JPS61205487A - ヒトプロティンｃ活性の発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、ヒトプロティンＣ活性をコードしているＤＮ
Ａ化合物および組換えＤＮＡクローニングベクターに関
するものである。本発明のベクターによれば、真核性ま
たは原核性宿主細胞のいずれにおいても、この新規なり
ＮＡ化合物を発現させることができる。本発明はまた、
これらのクローニングベクターで形質転換された宿主細
胞に関するものである。本発明に係る形質転換宿主細胞
は、ヒトプロティンＣまたはその前駆体、誘導体あるい
はサブフラグメントを発現する。本発明に係るＤＮＡの
多くは、これまで、自然界においても、また実験室にお
いても合成されたことのないプロティンＣ誘導体の合成
に利用し得るものである。 発明の構成並びに目的 ビタミンに依存性の血漿タンパクであるプロティンＣは
、生理学的に非常に重要なタンパク質である。おそらく
、プロティンＣは、他のタンノぐり質と一緒になって、
血栓症の誘因である、血液凝固（凝血）に対する最も重
要なプロンレギュレーター（降下調整剤、ｄｏｗｎ　　
ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　）として作用すると思われる。換
言すると、プロティンＣ酵素系は、抗凝血作用に関する
主要な生理学的機構に係っている。 プロティンＣの生物学的重要性および潜在的な治療上の
重要性は、臨床上の所見から推察される。 先天性のホモ接合体性プロティンＣレベルの場合には、
罹患した家族において、幼児期早期における急奔性紫斑
病（しばしば致死的な播種性の血管内凝固の型をとる）
による死亡がみられる。ヘテロ接合体性のプロティンＣ
欠損症の場合には、罹患した人々は重篤な、再発性の血
栓塞栓症に苦しむことになる。Ｂ型血友病または第■因
子入損症の、治療のための血液濃縮物であって、不純物
としてプロティンＣを含んでいるものは、ヘテロ接合体
性プロティンＣレベルに有効であると同時に、ホモ接合
体性の血管内凝血を阻止し、治療するのにも有効である
ということが臨床上、充分に確立されている。 また、血栓塞栓症、あるいは、血栓塞栓症に至る前置的
な病的状態、即ち、播種住血管内凝固（凝血）、大けが
、大手術を受けた状態、およびがん等の状態にある場合
にも、プロティンＣレベルが異常に低くなるということ
が分っている。 ヒトプロティンＣは肝臓で生合成され、血漿中に存在し
ている、セリンプロテアーゼ（セリン分解酵素）前駆体
（酵素原）である。プロティンＣの生物学的な活性が完
全に発現されるためには、ビタミンに要求性の翻訳後（
ポスト−トランスレーション）修飾がなされる必要があ
る。ジスルフィド結合を有する二本鎖の成熟プロティン
Ｃ酵素原は、一本鎖前駆体の制限的タンパク分解によっ
て生成される。この制限的タンパク分解には、肝臓から
の新生（形成途上にある）ポリペプチドが分泌される間
に、〜３３アミノ酸残基からなるシグナルペプチド（下
記の残基１〜３３）の開裂（切断）、〜９アミノ酸残基
からなるプロペプチド（残基３４〜４２）の除去、並び
に残基１９８および１９９の除去が起こることによって
酵素原中に認められる２本鎖が形成される過程が含まれ
ていると考えられる。酵素原が活性化されて活性なセリ
ンプロテアーゼになる過程には、ＡＲＧ−ＬＥｕペプチ
ド結合（残基２１１および２１２）のタンパク分解的な
開裂が含まれる。この開裂により、２本鎖分子の大きい
方の鎖のアミノ末端を構成するドデカペプチド（残基２
００〜２ｉｉ）が放出される。プロティンＣは著しくグ
リコジル化されており；成熟酵素は〜２３呪の炭水化物
を含有している。また、プロティンＣはｒ−カルボキシ
グルタミン酸やβ−ヒドロキシアスパラギン酸等の多く
の一般的でないアミノ酸をも含んでいる。ｒ−カルボキ
シグルタミン酸（ｇｌａ）は、コファクターとしてビタ
ミンＫを必要とする、肝ミクロソームのカルボキシラー
ゼによって、グルタミン酸残基から産生される。通常、
原核生物は、組換え遺伝子から発現されたタンパク質を
グリコジル化、ｒ−カルボキシル化あるいはβ−ヒドロ
キシグリコジル化しないので、通常のヒトプロティンＣ
の翻訳後修飾があまり多くなされていない形のプロン ティへ〇誘導体の合成を初めて可能にした、という点で
本発明は意義深いものといえる。これらの特異な誘導体
は、以下に詳しく述べる様に、極めて大きい研究的価値
と臨床上の価値を有している。 、本明細書中に開示した発明の目的に沿って、下記の如
く、用語を定義する。 ＡＰＲ：アンピシリン耐性表現型またはアンピシリン耐
性（表現型）を付与する遺伝子。 ｅｐ：を−抗原（Ｆ）遺伝子の５Ｖ４Ｑ初期プロモータ
ー、

【−抗原結合部位、および５Ｖ４Ｑ複製起源からな
るＤＮＡセグメント。 機能的ポリペプチド：回収可能な、生物学的に活性なヘ
テロローガス（異質の）またはホモローガス（同質の）
ポリペプチドまたは前駆体、ヘテロローガス・ポリペプ
チドとホモローガス・ポリペプチドの一部または全体と
からなる、回収可能な生物活性ポリペプチド、あるいは
、ヘテロローガス・ポリペプチドと、特異的に開裂され
得る生物学的に不活性なポリペプチドからなる回収可能
な生物学的に不活性な融合ポリペプチド。 Ｇ４１８艮：Ｇ４１８耐性表現型または０４１８耐性を
付与する遺伝子。これは、ＫｍＲと同意義に用いられる
。 ＩＶＳ　　：イントロンをコードしているＤＮＡ。 介在配列とも称される。 ＭＳＶ　ＬＴＲ：ネズミ肉腫りイルスの長い末端重復（
ｔｅｒｍｉｎａｌ　　ｒｅｐｅａｔ）のプロモーター活
性を含有しているＤＮＡセグメント。 新生（形成途上にある）タンパク質：ｍＲＮＡ転写物の
翻訳によって生産されたポリペプチドであって、まだ、
如何なる翻訳後修飾もなされていない段階のポリペプチ
ド。 ＰＡ：ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮＡ
配列。 プロモーター：ＤＮＡのＲＮＡへの転写を指令するＤＮ
Ａ配列。 プロティンＣ活性：ヒトプロティンＣの生物学的機能、
および抗−ヒドブロチインＣ抗体ら結合活性ζζ関与す
る、ヒトプロティンＣのあらゆる性質を指す。 組換えＤＮＡクローニングベクター＝１またはそれ以上
の付加的なりＮＡ上セグメント付加され得る、または既
に付加されたＤＮＡ分子からなる、自律的に複製可能な
あらゆる物質を指し、プラスミドおよびファージを含む
が、これらに限定されるものではない。 組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターが挿入されて
いる組換えＤＮＡクローニングベクター。 レプリコン：プラスミドまたはその他のベクターの自律
的な複製をコントロールすると共に、その様な複製を行
わせるＤＮＡ配列。 制限フラグメント：１またはそれ以上の制限エンドヌク
レアーゼ酵素の作用によって生成された全ての線状ＤＮ
Ａ配列。 Ｒ５Ｖ　　ＬＴＲ：ラクス肉腫（Ｒｏｕｓ　Ｓａｒｃｏ
ｍａ）フィルスの長い末端重復のプロモーター活性を含
有しているＤＮＡ配列。 感受性宿主細胞：特定の抗生物質または他の毒性化合物
に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントの存在なしに
は、これらの存在下で増殖することができない宿主細胞
。 構造遺伝子二機能的ポリペプチドをコードしているあら
ゆるＤＮＡ配列であって、翻訳開始シグナルおよび翻訳
停止シグナルをも包含する。 ＴＣＲ：テトラサイクリン耐性表現型またはテトラサイ
クリン耐性を付与する遺伝子。 形質転換：受容宿主細胞にＤＮＡを導入することであっ
て、その結果、受容細胞の遺伝型に変化をもたらすこと
・ 形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。 翻訳活性化配列：リポソーム結合部位および５′−ＡＴ
Ｇ　−３／の如き翻訳開始コドンを包含するＤＮＡ配列
であって、ｍＲＮＡ転写物のペプチドまたはポリペプチ
ドへの翻訳に与る、あらゆるＤＮＡ配列。 酵素原：タンパク分解酵素の酵素活性を持たない前駆体
。 第１図−プラスミドｐＨＣ７の制限サイトおよび機能地
図。 第２図−プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の制限部位およ
び機能地図。 第３図−プラスミドｐＬ１３３の制限サイトおよび機能
地図。 第４図−プラスミドｐＬ１３２の制限サイトおよび機能
地図。 第５図−プラスミドｐＬ１４１の制限サイトおよび機能
地図。 第６図−プラスミドｐＬ１４２の制限サイトおよび機能
地図。 第７図−プラスミドｐＭｓＶ−ＨＰＣの制限サイトおよ
び機能地図。 第８図−プラスミドｐＭＭＴΔＢＰＶ−，，ＨＰＣの制
限サイトおよび機能地図。 第９図−プラスミドｐＬ１５１の制限サイトおよび機能
地図。 第１０図−プラスミドｐＣＺ　１０１　の制限サイトお
よび機能地図。 第１１図−プラスミドｐｃＺＩＱの制限サイトおよび機
能地図。 ｔ４１２　図−ｐＣＺ４５９　　の制限サイトおよび機
能地図。 本発明はヒトプロティンＣ活性を有するポリペプチドを
コードしている、組換えＤＮＡベクター類に関するもの
である。便宜上、本発明ベクターの暗号鎖だけを示すと
、それらベクターは以下の式で示される配列を有する： ５’−Ｒ４−ＲＭ−ＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴ’ｒＣＣＴＧ
ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＣＣＧＴ　ＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣ
ＴＧＧＡＧ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＴＧＣＡＴＡ　ＧＡＧ　
ＧＡＧ　ＡＴＣＴＧＴ　ＧＡＣＴＴＣＧＡＧ　ＧＡＧ　
ＧＣＣＡＡＧ　ＧＡＡＡＴＴ　’ｒＴＣＣＡＡ　ＡＡＴ
　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣＡＣＡＣＴＧ　ＧＣＣＴＴＣ
ＴＧＧ　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴ　Ｇ
ＡＣＣＡＧ　ＴＧＣＴＴＧ　ＧＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＧ
　ＧＡＧ　ＣＡ、ＣＣＣＧ　ＴＧＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧ
　ＴＧＣＴＧＣＧＧＧ　ＣＡＣＧＧＣＡＣＧ　ＴＧＣＡ
ＴＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧ
ＣＧＡＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧ　ＧＡＧＧＧ
ＣＣＧＣＴ’ｒＣＴＧＣＣＡＧ　ＣＧＣＧＡＧ　ＧＴＧ
ＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴ　’ｒＧＣＴＣＧ　ＣＴＧ　
ＧＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧ　ＣＡＴ　ＴＡ
ＣＴＧＣＣＴＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＧＧＣＴＧ
Ｇ　ＣＧＧ　ＣＧＣＴＧＴ　ＡＧＣＴＧＴ　ＧＣＧ　Ｃ
ＣＴ　ＧＧＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧ　ＧＧＧ　ＧＡＣＧＡ
ＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧ　ＴＧＴＣＡＣＣＣＣＧＣＡ　Ｇ
ＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＣＣＣＴ　ＴＧＴＧＧＧ　ＡＧＧ　
ＣＣＣＴＧＧ　ＡＡＧ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＧＡＧＡＡＧ
　　ＡＡＧ　　ＣＧＣＡＧＴ　　ＣＡＣＣＴＧ　　ＡＡ
Ａ　　ＣＧＡＧＡＣＡＣＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＣＣＡＡ
　　ＧＡＡ　　ＧＡＣＣＡＡＧＴＡ　　ＧＡＴ　　ＣＣ
Ｇ　　ＣＧＧ　　ＣＴＣＡＴ”ｒ　　ＧＡＴ　　ＧＧＧ
ＡＡ、Ｇ　　Ａ、ＴＧ　　ＡＣＣＡＧＧ　ＣＧＧ　　Ｇ
ＧＡ　　ＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧ　　ＣＡＧ　　ＧＴ
Ｇ　　ＧＴＣＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＣＴＣＡ　　Ａ
ＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＣＣＴＧＣ
ＧＧＧＧＣＡ　　ＧＴＧ　　ＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣ
ＴＣＣＴＧＧＧＴＧ　　ＣＴＧ、、ＡＣＡ　　ＧＣＧ　
　ＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴ　　ＧＡＧ　　ＴＣ
ＣＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＴＣＣＴＴ　　ＧＴＣＡＧＧ
　　ＣＴＴ　　ＧＧＡ　　ＧＡＧ　　ＴＡＴ　　ＧＡＣ
ＣＴＧ　　ＣＧＧＣＧＣＴＧＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　
　ＴＧＧ　　ＧＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＣＣＴＧ　　Ｇ
ＡＣＡＴＣＡＡＧ　　ＧＡＣ，ＧＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡ
ＣＣＣＣＡＡＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧ　　ＡＧＣＡＣＣＡ
ＣＣＧＡＣＡＡＴ　　ＧＡＣＡＴＣＧＣＡ　　ＣＴＧ　
　ＣＴＧＣＡＣＣＴＧ　　ＧＣＣＣＡＧ　　ＣＣＣＧＣ
ＣＡＣＣＣＴＣＴＣＧ　　ＣＡＧ　　ＡＣＣＡＴＡ　　
ＧＴＧ　　ＣＣＣＡＴＣ：　　ＴＧＣＣＴＣＣＣＧ　　
ＧＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴ　ＧＣＡ　　ＧＡＧＣＧＣＧ
ＡＧ　　ＣＴＣＡＡＴ　　ＣＡＧ　　ＧＣＣＧＧＣＣＡ
ＧＧＡＧ　　ＡＣＣＣＴＣＧＴＧ　　ＡＣＧ　　ＧＧＣ
ＴＧＧ　　ＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＡ　　
ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＡＧＧＣＣＡＡＧ　　ＡＧＡ　
　ＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＡＣＴＴＣ
ＡＴＣＡＡＧ　　ＡＴＴ　　ＣＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＧ
　　ＣＡＣＡＡＴ　　ＧＡＧ　　ＴＧＣＡＧＣＧＡＧＧ
ＴＣＡＴＧ　　ＡＧＣＡＡＣＡＴＧ　　ＧＴＧ　　ＴＣ
Ｔ　　ＧＡＣ；ＡＡＣＡＴＧ　　ＣＴＧ　　ＴＧＴ　　
ＧＣＧ　　ＧＧＣＡＴＣＣＴＣＧＧＧ　　ＧＡＣＣＧＧ
　　ＣＡＣ，ＧＡＴ　　ＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡ
ＣＡＧＴ　　ＧＧＧ　　ＧＧＧ　　ＣＣＣＡＴＧ　　Ｇ
ＴＣＧＣＣＴＣＣＴ’ｒＣＣＡＣＧＧＣＡＣＣＴＧＧ　
　ＴＴＣＣＴＧ　　ＧＴＧ　　ＧＧＣＣＴＧ　　ＧＴＧ
　　ＡＧＣＴＧＧ　　ＧＧＴＧＡＧ　　ＧＧＣＴＧＴ　
　ＧＧＧ　　ＣＴＣＣＴＴ　　ＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧ
ＣＧＴＴ　　ＴＡＣＡＣＣＡＡＡ　　ＧＴＣＡＧＣＣＧ
ＣＴＡＣ，ＣＴＣＧＡＣＴＧＧ　　ＡＴＣＣＡＴ　　Ｇ
ＧＧＣＡＣＡＴＣＡＧＡ　　ＧＡＣＡＡＧ　　ＧＡＡ　
　ＧＣＣＣＣＣＣＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＧＣＴＧＧ　　
ＧＣＡ　　ＣＣＴ　　ＴＡＧ−３’（式中、Ａはデオキ
シアデニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはデオキシシチ
ジル、Ｔはチミジルを表わし、 ｋは式： ％式％ ５／−ＣＡＣＣＡＧ　　ＧＴＧ　　ＣＴＧ　　ＣＧＧ　
　ＡＴＣＣＧＣＡＡＡ　　ＣＧＴ−３’ λ１は式： ％式％ で示される配列を有し、ＭはＯまたはＩ、ＮはＯまたは
１を表わす。ただし、Ｍが０であるときにはＮもＯであ
り；艮が式： ％式％ で示される配列を有するときにはＲ１は式：５／−ＡＴ
Ｇ　　ＴＧＧ　　ＣＡＣ，ＣＴＣＡＣＡ　　ＡＧＣＣＴ
ＣＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＴＴＣＧＴＧ　　ＧＣＣＡＣＣ
ＴＧＧＧＧＡ　　ＡＴ’ｒ　　ＴＣＣＧＧＣＡＣＡ　　
ＣＣＡ　　ＧＣＴＣＣＴ　　ＣＴＴ　　ＧＡＣＴＣＡ　
　ＧＴＧ　　ＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧ　　ＣＧ
Ｔ−３／ で示される配列を有し；さらに、艮が式：％式％ で示される配列を有するときには、Ｒ１は式：５／−Ａ
ＴＧ　　ＴＧＧ　　ＣＡＧ　　ＣＴＣＡＣＡ　　ＡＧＣ
ＣＴＣＣＴＧ　　ＣＴＧ　　’ｒＴＣＧＴＧ　　ＧＣＣ
ＡＣＣＴＧＧＧＧＡ　　ＡＴＴ　　’ｒＣＣＧＧＣＡＣ
Ａ　　ＣＣＡ　　ＧＣＴＣＣＴ　　ＣＴＴ　ＧＡＣＴＣ
Ａ　　ＧＴＧ　　Ｔ’ｒＣＴＣＣＡＧＣＡＣ，ＣＧＡＧ
　　ＣＧＴ　　ＧＣＣ−３’で示される配列を有する。 ）。 本発明の組換えＤＮＡベクターは、相互に（Ａ）暗号鎖 （Ｂ）真核性の転写および翻訳活性化配列；または、 （Ｃ）　Ｉｊｉ（抜性の転写および翻訳活性化配列；並
びに、 （Ｄ）！ベクターの、宿主内での自律的な複製または染
色体への組込みを与えるＤＮＡ配列からなる複数のＤＮ
Ａ配列をライゲート（結合）させることにより調製され
る。 本発明はまた、真核性宿主細胞内で、ヒトプロティンＣ
活性を持っているポリペプチドを生産する方法であって
： Ａ、転写および翻訳活性化配列が転写および翻訳解読相
内に位置している、上記変法の（Ｂ）に従って調製され
た組換えＤＮＡベクター（ただし、Ｎが１の場合、翻訳
活性化配列は翻訳開始コドンをコードしていない）によ
って真核性宿主細胞を形質転換し；次いで、 Ｂ、工程Ａで形質転換された宿主細胞を遺伝子の発現に
適した条件下において培養することからなる方法を提供
するものである。この方法の一つの実施態様では、組換
えＤＮＡベクターは、選択可能なマーカーを含有してい
る。 本発明はまた、原核性宿主細胞内で、ヒトプロティンＣ
活性を有するポリペプチドを生産する方法であって、別
法（Ｃ）に従って調製されたベクター（ただし、ＮはＯ
であって、ＭはＯまたは１であり、しかも、選択マーカ
ーを含有している）を用いる点においてのみ上記の方法
と異なる方法を提供するものである。 本発明ベクターはヒトプロティンＣをコードしており、
ＭおよびＮが１の場合には、これまで知られていなかっ
た新生ヒトプロティンＣのアミノ酸配列をコードしてい
る。以後の記述を容易にするために、新生ヒトプロティ
ンＣのアミノ酸配列に番号を付して示すと、該配列は式
： ％式％ ＶＡＬ　　ＳＥＲＰＨＥ　　ＬＥＵ　　ＡＳＮ　　ＣＹ
Ｓ　　ＳＥＮＬＥＵ　　ＡＳＰ　　ＡＳＮ　　ＧＬＹ　
　ＧＬＹ　　ＣＹＳ　　ＴＨλＡＬＡ　　ＰＲＯＧＬＹ
　　ＴＹＲＬＹＳ　　ＬＥＵ　　ＧＬＹＡＳＰ　　ＡＳ
Ｐ　　ＬＥＵ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＣＹＳ　　Ｈ１
ｓＰＲＯＡ、ＬＡ　　ＶＡＬ　　ＬＹＳ　　ＰＨＥ　　
ＰＲＯＣＹＳＬＥＵ　　ＩＬＥ　　ＡＳＰ　　ＧＬＹ　
　ＬＹＳ　　ＭＥＴ　　ＴＨＲＡ艮Ｇ　　ＡＲＧ　　Ｇ
ＬＹ　　ＡＳＰ　　ＳＥに　ＰＲＯＴ艮ＰＴＲＰ　　Ｖ
ＡＬ　　ＬＥＵ　　ＴＨＲＡＬＡ　　ＡＬＡ　　）ＩＩ
ＳＣＹＳ　　ＭＥＴ　　ｋｓＰｓ、’ＧｕＵ　　ＳＥ艮
　ＬＹＳ　　ＬＹＳＬＹＳ　　ＴＲＰ　　Ｃ，ＬＵ　　
ＬＥＵ　　ＡＳＰ　　ＬＥＵ　　ＡＳＰＴＨＲＬＥＵ　
　ＳＥＲ，ＧＬＮ　　ＴＨＲＩＬＥ　　ＶＡＬＰＲＯＩ
ＬＥ　　ＣＹＳ　　ＬＥＵ　　ＰＲＯＡＳＰ　　ＳＥ艮
ＬＥＵ　　ＶＡＬ　　ＴＨＲＧＬＹ　　’ｒＲＰ　　Ｇ
ＬＹ　　ＴＹＲＶＡＬ　　ＬＥＵ　　ＡＳＮ　　ＰＨＥ
　　ＩＬＥ　　ＬＹＳ　　ＩＬＥＰＲＯＶＡＬ　　ＶＡ
Ｌ　　ＰＲＯＩ（Ｉｓ　　ＡＳＮ　　ＧＬＵＡＳＰ　　
ＳＥＲＧＬＹ　　ＧＬＹ　　ＰＲＯＭＥＴ　　ＶＡＬ（
式中、Ｈ２Ｎ　はアミノ末端、−ＣＯＯＨはカルボキシ
末端、ＡＬＡはアラニン、ＡＩＬＧはアルギニン、ＡＳ
Ｎはアスパラギン、ＡＳＰはアスパラギン酸、ｃｙｓは
システィン、ＧＬＮはグルタミン、ＧＬＵはグルタミン
酸、ＧＬＹはグリシン、ＨＩＳはヒスチジン、ＩＬＥは
インロイシン、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳはリシン、Ｍ
ＥＴはメチオニン、ＰＨＥはフェニルアラニン、ＰＲＯ
はプロリン、ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはスレオニン、Ｔ
ＲＰはトリプトファン、ＴＹＲはチロシン、そしてＶＡ
Ｌはバリンを表わす） で示される。 本発明のＤＮＡ化合物は、ヒトプロティンＣ活性をコー
ドしているヒト肝臓ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡク
ローンから導かれる。ｃＤＮＡクローン（類）を組立て
るために、プロティンＣをコードしているｃＤＮＡの末
端に、５′ポＩＪ　Ｑ配列、３′ポリＣ配列、並びに５
′および３′の両側におけるＰｓｔ　Ｉ制限酵素認識配
列を組立てた。これらｃＤＮＡクローンの内、２個を操
作し、新生期のヒトプロティンＣの暗号配列と、その暗
号領域の５′および３′末端に位置する、非翻訳ｍＲＮ
ＡをコードしているＤＮＡ部分との両方を含むＤＮＡ分
子を組立てた。このＤＮＡ分子をプラスミドｐＢＲ３２
２のＰｓｔ　１部位に挿入し、プラスミドｐＨＣ７を組
