より凍結融解法による成熟型サケ
成長ホルモンをコードする約1.１kbのＤＮＡ断片約0.７
μｇを回収した。
造〕（約3.８kb) 約５μｇを４０μｌのＹ−１００緩衝
液に溶かし１０単位のＢａｍＨＩを加え３７℃３時間反
応を行い、完全に切断し、さらにＨｉｎｄIII １単位
を加え３７℃３０分間反応を行い HindIIIによる部分切
断を行った。該反応液より凍結融解法による成熟型サケ
成長ホルモンをコードする約1.１kbのＤＮＡ断片約0.７
μｇを回収した。
【００９９】上記のように回収したｐＧＥＬ１０のＤＮ
Ａ断片約0.１μｇとｐｓＧＨＩＢ２のＤＮＡ断片約0.２
μｇとを３０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液Ｉに溶かし、２
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃、１８時間結合
反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を
形質転換し、得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを
回収し、ｐｓＧＨＩＭ１を得た。ｐｓＧＨＩＭ１の構造
はＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで
切断してアガロースゲル電気泳動にて確認した。
Ａ断片約0.１μｇとｐｓＧＨＩＢ２のＤＮＡ断片約0.２
μｇとを３０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液Ｉに溶かし、２
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃、１８時間結合
反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を
形質転換し、得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを
回収し、ｐｓＧＨＩＭ１を得た。ｐｓＧＨＩＭ１の構造
はＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで
切断してアガロースゲル電気泳動にて確認した。
【０１００】参考例3. 成熟サケ成長ホルモンをコード
する組換え体プラスミドｐｓＧＨＩＢ２の造成： サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
ｐｓＧＨｌ（特開昭６１−１５６９９記載の方法で製
造）５μｇを２０mMトリス−ＨＣｌ（pH7.５）、１０mM
ＭｇＣｌ2 および１０mM ＮａＣｌを含む溶液（以下
“Ｙ−１０緩衝液”と略記する）４０μｌに溶かし、制
限酵素ＭｂｏII〔ニューイングランド・バイオラブス
（New England Bio Labs）社製〕10単位を加え37℃、
３時間消化反応を行った。つづいて該溶液のＮａＣｌ濃
度を１７５mMとなるよう調製し、SaｌＩ10単位を加え、
３７℃、３時間消化反応を行った。この反応液からＬＧ
Ｔ法により、Ｎ末端付近に相当する１６３bpのＤＮＡ断
片約0.２μｇを得た。
する組換え体プラスミドｐｓＧＨＩＢ２の造成： サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
ｐｓＧＨｌ（特開昭６１−１５６９９記載の方法で製
造）５μｇを２０mMトリス−ＨＣｌ（pH7.５）、１０mM
ＭｇＣｌ2 および１０mM ＮａＣｌを含む溶液（以下
“Ｙ−１０緩衝液”と略記する）４０μｌに溶かし、制
限酵素ＭｂｏII〔ニューイングランド・バイオラブス
（New England Bio Labs）社製〕10単位を加え37℃、
３時間消化反応を行った。つづいて該溶液のＮａＣｌ濃
度を１７５mMとなるよう調製し、SaｌＩ10単位を加え、
３７℃、３時間消化反応を行った。この反応液からＬＧ
Ｔ法により、Ｎ末端付近に相当する１６３bpのＤＮＡ断
片約0.２μｇを得た。
【０１０１】次にｐｓＧＨ１の５μｇをＹ−１００緩衝
液４０μｌに溶かし、ＢａｍＨＩ10単位を加え、３７
℃、３時間消化反応を行った。つづいて該反応液のＮａ
Ｃｌ濃度を１７５mMに調整し、ＳａｌＩ10単位を加え３
７℃、３時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法
により、Ｃ末端側と３’−非翻訳領域を含む約９００bp
のＤＮＡ断片約0.５μｇを得た。
液４０μｌに溶かし、ＢａｍＨＩ10単位を加え、３７
℃、３時間消化反応を行った。つづいて該反応液のＮａ
Ｃｌ濃度を１７５mMに調整し、ＳａｌＩ10単位を加え３
７℃、３時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法
により、Ｃ末端側と３’−非翻訳領域を含む約９００bp
のＤＮＡ断片約0.５μｇを得た。
【０１０２】別にｐＧＥＬ１ ５μｇを４０μｌのＹ−
１００緩衝液に溶かし、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIとを
各々１０単位加え、３０℃、３時間消化反応を行った。
この反応液からトリプトファンプロモーターを含む約2.
