JPS60500895A - 有機体の同定および特徴づけ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有機体の同定および特徴づけ方法 本発明は、細菌、植物および動物のような前核細胞および真核細胞有機体を含む 有機体を迅速且つ正確に特徴づけおよび固定する方法に関するものである。

生きている有機体の分類は伝統的に、多かれ少かれ任意で、いくらか人Ａ的な線 に沿って行われてきた。

例えば生物の世界は二つの界に分けられている：植物（ｐｌａｎｔａｅ　）およ び動物（Ａｎｉｒｒｌａｌｉａ　）０この分類は一般に知られている有機体に対 しては都合がよいが、単細胞生物のよう々有機体（例えば、緑鞭毛虫類、細菌。

（藻類）に対しては困難となる。なぜならばこれらは基本的には「植物Ｊおよび 「動物」とは違うからである。

有機体をその細胞の内部構造によって単純に分けることが提案された。このやり 方では、すべての細胞生物は前核性（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　）か真核性（ｅ ｕｋａｒｙｏｔｉｃ）かのどちらかである。前核生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ 　）は真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｅａ　）はど複雑でなく、それらには、単位 膜組織による内部の仕切りがなく、明瞭な核を欠いている。前核細胞の遺伝情報 は２本鎖の環状ＤＮＡにのって細胞質に運ばれる。その他のＤＮＡは細胞中に存 在しない（ファージ、細菌性ウイールス、および自律的複製のできる環状ＤＮＡ プラスミツドが存在する場合は除く）。他方、真核生物には、多種多様の単位膜 組織があり、これは多くの機能成分を特殊化され孤立化された領域に分離する役 目をもっている。例えば、遺伝情報（ＤＮＡ）は明瞭に仕切られた核の中に見出 され、小器官である糸粒体（ミトコンドリア）および（光合成有機体で１ｌｔ） 葉緑体中にも見出される。

真核細胞のゲノムの複製、転写および翻訳は、細胞内の二又は三個所の別個の部 ０位、核細胞質部分、糸粒体および葉緑体でおこる。

しかしながら、前核生物と真核生物と、の差は、前核細胞で糸粒体および葉緑体 の比較を行う時、打砕かれる。これらの細胞小器官は今日ではフリーリビング（ ｆｒｅｅ　−ｌｉｖｉｎｇ　）前核生物に由来するものと考えられておｐｌその フリーリビング前核生物は原始的真核生物と、内共生（ｅｎｄｏｓｙｍｂｉ□ｔ ｉｃ　）関係に入り、究極的に宿主細胞の構造と密接に統合され、独立的存在が 不可能になったものである（参照例、　Ｆｏｘ　ｌ　ｃ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ。

［５ｃｉｅｎｃｅＪ　２０９；４５７−４６３（１９８０）り、４６２；５ｔａ ｎｉｅｒ、Ｒ，ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　ｌ”Ｔｈｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｗｏｒ ｌｄ　Ｊ第４版。

ｐｒｅｎｔｉｃｅ　−Ｈａｌ１社発行、１９７６、ｐ、８６　）ｏ例えばリポソ ームＲＮＡ遺伝子領域を担うマウ九胞糸粒体から得７ｔＤＮＡは大腸菌（Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ（Ｉｌｉ　）　リポソームＲＮＡとの顕著な配列相同性を 示すことが証明され、内共生モデルを強く支持している（　ＶａｎＥｔ　ｔｅａ 　ｒＲ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、［ｃｅｌｌ　Ｊ　２２：１５７−１７０（１９８０ ）　）。

また、とうもろこしく　Ｚｅａ　ｍａｙｇ　）葉緑体の２３８型リポソームＤＮ Ａのヌクレオチド配列Ｖｉ、大腸菌の２３Ｓ型リボンームＤＮＡと７１％の相同 性を有することも示されている（　Ｅｄｗａｒｄａ＋　Ｋ、　＆　Ｋｏｓｓｅｌ 、　Ｈ，ＪＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈＪ　９：２８５３−２８ ６９（１９８１）；その他の関連研究も（Ｂｏｎｅｎ　＊　Ｌ、　＆　Ｇｒａｙ 　ｒ　Ｍ−ＮＮ−ａ同上８：３１９−３３５（１９８０））。更にその一般概念 を支持している。

このモデルでは真核細胞は、性質からみると明らかメラ」である。「前核性−真 核性」二分法もまた広い分類の方法としてすら欠点がある。

有機体の分類が科学的課題以上のものとなるのは、交雑および育種（ｂｒｅｅｄ ｉｎｇ　）の目的で植物か動物を同定しようとする場合、およびいわゆる「より 高等な」有機体又はその他の媒体に感染するかも知れない微生物を、正確且つ信 頼をもって同定しようとする場合である。例えば植物栽培者、家畜飼育者又は魚 飼育者は異種および異型株を同定する迅速且つ信頼できる方法を得たいと思うだ ろう。獣医、医師又は園芸家は、試験植物、および動物組織中の感染性有機体（ 寄生虫。

菌類、細菌等）およびウイールスを正確に同定したいと思うだろう。これら有機 体およびクイールスの覆の正しい同定は特に重要なことである。

この問題は、細菌の同定について説明すると最も良くわかる。細菌種の名前は、 多くの菌株をあられすのが普通で１凱−菌株は一個の細胞から派生する集団と考 えられる。細菌種は、種の菌株の典型例における属性の等質性と多様性の程度を 述べることにより、一般に定義される。細菌種の、正確な定義を表現することは 、種の境を設けるために、棟内の菌株の多様さに対し境界を定めることが必要で あるため難かしい（Ｂ−ｕｃｈａｎａｎ＋　Ｒ，Ｂ、＋　［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔ　−ｅｒ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　Ｊ　＋　１５　：　２ ５−３２（１９６５）　）ｏ　種の定義を未知の細菌菌株の同定に実際に応用す るには表現型の属性を検出するための基質および条件のような適切なブロー１ブ の選択、および同種からの放射性物質で標識化されたＤＮＡが必要である。細菌 種の多様性の故に、スクリーニング法は菌株の同定のための古典的、進歩的方法 において使用される最初の道具である。スクリーニング法の結果はどこの研究室 の方法及び試薬が菌株の定義的な同定に適切であるかを予想するのに用いられる 。同定は結局、未同定菌株と特徴づけられた種の間の一定の表現型と遺伝子型の 類似点に基づいている。挑戦していることは、棟の境界を厳密に定めることであ り、好ましくは、種に特異的な情報を与える標準グローブを使ってこれを行うこ とである。そうすることにより種の定義づけが未知の菌株の同定に直接、且つ等 しく適用できる。

５ バージ−のマニュアル・オプ・デターミネテイプ・バクテリオロジ−（Ｂｕｃｈ ａｎａｒ＋＋　Ｒ，Ｅ、　ａｎｄ　Ｇｉｂｂｏｎｓ＋　Ｎ、Ｅ編集、　１９７４ ．第８版ｒ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆：Ｗｉｌｋｉｎｓ社、バルチモア）は最も理 解し易い細菌分類法、特に命名法、基本型菌株、関連文献等について示しである 。しかしながら、これは種の同定の出発点に過ぎないものである。なぜならば、 特にこれは時代遅れであり、スペース的に限られるため種についての記述が簡単 すぎるたＷ）で；ｌるｏＣ参照例；プレンデ−Ｄ、Ｊ　（Ｂｒｅｎｎｅｒ　Ｄ、 Ｊ　）［Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　 Ｊ第３版、米国微生物学会、ワシントンＤ、Ｃ，，１９８０，１−６頁）。

細菌に用いたｉ合「種」という語は、成る他と区別できる特徴をもった、有機物 の人なった種類として、又、本質的な有機体組織の特徴において、一般に相互に 近い類似性をもった有機体の一群と定義されてきた。

これらの定義の問題点は、それらが主観的であるということである（　Ｂｒｅｎ ｎｅｒ　ｒ同上、ｐ、２）ｏ又、種は単に宿主の範囲、病原性、成る糖の発酵の 際にガスを生産するかしないか、糖発酵が速いか遅いかのような基準に基づいて 定義されたことも’Ｉ＝ツた。

１９６０年代には数的細菌分類法（コンピューター分類法又は遺伝的表現型分類 法とも呼ばれる）が広く用いられるようになった０数的分類法は、有機体の遺伝 能力（ｐｏｔｅｎｔｉａ！　）をできるだけ多く試験することに基づいている。

多数の特性に基づいて分類することにより、一定程度の相似性をもった菌株のグ ループを形成することができ、これらを種と考えることができる。

しかしながら、成る一つの種を特徴づけるのに有効なテストが次の種のために役 立つとは限らないので種のこの定義法は未知の菌株の同定に直接的且つ実際的に 適用できない。たとえこれが種に特異的であると思われる属性を選ぶことによっ て、これらの属性が未知の菌株の確認のために用いられ、部分的に克服できると しても、この種の定義法は間接的に応用されているに過ぎない（Ｂｒｅｎｎｅｒ 　＋同上、９．２−６参照）。その上一般的方法は、これを種を定めるだめの唯 一の根拠として用いた場合、いくつかの問題をかかえており、それらの中には用 いるべき試験の絵および性質、その試験をどの程度評価すべきか関連性を反映さ せるためにはどのようにして、どの位の程度の類似性を選ぶべきか、同じ類似性 の基準がすべての群に適用できるかどうか等がある。ヒユーＲ，Ｈ（Ｈｕｇｈ　 、　Ｒ，Ｈ）およびギリアージＧ、Ｌ　（Ｇ１１ｉａｒｄｉ　、　Ｇ、Ｌ）著「 Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏＣ１１ｎｉｃａ１第２版、米 国微生物協会、ワシントン。

Ｄ、Ｃ，、１９７４、ｐ、２５０−２６９　、には、ゲノムのフラクションを利 用して細菌の種を定める手段としての最少の表現型の特質が列挙しである。一つ の種の中から多数のそしてランダムに選ばれた菌株試料を研究することによって 、最も高度に保存されているか又は非常に多くの菌株に共通でおる属性を選びだ し、種を定義することかできる。最少特性を使用するようになったととは進歩で アシ、菌株を仮に同定するためのスクリーニング法から始め、適当な追加の培地 が選択できるようにする。次いでその菌株が最少の特性の＃ミとんどを有するこ とを予想しながら当該種に保存されている既知の属性を調べる。最少特性の中の いくつかは当該種のすべての菌株にあられれるわけではない。これに関連した考 え方としては、その属の種のタイプ、ネオタイプ又は確認済みの対照菌株の比較 研究がある。各研究室によって培地および方法が異なるから、この照合は必要で あり、菌株こそ種の標準（５ｔａｎｄａｒｄ　）であって方法ではないのであ° る〇 細菌分類への分子レベルでのアプローチは二つのゲノムをＤＮＡ−ＤＮＡ再対合 （ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　）によって比較することである。種の遺伝的定 義には種の菌株が７０チ以上関連しているという仮定が含まれる。ＤＮＡ−ＤＮ Ａ再対合で菌株が同定できるのは、放射性標識ＤＮＡグローブと未知のＤＮＡが 同じ種のものである場合のみである。しかしこの７（１種一定義の実際的適用は 、適切なプローブを選択しなければならないことによって制限される。これは、 再対合群と相互関係かあシそうにみえる表現型属性を選択することによシ一部は 克服されるかもしれないが、これらが単独で用いられた場合、ＤＮＡ−ＤＮＡ再 対合による種の定義はやはり間接的に適用されるにとどまる。

ブレンナー、前出、第３負は、細菌の種を確認する理想的手段は、遺伝子を分離 し、直ちに当該菌株中の核酸配列をあらゆる既知の種の何か（ｓｐｅｃｉｅｓ− ｓｏｍｅ　−ｔｈｉｎｇ　）の標準パターンと比較する、質量分光光変法分析に 似ている「ブラックボックス」であると述べている。

しかしながらプレンナーは分離された遺伝子の一般的配列を決めるための制限エ ンドヌクレアーゼ分析をすることはできるけれども、「我々は適切なブラックボ ックス、特に臨床研究室で使用するために適したブラックボックスは手に入りそ うもない０」と認めている。彼の言葉は有機体のあらゆる種に等しくあてはめら れる。

