JPS61260891A - 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 - Google Patents
発酵法によるl−スレオニンの製造方法Info
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- JPS61260891A JPS61260891A JP9958985A JP9958985A JPS61260891A JP S61260891 A JPS61260891 A JP S61260891A JP 9958985 A JP9958985 A JP 9958985A JP 9958985 A JP9958985 A JP 9958985A JP S61260891 A JPS61260891 A JP S61260891A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、発酵法によるL−スレオニンの製造方法に関
するものである。
するものである。
プロテウスまたはプロビデンシアに属する微生物を用い
た発酵法によるL−スレオニンの製造方法としては、L
−イソロイシン要求性味を用いる方法(特公昭43−4
440号公報)やα−アミノーβ−ノ・イドロキン吉草
酸に耐性を有し力1つL−インロイシン要求性を有する
微生物を用いる方法(日本農芸化学会講演要旨集p、9
(1970) )が知られている。
た発酵法によるL−スレオニンの製造方法としては、L
−イソロイシン要求性味を用いる方法(特公昭43−4
440号公報)やα−アミノーβ−ノ・イドロキン吉草
酸に耐性を有し力1つL−インロイシン要求性を有する
微生物を用いる方法(日本農芸化学会講演要旨集p、9
(1970) )が知られている。
しかし、これらの方法によるL−スレオニンの生成蓄積
濃度、または糖などの原料からのし一スレオニ/生成収
率は十分に満足できるものではなかった。
濃度、または糖などの原料からのし一スレオニ/生成収
率は十分に満足できるものではなかった。
〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者ら
は、さらに生産性の高いL−スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロテウス属に属しL−スレオ
ニン生産能を有する微生物にL−ロイシン要求性を付与
することによって、L−スレオニン蓄積濃度、生成収率
が著しく向上することを見い出し本発明に到達した。
は、さらに生産性の高いL−スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロテウス属に属しL−スレオ
ニン生産能を有する微生物にL−ロイシン要求性を付与
することによって、L−スレオニン蓄積濃度、生成収率
が著しく向上することを見い出し本発明に到達した。
本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属シ(
バーシーのマニュアル・オプ・システマテイノクバクテ
リオロジーVo1. l (1984)。
バーシーのマニュアル・オプ・システマテイノクバクテ
リオロジーVo1. l (1984)。
第495〜496頁に従う)、生育のために少なくとも
L−ロイシンを必要とする性質とL−スレオニン生成能
をあわせ持つものである。またL−イソロイシンに対す
る栄養要求性、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸等
スレオニンアナローグに対する耐性およびエチオニン等
メチオニンアナローグに対する耐性はL−スレオニン生
成能に有効に作用するので、これらのいくつかの特性な
いしはすべての特性をあわせ持つ微生物がより好ましく
用いられる。またこれら特性は通常の変異誘導操作によ
り付与することが可能である。
L−ロイシンを必要とする性質とL−スレオニン生成能
をあわせ持つものである。またL−イソロイシンに対す
る栄養要求性、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸等
スレオニンアナローグに対する耐性およびエチオニン等
メチオニンアナローグに対する耐性はL−スレオニン生
成能に有効に作用するので、これらのいくつかの特性な
いしはすべての特性をあわせ持つ微生物がより好ましく
用いられる。またこれら特性は通常の変異誘導操作によ
り付与することが可能である。
ここにいう栄養要求性とは、広義の意味であり、不完全
欠失型(いわゆるLeaky型)も含むものである。
欠失型(いわゆるLeaky型)も含むものである。
さらにその要求物質の生合成前駆物質で要求性が満足さ
れる場合も含むものである。
れる場合も含むものである。
本発明で用いられる微生物は変異株により提供されその
代表的なものとしては、例えば以下のものがある。
代表的なものとしては、例えば以下のものがある。
フロヒデ7シ781/)ゲリNS−140(FERM
P−8083)(α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸
耐性、エチオニン耐性、L−イソロイシン要求性、L−
ロイシン要求性) プロヒデ:/シフaL/トゲIJ N5133I−6
9(FERMP−8085)(α−アミノ−β−ハイド
ロキシ吉草酸耐性、エチオニン耐性、L−(ソロイシン
要求性、L−ロイシン要求性、スレオニンアルドラーゼ
欠損性) プロビデンシア・レトゲリNS−140は、プロビデン
シア・レトゲリTY−1(FERM P−8079、
α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、エチオニン
耐性、L−イソロイシン要求性)を親株として、また、
プロビデンシア・レトゲリN5133I−69は、グロ
ビデンシア拳レトゲリN5133 (FERM P−
8082,α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、
エチオニン耐性、L−イソロイシン要求性、スレオニン
アルドラーゼ欠損性)を親株として、通常の変異処理方
法によって、L−ロイシン要求性株として得られたもの
である。
P−8083)(α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸
耐性、エチオニン耐性、L−イソロイシン要求性、L−
ロイシン要求性) プロヒデ:/シフaL/トゲIJ N5133I−6
9(FERMP−8085)(α−アミノ−β−ハイド
ロキシ吉草酸耐性、エチオニン耐性、L−(ソロイシン
要求性、L−ロイシン要求性、スレオニンアルドラーゼ
欠損性) プロビデンシア・レトゲリNS−140は、プロビデン
シア・レトゲリTY−1(FERM P−8079、