７kbのＤＮＡ断片約１μｇを得た。一方成熟サケ成長ホ
ルモンをコードするＤＮＡの発現に必要な翻訳開始コド
ンＡＴＧを付加し、さらにベクターＤＮＡと上記ＤＮＡ
とを連結する目的で下記のＤＮＡリンカー（配列番号１
６，１７）を合成した。
１００緩衝液に溶かし、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIとを
各々１０単位加え、３０℃、３時間消化反応を行った。
この反応液からトリプトファンプロモーターを含む約2.
７kbのＤＮＡ断片約１μｇを得た。一方成熟サケ成長ホ
ルモンをコードするＤＮＡの発現に必要な翻訳開始コド
ンＡＴＧを付加し、さらにベクターＤＮＡと上記ＤＮＡ
とを連結する目的で下記のＤＮＡリンカー（配列番号１
６，１７）を合成した。
【０１０３】
【化１６】
【０１０４】まず一本鎖ＤＮＡ、17-merと12-merを通常
のトリエステル法〔アール・クレア(R. Crea) ら：プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA., 75,
5765(1978)〕により合成した。17-merおよび12-merの一
本鎖ＤＮＡ各々12pmole を50mMトリス−ＨＣｌ(pH 7.
5)、10mM ＭｇＣｌ2 、10mMジチオスレイトールおよび
１mM ATPを含む溶液２０μｌに溶かし、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、３７℃、
６０分間リン酸化反応を行った。
のトリエステル法〔アール・クレア(R. Crea) ら：プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA., 75,
5765(1978)〕により合成した。17-merおよび12-merの一
本鎖ＤＮＡ各々12pmole を50mMトリス−ＨＣｌ(pH 7.
5)、10mM ＭｇＣｌ2 、10mMジチオスレイトールおよび
１mM ATPを含む溶液２０μｌに溶かし、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、３７℃、
６０分間リン酸化反応を行った。
【０１０５】上記で得たpsGH1 由来の MboII−ＳａｌＩ
断片(163bp) 0.１pmole 、SalI-BamHI断片（約900bp)0.
06pmole 、pGEL1 のHindIII−BamHI 断片（約2.7 kb)
0.02pmole を50mMトリス−ＨＣｌ（pH 7.5) 、10mM Ｍ
ｇＣｌ2 、10mMジチオスレイトールおよび１mM ＡＴＰ
を含む溶液３０μｌに溶かし、これに上記の合成ＤＮＡ
リン酸化反応液５μｌを加えた。この混合液にＴ４リガ
ーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、４℃、１８時間結合
反応を行った。
断片(163bp) 0.１pmole 、SalI-BamHI断片（約900bp)0.