先行技術のこの短かい再検討から、未知の細菌およびその他の有機体を同定し、 それを速かに分類し、特に病原性有機体又は利用できる生化学反応をおこす有機 体を同定するための迅速、正確且つ信頼できる方法が今必要であるとの結論に達 する。その方法は臨床研究室で普遍的に、そして容易に利用できるものでなけれ ばならないし、行った試験の数や、臨床医の主観的偏見に依存してはならず、又 、過去の、偶発的又は必然的試行錯誤法（Ｔｒｉａｌ　ａｎｄ　ｅｒｒｏｒ　ｍ ｅｔｈｏｄ）に依存してもいけない。更に、いかなる生きている有機体の属およ び種の同定および区別にも役立ち、獣医、植物栽培者、毒物学者、動物飼育者、 昆虫学者によって、又９ そのような同定が必要な他の関連領域において容易に且つ信頼性をもって使える 方法であることも必要である。

従って本発明の目的は有機体、これに限定するものではないが特に微生物を、客 観的に同定する迅速、正確且つ信頼できる方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は細菌のような有機体を、有機体のゲノムを利用して同 定する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、動物又は植物の病気の原因を特徴づけ同定すること ができるように臨床研究室において病原性有機体の種および属を特徴づけ、同定 する方法を提供することである。

本発明の今一つの目的は、以上に述べた分類法に有用な種々の生産物を提供する ことである。

本発明のこれらおよびその他の目的は、以下においてより容易に判明するように 、次の方法を提供することにより達せられた。すなわち、未知の有機体の種、を 特徴づける方法にして、（当該未知有機体から得られる、既知グローブ有機体か らの、又はその有機体に由来するリポソームＲＮＡ情報−含有核酸と）１イブリ ツド形成又は再対合した制限エンドヌクレアーゼ−消化ＤＮＡのクロマトグラフ −パターンを決定することによる方法でなく）未知有機体の遺伝子材料中の制限 エンドヌクレアーゼ切断部位の既知の位置と対応して該未知有機体の遺伝子材料 の進化的な保存配列の一部又は全部の位置を決定し、それによシ該未知有機体の 同定のだめの遺伝子的特徴づけを得、そして当該保存配列由来の同定のための遺 伝子特徴づけの少なくとも２つの組殉（既知の有機体を定義している該対の各々 ）からの情報と当該特徴づけとを比較することよりなる方法である。

本発明の又別の目的は次の方法を提供することにより達せられた。

成るサンプル中の病原性の有機体感染を診断する方法で、当該サンプル中の有機 体を上述の方法により同定することからなる方法。

本発明のよシよい理解のために、また本発明がいかに効果を表わすものであるか を示すために、図面と共に参考例を示す。

第１図はシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄ−ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒ ｕｇｉｎｏｓａ　）の菌株から分離したＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア ーゼ消化を示す。グローブとして大腸菌の１６８型および２３８型リポソームＲ ，ＮＡ（ｒ　ＲＮＡ）に対するｃ　ＤＮＡを用いた。

第２図ｕシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐ、ａｅｒ−ｕｇｉｎｏｓａ　）菌 株から分離したＤＮＡのＰｓｔ　（制限エンドヌクレアーゼ消化を示す０プロー ブとして大腸菌の１６８型および２３８型ｒ　ＲＮＡに対するｃ　ＤＮＡを用い た０ 第３図はグルコース−非発酵性　グラム−陰性桿菌１ 種から分離したＤＮＡのＥｃｏＲｌ制限エンドヌクレアーゼ消化を示す。グロー ブとして大腸菌の１６８型および２３８　製ｒ　ＲＮＡに対するｃ　ＤＮＡを用 いた。

第４図はグルコース−非発酵性　グラム−陰性桿菌種から分離したＤＮＡのＰｓ ｔｌ制限エンドヌクレアーゼ消化を示す。グローブとして大腸菌の１６８型およ び２３８型ｒ　ＲＮＡに対するｃ　ＤＮＡを用いた。

第５図は種々のバシルス・スプチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌 株から分離したＤＮＡのＥｃｏＲｌ制限エンドヌクレアーゼ消化を示す０プロー ブとして大腸菌の１６８型および２３８型ｒ　ＲＮＡに対するｃ　ＤＮＡを用い た。

第６図は第５図と同じ菌株に対して、同じプローブを用いて得られたＰｓｔｉデ ータを示す。

第７図は第５図および第６図と同じ菌株に対して同じプローブを用いて得られｆ ｃＢｇｌＮデータを示す。

第８図は第５−７図と同じ菌株に対して、同じプローブを用いて得られたＳａｃ 　（データを示す。

第９図はＢ、スプテリスおよびＢ、ポリミカ（Ｂ、ｐｏｌｙ−ｍｙｘａ　）から 分離したＤＮＡのＥＣＯＲｌ制限エンドヌクレアーゼ消化を示すＱグローブとし て大腸菌からの１６８型および２３８型ｒ　ＲＮＡに対するｃ　ＤＮＡを用いた ０ 第１０図は第９図と同じ閑株に対して、同じプローブを用いて得られたＰｓｔ　 ｌデータを示す。

第１１図は第９図および第１０図と同じ菌株に対して同じプローブを用いて得ら れたＢｇｌ　［およびＳａｃ　１データを示す。

第１２図はグローブとして大腸菌からの１．６８型および２３８型ｒ　ＲＮＡに 対するｃ　ＤＮＡを用い、感染マウス組織から、ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ中のスト レプトコッカス・ニューモニエ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ）の検出を示す０ 第１３図はムス・ムスキュラス・ドメステイカス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　 ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ　）　（マウス）の細胞質リポソームからの１８８型およ び２８８型ｒ　ＲＪ”ＪＡに対するｃＤＮＡを用い、哺乳類の組織から分離した ＤＮＡのＰｓｔ　■消化を比較することによるマウス種の同定を示すＯ 第１４図はムス・ムスキュラス・ドメステイカス２８８型ｒ　ＲＮＡ、　ｃ　Ｄ ＮＡ　グローブとハイブリツドを形成したマウスおよび猫組織からのＢｃｏ’Ｂ ｂＩ消化ＤＮＡを示す０ 第１５図はムス・ムスキュラス・ドメステイカス１８８型および２８８型ｒ　Ｒ ＮＡ　、　ｃ　ＤＮＡグローブとノーイブリッド形成した哺乳類組織からのＳａ ｃ　Ｉ消化ＤＮＡを示す。

第１６図はムス・ムスキュラス・ドメステイカス１８８型および２８８型ｒ　Ｒ ＮＡ　、　ｃ　ＤＮＡプローブとハイブリツド形成した哺乳類組織および細胞培 養からのＥｃｏＲｉ消化ＤＮＡを示す。

本発明は、もし種が共通の種属形成事象に関連づけられる個々に分離した菌株の 集合体であるならば、分散化にもかかわらず、客観的に種の境界を定める、菌株 が共有する類似性があるはずであり、種の菌株はそれらの共通の根源を探る手が かシとなる構造情報をもっているはずであるという発明者の認識に基づいている 。有機体の過去の歴史は最も多くセマンタイド（６ｅ−ｍａｎｔｉｄｅｓ）、Ｄ 　Ｎ　ＡおよびＲＮＡ０中に残っている（　Ｚｕｃｋｅｒｋａｎｄｌｅ　ｍ　Ｅ 　、およびＰａｕｌｉｎｇ＋　Ｌｒ　「Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｔｈｅｏｒｅｔｉ ｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｊ第８巻：３５７−３６６（１９６５）。

ヨーロッパ特許出願（］１３Ｐ−Ａ−）慝００７６１２３　（参考文献としてこ こに加えた）の中で、発明者は、リポソームＲＮＡ　（ｒ　ＲＮＡ　）に含まれ ている情報を利用する有機体の種の定義と特徴づけについてのシステムを記載し た。リポソームＲＮＡは蛋白合成に構造的並びに機能的役割を有しく　５ｃｈａ ｕｐｙ　ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａ１１３ｉｏ１ｏｇｙＪ 第７０巻：　２１５−２２４（１９７８））、そしてｒ　ＲＮＡ　−ＤＮＡハイ ブリッド化の研究から得られた一般的結論は、リポソームＲＮＡ遺伝子の基本的 配列は他の大多数の遺伝子に比べて進化の過程で変化を受けに＜＜、よシ保存さ れるらしいということである（Ｍｏ−ｏｒｅ　ｖ　Ｒ，Ｌ、著ｔ　［ｃｕｒｒｅ ｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｂ ｉｏｌｏｇｙ　Ｊ　、　６４巻、　１０５−１２８（１９７４）。

ａｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ社、ニューヨーク）０例えば、多数の細菌種から得 られる１６８型ｒ　ＲＮＡの一次構造は、オリゴヌクレオチット分析から推定さ れた（Ｆｏｘ＋Ｇ、Ｂ。

ｅｔ　ａｌ著＊　「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙ ｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＪ　？第２７巻：　４４−５７（１ ９７７）　）ｏ大腸菌の数菌株の１６８ｆｉオリゴマーカタログには無視できる 程の差がある（Ｕｃｈｉｄａ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ著；　［Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　Ｊ　、　３巻：　６３−７７（１９ ７４））が、種間の実質的な差は細菌系統学的分類表作成のために用いることが できる（　Ｆａｘ、　Ｇ、Ｂ、　［５ｃｉｅｎｃｅ　Ｊ　２０９巻二４Ｓ７−４ ６３（１９８０））ｏ　成る一細菌種の異なる菌株は、かならずしも同一ではな く、制限酵素地図は、異なるＥｃｏＲＩサイトが大腸菌の二菌株のｒ　ＲＮＡ遺 伝子中に生ずることを示している（Ｂｏｒｏｓ＋　１．Ａ、ｅｔ　ａｌ著ｔ　「 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ第６巻：１８１７−１８３ ０（１９７９））。細菌は保存ｒ　ＲＮＡ遺伝子配列を共有しているようにみえ 、そしてその他の配列は変化し得る（Ｆｏｘｓ　１９７７　ｖ同上）。

かくして本発明者は、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物は、成る種の有機 体（例えば細菌）の菌株では相似するが、他の種の有機体の菌株では異なる保存 配列を含む断片の組み合わせをもっていること、即ち菌株の変異にもかかわらず 、高い発生頻度をもち、最小遺伝子型特質をもつ制限断片の、酵素の特異的組み 合わせが種を決定することを見出した。これが、５ 本発明はＥＰ−Ａ−００７６１２３にて開発された概念を拡張するものでアシ１ ．さらにｒ　ＲＮＡの配列に加えて、進化を通じて高度に保存された配列が存在 することが発見されたのでアシ、それは、同定システムとしてはｒ　ＲＮＡ配列 と同じく有用であろう。いいかえれば、本発明はｒ　ＲＮＡではなく、保存され たプローブを使うことによって、ＥＰ−Ａ−００７６１２３の同定と特徴づけ技 術を実行する方法を提供することにある。

本発明はまた、同定プロセスで使用されるであろう方法の追加実施例をも提供す る。本発明者はこの方法が、分類学（古典的）において同一であるか異なってい るかを問わす前核細胞性、真核細胞性を問わず同定しようとする有機体以外の有 機体からの保存された核酸プローブを用い、前核および真核ＤＮＡ両方に適用で きるという点で一般的であることをも見出した。

本発明は、制限エンドヌクレアーゼ部位のような既知の位置に対応するＤＮＡあ るいは他の遺伝子材料の保存配列に基づいて有機体を定義する客観的方法を提供 する。保存配列を含む制限断片の検出は、ＤＮＡ切片をプローブ有機体からの保 存配列情報を含む核酸とハイブリッド化又は再対合させることによって行われる 。

本発明の工程によって特徴づけられる「有機体」（この言葉は「同定する」を含 むと解釈される〕という語によって、定義によりそのゲノム中にＤＮＡまたは） ＬＮＡを含む事実上すべての有機体を意味する。この点に関して参考のために伝 統的分類表にふれておくことが有用である。