立てた。従って、プラスミドｐＨｃ７は、前記の暗号配
列（ＭとＮの両方が１である配列）、並びに、これも分
子を１本鎖だけで示すと、式： ％式％ （式中、Ａはデオキシアニル、Ｇはデオキシグアニル、
Ｃはデオキシシチジル、モしてＴはチミジルを表わす） で示される付加的な配列を、新生期のヒトプロティンＣ
暗号配列の暗号路の５′および３′末端にそれぞれ有し
ている。ＤＮＡ塩基対形成における相補性から、２本鎖
ＤＮＡ分子の鎖の内、１方の鎖の配列があればそれと対
向する鎖の配列は十分決定できる。プラスミドｐＨＣ７
は、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリイ
（ＮＲＲＬ。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ペオリア、イリノイスに
寄託され、そのパーマネント・ストック・カルチャー・
コレクションの一部となっている菌株、大腸菌（Ｅ、、
ｃｏｌｉ　）　Ｋ　１２ＲＲ１／ｐＨＣ７から常法通り
単離できる。大腸菌に１２　Ｒ爬１／ｐＨＣ７の培養物
は、ＮＲＲＬから、寄託番号ＮＲλＬ　Ｂ−１５９２６
の下に入手可能である。プラスミドｐＨＣ７の制限サイ
トおよび機能地図を添付の第１図に示す。 上記の如く、プロティンＣ活性をコードしているＤＮＡ
を含んでいる様々な組換えＤＮＡ発現ベクターを組立て
た。本発明のベクター類は２つのタイプ：真核性、殊に
、哺乳類宿主細胞を形質転換する様、計画されたもの、
並びに大腸菌を形質転換する様、計画されたもの、に分
けられる。本明細書で例示した真核性または哺乳類ベク
ターで大腸菌を形質転換することもできるが、これらの
プラスミド中に存在している、プロティンＣ活性の暗号
ＤＮＡの転写のための真核性プロモーターは、大腸菌内
では効率よく機能しない。 本発明に係る、新生ヒトプロティンＣをコードしている
ＤＮＡ化合物は、哺乳類およびその他の真核性宿主細胞
を形質転換し、さらに、それら細胞内でプロティンＣ活
性を発現させるのに、特に好適である。多くの哺乳類宿
主細胞は、新生ヒトプロティンＣのアミノ末端に存在し
ているシグナルペプチドを認識し、適切にプロセシング
するために必要な細胞機構を有している。ある種の哺乳
類宿主細胞は、血漿中に存在するヒトプロティンｃ＋ｃ
ｔＢめられる如く、グリコジル化、ｒ−カルボキシル化
、およびβ−ヒドロキシル化等の翻訳後修飾をも行うこ
とができる。広範囲に及ぶ様々な真核性宿主細胞の形質
転換のためのベクターがあり、以下に例示する特定のベ
クターは決して、本発明の範囲を制限することを意図し
たものではない。 ｐｓｖ２−型（タイプ）のベクターは、一定の真核性転
写単位−一プロモーター＜ｅｐ　）、介在配列（ＩＶＳ
）、およびポリアデニル化（ＰＡ）部位を構成している
５ｖ４０ゲノムセグメントを含んでいる。５Ｖ４Ｑ　を
−抗原が存在しない場合には、プラスミドｐＳＶ２−型
ベクターは哺乳類およびその他の真核性細胞の染色体性
ＤＮＡに組込まれることによって宿主細胞を形質転換す
る。挿入遺伝子の転写が５Ｖ４Ｑプロモーターによって
行われる種々のプラスミドｐＳＶ２−型ベクター類、即
ち、ｐＳＶ２−　ｇｐｔ、　ｐＳＶ２−　ｎｅｏ、　Ｐ
Ｓ’Ｖ２−　ｄｈｆｒ、およびｐｓｖ２−β−グロブリ
ンが組立てられている。 これらのベクターはアメリカン・タイプ・カルチ’？　
−φフＬ／Ｆ　’／　Ｅ　７（ＡＴＣＣ％Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　、ｏ７クビレ、メリーランド（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　
Ｍａｒｙｌａｎｄ））またはノーザン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリイ（ペオリア、イリノイス）のい
ずれかから入手可能である。 フ５７．　ミｌ’　ｐＳＶ２−ＨＰＣ８ハブ５　スミＦ
　ｐｓＶ２−　ｇＰｔ　（ＡＴＣＣ３７１４５）、プラ
スミドｐＨＣ７、お。 よび２個の合成リンカ−から導かれる本発明のベクター
である。ｒｇｐｔＪという語句は、プラスミドｐｓＶ２
−ｇｐｔ上に存在している大腸菌のキサンチン−グアノ
シン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼを表わして
いる。プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ３は、まず最初、プ
ラスミドｐＨＣ７由来の、新生プロティンＣの暗号配列
のアミノ末端から号の配列と１個の合成リンカ−とを含
むＨｉｎｄ［［−Ａｐａ■制限フラグメントを調製し；
次いで、プラスミドｐＨＣ７由来の、新生プロティンＣ
の暗号配列のカルボキシ末端から１／２の配列と１個の
合成リンカ−とを含むＡｐａ　ニー　Ｂｇｌ　［制限フ
ラグメントを調製し；これら２飼の７ラグメントをＨｉ
ｎｄｍ　−Ｂｇｌ　ＩＩ−開裂プ５　スミＦ　ｐＳＶ２
−　ｇｐｔＧｃ挿入することにより、組立てられた。プ
ラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の詳しい組立て方法を実施
例２に記載し、該プラスミドの制限サイトおよび機能地
図を添付の第２図に示した。 ７’５　スミ）’ｐｓＶ２−ＨＰＣＢを、プラスミドＰ
Ｓｖ２−β−グロビン（Ｎ艮ＲＬ　Ｂ−１５９２８）と
−緒に、プラスミドｐＬ１３３の組立てにおける出発物
質として用いた。新生プロティンＣの全暗号領域を含む
、プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣｇの２つの制限フラグメ
ント、〜０．２９　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　］ｌｌ−Ｓａｌ　
Ｉ　７ラグメントおよび〜１．１５　ｋｂ　ＳａＩ　ｉ
　−Ｂｇｌ　［［７ラグメントを、Ｈｉｎｄ　［１−Ｂ
ｇｌ　［［−開裂プラスミドｐＳＶ２−β−グロビンに
ライゲートした。得られたプラスミド（ｐＬ１３３と命
名）は、β−グロビン暗号領域が全て、新生プロティン
Ｃの暗号領域で置き換えられたものであった。プラスミ
ドｐＬ１３３の詳しい組立て方法を実施例３に示し、該
プラスミドの制限サイトおよび機能地図を添付の第３図
に示した。　　　　　・ プラスミドｐＬ１３２．は、プラスミドｐＳＶ２−ＨＰ
Ｃ８のＩ（ｉｎｄ　ｌ［−Ｓａｇ　ＩおよびＳａｌ　Ｉ
−Ｂｇｌ　１１制限フラグメントをプラスミドｐＳＶ２
−ｎｅｏ　（ＡＴＣＣ３７１４９）に挿入したことを除
き、プラスミドｐＬ１３３の組立て法と類似の方法で組
立てられた。 「ｎＣＯ」という語句は、プラスミド中にネオマイシン
耐性付与遺伝子（これはＧ４１８耐性をも付与する）が
存在していることを表わす。その組立てについては実施
例４に記載されているが、これは多シストロンを産生ず
る。新生のプロティンＣおよび０４１８耐性付与暗号配
列の両者は、同一のＳＶ４０初期プロモーターによって
開始されるポリシストロン性ｍＲＮＡ　　として転写さ
れる。０４１８は大多数の真核性、その他の宿主細胞に
とって有毒であるため、プラスミドｐＬ１３２形質転換
体を０４１８耐性についてスクリーニングすることによ
って選択することができる。プラスミドｐＬ１３２の制
限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示す。 プ５７．ミドｐｓＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６
）はＳＶ４０初期プロモーターのコントロール下にある
ネズミのジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈ［ｒ　）を含有し
ている。適当な条件下において、このｄｈｆｒ遺伝子は
宿主の染色体内で増幅され、あるいは、コピーされるこ
とが知られている。この増幅によって、ｄｈｆｒ遺伝子
と極めて近接しているＤＮＡ配列が含まれて（ることが
ある。プラスミドｐＬ１４１は、５ｖ４０初期プロモー
ターのコントロール下にある、ｄｈｆｒ遺伝子と、新生
プロティンＣ構造遺伝子の両者を含有している本発明の
ベクターである。 プラスミドｐＬ１４１を組立てるには、プラスミドｐＳ
Ｖ２−　ｄｈｆｒ上の単一のＢａｍＨ１部位をＸｈ。 工部位に変換してプラスミドｐＳＶ２−　ｄｈｆｒ　−
Ｘを得る。新生プロティンＣ構造遺伝子を含有している
、プラスミドｐＬ１３３の２つのフラグメント、〜Ｑ、
５４　ｋｂ　Ｐｖｕｌｌ　−Ｂｓｔ　Ｅ　［［フラグメ
ントと〜２．７　ｋｂ　Ｂｓｔ　Ｅ　［［−ＥｃｏＲ■
フラグメントを単離し、まずＰｖｕ［−Ｂｓｔ　Ｅ　［
１７ラグメントをＸｈｏ　Ｉ−ＢｓＬＥ［［フラグメン
トに変換し、次いで、ＥｃｏＲｉ−Ｘｈｏ）−開裂プラ
スミドｐＳＶ２−　ｄｈｆｒ＝Ｘにライゲートした。得
られたプラスミド（ｐＬ１４１と命名）を添付の第５図
に示し、その組立て法を実施例５に述べる。 哺乳類その他の真核性宿主細胞内でプロティンＣ活性を
発現するために組立てられた本発明の例示プラスミドに
おいて、５Ｖ４Ｑ初期プロモーター以外のプロモーター
をも用いることができる。本発明は、本明細書中に例示
した特定の真核性プロモーターの使用に限定されるもの
では、決してない。その他のプロモーター類、例えば、
５Ｖ４Ｑ後期プロモーターまたは、例えば、エストロゲ
ン−誘導性の、ニワトリのオポアルブミン遺伝子、イン
ターフェロン遺伝子、クルココルチュイドー誘導性のチ
ロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナ
ーゼ遺伝子、主な初期および後期アデノフィルス遺伝子
等の真核性遺伝子からのプロモーターも、真核性宿主細
胞内でプロティンＣを生産するために計画された組換え
ＤＮＡ発現ベクター中に使用するために、容易に単離し
、修飾することができる。また、プロティンＣを発現さ
せるために、真核性プロモーター類を直列に並べて用い
てもよい。さらに、広範囲の真核性宿主細胞に感染する
多くのレトロフィルスが知られている。 レトロフィルスＤＮＡの長い末端重複（ロング・ターミ
ナル・リピート）はしばしばプロモーター活性をコード
しており、これを、ヒト豐プロティンＣの発現を駆動さ
せる目的で、５Ｖ４Ｑ初期プロモーターの代りに用いる
ことができる。 プラスミドｐＲ５Ｖ　ｃａｔ　（ＡＴＣＣ３７１５２）
は、ニワトリその他の宿主細胞に感染することが知られ
ているラクス肉腫りイルス（Ｒ５Ｖ）の長い末端重複部
分を含んでいる。このＲ８Ｖの長い末端重複配列は、プ
ラスミドｐＲ５Ｖｃａｔ　ｃ７）〜０．７６　ｋｂＮｄ
ｅ■−Ｈｌｎｄｌ［制限フラグメントとして単離するこ
とができる。このＲ５Ｖの長い末端重複に含まれるプロ
モーター〔ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ　）ら、１９８２、
Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　７９　：　６７７７　）を、プラス
ミドｐＬ１３３の〜５．　ｌ　ｋｂ　Ｎ　ｄｅ　Ｉ−Ｈ
ｉｎｄｌ［フラグメントにクローンすると、５Ｖ４Ｑ初
期プロモーターと置き換わり、新生ヒトプロティンＣ構
造遺伝子の転写と発現を駆動するのに適正な位置をとる
。得られたプラスミド（ｐＬ１４２と命名）を添付の第
６図に示す。プラスミドｐＬ１４２の組立てを実施例６
に記載する。 本発明に係るもう１つのプラスミドは、プロティンＣの
発現を駆動するために、ラクス肉腫りィルスの長い末端
重複のプロモーターを用い、また、選択および遺伝子の
増幅のためにｄｈｆｒ遺伝子を含有している。このプラ
スミド（ｐＬ１５１と命名）は、フ５　ｘ　ミ）’　ｐ
ｓＶ２−　ｄｈｆ　ｒ　−Ｘ（ｙ）　〜４．２　ｋｂＥ
ｃｏＲ■−Ｘｈｏ　工制限フラグメントをプラスミドｐ
Ｌ１４２１７）〜１．０６　ｋｂＢｓｔ　Ｅ［１−Ｎｄ
ｅ　■制限フラグメント、およびプラスミドｐＬ１３３
の〜２．７４ｋｂＢｓｊＥ［−ＥｃｏＥＬＩ制限フラグ
メントにライゲートすることにより、組立てられた。ラ
イゲーションとプラスミドｐＬ１５１の組立てを達成す
るために、ライゲーションに用いたｐＬ１４２制限フラ
グメントのＮｄｅ■部位を、ＤＮＡリンカ−を付加する
ことにより、Ｘｈｏ　ｉ部位に変換した。プラスミドｐ
Ｌ１５１の組立てを以下の実施例ａに記載し、該プラス
ミドの制限サイトおよび機能地図を添付の第９図に示す
。 ）５７．　ミｌ’　ｐＭｓＶｉ　（ＮＲＲＬＢ　−１５
９２９）は、マクス等の宿主細胞に感染するフィルスと
して知られているネズミ肉腫りイルス（ＭＳＶ）の長い
末端重復（ＬＴλ）を含有している。プラスミドｐＳＶ
２−　ＨＰＣｇ　ｏ）　〜１．４　ｋ　ｂ　Ｂｃｌ　ｉ
制限フラグメントをプラスミドｐＭｓＶｉの単一のＢｇ
ｌ［制限酵素認識配列にクローニングすることにより、
新生プロティンＣ構造遺伝子をＭＳＶの長い末端重復の
プロモーターのコントロール下に置く。得られたプラス
ミド（ｐＭＳＶ−ＨＰＣ，：″命名）を添付の第７図に
示した。プラスミドｐＭＳＶ　−ＲＰ　Ｃの組立ては、
実施例７に記載されている。 マクスのメタロチオネイン（ＭＭＴ）プロモーターも真
核性宿主細胞内で使用するために、充分に特性化されて
いる。このＭＭＴプロモーターは、本発明に係る別のプ
ラスミド（ｐＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣと命名されている
）の組立てにおける出発物質である、１５　ｋｂプラス
ミドｐｄ　Ｂ　Ｐ　Ｖ　−ＭＭＴｎｅ　ｏ　（ＡＴＣＣ
３７２２４）内に存在している。プラスミドｐＭＭ″ｒ
ΔＢＰＶ＋ＨＰＣを組立てるには、まず、プラスミドｐ
ｄＢＰＶ　−ＭＭＴｎｅｏをＢａｍＨｉで消化し、次い
で、再ライゲートし、プラスミドｐＭＭＴΔＢＰＶを形
成する。このＢａｍＨ（欠失により、クシ乳頭腫フィル
ス（ＲＰＶ）ＤＮＡの〜Ｂｋｂが除去される。 次いで、プラスミドｐＭＭＴΔＢＰＶをＢｇｌｌｌで消
化シ、このＢｇｌ　■−消化プラスミドに、プラスミＦ
　ｐＳＶ２−　ＨＰＣ８（７）　〜ｌ、　４　ｋｂ　Ｂ
ｃｔ　■制限７５グメントをライゲートした。得られた
プラスミド（ｐＭＭＴ△Ｂ　Ｐ　Ｖ　−ＨＰ　Ｃト命名
）ハ、ＭＭＴプロモーターの下で転写および発現が行わ
れる位置に、新生プロティンＣ構造遺伝子を含有してい
る。プラＸ　ミ）’ＰＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣ内の、新
生フロティンＣ構造遺伝子のすぐ下流に隣接して、メタ
ロチオネインプロモーターによってコントロール下レ、
プラＸ　ミｌ’ｐＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣで形質転換さ
れた宿主の選択を可能ならしめる、０４１８耐性−付与
遺伝子が存在している。プラスミドＰＭＭＴΔＢＰＶ−
ＨＰＣの組立ては実施例８に記載されており、該プラス
ミドの制限サイトおよび機能地図は、添付の第８図に示
されている。 上記のベクター類（プラスミドｐＨＣ７を除く）は、様
々な真核性（殊に哺乳類）宿主細胞に導入（トランスフ
オーム）可能であり、それらの内で発現り得る。フ５　
Ｘ　ミＦ　ｐＳＶ２−　ＨＰＣｆ３、ｐＬ１４２および
ｐＬ１３３は安定な形質転換体を単離、同定するための
選択マーカーを有していないので、これらのベクター類
は、以下の実施例１２に示す如く、過渡的な段階でのア
ッセイに、あるいは、同時形質転換を目的とする場合に
、最も有用なベクターである。通常、大腸菌内でプラス
ミドＤＮＡを調製する方が、他の宿主生物内で調製する
よりも効率的であるのセ、これらのベクター類はすべて
（プラスミドｐＨＣ７をも含む）、大腸菌内で複製され
得る配列を含有している。 上記のベクター類に含まれている新生ヒトプロティンＣ
構造遺伝子は、この新生ヒトプロティンＣ構造遺伝子と
関連する特定のプロモーターが機能する宿主細胞内で発
現する。５Ｖ４Ｑ初期プロモーター、ラクス肉腫りイル
スの長い末端重複プロモーター、ネズミの肉腫フィルス
の長い末端重複プロモーター、並びにマクスのメタロチ
オネインプロモーターは、広範囲に及ぶ様々な宿主細胞
内で機能する。プ５７．　ｉ　ｌ’　ｐＳＶ２−　ｏｐ
ｃＢ、ｐＬ１３３、ｐＬ１３２、ｐＬ１５Ｉ、ｐＬ１４
Ｉ、ｐＭｓＶ−ＨＰＣｌｐ　ＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣお
よびｐＬ１４２にとって好ましい宿主細胞を、適当な注
を添えて表Ｉに示す。 本発明において好ましい形質転換体は、Ｈｅ　ｐＧ　−
２／ｐＬ　１３２　、　Ｈｅ　ｐＧ　−２／ｐＭＳＶ−
ＨＰＣ。 ＨｅｐＧ−２／ｐＬ１４１．ＨｅｐＧ−２／ｐＬ１５１
゜ＨｅｐＧ−２／ＰＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣ，Ｈ４１１
ＥＣ３／ｐＬ１４１．Ｈ４ＩＩＥｃ３／ｐＬ１３２．Ｈ
４，ｌｌＥＣ３／ＰＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣ，Ｈ４１１
ＥＣ３／ｐＭＳＶ−ＨＰＣ。 Ｈ４１１ＥＣ３／ｐＬ１５１．ＬＬＣ−ＭＫ２／ｐＬ１
３２゜ＬＬＣ−ＭＫ２／ｐＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣ，Ｌ
ＬＣ−ＭＫ　２／−ｐＬ１４１．ＬＬＣ−ＭＫ２／ｐＬ
１５１．Ｃ１２７Ｉ／ｐＭＭＴΔＢ　ＰＶ　−ＨＰＣ、
Ｃ１２７１／ｐＭＳ　Ｖ−ＨＰＣ。 Ｃ１２７１／ｐＬ１５１．３Ｔ３／ｐＭｓＶ−ＨＰＣ，
３Ｔ３／ｐＭＭＴ△Ｂ　Ｐ　Ｖ−ＨＰＣ、３Ｔ３／Ｐ　
Ｌ　１３２　、３Ｔ３／ｐＬ１４１　。 ３Ｔ３／ｐＬ１５１．ＲＰＭＩ８２２６／ｐＭＳＶ−Ｈ
ＰＣ。 ＲＰＭＩ８２２６／ｐＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣ、ＲＰＭ
Ｉ８２２６／ｐＬ１３２．ＲＰＭ１８２２６／ｐＬ１４
１．ＲＰＭＩ８２２６／　−ｐＬ１５１．ＣＨＯ−にｌ
　／ｐＭＳ　Ｖ−ＨＰＣ、ＣＨＯ−Ｋｌ　／　−ｐＭＭ
ＴΔＢＰＶ−ＨＰＣ，ＣＨＯ−Ｋｌ／ｐＬ１３２゜ＣＨ
Ｏ−Ｋｌ／ｐＬ１４１．ＣＨＯ−に１／ｐ　Ｌ　１５１
　、　ＣＨＯ−Ｋｌ−（ｄｈｔｒ−）／ｐＭｓＶ−ＨＰ
Ｃ，ＣＨＯ−に１（ｄｈｆｒ−）／ｐＭＭ’Ｉ”ΔＢＰ
Ｖ−ＨＰＣ、ＣＨＯ−Ｋ１（ｄｈｆｒ−）　／ｐＬ１３
２．ＣＨＯ−Ｋ１（ｄｈｆｒ−）／ｐＬ１４１．　およ
Ｕ：ＣＨＯ−Ｋｌ　（ｄｈｆｒ−）／ｐＬ１５１　であ
る。 本発明のＤＮＡ化合物は、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　）およびストレプトマイセス等の原核
性宿主細胞内でも発現し得る。通常、原核性宿主細胞は
組換え遺伝子から製造された哺乳類タンパク質ヲ、グリ
コジル化、ｒ−カルボキシル化またはβ−ヒドロキシル
化しないので、原核性宿主細胞内で本発明のプロティン
Ｃ活性をコードしているＤＮＡを発現させることｆこよ
り、種々の、新規なヒトプロティンＣ誘導体を生産する
ことができる。原核性宿主細胞内で発現された新規なプ
ロティンＣ誘導体は様々な程度のプロティンＣ活性を示
し、従って、これを翻訳後修飾の研究に用いることがで
きる。 これらの新規な誘導体はまた、プロティンＣ−特異抗体
の産生を刺激するための抗原として用いることができ、
あるいは、プロティンＣの測定ｌこも用いることができ
る。多くの測定法ｌこおいでは、試料中のタンパク質レ
ベルを測定するのに競合的な抗体結合を利用する。即ち
、放射活性（またはそれ以外の方法で）標識した、原核
生物−産生ヒトプロティンＣを、血漿中のプロティンＣ
の測定における［競合的な分子（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ　
ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」として用いることができる。当該
技術分野の人々ならば、その様な測定が、入院患者また
は外来患者に対するプロティンＣを含む治療法の治療期
間中ｌこおいて、さらｌこは、凝固障害を有する患者の
診断のためｌこ、必須であるということを容易に理解す
るであろう。 さらｆこ、ヒトプロティンＣの抗凝固活性は、このタン
パク質からｒ−カルボキシル化されたグルタミン酸残基
を除去することｌこより、プロティンＣのプロフィブリ
ノリティック活性から分離することができる。活性化さ
れたヒトプロティンＣは、軽鎖のアミノ末端Ｅこ集まっ
ている幾つかのｒ−カルボキシル化グルタミン酸（ｇｌ
ａ）残基を含有しでおり、これらの残基を除去すると、
抗凝固活性は破壊されるが、得られた「ｇｌａ−減少」
プロティンＣのプロフィブリノリティック活性は破壊さ
れていない。本発明は、（１）新生ヒトプロティンＣ構
造遺伝子中の、ヒトプロティンＣの「ｇｌａ−領域」で
あるアミノ酸残基１〜８３をコードしでいるＤＮＡを欠
失させ、この欠失されたＤＮＡを真核性（または原核性
）宿主細胞内で発現させるか；あるいは（２）新生ヒト
プロティンＣの構造遺伝子、あるいはそのサブフラグメ
ントまたは誘導体を、組換え法によって生産されたヒト
プロティンＣをｒ−カルボキシル化しない大腸菌、また
はその他の適当な原核性宿主細胞内で発現させる、とい
う異った２つの方法ｆこよってｇｌａ−減少プロチイン
Ｃを生産することに関するものである、本発明に係る、
プロティンＣ活性をコードしでいるＤＮＡ化合物を原核
性宿主細胞内で発現させる前に、真核性のシグナルペプ
チドをコードしでいるＤＮＡを除去した。理論上、新生
ヒトプロティンＣのアミノ末端ｆこおける最初の３３ア
ミノ酸残基が、プロティンＣの肝臓から血流中への分泌
を促すシグナルペプチドとしての作用を有する。 本発明は、真核性宿主細胞内でプロティンＣ活性を発現
させるためｌこ特定の真核性シグナルペプチドを用いる
ことに限定されるものではない。一般則としで、原核生
物は有効ｆこ真核性シグナルペプチドをプロセシングし
ない；従って、新生ヒトプロティンＣ構造遺伝子のシグ
ナルペプチドをコードしでいる部分を原核生物内で発現
させることは、幾分、非能率的であろう。本明細書中で
は特に例示していないが、本発明は、原核生物内でプロ
テをも包含するものである。 上記の如く、新生ヒトプロティンＣの１〜３３アミノ酸
残基は、細胞外分泌のための「シグナル」をコードしで
いると思われ、活性なプロティンＣ中には存在しでいな
い。ヒトプロティンＣのプｏ　／（ｆチドを構成しでい