06pmole 、pGEL1 のHindIII−BamHI 断片（約2.7 kb)
0.02pmole を50mMトリス−ＨＣｌ（pH 7.5) 、10mM Ｍ
ｇＣｌ2 、10mMジチオスレイトールおよび１mM ＡＴＰ
を含む溶液３０μｌに溶かし、これに上記の合成ＤＮＡ
リン酸化反応液５μｌを加えた。この混合液にＴ４リガ
ーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、４℃、１８時間結合
反応を行った。
【０１０６】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換しApr のコロニーを得、このコロニーよりプラス
ミドＤＮＡを回収し、第16図に示したpsGHIB2 を得た。
psGHIB2 の構造はEcoRI 、HindIII、ClaI、 BglII、Sal
Ｉ、BamHI で切断してアガロースゲル電気泳動にて確認
した。psGHIB2 中のサケ成長ホルモンをコードする DNA
のＮ末端付近の配列は
質転換しApr のコロニーを得、このコロニーよりプラス
ミドＤＮＡを回収し、第16図に示したpsGHIB2 を得た。
psGHIB2 の構造はEcoRI 、HindIII、ClaI、 BglII、Sal
Ｉ、BamHI で切断してアガロースゲル電気泳動にて確認
した。psGHIB2 中のサケ成長ホルモンをコードする DNA
のＮ末端付近の配列は
【０１０７】
【化１７】
【０１０８】であることをＭ１３ファージを用いたサン
ガー(Sanger)法に従って決定した（配列番号１８，１
９）。その結果psGHIB2 は成熟型サケ成長ホルモンポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むことがわかった。プ
ラスミドpsGHIB2 を含む大腸菌はEscherichia coli ESG
HIB2 (EFRM BP-612) として昭和５９年９月２０日付で
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託され
ている。
ガー(Sanger)法に従って決定した（配列番号１８，１
９）。その結果psGHIB2 は成熟型サケ成長ホルモンポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むことがわかった。プ
ラスミドpsGHIB2 を含む大腸菌はEscherichia coli ESG
HIB2 (EFRM BP-612) として昭和５９年９月２０日付で
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託され
ている。
【０１０９】参考例4. プラスミドｐＧＨＤ７の造成
（図13) ： ｌecＩプロモーター（特開昭60−221091参照）、大腸菌
リポプロテイン遺伝子（ｌpp) のターミネーター、ヒト
インターフェロン−γｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐＧＨ
Ｂ３〔特開昭60−221091（IGHB3 FERM BP−403)〕約２
μｇを30μｌのＹ−50緩衝液〔10mM トリス−ＨＣｌ
（pH7.５）、50mM ＮａＣｌ、７mM ＭｇＣｌ2 および
６mM ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液〕に溶か
し、８単位のＰｖｕIIを加え、３７℃で２時間消化反応
を行った。
（図13) ： ｌecＩプロモーター（特開昭60−221091参照）、大腸菌
リポプロテイン遺伝子（ｌpp) のターミネーター、ヒト
インターフェロン−γｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐＧＨ
Ｂ３〔特開昭60−221091（IGHB3 FERM BP−403)〕約２
μｇを30μｌのＹ−50緩衝液〔10mM トリス−ＨＣｌ
（pH7.５）、50mM ＮａＣｌ、７mM ＭｇＣｌ2 および
６mM ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液〕に溶か
し、８単位のＰｖｕIIを加え、３７℃で２時間消化反応
を行った。
【０１１０】次いでＮａＣｌを 150mMとなるように加
え、８単位のＳａｌＩを加えて37℃でさらに２時間消化
反応を行った。続いて、フェノールおよびクロロホルム
抽出とエタノール沈澱の後、ＤＮＡ断片を全量３０μｌ
の50mM トリス−ＨＣｌ(pH 7.6)、７mM ＭｇＣｌ2 、
６mM ２−メルカプトエタノール、0.２５mM ｄＡＴ
Ｐ、0.２５mM ｄＣＴＰ、0.２５mM ｄＧＴＰおよび0.
２５mM ｄＴＴＰを含む緩衝液に溶かし、４単位の大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Klenow断片（宝酒造社製）を
加え、１５℃で２時間反応させ、生じた突出末端を平坦
末端に変えた。６５℃、１０分間の熱処理後、低融点ア
ガロースゲル電気泳動法を用い、大きい方のＤＮＡ断片
（3.６kb) を精製した。
え、８単位のＳａｌＩを加えて37℃でさらに２時間消化
反応を行った。続いて、フェノールおよびクロロホルム
抽出とエタノール沈澱の後、ＤＮＡ断片を全量３０μｌ
の50mM トリス−ＨＣｌ(pH 7.6)、７mM ＭｇＣｌ2 、
６mM ２−メルカプトエタノール、0.２５mM ｄＡＴ
Ｐ、0.２５mM ｄＣＴＰ、0.２５mM ｄＧＴＰおよび0.