モネラ（Ｍｏｎｅ　ｒａ　）界、植物（Ｐｌａｎｔａｅ）および動物（Ａｎｉｍ ａｌｉａ　）に属するすべての有機体が含まれる。例えばモネｔ　（ｍｏｎｅｒ ａ　）界には、ミコバクテリウム（ｍ−ｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ）　＊スピロヘ ータ（５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ　）　ｔ　ニーバクテリア（ｅｕｂａｃｔｅｒｉ ａ　）　ｙリクツチャー（ｒｉｃｋｅｔｔ−ｓｉａｅ）綱の分裂品（細菌）およ び藍藻類：サイアノツイータ（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｈａ　）　を挙げることがで きる。植物界には、ユーグレノイド類（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｔａ　）　ｖ緑藻類 ：クロロフイー：！（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ　）　ｒクロロフィーエ（Ｃ−ｈ ｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ　）およびカロフィセエ（Ｃｈａｒｏｐｂｙｓｅａｅ　 ）綱、クリンファータ（ｃｈｒｙｓｏｐｈｔａ　）類キサントフイセロフイータ （ｐｙｒｒｏｐｈｙｔａ　）類デイノフラゲラータ（Ｄｉ−ｎｏｆｌａｇｅｌｌ ａｔｅｓ　）　＊褐藻類：ファオフイータ（ｐｈａｅｏｐｈ−ｙｔａ）；紅藻類 ：ロドフイータ（Ｒｈｏｄｏｐｈｔａ　）　：枯菌類：ミコマイコフイータ（Ｍ ｙｘｏｍｙｃｏｐｈｙｔａ　）　、ミコマイセタ（ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ　） 　ｖアクラシエ（ａｃｒａｓｉａｅｓ　）　＋　プシズモデイオホレエ（ｐｌａ ｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｅａｅ　）　、ラブリンタリエ（Ｉａｂｙｒｉｎｔｈｕｌ ｅａｅ　）綱；ニーマイ’：１７　（−タ：真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｐｈｙｔａ　 ）　＋フィコミセタ（ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ　）　Ｔアズコミセタ（ａｓｃ ｏｍｙｃｅｔｅｓ　）　ｙバシドミセタ（ｂａｓｉ−ｄｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱； 鮮苔類、ヘバティエ（ｈｅｐａｔｉｃａｅ　）　＋アントセロテ（ａｎｔｈｏｃ ｅｒｏｔａｅ　）　ｔムスク（ｍｕｓｃｉ　）綱；維管束植物トンケオフイータ （Ｔｒａｃｈｅｏｐｈｙｔａ　）　ｙプシイロシダ（ｐｓｉｌｏｐｓｉｄａ　） 　ｙリコサイダ（１ｙｃｏｐｓｙｄａ　）　＋スヘノプシダ（５ｐｈｅｎｏｐｓ ｉｄａ　）　＋ブチロブシダ（ｐｔｅｒ−ｏｐｓｉｄａ）　ｔスベルモブシダ（ ｓｐｅｒｍｏｐｓｉｄａ　）　豆類タサイカデ（、ｃｙｃａｄａｅ　）　Ｆジン クゴエ（ｇｉｎｋｇｏａｅ　）　＋　コニヘレ（ｃｏｎｉ　ｆｅｒａｅ　）　＋ グネテ（ｇｎｅｔｅａｅ　）およびアンギロスベルマエ（ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ ａｅ　）綱、デコチレドネエ（ｄ−ｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ　）　ｒモノコ チロエドネ（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｏｅｄ　−ｏｎｅａｅ　）亜綱が記載される。

動物界には、原生動物豆稈、原生動物門プロトシア（ｐｒｏｔｏｚｏａ　）、　 ＋プラスモトｏ　マ（ｐｌ　ａｓｍｏｄｒｏｍａ　）豆量、フラゲラータ（ｆｌ ａｇｅｌｌ−ａｔａ）ｔサルコデナ（ａａｒｃｏｄｉｎａ　）およびスポロシア （５ｐｏｒｏｚｏａ　）綱；シリオフォーン（ｃｉ目ｏｐｈｏｒａ　）豆量、５ シリアタ（ｃｉｌｉａｔａ　）綱：側生動物豆稈、ポリへ２（海綿動物門ｐｏｒ ｉｆｅｒａ　）　、カルカレ（ｃａｌｃａｒｅａ　）綱うヘキサチネーリダ（ｈ ｅｘａｃｔｉｎｅｌ　Ｉ　ｉｄａ　）綱およびデスモスボギエ（ｄｅｓｒｎｏｓ ｐｏｎｇｉａｅ　）綱；中生動物豆稈、中生動物門；後生動物亜界うディアタ（ 几ａｄｉａｔａ、）部門。

コレンテラタ（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｔａ　）門、ヒドロシア（ｂｙ−ｄｒｏｚ ｏａ　）　ｔシ７オゾア（−ｇｃｙｐｈｏｚｏａ　）　ｔウドシア（ａｕ−ｔｈ ｏｚｏａ　）綱、ステノフオラ（ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ　）門、テンタクラータ （ｔｅｎｔａｃｕｌａｔａ　）およびヌダ（ｎｕｄａ）綱；プロトス）　ミ（ｐ ｒｏｔｏｓｔｍｉａ　）部門扁形動物門プラチェルミンタ（ｐｌａｔｙｈｅｌｍ ｉｎｔｅｓ　）　ｔラベル２す（ｔｕｂｅｌ　１ａｎａ　）　＋トレマトーダ（ ｔｒｅｍａｔｏｄａ　）およびセストダ（ｃｅｓｔｏ−ｄａ）綱；ネメルチナ（ ｎｅｍｅｒｔｉｎａ　）門、アカントセファラ（ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ 　）門：アシエルミンタ（ａｓｃｈｅ−１ｍｉｎｔｌｅｓ　）　門、ロチヘラ（ ｒｏｔｉｆｅｒａ）　＋　ガストロトリ力（ｇａｓｔｒｏｔｒｉｃｈａ　）　ｒ 　キノリンカ（ｋｉｎｏｒｈｙｎｃｈａ　）　ｒプリアプリダ（ｐｒｉａｐｕｌ 　ｉｄａ　）　＋ネマトーダ（ｏｅｍａｔｏ−ｄａ）およびネマトモルファ（ｎ ｅｍａｔｏｍｏｒｐｈａ　）属；エントブロクタ（ｅｎｔｏｐｒｏｃｔａ　）門 ：エクトプロクク（ｅｃｔ　−ｏｐｒｏｃｔａ　）門、ギムル−マタ（ｇｙｍｎ ｏｌａｅｍａｔａ　）およびフイラクトレマータ（ｐｈｙ’ｌａｃｔｏｌａｅｍ ａｔａ　）綱；フオロニダ（ｐｈｏｒｏｎｉｄａ　）　門；プラチオボダ（ｂｒ ａＣ’１ｏｐｏ　−ｄａ）門、イナルチクラタ（１ｎａｒｔｉｃｕｌａｔａ　） およびアルチクラータ（ａｒｔｉｃｕｌａｔａ）綱；モルスカ軟体動物（ｍ−ｏ ｌｌｕｓｃａ　）門ｔアムフイニューラ（ａｍｐｈｉｎｅｕｒａ）　ｒモノプラ コフオラ（ｍｏｎｏｐｌａｃｏｐｈｏｒａ　）　＋ガストロボーダ（ｇａｓｔｒ ｏｐｏｄａ　）　＋スカ７オポーダ（５ｃａｐｈｏｐｏｄａ　）　＋ベレサイポ ーダ（ｐｅｌｅｃｙｐｏｄａ　）づよびセファロボーダ（ｃｅｐｈａｌｏｐｏｄ ａ　）綱：ンプンクリダ（５ｉｐｕｎｃｕｌ　ｉｄａ　）門；エチウリーダ（ｅ ｃｈｉｕｒｉｄａ　）　門、アネリダ（ａｎｎ　−ｅｌｉｄａ）門、ポリケータ （ｐｏｌｙｃｈａｅｔａ　）　、オリゴケータ（ｏｌｉｇｏｃｈａｅｔａ　）　 およびヒルデイネア（ｈｉｒｕｄｉｎｅａ　）綱；オニコ７オラ（ｏｎｙｃｈｏ ｐｈｏｒａ　）　門；タルディグラダ（ｔａｒｄｉｇｒａｄａ　）門；ペンタ− ストイミダ（ｐｅｎｔａｓ−ｔｏｉｍｉｄａ）門；アルソロポーダ（ａｒｔｈｒ ｏｐｏｄａ　）門；トリロビータ（ｔｒｙｌｏｂｉｔａ　）　門、ケリセラータ （ｃｈｅｌｉ−ｃｅｒａｔａ　）豆量、キ７オスラ（ｘｉｐｈｏｓｕｒａ　）　 ｔアラキミダ（ａｒａｃｈｍｉｄａ　）　＊　ピクノゴミダ（ｐｙｃｎｏｇｏｍ ｉｄａ　）綱１マンデプ２り（ｍａｎｄｉｂｕｌａｔａ　）豆量、クルスタエ（ Ｃ「−ｕｓｔａｃｅａ　）　ｙ　チロボダ（ｃｈｉｌｏｐｏｄａ　）　ｖデイブ ロポーダ（ｄｉｐｌｏｐｏｄａ　）　ｒボロボーダ（ｐａｕｒｏｐｏｄａ　）　 ｔシンフイラ（ｓｙｍｐｈｙｌａ　）綱、コレンボラ（ｃｏｌ　ｌｅｍｂｏｌ　 ａ　）　＋プロチュラ（ｐｒｏｔｕｒａ　）　ｐデイプルラ（ｄｉｐｌｕｒａ　 ）　＋チサヌ之（ｔｈｙｓａｎｕｒａ　）　＃　エフエメリダ（ｅｐｈｅｍｅｒ 　ｉｄａ　）　＋　オドナタ（ｏｄｏｎａｔａ　）　ｖオルトブチ？　（ｏｒｔ ｈｏｐｔｅｒａ　）　＋デルマプテラ（ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ　）　＋エンビニ ア（ｅｍｂｉａｎｉａ　）　＋−プレコブテラ（ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ）　、ゾ ラプテラ（ｚｏ’ｒａｐｔ−ｅｒａ）ｔ　コロデンテイア（ｅｏｒｒｏｄｅｎｔ ｉａ　）　ｒマルロ７アガ（ｍａｌｌｏｐｈａｇａ　）　ｔアノプルラ（ａｎｏ ｐｌｕｒａ　）　＋チサスノブテラ（ｔｈｙｓａｓｎｏｐｔｅｒａ　）　ｔヘミ プテラ（ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）＋ノイロプテ９　（ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ　）　 ＋　コレオプテラ（ｃｏｌｅｏ−ｐｔｅｒａＬ　ヒメノプテラ（ｈｙｍｅｎｏｐ ｔｅｒａ　）　ｔメ０プテラ（ｍｅｃｏｐｔｅｒａ　）　＋　シホナプテラ（ｓ 　１ｐｈｏｎａｐｔｅｒａ　）　ｔデプテラ（ｄｉｐｔ’ｅｒａ　）　＋　）リ コゾテラ（ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ　）　およびレビドプテラ（１ｅｐｉｄｏｐ ｔｅｒａ　）　目の昆虫類；デンテロストミア（Ｄｅｎｔｅｒｏｓｔｏｍｉａ　 ）部門の動物νケトグナタ（ｃｈａｅｔｏｇｎａｔｈａ　）門、エチノデルマタ （ｅｃｈｉｎｏ−ｄｅｒｍａｔａ　）門、クリノイデア（ｃｒｉｎｏｉｄｅａ　 ）　＋アストロデア（ａｓｔｅｒｏｄｅａ　）　ｒオフイウロイデア（ｏｐｈｉ ｕｒｏｉｄｅａ）＋エチノイデア（ｅｃｈｉｎｏｉｄｅａ　）およびホロツロイ デア（ｈｏｌｏｔｕｒｏｉｄｅａ　）綱９ポゴノ７オラ（ｐｏｇｏｎｏｐｈｏｒ ａ　）門、ヘミコロデータ（ｈｅｍ　１ｃｈｏｒｄａｔａ　）門、エンテロツイ スタ（ｅｎｔｅｒｏｐｎｅｕｓｔａ　）　およびプテロブランキア（、ｐｔｅｒ ｏｂｒａｎｃｈｉａ　）　綱；コルデータ（ｃｈｏｒｄａｔａ　）門ｔウロコル データ（ｕｒｏｃｈｏｒｄａｔａ　）豆量、アシデアシエ（ａｓｃｉｄｉａｃｉ ａｅ　）　ｙタリアセエア（ｔｈａｌ　１ａｃｅａｅ　）　＋　ラルパセア（， １ａｒｖａｃｅａ　）綱；セファロコルデータ（ｃｅｐｈａ−１ｏｃｈｏｒｄａ ｔａ　）豆量、ベルテプラータ（ｖｅｒｔｅｂｒａｔａ　）豆量、アグナタ（ａ ｇｎａｔｈａ　）　＋コンドリキチェ（ｃｈｏｎｄｒｉ−１）目、アンフイビア （ａｍｐｈｉｂｉａ　）　＋レピチリア（ｒｅ−ｐｉｔｉｌｉａ）＊　アベス（ ａｗｅｓ　）およびマンマリア（ｍａｍ−ｍａｌｉａ）綱、プロトチリア（ｐｒ ｏｔｏｔｈｅｒｉａ　）亜綱、テリア（ｔｈｅｒｉａ　）亜綱、マルサビアリス （ｍａｒｓｕｐｉａｌ　ｉｓ　）　ｒインセフティボラ（１ｎｓｅｃｔｉｖｏｒ ａ）　ｒデルモプテラ（ｄｅ−ｒｍｏｐｔｅｒａ　）　、チロプテラ（ｃｈｉｒ ｏｐｔｅｒａ　）　ｐ　プリマチス（ｐｒｉｍａｔｅｓ　）　＊エデタタ（ｅｄ ｅｎｔａｔａ　）　＋　７オリドータ（ｐｈｏｌｉｄｏｔａ　）　＋２ゴモルフ ァ（ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ　）　＋　０デフテイア（ｒｏｄｅｎｔｉａ　）　、 セタセエ（ｃｅｔａｃｅａｅ　）　ｒ　カルニボフ（ｃａｒｎｉｖｏｒａ）ｒツ プリデンタータ（ｔｕｂｕｌｉｄｅｎｔａ　−ｔａ）、グロボシデア（ｐｒｏｂ ｏｓｉｃｄｅａ　）　、　？ニラコイデア（ｈｙｒａｃｏｉｄｅａ　）　＋　シ レニア（５ｉｒｅｎｉａ　）　、ベリンタ゛クチ２１ う（ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ　）およびアルチオダチラ（ａｒｔｉ−ｏｄ ａｃｔｙｌａ　）目を挙げることができる。目の下にはまだ科、族、属、種およ び亜種までアシ、亜種外の分類群、株又は個体があることが知られている。その 上、培養細胞（植物又は動物）も、ウイールスと同様同定することができる。こ れらの分類はこの出願において説明的目的のためにのみ用いられ、限定的に使用 されるものでない。同定する有機体は既知のものでも未知のものでもよいが最も 普通には未知のものである。

