JPS6122955B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗生物質ゲンタミシンC₁a
（Gentamicin C₁a）の新規な製造法に関する。 従来より抗生物質ゲンタミシンC₁a生産菌とし
ては、ミクロモノスポラ・プルプレア
（Micromonospora purpurea；特公昭44−21394
号、米国特許第3091572号、Antimicrob・agents
and chemother.1963P1、８、14、17および
116）、ミクロモノスポラ・エチノスポラ
（Micromonspora echinospora）およびその２変
種（上記同一文献）、ミクロモノスポラ・サガミ
エンシス（Micromonospora sagamiensis）およ
びその２変種（特開昭49−42888号）、およびミク
ロモノスポラ・プルプレア・バリエタス・ニグレ
ツセンス（Micromonospora purpurea var・
nigrescens：ハンガリー国特許第168778号、J.
Antibiot.30：945（1977）が知られていた。上記
の通り、抗生物質ゲンタミシンC₁a生産菌は、す
べてミクロモノスポラ属（Micromonospora）に
属するものであり、その形態的特徴は基生菌糸に
一個づつ胞子を形成するものであり、さらにミク
ロモノスポラ属はミクロモノスポラ科
（Micromonospraceae）に属するものであつた
（Bergeys manual of determinative
bacteriology第８版（1974））。 本発明者らは、静岡県富士市の畑土壌より分離
した放線菌G367株が抗生物質ゲンタミシンC₁aを
産生することを見い出し、後述する通り、放線菌
G367株がダクチロスポランジウム属
（Dactylosporangium）に属するもので、その形
態的特徴は基性菌糸に胞子のうを着生し、胞子の
う中に鞭毛を有する胞子を形成するもので、さら
にこのダクチロスポランジウム属はアクチノプラ
ネス科（Actinoplanaceae）に属するもので、従
来のミクロモノスポラ属とは分類学上、明らかに
科の段階での相違が認められるもので、抗生物質
ゲンタミシンC₁aの新規な生産菌であることを見
い出した。 また上記の放線菌G367株の菌学的諸性状は次
の通りである。 〔〕 形態的性状 リンゴ酸カルシウム寒天培地〔Bact.Rev.
21：１（1957）〕上、30℃、３−７日間培養
し、観察した所見は次の通りである。 基生菌糸は曲線状または屈曲状で、分枝をな
して伸長し、分断はせず、直径0.5〜0.8μであ
り、気菌糸は形成しない。 基性菌糸に、大きさ1.5〜2.0×2.0〜2.5μの
球状または楕円状物体の着生が、寒天培地中に
埋つた状態でみられる。 基生菌糸より短かい胞子のう柄を生じ、胞子
のうは指形で、寒天培地表面上に、１個または
房状に形成する。胞子のうの大きさは、1.0〜
1.5×4.0〜6.5μで、中に３〜４個の胞子がたて
に一列に入つている。 胞子は水中で運動性があり、形は球形、楕円
形または洋梨形を呈し、大きさは1.0〜1.5×1.5
〜2.5μであり、極性で房状の鞭毛を有してい
る。 〔〕 ジアミノピメリン酸組成 全菌体分析によるジアミノピメリン酸は、メ
ゾー型およびメゾー型よりRm値の低いもの
（slow moving diaminopimelic acid）が検出
された。 〔〕 各種培地における生育状態等 各種培地上で、30℃、14日間培養し、観察し
た所見は次表の通りであり、オート・ミール寒
天培地上で未発育の気菌糸がわずかに形成され
る以外は、気菌糸の形成は認められず、また胞
子のうはリンゴ酸カルシウム寒天培地上で良
好、土壌寒天培地〔J.gen.Microbiol.50：295
（1968）〕上で、中程度であり、その他の培地上
ではわずか、またはほとんど形成されなかつ
た。 なお、色の表示は、カラー・ハーモニー・マ
ニアル（Color Harmony Manual）第４版1958
年（Container Corporation of America）に
よる色の分類に従つたものである。