２５mM ｄＴＴＰを含む緩衝液に溶かし、４単位の大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Klenow断片（宝酒造社製）を
加え、１５℃で２時間反応させ、生じた突出末端を平坦
末端に変えた。６５℃、１０分間の熱処理後、低融点ア
ガロースゲル電気泳動法を用い、大きい方のＤＮＡ断片
（3.６kb) を精製した。
【０１１１】このようにして得たＤＮＡ断片（約0.１μ
ｇ）を20mM トリス−ＨＣｌ（pH7.６）、10mM ＭｇＣ
ｌ2 、10mM ジチオスレイトールおよび0.５mM ＡＴＰ
を含む緩衝液（以下この緩衝液を“Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液II”と略称する）２０μｌ中、２単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより、４℃で１８時間結合反応を行った。
ｇ）を20mM トリス−ＨＣｌ（pH7.６）、10mM ＭｇＣ
ｌ2 、10mM ジチオスレイトールおよび0.５mM ＡＴＰ
を含む緩衝液（以下この緩衝液を“Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液II”と略称する）２０μｌ中、２単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより、４℃で１８時間結合反応を行った。
【０１１２】このようにして得られた組換えプラスミド
DNA で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、アンピシリン
耐性株を得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを
単離し、その構造解析を行ったところ、目的の構造を有
するプラスミドｐＧＨＤ７が造成されたことを確認し
た。
DNA で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、アンピシリン
耐性株を得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを
単離し、その構造解析を行ったところ、目的の構造を有
するプラスミドｐＧＨＤ７が造成されたことを確認し
た。
【０１１３】参考例5. プラスミドpArg４の造成（図1
4）： ｔｒｐポータブル・プロモーターを持つpKYP100 プラス
ミド〔T. Nishiら：Agric. Biol. Chem. 48, 669−67
5(1984) 〕約３μｇを３０μｌの緩衝液〔10mMトリス -
ＨＣｌ(pH 7.5)、50mM ＮａＣｌ、７mM ＭｇＣｌ2 お
よび６mM ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液〕に
溶かし、１０単位のＰｓｔＩと１０単位のＨｉｎｄIII
を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１
０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電気泳動を用
い、小さい方のＤＮＡ断片（0.８８kb) を精製した。さ
らに、ヒトインターフェロン−γ発現プラスミドｐＧＥ
Ｌ１〔ＦＥＲＭ BP−612 、特開昭61−９３１９７〕約
３μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、10単位
のＰｓｔＩと１０単位のNcoIを加え、３７℃で２時間消
化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、低融点
アガロースゲル電気泳動を用い、大きい方のＤＮＡ断片
(1.7kb）を精製した。
4）： ｔｒｐポータブル・プロモーターを持つpKYP100 プラス
ミド〔T. Nishiら：Agric. Biol. Chem. 48, 669−67
5(1984) 〕約３μｇを３０μｌの緩衝液〔10mMトリス -
ＨＣｌ(pH 7.5)、50mM ＮａＣｌ、７mM ＭｇＣｌ2 お
よび６mM ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液〕に
溶かし、１０単位のＰｓｔＩと１０単位のＨｉｎｄIII
を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１
０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電気泳動を用
い、小さい方のＤＮＡ断片（0.８８kb) を精製した。さ
らに、ヒトインターフェロン−γ発現プラスミドｐＧＥ
Ｌ１〔ＦＥＲＭ BP−612 、特開昭61−９３１９７〕約
３μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、10単位
のＰｓｔＩと１０単位のNcoIを加え、３７℃で２時間消
化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、低融点
アガロースゲル電気泳動を用い、大きい方のＤＮＡ断片
(1.7kb）を精製した。
【０１１４】次に、上で精製した２つのＤＮＡ断片を連
結するためのＤＮＡリンカー（配列番号２０，２１、Ｅ
ｃｏＲＶサイトとＳａｌＩサイトを内部に有する）をデ
ザインした。
結するためのＤＮＡリンカー（配列番号２０，２１、Ｅ
ｃｏＲＶサイトとＳａｌＩサイトを内部に有する）をデ
ザインした。
【０１１５】
【化１８】
【０１１６】上図に示した２種の一本鎖ＤＮＡ（それぞ
れ36- mer)を通常のトリエステル法〔R. Crea ら：Pro