る、新生ヒトプロティンＣの残基３４〜４２もまた、こ
のタンパク質のプロセシングおよび活性化の間に除去さ
れ、それらは、該分子の正しい折りたたみと修飾に寄与
していると考えられている。新生ヒトプロティンＣの残
基３３〜４２は以下ｌこ例示する原核性発現ベクター中
にコードされでいるが、本発明は、新生ヒトプロティン
Ｃの、残基３３を含まない、残基３４〜４２をコードし
ている原核性発現ベクターをも包含するものである。 しかしながら、本発明は、特定のプロティンＣ誘導体の
発現ｌこ限定されるものではない。本発明のＤＮＡは、
新生プロティンＣのアミノ酸残基１〜４２または１〜８
３をコードしでいる部分を欠失し、その結果、誘導体を
発現させる様、容易ｆこ修飾することができる。さらに
、活性なヒトプロティンＣの軽鎖または重鎮を発現させ
るベクターを組立でるために本発明化合物を操作して活
性なヒトプロティンＣ重鎖（アミノ酸残基２１２〜４６
１）と、活性なヒトプロティンＣ軽鎖（アミノ酸残基４
３〜１９７）とを分離することは容易である。この様に
して、真核性または原核性の適当な宿主内で２本の鎖を
別々ｆこ生産し、次いで、化学的に再結合することｆこ
より、活性なヒトプロティンＣを合成することができる
。 新生ヒトプロティンＣのアミノ酸残基１〜４２．１９８
および１９９に関する上記のタンパク分解的プロセシン
グに加えで、プロティンＣ酵素原の活性化はアミノ酸残
基２００〜２１１の除去をも含む。このプロセシングは
、天然ではインビボ（生体内）、より特異的ｌこは、血
流内で起きていると考えられている。活性化の過程（こ
おいて種々の有用なプロティンＣ誘導体が存在しており
、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターは、その内のどれ
をコードしていでもよい。その様なベクターによって不
活性な形のヒトプロティンＣを組換え生産することがで
き、ヒトの循環系内で、あるいは実施例１５の方法ｌこ
従って活性化することができる。 また、ヒトプロティンＣの軽鎖と重鎮とを別個に生産し
、次いで化学的に再結合する方法を、他の、種々の有用
なヒトプロティンＣ誘導体の生成に利用することができ
る。例えば、新生ヒトプロティンＣのアミノ酸残基３３
〜１９７．３４〜１９７または４３〜１９７を含む軽鎖
分子を生産し、次いで、これと、新生ヒトプロティンＣ
のアミノ酸残基２００〜４６１または２１２〜４６１を
含む重鎖分子と再結合させると、その結果、活性なプロ
ティンＣ誘導体、あるいは、残基３３〜４２または３４
〜４２、および２００〜２１１を含むペプチドが切断さ
れる（その様な切断は、ヒトの循環系で自然に起こる）
ことｔこよって活性化されるプロティンＣ誘導体が生産
される。 プラスミドｐＣＺ　４６０は、プロティンＣ活性を大腸
菌内で発現させるために組立てられた本発明プラスミド
である。プラスミドｐｃｚ　４６０は、プラスミドｐＣ
Ｚ　１０１　、プラスミドｐＨＣ７、および様々なりＮ
ＡＩＪンカー類から組立てられた。 プラスミドｐｃＺ１０１　はスコナーらｆこより、記載
されている（　５ｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ、　ａｌｏ、（１
ｇＢ４　）プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミイ・オブ・サイエンスイズＵＳＡ８１５４０
３〜５４０７３．ＰＣＺＩＯＩ　　（７）制限サイトお
よび機能地図を添付の第１０図ｆこ示す。 実施例１０に記載の如く、様々な操作を介して、合成Ｘ
ｂａ　Ｉ　−Ｎｄｅ　Ｉ　　リンカ−をプラスミドｐＣ
Ｚ１０１のＩＰＰプロモーターの下流ｆこ導入した。 得られたプラスミド（ｐＣＺ　ｌ　ｌ　　と命名）に、
メチオニニル残基と新生ヒトプロティンＣのアミノ酸残
基３３〜３９（上記の番号に従う）をコードしているも
う１つのＤＮＡリンカ−を付加することにより、該プラ
スミドを修飾した。次いで、このプラスミド（ｐｃＺ４
５１と命名）をＢａｍＨＩで切断した後、アミノ酸残基
３９〜４４５をコードしている、プラスミドｐＨｃ７の
〜１，２ｋｂＢａｍＨ１フラグメントを挿入し、プラス
ミドｐＣＺ４４５を得た。さらに、初期の組立て段階で
偶然付加された余分なＮｄｅ　ｌ　リンカ−を除去する
ことによってプラスミドｐＣＺ　４５５　　を修飾し、
プラスミドｐＣＺ４５９を得た。 プラスミドＰＣＺ４５９は、メチオニル残基と新生プロ
ティンＣのアミノ酸残基３３〜４４５を発現させる様に
位置しているＩＰＰ　　プロモーターを含んでいる。コ
ピー数コントロールが失われる温度（〉〜２５℃）の下
で、プラスミドｐＣＺ４５９は大腸菌内で、メチオニル
残基、新生ヒトプロティンＣのアミノ酸残基３３〜４４
５、および最初に大腸菌ｔｐｐ遺伝子から単離されたプ
ラスミドＤＮＡによってコードされていた約３６のアミ
ノ酸残基、を含む分子量約５０キロダルトンの機能的ポ
リペプチドを発現する、プラスミドｐＣ２４５９の制限
サイトおよび機能地図を添付の第１２図に示す。 プラスミドｐＣＺ　４５９に、ヒトプロティンＣのカル
ボキシ末端であるアミノ酸残基４４６〜４６１をコード
しているＤＮＡを挿入し、プラスミドｐｃｚ　４６０を
得た。このプラスミドｐＣＺ４６０の組立ては、まずカ
ルボキシ末端暗号ＤＮＡを含有している、プラスミドｐ
ＨＣ７の〜０．８８ｋｂ　　Ｐｓｔ　Ｉ制限フラグメン
トをプラスミドｐＵＣ１９（７７−？　シフ　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　）　　Ｉｎｃ　０１．８００センテニア
ル・ドライブ、ビスキャラタウエイ（Ｃｅｎｔｅｎｎｉ
ａｌ　Ｄｒ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　）　ＮＪ０８８
５４　　から入手可能〕に挿入し、プラスミドｐＵｃ１
９Ｈｃを得ることにより、行われた。プラスミドｐＵＣ
１９ＨＣは、プロティンＣ構造遺伝子のカルボキシ末端
−暗号ＤＮＡを単離することができる〜８Ｑ　ｂｐ　Ｂ
ａｍＨＩ　制限フラグメントを含有している。プラスミ
ドｐＵＣ：１９ＨｃをＢａｍＨｆ１　で開裂して〜８０
ｂｐ　ＢａｍＨＩ７ラグメントを単離し、これをプラス
ミドｐｃｚ　４５９に挿入することにより、プラスミド
ＰＣＺ４６０を得た。プラスミドｐＣＺ　４６０　は新
生ヒトプロティンＣのアミノ酸残基２〜３２が存在しな
いことを除き、これと同じポリペプチドをコードしでお
り、これを発現させる。プラスミドＰＵＣ１９ＨＣとプ
ラスミドｐｃＺ４６０の詳しい組立て方法を実施例１１
に示す。 特殊なプロモーターの選択は、本発明の実施可能性（オ
ペラビリテイ）＃ことって臨界的な事でないので、ヒト
プロティンＣ活性の大腸菌内での発現は、決して、特定
のプロモーターの使用に限定されない。既に例示したり
ボタンバク質プロモーターに代り得るプロモーターには
、大腸菌ラクトース（ｌａｃ　）、大腸菌ｔｒｐ　　、
バタテリオファージλＰ　ｔ　ＯＬ、　、およびバタテ
リオファージλＰＲ０Ｒ等のプロモーターが含まれるが
、これらに限定されない。さらに、ｔｒｐプロモーター
とｌａｃプロモーターの如く、１またはそれ以上のプロ
モーターを直列Ｉこ配したり、ｔａＣプロモーターの如
く、ハイブリッドプロモーターを用いで、プロティンＣ
構造遺伝子の発現を行わせることもできる。上記のプロ
モーターは、いずれも、既に特性化されでおり、当業者
が熟知しでいるものであって、合成的に、あるいは既知
のプラスミドから組立てることができるものである。 プラスミドｐｃｚ　４６０の複製は、ショーナーら（５
ｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、　（１９８４）　　プロ
シーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・
オブ・サイエンスイズＵＳＡ、８１　５４０３〜５４０
７　）の開示した熱誘導性（サーモインジューサプル）
ランチウェイレプリコンにより、きめることができる。 ３０℃、特ｌこ２５℃以下の温度では、このレプリコン
は約１０〜１５コピー／細胞という、比較的低いコピー
数を保持している。 温度ｂｉ３７℃にまで上ると、コピー数コン、トロール
が失なわれ、このレプリコンを含有しでいるプラスミド
は、１０００〜２０００コピー／細胞にまで増幅される
。当業者ならば理解するであろうが、本発明は、決して
、特定のランナウェイレプリコン、または特定のコピー
数の突然変異体しか使用してはならないというものでは
ない。その他の誘導可能なランチウェイレプリコンまた
は高コピー数のレプリコンを、適切な選択ｌこより、あ
るいは組立てることｌこより、得ることができる。その
様なレプリコンも、本発明の範囲内に含まれる発現ベク
ターの組立でに用いることができる。 本発明に係るヒトプロティンＣ誘導体遺伝子の如き外来
性遺伝子をランチウェイレプリコンを含有しているベク
ターｌこクローニングすると、誘導に際してコントロー
ルが外される結果、タンパク質の合成速度が著しく大き
くなると共に、細胞質内にタンパク性顆粒が形成される
。この顆粒のタンパク組成の均質性は高く、この顆粒の
少なくとも５０％、多くは８０％（いずれも乾重量％）
以上が所望のタンパク質生産物からなる。、この顆粒は
、容易ｆこ細胞リゼイト（溶解液）から単離され、また
、低濃度の尿素、あるいは洗浄剤溶液で洗浄しでも安定
である。洗浄することにより、顆粒１こ対して非特異的
ｌこ結合しているタンパク質が除かれる。 しかしながら、本発明は、大腸菌内でプロティンＣ活性
を発現させる場合ｌこランチウェイレプリコンを使用し
なければならないというものではない。プラスミドｐＢ
Ｒ３２２、ｐＢＲ３２８、ｐ　ＡＣＹＣ１８４等のプラ
スミドに由来する多くのレプリコンが当業者に知られて
おり、それらは、本発明のプロティンＣ−暗号ＤＮＡを
発現させるために設計された、組換えＤＮＡクロニーン
グ、および発現ベクターの組立てに適しでいる。本発明
はまた、本明細瞥中に例示したプラスミドに含まれてい
る実際の選択マーカーの使用に限定されるものでもない
。本発明のＤＮＡ化合物（または配列）を含んでいる組
換えＤＮＡクローニングベクター、または発現ベクター
ｌこ用いるのｌζ適当な、真核性並びＥこ原核性宿主細
胞用の、広範囲ｆこ及ぶ種々の選択マーカーが存在して
いる。 本発明の例示ＤＮＡ配列およびプラスミドｌこは多くの
修飾や変更が可能である。例えば、遺伝暗号の同義性に
より、本明細蕾中番こ例示した翻訳路で置き換えること
のみならず、ポリペプチドの暗号領域全体を通しで、ヌ
クレオチドの置換を行うことができる。その様な配列は
、ヒトプロティンＣについて現在知られているアミノ酸
配列またはＤＮＡ配列から推定することができ、下記の
従来からの合成法により、組立てることができる。その
様な合成法は、実質上、イタクラらの方法〔Ｉｔａｋｕ
ｒａ　ｅｔ、ａｌ、　、　１９７７サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ　）　１９８　：　　１０５６　）　　並び１
こフレアらの方法（Ｃｒｅａ　ｅｔ、　ａｌ、　　１９
７８、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンスイズＵＳＡ７５：５７６５
）ｌこ従って行うことができる。従って、本発明は特に
例示したＤＮＡ配列およびプラスミドｆこ限定されるも
のではない。 本発明の原核性発現ベクターおよび本発明方法は、広範
囲の宿主生物、とりわけ、大腸菌、大腸菌に１２、大腸
菌Ｋ１２Ｒ５Ｖ３０８、大腸菌に１２　　ＨＢＩＯＩ、
大腸菌に１２　　Ｃ６００、大腸菌に１２１ＬＲＩ、大
腸菌に１２ＲＲ１ΔＭ１５、大腸菌に１２ＭＭ２９４　
等のダラム陰性菌１こ適用し得る。本発明のすべての態
様が有用であるが、いくつかのベクターおよび形質転換
体が好ましい。好ましい形質転換体は、大腸菌に１２　
　ＲＶ３０ｇ／ｐＣＺ　４６０である。 当業者には理解されるであろうが、本発明の発現ベクタ
ーは真核性または原核性いずれの宿主細胞ｌこも用いる
ことができ、その様にしで、ヒトプロティンＣ活性を有
するポリペプチドを宿主ｌこ発現させることができる。 宿主細胞内で機能し、新生ヒトプロティンＣ構造遺伝子
の転写を駆動する様なプロモーターを含有しでいるベク
ターで該宿主細胞を形質転換すると共ｆこ、該宿主細胞
がシグナルペプチドのプロセシングを行うための細胞機
構を有しているならば、培地から、プロティンＣ活性を
単離することができる。他の発現状況下、例えば、プラ
スミドｐＣＺ　４６０が大腸菌ＲＶ３０８中に含まれで
いる場合には、プロティンＣ活性を宿主細胞から単離し
なければならない。 前記の如く１組換え法によって生産されたプロティンＣ
は血栓性の疾患の治療に優れた効果を現わすことであろ
う。ホモ接合体性またはへテロ接合体性のプロティンＣ
を欠損しでいる人々は重篤な血栓症ｌこ苦しんでおり、
今日では、凝固因子である第１Ｘ因子濃縮物（これはプ
ロティンＣを含んでいる）によって治療されている。こ
れらの内、ホモ接合体性プロティンＣ欠損症の人々の治
療には、血漿が〜３０００−であると仮定し、血管外空
隙への幾分かの拡散を見積ると、酵素を酵素原の形で投
与するとすると、組換え法で生産されたプロティンＣを
、用量域５ｑ〜１ｏｏｍｙ／投与を１日２回与えるとよ
い。また、ペテロ接合体性のプロティンＣ欠損症の場合
に必要なプロティンＣの用量はホモ接合体性の場合より
も低く、酵素原の形として、用量域は２．５１１ｑ〜５
０η／投与となる。 組換えＩこより生産されたプロティンＣは、深部静脈血
栓症、肺動脈塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓または末梢
動脈で生じた塞栓、急性心筋梗塞症、血栓性発作および
伝染性血管内凝血等を含む、血管向凝固ｔこ関連する広
範な種々の後天性の疾患状態を予防、並びｌこ治療する
のにも有用であろう。 実験データ並びに臨床データによると、従来からの抗凝
血剤、特にワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ　）は、侵
入性のがんの治療Ｅこ有用であり、その様な悪性腫瘍が
転移し離れた病巣を生じることを阻止または減少させる
様、作用することが分っている。組換えｌこより生産さ
れたプロティンＣは、以下ｔこ詳しく述べる理由に基づ
き、これらの臨床状況−こおいで従来用いられでいた抗
凝固剤の代替品として重要なものである。 深部静脈血栓症や肺動脈塞栓症は従来からの抗凝血剤で
治療できるが、例えば、手術を受けでいる患者、慢性的
な就床患者、およびうっ血性心不全症患者等、血栓塞栓
症を併発する危険率が高いとされている患者ｆこ対しで
、血栓塞栓症の発現を防止することは、臨床的ｆこより
有意義なことである。手術を受けた年令が５０歳の患者
の５０％以上が、また全体としては、手術を受けた患者
の約２０％以上が術後の深部静脈血栓症ｆこ苦しんでお
り、また、深部静脈血栓症の術後には、全症例巾約２０
％が１またはそれ以上の肺動脈塞栓を併発している。今
日、深部静脈血栓症の防止のため１こ、術前および術後
に低用量のヘパリン（例えば８時間毎ｌこ５，０００単
位）を投与しでいる。低用量のヘパリン投与は時々、手
術中または手術後ｆこ重篤な出血を引き起こす。活性化
されたプロティンＣはヘパリンよりも選択性が高く、ト
ロンビンが生成し、繊維素トロンビンが形成された時、
およびその位置でしか活性を示さない。それ故、プロテ
ィンＣは、深部静脈血栓症を防止するために予防的に用
いたとき、ヘパリンよりも有効であり、しかも、出血性
合併症を引き起こし難いと思われる。 深部静脈血栓症の予防を目的とする場合の組換え一生産
プロチインＣの用量は１〜ｉｏ＃ｖ、、’日の範囲であ
り、プロティンＣの投与は、手前前６時間から開始し、
患者が動ける様ｌこなるまで続ける必要がある。確定的
で客観的ｌこ証明された深部静脈血栓症および／または
肺動脈塞栓症の場合の活性なプロティンＣの投与量は、
負荷用量として１〜１０”’９、以後、３〜３０１１Ｉ
ｇ７日の範囲の量の継続注入、とする。末梢動脈の塞栓
の場合Ｅこも同様な投与計画をたてることができる。活
性プロティンＣの注入多こより、出血性の合併症が減少
されると思われることから、急性の動脈閉鎖を併発し、
その場合に、四肢の切断を避け、四肢を守ることがしば
しば要求される血栓切除術または塞栓切除術と関連した
外科的処置において、ヘパリンの代りに活性プロティン
Ｃを用いることができる。 心臓ｌこ発生する動脈塞栓は、人工心臓弁を有する患者
における心臓弁と関連した疾患、急性心筋梗塞、および
ある種のタイプの不整脈等の心疾患に併発していること
が多い。この様な問題ｌこ対する従来からの経口抗凝固
剤ｔこよる治療は必ずしも完全に有効であるといえず、
しかも、経口抗凝固剤の使用ｔこは、常に、出血が併発
する危険性が本質的に存在している。確立された深部静
脈トロンビン−肺動脈塞栓の治療Ｅこ匹敵し得る用量の
活性プロティンＣを携帯用のポンプで連続注入する方法
は、心臓性の塞栓の予防に、実質上有効である。 同様に、末梢動脈（特に、頚動脈）中の血栓が発生源と
なっている塞栓は、血小板機能の抑制作用を有する薬物
、経口抗凝固剤、またはそれらの複合剤を含む現在用い
られている治療方法ｌこよっては充分に治療または予防
することかできない。 心臓性の寒極の場合の如く、この心臓性塞栓に関しで示
したと同様のやり方で活性プロティンＣを長期間投与す
る方法は、頚動脈血栓に由来する塞栓を防ぎ、塞栓症性
の発作に至ることを防止するのに大いに有効である。 組換えプロティンＣはまた、血栓性発作の治療にも有用
である。今日、発作は、常に従来からの抗凝固剤で治療
し得るわけではない。ヘパリンまたは経口抗凝固剤によ
る発作の治療も時には有効であるが、梗塞を起こしでい
る脳領域での出血の危険性を高め、そのことにより、発
作に伴なう神経学的な損傷を悪化させる。プロティンＣ
は出血性の合併症を引き起こす可能性が低いので、これ
を発作を起こした患者ｆこ投与することで閉鎖性の動脈
血栓の局所的な拡がりを防止でき、その結果、発作に起
因する神経学的損傷を軽減することができる。活性プロ
ティンＣの投与量は発作の性質および重篤度に応じで、
各患者毎に異なる。 組換え法で生産された活性プロティンＣは、インビボで
の線維素（フィブリン）溶解の促進能力を有しているの
で、急性心筋梗塞の治療に有効である。活性プロティン
Ｃを、組織プラスミノーゲン賦活剤と一緒に、心筋梗塞
の急性期に投与するとよい。閉塞性の冠血栓が溶解した
後、冠性の再閉塞を防止するために、活性プロティンＣ
をさらＥこ数日ないし数週間投与する。急性の心筋梗塞
の場合Ｉこは、組織プラスミノーゲン活性化剤による治
療の開始時に、プロティンＣを負荷用量として１〜１０
〜与え、以後、３〜３０ｍｇ／日の用量域で、プロティ
ンＣを連続注入する。 プロティンＣ酵素原または活性型のプロティンＣは播種
住血管内凝固の治療ｌこ有用である。前記の如く、おそ
ら（、トロンボモジュリン（血栓調節因子）−トロンビ
ンｌこよるタンパク質の広範囲に及ぶ活性化と、それｌ
こ続くその活性化された酵素の異化または不活化を含む
機構により、播種住血管内凝固においではプロティンＣ
のレベルが著しく減少する。広範な臨床試験ｆこおいで
、播種性血管内凝固症患者に対するヘパリンおよび経口
抗凝固剤の投与が行われたが、それらの試験の結果は期
待外れであった。播種性血管内凝固症患者は、特徴的に
、微小循還をも含め、広い範囲に及ぶ血栓を有し、広域
性微小循還内のフイブリントロンン 勢ｐ形成の間に、まず活性化され、次いで不活化される
ことによる必須凝血因子（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｃｌｏｆ
ｆｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ　）の「消費」に起因する重
篤な出血性の障害を伴なうことが多い。播種住血管内凝
固においでは、プロティンＣは従来の抗凝固剤とは明ら
かに異なる利点を有する。プロティンＣは高い選択性を
有するので、ヘパリンや経口抗凝固剤の如き、播種住血
管内凝固に関連した出血性障害を悪化させることがない
ばかりか、さらＩこ微小血管性のフィブリン析出物が形
成されることを遅延させ、あるいは阻止する。播種住血
管内凝固のための製剤としでは、活性化されたセリンプ
ロテアーゼよりもプロティンＣ酵素原を選択するのがよ
い。そうすれば、これらの患者の微小循還内ｆこ実質的
な量存在するトロンボモジュリン−トロンビンにより、
該酵素原の活性なセリンプロテアーゼへの完全な活性化
が確保されることになる。必要とされる用量は、治療開
始時においで循還液中に存在するプロティンＣの量に応
じで異なるが、ホモ接合体性、またはへテロ接合体性の
プロティンＣ欠損症の場合の用量ｌこ匹敵する量である
。 従来からの抗凝固剤、特にワルファリンは侵入性の悪性
腫瘍を治療するのに有用であることを示す証拠が提示さ
れでいる。多くの腫瘍細胞は、局部的なフィブリンの析
出を招く様な、凝固系の活性化を引き起こす物質を産生
ずる。これらのフィブリン析出物は、がん細胞が分割し
て転移病巣を作る際の「巣」の役割を果す。１つの臨床
研究によると、肺に小さい細胞性のがんを有する患者に
おいて、がんの化学療法に加えてワルファリンを投与さ
れていた患者は、この化学療法のみを受けた患者よりも
長く存命し、転移病巣の広がりも少ないということが示
された。しかしながら、この研究で採用されたがんの化
学療法は、今日、臨床腫瘍学において適切と考えられて
いる治療法程強力ではなかった。より強力ながんの化学
療法においては、殆んど常に、血小板の大幅な減少をも
たらし、そして、血小板減少症とワルファリン治療との
組み合わせによって、患者は重篤な出血性合併症の容認
し難い程高い危険性にさらされることになる。活性プロ
ティンＣは従来の抗凝固剤よりも高い選択性を有し、ヘ
パリンまたは経口抗凝固剤のいずれよりも、はるかに高
い治療指数を有するので、血小板減少症患者に投与して
も比較的安全であり、従って、活性プロティンＣと併用
することにより、侵入性がんの患者を、有効な強度の化
学療法で治療することができるのである。活性プロティ
ンＣによる侵入性がんの治療は、深部静脈血栓症−肺動
脈塞栓の場合に用いられる投与計画に準じて行う。 本発明化合物は薬学的ｌこ有用な組成物を調製するため
の既知の方法に従って製剤化されることができる。即ち
、本発明のヒトプロティンＣ産物と薬学的Ｅこ許容し得