【表】

【表】 〔〕 生理的性状 生理的諸性状は下記の通りである。 (1) 炭素源の資化性

【表】

【表】

【表】 (2) 生育温度範囲：20〜40℃ (3) 脱脂牛乳：ペプトン化および凝固とともに
陽性 (4) メラニン様色素の生成：陰性（チロシンお
よびペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地
上） (5) スターチの加水分解：陽性 (6) セルロースの分解：陰性 (7) カゼインの分解：陽性 (8) チロシンの分解：陰性 (9) ゼラチンの液化：陽性 (10) 硫化水素の生成：弱い陽性 (11) 硝酸塩の還元：陽性 (12) 生育PH：PH5.5〜9.0 上記の通り、本菌G367の特徴としては、基生
菌糸に指形の胞子のうを着生し、胞子のう中に胞
子がたてに一列にならび、胞子に房状の鞭毛を有
していることにある。 このように、胞子のうを形成し、その中に鞭毛
を有する胞子を形成するものは、アクチノプラネ
ス科（Actinoplanaceae）に属するものであつ
て、胞子のうが指形で、その中にたてに一列に胞
子が形成されるものは、ダクチロスポランジウム
属に属する。 さらに、本菌G367株は有機培地上で、基生菌
糸が橙褐色ないし褐色を呈し、褐色の可溶性色素
を生ずる特徴を有することにより、ダクチロスポ
ランジウム・タイランデンセ
（Dactylosporangium thailandense）〔Arch.
Microbiol.58：42−52（1967）〕に属するものと
同定した。 よつて、本菌G367を、ダクチロスポランジウ
ム・タイランデンセG367と命名したもので、ま
た本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に「微
工研菌託第4840号」として申請されている。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、ダクチロスポランジウム属に属する抗生物質
ゲンタミシンC₁a生産菌を培地に培養し、その培
養物より抗生物質ゲンタミシンC₁aを採取するこ
とを特徴とする抗生物質ゲンタミシンC₁aの製造
法である。 まず本発明を実施するに当り使用されるダクチ
ロスポランジウム属に属する抗生物質ゲンタミシ
ンC₁a（以下単に、ゲンタミシンC₁aという）の
生産菌としては、上記のダクチロスポランジウ
ム・タイランデンセ G367株がその一例として
挙られるもので、また本発明の使用菌はこれに限
定されるものでなく、ダクチロスポランジウム属
に属するゲンタミシンC₁a生産菌であればよく、
天然または変位株も使用し得る。 次いで、本発明のゲンタミシンC₁aを製造する
に当つて例示すれば、上記のダクチロスポランジ
ウム属に属するゲンタミシンC₁a生産菌を通常の
微生物の培養に使用する培地成分を含む培地にて
好気的に培養することによつて得られる。培地と
しては、固型培地または液体培地が用いられる
が、特に大量生産のためには液体培地、特に水性
培地が適当である。 培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用され得る。炭素源として
は同化可能な炭素化合物であればよく、例えばグ
ルコース、シユクロース、マルトース、スター
チ、デキストリン、モラツセなどが使用される。
窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよ
く、例えばコーン・スチープ・リカー、大豆粉、
綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エキス、酵
母エキス、カゼイン加水分解物、アンモニウム
塩、硝酸塩などが使用される。その他、リン酸
塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナト
リウム、コバルト、鉄、マンガンなどの塩類が必
要に応じて使用される。 培養温度は菌が発育し、ゲンタミシンC₁aを生
産する範囲内で適宜変更し得るが、特に好ましく
は25〜35℃である。培養時間は、条件によつて多
少異なるが、通常100〜200時間程度であつて、ゲ
ンタミシンC₁aが最高力価に達する時期を見計つ
て適当な時期に培養を終了すればよい。 このようにして得られたゲンタミシンC₁a生産
菌の液体培養の培養物中において、ゲンタミシン
C₁aは液体部に大部分産生されている。 次いでこのゲンタミシンC₁a生産菌の培養物か
らゲンタミシンC₁aを採取するのであるが、ゲン
タミシンC₁aは水溶性の塩基性アミノ糖化合物で
あることを利用して分離精製を行なうことが簡便
である。また生産されたゲンタミシンC₁aはバチ
ルス・ズブチリスPC1219を被検菌として、通常
の寒天板法により活性区分の確認、および定量を
行なつたものである。 ゲンタミシンC₁aの分離精製手段の一例を示す