α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、エチオニン
耐性、L−イソロイシン要求性)を親株として、また、
プロビデンシア・レトゲリN5133I−69は、グロ
ビデンシア拳レトゲリN5133 (FERM P−
8082,α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、
エチオニン耐性、L−イソロイシン要求性、スレオニン
アルドラーゼ欠損性)を親株として、通常の変異処理方
法によって、L−ロイシン要求性株として得られたもの
である。
L−ロイシン要求性株を得るには、親株を紫外線照射す
るか、あるいは変異誘発剤(例えばN−メチル−N′−
二トローN−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホ
ン酸等)で処理したのち、通常の最少培地(例えば、デ
ィビスの最少培地)に、ごく微量のカザミノ酸または酵
母エキスを含むような平板培地にて30℃で3〜5日培
養し、生じた小さなコロニーな釣菌分離する。そしてこ
れらの菌株のうち生育にL−ロイシンを必要とするもの
を選定すればよい。
るか、あるいは変異誘発剤(例えばN−メチル−N′−
二トローN−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホ
ン酸等)で処理したのち、通常の最少培地(例えば、デ
ィビスの最少培地)に、ごく微量のカザミノ酸または酵
母エキスを含むような平板培地にて30℃で3〜5日培
養し、生じた小さなコロニーな釣菌分離する。そしてこ
れらの菌株のうち生育にL−ロイシンを必要とするもの
を選定すればよい。
さらに具体例を実施例1に示す。
本発明において用いる菌株とその親株のL−ロイシン要
求性を検定した結果を実施例1に示す。
求性を検定した結果を実施例1に示す。
本発明におけるL−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よび”セルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コ・・り酸等の如き有機酸、グリセロ
ールの如きアルコール類等を2〜15%、窒素源として
、酢酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、す/酸アンモニウム、
硝酸アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンそニ
アガス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0%、有
機微量栄養素としては、L−イソロイシン等の被要求物
貞が0.001〜0.4%、または必要に応じてコーン
ステイープリカー、ペプトン、酵母エキス等θ〜4%を
それぞれ適当血含有する培地が好適に用いられる。これ
らの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第1
鉄7水和物、硫酸マンガン4−6水和物等が少量添加さ
れる。
よび”セルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コ・・り酸等の如き有機酸、グリセロ
ールの如きアルコール類等を2〜15%、窒素源として
、酢酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、す/酸アンモニウム、
硝酸アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンそニ
アガス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0%、有
機微量栄養素としては、L−イソロイシン等の被要求物
貞が0.001〜0.4%、または必要に応じてコーン
ステイープリカー、ペプトン、酵母エキス等θ〜4%を
それぞれ適当血含有する培地が好適に用いられる。これ
らの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第1
鉄7水和物、硫酸マンガン4−6水和物等が少量添加さ
れる。
培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培地のpH
は5から9に、温度は24〜37℃に調節し、48〜1
20時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。
は5から9に、温度は24〜37℃に調節し、48〜1
20時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。
培養液よりL−スレオニンを採取するには、例えば菌体
を除去した培養P液をpf(2に塩酸で調製したのち、
強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液後、希アンモニア
水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後、濃縮する。こ
れにアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を
集め、L−スレオニンを得ることができる。
を除去した培養P液をpf(2に塩酸で調製したのち、
強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液後、希アンモニア
水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後、濃縮する。こ
れにアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を
集め、L−スレオニンを得ることができる。
実施例1
A、(L−ロイシン要求性変異株の取得)プロビデンシ
ア・レトゲリTY−1(FgRMP−8071j、
α−アミノ−β−)1イドロキシ吉草酸耐性、L−エチ
オニン耐性、L−インロイシン要求性)または、プロビ
デンシア・し ト ゲ リ NS 133 (FE
RM P−8082、α −アミノーβ−)・イド
ロキシ吉草酸耐性、L−エチオニン耐性、L−インロイ
シン要求性。
ア・レトゲリTY−1(FgRMP−8071j、
α−アミノ−β−)1イドロキシ吉草酸耐性、L−エチ
オニン耐性、L−インロイシン要求性)または、プロビ
デンシア・し ト ゲ リ NS 133 (FE
RM P−8082、α −アミノーβ−)・イド
ロキシ吉草酸耐性、L−エチオニン耐性、L−インロイ
シン要求性。
スレオニンアルドラーゼ欠損性)の菌体に、通常の方法
で紫外線照射し、この細胞を、ポリ3プトンo、oi%
添加した寒天平板培地(グルコース0.5%、硫安0.