る担体賦形剤とを混合することにより、組成物を調製す
る。適当な担体賦形剤、および例えばヒトアルブミンの
如き他のヒトプロテイン質をも含むそれらの製剤化は、
当業者周知である。その様な組成物中には、宿主（患者
）に対して有効な投与を行うのに適当な薬学的に許容し
得る組成物を調製する上で適量の担体賦形剤と一緒Ｅこ
、有効量のプロティンＣが含有されでいる。 このプロティンＣ組成物は非経口的ｌこ投与することが
できるが、該物質が確実に有効な形で血流中に運ばれる
様な他の方法によっても投与され得る。 以下の実施例により、本発明をさらｌこ詳しく説明する
。本発明の組立てｌこ用いた方法、及びその方法の説明
を適宜記載した。 実施例１　大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　）　Ｋ１２　Ｒ
ＲＩ　／ｐＨＣ７の培養およびプラスミドｐＨＣ７の単
離Ａ、大腸菌に１２ＲＲ１／ＰＨＣ７の培養テトラサイ
クリン１５μｇ／ｍｔを含有しているＬグロス（１０ｇ
ペプトン、１０ｇＮａＣ１，および５ｇ酵母エキス）１
１に大腸菌に１２　ＲＲＩ／ｐＨＣ７（ＮＲＲＬ　Ｂ−
１５ｇ２６　）を接種し、エアーシェーカー（空気振盪
機）内で３７℃ｌこおいで、５９０　ｎｍにおける光学
的密度（０，Ｄ、）カル１吸収単位になるまでインキュ
ベートし、この時点でクロラムフェニコール１５０ηを
加えた。 約１６時間インキュベーションを続けた：このクロラム
フェニコールの添加ｔこよってタンパク質合成が阻止さ
れ、その結果、以後の細胞分割は阻害されたが、プラス
ミドの複製は継続された。 Ｂ、プラスミドｐ　ＨＣ７の単離 実施例ＩＡで調製した培養物を、ンルボール（Ｓｏｒｖ
ａｌｌ　）　ＧＳＡ　　ｏ−ター〔シュポン（Ｄｕｐｏ
ｎｔ　）ＣＯ，、インスツルメント・プロダクツ（Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　）、バイオメジ
カル・において６ｏｏｏｒｐｍで５分間遠心した。得ら
れた上清を捨て、細胞ペレットをＹＥＳバッファー（１
０ｍＭ）すｘ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５：　　１０ｍＭＮａ
Ｃ／　：およびｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）　４０　ｍｌ中
で洗浄し、次いで再ペレット化した。再度、上清を捨て
た後、細胞ペレットをドライアイス−エタノール洛中で
凍結させ、次いで解凍した。解凍した細胞ペレットを２
５％５％スフ−Ｘ　／　５０　ｍＭ　ＥＤＴ　Ａ溶液１
０−に再懸濁した。５　”Ｐ／＋ｎｊ　リゾチーム溶液
１ｔｎｌ：　０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　３．Ｉ、ｐ）Ｉｓ
、ｏ：および１０ｊＩＰ／−のＲＮＡ５ｅＡ　１００−
　を加えて混合した後、得られた溶液を氷上で１５分間
インキュベートした。溶解液〔３−の１０％トリトン（
Ｔｒｉ　ｔｏｎ　）　−Ｘ　Ｚｏｏ、７５−の６．２５
　ＭＥＤＴＡ　。 ｐＨ８，ｏ：１５−のＩＭ）リス−ＨＣｌ％ｐＨ８，ｏ
　：勿よび水７−を混合して調製〕３−をこのりゾチー
ム処理細胞に加え、混合し、得られた溶液を氷上でさら
に１５分間インキュベートした。溶解した細胞をドライ
アイス−エタノール浴中で凍結した後、解凍した。 ５ｗ２７０−ター〔ベックｖ　７　（ＢｅｃｋｍａｒＱ
７３６０　　Ｎ、　　ＩＪンカーン・アベニュー、リン
カーンウッド、ＩＬ６０６４６：ｌ中、２５．０００ｒ
ｐｎで４０分間遠心することにより、溶液中の細胞破片
を除いた。ＣｓＣ４３０，４４ｔと５’９／ａｌＸ−チ
ジウムブロマイド溶液〜ＩＩＩＬｌ！を加え、溶液の容
量を４０ｒｘｌに調整した後、ｖｔｉ５０超遠心管（ベ
ックマン〕中にデカントして入れた。チューブをシール
した後、溶液をＶｔｔ５０ローター中で４２゜ｏ　ｏ　
ｏ　ｒｐｍにおいて１６時間遠心した。紫外光で観察し
、得られたプラスミドのバンドを単離した後、【１７５
チユーブに入れてローター（ベックマン）内に置き、５
５．００　Ｏｒｐｍで１６時間遠心した。必要な用量調
節、は、いずれも０゜７６１９／ｄのＣ５Ｃｊ７を含む
ＴＥＳを用いて行った。再度、プラスミドバンドを単離
し、塩−飽和インプロパノールでエチジウムブロマイド
を抽出し、ＴＥＳバッファーで１：３に希釈した。次い
で、２容量のエタノールを溶液に加えた後、−２０℃で
一夜インキユベートした。この溶液を５５３４０−タ−
（ンルボールノ中、１０，０００　ｒＰｍテ１５分間遠
心することにより、プラスミドＤＮＡをペレット化した
。 この方法ｆζよって得たプラスミドＰＨＣ７ＤＮＡ〜Ｉ
ＩＩＩＰをＴＥバ’７７７　　（１０ｍＭ）すｘ　−Ｈ
（４゜ＰＨ８，０およびｌ　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ）　中に
懸濁し、−２０℃で保存した。プラスミドｐＨＣ７の制
限サイトおよび機能地図を添付の第１図に示す。 実施例２　プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の組立て Ａ、プラスミドｐＨＣ７の−１，２５ｋｂ　Ｂａｎ１制
限フラグメントの組立て　一 実施例１で調製したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ５０　ａ
ｌ：を、制限酵素Ｂａｎ１５　ｍｌ　（−５０単位）、
１０ＸＢａｎｌ制限ｔ４　”／　７７−　（１，５Ｍ　
Ｎａｐｌ！：６０ｍＭ）すｘ−ＨＣ１！、ＰＨ７，９：
　６０ｍＭＭｇＣｌ！２；　＃、ｉ、び１ｗＩｇ／５ｌ
ＢｓＡ）１０μ／、　　および水３５μｌと混合し、消
化が完了するまでインキュベートした。次に、このＢａ
ｎ１消化プラスミドＤＮＡを３．５％ポリアクリルアミ
ドゲル（２９＝Ｉ、アクリルアミド：ビスーアクリルア
ミド〕電気泳動にかけ、〜１，２５ｋｂ　ＢａｎＩ制限
フラグメントが他の制限産物から分離されるまで泳動さ
せた。ゲルをまずエチジウムブロマイドの希薄溶液で染
色し、次いで、このゲルを紫外線下で観察することによ
り、ＤＮＡバンドを調べた。 〜１．２５　ｋｂＢａｎｌ制限フラグメントを含む領域
をゲルから切り取り、試験管内に入れて小片にくずした
。この小片の入った試験管内に抽出バッフ７−＜、　５
００　ｍＭ　Ｎｕ、ａＯＡｃ　、　　ｌ　Ｑ　ｍＭＭｇ
ＯＡｃ。 ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　１％５０５および１０”’９
／ａｄｔＲＮＡ　）　１　ｘｉを加え、３７℃で一装置
いた。遠心して残渣をペレット化し、上清を新らしいチ
ューブに移した。得られた残渣を抽出バッファー２００
μｌで１回洗浄し、洗浄上澄み液を、−夜抽出によって
得た最初の上清と合わせた。上清をグラス９−ル製プラ
グ（Ｐｌｔｍｇ、）　ｌご通した後、２容量のエタノー
ルを加えて混合した。得られた溶液をドライアイス−エ
タノール浴中に〜１０分間置き、次いで、遠心してＤＮ
Ａをペレット化した。 この方法で〜１．２５　ｋｂ　ＢａｎＩ制限７ラグメン
ト約８μｇを得た。この精製（純化〕フラグメントをＴ
Ｅバッファー１０μｌに懸濁し、−２０℃で保存した。 Ｂ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｂｃｌ！Ｉ　−Ｒａｎ　Ｉ　リ
ンカ−の組立てこのリンカ−の組立てに用いたＤＮＡフ
ラグメントは、シスチック（Ｓｙｓｔｅす１４５０Ａ　
　ＤＮＡシンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅす（シ
スチック・インコーホレイテッド３８１６チヤンドラー
・ドライブ、ミネアポリス、ＭＮ）またはＡＢＳ３８０
ＡＤＮＡシンセサイザー〔アプライド・バイオシステム
ス（Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍす、インコ
ーホレイテッド、８５０リンカーン・センター・ドライ
ブ、フォスターシティ、ＣＡ　９４４０４　）のいずれ
かを用いて合成した。当業者は多くのＤＮＡ合成装置を
知って詔り、それらをフラグメントの製造に用いること
ができる。加えて、これらのフラグメントは、実質上、
イタクラらの方法（ｌ　ｔａｋｕｒ＠ｅｔ　、ａｌ　、
、１９７７サイｘ　７　Ｘ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９
ｇ：１０５６　：ｌおよびフレアらの方法（Ｃｒｅａｅ
ｔ、　ａｌ−１１９７８，プロシーデインダス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、ＵＳ
Ａ、７５　：　５７６５　）に従って常法通り調製する
こともできる。 これらの一本鎖リンカー５００ピコモルづつを、Ｔ４ポ
リヌクレオチド・キナーゼ１５単位（〜０．５μｌ）、
１０×リガーゼバツフアー（３００ｍＭトリス−ＨＣＪ
、ＰＨ＝７．８　：　１００　ｒｎＭ　ＭｇＣＪ２；１
００　ｍＭジチオトレイトール；および１　ｒＩ９／　
ｎｔｌＢＳＡ）２μ／、５００μＭ　ＡＴＰ　１０μｌ
、および水７．５μｌを含む制限バッファー２０μｌ中
でキナーゼ処理した。３７℃で３０分間、キナーゼ反応
混合物をインキュベートし、次いで、１００℃で１０分
間インキュベートして反応を止めた。 キナーゼ処理を確実にするために、反応物を氷上で冷や
し、０．２Ｍジチオトレイトール２μｍ５ｍＭＡＴＰ　
２．５　Ｉｌｌ：、およびＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ１５単位を加えて混合し、この反応混合物を３７℃で
さらに３０分間インキュベートした。１００℃で１０分
間、インキュベートして反応を止め、氷上で冷却した。 キナーゼ処理は別々に行なうが、各キナーゼ反応の後、
２本の一本鎖１）ＮＡ！Ｊンカーを混合した。 鎖をアシノングするために、−１５０＋ｙ＃の水の入っ
た水浴中で１００℃において１０分間、キナーゼ反応の
反応混合物をインキュベートした。このインキュベーシ
ョンの後、水浴を閉じ、室温まで放冷した（この工程は
、約３時間を要した〕。次いで、キナーゼ処理したＤＮ
Ａを含むチューブが入ったままの水浴を、４ｆｓの冷蔵
庫内に１夜置い立てられたリンカ−は式： で示される構造を有していた。このリンカ−を、使用に
供するまで一２０℃で保存した。 Ｃ，−１，２３ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ−Ａｐａ　Ｉ制限フ
ラグメントの組立て 実施例２人で単離したｗｌ、２５　ｋｂ　Ｂａｎ　Ｉ　
　フラグメント〜８μｇを実施例２Ｂで組立てたリンカ
−〜５０μｌ！（〜５００ピコモル）、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ１１１１！（〜１０単位〕、１０　Ｘ　ＩＪガーゼ
／”７７７　１０　Ｉｌｌ　、　１０ｍＭ　ＡＴＰ　Ｉ
　Ｑ　ｐｉ：および水１９μｌに加えて混合し、得られ
たライゲーション反応混合物を４℃で一夜インキユベー
トした。 ６５℃で１０分間インキュベーションすることにより、
ライゲーション反応を止めた。終濃度が０．３Ｍになる
量のＮａ０ＡＣと２容量のエタノールを加え、ドライア
イス−エタノール浴中で冷却した後、得られた溶液を遠
心することにより、ＤＮＡをペレット化した。 このＤＮＡペレットを１０ＸＡＰａｌ　　反応バッフ７
−（６０ｍＭ　ＮａＣｌ！：６０ｍＭ　）リス−ＨＣ１
！、ｐＨ＝７．４　：　６０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　：お
よび６０ｍＭ２−メルカプトエタノール）１０μｌ、制
限酵素Ａｐａ　Ｉ　５１１１　（−５０単位）、および
水８５ｆｉｌ中に溶かし、この反応混合物を３７℃に２
時装置いた。次いで、上記の如くにして反応を止め、Ｄ
ＮＡをペレット化した。このＤＮＡペレ、ットを１０Ｘ
ＨｉｎｄＩＩＩ反応バッファ　　（５００ｍＭＮａＣ４
：　５　Ｑ　ＱｍＭ　）す７．−ＨＣｌ：、　ｐＨ＝　
３．０；オヨび１００　ｍＭＭｇＣ１２）　１０　Ｉｌ
ｌ、制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　５　ｆｉｌ　（〜５０
単位〕および水８５μｌ中に溶かし、この反応混合物を
３７℃に２時装置いた。 ＨｉｎｄＩＩＩ消化の後、反応混合物を３，５％ポリア
クリルアミドゲル上に適用し、実質上、実施例２Ａ（７
）方法に従って所望のｗｌ、２３　ｋｂ　ＨｉｎｄｎＩ
−Ａｐａｌ　　制限フラグメントを単離した。所望のフ
ラグメント約５μｇを得、ＴＥバッファー１０μｌに懸
濁し、−２０℃で保存した。 Ｄ、プラスミドｐＨＣ７の〜ｏ、ｓＢ　ｋｂ　ＰｔＬ　
Ｉ制限フラグメントの単離 実施例１で調製したプラスミドＰＨＣ７ＤＮＡ５０μｌ
を制限酵素Ｐｓｔ　　Ｉ　５μｌ！（５０単位）、１０
）＜ＰｓｔＩ反応バッファー（１，０ＭＮａＣ１！；１
００ｍＭ）リス−ＨＣ１！、ＰＨ＝７．５　：　　１０
０ｍＭＭｇＣｌ！２；および１　’９／１ｎｌＢ　Ｓ　
Ａ　）　１０　ｔｔｌ、および水３５μｌと混合し、３
７℃で２時間インキュベートした。次いでＰｓｔｌ−、
、、−消化プラスミ）’ＰＨＣ７ＤＮＡを３．５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、実質上、実施例２
人の方法に従って所望の０．８８ｋｂフラグメントを精
製した。 所望のフラグメント約５μｇを得、これをＴＥ／＜ツフ
ァ−１０μｌに懸濁し、−２０℃に保存した。 Ｅ、　　Ｐｓｔ　　Ｉ　−Ｂｃｌｆ：　Ｉ−Ｂｇｌ：■
　リンカ−の組立て 実質上、実施例２Ｂの方法に従って、式二で示されるリ
ンカ−をライゲーションに用し）るために組立て、調製
した。 Ｆ。　〜０゜１９　ｋｂ　Ａｐａ　Ｉ　−Ｂｇｌ７　Ｉ
Ｉ制限フラグメントの組立て 実施例２Ｄで単離した−０，８８　ｋｂ　ＰｓｔＩフラ
グメント〜５μｇを実施例２Ｅで組立てたリンカ−〜５
０μＩ！（＃５００ピコモルフ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ
１μｌ（〜１０単位）、１０×リガーゼハツ７７−１０
　μ！、１０ｍＭ　ＡＴＰ　１０μｌおよび水１９μｌ
に加えて混合し、得られたライゲーション反応混合物を
４℃で一夜イッキユベートした。 ６５℃で１０分間インキュベーションすることにより、
ライゲーション反応を止めた。ライゲートしたＤＮＡを
沈殿させた後、このＤＮＡペレットを１０ＸＡｐａｌ　
　反応バッファー１０μｌ、制限酵素ＡｐａＩ　５１１
１　　（−５０単位）、および水８５μｌ中に溶かし、
この反応混合物を３７℃に２時装置いた。次いで、反応
を止め、再度、ＤＮＡをペレット化した。このＤＮＡペ
レットヲ１０×Ｂ　ｇ　ｌ！■反応ハ’７７７　　（Ｉ
　Ｍ　ＮａＣ１！：　　１００ｍＭ　）リス−ＨＣｊ７
、ｐＨ＝　７．４　：　１００　ｍＭ　ＭｇＣＩ！２　
　および１００ｍＭ２−メルカプトエタノール）１０μ
ｌ、制限酵素ＢｇＩ！ＩＩ５μｌ！（−５０単位）およ
び水８５μｌ中に溶かし、この反応混合物を３７℃に２
時装置いた。 Ｂｇｊ７■消化の後、反応混合物を３．５％ポリアクリ
ルアミトゲ、ル上に適用し、実質上、実施例２Ａの方法
に従って所望の〜０．１９　ｋｂ　Ａｐａ　Ｉ　−Ｂｇ
Ｌｎ制限フラグメントを単離した。所望のフラグメント
約１μｇを得、ＴＥバッファー１０μｌに懸濁し、−２
０℃で保存した。 Ｇ、　　Ｈｉ　ｎｄ　ＩＩＩ　−Ｂｇｌ！ＩＩ−消化プ
ラスミドｐＳＶ２−ｇＰｔの単離 プラスミドｐＳＶ２−ｇｐｔ　ＤＮＡ（ＡＴＣＣ３７１
４５）約１０　、！！ｇを１０ＸＨｉｎｄｎ１反応ノク
ツフ７−１０ａｌ、制限酵素１（ｉ　ｎｄ　ＩＩＩ　５
　μｌ！（−５０単位）、および水８５μｌに溶かし、
反応混合物を３７℃で２時間保った。次いで、この反応
混合物をＮａ０ＡＣＯ，２５Ｍとした後、２容量のエタ
ノールを加え、ドライアイス−エタノール浴中で冷却し
、遠心してＤＮＡをペレット化した。 このＤＮＡペレットを１０ＸＢｇｌ！■バッファー１０
μｌ、制限酵素ＢｇＩ！［５μＩ！（〜５０単位〕、お
よび水８５μｌに溶かし１反応混合物を３７℃で２時間
保った。ＢｇＩ！ｎ消化の後、反応混合物を１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、フラグメントを分離した。エ
チジウムプロミドと紫外光を用いて観察し、所望の−５
，１ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇｌ■　フラグメントを
含有しているバンドをゲルから切り取って透析チューブ
内に入れ、アガロースからＤＮＡが放出されるまで電気
泳動を続けた。 フェノールとＣＨＣｌ！３を用いて透析チューブから、
ＤＮＡを含有しているバッファーを抽出した後、このＤ
ＮＡを沈殿させた。このペレットをＴＥバッファー１０
μｌに再懸濁した。このものは、プラスミドｐｓＶ２−
ｇｐｔの所望の−５，ｌ　ｋ　ｂＨｉ　ｎｄＩＩＩ−Ｂ
ｇＪＩＩフラグメントで構成されていた。 Ｈ，プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の組立てのためのフ
ラグメントのライゲーション 実施例２Ｃで調製した〜１．２３　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｎ
Ｉ−Ａ　ｐ　ａ　Ｉ　制限フラグメント２μｌ、実施例
２Ｆで調製した一Ｑ、ｌ　９　ｋｂ　Ａｐａ　１−Ｂｇ
ｌ！ＩＩフラグメント３μｌ、および実施例２Ｇで調製
した〜５．１ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−ＢｇＩ！ｎ７５
グメント２ｉｓｌを混合し、次いで、１０Ｘリガーゼバ
ツフアー１０μｌ。 Ｉ　ＱｍＭ　ＡＴＰ　１　’ＯＩｌ１％Ｔ４　　ＤＮＡ
リガーゼ１μｌ（〜１０単位〕および水７２μｌと一緒
に１６℃で一夜インキユベートした。ライゲートされた
ＤＮＡは所望のプラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣ８を構成し
ていた。このプラスミドの制限サイトおよび機能地図を
添付の第２図に示す。 ■、大腸菌Ｋ　１２　ＲＲＩ／ｐｓＶ２−ＨＰＣ８（７
）組立て大１％菌に１２　ＲＲｌ（ＮＲＩＩＬＬＢ−１
５２１０）のし−ブロス中培養物５０ａｅを５９０　ｎ
ｍにおける０、Ｄ。 が〜０．２になるまで増殖させた。この培養物を氷上で
１０分間冷却した後、遠心して細胞を集めた。 得られた細胞ペレットを冷１００　ｍＭ　ＣａＣ／２２
５ａｅ中に再懸濁し、氷上で２５分間インキュベートし
た。遠心して細胞を再度ペレット化し、得られたペレッ
トを冷１００　ｍＭ　ＣａＣｌ２２．５　ａ／！に再懸
濁して一夜、氷上でインキュベートした。 この細胞懸濁液２００μｌを実施例２Ｈで調製した、ラ
イゲートしたＤＮＡと混合し、氷上で２０分間インキュ
ベートした。次いでこの混合物を４２℃において２分間
、さらに室温で１０分間インキュベートした。この細胞
混合物にＬ−プロス３　ａｔを加えた後、空気振盪機（
エアーシェーカー）中、３７℃で２時間インキュベート
した。 この細胞混合物の一部をアンピシリン１００μｇ／ａｔ
を含んだＬ−寒天平板（Ｌ−ブロス中に寒天１５　ｆ／
／ｌを含む〕に適用し、この平板を３７℃でインキュベ
ートした。大腸菌Ｋ　１２　ＲＲＩ　／ｐｓＶ２−ＨＰ
Ｃ９形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分
析により、証明した。選択のための抗生物質としてテト
ラサイクリンではなく、アンピシリンを用いる外は、実
質上、実施例１の方法に従って大腸菌に１２艮Ｒ１／ｐ
ＳＶ２−ＨＰ　Ｃ８からプラスミドＤＮＡを得た。 実施例３　プラスミドＰ　Ｌ　１３３の組立てＡ、　　
１５ｘ　ミｔ’ｐｓＶ　２−ＨＰ　Ｃ８（７）−０，２
９ｋｂＨｉｎｄ　ｌｌｌ−５ａＩ！Ｉ制限フラグメント
の単離プラスミドｐｓＶ２−Ｈｐｃｓ　　ｓｏ　８ｇ　
ヲ１０ＸＢｉｎｄ■反応バッファー１０μｌ、制限酵素
ＨｉｎｄＩ［５μｌ！（〜５０単位）、および水８５μ
ｌに溶かし、この反応混合物を３７℃で２時間インキュ
ベートした。ＨｉｎｄＩＩＩ消化の後、ＤＮＡを沈殿さ
せ、得られたＤＮＡペレットを１０　Ｘ　Ｓａｄ　Ｉ反
応／４”７フ７−　（１，５Ｍ　ＮａＣ４；　５Ｑ　ｍ
Ｍ　）リス−ＨＣ４、ｐＨ＝　７．９　：　６０　ｍＭ
　ＭｇＣｌ！２　：　６０　ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール：および１１１１ｆ／ａｒｔ　Ｂ　Ｓ　Ａ）　１０
　ｔｉｌ：　、制限酵素Ｓａｌ！Ｉ　ｓ　Ｉｌｌ　（−
ｓＯ単位）、窓よび水８５μｌに溶かした。得られたＳ
ａｌ！■反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし
た。 このＨｉｎ　ｄ　ＩＩＩ　−Ｓａ／　ｌ−消化プラスミ
ドｐＳＶ２−ＨｐｃＢを３．５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、所望の一〇、２９　ｋ　ｂ　Ｈｉｎ
　ｄ　Ｉｎ　−５ａｌ！Ｉ制限フラグメントが他の反応
生成物から明確に分かれるまで、泳動させた。実質上、
実施例２Ａの方法に従い、所望のフラグメントラ精製し
た。得られたフラグメント〜２μｇをＴＥバッファー１
０μｌに懸濁し、−２０℃で保存した。 Ｂ、　　プ５ｘミＦｐＳＶ２−ＨＰＣ８（７）−１，５
ｋｂＳａ／　Ｉ−Ｂｇｌ！ＩＩ制限フラグメントの単離
プラスミドｐＳＶ２−ＮＰＣ８５０μｆ　を１０×Ｂｇ
Ｉ！ＩＩ反応バッファー１０μｌ、制限酵素Ｂｇｌ！■
５μｌ！（〜５０単離〕、および水８５μｌに溶かし、
この反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。 Ｒｇｌ　ＩＩ消化の後、ＤＮＡを沈殿させ、得られたＤ
ＮＡペレットを１０１０Ｘ５ａ　　反応バッファー１０
μｌ、制限酵素Ｓａ、／Ｉ５μｌ、および水８５μｌに
溶かした。得られたＳａｌ！Ｉ反応混合物を３７℃で２
時間インキュベートした。 コ（７）Ｓａｌ！Ｉ−Ｂｇｌ！ｎ−消化フ５スミｌ’Ｐ
ｓＶ２−ＨＰＣＢを３．５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、所望（７）−１，１５ｋｂ　Ｓａｌ！Ｉ
　−Ｂｇｊ７　ＩＩ制限フラグメントが他の反応生成物