と次の通りである。すなわちゲンタミシンC₁a生
産菌は前述の如く培養して得られる培養物から固
形分を除去して培養液を得るのであるが、ゲン
タミシンC₁aがアミノ糖化合物であるためにその
培養物のPHを一旦酸性に調整し、これを中和して
過してその培養液を得ることが好ましく、次
いでこの培養液を陽イオン交換樹脂例えばアン
バーライトIRC−50（NH₄ ⁺型）のカラムにチヤ
ージせしめて吸着せしめ、これにより活性物質を
2Nアンモニア水にて溶出せしめ、さらにその溶
出液を濃縮した後、そのPHを調整し、陽イオン交
換樹脂例えばCM−セフアデツクスＣ−25（NH₄ ⁺
型）のカラムにチヤージせしめて吸着せしめ、０
〜0.35Nの濃度勾配をもたせたアンモニア水にて
溶出せしめ、その活性画分を得、これを減圧濃縮
し、凍結乾燥することによりゲンタミシンC₁aの
精製白色粉末を遊離塩基の型にて得られる。また
このようにして得られるゲンタミシンC₁aは薄層
クロマトグラフイーにて単一スポツトを示すもの
であることが簡便になし得る。 次いでこのようにして得られた本発明のゲンタ
ミシンC₁aの物理化学的性状を挙れば次の通りで
ある。 分子量 449（マススペクトルより） 分子式 C₁₉H₃₉N₅O₇ 比旋光度 〔α〕^２６ _Ｄ＝＋96.2（Ｃ＝0.39、H₂O） ペーパークロマトグラフイー クロロホルム：メタノール：17％アンモニア水
（２：１：１） Rf＝0.22 プロパノール：ピリジン：酢酸：水＝（６：
４：１：３）上層液 Rf＝0.29 色性状 白色粉末 上記の性状、さらにマススペクトルの各ピー
ク、核磁気共鳴スペクトルなどより、本発明によ
り得られる化合物が、前記の文献記載のゲンタミ
シンC₁aと同一物質であると同定された。 次に本発明の実施例を挙げて具体的に説明する
が、本発明はこれにより何んら限定されるもので
はない。 実施例 １ デキストリン１％、グルコース１％、カゼイン
水解物0.5％、酵母エキス0.5％、炭酸カルシウム
0.1％を含有する培地（PH7.0）100mlを500ml容三
角フラスコに分取し、120℃、20分間加熱殺菌し
た。本培地10本に、各々ダクチロスポランジウ
ム・タイランデンセG367株の斜面培養液よりの
一白金耳を接種し、30℃、120時間振盪培養し
た。次いでこれを上記と同一組成の加熱殺菌した
培地20を含有する30容ジヤーフアーメンター
に移植し、30℃、72時間、300rpm、毎分20の
無菌空気の条件下で通気撹拌培養した。次いでデ
キストリン５％、グルコース0.5％、脱脂大豆粉
３％、炭酸カルシウム0.7％、塩化コバルト
1.3ppmを含有する加熱殺菌した培地（PH7.2）
200を含有する250容タンクに上記の培養物10
を移植し、30℃、120時間、250rpm、毎分100
の無菌空気の条件下通気撹拌培養し、培養物約
190を得た。 次いで、実施例２の如くして、その培養物より
ゲンタミシンC₁aを分離精製するものである。 実施例 ２ 実施例１で得られた培養物を、12N硫酸水溶液
にてPH２に調整し、30分間撹拌した後、濃アンモ
ニア水にてPH7.0に調整し、さらにこれに過助
剤としてパーライト（商品名）４Kgを加えて過
し、次いで得られた培養液を、アンバーライト
IRC−50（ローム・アンド・ハース社製）（NH₄ ⁺
型）10を充填したカラムにチヤージし、水洗し
た後、2Nアンモニア水20にて溶出せしめ、そ
の全溶出液を得て、これを100mlまで減圧濃縮し
た。 次いでこの濃縮液を6N硫酸水溶液にてPH7.0に
調整し、これを、CM−セフアデツクスＣ−25
（フアルマシア・フアイン・ケミカル社製）
（NH₄ ⁺型）500mlを充填したカラム（径４cm）に
チヤージして活性物質を吸着せしめた。その後該
カラムを水洗後、０〜0.35Nの濃度勾配をもたせ
たアンモニア水５により溶出せしめ、溶出液を
20mlずつ分画した。各分画について、クロロホル
ム：メタノール：28％アンモニア水＝１：１：１
の下層を展開溶媒とした薄層クロマトグラフイー
を行ない、ニンヒドリン発色により目的物を確認
した。その結果、第235画分より245画分がゲンタ
ミシンC₁aのみを含有したものであつた。次いで
この画分を回収、合せて減圧濃縮し、次いで凍結
乾燥してゲンタミシンC₁a85mgを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ダクチロスポランジウム属に属する抗生物質
   ゲンタミシンC₁a生産菌を培地に培養し、その培
   養物より抗生物質ゲンタミシンC₁aを採取するこ
   とを特徴とする抗生物質ゲンタミシンC₁aの製造
   法。 ２ ダクチロスポランジウム属に属する抗生物質
   ゲンタミンC₁a生産菌が、ダクチロスポランジウ
   ム・タイランデンセ G367である特許請求の範
   囲第１項記載の抗生物質ゲンタミシンC₁aの製造
   法。