1%、リン酸第1カリウム0.3 % 、 リン酸第
2カリウム0.7%。
で紫外線照射し、この細胞を、ポリ3プトンo、oi%
添加した寒天平板培地(グルコース0.5%、硫安0.
1%、リン酸第1カリウム0.3 % 、 リン酸第
2カリウム0.7%。
硫酸マグネシウム7水和物0.01%、L−インロイシ
ンo、oos%、寒天2%)に塗布した。
ンo、oos%、寒天2%)に塗布した。
次に、30℃にて4〜6日間培養し、生じたコロニーの
うち小さなコロニーを釣菌分離した。分離された菌株の
うちより実施例1のBをこ示す方法により、L−ロイシ
ン要求性変異株を選出した。
うち小さなコロニーを釣菌分離した。分離された菌株の
うちより実施例1のBをこ示す方法により、L−ロイシ
ン要求性変異株を選出した。
B、(L−ロイシン要求性の検定)
下記第1表に示す各菌株を、プイヨ/寒天斜面培地で2
4時間培養しその菌体をごく機敏かきとり、L−ロイシ
ン無添加、およびL−ロイシン0.01%添加した下記
組成の合成寒天平板培地にうずく塗布し、30℃にて4
日間培養しその生育の有無を観察した。L−ロイシン無
添加寒天平板培地で生育できず、L−ロイシン添加寒天
平板培地で生育するものをL−ロイシン要求性変異株と
した。
4時間培養しその菌体をごく機敏かきとり、L−ロイシ
ン無添加、およびL−ロイシン0.01%添加した下記
組成の合成寒天平板培地にうずく塗布し、30℃にて4
日間培養しその生育の有無を観察した。L−ロイシン無
添加寒天平板培地で生育できず、L−ロイシン添加寒天
平板培地で生育するものをL−ロイシン要求性変異株と
した。
合成寒天培地
グルコース 0.5 %
(NH4h 504 0.1 %KH,P0.
0.3 % に、f(PO40,7% Mg S 04・7El*OO,01% −L−
イソロイシン 0.005% 寒 天 2096 結果は第1表に示すとおりであり、本発明方法で使用す
るL−ロイシン要求性株プロビデンシアーレトゲリMS
−140およびプロビデンシア・レトゲリN5133I
−69は、それぞれ親株のプロビデンシア・レトゲリT
Y−1,およびプロビデ/770レトゲリN5133と
の比較より明らかに、L−ロイシン要求性を獲得してい
る。
0.3 % に、f(PO40,7% Mg S 04・7El*OO,01% −L−
イソロイシン 0.005% 寒 天 2096 結果は第1表に示すとおりであり、本発明方法で使用す
るL−ロイシン要求性株プロビデンシアーレトゲリMS
−140およびプロビデンシア・レトゲリN5133I
−69は、それぞれ親株のプロビデンシア・レトゲリT
Y−1,およびプロビデ/770レトゲリN5133と
の比較より明らかに、L−ロイシン要求性を獲得してい
る。
第1表
(2) +:生育あり −二生育なし実施例2
第2表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で30
℃16時間振とうして前培養したのち、あらかじめ11
5℃、10分間蒸気滅菌した下記組成の主発酵用培地(
ただし表−2の比較例として示した親株の場合にはL−
ロイシンは無添加)40mを含む14容、三角フラスコ
に植継ぎ30℃、l 50 rpm % 振幅3al
の条件下で90時間培養した。
℃16時間振とうして前培養したのち、あらかじめ11
5℃、10分間蒸気滅菌した下記組成の主発酵用培地(
ただし表−2の比較例として示した親株の場合にはL−
ロイシンは無添加)40mを含む14容、三角フラスコ
に植継ぎ30℃、l 50 rpm % 振幅3al
の条件下で90時間培養した。
発酵用培地
グルコース(別滅菌) 8 %(NL)z
5O42% KHIP0. 0.1 %Mg
SO4・7H意0 0.04 %Fe+
2 ya Mn+2 wa L−イソロイシン 0.0025 %L−
ロイシン 0.08 5%CaC05(別
滅菌) 4 %p)I
7.0 7.0(ト)OH神種培養終了後、菌
体、炭酸カルシウムを除去したP液中のL−スレオニン
濃度を自動アミノ酸分析計(日本電子 JLC200A
)で定置したところ第2表に示すような結果を得た。
5O42% KHIP0. 0.1 %Mg
SO4・7H意0 0.04 %Fe+
2 ya Mn+2 wa L−イソロイシン 0.0025 %L−
ロイシン 0.08 5%CaC05(別
滅菌) 4 %p)I
7.0 7.0(ト)OH神種培養終了後、菌
体、炭酸カルシウムを除去したP液中のL−スレオニン
濃度を自動アミノ酸分析計(日本電子 JLC200A
)で定置したところ第2表に示すような結果を得た。
第2表
スレオニン生成収率は、消費グルコース<対する生成ス
レオニンの重量収率で表わした。
レオニンの重量収率で表わした。
蓄積濃度、L−スレオニン生成収率ともいずれの場合も
親株に比べて有意に向上した。
親株に比べて有意に向上した。
実施例3
プロビデンシア拳レトゲリMS−140を、液体ブイヨ
ン培地で30℃、16時間振とう培養し、これを実施例
2の発酵用培地のうち(NH4)*SO4を0.5%、
グルコースを4.0%とした培地900dを分注したガ
ラス製小型ジャーファーメンタ−へ10%となるように
接種した。30℃にて、800rpms通気量I Wm
tcて、通気攪拌培養を開始した。
ン培地で30℃、16時間振とう培養し、これを実施例
2の発酵用培地のうち(NH4)*SO4を0.5%、
グルコースを4.0%とした培地900dを分注したガ
ラス製小型ジャーファーメンタ−へ10%となるように
接種した。30℃にて、800rpms通気量I Wm
tcて、通気攪拌培養を開始した。
pH調節および窒素源の供給は、255%アンモニア水