から明確に分かれるまで、泳動させた。実質上、実施例
２人の方法に従い、所望のフラグメントを精製した。得
られたフラグメント〜８μｇをＴＥバッファー１０μｌ
に懸濁し、−２０℃で保存した。 Ｃ・　プラスｆドｐｓＶ２−β−グロブリンの〜４．２
ｋｂ　Ｂｇｌ！ＩＩ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　制限フラグ
メントの単離 プラスミドｐＳＶ２−β−グロブリン（ＮＲＲＬＢ−１
５９２８［所望の−４，２ｋｂ　ＢｇＩ！■−Ｈｉｎｄ
ｍ制限フラグメントの単離は、プラスミドｐＳＶ２−ｇ
ｐｔ　の代りにプラスミドｐｓＶ２−β−グロブリンを
用いる外は実質上、実施例２Ｇの方法に従って行われた
。得られたＤＮＡ−５μｇをＴＥバッファー１０μｊに
懸濁し、−２０’Ｃで保存した。 Ｄ。プラスミドｐＬ１３３の組立てのための、フラグメ
ントのライゲーション 実施例３Ａで得たフラグメント２μｌ、実施例３Ｂで得
たフラグメント２μｒ、および実施例３Ｃで得た７ラグ
メント２μｌを一緒に混合し、実質上、実施例２Ｈの方
法に従ってライゲートさせた。ライゲートしたＤＮＡは
所望のプラスミドｐＬ１３３を構成していた。このプラ
スミドの制限サイトおよび機能地図を添付の第３図に示
す。 Ｅ、大腸菌に１２　　ＲＲＩ／ｐＬ１３３の組立て形質
転換のためのＤＮＡとしてプラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ
８でｌ；！ｆ、Ｃ＜プラスミ）’ｐＬ１３３を用いる外
は実質上、実施例２■の方法に従い、所望の大腸菌に１
２　ＲＲＩ／ｐＬ１３３形質転換体を組立てた。 細胞の培養に用いた抗生物質がテトラサイクリンではな
くアンピシリンであることを除き、実質上、実施例１の
方法に従って大腸菌に１２ＲＲ，］／ｐＬ１３３形質転
換体からプラスミドＤＮＡを得た。 実施例４　プラスミドｐＬ１３２の組立てＡ。プラスミ
ドｐＳＶ２−ｎｅｏの−５，７ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ　−
Ｂｇｌ！ＩＩ制限フラグメントの単離プラスミドｐｓＶ
２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１４９）　　の〜５．７　ｋ
ｂＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｂｇｌ！ＩＩ７ラグメントの単離
は、プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　２−　ｇ　ｐ　ｔの代りに
プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏを用いる外は、実質上、実
施例２Ｇの方法に従って行われた。得られたＤＮＡ−５
μｇをＴＥバッファー１０μｌに懸濁し、−２０℃で保
存した。 Ｂ、プラスミドｐＬ１３２の組立てのための、フラグメ
ントのライゲーション プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏの＝５．７　ｋｂ　Ｈｉｎ
ｄ　１−Ｂｇｌ！ＩＩ制限フラグメント（実施例４Ａで
調製）２μｌ、実施例３Ａで調製したプラスミドｐｓｖ
２−ＨＰＣ８（７）　−０，２９ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩ
Ｉ　−５ａ　ｌ！Ｉ制限フラグメント２μｌ、および実
施例３Ｂで調製したプラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の〜
１．１５　ｋｂ　Ｓａｌ！Ｉ−Ｂｇｌ！ＩＩ制限フラグ
メント２μｌを一緒に混合し、実質上、実施例２Ｈの方
法に従ってライゲートさせた。ライゲートしたＤＮＡは
所望のプラスミドｐＬ１３２を構成していた。このプラ
スミドの制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示
す。 Ｃ５大腸菌に１２ＲＲ１／ｐＬ１３２の組立て形質転換
のためのＤＮＡとしてプラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８で
ｌ；！ｒ、ｃ＜プラスミドｐＬ１３２を用いる外は実質
上、実施例２Ｉの方法に従い、所望の大腸菌Ｋｌ　２　
ＲＲＩ／ｐＬ１３２形質転換体を組立てた。 細胞の培養に用いた抗生物質がテトラサイクリンではな
くアンピシリンであることを除き、実質上、実施例１の
方法に従って大腸菌に１２ＲＲ１／ｐＬ１３２形質転換
体からプラスミドＤＮＡを得た。 実施例５　プラスミドｐＬ１４１の組立てＡ、プラスミ
ドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−Ｘを得るための、プラスミドｐ
ｓＶ２−ｄｈ　ｆ　ｒ　＋ＣオけるＸｈｏ　Ｉ認識配列
の組立て プラスミＦ　ｐＳＶ２−ｄｈ　ｆ　ｒ　（大腸菌に１２
　　）ＩＢＩ　Ｑ１／Ｐｓｖ２−ｄｈｆｒ、ＡＴＣＣ３
７１４６から単離）　１０　μｇと１０Ｘ１０ＸＢａ塩
類１０μｊ’ＪＩ限酵素’ＢａｍＨＩ　２μ７：（〜２
０単位）、オヨヒ水８８　ｔｔｌとを混合し、得られた
反応混合物を３７℃で２時間インキユベートシた。フェ
ノールおよびクロロホルムで抽出して反応を止めた後、
Ｂ　ａ　ｍＨＩ消化プラスミドｐＳＶ２−ｄｈ［ｒ　Ｄ
ＮＡを沈殿させ、遠心して集めた。 このＤＮＡぺＬ／７トを、５０　ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　１
　ｐ　ｚ。 各ｄＮＴＰのｌ　Ｑ　Ｑ　ｍＭ溶液４　ｐｌ　、　ＤＮ
Ａポリメラー−１／Ｉのクレノー（ｋｌｅｎｏｗ）フラ
グメント１μｌ〔〜５単位、二ニー″イングランド・バ
イオラボス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ
）’）、水３４μ／。 およびフレｒ・バッファー（４００ｎｎＭ　ＫＰ　０４
、Ｐ　Ｈ＝７．５　；　６６　ｒｎＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ／　
２　；および１０ｍＭ２−メルカプトエタノール）５μ
ｌに再懸濁し、１４℃で１時間インキュベートシタ。０
．２５ＭＥＤＴＡ４μｌを加え、次いでフェノール抽出
を行うことにより、反応を止めた。反応混合物からＤＮ
Ａを沈殿させ、遠心してペレット化した。ＤＮＡ〜ｌＯ
μｇを得、これをＴＥバッファー２０μｅに溶かした。 式： で示されるＸ　ｈ　ｏリンカ−（類）にューイングラン
トハイオラボス、３２トザーロード、ベバーリイ、ＭＡ
Ｏ９１９５）を下記の方法でキナーゼ処理し、ライゲー
ションのために調製した。リンカ−４μｌ（〜２μｆ）
を水２０．１５μｌと１０×キナーゼバツフアー（５０
０ｍＭ　）、リス−ＭＣＩ：。 ｐＨ＝７．６および１００　ｍＭ　ＭｇＣ１２）　５　
μｌに溶かし、９０℃で２分間インキュベートした後、
室温まで冷却した。この混合物にｒ−３２ｐ−ＡＴＰ５
μＥ（〜２０μｃｉ）、ＩＭＤＴＴ２．５μｌ、および
ポリヌクレオチドキナーゼ５μｌ！（−１０単位〕を加
えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで
、ｇ、０１　ｍＭＡＴＰ　３．３５　ｔｔｌと、さらに
５μｌのキナ−せを加え、なお３０分間、３７℃におい
て反応を続けた。次いで、得られた反応混合物を一２０
℃で保存した。 ＢａｍＨｌ−消化、クレノー処理を行なったプラスミｌ
’ｐｓＶ２−ｄ１１ｆｒ　　６．８　ｔｔｌ：　（〜３
．４　μｇ　）　と、キナーゼ処理したＸｈｏｌリンカ
−とを混合し、水１１．３μ／、ＩＯＸリガーゼバッフ
ァー３．５μｌ、Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＡＴＰ　１．４　ｐｌ
　、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌ！（〜１０単位）
と−緒に１６℃で一夜インキユベートした。６５℃で１
０分間インキュベートすることにより、反応を止めた。 １０ＸＸｂｏＩ　　反応ハ’７７７−　（１，５Ｍ　Ｎ
ａＣｊ’　：６０ｍＭ１−リス−ＨＣ：Ｊ、ＰＨ＝　７
．９　：　６０　ｍＭＭｇＣＩ！２；６０ｍＭメルカプ
トエタノール；および１！／ａｇＢｓＡ）１０μＪ、制
限酵素ＸｈＯＩ５μＪ（〜１００単位〕、および水５０
μｌを上記の反応混合物に加え、３７℃で４時間インキ
ュベートした。反応混合物を１％アガロースゲル上に適
用し、実質上、実施例２Ｇの方法に従って所望のフラグ
メントを単離した。得られたフラグメント〜２μｌをＴ
Ｅバッファー１０μｌに懸濁した。 次いで、Ｘｈｏ　Ｉ　　リンカ−を付加したＢ　ａ　ｍ
　ＨＩｍ化プラスミドｐｓＶ２−ｄｈｆｒをライゲート
し、形質転換に係るＤＮＡがプラスミドｐＳＶ２−ｄｈ
ｆｒ−Ｘである外は実質上、実施例２Ｈおよび２工の方
法に従って大腸菌に１２ＲＲ１を形質転換した。 得られた大腸菌Ｋ　１２　　ＲＲＩ／ｐｓＶ、２−ｄｈ
ｆｒ　−Ｘ形質転換体を、そのアンピシリン耐性表現型
、並びにそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、
同定した。細胞の培養期間中に用いる抗生物質がアンピ
シリンであることを除き、実質上、実施例１の方法に従
い、この形質転換体からプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ
−Ｘを単離した。 Ｂ−１５７，ミＩ’　ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ　　−Ｘ（７
）−４，２ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ制限フラグメン
トの単離１５スミｔ’ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ　−ｘ５　μ
ｇを１０×Ｘｈｏ　Ｉ　　反応バッファー１０μｌ、制
限酵素Ｘｈ。 １５μＩ！（〜５０単位）、および水８５μＥと混合し
、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキュベート
した。反応の後、Ｘｂｏｌ　　消化プラスミＦｐＳＶ２
−ｄｈｆｒ−Ｘ　ＤＮＡを沈殿サセ、遠心シて集めた。 このＤＮＡペレットを１０　Ｘ　ＥｃＯＲＩ反応バッフ
ァー１０μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＩ　５μｌ（〜５０５
０ｐ、および水８５μｌに再懸濁し、得られた反応混合
物を３７℃で２時間インキュベートした。ＥｃｏＲＩ反
応の後、得られたＸｈｏｌ−ＥＣＯＲ”−消化ブ５　ス
ミｔ’ｐｓＶ２−ｄｈｆｒ−ＸＤＮＡを１％アガロース
ゲルに通用し、実質上、実施例２Ｇの方法に従い、所望
の−４，２ｋｂ　ＥｃｏＲｌ−ＸｈｏＩ制限フラグメン
トを精製した。得られたフラグメント−１０μｇをＴＥ
バッファー２０ｔＬｅに懸濁し、２０°で保存した。 Ｃ，プラスミドｐＬ１３３の−０，６４ｋｂ　Ｐｖｕ■
−ＢｓｔＥｎ制限フラグメントからのＸ１１ｏＩ−Ｂｓ
ｔＥｌＮ制限フラグメントの組立て プラスミドｐＬ１３３５０μｇを１ＱＸＰｖｕｌＩ反応
バッファ　　（５Ｑ□ｍＭＮａｃＪ：６０ｍＭ　）リス
−ＨＣ１，ＰＨ＝７．５：６０ｍＭＭｇＣｌ！２：６Ｑ
ｍＭメルカフトエタ／−ル：オヨヒ１１１ｖＲＩＢ　Ｓ
　Ａ　）　１０　ｔｔｌ、制限酵素ＰｖｕＩＩ５μｌ（
〜５０単位）、および水８５μｌと混合し、得られた反
応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。反応の
後、Ｐｖｕ■−消化プラスミドｐＬ１３３ＤＮＡを沈殿
させ、遠心して集めた。 実施例５Ａで用いたｘｂ、ｏ　　ＩＪンカーと同じリン
カ−約５μｇを実質上、実施例５Ａの方法に従ってキナ
ーゼ処理し、Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ−消化プラスミドｐＬ１
３３ＤＮＡにライゲートした。ライゲーション反応の後
、ＤＮＡを沈殿させ、遠心して集めた。 このＤＮＡベレットを１０×ｘｈＯＩ反応バッフｙ−２
０ｔｔｌ　、　制限酵ｚＸｈｏＩ　１０　ａｌ　　（−
１００単位〕、および水１６５μｌに再懸濁し、３７℃
で４時間インキュベートした。次いで、この反応混合物
に制限酵素ＢｓｔＥ■５μｌ（〜５０単位〕を加えた後
、鉱油の下、６０℃で４時間インキュベートした。得ら
れたＸｈｏｌ−Ｂｓｔ　Ｅ　ｎ−消化ＤＮＡを３゜５チ
ポリアクリルアミドゲルに適用し、実質上、実施例２人
の方法に従い、所望の〜０．６４ｋｂ　ＸｈｏＩ−Ｂｓ
　ｔ　Ｅ　ＩＩ制限フラグメントを精製した。得られた
フラグメント約３μｇをＴＥバッファー６μｇに再懸濁
し、−２０℃で保存した。 Ｄ、プラスミドｐＬ１３３の−７２，７，ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ−ＢｓｔＥＩＩ　　制限フラグメントの単離プラス
ミドｐＬ１３３　５０μｇを１０ＸＢｓｔＥＩＩ反応バ
ッファー１０μｌ、制限酵素ＢｓＬＥｎ５μｌ（〜５０
単位、および水８５μｌを混合し、得られた反応混合物
を鉱油の下、６０℃で２時間インキュベートした。反応
の後、ＢｓｔＥＩＩ−消化プラスミドｐＬ１３３ＤＮＡ
を沈殿させ、遠心して集めた。このＤＮＡペレッ）　ヲ
１０　Ｘ　ＥｃｏＲＩ反応バッファー１０μｌ、制限酵
素ＥｃｏＲＩ５μｅ（〜５ｏ単位）、および水８５μｌ
に再懸濁し、得られた反応混合物を３７℃で２時間イン
キュベートした。ＥｃｏＲＩ反応の後、得られたＢｓ１
ＥＩＩ−ＥｃｏＲＩ−消化プラスミドｐＬ１３３ＤＮＡ
を１％アガロースゲルに適用し、実質上、実施例２Ｇの
方法に従い、所望の〜２．７　ｋｂ　ＥｃＯＲＩ　−Ｂ
ｓｔＥｌｌ制限７ラグメントを精製した。得られたフラ
グメント〜１０μｇをＴＥバッファー２０μｅに懸濁し
、２０°で保存した。 Ｅ、プラスミドｐＬ１４１の組立てのための７ラグメン
トのライゲーション、および大腸［Ｋ１２ＲＲ１の形質
転換 実施例５Ｂで調製したプラスミドｐＳＶ２−ｄｈ　ｆｒ
−ｘの−４，２ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ制限フラグ
メント２μｌ、実施例５ＣにおいてプラスミドｐＬ１３
３から組立テｆ；−−Ｑ、５４　ｋ　ｂ　Ｘｈｏ　ｌ−
Ｂｓ　ｔ　ＥＩＩ制限フラグメント２μ１１および実施
例５Ｄで調製したプラスミドｐＬ１３３の〜２．７　ｋ
ｂ　ＥｃｏＲｌ−ＢｓｃＥＩＩ制限フラグメントを一緒
に混合し、実質上、実施例２Ｈおよび２工の方法に従っ
てライゲートし、得られたプラスミドｐＬ１４１ＤＮＡ
を用いて大腸菌に１２ＲＲ１を形質転換した。所望の大
腸菌に１２　ＲＲＩ／ｐＬ１４１　　形質転換体をその
アンピシリン耐性表現型とそのプラスミドＤＮＡの制限
酵素分析により、同定した。細胞の培養期間中に用いる
抗生物質がアンピシリンである外は実質上、実施例１の
方法に従い、形質転換体からプラスミドｐＬ１４１を単
離した。プラスミドｐＬ１４１の制限サイトおよび機能
地図を添付の第５図に示す。 実施例６　プラスミドｐＬＩ　４２の組立てＡ、プラス
ミドｐＲ５Ｖｃａｔ（ｙ）　〜０．７６＋ｃｂ　Ｎｄｅ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ　　制限フラグメントの単離プラス
ミＦ　ＰＲ５Ｖ　Ｃａ　Ｌ　（Ａ　Ｔ　Ｃｃ−ｉｃ、寄
託番号ＡＴＣＣ３７１５２の下で寄託されている宿主大
腸菌Ｅ（ＢＩＯＩから入手可能）５０μｇを１０Ｘ℃で
２時間インキュベートした。ＨｉｎｄＩＩＩ　消化の後
、ＤＮＡを沈殿させ、遠心して集めた。得られたＤＮＡ
ベレットを１０ＸＮｄｅＩ反応バッファー（１，５Ｍ　
ＮａＣｊ７：　１００ｍＭ　　トリス−Ｈ，ＣＩ！、ｐ
　Ｈ＝７．８　、”　７０　ｒｎＭ　Ｍｇ　Ｃ１！２　
：および５ＱｍＭ２−メルカプトエタノール）１０μで
、制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ　１０’μｌ　（−”３０単位〕
、および水８５μｊに溶かした。得られた反応混合物を
３７℃で消化が完了するまでインキュベートした。 このＨｉｎｄ　［１−Ｎｄｅ　Ｉ　　−消化プラス払ｐ
Ｒ５ＶｃａｔＤＮＡを３．５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、〜Ｑ、７５　ｋｂ　Ｎｄｅ　ｌ−Ｈｌ
　ｎｄ　ＩＩＩ　制限フラグメントを実質上、実施例２
人の方法に従い、単離、精製した。得られたフラグメン
ト〜５μｇをＴＥバッファー１０μｌに懸濁し、−２０
℃で保存した。このフラグメントはラウス肉腫ウィルス
由来の長い末端重複のプロモーター活性を含有しており
、多くの真核性細胞内でＤＮＡ転写におけるプロモータ
ーとして機能する。 Ｂ、　プラスミドｐ　Ｌ　１３３　（７）−５，１ｋｂ
　Ｎｄｅ　１−Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉｎ　制限フラグメント
の単離この単離は、プラスミドｐＲ５Ｖｃａｃの代りに
プラスミドｐＬ１３３を消化する外は実質上、実施例６
Ａの方法に従って行われた。さらに、３．５％ポリアク
リルアミドゲルの代りに１チアガロースゲルを用い、実
質上、実施例２Ｇの方法に従ってフラグメントを単離し
た。得られた約５μｇの所望のフラグメントをＴＦ、バ
ッファー１０μｌに懸濁し、−２０℃で保存した。 Ｃ，プラスミドｐＬ１４２の組立てのためのライゲーシ
ョン、および大腸菌に１２ＲＲ１の形質転換実施例６Ａ
で単離したプラスミドｐＲ５Ｖｃａｔの−０，７５ｋｂ
　Ｎｄｅｌ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩＩｎ制限フラグメント２
μｌ施例６Ｂで単離したプラスミドｐＬ１３３の、　５
．ｌ　ｋ　ｂ　Ｎｄｅ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄ　Ｉｎ制限フラ
グメント１μｌにライゲートした。ライゲーションは実
質上、実施例２Ｈの方法に従って行われた。ライゲート
されたＤＮＡは所望のプラスミドｐ　Ｌ　１４２を構成
しており、これを用いて実質上、実施例２Ｉの方法に従
って大腸菌ｘ１２ｉｔＲ１を形質転換した。大腸菌に１
２　ＲＲＩ／ｐＬ１４２形質転換（［−。 そのアンピシリン耐性表現型とそのプラスミドＤＮＡの
制限酵素分析により、同定した。プラスミドｐＬ１４２
　　の制限サイトおよび機能地図を添付の第６図に示Ｙ
質転換体からのプラスミドｐＬ１４２の単離は、細胞の
培養に際して用いる抗生物質がアンピシリンであること
を除き、実質上、実施例１の方法に従って行った。 実施例７　プラスミドｐＭｓＶ−ＨＰＣの組立てプ５ス
ミｔ’ｐＭｓＶｉ（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９２９）１０μ
ｇを１０ＸＢｇｌ！ＩＩバッファー１０μｊ、制限酵素
ＢｇＪ　ＩＩ　２μｌ（〜２０単位）、および水８８μ
ｌに溶かし、得られた反応混合物を３７℃で２時間イン
キュベートした。ＢｇＩ！Ｉｆ　−消化プラスミドｐＭ
ｓＶｉ　ＤＮＡ　をフェノールおよびクロロホルムの両
者で抽出した後、ＤＮＡを水１０μｌに再懸濁した。 Ｂｇｌ　■　−消化プラスミドｐＭＳＶｉ　　ＤＮＡ　
２μｌを下記の実施例８Ｃで調製したプラスミドｐｓＶ
２−）（ＰＣＢ　（７）　〜１．４２５　ｋｂ　ＢＣ１
！■　制限フラグメント２μｌと混合し実質上、実施例
２Ｈおよび２工の方法に従い、２つの７ラグメントをラ
イゲートし、これを用いて大腸菌Ｋ１２　ＲＲｌを形質
転換した。 所望のｐＭｓＶ−ＨＰＣ形質転換体をそのプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素分析と、そのアンピシリン耐性およびテ
トラサイクリン耐性表現型により同定した。プラスミド
ｐＭｓＶ−ＨＰＣの制限サイトおよび機能地図を添付の
第７図に示す。プラスミドｐＭｓＶ−ＨＰＣ上にはネズ
ミ肉腫ウィルス配列が存在しているので、このプラスミ
ドを包膜しくカプシドで包みノ、広い宿主域を有するヘ
ルパーウィルス〔例、アンフオトロピック（ａｍｐｈｏ
ｔｒｏｐｉす。 ネズミ白血病ウィルス〕またはその様なヘルパー機能を
担っているセルラインによって供給される転移−活性機
能を有する透過性のベクターにすることができる。この
方法により、ベクターの形質転換能を太いに高め、ベク
ターが発現し得る宿主細胞の範囲を広げることができる
。 実施例８　プラスミドＰＭＭＴΔＢＰｖ−ＨＰＣの組立
て Ａ、中間体プラスミドｐＭＭＴΔＢＰＶの組立て７’う
Ｘ　ミＦｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　（ＡＴＣＣ３７２
２４）約ｌμｇを、１０Ｘ１０ＸＢａ　　反応バッファ
ー１０μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ　５　μｌ！（＝５０
単位〕、および水８５μｌと混合し、得られた反応混合
物を３７℃で２時間インキュベートした。 ６５℃で５分間インキュベートした後、ＢａｍＨＩ消化
プ５ｘ、ミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　Ｄ　Ｎ　Ａを
リガーゼバッファーで濃度的０．１μｇ／μｊに希釈し
、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼでライゲートした後、得られた
プラスミドｐ　Ｍ　Ｍ　ＴΔＢＰＶＤＮＡを用。Ｉ、実
質上、実施例２Ｈおよび２Ｉの方法に従って大腸菌に１
２ＲＲ１を形質転換した。大腸菌に１２ＲＲ１／ｐＭＭ
ＴΔＢＰＶ　　形質転換体を、そのアンピシリン耐性表
現型とそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により同定
した。細胞培養に際して用いる抗生物質がアンピシリン
である外は実質上、実施例１の方法に従って形質転換体
からプラスミドｐＭＭＴΔＢＰｖＤＮＡを単離した。 Ｂ、Ｂｇｌ　■−１’／４化プ５ｘ　ミドｐＭＭＴΔＢ
ＰＶ（７）調製 プ５７．　ミＦｐＭＭＴΔＢＰＶ　ＤＮＡ　１０　＃ｇ
を１０ｘＢｇＩ！ＩＩ　／＜”／７７　１０　ｔｌｌ　
、制限酵素Ｂｇ／■５μｌ！（−５０単位〕、および水
８５μｌに溶かし、得られた反応混合物を３７℃で２時
間インキユペートシた。次いで、この反応混合物をフェ