c. Natl. Acad. Sci.,75, 5765(1978)〕により合成し
た。続いて各々２０pmole を５０mM トリス−ＨＣｌ
（pH7.５）、１０mM ＭｇＣｌ2、５mM ジチオスレイ
トール、0.１mM ＥＤＴＡおよび１mM ＡＴＰを含む全
量２０μｌの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ４単位を加えて、37℃で３０分間リン酸化反応を行
った。これらの一本鎖ＤＮＡを等量ずつ混合し、６５℃
で５分間加熱後、室温で徐冷することにより、上記の構
造を有するＤＮＡリンカーを得た。
れ36- mer)を通常のトリエステル法〔R. Crea ら：Pro
c. Natl. Acad. Sci.,75, 5765(1978)〕により合成し
た。続いて各々２０pmole を５０mM トリス−ＨＣｌ
（pH7.５）、１０mM ＭｇＣｌ2、５mM ジチオスレイ
トール、0.１mM ＥＤＴＡおよび１mM ＡＴＰを含む全
量２０μｌの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ４単位を加えて、37℃で３０分間リン酸化反応を行
った。これらの一本鎖ＤＮＡを等量ずつ混合し、６５℃
で５分間加熱後、室温で徐冷することにより、上記の構
造を有するＤＮＡリンカーを得た。
【０１１７】このＤＮＡリンカー（１pmole)と上で精製
した２種のＤＮＡ断片（それぞれ0.１μｇずつ）を前記
Ｔ４リガーゼ緩衝液II２０μｌ中、２単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより、４℃で１８時間結合反応を行った。
このようにして得られた組換えプラスミドDNA で大腸菌
ＨＢ１０１株を形質転換し、アンピシリン耐性株を得
た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、そ
の構造解析を行ったところ、目的の構造を有するプラス
ミドｐＡｒｇ４が造成されたことを確認した。
した２種のＤＮＡ断片（それぞれ0.１μｇずつ）を前記
Ｔ４リガーゼ緩衝液II２０μｌ中、２単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより、４℃で１８時間結合反応を行った。
このようにして得られた組換えプラスミドDNA で大腸菌
ＨＢ１０１株を形質転換し、アンピシリン耐性株を得
た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、そ
の構造解析を行ったところ、目的の構造を有するプラス
ミドｐＡｒｇ４が造成されたことを確認した。
【０１１８】
配列番号：1 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Asn Lys Gly Gln 20
【０１１９】配列番号：2 配列の長さ：99 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGATCAGATC TTCATGTTCG TTCCGATTTT CACTTACGGT GAACTGCAAC GTCTGCAAGA 60 GAAAGAACGT AACAAAGGTC AGCGGATCCT GTAAGAGCT 99
【０１２０】配列番号：3 配列の長さ：93 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TAGTCTAGAA GTACAAGCAA GGCTAAAAGT GAATGCCACT TGACGTTGCA GACGTTCTCT 60 TTCTTGCATT GTTTCCAGTC GCCTAGGACA TTC 93
【０１２１】配列番号：4 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGATCAGATC TTCATGTTCG TTCCGATTTT CACTTACGGT GAACTGCAAC 50
【０１２２】配列番号：5 配列の長さ：43 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGTTCACCGT AAGTGAAAAT CGGAACGAAC ATGAAGATCT GAT 43
【０１２３】配列番号：6 配列の長さ：49 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GTCTGCAAGA GAAAGAACGT AACAAAGGTC AGCGGATCCT GTAAGAGCT 49
【０１２４】配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CTTACAGGAT CCGCTGACCT TTGTTACGTT CTTTCTCTTG CAGACGTTGC 50
【０１２５】配列番号：8 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGCTTATGAT AGAAAACCAA CGGCTCTTCC A 31
【０１２６】配列番号：9 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GATCTGGAAG AGCCGTTGGT TTTCTATCAT A 31
【０１２７】配列番号：10 配列の長さ：26 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Asn Lys Gly Gln Arg Ile Phe Hse 20 25
【０１２８】配列番号：11 配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Asn Lys Gly Gln Arg 20