にて行い、pHは、6.5〜8.0に維持した。
にて行い、pHは、6.5〜8.0に維持した。
グルコースを適宜添加し、最終的に、合計150Fのグ
ルコース培養に用いた。
ルコース培養に用いた。
76時間培養後、培養液中には26.Of/l のL−
スレオニン(対グルコース重1収率17.34%)が生
成した。
スレオニン(対グルコース重1収率17.34%)が生
成した。
培養液より菌体な除き、その500dを、強力チオン交
換樹脂ダイヤイオン5K−IBCH型〕のカラムに通し
た。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸着
成分を溶出し、脱色後、減圧濃縮した。これにエタノー
ルを加え、冷却し、生成した結晶を集めて乾燥した結果
、純度96%[hのL−スレオニンの結晶1L5fが得
られた。
換樹脂ダイヤイオン5K−IBCH型〕のカラムに通し
た。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸着
成分を溶出し、脱色後、減圧濃縮した。これにエタノー
ルを加え、冷却し、生成した結晶を集めて乾燥した結果
、純度96%[hのL−スレオニンの結晶1L5fが得
られた。
本発明法により、高い収率および蓄積濃度でL−スレオ
ニン生成が可能となり、より安価なL−スレオニンの生
産が可能となる。
ニン生成が可能となり、より安価なL−スレオニンの生
産が可能となる。
特許出願大東し株式会社
Claims (2)
- (1)プロビデンシア(Providencia)属に
属し、生育のために少なくともL−ロイシンを必要とし
、かつL−スレオニン生産能を有する微生物を培養して
、培養液中にL−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培
養液よりL−スレオニンを採取することを特徴とする発
酵法によるL−スレオニンの製造方法 - (2)使用する微生物がさらにスレオニンアルドラーゼ
欠損性を有する微生物であることを特徴とする特許請求
範囲第1項記載の発酵法によるL−スレオニンの製造方
法
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9958985A JPS61260891A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
DE8686106204T DE3682709D1 (de) | 1985-05-13 | 1986-05-06 | Verfahren zur herstellung von l-threonin durch fermentation. |
EP86106204A EP0205849B1 (en) | 1985-05-13 | 1986-05-06 | Process for producing l-threonine by fermentation |
US07/357,690 US5098835A (en) | 1985-05-13 | 1989-05-25 | Process for producing l-threonine by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9958985A JPS61260891A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26775186A Division JPS62171692A (ja) | 1986-11-12 | 1986-11-12 | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61260891A true JPS61260891A (ja) | 1986-11-19 |
JPS6235759B2 JPS6235759B2 (ja) | 1987-08-04 |
Family
ID=14251279
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9958985A Granted JPS61260891A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61260891A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62171692A (ja) * | 1986-11-12 | 1987-07-28 | Toray Ind Inc | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
-
1985
- 1985-05-13 JP JP9958985A patent/JPS61260891A/ja active Granted
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62171692A (ja) * | 1986-11-12 | 1987-07-28 | Toray Ind Inc | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
JPS6324679B2 (ja) * | 1986-11-12 | 1988-05-21 | Toray Industries |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6235759B2 (ja) | 1987-08-04 |
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