ノールで１回、さらにクロロホルムで１回抽出し、ＤＮ
Ａを沈殿させ、遠心して集めた。この様にして得たＢｇ
Ｉ！ＩＩ−消化プラスミドｐ　Ｍ　Ｍ　ＴΔＢＰＶ〜１
０μｇをＴＥバッファー２０μｌに懸濁し、２０℃で保
存した。 Ｃ，１５スミｌ’ＰｓＶ２−ＨＰＣｇ　（７）−１，４
２５ｋｂＢｅｌ！Ｉ　　制限フラグメントの単離制限酵
素Ｂｃｌ！Ｉ　によってＤＮＡを完全に消化するために
は、認識配列中のデオキシアデニル残基がメチル化され
ていてはならない。Ｂｃｌ！Ｉ　　消化に供されるプラ
スミドＤＮＡを大腸菌内で生産する場合には、大腸菌に
１２　ＧＭ４８（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７２５）の如く、
アデニンメチラーゼ欠損株を用いる必要がある。 形質転換のために大腸菌に１２　ＧＭ４８を用意し、こ
れを、実質上、実施例２Ｉの方法に従い、プラスミドｐ
ＳＶ２−ＨＰＣＦ３で形質転換した。細胞培養中に用い
る抗生物質がアンピシリンである外は、実質上、実施例
１の方法に従って大腸菌１ｃ１２　ｃＭ４８／ｐＳＶ２
−ＨＰＣ８形質転換体からプラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣ
ＢＤＮＡ　　を単離した。 大腸菌に１２　ＣＭ４８／ｐｓＶ２−ＨＰＣ＋３形質転
換体から単離したプラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８ＤＮＡ
５０μｇを１０ＸＢｃｌ！Ｉ　反応バッファー（７５０
ｍＭＫＣｌ！；　５ＱｍＭ　　）リス−１（ＣＩ！、Ｐ
Ｈ＝７．４：１００ｍＭＭｇＣ１２：　１０　ｍＭジチ
オトレイトール：オヨび１１１９７ａｄＢｓＡ）１０μ
／、制限酵素Ｂｃ／１５μｌ！（〜５０単位〕および水
８５μｌに溶かし。 得られた反応混合物を５０℃で２時間インキュベートし
た。このＢｃＩ！Ｉ−消化プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ
８ＤＮＡをＩＪアガロースゲルに適用して所望の〜１，
４２５　ｋｂ　Ｂｃｌ！Ｉ制限フラグメントを単離し、
実質上、実施例２Ｇの方法に従って精製した。得られた
フラグメント〜５μｇをＴＥバッファー１０μｌ　に溶
かし、−２０℃に保存した。 Ｄ、　　７”　５　Ｘ　ミＦ　ｐＭＭＴ、１ＰＶ−ＨＰ
Ｃ（７）組立テノタめのライゲーションおよび大腸菌に
１２　ＲＲＩの形質転換 実施例８Ｂで調製したＢｇＩ！ＩＩ−消化プラスミＦ　
ｐＭＭＴΔＢＰＶ　ＤＮＡ　　２　ｌｉｔと、実施例８
Ｃで単離した。プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の〜１．
４２５ｋｂ　ＢｃＩ！Ｉ制限フラグメント２μＥとを混
合し。 実質上、実施例２Ｈおよび２■の方法に従ってライゲー
トし、得られたプラスミドｐＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣＤ
ＮＡを用いて大腸菌に１２ＲＲ１を形質転換した。所望
の大腸菌Ｋ　１２　ＲＲｌ　／　ｐ　ＭＭＴΔＢＰＶ−
ＨＰＣ形質転換体を、そのアンピシリン耐性表現型とそ
のプラスミドの制限酵素分析により、同定した。細胞培
養中に用いる抗生物質がアンピシリンである外は実質上
、実施例１の方法に従って形質転換体からプラスミドｐ
ＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣを単離した。プラスミドｐＭＭ
ＴΔＢＰＶ−Ｈ付 ＰＣの制限サイトおよび機能地図を添の第８図に△ 示す。 実施例９　プラスミドｐＬ１５１の組立てＡ、プラスミ
ドｐＬ１４２から導かれる〜１．０６ｋｂＢｓＬＥ■−
Ｘｈｏ　Ｉ制限フラグメントの組立て プラスミドｐＬ１４２　ＤＮＡ　５０　ｐｇを１０ＸＮ
ｄｅ１反応バッファー１０μ／、制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ　
５μＩ！（〜５０単位〕、詔よび水８５μｊに溶かし、
得られた反応混合物を３７℃に２時装置いた。反応後。 ＤＮＡを沈殿させ、遠心して集めた。ＤＮＡペレットを
クレー−バッファーに再懸濁し、実質上、実施例５Ａの
方法に従ってＮｄｅｌ−消化ＤＮＡをクレノー酵素で処
理した。クレノー反応の後、ＤＮＡを再度沈殿させ、遠
心して集めた。 実質上、実施例５Ａの方法に従ってＸｈＯリンカ−（５
’−Ｃ：ＣＴＣＧＡＧＧ−３′）をキナーゼ処理し、ラ
イゲーションのために調製してＮｄｅＩ−消化、クレノ
ー処理プラスミドｐＬ１４２ＤＮＡにライゲートした。 このライゲーション反応物を熱で不活性化した後、ＤＮ
Ａを沈殿させ、遠心して集めた。 このＤＮＡペレットを１０ＸＸｈｏ　Ｉ反応バッファー
２０ｔｔｌ：、制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ　１０１ｔｌ　（−
１００単位）および水１７０μｅに溶かし、得られた反
応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。 次いで、この反応混合物に制限酵素ＢｓｔＥｎ５μｌ！
（〜５０単位）を加え、鉱油下６０℃で４時間インキュ
ベートした。フェノール沈殿の後、消化ＤＮＡをアクリ
ルアミドゲルに適用し、実質上、実施例２Ａの方法に従
って〜１．０６　ｋｂ、　Ｂｓ　ｔ　Ｅ■−Ｘｈｏ　Ｉ
　　制限フラグメントを単離し、精製した。所望のフラ
グメント約５μｇを得、これをＴＥバッファー１０μｌ
に懸濁し、−、２０’Ｃで保存した。 Ｂ８　　ライゲーション、並びにプラスミドｐＬ１５１
および大腸菌に１２　ＲＲＩ／ｐＬ１５１の最終的な組
立て 実施例９Ａで調製した、プラスミドｐＬｌ　４２から導
かれた−１．Ｑ　５　ｋｂ　Ｂｓ　ｔ　Ｅ　ｎ　−Ｘｈ
ｏ　ｉ制限フラグメント２μｌを実施例５Ｂで調製した
プラスミｔ’ｐｓＶ２−ｄｈｆｒ−Ｘ（７）−４，２ｋ
ｂＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメント２μｌ、およ
び実施例５Ｄで調製したプラスミドｐＬ１３３の〜２．
７４Ｂｓｔ　ＥＩＩ　−ＥｃｏＲＩ　制限フラグメント
２μｌにライゲートした。ライゲーション反応は、実質
上、実施例２Ｈの方法に従って行われた。 ライゲートされたＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ１５１
を構成しており、これを用いて、実質上、実施例２Ｉの
方法に従い、大腸菌に１２ＲＲ１を形質転換した。所望
の大腸菌Ｋｌ　２　ＲＲ１／ｐ　Ｌ１５１形質転換体を
アンピシリン−含有培地上で選択し、そのプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素分析により、同定した。このプラスミド
ｐＬｌ　５１の制限サイトおよび機能地図を添付の第９
図に示す。 実施例１０　プラスミドｐｃＺ］　１の組立てＡ８　　
中間体プラスミドＰＣ７１１８の組立てプラスミドＰＣ
ＺＩＯＩ　　１０μｇを１０ＸＮｄｅＩ反応バッファー
１０μｌ、制限酵素ＮｄｅＩＩＱμｌ（〜２０単位〕、
および水８０μｌに溶かし、得られた反応混合物を３７
℃において、消化が完了するまでインキュベートした。 この゛Ｎｄｅｌ−消化プラスミドｐＣＺ　ＩＱＩ　ＤＮ
Ａを沈殿させ、遠心して集めた。このＤＮＡペレットを
１０　Ｘ　ＥｃｏＲＩ反応バッファー１０μｌ、制限酵
素ＥＣ０ＲＩ２μｌ（〜２０単位〕、および水８８μｌ
に溶かし、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。 再度ＤＮＡを沈殿させ、遠心して集めた後、実質上実施
例５Ａの方法に従い、Ｎｄｅ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ消化プラ
スミドＰＣＺＩＯＩ　ＤＮＡを、クレノー酵素で処理し
た。このクレノー処理ＤＮＡをリガーゼバッファー中で
濃度約０．１μｇ／μｌに希釈し、次いで、実質上実施
例２Ｈの方法に従って自己ライゲートさせた。ＤＮＡ配
列決定の結果、クレノー酵素にヌクレアーゼが混ざって
いることが判明し、いくらか分解されていたが、ｌｐｐ
プロモーターには著しい影響がなかった。コンピテント
大腸菌に１２ＲＶ３０８細胞を用意し、形質転換用ＤＮ
Ａを加えた後２５℃以上の温度で細胞をインキュベート
しない、ということの外は、実質上、実施例２Ｉの方法
に従い、プラスミドｐｃＺｌ１８ＤＮＡで形質転換した
。すなわち、形質転換するＤＮＡを細胞と混合し、氷上
で３０分ないし１時間インキュベートした後、細胞を遠
心して集めた。 得られた細胞ペレットをＬ−グロス〜１　ｍｌに再懸濁
し、この懸濁液を２５℃において１時間インキュベート
シた後、選択用平板上にプレートした。 大腸菌に１２　ＲＶ３０８／ｐｃＺ１１８　形質転換体
をそのカナマイシン耐性表現型とそのプラスミドＤＮＡ
の制限酵素分析により同定した。この形質転換体を、カ
ナマイシンと一緒にＴＹプロス中、低温（〜２５℃〕で
、６００　ｎｍにおける０、Ｄ、が０８５〜１，０に達
するまで培養し、次いで、それらを３７℃で４時間また
はそれ以上インキュベートすることにより、該形質転換
体からプラスミドｐｃ７１１８ＤＮＡを単離した。次に
細胞を集め、実質上、実施例ＩＢの方法に従いプラスミ
ドＰＣ２１１１３ＤＮＡを単離した。 Ｂ、中間体プラスミドｐｃＺ１４１の組立てプラスミド
ＰＣＺ１１８ＤＮＡ１０μｇをＩＯＸＢａｍＨＩ　　ｚ
＜７７アー１０ｐｌ：、　　制限酵素ＢａｍＨＩ２μｌ
！（〜２０単位〕、および水８８μｌに溶かし、得られ
た反応混合物を３７℃で２時装置いた。このＢａｍＨＩ
−消化プラスミドｐＣ２１１８ＤＮＡを沈殿させ、遠心
して集めた。このＤＮＡペレットをクレノーバッファー
に再懸濁し、実質上、実施例５Ｂの方法に従ってクレノ
ー酵素で処理した。次に、得られたＢａｍＨＩ−消化、
クレノー処理プラスミドｐｃＺｌ　１１３　ＤＮＡを６
５℃において５分間インキュベートした。 Ｎｄｅ　Ｉ　　リンカ−（５’−ＣＣＡＴＡＴＧＧ−３
′％ニューイングランドバイオラボ供給〕をキナーゼ処
理シ、ライゲーションのために調製して、実質上、実施
例５Ａの方法に従い、ＢａｍＨＩ−消化、クレノー−処
理プラスミドｐｃ２１１８ＤＮＡにライゲートした。リ
ンカ−がライゲートされた後、酢酸ナトリウム（ＮａＯ
Ａｃ）を、制限酵素ＮｄｅＩＩＱμｌ！（〜３０単位）
と−緒に、終濃度が１５０ｍＭになる様に加え、得られ
た反応混合物を３７℃において、ＮｄｅＩ　　による消
化の完了が認められるまで、インキュベートした。次い
で、このＮｄｅＩ消化ＤＮＡを１％アガロースゲルに適
用し、実質上、実施例２Ｇ（７）方法に従い、−ｇ、２
　ｋｂ　Ｎｄｅ　Ｉ制限フラグメントを単離し、精製し
た。〜５μｇのフラグメントを得、これをＴＥバッファ
ー１０μｌに懸濁した。 上記の如くにして調製したＤＮＡ４μＥを自己ライゲー
トし、得られたプラスミドｐｃ：Ｚ１４１　ＤＮＡを用
い、実質上、実施例１２Ａの方法に従って大腸菌に１２
　ＲＶ３０８　　を形質転換した。大腸菌に１２　ＲＶ
３０８／ＰＣ：Ｚ１４１　　形ｆｊ転換（１−そのカナ
マイシン耐性表現型とそのプラスミドＤＮＡの制限酵素
分析により、同定した。実質上、実施例１０Ａの方法に
従い、形質転換体からプラスミｌ’ＰＣＺ１４１　ＤＮ
Ａを単離しｆ：。 プラスミドｐｃＺｌ　４１　のＤＮＡ配列決定により、
クレノー酵素による処理の際、予測された様に、Ｂａｍ
ＨＩ　　オーバーラツプ（重複〕の１充填（ｆｉｌｌｅ
ｄｉｒＱ’がなされていないことが分った。そ）代す、
ＢａｍＨＩ　　オーバーラツプと隣接する配列は、Ｎｄ
ｅ　１リンカ−の付加に先立ち、プラスミドｐｃＺ１１
８ＤＮＡから除かれてしまっていた。この混合ヌクレア
ーゼ活性は、実質的に、以後のプラスミドｐＣＺ４５９
の組立てには影響を及ぼさなかった。 Ｃ０中間体プラスミドｐｃＺＩＱの組立てフ５スミｌ’
ｐｃＺ１４１１０　μｇヲ１０ＸＸｂａ　Ｉ反応バ”７
７７−（５００ｍＭＮａｃｌ！；　６０ｍＭ　　）リス
−ＨＣ１！、ＰＨ＝７−９　：　６０　ｒｎＭ　Ｍ　ｇ
　Ｃｔ！２　；および１ｍｉ／ａｌＢ　Ｓ　Ａ　）　１
０　ｉｓｌ、制限酵素）（ｂａ　Ｉ　５　ｔｔｌ（〜５
０単位）、および水８５μｌに溶かし、得られた反応混
合物を３７℃で２時間インキュベートした。このＸｂａ
　Ｉ−消化プラスミドＰＣＺ１４１　　ＤＮＡを沈殿さ
せ、遠心して集めた。このＤＮＡペレットを１０ＸＮｄ
ｅ　Ｉ反応バッファー１０μＥ１制限酵素Ｎｄｅ　１１
０　μｌＩＣ〜３０単位〕、および水８０μｌに再懸濁
し、得られた反応混合物を３７℃で消化が完了するまで
インキュベートした。 このＮｄｅ　１−Ｘｂａ　Ｉ−消化プラスミドｐＣＺ１
４１ＤＮＡを１％アガロースゲルに適用し、実質上、実
施例２Ｇの方法に従って〜３，５ｋｂ制限フラグメント
を単離し、精製した。約５μｇのフラグメントを得、こ
れをＴＥバッファー１０μｌに懸濁した。 式： で示されるＤＮＡリンカ−を合成し、キナーゼ処理して
実質上、実施例２Ｂの方法に従い、ライゲーションのた
めに調製した。このリンカ−は、両端に位置する一本鎖
ＤＮＡ配列を介して、プラスミドｐｃ：ＺＩ４１　　の
−８，５ｋｂＮｄｅ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉ制［フラグメント
とライゲーションされる。プラスミドＰＣＺ１４１　の
Ｘｂａ　Ｉ　　部位はこのプラスミド上に存在している
ｌｐｐ　　プロモーターの直ぐ下流に挿入されるあらゆ
る構造遺伝子のための、強力なリポソーム結合部位をコ
ードしている。 プラスミドｐｃＺ１４１　　のｗ８．６　ｋｂ　Ｘｂａ
Ｉ　−ＮｄｅＩ　制限フラグメント２μｌと上記のＸｂ
ａＩ−ＮｄｅＩリンカ−１００ピコモルとをライゲート
し、得うれたプラスミドｐｃＺＩＱＤＮＡを、実質上、
実施例１０Ａの方法に従って大腸菌に１２　ＲＶ３０８
　　に導入（トランスフオーム）した。大腸菌に１２Ｒ
Ｖ３０８／ｐｃＺ１０形質転換体を、そのカナマイシン
耐性表現型とそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によ
って同定した。実質上、実施例１０Ａの方法に従い、こ
の形質転換体からプラスミドｐＣＺ１０を単離した。プ
ラスミドｐｃＺＩＱの制限サイトおよび機能地図を添付
の第１１図に示す。 Ｄ、中間体１ラスミドｐｃＺ１１４の構築１５７、ミｌ
’ｐｃＺ１０１ＤＮＡ１０　ｕ、ｇを、ＩＱ＞＜Ｘｂａ
Ｉ反応緩衝液１０ｐｌ：、制限酵素ＸｂａＩ２μｊ’Ｃ
〜２０単位）およびＨ２Ｏ８８μｌに溶解し、得られた
消化液を３７℃で２時間インキュベートした。 このｘｂａＩ　消化したプラスミドＰＣＺＩｏＩＤＮＡ
を遠心によって沈殿させ、集めた。このＤＮＡベレット
を、１０Ｘ１０ＸＢａ　反応緩衝液１ｏ　ｐｌ、制限酵
素ＢａｍＨＩ２μｅ（〜２ｏ単位〕およびツ８８ａ／に
溶解し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベー
トした。実質上、実施例２Ｇの方法に従って、このＸｂ
ａ　Ｉ−ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＣＺ１０１
ＤＮＡを１％アガロースゲルにかけ、〜１０．２ｋｂの
Ｘｂａ　Ｉ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離し、精
製した。約５μｇのフラグメントが得られ、ＴＥ緩衝液
１０μｌに懸濁させ、−２０℃で貯麓した。 プラスミドＰＣＺＩＯＩＤＮＡ　５０μｇを、ｌ０ＸＢ
　ａ　ｍ　ＨＩ反応緩衝液２０　μ／　、制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ３μｌ！（〜５０単位）、制限酵素Ｈｇ１ＡＩ５
μｌ（〜５０単位〕およびＨ２Ｏ１７０μｌに溶解し。 得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。 実質上、実施例２人の方法に従って、このＢ　ａｍＨＩ
　−Ｈｇ　ｉ　Ａ　Ｉ　　で消化したプラスミドｐＣＺ
ＩＱＩ　ＤＮＡ　を３．５％ポリアクリルアミドゲルに
かけ１．Ｑ、５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｇｉＡＩ制限フラ
グメントを単離し、精製した。約５μｇのフラグメント
が得られ、ＴＥ緩衝液１０μｅに懸濁させ、−２０℃で
貯蔵した。 以下の配列： で示されるＤＮＡＩＪンカーを、実質上、実施例２Ｂの
方法に従って、ライゲーション用に構築し、キナーゼ処
理し、調製した。上記のＤＮＡリンカ−は、Ｘｂａ　ｌ
−Ｈｇ１ＡＩ切断Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉｔ適合する、単鎖ＤＮ
Ａ１［要部を有している。 実質上、実施例１０Ａでの教示に従ってプラスミ　ドｌ
ｌ：Ｚ１０１の−Ｉ　　Ｑ、２　ｋ　ｂ　　Ｘｂａ　　
Ｉ−ＢａｍＨＩ制限７ラグメント２μ１１プラスミドｐ
ＣＺ　１０１の〜０，６　ｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｈｇｉ　
Ａｌ　制［７５りｌ　７ト２μｌ、および上記リンカ−
１００ピコモルをライゲーションし、得られたプラスミ
ドＰＣＺＩ　１４ＤＮＡで、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｒ
Ｖ３０８を形質転換した。 このＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／ｐｃＺ１１形
質転換体は、そのカナマイシン耐性の表現型によって、
およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同
定した。プラスミドＰＣ：Ｚ１１４　は、実質上、実施
例１０Ａの方法に従って形質転換体から単離した。プラ
スミドｐＣＺ１１４　は本質的にプラスミドＰＣＺＩＯ
Ｉ　　と同様の制限部位詔よび機能地図を有している。 Ｅ、プラスミドｐｃＺ１１４　由来の−Ｑ、９　ｋｂ　
Ｎｄｅｌ−Ｋｐｎｌ制限フラグメントの構築 プラスミドＰＣ２１１４ＤＮＡ５０μｇを、１０μｓ）
１０ＸＳｍａＩ　反応緩衝液［：１．５ＭのＮａＣｌ！
、６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ＝７．４）　、６
．ＯｍＭのＭｇＣ１！２，１００　ｍＭ（７）　　２−
１　／Ｉ／カフ）　１り／　−ル、および１１１１ｇ／
ｍｅのＢＳＡ：ｌ　、５μｌ（〜５０単位）の制限酵素
ＳｍａＩおよび８５μｌのＨ２Ｏ６橢解し、得られた反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。反応を、フ
ェノールおよびＣＨＣｌ！３抽出によって終結させ、次
いで５ｍａｌ消化したプラスミドｐｃＺｌ１４ＤＮＡを
遠心して集めた。 Ｎｄｅ　Ｉ　　ＩＪ７カー〔５’−ＣＣＡＴＡＴＧＧ−
３二ニユーイングランド・バイオラプス（Ｎｅ、ｗ　Ｅ
ｎｇＬａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）］を、実質上、実施例
１０Ｂの方法に従って、キナーゼ処理し、そしてＳｍλ
Ｉ消化したプラスミドｐｃＺ１１４ＯＮＡにライゲーシ
ョンした。ライゲーションをフェノールおよびｑＨＣ１
３抽出で終結させた後、ＤＮＡを沈殿させ、集めた。 コ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａペレットを１０　ｐｉ：の１０Ｘ
ＫｐｎＩ反応緩衝液（５Ｑ　ｍＭのＮａＣ４，５ＱｍＭ
のトリス−ＨＣｌ！（ＰＨ＝　７．５　）、５ＱｍＭの
ＭｇＣ１！２．６０ｍＭ　（７）２−１　ルｔｙフｌ−
ｘｐ　７−ル、オヨび１　’９／ｎｅのＢＳＡ）、５μ
Ｅ（〜５０単位〕の制限酵素Ｋｐｎｌ、および８５μｌ
の８２０に溶解し、轡られた反応液を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。 ６５℃で１０分間加熱することによって反応を終結させ
た。室温まで冷却した後、】Ｑ×Ｎｄｅ１反応緩衝液２
０μｌ、制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ　１５μｌ！（〜４５単位
）、および８２０６５ｕｌをＫｐｎ　Ｉ消化したＤＮＡ
に加え、得られた反応液を３７℃で数時間インキュベー
トした。 このＮｄｅ　Ｉ　−Ｋｐｎ　Ｉ消化しりＤ　Ｎ　Ａを、
実質上、実施例２Ａの方法に従って、３．５％ポリアク
リルアミドゲルにかけ、−Ｑ、９　ｋｂＮｄｅｌ−Ｋｐ
ｎＩ制限フラグメントを単離し、精製した。約５μｇの
所望のフラグメントが得られ、１０μｌに懸濁させ、−
２０℃で貯蔵した。 Ｆ、　　プラスミドｐｃＺｌ］の最終的な構築１５スミ
ｌ’ＰｃＺ１０ＤＮＡ１０　、ｕｇを、１０ＸＫｐｎＩ
反応緩衝液１０　ｐｉ：　、制限酵素Ｋｐｎ　Ｉ　５ｔ
ｔｌ！（〜５０単位〕、およびＨ２Ｏ８５μｌに溶解し
、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした
。 ６５℃で１０分間インキュベートして反応を終結させた
。次いで、１０；ｘＮｄｅＩ反応緩衝液２０μｌ。 制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ　５μＩ！（〜５０単位）、および
Ｈ２Ｏ７５μｌを加えた後、３７℃で２時間インキュベ
ートして、このＫｐｎｌ消化したＤＮＡをＮｄｅｌ　　
で消化した。 コ（７）Ｋｐｎ　Ｉ−Ｎｄｅ　Ｉ消化したプラスミドｐ
ＣＺＩＱＤＮＡを、実質上、実施例２Ｇの方法に従って
、１％アガロースゲルにかけ、〜７，９　ｋｂ　Ｎｄｅ
　Ｉ−ＫｐｎＩ制限フラグメントを精製した。約５μｇ
のフラグメントが得られ、ＴＥ緩衝液１０μｌに懸濁さ
せた。 プ５　スミｔ’　ＰＣＺＩＯ（７）−７，９ｋｂ　Ｎｄ
ｅ　Ｉ−ＫｐｎＩ制限フラグメント２μｌおよびプラス
ミドｐｃＺ１１４（７）−０，９ｋ　ｂ　Ｎｄｅ　Ｉ−
Ｋｐｎ　Ｉ制限フラグメント２μｌを、実質上、実施例
１０Ａの方法に従って、ライゲーションし、得られたプ
ラスミドｐｃＺｌ　１ＤＮＡ″ｒ！Ｅ、ｃｏｌｉＲＶ３
０８を形質転換シタ。コ（７）Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２
　ＲＶ３０８／ｐＣＺ１１形質転換体は、そのカナマイ