【０１２９】配列番号：12 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGATAAGCTT ATGAGCTCG 19
【０１３０】配列番号：13 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TATTCGAATA CTCGAGC 17
【０１３１】配列番号：14 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAGGGTATCG ATAAGCTTAT GAGCTCGCGA 30
【０１３２】配列番号：15 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAGGGTATAA GCTTATG 17
【０１３３】配列番号：16 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGCTTATGAT AGAAAAC 17
【０１３４】配列番号：17 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATACTATCTT TT 12
【０１３５】配列番号：18 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAGCTTATGA TAGAAAACCA A 21
【０１３６】配列番号：19 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTCGAATACT ATCTTTTGGT T 21
【０１３７】配列番号：20 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGCTTATGAT ATCGAACGTC GACGACGGCG TCGAAC 26
【０１３８】配列番号：21 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATACTATAGC TTGCAGCTGC TGCCGCAGCT TGGTAC 26
【図１】はプラスミドｐＭＴＡ１の造成工程を示す。
【図２】はプラスミドｐＭＴＡ２の造成工程を示す。図
中Ｂｇ、Ｂａｍ、ＰはそれぞれＢｇｌII、ＢａｍＨＩ、
ＰｓｔＩの認識部位を示す。ＭＴは13Leu-モチリン遺伝
子を示す。以下同じ。
中Ｂｇ、Ｂａｍ、ＰはそれぞれＢｇｌII、ＢａｍＨＩ、
ＰｓｔＩの認識部位を示す。ＭＴは13Leu-モチリン遺伝
子を示す。以下同じ。
【図３】はプラスミドｐＭＴＡ４の造成工程を示す。
【図４】はプラスミドｐＭＴＫ４の造成工程を示す。図
中ＳＧＨはシロザケ成長ホルモン遺伝子を示す。以下同
じ。
中ＳＧＨはシロザケ成長ホルモン遺伝子を示す。以下同
じ。
【図５】はプラスミドｐＭＴＬ４の造成工程を示す。図
中Ｔｌｐｐはリポプロテインターミネーターを示す。Ｔ
ｒｐはトリプトファンプロモーターを示す。
中Ｔｌｐｐはリポプロテインターミネーターを示す。Ｔ
ｒｐはトリプトファンプロモーターを示す。
【図６】はプラスミドｐＭＴＮ４の造成工程を示す。
【図７】はプラスミドｐＭＴＭ４の造成工程を示す。
【図８】はプラスミドｐＭＴＯ４の造成工程を示す。
【図９】はプラスミドｐＭＴＯＩ４の造成工程を示す。
【図１０】はプラスミドｐＭＴＯII４の造成工程を示
す。
す。
【図１１】はプラスミドｐＭＴＯIII４の造成工程を示
す。
す。
【図１２】はプラスミドｐＴｒＳ２０の造成工程を示
す。
す。
【図１３】はプラスミドｐＧＨＤ７の造成工程を示す。
【図１４】はプラスミドｐＡｒｇ４の造成工程を示す。
【図１５】はプラスミドｐＧＥＬ１０の造成工程を示
す。
す。
【図１６】はプラスミドｐｓＧＨＩＭ１の造成工程を示
す。
す。
【図１７】は13Met-モチリンおよび13Leu-モチリンの腸
管収縮作用を示す。図中○は13Leu-モチリン、●は13Me
t-モチリンを示す。
管収縮作用を示す。図中○は13Leu-モチリン、●は13Me
t-モチリンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｓｃａｎｄ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．11，Ｎｏ．２, Ｐ．199−203（1976) Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．, Ｖｏｌ．26，Ｎｏ．１，Ｐ．101−107 （1978)
Claims (3)
- 【請求項１】 下記式１のアミノ酸配列を有するペプチ
ドをコードするＤＮＡ。 【化１】 （式中、記号は下記アミノ酸残基を示す。 Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｖａｌ：バリン、Ｐｒｏ：
プロリン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｔｈｒ：スレオニ
ン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｇｌｙ：グリシン、Ｇｌｕ：グ
ルタミン酸、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｇｌｎ：グルタミン、
Ａｒｇ：アルギニン、Ｌｙｓ：リジン、Ａｓｎ：アスパ
ラギン。以下同じ） - 【請求項２】 下記式２のヌクレオチド配列を有するＤ
ＮＡ。 【化２】 （式中ＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩに
向かう引き出し線は、これら制限酵素による切断部位を
示す。Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃはそれぞれヌクレオチド中の塩基
