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JPS61260891A - 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 - Google Patents

発酵法によるl−スレオニンの製造方法

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Publication number
JPS61260891A
JPS61260891A JP9958985A JP9958985A JPS61260891A JP S61260891 A JPS61260891 A JP S61260891A JP 9958985 A JP9958985 A JP 9958985A JP 9958985 A JP9958985 A JP 9958985A JP S61260891 A JPS61260891 A JP S61260891A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
threonine
leucine
providencia
microorganism
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP9958985A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS6235759B2 (ja
Inventor
Masanari Yamada
勝成 山田
Hiroki Tsutsui
筒井 浩己
Kyosuke Yomoto
四本 喬介
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries Inc filed Critical Toray Industries Inc
Priority to JP9958985A priority Critical patent/JPS61260891A/ja
Priority to DE8686106204T priority patent/DE3682709D1/de
Priority to EP86106204A priority patent/EP0205849B1/en
Publication of JPS61260891A publication Critical patent/JPS61260891A/ja
Publication of JPS6235759B2 publication Critical patent/JPS6235759B2/ja
Priority to US07/357,690 priority patent/US5098835A/en
Granted legal-status Critical Current

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、発酵法によるL−スレオニンの製造方法に関
するものである。
〔従来の技術〕
プロテウスまたはプロビデンシアに属する微生物を用い
た発酵法によるL−スレオニンの製造方法としては、L
−イソロイシン要求性味を用いる方法(特公昭43−4
440号公報)やα−アミノーβ−ノ・イドロキン吉草
酸に耐性を有し力1つL−インロイシン要求性を有する
微生物を用いる方法(日本農芸化学会講演要旨集p、9
(1970) )が知られている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかし、これらの方法によるL−スレオニンの生成蓄積
濃度、または糖などの原料からのし一スレオニ/生成収
率は十分に満足できるものではなかった。
〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者ら
は、さらに生産性の高いL−スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロテウス属に属しL−スレオ
ニン生産能を有する微生物にL−ロイシン要求性を付与
することによって、L−スレオニン蓄積濃度、生成収率
が著しく向上することを見い出し本発明に到達した。
本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属シ(
バーシーのマニュアル・オプ・システマテイノクバクテ
リオロジーVo1. l (1984)。
第495〜496頁に従う)、生育のために少なくとも
L−ロイシンを必要とする性質とL−スレオニン生成能
をあわせ持つものである。またL−イソロイシンに対す
る栄養要求性、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸等
スレオニンアナローグに対する耐性およびエチオニン等
メチオニンアナローグに対する耐性はL−スレオニン生
成能に有効に作用するので、これらのいくつかの特性な
いしはすべての特性をあわせ持つ微生物がより好ましく
用いられる。またこれら特性は通常の変異誘導操作によ
り付与することが可能である。
ここにいう栄養要求性とは、広義の意味であり、不完全
欠失型(いわゆるLeaky型)も含むものである。
さらにその要求物質の生合成前駆物質で要求性が満足さ
れる場合も含むものである。
本発明で用いられる微生物は変異株により提供されその
代表的なものとしては、例えば以下のものがある。
フロヒデ7シ781/)ゲリNS−140(FERM 
P−8083)(α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸
耐性、エチオニン耐性、L−イソロイシン要求性、L−
ロイシン要求性) プロヒデ:/シフaL/トゲIJ  N5133I−6
9(FERMP−8085)(α−アミノ−β−ハイド
ロキシ吉草酸耐性、エチオニン耐性、L−(ソロイシン
要求性、L−ロイシン要求性、スレオニンアルドラーゼ
欠損性) プロビデンシア・レトゲリNS−140は、プロビデン
シア・レトゲリTY−1(FERM  P−8079、
α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、エチオニン
耐性、L−イソロイシン要求性)を親株として、また、
プロビデンシア・レトゲリN5133I−69は、グロ
ビデンシア拳レトゲリN5133 (FERM  P−
8082,α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、
エチオニン耐性、L−イソロイシン要求性、スレオニン
アルドラーゼ欠損性)を親株として、通常の変異処理方
法によって、L−ロイシン要求性株として得られたもの
である。
L−ロイシン要求性株を得るには、親株を紫外線照射す
るか、あるいは変異誘発剤(例えばN−メチル−N′−
二トローN−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホ
ン酸等)で処理したのち、通常の最少培地(例えば、デ
ィビスの最少培地)に、ごく微量のカザミノ酸または酵
母エキスを含むような平板培地にて30℃で3〜5日培
養し、生じた小さなコロニーな釣菌分離する。そしてこ