機能的には、本発明の目的のためにはすべての有機体を真核細胞群と前核細胞群 に分けるのが便利である。

前核有機体を同定する場合には、ＤＮＡは細胞の中、又は区画されていない染色 体中に存在するものである。

真核有機体を同定する場合には、核ＤＮＡ又は小器官内ＤＮＡ（糸粒体ＤＮＡ又 は葉緑体Ｉ）ＮＡ）を用いればよい。

簡単に言うと、保存配列（および、多分様レベル以下の分類又は亜種以下の小分 類（１ｎｆｒａｓｕｂｓｐｅｃｉｆｉｃｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ　）を作シ出す ために用いることができる配列）を分析するために、高分子量ＤＮＡおよび／又 は小環状ＤＮＡが有機体から分離され同定されるのである。ＤＮＡは当業者には 周知の方法により抽出される。

ＤＮＡは　１）保存配列の存在と位置及び　２）エンドヌクレアーゼ制限部位に 関する位置の両者を確か２ めるために分析されるのである。保存配列の存在を分析するための最も簡便な方 法は、保存ＤＮＡ配列でハイブリッド化できるポリヌクレオチドプローブを利用 することである。しかし、化学的配列測定や分析によシ得られるような直接的配 列情報も利用されるｏＥＰ−Ａ　００７６１２３において利用されたプローブは 、ｒＲＮＡ　情報含有プローブであったが、この場合には、保存配列を有する他 のいかなるプローブも使用可能である。類似の方法において、エンドヌクレアー ゼ制限部位の与えられた一組を見いだす最も簡便な方法は、適当な制限酵素でＤ ＮＡを切断することである（実際、これはＥＰ−Ａ−００７６１２３で教えられ 、実施された方法である）。しかし、既知の制限部位配列と連結された配列情報 あるいは、切断および部分的配列の如き他の方法も使用されうる。

最も一般的には、ＤＮＡは特殊な部位で制限エンドヌクレアーゼによって断片に 切断されるのである。その断片は、クロマトグラフシステムで大キさによって分 離されるｏ　ＢＰ’−Ａ　Ｏ０７６１２３では、ゲルクロマトグラフィーが有用 なりロマトグラフシステムの例として使用された。しかし、高圧液体クロマトグ ラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、あるいは他の分離技術のような他のシ ステムも使用可能である。ゲルクロマトグラフィーを使用する場合、断片を分離 し、当業者が周知の方法で、ゲルを染色し、大きさが既知の断片３ で作った標準曲線を用いて、断片の大きさについて標準化する。次いで分離した 断片をサウザーン（Ｓｏｕｔｈ−ｅｒｎ　）のスポット法（５ｏｕｔｈｅｒｎ＋ 　Ｅ、Ｍ、　［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｊ ｙ　３８：５０３−５１７（１９７５）、ここに参照として挿入されている）に よシ、亜硝酸セルローズ紙に移し、加熱によりそこに共有結合させる。保存配列 を含む断片はそれから、保存配列情報を含む核酸グローブとハイブリッド化する 能力によって位置が定められる。また、ハイブリッド化が消化後分離前に生ずる か、あるいは制限切断がハイブリツド化後に生じ、その後断片が分離されてもよ い。

核酸プローブは、非放射性物質で標識化されるか、又は、好ましくは放射性物質 で標識化される。放射性物質で標識化する場合、プローブは几ＮＡでもよいし、 逆転写によって合成されるか、例えば切シ込み翻訳（ｎ１ｃｋ　ｔｒａｎｓｌａ ｔｉｏｎ　）によって標識化され得るクローン断片上に含まれる、ＲＮＡに相補 的なりＮＡ（ｃＤＮＡ）でもよい。また、合成オリゴデオキシリボヌクレオチド は標識化ヌクレオチドから合成されてもよい。

よく定義されているグローブは、後で見るように任意に選ばれた有機体から得ら れるか、または一致した配列から得られてもよい。一度ノ・イブリッド化がおこ ったら、ノ・イブリッドを形成した断片は、二重鎖の核酸を選択的に検出するこ とにより検出するか（非放射性標識化プローブ）、又は例えばラジオオートグラ フ法によって目に見えるようにする（放射性標識化プローブ）。ハイブリッドを 形成した各断片の大きさは、制限部位に関係しており、既述の標準曲線を用いて 、移動距離から決められる。ハイブリッド化量、ハイブリッド化パターン、ハイ ブリッドを形成した断片の大きさは、制限部位に関係しており、個々に、又は組 み合わせて有機体を同定するのに使用される。

この技術からあられれる遺伝子特徴づけは、少なくとも二個、さも々ければ多数 の既知の標準有機体、属又は種から得られた同等の特徴づけと容易に比較できる 。予備的な広い分類が（例えば古典的分類法を用いて）既に行われた後で、視覚 による検査および適当なりロマトグラフパターンとの照合により、（ＥＰ−Ａ− ００７６１２３の如く）ハイブリッド化された制限断片の大きさの比較により、 バンド強度（ハイブリッド化量）により、又はこれらを組み合わせることによっ て比較をおこなうことができる。理想的にはポイントーオブーセール（ｐａｉｎ ｔ　−ｏｆ　−５ａｌｅ）　処理に用いられるような、−次元コンピューター− パターン認識装置によって比較するのがよい。

発明者は前記の方法を用いる時は、同じ種の有機体の遺伝子特徴づけは、非常に 似ており、わずかな差は、菌株の変化による亜種間の差にとどまるが、種間の差 および属間の差（そしてもっと高レベルの分類においても）は非常に大きい。

２５ 成る一つの種の株間において酵素−特異的断片の変異のあることを利用して、種 々の目的、例えば細菌の場合、疫学的目的のために株をタイプ分けすることがで きる。実際、制限酵素は棚内の株を区別することができるものを選ぶことができ る。

本研究に用いられる「プローブ有機体」（そしてそれから核酸プローブが得られ る）は、上に挙げた有機体のどれでもよく、真核有機体でも前核有機体でもよい 。唯一の制限は、保存配列−含有グローブが、未知の有機体のＤＮＡと最大にハ イブリッド化しなければならない、という事実によって与えられる。

保存配列情報−含有グローブに４種＠ある：１）前核プローブ（特に細菌から得 られた）、２）真核糸粒体プローブ、３）真核葉緑体プローブ、４）真核非−小 器官性プロープ。

ＤＮＡ（エンドヌクレアーゼで消化される）の出所も４種類ある：１）前核細胞 ＤＮＡ、２）　真核糸粒体ＤＮＡ、３）　真核葉緑体ＤＮＡ１４）真核細胞核Ｄ Ｎ０ 斯くして次の・・イブリッド比表が作られた（第１表）。

第　１　表 ハイブリッド比表 前核性　真　核　性 糸粒体葉緑体非−小器官 前核細胞　十　＋＋− （Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ） 真核葉緑体　＋　＋＋− 注Ｑ）　Ｅｕ、−真核細胞 表は、一般にどのプローブが未知の有機体のＤＮＡと最大にハイブリッド形成す ることができるかを示している。例えば、成る真核有機体を同定するためには、 種−特異的糸粒体又は葉緑体ＤＮＡを抽出し、それをエンドヌクレアーゼで消化 し、この消化物を前核プローブか又は小器官から抽出した真核グローブとノ・イ ブリッド化すればよい。同様にして、前核有機体を同定するためには、種−特異 的細胞ＤＮＡを抽出し、エン７ ドヌクレアーゼでこれを消化し、消化物を前核グローブ又は小器官から抽出した 真核プローブとハイブリッド化すればよい０又、種−特異的核ＤＮＡを抽出、消 化し、これを非−小器官性の真核プローブとハイブリッド化することによっても 、真核有機体を同定することができる。真核細胞は、核、糸粒体、又は若干の場 合では葉緑体系の中の一つ又は何らかの組み合わせによって定めることができた 。これらの交叉ハイブリッド化は、真核小器官由来の核酸が前核核酸からの進化 的な保存配列と広い相同性をもっているが、核−抽出真核ＤＮＡと、前核ＤＮＡ との間では当該相同性は一般にそのように広くは存在しないという事実に基づい ている。

消化すべきＤＮＡおよびこれに付随するプローブの対の選択は任意であり、同定 するべき有機体によるであろう。即ちそれは問われた問題によるだろう。例えば 、感染物質を検出し、同定する目的で、真核細胞（例えば動物又は植物）中ある いは一緒に存在する前核細胞の種（例えば細菌）を検出する場合は、前核プロー ブを選び、小器官由来のＤＮＡは抽出されないか、最小限量抽出される条件で処 理すればよい。このやシ方を用いれば、小器官由来のＤＮＡと前核ＤＮＡとの干 渉は最小であると確信することができる。真核種（それは前核細胞によっては感 染されない）を前核プローブで同定する場合、例えば核から小器官全分離し、次 いで小器官のＤＮＡのみを抽出するというようにして、小器官由来のＤＮＡの濃 度を最大にするのが最も良い。前核有機体の感染を受けた真核有機体を同定した い場合は、非−小器官、非−前核細胞由来のプローブを用いるのが最良である。