アデニン、チミン、グアニン、シトシンを示す。以下同
じ） - 【請求項３】 下記式１のアミノ酸配列を有するペプチ
ドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 【化３】 （式中、記号は下記アミノ酸残基を示す。 Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｖａｌ：バリン、Ｐｒｏ：
プロリン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｔｈｒ：スレオニ
ン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｇｌｙ：グリシン、Ｇｌｕ：グ
ルタミン酸、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｇｌｎ：グルタミン、
Ａｒｇ：アルギニン、Ｌｙｓ：リジン、Ａｓｎ：アスパ
ラギン。以下同じ）
Priority Applications (9)
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|---|---|---|---|
| JP61215088A JP2862870B2 (ja) | 1986-09-12 | 1986-09-12 | 新規ペプチド |
| CA000546627A CA1339464C (en) | 1986-09-12 | 1987-09-10 | ¬leu13| motilin, dnas coding for same and methods for producing same |
| EP87113347A EP0259891B1 (en) | 1986-09-12 | 1987-09-11 | [Leu 13] motilin, DNAs coding for same and methods for producing same |
| DE3751081T DE3751081T2 (de) | 1986-09-12 | 1987-09-11 | [Leu 13] Motilin, dessen kodierende DNS-Moleküle und Verfahren zu dessen Herstellung. |
| US08/094,915 US5420113A (en) | 1986-09-12 | 1993-07-22 | [Leu13]motilin, DNAs coding for same and methods for producing same |
| JP5192104A JP2634132B2 (ja) | 1986-09-12 | 1993-08-03 | 新規ペプチド |
| US08/387,566 US5721353A (en) | 1986-09-12 | 1995-02-13 | DNAs coding for LCU13 ! motilin |
| US08/450,384 US5695952A (en) | 1986-09-12 | 1995-05-25 | Method for producing Leu13 !motilin |
| US08/975,353 US6018037A (en) | 1986-09-12 | 1997-11-20 | DNA coding for (Leu13) motilin |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JPH0722517B2 (ja) * | 1989-08-24 | 1995-03-15 | 株式会社三和化学研究所 | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
| JPH0742319B2 (ja) * | 1989-01-06 | 1995-05-10 | 株式会社三和化学研究所 | モチリン様活性を有するポリペプチド及びその用途 |
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-
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-
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- 1987-09-11 DE DE3751081T patent/DE3751081T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-09-11 EP EP87113347A patent/EP0259891B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-08-03 JP JP5192104A patent/JP2634132B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
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| Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．１，Ｐ．１０１−１０７（１９７８） |
| Ｓｃａｎｄ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２，Ｐ．１９９−２０３（１９７６） |
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|---|---|---|---|
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