れらの菌株のうち生育にL−ロイシンを必要とするもの
を選定すればよい。
さらに具体例を実施例1に示す。
本発明において用いる菌株とその親株のL−ロイシン要
求性を検定した結果を実施例1に示す。
本発明におけるL−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よび”セルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コ・・り酸等の如き有機酸、グリセロ
ールの如きアルコール類等を2〜15%、窒素源として
、酢酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、す/酸アンモニウム、
硝酸アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンそニ
アガス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0%、有
機微量栄養素としては、L−イソロイシン等の被要求物
貞が0.001〜0.4%、または必要に応じてコーン
ステイープリカー、ペプトン、酵母エキス等θ〜4%を
それぞれ適当血含有する培地が好適に用いられる。これ
らの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第1
鉄7水和物、硫酸マンガン4−6水和物等が少量添加さ
れる。
培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培地のpH
は5から9に、温度は24〜37℃に調節し、48〜1
20時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。
培養液よりL−スレオニンを採取するには、例えば菌体
を除去した培養P液をpf(2に塩酸で調製したのち、
強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液後、希アンモニア
水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後、濃縮する。こ
れにアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を
集め、L−スレオニンを得ることができる。
〔実施例〕
実施例1 A、(L−ロイシン要求性変異株の取得)プロビデンシ
ア・レトゲリTY−1(FgRMP−8071j、  
α−アミノ−β−)1イドロキシ吉草酸耐性、L−エチ
オニン耐性、L−インロイシン要求性)または、プロビ
デンシア・し ト ゲ リ NS  133  (FE
RM   P−8082、α −アミノーβ−)・イド
ロキシ吉草酸耐性、L−エチオニン耐性、L−インロイ
シン要求性。
スレオニンアルドラーゼ欠損性)の菌体に、通常の方法
で紫外線照射し、この細胞を、ポリ3プトンo、oi%
添加した寒天平板培地(グルコース0.5%、硫安0.
1%、リン酸第1カリウム0.3 % 、  リン酸第
2カリウム0.7%。
硫酸マグネシウム7水和物0.01%、L−インロイシ
ンo、oos%、寒天2%)に塗布した。
次に、30℃にて4〜6日間培養し、生じたコロニーの
うち小さなコロニーを釣菌分離した。分離された菌株の
うちより実施例1のBをこ示す方法により、L−ロイシ
ン要求性変異株を選出した。
B、(L−ロイシン要求性の検定) 下記第1表に示す各菌株を、プイヨ/寒天斜面培地で2
4時間培養しその菌体をごく機敏かきとり、L−ロイシ
ン無添加、およびL−ロイシン0.01%添加した下記
組成の合成寒天平板培地にうずく塗布し、30℃にて4
日間培養しその生育の有無を観察した。L−ロイシン無
添加寒天平板培地で生育できず、L−ロイシン添加寒天
平板培地で生育するものをL−ロイシン要求性変異株と
した。
合成寒天培地 グルコース   0.5  % (NH4h 504    0.1  %KH,P0.
    0.3  % に、f(PO40,7% Mg S 04・7El*OO,01%    −L−
イソロイシン   0.005% 寒  天       2096 結果は第1表に示すとおりであり、本発明方法で使用す
るL−ロイシン要求性株プロビデンシアーレトゲリMS
−140およびプロビデンシア・レトゲリN5133I
−69は、それぞれ親株のプロビデンシア・レトゲリT
Y−1,およびプロビデ/770レトゲリN5133と
の比較より明らかに、L−ロイシン要求性を獲得してい
る。
第1表 (2) +:生育あり  −二生育なし実施例2 第2表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で30
℃16時間振とうして前培養したのち、あらかじめ11
5℃、10分間蒸気滅菌した下記組成の主発酵用培地(
ただし表−2の比較例として示した親株の場合にはL−
ロイシンは無添加)40mを含む14容、三角フラスコ
に植継ぎ30℃、l 50 rpm %  振幅3al
の条件下で90時間培養した。
発酵用培地 グルコース(別滅菌)    8    %(NL)z
 5O42% KHIP0.        0.1    %Mg 
SO4・7H意0      0.04   %Fe+
2    ya Mn+2    wa L−イソロイシン      0.0025  %L−
ロイシン      0.08  5%CaC05(別
滅菌)     4    %p)I        
   7.0  7.0(ト)OH神種培養終了後、菌
体、炭酸カルシウムを除去したP液中のL−スレオニン
濃度を自動アミノ酸分析計(日本電子 JLC200A
)で定置したところ第2表に示すような結果を得た。
第2表 スレオニン生成収率は、消費グルコース<対する生成ス
レオニンの重量収率で表わした。
蓄積濃度、L−スレオニン生成収率ともいずれの場合も
親株に比べて有意に向上した。
実施例3 プロビデンシア拳レトゲリMS−140を、液体ブイヨ
ン培地で30℃、16時間振とう培養し、これを実施例
2の発酵用培地のうち(NH4)*SO4を0.5%、
グルコースを4.0%とした培地900dを分注したガ
ラス製小型ジャーファーメンタ−へ10%となるように
接種した。30℃にて、800rpms通気量I Wm
 tcて、通気攪拌培養を開始した。
pH調節および窒素源の供給は、255%アンモニア水
にて行い、pHは、6.5〜8.0に維持した。
グルコースを適宜添加し、最終的に、合計150Fのグ
ルコース培養に用いた。
76時間培養後、培養液中には26.Of/l のL−
スレオニン(対グルコース重1収率17.34%)が生
成した。
培養液より菌体な除き、その500dを、強力チオン交
換樹脂ダイヤイオン5K−IBCH型〕のカラムに通し
た。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸着
成分を溶出し、脱色後、減圧濃縮した。これにエタノー
ルを加え、冷却し、生成した結晶を集めて乾燥した結果
、純度96%[hのL−スレオニンの結晶1L5fが得
られた。
〔発明の効果〕
本発明法により、高い収率および蓄積濃度でL−スレオ
ニン生成が可能となり、より安価なL−スレオニンの生
産が可能となる。
特許出願大東し株式会社