なぜならばこのグローブは前核細胞からのＤＮＡとは一般に十分にハイブリッド を形成しないからである。

同じ界、又は同じ豆稈、又は同じ部門、又は同じ門、又は同じ部門、又は同じ綱 、又は同じ並路、又は同じ目、又は同じ科、又は同じ族、又は同じ属からの一対 （ＤＮＡおよびプローブ）を用いるのが好ましい。前核ＤＮＡとハイブリッドを 形成させるためには前核細胞プローブ（例えば細菌のプローブ）を用いるのが特 に好ましい。このやり方で、前核有機体の属、種および株を検出し、定量し、そ して同定することができるだろう。最も好ましい前核グローブの１つは細菌から 得られるもので、その中でも特に、使い易く、手に入シ易いという点で大腸菌か らのものがよい。大腸菌から得たプローブは、いかなる有機体にも、特にすべて の前核有機体の同定に用いることができ、あらゆる細菌の菌株の同定のために最 も好ましい。他の、特に好ましい実施態様は、成る与えられた科に由来する真核 プローブを用いて、同じ科の真核細胞有機体を同定することである（例えば哺乳 類有機体全確認するために哺乳類プローブを用いる）。最も好ましいのは同じ亜 ２９ 科および／又は目および／又は族の有機体から得たグローブとＤＮＡを用いるこ とである（例えばマウスの成る種を同定する場合には、マウス由来のプローブを 用いるのがよい）。

最も鋭敏で有効な対の系は、プローブの出所と未知ＤＮＡの出所との間が進化的 にあまシ距離がないか又は分散がよシ少い、という系である。

本発明において、「進化的に保存された遺伝子材料配列」という語句は、植物、 動物又は微生物のうちの少なくとも２つの相違する種の間で相同性を示す遺伝子 材料１例えばＤＮＡの配列を表わすのに使用される。

２つの保存された配゛列の間の相同性とは、もしもそのようなりＮＡ分子の配列 の一方が検出可能なように標識化されていれば、２つの単鎖ＤＮＡ分子若しくは 断片が互いにハイブリッド条件下に置かれた場合に十分ハイブリッド化若しくは アニーリングが生じ、それによって標準的な方法（即ち、放射性標識、酵素標識 等）により検出可能な程十分安定な２重鎖を生ずることである。

ＥＰ−Ａ−００７６１２３において例示された進化的な保存配列は、リポソーム 几ＮＡ遺伝子のそれであった。

これは今でも高度に望ましい遺伝子配列である。しかしながら、進化的距離を越 えて十分に保存された有用な遺伝子配列が他にも存在することが発見された。

そのような付加的な配列の例は、参考文献としてここに入れたＤａｙｈｏｆｆの ’　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅａｎｄ　５ｔｒｕｃ ｔｕｒｅ　ｔ　Ｖｏｌｕｍｅ　５　ｒ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　３　ｔ１９７Ｌ ＮＢＲ，１９７９，ｐａｇｅｓ　９−２４　に、同超科（Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌ ｙ　）同君（Ｆａｍｉｌｙ　）＋好ましくは同副将（Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　）あ るいは同門（Ｅｎｔｒｙ　）に属するものとして示されている転移ＲＮＡあるい は蛋白をコード化している遺伝子や部分の配列である。蛋白の科というのは、そ れらの配列の５０チ以下のアミノ酸残基によっていずれの二個の蛋白も各々区別 されるものである０蛋白の副将というのは、配列の２０チ以下のアミノ酸残基に よっていずれの二個の蛋白も区別されるものでちる０門は、配列の５％以下のア ミノ酸残基によっていずれの二個の蛋白が区別され・るものである０ 使用されうる遺伝子配列又はその適当な部分の特殊な例は、チトクロームＣ関連 遺伝子、チトクロームＣ１関連遺伝子、チトクロームＣユ関連、チトクロームｂ Ｓ関連、フェロトキシン関連、リボトロピン関連、フラボトキシン関連、アルコ ールデヒドロゲナーゼ関連、ペルオキシダーゼ関連、アデニレートキナーゼ関連 、ホヌ７オリパーゼち関連、トリプトファンオペロン関連、ｆ）ルポキシペプチ ダーゼ関連、サブチリシン関連、べ二シリナーゼ関連、プロテアーゼインヒビタ ー関連、ソマトトロピン関連、コルチコトロピン関連、リボトロピン関連、グル カゴン関連、蛇静脈毒素（８ｎａｋｅｖｅｎｏｍ　ｔｏｘｉｎ　）関連、植物毒 素（ｐｌａｎｔ　ｔｏｘｉｎ　）関連、１ 抗微生物毒素（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｔｏｘｉｎ　）関連、免疫グロブ リン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　）関連遺伝子、リポソームＲＮＡ以外の リポソーム関連遺伝子、ヘムキャリヤー（ｈｅｍｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　）遺伝子 、染色体蛋白（ｃｈｒｏｍｏｓｏ　−ｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）遺伝子、線維 性蛋白（ｆｉｂｒｏｕｓ　ｐｒｏｔ　−ｅｉｎ　）遺伝子などである。

これらの付加的なりＮＡ配列のうちいくつかのものの保存は、リポソームＲＮ　 Ａ　（ｒ　ＲＮＡ　）　遺伝子の場合はど動物、植物または微生物界を通じて普 及しているものではない。（かくして、依然ｒ　ＲＮＡの使用が好ましい）。し かし、これは、よシ制限された範囲又は豆稈内で、有機体を同定又は特徴づけす るために付加的な配列を利用できるかもしれないので、その使用に対し重太芳障 害を構成するものではない。たとえば、ｔｒｐ　Ｄ　微生物グローブを発生させ 、それから微生物界内で試験するためこのプローブを使用するために、微生物由 来のｔｒｐ　Ｄ配列を利用することが可能である。

事実、同じ種、科又は属のｔｒｐ　Ｄプローブをさらに狭い界（例えば、エンテ ロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ　−ｃｅａｅ　）　又はバチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　等の存在に関する試験）内でｔｒｐ　Ｄグローブを使う 仁とは可能である０従って、付加的グローブ配列のいくつかの適応範囲は、ｒ　 ＲＮＡグローブはど広いものではないが、その適応性はやはり狭い赤白で極めて 効果的であろう。

保存ＤＮＡ配列情報を含むプローブは、ＥＰ−Ａ−００７６１２３で例示された ｒ　ＲＮＡ情報含有プローブの製法と同様の操作で製造される０かくしてプロー ブは、ＲＮＡ％ＤＮＡまたはｃＤＮＡなどであってよい。

その技術に含まれる個々のステップを、真核細胞お上び前核細胞（適用できる場 合）の両方に言及しつつ、又は技術的に何らかの相異がるる場合には、細胞の各 々のタイプについて別々に、述べるつもシである。

第一段階は未知有機体からのＤＮＡの抽出である〇真核細胞からの核ＤＮＡは当 業者には既知の標準的方法によって選択的に抽出することができる（例としてＤ ｒｏｈａｎ＋　Ｗ　ｅｔ　ａｌ著＋　「Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ ｃｔａ　Ｊ　ｔ５２１（１９７８）、１−１５．　ここには参考文献として挿入 されている）。小器官ＤＮＡは小さくて環状であるからスプーリング（ｓｐｏｏ ｌｉｎｇ）法が、非環状核ＤＮＡを、環状、小器官由来のＤＮＡから分離するの に役立つ。結果として、スプーリングされなかった物質は、小器官由来のＩ）Ｎ Ａを含み、これは密度勾配遠心法によって個々に分離することができる。もう一 つの方法として、糸粒体（又は葉緑体）を、打ち砕いた細胞の混合物から分離し 、精製した糸粒体（又は葉緑体）フラクションを小器官由来のＤＮＡの調製に用 い、精製した核フラクションを核ＤＮＡの調製に用いる。（例としてＢｏｎｅｎ 　Ｌ、　ａｎｄ　Ｑｒａｙ　Ｍ、Ｗ著［ＮｕｃＪｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａ ｒｃｈＪ８：３１９−３３５（１９８０）参照）。

前核ＤＮＡ抽出も当業者には良く知られている。例３３ えば、工業的発酵懸濁液、寒天培地、植物又は動物組織又は試料その他のような 媒質中に存在する未知の細菌を、高分子量ＤＮＡを抽出するように設定された周 知の条件下で処理する。例えば、未知の有機体の＃Ｉ胞を抽出緩衝液に懸濁し、 リゾチームをこれに加え、この懸濁液をインキュベートする。細胞破壊は、洗浄 剤の添加および／又は温度上昇によって一層促進することができる。プロテアー ゼ消化後クロロホルム／フェノール抽出およびエタノール沈澱を行ないＤＮＡの 抽出は完了する。フェノール／クロロホルム抽出よシスっと早いもう一つの抽出 法は、エタノール沈澱を用いてＤＮＡを速やかに分離する方法である。この方法 はＤＮＡを直接コロニー、又は少量の液体培地から分離するために好んで使われ る。ての方法はＤａｖｉｓ＋几、Ｗｅｔ　ａｌ著「Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　 Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ−ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋　Ａｄｖ−ａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔ ｅｒｉａｌ　ＧｅｎｅｔｉｃｓＪ　（今後は「デービス」と記す）、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　研究所、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ＋　＝ニーヨーク＋　１９８０１ｐ、１２０−１２１’（ここに参考文献として 記入）に記載されている。

ＤＮＡ（前核細胞又は真核細胞の（核又は核以外の））は次の段階のために生理 的緩衝液に溶解される。

希望するＤＮＡの単離後につづく可能なステップには多様性がある。これらのス テップのうちのひとつがエンドヌクレアーゼ消化である。

抽出されたＤＮＡの消化は制限エンドヌクレアーゼ酵素で行う。どんな制限エン ドヌクレアーゼ酵素でも用いることができる０確認しようとするものと同じ種の 有機体から得たものでないほうが好ましい。そうでなければＤＮＡは完全無傷の まま残るであろう。（このことが、結局は有機体を同定することになるだろう。

なぜならば酵素がそれ自身の起源である糧から得られたＤＮＡを切断するとは思 われないからである）０特徴づけるべき有機体様は未知であろうから、断片の消 化物を得るには最少量の試行錯誤が課されるが、これは熟練した当業者が不必要 な実験を行わずに日常的に実行できる程度の仕事である。可能性のある制限エン ドヌクレアーゼ酵素の例は、Ｂｇｌ　Ｉｒ　ＢａｍＨＩ、　Ｅｃｏ几Ｉ＋　Ｂｓ ｔ　ｌ　＋　Ｈｉｎｄ　ｉ［＋　Ｂａｌ　Ｉｒ　Ｈｇａ　■＋　Ｓａｌ　（ｒ　 Ｘｂａｌ、　Ｓａｃ　ｌ　＋　Ｓｓｔ　Ｉｒ　Ｂｃｌ　Ｉ　＋　Ｘｈｏ　Ｉｒ　 Ｋｐｎ　ｌ　、　Ｐｖｕ■、５ａｕ１１Ｉａ、その他である。Ｄａｖｉｓ＋同上 ＋ｐ、２２８−２３０もみよ、（ここに参考文献として記入）一種類以上のエン ドヌクレアーゼ混合物も消化のために用いることができる。普通は、ＤＮＡとエ ンドヌクレアーゼは適当な緩衝液中で一緒に、適当な時間（１〜４８時間の範囲 内、温度範囲は２５℃−６５℃で、好ましくは３７℃）インキュベートする。

その結果得られる同定用遺伝子特徴づけは、用いた１又はそれ以上のエンドヌク レアーゼのタイプに依存するだろうし、エンドヌクレアーゼに特異的であるだろ う。従って消化のためにどの酵素（１種類か又は数５ 種類）を用いたかに注意する必要がある。なぜならば、カタログに用いられる比 較用特徴づけは、同じ酵素又は酵素類を用いて作られていなければならないから である。

別のステップは、所望のＤＮＡ分子を消化することなく、例えば、配列化及び制 限部位ライブラリーを参照することによって所望のＤＮＡ分子上のエンドヌクレ アーゼ部位を明らかにすることである。明らかに、消化はその部位を示すのによ シ効果的な方法ではあるが、これに限定されるべきものではない。発明の本質は 、エンドヌクレアーゼ制限部位の位置に関連するＤＮＡＫ浴った保存配列あ位置 が、各々の種に特徴的な組み合せ（ｓｅｔ）を構成しているという発見にある。

従って、希望する情報（部位の位置と遺伝子の位置との関連）を得るだめの技術 は、すべて発明において有用であろう。

さらに、ＤＮＡ分子に沿った保存配列の位置は、ノ・イブリッド化グローブを使 用することによって最もよく示される。仁のグローブは、未知のＤＮＡの制限ｔ Ｆｒ片をアニーリングさせる。しかし、配列化のような、保存ＤＮＡ配列の決定 をさせる他の方法も有用である。