シン耐性の表現型によって、およびそのプラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析によって同定した。実質上、実施例１
０Ａの方法に従って、形質転換体からプラスミドｐｃＺ
ｌｌを単離した。 プラスミドＰＣＺＩＯに存在するＩＰＰ　プロモーター
および合成リボンーム結合部位の１下流〃に、Ｂ　ａ　
ｍ　ＨＩ制限酵素認識部位を配置するように、プラスミ
ドｐｃＺｌｌを構築した。このＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位に
よって、プラスミドｐｃＺｌｌに、プロティンＣ活性を
コードしているＤＮＡ配列を挿入し、該配列をＩＰＰ　
　プロモーターの制御下に置くことができる。この構築
を下記の実施例１１に開示する。 実施例１１ プラスミドＰＣＺ４６０　の構築詔よびＥ、ｃｏｌｉに
おけるプロティンＣ誘導体の発現 Ａ、中間体プラスミドｐｃｚ４５１の構築プラスミドｐ
ｃＺ１１　（１・Ｏｆｉｇ　）を、ｌＱＸＢａｍＨＩ反
応緩衝液１０　ｐｉ：、制限酵素ＢａｍＨＩ　５　ｔｔ
ｌ！（〜１０単位）、制限酵素Ｎｄｅ１５μｌ（〜１０
単位）およびＨ２０ｓ　ｏμｌに溶解し、得られた反応
液を３７℃で２時間インキュベートした。このＮｄｅＩ
−ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐｃＺ１１　ＤＮＡを
、実質上、実施例２Ｇの方法に従って、１％アガロース
ゲルｊＣかけ、〜８゜５　ｋｂ　Ｎｄｅ　Ｉ　−Ｂａｍ
ＨＩ制限フラグメントを単離し、精製した。約５μｇの
フラグメントが得られ、ＴＥ緩衝液１０μｌに懇濁させ
た。 以下の配列： で示されるＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪンカーを、実質上、実施例
２Ｂの方法に従って、ライゲーション用に構築シ、キナ
ーゼ処理し、調製した。このリンカ−は、上記調製のＮ
ｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐｃＺ１１　Ｄ
ＮＡとのライゲーションが可能な、単鎖ＤＮＡ延長部を
有している。メチオニンのコドン、および新生ヒトプロ
ティンＣのアミノ酸残基３３−３９のコドンをａ−ドす
るように、このリンカ−を設計した。アデニルおよびチ
ミジルに富むようにし、それでもなお天然のヒトプロテ
ィンＣにおけると同様のアミノ酸配列を暗号化するよう
にリンカ−を設計した。既述したように、新生ヒトプロ
ティンＣ構造遺伝子の、推定の信号ペプチドを暗号化し
ている領域は、原核生物宿主細胞用に設計した発現プラ
スミドには含めなかった。 実質上、実施例１０Ａの方法に従って、プラスミドｐｃ
Ｚｌｌの−３，５ｋｂ　ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ制限フラ
グメント２μｌと上記リンカ−１００ピコモルをライゲ
ーションし、得られたプラスミドｐＣＺ４５１　　ＤＮ
Ａを使用してＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８を形質
転換１．ｆ：。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／Ｐ
ＣＺ４５１形質転換体は、そのカナマイシン耐性の表現
型によって、およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分
析によって同定した。実質上、実施例１０Ａの教示に従
って、形質転換体からプラスミドＰＣＺ４５１ＤＮＡを
単離した。 プラスミドｐｃＺ４５１　を部分的に配列決定すること
により、このプラスミドは、プラスミドｐＣＺ１１の構
築の間に、ＮｄｅＩリンカ−が複数個直列に結合したた
め、２つのＮｄｅＩ部位を有することがわかった。直列
に並んだＮｄｅＩ部位は望ましくなく、実施例１１Ｇに
記載のようにして除去した。 Ｂ、中間体プラスミドｐＣＺ４５５の構築プラスミドｐ
ｃ：Ｚ４５１を、１０Ｘ１０ＸＢａ反応緩衝液１０μｌ
、制限酵素ＢａｍＨＩ　２　ｌｉｔ　（−２０単位〕お
よびＨ２Ｏ８８μｌ　に溶解し、得られた反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。反応をフェノールおよ
びＣＨＣｌ！３抽出で終結させた後、遠心によってＤＮ
Ａを沈殿させ、集めた。 ＢａｍＨＩ消化したプラスミ゛ドｐｃＺ４５１　Ｄ　Ｎ
Ａｌ０μｇをＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、−２０℃で
貯蔵した。 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８にはＤＮＡ制限−修
飾系が存在するので（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＲｌに
は存在しない）、実施例１で単離したようなプラスミド
ｐＨＣ７ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡを修飾するが制限
はしない宿主細胞に導入して形質転換し、この細胞から
単離しなければならない。本発明の構築においては、プ
ラスミドｐＨＣ７から単離したＢａｍＨＩフラグメント
はＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８制限系によって制
限されないので、このようなサイクリングは必要ない。 しかし、一般的にはこのようなサイクリングが必要であ
る。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＪＡ２２１　（ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５２ｉｉ）はこのようなサイクリングに適する
宿主である。 プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ５０　／ｊｇを、１０Ｘ１０
ＸＢａ反応緩衝液１０ｔｔｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ　５
　ｐｌ（噌５０単位）およびＨ２Ｏ８５μｌに溶解し、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。 ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを、実
質上、実施例２Ｇの教示に従って、１チアガロースゲル
にかけ、〜１，２ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントを
単離し、精製した。約５μｇのフラグメントが得られ、
Ｔ’Ｅ緩衝液１０μｌに溶解し、−２０℃で貯蔵した。 実質上、実施例１０Ａの方法に従って、ＢａｍＨＩ消化
したプラスミドｐＣＺ４５１　（２Ｋ）およびプラスミ
ドｐＨＣ７の−１，２ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメン
ト２μｌをライゲーションし、得られたプラスミｔ’Ｐ
ｃＺ４５５　ＤＮＡ　を使用シテＥ、ｃｏｔ　１Ｋ１２
　ＲＶ３０８を形質転換した。このＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１
２ＲＶ３Ｑ８／ｐＣＺ４５５転換体を、そのカナマイシ
ン耐性の表現型によって、およびそのプラスミドＤＮＡ
の制限酵素分析によって同定した。実質上、実施例１０
Ａの教示に従って、形質転換体からプラスミドｐＣＺ４
５５　を単離した。 プラスミドｐＨＣ７の−１，２ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フ
ラグメントは、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで消化したプラスミド
ｐｃＺ４５１　　に、２配向のどちらででもライゲーシ
ョンすることができる。これら２配向のうちの１万だけ
（プラスミドｐＣＺ４５５　　と称される〕が、プロテ
ィンＣを暗号化するＤＮＡを正確に再構築する。プロテ
ィンＣのヌクレオチド配列がわかっているので、正しい
配向は制限酵素分析によって容易に同定される。プラス
ミドｐＣＺ４５５　においては、〜１．２　ｋｂ　Ｂａ
ｍＨＩ制限フラグメント内に位置するＢｇｌ　　■制限
酵素認識配列が、ＩＰＰ　　プロモーターの３′末端に
位置するＸｂａｌ　　制限酵素認識配列のできるだけ近
くに配置されるように、この〜１．２　ｋｂ　ＢａｍＨ
Ｉ制限フラグメントを配向させる。 Ｃ０中間体プラスミドｐＣＺ４５９の構築実施例】ＩＡ
に記載したように、プラスミドｐｃ：Ｚ４５１およびｐ
ＣＺ４５５　における直列に並んだ複数のＮｄｅ　ｌ制
限部位の存在は望ましくない。この直列部位は、ＩＰＰ
プロモーターとプロティンＣを暗号化するＤＮＡの開始
コドンの間に位置しており、プロティンＣ暗号化配列の
ｍＲＮＡ転写の枠外読み取りを引き起こすことがある。 従って、プラスミドＰＣＺ４５５　（５０ｐｇ）をＩＱ
＞＜ＫｐｎＩ　　反応緩衝液１０　ｔｔｌ　、制限酵素
Ｋｐｎ　ｌ　ｓ＃　（ｗ５Ｑ単位）およびＨ２０Ｂ　５
μｌに溶解し、得られた消化液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。次いで、こ（７）ＫｐｎＩ　　消化した
プラスミドＰＣＺ４５５ＤＮＡを、１０ＸＮｄｅＩ反応
緩衝液２０μｌ、制限酵素Ｎｄｅ１１５μｌ（〜４５単
位）およびＨ２Ｏ６５μｌに添加した後、得られた反応
液を３７℃でＮｄｅｌ消化が完結するまでインキュベー
トして、Ｎｄｅ　Ｉ消化を行なった。 実質上、実施例２Ｇの方法に従って、〜ｌ、　９　ｋｂ
ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩ制限フラグメントを反応混合物から
単離し、精製した。約５μｇの７ラグメントが得られ、
ＴＥ緩衝液１０μｌに懸濁させた。 実質上、実施例１０Ａの方法に従って、実施例１０　Ｆ
で調製したプラスミドｐｃＺＩＱの−７，９ｋｂＮｄｅ
ｌ−ＫｐｎＩ制限フラグメント２μｌとプラスミドｐＣ
Ｚ４５５の−１，９ｋｂ　Ｎｄｅ　Ｉ−Ｋｐｎ　Ｉ制限
フラグメントをライゲーションし、得られたプラスミド
Ｐｃｚ４５９ＤＮＡでＥ、ｃｏｌｉＲＶ３０８　を形！
転換シタ。コ（７）Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８
／ｐＣＺ４５９形質転換体を、そのカナマイシン耐性の
表現型によって、およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵
素分析によって同定した。実質上、実施例１０Ａの方法
に従って、形質転換体からプラスミドｐＣＺ４５９を単
離した。プラスミドｐＣＺ４５９　　の制限部位および
機能地図を、添付の第１２図に示す。 プラスミドｐＣＺ４５９は、先に番号を付した新生ヒト
プロティンＣのアミノ酸残基３３〜４４５のコドンをコ
ードしているＤＮＡと、その前のメチオニンコドンをコ
ードしているＤＮＡを発現させるために配置されたＩＰ
Ｐ　　プロモーターを含有している。従って、プラスミ
ドｐＣＺ４５９　　は、真核生物の信号ペプチドのアミ
ノ酸残基２〜３２およびプロティンＣのカルボキシ末端
における最後の１６アミノ酸残基をコードしている部分
のみを欠く、はとんどすべての新生プロティンＣ構造遺
伝子を含有する。プラスミドｐＣＺ４５９のプロティン
Ｃを暗号化している部分のイ末端に位置するＤＮＡは、
Ｅ、ｃｏｌｉのリポタンパク遺伝子由来であり、プロテ
ィンＣを暗号化しているＤＮＡと共に転写される。 プラスミドＰＣＺ４５９のＩＰＰ　プロモーターから転
写されるｍＲＮＡは、ポリペプチド、す、なわちそのア
ミノ末端にメチオニン残基を有し、これに新生ヒトプロ
ティンＣのアミノ酸残基３３〜４４５が続き、次いでこ
れにリポタンパク遺伝子由来のＤＮＡによって暗号化さ
れている以下のアミノ酸配列（前記の定義を使用して）
： が続く、ポリペプチドに翻訳される。この融合遺伝子の
産物は、５０．５キロダルトン（ｋｄ）の計算分子量を
有し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／ＰＣＺ４５
９形質転換体を３７℃で培養すれば、該産物を含有する
顆粒を産生ずる。 この顆粒は、約３５　ｋｄおよび２２　ｋｄの測定分子
量を有する、融合遺伝子産生物の２つの異なるサブフラ
グメントをも含有する。理論的には、これらのサブフラ
グメントは、ヒトプロティンＣの軽鎖および重鎖の間に
位置するＬ　Ｙ　Ｓ　−ＡＲＧ配列部分でこの融合遺伝
子産物が開裂することにより生成μ新生ヒトプロティン
Ｃのアミノ酸残基１９８および１９９）、　計算分子量
３１．７ｋｄおよび１８．８ｋｄのポリペプチドを生じ
る。融合遺伝子産物および両サブフラグメントは、天然
のヒトプロティンＣに対するポリクローナル抗体と反応
する。 Ｄ、中間体プラスミドｐＵｃ１９Ｈｃの構築およびその
〜８０ｂｐ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントの単離１０μ
ｇのプラスミドｐｕｃ１９　Ｃ市販品より入手可能、フ
ァーマシア・Ｐ−Ｌ・バイオケミカルズ・インコーポレ
ーション（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　ｓ　％Ｉｎｃ　、　）、ニュージ、ヤージー
０８８５４、ビスカタウエイ、センテニアル・アベニュ
ー、８００番（８Ｑ　ＯＣｅｎｔｅｎｎｉａｌ　Ａｖｅ
、、Ｐｉ　−ｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、０８８５４）
）を、１０×ＰｓｔＩ反応緩衝液１０μＪ、制限酵素Ｐ
ｓｔ　Ｉ　　２ｉｓｌ（＝２０単位〕およびＨ２ＯＢＢ
μｌに溶解し、得られた反応液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。フェノールおよびＣＨＣｌ！３ＨＣｌ上
って反応を終結させた後、遠心によりＤＮＡを沈殿させ
、集めた。 このＰｓｔ　ｌ　　消化したプラスミドｐＵｃ１９ＤＮ
ＡペレットをＴＥ２０μｌ　に溶解し、−２０℃で貯蔵
した。 実質上、実施例２Ｇおよび２Ｈの方法に従って、このＰ
ｓｔＩ消化プラスミドＰＵＣ１９ＤＮＡ２μｌを、実施
例２Ｄで調製したプラスミドｐＨＣ７の〜０．８８　ｋ
ｂ　Ｉ’ｓｔ　ｌ制限フラグメント１μＥにライゲーシ
ョンし、得られたプラスミドｐＵｃ１ｇＨｃＤＮＡを使
用してＥ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１２　ＲＲｋ調１５　（ＮＲ
ＲＬＢ−１５４４０）を形質転換した。この形質転換し
た細胞を、５０μｇ／ａｌのアンピシリン、１ｍＭのＩ
ＰＴＧ（インプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）、
および５０１１　ｇ／１ｘｌ（ＤＸＧ　（５−〕ｏ　−
Ｔ−−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
シド〕を含有するＬ−寒天指示平板上に植えた。 プラスミドＰＵＣ１９で形質転換した細胞は指示平板上
で青色を呈し、−万プラスミドｐＵＣ１９ＨＣで形質転
換した細胞は指示平板上で白色であった。 プラスミドｐＨＣ７の−Ｑ、８８ｋｂ　ＰｓＬ　Ｉ　制
限フラグメントは２つの方向のどちらででも挿入するこ
とができるので、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析を使
用してＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＲＩΔＭ１５／ｐＵｃ
ｌ　ｇｔｔｃ　　形質転換体を同定した。プラスミドＰ
［ＪＣｌ　９８Ｃとは、プラスミドｐ［Ｊｃ１９由来Ｄ
ＮＡのＢａｍＨＩ制限部位に近接している、〜０．８８
ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　　制限フラグメントのＰｓｔＩ　　
オーバーラツプ（重複）の１個から〜６０　ｋｂ離れて
ＢａｍＨＩ制限部位を配置している配向であるものをい
う。選択に使用する抗生物質がテトラサイクリンではな
くアンピシリンであること以外は、実質上、実施例１の
方法に従って、プラスミドＰＵＣ１９ＨＣを形質転換体
から単離した。 プラスミドｐ［Ｊｃ１９ＨｃのＤＮＡ　Ｉ　Ｑ　Ｑμｇ
を、１０Ｘ　Ｒａｍ　Ｈ１反応緩衝液１０μで、制限酵
素ＢａｍＨＩ　１０　μｌ！　（〜１００単位〕および
Ｈ２Ｏ８０μ８こ溶解し、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。実質上、実施例２人の方法に
従って、ＢａｍＨＩで消化したプラスミドＰＵＣ１９Ｈ
ｃのＤＮＡを、６．５％ポリアクリルアミドゲルにかけ
、〜８Ｑ　ｂｐ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントを精製し
た。約１μｇのフラグメントが得られ、ＴＥ緩衝液５μ
ｌに懸濁させ、−２０’Ｃで貯蔵した。 Ｅ、ＢａｍＨＩ消化プラスミドＰＣＺ４５９　の調製お
よびプラスミドＰＣＺ４６０　　の最終的な構築プラス
ミドＰＣ２４５９（５μｇ　）を、１０Ｘ１０ＸＢａ反
応緩衝液２　ｔｉｐ　、制限酵素ＢａｍＨＩ　Ｉ　ｌ１
ｌ（〜５単位）およびｆ（２０１７μｌに溶解し、得ら
れた反応液を３７℃で５分間インキュベートした。 フェノールおよびＣＨＣｌ！３ＨＣｌ上って反応を終績
させた。部分的なりａｍＨＩ消化物を得るため、反応時
間を短かくした。この、部分的にＢａｍＨＩ消化したプ
ラスミドｐＣＺ４５９を沈殿させ、集めた後、実質上、
実施例２Ｈの教示に従って、ＤＮＡペレットをリガーゼ
緩衝液に懸濁させ、プラスミドｐＵｃ１９Ｈｃの−８０
ｂ　ｐ　ＢａｍＨＩ　　制限フラグメント２μｌにライ
ゲーションした。 所望のプラスミドＰＣＺ４６０　　Ｄ　Ｎ　Ａを構成し
ているこのライゲーションＤＮＡを使って、実質上、実
施例１０Ａの方法に従い、Ｅ、ｃｏＬｉ　Ｋ１２　ＲＶ
３０８ヲ形質転換シタ。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３
０８／ｐｃＺ４６０形質転換体を、そのカナマイシン耐
性の表現型によって、およびそのプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によって同定した。プラスミドｐｃＺ４６０
　＠実質上、実施例１０Ａの方法に従って、形質転換体
から得た。 〜ｓ　ｏ　ｂｐフラグメントは、２つの可能な方向の両
方向で、かつ、プラスミドｐＣＺ４５９　　の２つのＢ
ａｍＨＩ制限酵素認識部位の両部位に挿入することがで
きた。従って、様々なプラスミドが上記のライゲーショ
ン中に産生じた。プラスミドｐＣＺ・４６０は、適切ｙ
、（Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ部位に、また同時に、プロティン
Ｃを暗号化しているＤＮＡ配列の再構築に必要な方向で
、〜８０　ｂｐ　　ＢａｍＨＩ制限フラグメントを挿入
して得られるプラスミドに与えられる名称である。従っ
て、プラスミドｐｃＺ４６０　においては、新生ヒトプ
ロティンＣのアミノ酸残基３３〜４６］は、プラスミド
上に存在するＩＰＰプロモータと隣接している転写の読
み取り相内に位置するＤＮＡセグメント上に、正しくコ
ートサれている。プラスミドｐｃＺ４６０の制限酵素分
析により、１以上の一９Ｑ　ｂｐＢａｍＨＩ制限フラグ
メントが、部分的にＢ　’ａ　ｍｕ　１消化したプラス
ミドｐＣＺ４５９　出発物質にライゲーションしている
ことがわかった。正しいプロティンＣを暗号化している
ＤＮＡ配列は適切に再構築されたので、プラスミド上に
存在するこの付加的なフラグメントは、プロティンＣを
暗号化しているＤＮＡ配列中に介在していることもなく
、また、それを延長するものでもない。 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／ｐｃＺ４６０（Ｎ
ＲＲＬ　　Ｂ−１５９２７）形質転換体は、プラスミド
ＰＣＺ４６０上に暗号化されたプロティンＣ誘導体を含
有する顆粒を産生ずる。このプロティンＣ誘導体は約５
０キロダルトンの測定分子量を有し、ＤＮＡ配列からの
正確な計算値は約４８．３ｋｄである。Ｅ、ｃｏｌｉＫ
１２　　ＲＶ３０８／ｐｃＺ４６０　形質転換体ハ、抗
ヒトプロティンＣのポリクローナルまたはモノクローナ
ル抗体と交差反応する、測定分子量５　Ｑ　ｋｄ、２２
　ｋｄ、および３４　ｋｄの３種類の異なるポリペプチ
ドを産生ずる。２２　ｋｄおよび３４　ｋｄのポリペプ
チドは、活性なヒトプロティンＣの軽鎖と重鎖を分離す
る、リジンおよびアルギニン残基部分（前記、形成され
つつあるヒトプロティンＣに付与されるアミノ酸配列の
残基１９８および１９９に対応する〕での５Ｑｋｄのプ
ロティンＣ誘導体の切断（計算分子量２９．５ｋｄおよ
び１８．８ｋｄのポリペプチドを生じるであろう）に起
因すると考えられている。 実施例１２ ＨｅｐＧ−２／ｐＬ１３３形質転換体の構築次に挙げる
方法はＨｅｐＧ−２／ｐＬ１３３形質転換体の構築につ
いて記載するものであるが、プラスミ　ドｐｓＶ２−Ｈ
ＰＣ８、ｐＬ１３２　、　ｐＬ１５１　　、　ｐＭｓＶ
−ＨＰＣ％ｐＬ１４Ｉ、ｐＬ１４２、オＪ：　ヒｐＭＭ
Ｔ△Ｂ　ＰＶ−ＨＰＣ等、本発明の他のプラスミドすべ
てのＨｅｐＧ２形質転換体の構築にも同様に適用するこ
とができる。さらに、この方法は、好ましいセルライン
として本明細書中第１表に挙げたセルラインにも一般的
に適用することができる。真核性宿主細胞のための形質
転換法は、当分野で既知である。たとえば、ウィグラー
等（Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、プロシーデインダス
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス米
国（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ　）、７６．１３７３頁
Ｃ１９７９）］　　およびグラハム等（Ｇｒａｈａｍｅ
ｔａｌ、、パイラロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、５２．