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)プロビデンシア(Providencia)属に
    属し、生育のために少なくともL−ロイシンを必要とし
    、かつL−スレオニン生産能を有する微生物を培養して
    、培養液中にL−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培
    養液よりL−スレオニンを採取することを特徴とする発
    酵法によるL−スレオニンの製造方法
  2. (2)使用する微生物がさらにスレオニンアルドラーゼ
    欠損性を有する微生物であることを特徴とする特許請求
    範囲第1項記載の発酵法によるL−スレオニンの製造方
JP9958985A 1985-05-13 1985-05-13 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 Granted JPS61260891A (ja)

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JP9958985A JPS61260891A (ja) 1985-05-13 1985-05-13 発酵法によるl−スレオニンの製造方法
DE8686106204T DE3682709D1 (de) 1985-05-13 1986-05-06 Verfahren zur herstellung von l-threonin durch fermentation.
EP86106204A EP0205849B1 (en) 1985-05-13 1986-05-06 Process for producing l-threonine by fermentation
US07/357,690 US5098835A (en) 1985-05-13 1989-05-25 Process for producing l-threonine by fermentation

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPS62171692A (ja) * 1986-11-12 1987-07-28 Toray Ind Inc 発酵法によるl−スレオニンの製造方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPS62171692A (ja) * 1986-11-12 1987-07-28 Toray Ind Inc 発酵法によるl−スレオニンの製造方法
JPS6324679B2 (ja) * 1986-11-12 1988-05-21 Toray Industries

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