ハイブリッド化プローブを使用する場合、大きさに従ってＤＮＡ断片を最初に消 化、分離し、それから、分離された断片をハイブリッド化することが好ましい。

しかし、最初に消化し、過剰モルのプローブおよび／またはプローブに補足的な 配列でＤＮＡをアニーリングしてから、混合物を分離することもできる。例えば 、未知のＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ消化され、変性され、液体中で小さ い探知可能なラベル化ＤＮＡ断片、又は、興味のある保存配列の一部又は全部に 補足的な合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの一つあるいはそれ以上の過剰モ ルでハイブリッド化されうる。

大多数の制限酵素はＤＮＡにおいて全くまれに切断するので、多くの場合１、ハ イブリッドの１つあるいは複数の二重鎖領域は制限断片の大きさに比べて少ない であろう。ハイブリッド化反応は、オリゴデオキ７リボヌクレオチドのみがハイ ブリッド化するような条件下で、行なわれる。単鎖ＤＮＡ断片のような未反応物 およびハイブリッド化したオリゴデオキシヌクレオチドを含むＤＮＡ断片は、伝 統的なりロマトグラフ技術によって分離される。ラベル化されたＤＮＡ断片は、 予想どおり大きさで分類した分画に現われるであろう。

最初に過剰モルのプローブでＤＮＡをアニーリングし、次いで消化し、それから 混合物を分離することも可能である。溶液を短時間又は低いＣ□ｔでインキュベ ートする時、制限部位はハイブリッド化又は二重鎖領域に限定されるであろう。

溶液を長時間又は高いｃｏｔでインキュベートする時は、未知のＤＮＡはアニー ルシ、制限エンドヌクレアーゼ切断の起こシやすい標識化二重鎖を生ずるであろ う。組み換えのない単鎖末端は、３７ Ｓｌのようなヌクレアーゼによって除去される。対になっていない塩基はＤＮＡ ポリメラーゼＩまたはＴ４ポリメラーゼを使って充填される。

また、保存配列情報（例えば２０−．３０−、又は５０個）の中に、プローブと して選択された保存領域の残部よシも高度に保存された副配列を認めることがら る。

それらの「短かい」配列は、所望にょシ合成的あるいは酵素的につくられ、標識 化ヌクレオチドを組み入れてもよい。未知物質由来の単鎖、前消化されたｆ）Ｎ Ａは、これらの短かく、高度に保存された断片でインキュベートされ、それにハ イブリッド化されうる０それから分離は、短かい標識化プローブに対して、部分 的にアニーリングされた断片を含む消化混合物で行なわれる。（従って、分離状 ハイブリッド化後に発生する）。

すべての実用的な目的のために消化混合物は、本質的に単鎖の断片の混合物のよ うにふるまうので、分離は液体クロマトグラフィーで行なわれる。

指摘したように、好ましい方法は最初に消化し、次に分離し、それからハイブリ ッド化することである。

従って、エンドヌクレアーゼ消化後、種々の大きさの断片を含むインキュベーシ ョン混合物は適当なりロマトグ２フィー法によって分離されるのが好ましい。ハ イブリッド化が直前のステップである場合、核酸消化物を大きさによって分離す ることができて、その後の核酸プローブとのハイブリッド化を可能とする方法な らなんでも用いることができる。例えば、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラ フィー又はキャピラリーゾーン電気泳動を用いることができる。（Ｊｏｒｇｅｎ ｓｏｎ　＋Ｊ、　Ｗ、、　Ｊ、ｏｆ　ＨＲＣａｎｄ　ＣＣ，４：２３０−２３１ （１９８１））。

現在、好ましいのはゲル電気泳動法であり、特に好ましいのは、アガロース・ゲ ル電気泳動法である。この装置では、Ｄ？ｊｊＡ消化物は％普通は適当な緩衝液 中で電気泳動にかけられ、ゲルは普通は、臭化エチジウム溶液に浸され、多分加 えられる標準マーカー断片が見えるようにするためにＵＶ−光一箱に置かれる。

検出用に標識化された標準マーカー断片を用いることもできる。

分離し、目で見えるようにした後、そのＤＮＡ断片をす欠ザーン法によジニトロ セルローズ濾紙又は荷電修飾ナイロン膜（ｃｈａｒｇｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｎ ｙｌｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）に移す（［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｊ　３８　：５０３−５１７（１９７５））。この 移し換えは、変性および中和段階後に行うことができ、普通は長時間かけ（約１ ０−２０時間）るか又は電気的力をかけて、ゲルから濾紙へと移される。ゲルか ら濾紙への移動を促進する機器は市販されている。受けとったニトロセルローズ 濾紙は次いでＤＮＡを濾紙に結合するため高温（６〇−８０℃）で数時間加熱さ れる。

また、Ｐｕｒｒｅｌｌｏｒ　Ｍ、ら（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１２８：３ ９３−３９７（１９８３））の直接ノ・イブリッド化に関する最近の９ 方法を用いることによって、転移がさけられる。

濾紙に結合したＤＮＡ消化断片のハイブリッド化に利用されるプローブは、核酸 プローブであシ、成る与えられたよくわかっている有機体又は既知の塩基配列か ら得られたものであることが望ましい。

また、グローブ配列には自然の相対物（ｃｏｕｎｔｅｒｐ−ａｒｔ　）を有さな いものがよい。すなわち、プローブ配列は異種間で、多くの同一配列の残基が最 も一般的に存在するそれぞれの部分で、塩基が同一配列であるかもしれない。そ の同一配列は、どんな自然におこる配列のうちの一つよルももつ表安定なハイブ リッドを一般に形成し得る。グ°ロープは予定した配列に、個々のヌクレオチド を共有結合することによってつくられた合成オリゴデオキシリボヌクレオチド分 子であってもよい。合成分子は、例えば、合成におけるトリホスフェート法（Ａ ｌｖａｒａｄｏ　−０ｒｂｉｎａ　ｅｔ　ａｌ　、５ｃｉｅｎｃｅ　２１４：２ ７０−２７４（１９８１））で調製される。グローブ分子はどんな大きさでも有 用でアシ、プローブ溶液中に一配列以上あればよい。例えば、数個の２０塩基配 列はｒＲＮＡ遺伝子で高度に保存された数個の部分を検出するのに用いられる。

それは検出可能なように標識化されているか、又は標識化されていないかのどち らかであるが、検出可能なように標識化されているものが望ましい。この場合に は、核酸プローブは検出可能な標識化ＲＮＡ、好ましくは切シ込み翻訳標識化Ｄ ＮＡ、クローンＤＮＡ又はグローブ有機体からのＲＮＡに相補的である検出可能 なりＮＡ（ｃＤＮＡ）のいずれかてろシ、高度に保存されたＤＮＡ配列情報を含 むものすべてでるる。合成オリゴデオキシヌクレオチドは検出可能な標識化ヌク レオチドで調製されるので、その分子は、標識化ヌクレオチド残基を組み入れる ことＫより標識化される。組合せの選択によって、グローブは前核細胞からのも のでも真核細胞（細胞質由来、又は小器官由来）からのものでもよい。最も好ま しいのは、検出可能な標識が放射性燐のような放射性標識であることでおる（例 、３２Ｐ、３Ｈ又は１４Ｃ）、か又はピオチン／アビジンに基づ（（ｂｉｏｔｉ ｎ／ａｖｉｄｉｎ−ｂａｓｅｄ　）システムでおる。核酸プローブは金属原子で 標識化してもよい。例えば、ウリジンおよびシチジンヌクレオチメドは共有結合 水銀誘導体を形成することができる。水銀と結合したヌクレオシド・三燐酸は逆 転写酵素を含む多くの核酸ポリメラーゼの良い基質である（　Ｄａｌｅｅｔ　ａ ｌ　＋　［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａ ｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｊ　７０：２２３８−２２４２＋　１９７３ ）ｏ天然核酸の直接的共有結合による水銀化が報告された。

（Ｄａｌｅ　ｅｔ　ａｌ　ｙ　［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　１４：　２４ ４７−２４５７）。水銀化重合体のリアニーリング（ｒｅａｎｎｅ−ａｌｉｎｇ ）性は、対応する水銀のない重合体のそれと似ている（　Ｄａｔｅ　ａｎｄ　Ｗ ａｒｄ　ｙ　「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　１４　二２４５８−２４６９） 。金属標識化プローブは、例えば光−聴音スペクトロスコピー、Ｘ線スペクトロ スコピー、例えばＸ線螢光、Ｘ線吸収又は光子スペクトロスコピーによって検出 することができる。

所望の保存ＤＮＡ配列含有プローブの単離と調製は当業者の技術内である。例え ば、真核細胞および前核細胞からのｒ　ＲＮＡの分離は、当業者にはよく知られ ている。従って、真核細胞質リポソームからｒ　ＲＮＡを調製するためには、Ｒ ＮＡを全細胞又はリポソームから抽出し、スクロース勾配遠心法によシ分離する ことができ、１８Ｓ型および２８８型フラクションを分子量既知のマーカーを用 いて集めることができる（例えばＰｅｒｒｙ＋几、Ｐ、およびＫｅｌｌｙ、　Ｄ 、Ｅ、、著「２８Ｓおよび１８８リボンーム几ＮＡの生産が少量のアクチノマイ シンＤによって阻害される時の５８ＲＮＡの持続性合成Ｊ　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、、　７２：２３５−２４６（１９６８）、ここに参考文献として記 されている）。当然の結果として、小器官由来ｒ　ＲＮＡは、同様な方法で、小 器官フラクションから分離され精製される（例えばＶａｎＥｔ−ｔｅｎ　Ｒ，Ａ 、ｅｔ　ａｌ　、「　Ｃｅ１ｌ　Ｊ　２２　二　１５７−１７０（１９８０）　 、又はＥｄｗａｒｄｓ＋　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ　、　「Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｊ９：２８５３−２８６９（１９８１））。

もし放射性標識化グローブを用いるならば、このものは、適当な放射能をもつ化 合物を含んだ栄養物、又はそのような化合物を含む培養培地中で、生育又は培養 されたグローブ有機体から分離される。グローブが相補性ＤＮＡである場合（ｃ 　ＤＮＡ　）　、このものは、グローブ有機体から分離されたＲＮＡを放射性ヌ クレオジッド・三燐酸（例えば、３２Ｐ−ヌクレオシド又は３Ｈ−ヌクレオシド ）の存在下、逆転写することによって作られる。

標識化プローブは、又切り込み翻訳ＤＮＡ分子、特に小器官由来の全環状ＤＮＡ から得られたものであってもよい。具体的には、葉緑体又は糸粒体の環状ＤＮＡ が、放射性標識の存在下切り込み翻訳されることによって標識化ＤＮＡプローブ が得られる。葉緑体標識化グローブは、葉緑体ＤＮＡと最も良くハイブリッド化 し、糸粒体標識化グローブは、糸粒体ＤＮＡと最も良くハイブリッド化するであ ろう。葉緑体（又は糸粒体）の切シ込み翻訳標識化プローブは、糸粒体（又は葉 緑体）ＤＮＡと２番目に良くハイブリッド化するでろろう。それは、一般的にあ まり好ましくない形ではあるが、全植物（又は動物）のＤＮＡともハイブリッド 化するだろう。グローブは、実用性を考慮した場合はこの方法が良いとはいえな いとしても真核細胞の核ＤＮＡからも切シ込み翻訳によって得られるかも知れな い。これを実現するより有用なアプローチは、真核細胞の核ＤＮＡから高度保存 遺伝子を切シとり（制限酵素により）、断片を分け、遺伝子配列を同定しくノ・ イブリッド化によって）、そしてその遺伝子配列を分離する（電気泳動法によっ て）ことである。次いで分離した配列はグラスミツド又は他のペククーに再結合 され、適当な宿主の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　）後３２ｐ−含 有媒質中でクローニングを行えばよい。もう一つの方法は、形質転換宿主を増殖 し、次いでＤＮＡを分離し、切シ込み翻訳によってそれを標識化するか、又はＤ ＮＡを分離し、配列を切シとシ、次いで標識化する。得られたリポソームプロー ブはｃＤＮＡと同じ状態でハイブリッド化する（後記参照）０好ましい核酸プロ ーブは、プローブ有機体からのＲＮＡに相補的な、放射性標識化ＤＮＡでらる０ そのＲＮＡは普通、保存遺伝子を解読しているメツセンジャーＲＮＡであり、実 質的に運搬ＤＮＡ（ｔＲＮＡ）又は（ｒ　ＲＮＡが使われるのでなければ）リポ ソームＲ，ＮＡ（ｒ　ＲＮＡ　）のような他のＲＮＡは含まない。もしｒ　ＲＮ Ａが使用されれば、前核細胞ｒ　ＲＮＡは普通は３種類のサブグループを含む。