４５６頁（１９７３）　’：ｌ。 Ａ、細胞の調製 ヒト肝臓芽細胞腫の細胞、ＨｅｐＧ−２（ＡＴＣＣすＨ
Ｂ８０６５　）の培養物を、形質転換当日に４０〜５０
％の面生長（融合度）が得られるように、形質転換に先
だって１〜２日継代培養した。形質転換の２〜３時間前
に培地を交換した。それぞれの形質転換には、２５ＣＩ
＃フラスコの細胞培養物１つを必要とする。 Ｂ、Ｄ　Ｎ　Ａの調製 プラスミドｐＬ１３３ＤＮＡ１０〜２０μｇを、２Ｍの
ＣａＣ１ｚ　　６２．５μｌおよびＨ２Ｏ４３７，５μ
ｌに加えた。次いで、この０．５ｍｌのＤＮＡを、０．
５ｒｒｔｌＯ”）　２ＸＨｅＢＳ　　ＣＩ　Ｑ　　ｇ／
Ｌ　ヘペス（ＰＨ＝７．５）、１６ｇ／ＬのＮａＣｌ３
．０．７４ｇ／ＬのＫＣＪ、０．２５ｇ／ＬのＮａ２Ｐ
Ｏ４、および２ｇ／Ｌのデキストロース〕に滴下し、乳
状の沈殿を生成させた。この混合物を細胞に加える前に
、室温で１０〜２０分間放置した。インキュベーション
を長くすると、うまく形質転換しない、粗い沈殿を生じ
ることもあるが、時折、沈殿を生じさせるためにより長
いインキュベーショイ時間が必要になることがある。 Ｃ１細胞の形質転換 実施例１２Ｂで調製したＤＮＡ溶液１　ｒｒｔｌを、穏
やかに撹拌しながら２５ｄフラスコのＨｅｐＧ−２細胞
に加え、３７℃で３〜４時間インキュベートした。細胞
を切り離さないように注意しながら、細胞を、血清を含
まない増殖培地（ダルベツコの変性イーグル培地、ギブ
ゴ）で２回洗浄した。１５チのグリセリンを含むＨｅＢ
ＳＩＫＡ’　を細胞に加え、次いで３７℃で２分間イン
キュベートした。 この１グリセリン−ショック”インキュベーションは、
血清を含まない増殖培地を加え、次いで血清を含まない
増殖培地で２回洗浄することによって終結させた。次に
、血清代用品〔ウシ血清アルブミンまたはウルトロサー
〇　（（Ｊｌ　ｔ　ｒｏｓｅ　ｒ−Ｇ）、リアクティブ
・イー・べ−・エフ・フォグ・シミ（Ｒｅａｃｔ　ｉ［
ｆ　Ｉ　、Ｂ、Ｆ、Ｆｏｃ、Ｃｈｉｍ、　ＲＬＫＢ　）
　、ポアンｆ−ギ５−／ｌ／　（Ｐｏｉｎｔｅｔ　Ｇｉ
ｒａｒｄ）、９２３９０ビルヌベラ・ギャレンヌ（Ｖｉ
ｌｌｅｎｅｕｖｅｌａ　Ｇａｒｅｎｎｅ〕、フランスよ
り市販〕を含有する完全な、新鮮な増殖培地および１２
．５μｇ／ａｔビタミン−ヲ加え、細胞を３７℃のイン
キュベーターに戻した。ウシ胎児血清は、プロティンＣ
検定を妨害するウシ因子およびプロテアーゼを含有する
ため、培地に使用しなかった。 通常は形質転換の約９６時間後に、一時検定のために、
５ｍＭの最終濃度となるように酪酸ナトリウムを加えた
。Ｇ４１８λまたはｄｈｆｒ遺伝子のような選択マーカ
ーを含有するプラスミドを包含する形質転換のために、
安定な形質転換体の選択が望ましい時には、酪酸ナトリ
ウムは加えず、選択剤（たとえば４００μｇ／ＩＬＩ　
Ｇ　４１８　）を形質転換の約２〜４日後に加えた。こ
の時にはウシ胎児血清を含有する完全な培地を加え、選
択培地で、２〜３週間、５〜７日毎に培地を変えながら
細胞を増殖させる。次いで個々のクローンを、さらに分
析するため単離する。 Ｄ、プロティンＣの検定 Ｈｅ　ｐＧ−２／ｐＬ１３３形質転換体および擬形質転
換ＨｅｐＧ−２細胞を、形質転換の９６時間後に、プロ
ティンＣについて検定した。擬形質転換細胞は、形質転
換操作にかけたが、形質転換するＤＮＡには接触させな
かったものである。この検定には、後述するようにプロ
ティンＣに対する抗体を必要とする。プロティンＣに対
する抗体を調製するための、プロティンＣ精製のための
技術は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調ｉ
のための技術と同様、当分野で知られている。 ヤギ抗−ヒドブロチインＣポリクローナル抗体を、９６
−ウェル（くぼみ）の組織培養皿中で一晩インキユベー
トし、抗体をプラスチックに結合させた。ウェルを緩衝
液で洗浄した後、ＨｅｐＱ−２／ｐＬＩ３３形質転換体
からの、および擬形質転換したＨｅｐＧ−２細胞からの
培地試料をこのウェルに加えた。この培地試料は形質転
換の９６時間後に採取した。このウェル中の培地試料を
、３７℃で２時間インキュベートした後、ウェルを緩衝
液ですすぎ、マウス抗−ヒドブロチインＣモノクローナ
ルＩｇＧをウェルに加え、４℃で１晩インキユベートし
た。 未結合のモノクローナル抗体を緩衝液ですすぎ流した後
、ペルオキシダーゼでコンジュゲートした、ヒツジ抗−
マウスＩｇＧ　をウェルに加え、３７℃で２時間インキ
ュベートした。緩衝液ですすいだ後、ＡＢＴＳ（２，２
’−アジノージ−３−エチルベンゾチアゾリン−スルホ
ン酸塩）の溶液をウェルに加え、室温かつ暗所でのイン
キュベーションを継続し、試料の光学密度を３０分毎に
２時間、４０５ｎｍで測定した。 本質的に、この検定は、皿に付着しているポリクローナ
ル抗体に結合するプロティンＣによって行なわれる。次
いでモノクローナル抗体がプロティンＣに結合し、ペル
オキシダーゼをコンジュゲートした抗−マウスＩｇＧ　
がモノクローナル抗体に結合するようになる。ペルオキ
シダーゼは時間依存性の反応でＡＢＴＳと反応し、４０
５ｎｍに強い吸収がある生成物を与える。簡単に言えば
、試料中のプロティンＣが多ければ多いほど、４０５ｎ
ｍでの０゜Ｄ、測定値は高くなる。 Ｈｅ　ｐＧ−２／ｐＬＩ　３３形質転換体は、擬形質転
換細胞の１０倍までの測定値を与え、ＨｅｐＧ−２／ｐ
Ｌ１３３形質転換体において、プラスミド制御のプロテ
ィンＣが発現していることを示した。ＨｅｐＣ−２細胞
は染色体性のプロティンＣ構造遺伝子を含有しているの
で、ｍＲＮＡを形質転換体から単離し、プラスミドにコ
ードされたプロティンＣのメツセージ（情報）が存在す
るかどうかを測定した。そティンＣのｍＲＮＡを有して
いることがわかった。 測定値は、調整培地１ｍｇあたりプロティンＣ約１００
〜３０００ｇに対応する。 同様の検定をＣ：ＨＯ−Ｋ　ｌ　（ｄｈｆｒ−）／ｐＬ
１４１形質転換体について行ない、調整培地１ばあたり
のプロティンＣが約１．８μｇであることを測定した。 ＤＸＢ１１宿主細胞のようなＣＨＯ−に１（ｄｈｆｒ−
）宿主細胞は、０ｆ（Ｏ−Ｋｌ細胞に見い出される野生
種のジヒドロ葉酸還元酵素を欠いている。このようなｄ
ｈｆｒ−ＣＨＯ−Ｋｌ宿主細胞は、よく知られた方法に
従って得ることができる。組み換えＤＮＡの増幅により
、Ｈｅ　ｐＧ−２／ｐ　Ｌ　１３３形質転換体よりＤＸ
Ｂ］、１／ｐＬ１４１形質転換体の方に、より多くの組
み換えプロティンＣ遺伝子コヒーカ存在スルノテ、ＤＸ
Ｂ１１／ｐＬ１４１形質転換体はより多数のプロティン
Ｃを発現する。前記のようにこの増幅は当分針でよく知
られており、野生種のｄｈｆｒ遺伝子を含有するプラス
ミドで形質転換された宿主細胞を、増加量のメトトレキ
セイトにさらすことによって行なう。このメトトレキセ
イト仲介の増幅は、多種多様の宿主細胞において行なう
ことができ、ｄｈｆｒ−セルラインに限定はされない。 Ｌ　Ｌ　Ｃ−ＭＫ２／ｐＬ１３２形質転換体で行なった
プロティンＣ検定は、調整培地１　ｔｔｔｌあたり約２
５　ｎｇのプロティンＣを示した。 実施例１３ 組み換えヒトプロティンＣ酵素原の活性化本実施例は、
組み換えヒトプロティンＣを発現し、分泌する゛哺乳動
物細胞の調整組織培養培地から単離した組み換えヒトプ
ロティンＣに適用する。 調整組織培養培地に含有されるプロティンＣを、予め精
製することなく、直接活性化することもできる。 活性化は、ウシトロンビンと複合したウサギトロンボモ
ジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌ　ｉｎ）を利用し
、この複合体をアガロースビーズ上に固定する。アガロ
ースビーズは沈殿性であり、従って容易に活性化混合物
から除去される。トロンボモジュリン−トロンビンは、
次に示す方法で容易にアガロースヒースに固定化できる
。ウサギトロンボモジュリンに対して高い結合親和力を
有するモノクローナル抗体を、６〜８炭素原子のアーム
を持った架橋アガロースビーズ〔たとえばアフィゲル”
１０２およびアフィゲル″ｌＭ２Ｏ２、バイオ・ラッド
（Ｂｉ。 Ｒａｄ）、リッチモンド、カリフォルニア〕に共有結合
させる。精製したネズミＩｇＧ　モノクローナル抗体は
、架橋アガロースのアームの化学構造に依存して、その
遊離のカルボキシまたは遊離のアミノ基を介して共有結
合することができる供有結合には通常のカルボジイミド
化合物を使用する〕。 たとえば、約０．１５０Ｄ単位のＩｇＧ　タンパクが、
このアガロースゲルマトリックスに共有結合することが
できる。次に、高純度のウサギトロンボモジュリン調製
物を、０．０２Ｍ１−リス−ＨＣｌ！（ｐＨ７．４）：
ｔｉ（、Ｊ：び０．１５ＭのＮａＣｊ７の緩衝液で０．
１５０Ｄ単位／　ｗｅまで希釈する。次いで、結合した
モノクローナル抗−トロンボモジュリン抗体でバックさ
れたアガロースビーズ１容量を、トロンボモジュリン１
容量と混合し、混合物を緩やかに撹拌しながら一部イン
キユベートする。 次いでこのビーズを遠心し、結合したトロンボモジュリ
ン量を、精製したタンパクのＥ１％（吸光係数）を８．
８、Ｍｒ（分子量）を７５　ｋｄと仮定して、上澄液の
Ａ２８ｏの測定により算出する。 見かけ上均質になるまで精製したウシトロンビン（比活
性二２．０００　ＮＩＨＬＩ／ｎ１ｇ）ヲ固定化シタト
ロンボモジュリンに対して等モルの計算値量よりわずか
に過剰量加える。次いでこのビーズを３０分〜１晩、４
℃でインキュベートする。このインキュベーションノ後
、ビーズヲ０００２Ｍトリス−ＨＣ：Ｊ（ＰＨ１，４）
　および０．１５ＭのＮａＣｌ！緩衝液で６〜１０回洗
浄し、次いでビーズをこの緩衝液中、４℃で貯蔵す゛る
。 精製したプロティンＣ溶液またはプロティンＣ含有組織
培養培地１＃！Ｅを、パックされたビーズ５０μｌに加
え振艙器上、３７℃で３０分間インキュベートする。活
性化したセリンプロテアーゼへの酵素原の活性化は、通
常１η／＃！ｇのウシ血清アルブミン（放射線酵素検定
グレード、シグマ、セントルイス、ミＸ−ＩＪ　）を含
有する、種々の生理的ｐＨおよびイオン強度の緩衝液中
で容易に起こる。 この活性化反応はカルシウムを必要とし、このため、通
常、活性化混合物に、最終濃度が０．００５−０．０２
５ＭになるようにＣａ　Ｃ／２を加える。 インキュベーションの終了時に、遠心によってビーズを
除去し、見かけ上均質になるまで精製した、ヒト抗トロ
ンビン■を加えて残存する遊離のトロンビンすべてを失
活させる。精製した抗トロンビンＩＩＩ（ＩＯＤ単位／
１ｔｌ）２０μｌを、活性化混合物それぞれ５００μｌ
に加える。室温で１５分間インキュベートした後、合成
ペプチドパラニトロアニリド（ＰＮＡ）基質Ｈ−Ｄ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｉｐ　−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２３８、カビ
ービトラム（Ｋａｂｉ−Ｖｉｔｒｕｍ）、ストックホル
ム、スウェーデン〕、マたは活性化プロティンＣに感応
性の他のトリペプチドバラニトロアニリド基質を使用し
て、活性混合物について、活性化したプロティンＣの活
性を試験する。 この手法によって、翻訳後のγ−カルボキシ化修飾が起
こったかどうかとは関係なく、プロティンＣについて、
活性化したプロティンＣ活性の活性化および発現が可能
である。しかし、′″ｇｌａが少ない“プロティンＣの
活性化速度は、翻訳後の修飾を受けたプロティンの活性
化速度の約２０−である。もし、発現した産生物がｒ−
カルボキシグルタメート残基を含有しなければ、活性化
インキュベーションの期間は、この比較的低い活性化速
度を考慮して延長する。 別法では、見かけ上均質になるまで精製したウシ凝固因
子Ｘａを利用し、凝固因子Ｖａ（Ｘａが関与するプロト
ロンビンからトロンビンへの変換に必須であり、かつ活
性化プロティンＣ感応性の補助因子である〕の不活性化
速度を測定することからなる凝固検定法で活性化プロテ
ィンＣの活性を測定することができる。ＨｅｐＱ−２／
ｐＬ１３３形質転換体からの調整培地について前記の活
性化法を行ない、凝固検定によって証明したとき、該培
地は擬−形質転換したＨｅｐＧ−２細胞（〜１２５”ｇ
／ａｌｌ）に比べ〜２Ｘｆｌいしそれ以上の活性化プロ
ティンＣ（〜２５０ｎｇ／ａｔｅ）を有することがわか
った。 ＣＨＯ−Ｋｌ−１ｄｈｆｒ　　）／ｐＬ１４影質転換体
質転換体ら単離したプロティンＣを本実施例の方法に従
って活性化し、凝固およびアミトール性（ａｍｉｄｏｌ
ｙｔｉり検定で試験した。この検定は、プロティンＣが
活性であることを明らかにし、そして形質転換したＣＨ
Ｏ−Ｋｌ　宿主細胞が実質的なγ−カルボキシラーゼ活
性を有していることを示した。プロティンＣのようなビ
タミンに一依存性セリンプロテアーゼ（これに限定はさ
れない）を含む多数のポリペプチドが、少なくともその
生物学的活性の一部にγ−カルボキシル化を必要とし、
そしテタとえばＨｅｐＧ−２およびＨ４Ｉ　Ｉ　ＥＣ３
セ／ｌ／ライン等、少数のセルラインしかｒ−カルボキ
シラーゼ活性を有していないので、ＣＨＯ−Ｋｌ　宿主
細胞における実質的なｒ−カルボキシラーゼ活性の発現
は予期しないものであった。従って、本発明は、Ｃ：Ｈ
Ｏ−Ｋ　１　宿主細胞（そのｄｈｆｒ−誘導体を含む）
を使用して、ｒ−カルボキシル化したポリペプチド、特
にヒトプロティンＣのようなビタミンに一依存性セリン
プロテアーゼ、を産生ずるための方法をも含有するもの
である。 アミトール性または凝固検定のいずれを利用しようが、
通常、ヒト血漿由来の高純度活性化プロティンＣを標準
として使用して検量線を作製する。 固定化したトロンボモジュリン−トロンビン調製物は再
使用が可能である。完全に活性化した活性体は、０．０
２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）および０．１５Ｍの
ＮａＣ１！緩衝液でビーズを繰り返し洗浄すると簡単に
再生できる。 この技術は、大スケールで大量のプロティンＣを活性化
するのに適している。大量に活性化しようとするときに
は、活性化しようとするプロティンＣの量に適した大き
さのカラムにビーズを詰め、プロティンＣ溶液を低流出
速度（たとえば６〜］Ｏａｔ／ｈ）でカラムに通す。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＨｃ　７の制限サイトおよび機能
地図、第２図はプラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣＢの制限部
位および機能地図、第３図はプラスミドｐＬ１３３の制
限サイトおよび機能地図、第４図はプラスミドｐＬ１３
２　　の制限サイトおよび機能地図、第５図はプラスミ
ドｐＬ１４１の制限サイトおよび機能地図、第６図はプ
ラスミドｐＬ１４２の制限サイトおよび機能地図、第７
図はプラスミドｐＭｓ　Ｖ−ＨＰＣの制限サイトおよび
機能地図、第８図はプラスミドｐＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰ
Ｃの制限サイトおよび機能地図、第９図はプラスミドｐ
Ｌ１５１の制限サイトおよび機能地図、第１０図はプラ
スミドｐＣＺ１０１の制限サイトおよび機能地図、第１
１図はプラスミドｐｃＺＩＱの制限サイトおよび機能地
図、第１２図はｐＣＺ４５９の制限サイトおよび機能地
図を示すそれぞれ模式図である。 ＦＩＧ、２ ５Ｑｌｌ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ。７ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ。１２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトプロテインＣ活性を有するポリペプチドをコー
   ドしている二本鎖デオキシリボ核酸であつて、その暗号
   鎖が式： 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
   、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わし、 には式： 【遺伝子配列があります】または 【遺伝子配列があります】 Ｒ＾１は式： 【遺伝子配列があります】または 【遺伝子配列があります】 で示される配列を有し、Ｍは０または１、Ｎは０または
   １を表わす。ただし、Ｍが０であるときにはＮも０であ
   り；Ｒが式： 【遺伝子配列があります】 で示される配列を有するときにはＲ＾１は式：【遺伝子
   配列があります】 で示合される配列を有し；さらに、Ｒが式：【遺伝子配
   列があります】 で示される配列を有するときには、Ｒ＾１は式：【遺伝
   子配列があります】 で示される配列を有する。） で示される二本鎖デオキシリボ核酸。 ２、第１項記載のＤＮＡを含有しているプラスミド。 ３、プラスミドｐＨＣ７、ｐＳＶ２−ＨＣＰ８、ｐＭＳ
   Ｖ−ＨＰＣ、ｐＬ１３３、ｐＬ１３２、ｐＬ１５１、ｐ
   Ｌ１４１、ｐＬ１４２、ｐＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣまた
   はｐＣＺ４６０である第２項記載のプラスミド。 ４、真核性宿主細胞内でヒトプロテインＣ活性を有する
   ポリペプチドを生産する方法であつて：Ａ、真核性宿主
   細胞を、組換えＤＮＡベクターであつて： ｉ）該宿主内における該ベクターの自律的な複製または
   染色体への組込みを司るＤＮＡ配列；ｉｉ）該宿主内で
   機能的なプロモーターおよび翻訳活性化配列；および、 ｉｉｉ）該プロモーターおよび翻訳活性化配列を伴なつ
   ている転写および翻訳解読相内に位置している第１項に
   記載のＤＮＡ化合物； を含有するベクター（ただし、Ｎが１の場合は、翻訳活
   性化配列は翻訳開始コドンをコードしていない）によつ
   て形質転換し：次いで、 Ｂ、工程Ａで形質転換された宿主細胞を遺伝子の発現に
   適した条件下において培養することを特徴とする方法。 ５、宿主細胞が、ＨｅｐＧ−２、ネツタイシマ蚊、ＣＶ
   −１、ＬＬＣ−ＭＫ＿２、３Ｔ３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨ
   Ｏ−Ｋ１（ｄｈｆｒ＾−）、アンセラエア・オイカリプ
   テイ、ＨｅＬａ、ＲＰＭＩ８２２６、Ｈ４ＩＩＥＣ３、
   Ｃ１２７ＩまたはＨＳ−スルタン細胞である第４項記載
   の方法。 ６、形質転換された宿主細胞が、プラスミドｐＬＩ３３
   、ｐＳＶ２−ＨＰＣ８またはｐＬ１４２で形質転換され
   たＨｅｐＧ−２、ネツタイシマ蚊、Ｃ１２７Ｉ、ＬＬＣ
   −ＭＫ＿２、３Ｔ３またはＨ４ＩＩＥＣ３細胞である第
   ５項記載の方法。 ７、組換えＤＮＡベクターが、さらに該真核性宿主細胞
   内で機能的な選択マーカーをも含有している第４項また
   は第５項記載の方法。 ８、形質転換された細胞が、プラスミドｐＬ１３２、ｐ
   Ｌ１５１、ｐＬ１４１、ｐＭＳＶ−ＨＰＣまたはｐＭＭ
   ＴΔＢＰＶ−ＨＰＣで形質転換された、ＨｅｐＧ−２、
   ネツタイシマ蚊、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ＿２、３Ｔ３
   、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１（ｄｈｆｒ＾−）、アン
   セラエア・オイカリプテイ、ＨｅＬａ、ＲＰＭＩ８２２
   ６、Ｈ４ＩＩＥＣ３、Ｃ１２７Ｉ、またはＨＳ−スルタ
   ン細胞である第７項記載の方法。 ９、プラスミドｐＳＶ２−ＨＣＰ８、ｐＭＳＶ−ＨＰＣ
   、ｐＬ１３３、ｐＬ１３２、ｐＬ１５１、ｐＬ１４１、
   ｐＬ１４２、またはｐＭＭＴΔＢＰＶ−ＨＰＣで形質転
   換されたＨｅｐＧ−２、ネツタイシマ蚊、ＣＶ−１、Ｌ
   ＬＣ−ＭＫ＿２、３Ｔ３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１
   （ｄｈｆｒ＾−）、アンセラエア・オイカレプテイ、Ｈ
   ｅＬａ、ＲＰＭＩ８２２６、Ｈ４ＩＩＥＣ３、Ｃ１２７
   Ｉ、またはＨＳ−スルタン細胞である真核性宿主細胞。 １０、原核性宿主細胞内でヒトプロテインＣ活性を有す
   るポリペプチドを生産する方法であつて：Ａ、原核性宿
   主細胞を、組換えＤＮＡベクターであつて： ｉ）該宿主内における該ベクターの自律的な複製または
   染色体への組込みを司るＤＮＡ配列；ｉｉ）該宿主内で
   機能的なプロモーターおよび翻訳活性化配列；および、 ｉｉｉ）該プロモーターおよび翻訳活性化配列を伴なつ
   ている転写および翻訳解読相内に位置している第１項記
   載のＤＮＡ化合物（ただし、Ｎは０であつてＭは０また
   は１である）；および ｉｖ）選択マーカー； を含有するベクターによつて形質転換し：次いで、Ｂ、
   該原核性宿主細胞を遺伝子の発現に適した条件下におい
   て培養することを特徴とする方法。 １１、原核性宿主細胞がバチルス、ストレプトマイセス
   、または大腸菌である第１０項記載の方法。 １２、宿主細胞が大腸菌Ｋ１２である第１１項記載の方
   法。 １３、宿主細胞が大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８、ＭＭ２９４
   、ＲＲ１またはＲＲ１ΔＭ１５である第１２項記載の方
   法。 １４、プラスミドｐＣＺ４６０で形質転換された大腸菌
   細胞。 １５、大腸菌Ｋ１２である第１４項記載の細胞。 １６、大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８、ＭＭ２９４、ＲＲ１ま
   たはＲＲＩΔＭ１５である第１５項記載の細胞。 １７、第４〜８項または第１０〜１３項のいずれかに記
   載の方法によつて生産されたヒトプロテインＣ活性を有
   するポリペプチドの治療有効量を担体と共に含有してい
   る組成物。 １８、非経口投与に適した第１７項記載の組成物。 １９、血管系の異常の予防また治療に用いるための、ヒ
   トプロテインＣ活性を有するポリペプチド。 ２０、プロテインＣ欠損に係る血管系の異常、深部静脈
   血栓症、肺動脈塞栓症、末梢動脈血栓症、伝染性血管内
   凝血、心臓または末梢動脈で生じた塞栓、急性心筋梗塞
   症、血栓性発作あるいは侵入性がんに伴なうフイブリン
   の析出の予防または治療に用いられる第１９項記載のポ
   リペプチド。