いわゆる５８，１６８．および２３８−断片でちるｏ　ｃＤＮＡへの逆転写は３ 種類すべての混合物で行われるか、さもなければ１６８および２３８断片の混合 物で行われる０とれらｒ　ＲＮＡ成分のうち一つだけで逆転写を行うのは、成る 状態では可能他の種類のＲＮＡをほとんど含まない純粋のｒ　ＲＮＡにインキュ ベートする。この場合よシ好ましいのは、仔牛甲状腺ＤＮＡ加水分解物のような プライマーの存在下において、鳥骨髄芽球症つイールス（ＡＭＶ）からの逆転写 酵素とインキュベートすることである。混合物は適当なデオキシヌクレオシド三 燐酸を含んでいなければならず、そのヌクレオシドのうち少くとも一つは、例え ば３２Ｐによって、放射性標識化されている。

例、ｔば、デオキシシチジン５’−（３２Ｐ）％デオキシシチジン　５’−（” Ｐ）、テオキシアテニン５′−（３２Ｐ）、又ハブオキシグアニジン５’−（３ ２Ｐ　）・三燐酸が放射性ヌクレオシドとして用いられる。３０分〜５時間、２ ５℃−４０℃でインキュベートシ、クロロホルムおよびフェノールによる抽出お よび遠心分離並びにクロマドグ２フイー後、放射性標識化フラクションを合一し 、ｃ　ＤＮＡプローブとする。実質的には純粋な型の保存ＤＮＡ情報を含む放射 性標識化ｃ　ＤＮＡプローブ、即ち非標識化分子がなく、他の型のＲＮＡに相補 的なｃＤＮＡもなく、蛋白性物質もなく、膜、小器官等の細胞成分もない放射性 標識化ｃ　ＤＮＡグローブも、本発明の一面を構成する。好ましいプローブは前 核細胞の標識化ｃ　ＤＮＡで、最も好ましいのは細菌の標識化ｃ　ＤＮＡでちる 。グローブの種は、細菌性微生物、例えばエンテロバクテリアセア（Ｅｎｔｅｒ ｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ　）、バシルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）、シ：Ｌ−ドモナス４５ ハエモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ　）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃ ｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ　）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ　）、ネイセリア（Ｎ ｅ１ｓｓｅｒｉａ　）、バクトロイデス（Ｂａｃｔｒｏｉｄｅｓ　）科に含まれ る種、およびその他の嫌気性群、例えばレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌ　Ｉａ　 ）等が使われる。本出願において前核細胞の実施例は、細菌性前核グローブ有機 体としての大腸菌の使用に限られているとはいえ、決してこの微生物に限られる ものではない。グローブとして放射性標識化型のｃＤＮＡの使用は、ＤＮＡのハ イブリッド化中の安定性がよシ大きいので放射性標識化ＲＮＡの使用より好まし い。

標識化ｃ　ＤＮＡグローブがＲＮＡの忠実なコピーでなければ々らガいこと、即 ち合成が行、われるあらゆる時に鋳型ＲＮＡの全ヌクレオタイド配列が転写され たものでおることを認識することが重要である。プライマーの使用はこの点で必 須である。ｃ　ＤＮＡが忠実なコピーでらるということは、ノ・イブリッド化後 にこれが二つの特性をもっているという事実によって証明することができる； １、ｃＤＮＡは標識化ｒ　ＲＮＡの１ｏＯ％にリボヌクレアーゼ消化から保護し なければならない；そして２　標識化ｃ　ＤＮＡは、Ｓ１ヌクレアーゼに対する 抵抗によってわかるように、ｒＲＮＡＫ特異的にアニールしなければならない。

ペルジャンスキーＭ、Ｍらの［Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ　Ｓｃ　Ｐａｒｉｓ　Ｊ　ｔ２ ８６、シリーズＤ、ｐ、１８２５−１８２８（１９７８）には大腸菌ｒ　ＲＮＡ に由来する…−放射性標識化ｃＤＮＡについて記載されている。この研究におけ るｃ　ＤＮＡは、本発明のようにプライマーの存在下逆転写酵素で調製したもの ではなく、リボヌクレアーゼＵ２を用いてあらかじめ分割しておいたｒ’　ＲＮ Ａを鋳型として用いＤＮＡポリメラーゼ■で調製したものである。ペルジャンス キーらのｒ　ＲＮＡ消化産物（ＲＮＡ　ｓｅ　Ｕ２による）は、最初のｒ　ＲＮ Ａと異なる塩基比を有し、塩基および／又は短かい断片が失なわれたことを示し ている。このようにして得られたｃ　ＤＮＡは忠実なコピーではない。その上ペ ルジャンスキーが用いたＤＮＡポリメラーゼＩの使用は、ｒＲＮＡのへテロ重合 転写に対するホモ重合転写の優位に拍車をかけることが知られている（参照、５ ａｒｉｎＰ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ　＋　［Ｂｉｏｃｈｅｍ＋Ｂｉｏｐｈｙｓ＋　Ｒ ｅｓ、Ｃｏｍｍ、Ｊ　＋５９　：２０２−２１’４（１９７４））。

これらをまとめると、グローブは、ａ）例えば遺伝子のように、保存配列を含む ゲノムＤＮＡから、クローニングおよび／又は切り込み翻訳によって、ｂ）　Ｒ ＮＡそれ自身から、又はｃ）　ｃＤＮＡから、Ｒ，ＮＡの逆転写によって得られ る。

７ 標準的には、本発明工程の次の段階は、未知有機体からの分離ＤＮＡ消化物の、 標識化していないか又は（好ましくは）放射性標識化した几ＮＡ又はＤＮＡプロ ーブトノハイブリッド化である。ハイブリッド化は未知有機体からの共有結合的 に標識化されたＩ）ＮＡ消化物を含有する紙を、グローブを含むハイブリッド化 混合物と接触することによって行われる。インキュベーションは加温下（５０− ７０℃）長時間かけて行い、その後、濾紙を洗って結合していない放射能を除去 しく必要な場合）、次いで空気乾燥し、検出の用意をする。もう一つの、上記方 法よシ遥かに迅速にできる、非常に好ましいハイブリッド化は、コーンＤ、Ｅ（ Ｋｏｈｎｅ、Ｄ、Ｅ　）らの「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　１６　：　５３ ２９−５３４１（１９７７）に参考文献として記載の、室温フェノール乳濁液再 封合法である０ ハイブリッド化後、この方法では適当にノ・イブリッド形成した断片の選択的検 出が必要である０この検出は、ハイブリッド形成した断片が二重鎖構造であるこ とを利用し、これによる選択的方法（非標識化プローブ（０１合）％　ラジオオ ートゲシフ法又はコンピューター化されていてもされていなくてもよく、これに より検出スピードを増すのであろう適当な放射線スキャナー法（標識化プローブ の場合）によって行うことができる。これらの方法は熟練せる当業者にはよく知 られており、この点でこれ以上記すことはないだろう。

この方法の最終産物は、特定の位置に種々の強度のピークおよび谷、おるいは好 ましくは明および暗領域ヲモった、クロ・マドグラフ帯パターンのような同定用 遺伝子特徴づけでるる。これらの位置はＥｃｏＲ■　消化λバクテリオファージ ＤＮＡのようなマーカーの分離法にかけることによって、特定の断片サイズ（キ ロベース対）に容易に照合きせることかできる。このようにして帯相互の相対的 位置も６帯の絶対的大きさも容易に確かめることができる。未知有機体の同定用 遺伝的特徴づけをカタログ又はライブラリーにある特徴づけと比較する０カタロ グ又はライブラリーには少くとも２から、はとんど無限といってよい程の数の確 定せる種々の有機体の属および種の特徴づけを掲載する本からなっていても良い 。例えば人の病気を発生させる病理学的に関係のめる細菌は約１００と推定され 、そのため、病原細菌の標準カタログは５０〜１５０のそのような特徴づけを含 むだろうと推定される。疫学的判定システムのだめの細菌菌株の型のカタログも また含まれていても良い０ 特徴づけは選んだエンドヌクレアーゼ酵素のタイプ゛又はタイプ群に依存し、多 分放射性標識化プローブの出所（プローブ有機体）として用いられた特定の有機 体に、そして又プローブ調製のために利用した保存ＤＮＡ配列情報核酸の組成（ 例えば前核細胞の５８，１６８又は２３Ｓ型サフリイプか、１６８および２３８ 型４９ のみかまたは一致配列等）に依存するだろう。こうして、カタログは各グローブ 毎に、記録された帝サイズおよび相対的強度をもった、種々の酵素−特異的特徴 づけを含むかも知れない。濾紙に結合した結合ＤＮＡの濃度が減るにつれて、最 も強い帯のみが見えるようになり、この又はこれらの帯のサイズで徳を確認する ことができる。

叙上の変化又は順列は、勿論、全てライブラリーに利用される。その上真核有機 体については、ライブラリーは一つのタイプのＤＮＡ、又は小器官および／又は 核−ＤＮ’Ａの組み合わせを用いることによシ生じる諸パターンを含むかも知れ ない。各ＤＮＡ消化物のパターンは、プローブ組成に依るであろう。カタログは 、もし１種類以上の株又は種が、抽出サンプル中に存在していて、グローブによ って検出される場合、それから生ずる特徴づけを解釈できるように整理されてい る。

ユーザーは、得られた特徴づけ、例えば帯パターンを視覚的に比較することもで きるし、パターン認識用にプログラムされた一次元のコンピュータ一式デジタル スキャナーによっても比較することもできる。これらのコンピュータースキャナ ーは、タイムーオプーセール（ｔｉｍｅ　−ｏｆ　−５ａｌｅ　）処理（一般に 利用される「スーパーマーケット」チェックアウトバーコードまたはパターン読 みとシ装置）の当業者にはよく知られている。理想としては、ライブラリー又は カタログは複数の有機体の相対的特徴づけと、断片の分子量又はサイズの絶対値 とでコンピューターメモリーの中に入っているべきで、ある。そうなれば、カタ ログ比較は、針鼠情報要素の一つ又は両方（相対的特徴づけおよび／又は絶対的 サイズ要素）によって、未知の特徴づけをライブラリーに存在する特徴づけの一 つと照合することによって行われる。標準と比較した時の６帯の強度は、ハイブ リッド化した結合ＤＮＡの量をあられすこともできるので有機体の存在の程度、 例えば真鴫細胞中の前核細胞の存在の程度を推定するのに用いることができる。

もしもユーザーが与えられた有機体の性質を確認し、同定を更に進めたいと思う ならば、そのようなユーザーは、未知の有機体を第二の異るエンドヌクレアーゼ で消化し、得られた特徴づけを、二番目に選んだエンドヌクレアーゼの場合の有 機体のカタログ特徴づけと比較すればよい。この過程は、正確な同定を行うため に必要なだけ何回も繰返すことができる。しかしながら、普通は単一グローブで 一回分析をすれば大抵の場合は十分である。

本発明およびその変法は無数に応用できる。本発明は植物栽培者又は動物飼育者 が彼等の対象物を正しく確認するために用いてもよいし、臨床および微生物学研 究室で、真核細胞も含む何らかの媒体中に存在する細菌、寄生虫又は菌類を同定 するために用いてもよい。

１ この後者の場合は、この方法は標準微生物検定法として用いられる。なぜならば 微生物の分離および増殖の必要が々いから′である。試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ）増殖２よび特徴づけは、現在、マイコバクテリウム・レプラ（Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　１ｅｐｒａｅ　）　（ライ病の病原菌）のような若干の微生物 にとっては不可能てあシ、必需的細胞内細菌（例えばリケッチャ−、グラミジア 等）のＩような若干の微生物は標準培地上では不可能であるか、不可能でなくて も非常に危険である（例えばＢ、アントラシス（Ｂ、　ａｎｔｈｒａｃｉｓ　） （炭痕病の病原菌）０本法は核酸の単離に基づいておシ、それは従来の細菌分離 および特徴づけを行わないから、゛これらの問題を排除することができる。この 方法はこれまで正式には記載のなかった微生物を検出することができると思われ る。その上拳法は、種の異なる菌株を見分けることができ、これは、例えば細菌 学における疫学的類型化に役立つ。

この方法は犯罪捜査で植物又は動物組織を正しく、はっきシと同定するために、 法医学実験室で用いることができる。又作物被害の性質を確かめる場合、昆虫学 者が昆虫の種を速かに同定するためにも用いられる。

更にこの方法を亜種以外の分類群（例えば植物根の窒素酵素遺伝子；参照：　Ｈ ｅｎｎｅｃｋｅ　Ｈ２９１［Ｎａｔｕｒｅ　Ｊ３５４（１９８１））の同定と結 びつけることによって、この方法論は個々の菌株の遺伝子型を調査し、同定する ために用いることができる。

この発明の方法は、微生物が見出されるあらゆる場所で、微生物の同定に好まし く使用される。これら微生物は生理学的物質中にも非生理学的物質中にも見出さ れるだろう。それらは工業的増殖培養基、培養肉汁等の中に見出され、そして例 えば遠沈法によって濃縮させられるだろう。微生物が生理学的培地に見出される のが好ましいし、それが感染した動物源に見出されるのが最も好ましい。この後 者の具体例では水沫は動物、特に好ましいのはヒトにおける細菌感染を診断する のに用いられる。前核グローブによる細菌ＤＮＡの検出および同定は高度に選択 的で、動物（例えば哺乳類）ＤＮＡの存在においてさえ障害なしにおこなえる。

もし前核プローブを用いるならば、糸粒体ＤＮＡとのハイブリッド化を最小にす る条件を選ぶか、糸粒体の帯を当該パターンから差し引くことができる。このよ うにしてこの技術は臨床研究室、菌寄託機関、工業的発酵研究室等において用い ることができる。

特に興味深いことは感染微生物の種および菌株の同定に加えて、微生物の中に何 らかの特殊な遺伝子配列の存在を発見できる可能性のあることである。例えば、 薬剤耐性を仲介する伝達性プラスミツドＲ因子上に見出される抗生物質耐性配列 の存在を検出することができる。標識化Ｒ因子ＤＮＡ又はクローン標識抗生物質 耐性配列をハイブリッド化混合物に加えることによって、その有機体の抗生物質 耐性の有無を正しく決める５３ ことができる（正規でない一本又は数本の帯があられれる）。又、加えた抗生物 質耐性配列プローブ（１又は数種）の存在下で一度ハイブリッド化した濾紙を再 ハイブリッド化してもよい。又別の方法として、未知のＤＮＡをアリコートに分 け、第一のアリコートを同定のために、第二のアリコートを薬剤耐性配列の存否 のために、第三のアリコートを毒素遺伝子のために用いるというように試験する こともできる。又別の方、法として、−放射線核種（例えば３２Ｐ）で標識化し た保存遺伝情報を含むプローブを別の放射線核種（例えば３Ｈ又は１４Ｃ）で標 識化したＲ−因子グローブを加えたハイブリッド化混合物中で用いることもでき るだろう。ハイブリッド化後、未知ＤＮＡ中のＲ−因子ＤＮＡの存在を、二種類 のスキャナーによる走査でテストすることができる。一つは種および菌株同定の ためでロシ（例えば３２ｐ　）、他の一つは薬剤耐性等のためのものである（例 えば３Ｈ又は１４Ｃ）。この方法で実験者は、微生物の分離および特徴づけをす る必要なしに１属および種を同定、菌株をタイプ分け、薬剤耐性、毒素生産若し くはその他の特性、又は標識核酸配列若しくはグローブで検出しうる種レベル以 下の分類群のテストのすべてを、一つの実験で行うことができる。

Ｒ−因子は普遍的で、種の境界と交差しているので、同定は、いかなる細菌属又 は種においても、同じＲ−因子グローブで行うことができる（参照：　ＴＯＩＴ ｌｋｌｎＳ　ＨＬ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、、１４１：６２ ５−６３６（１９８１））。

更に、真核細胞又は前核細胞におけるウィールス又はウイールス関連配列の存在 も本発明の方法を結合して検出および同定することができる。「Ｍａｎｕａｌ　 ｏｆ　ＣＩ　−１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｊ第三版（発行者Ｌ ｅｎｎｅ　ｔ　ｔｅｎ　Ｅ。

Ｈ＋Ａｍｅｒ、　Ｓｏｃ、Ｍｉｃｒｏｂ、、１９８０　＋　７７４−７７８　） 　に掲載されているすべてのウイールスを同定することができる。例えば、ピコ ルナグイリゾ（１）ｉｃｏｒｎａｙｉｒｉｄａｅ　）、カリシグイリゾ（ｃａｌ ｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ　）、レオグイリゾ（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ　）、トガグ イリゾ（ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ　）、オルトマイコグイリｉ（ｏｒｔｈｏｍｙ ｘｏｖｉｒｉｄａｅ　）、バラマイコヴイリデ（ｐａｒａｍｙ−ｘｏｖｉｒ　１ ｄａｅ　）、ラブドヴイリデ（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ　）、レオグイリゾ （ｒｅｔｒｏｖｉ　ｒｉｄａｅ　）、アデノビリデ（ａｒｅｎ−ａｖｉｒｉｄａ ｅ　）、コロナグイリゾ（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ　）、ブニアグイリデ（ ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ　）、バグオヴイリデ（ｐａｒｖ−ｏｖｉｒｉｄａｅ 　）、パポパグイリデ（ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ　）、アデノビリデ（ａｄ ｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ　）、ヘルペスヴイリデ（ｈｅｒ−ｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ 　）、ヴイドヴイリデ（ｖｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ　）およびボキシヴイリデ（ｐ ｏｘｖｉｒ　１ｄａｅ　）等。

Ａ）ソウィールス性ゲノムが宿主ＤＮＡに組み込まれている場合（ＤＮＡウィー ルス例えばバポバヴイリデメンバー、ＲＮＡウィールス例えばレトログイリゾメ ンバー）は、高分子量ＤＮＡを組織から抽出し、制限酵素によって消化する。全 体的手順は細菌の場合と同様である。ウイールス性プローブの選択は、この場合 も５ 求められている課題次第でアシ、「プロープウィールス」および検出すべきウィ ールス関連配列間の相同性の程度に依存する０都合よい配列相同性を得るために ｆｉ、　７０−７’および組織の配列がウィールスノ同シ科属又は種に関係して いることが必要だろう。保存された配列の程度に加えて、ウイールスプロープが 宿主ＤＮＡのウイールス関連配列とハイブリッドを形成するかしないかは、ハイ ブリッド化の条件、例えばストリンジェント条件であるかリラックス条件である かによって決まるだろう。ハイブリッド化の結果は１．宿主ＤＮＡに組み込まれ たウィールスゲツムがあることを示す一本の帯又は帯バクーンであるだろう。こ の情報は、発癌の予測に役立つ。クローン化つイールス配列を含む標識化相補性 核酸グローブ−のいずれをもプローブとすることができる０ＲＮＡウイールスの 場合には、例えばウイールスＲＮＡを用いて逆転写酵素でＤＮＡを作ることがで き、ＤＮＡウイールスの場合には、例えば切シ込み翻訳によって標識化したウイ ールスＤＮＡを用いることができる。ここでも複数のプローブ、特に、異なる標 識をしたプローブを用いることができる。

同じ一般的特徴がＤＮＡおよびＲ，Ｎ’λ′ウイールスに等しくあてはまる。ウ イールスのゲノムは相対的に小さく、沈降核酸は遠心分離によって集めるのが好 ましい。全操作を核酸全部を用いて行ってもよいし、種々の操作を別々に行って もよい。遠心分離する前に、細胞ＤＮＡをスプーリングで、取り除くことによシ 、つこれは、ウィールスゲツムが組み込まれているかどうかを調べるためにも用 いることができる。

ウィールスプロープをハイブリッド化するためには、そのプローブが未知有機体 と同じ科、属又は種であることが必要だし、少くとも最も好ましい。反応条件、 ストリンジェントかリラックスかが、与えられたプローブと関連性の低いゲノム とがハイブリッドを形成するか否かを決める。プローブは、標識化されたクロー ンウイールス配列であるかも知れないし、完全なゲノム又はその一部であるかも 知れない。

前記したサウザーンに記載の方法は、大きいＤＮＡ断片（約０．５キロベ一ス以 上）を、アルカリ変性後、ニトロセルロース紙に移し換えるために有用である。

この方法はＤＮＡウイールスの場合には有用で、几ＮＡウイールスの場合には役 に立たないかも知れない。ＲＮＡを活性化セルロース紙（ジアゾベンジルオキシ メチル紙）に移して共有結合で結合させ、そしてこれをＲＮＡウイールスのため に用いることができる。サウザーン法のトーマスによる変法（Ｔｂｏｍａｓ＋　 Ｐ、　ｐ　［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　Ｊ　ＵＳＡ　７７：５２０１−５２０５（１９８０ ））は、ＲＮＡおよび小さいＤＮＡ断片を、ハイブリッド化のために、ニトロセ ルロース紙に効率的に移すのに用いることができる。ＲＮＡおよび小ＤＮＡ断片 を、グリ５７ オキザールおよびジメチルスルフオキシドで変性し、アガロースゲル中で電気泳 動にかける。この操作で、１００〜２０００　ヌクレオタイドであるＤＮＡ断片 、及びＲＮＡは効率的に移動し、ハイブリッド化中ニトロセルロース紙上に残留 する。これは、小さいリポソームＤＮＡ断片に対しても有用である。そこで、最 も好ましいのは制限酵素によって消化された標本を分割し、その一部の核酸をグ リオキザールで変性することでろる。サウザーンおよびトーマス操作法は、最大 量の情報を与えるであろう。

Ｂ）ＤＮＡウイールスの場合、二重鎖（ＤＳ）ＰイーシスＤＮＡで制限分析を行 うことによって存在するウィールスを同定することができる。単鎖（Ｓ　Ｓ　） 　ＤＮＡウイールスは種々異る長さのゲノムを有するだろう。

ハイブリッドを形成するプローブ（配列情報はＤｓ−ＤＮＡに変換され得る）、 ハイブリッドを形成した断片のパターンおよび／又は１若しくは複数のサイズは ウイールスの同定に使用できる。ここでも又、相補性核酸プローブを得る多数の 方法がある。例えば、ＤＳ−ＤＮＡの場合は、切シ込み翻訳を用いることができ 、５Ｓ−ＤＮＡの場合には、ＤＮＡポリメラーゼがｃＤＮＡ合成のために用いら れる。

Ｃ）ＲＮＡウイールスの場合、ＲＮＡは制限エンドヌクレアーゼによって消化さ れない（配列情報はＤＳ−ＤＮＡに変換されたかも知れない）。異るＲＮＡウィ ールスのゲノムは異る大きさをもち、若干のＲＮＡウィールスのゲノムには１分 子以上の分子がある。このことによシ、成るプローブ又は合一グローブによって 検出された塩基配列に治って、ＲＮＡウィールスを同定することができる。グロ ーブの１例は、ウイールスＲＮＡを用いて合成しｆｃｃＤＮＡである。

標本中の感染性病原菌を探す場合、その標本から核酸を抽出することによシ、又 は先づ培地又は細胞で培養して病原菌の数をふやすこと、又は遠心法のような濃 縮過程を用いること又はすべてのアプローチを試みることによって直接的に探す ことができる。

本発明から、その方法を実行するために必要な要素を含む「キット」を作成する ことは容易である。そのようなキットは、試験管又はバイアルのような１個以上 の容器をその中にきっちシと詰められるように仕切られたキャリヤーからなるも のであろう。上記容器の一つは、非標識化核酸グローブ又は例えば有機体プロー ブからのＲＮＡに対する放射性標識化ｃＤＮＡのような検出可能に標識された核 酸プローブ（細菌を確認するためのキットの場合は、前核細胞のｃＤＮＡが一層 好ましい）を含んでいて良い。標識化核酸プローブは、凍結乾燥の形か又は必要 ならば適当な緩衝液中に存在するだろう。１又はそれ以上の容器は未知有機体か らのＤＮＡの消化に利用される一種類かそれ以上のエンドヌクレアーゼ酵素を含 むだろう。これら酵素はそれ９ だけで、又は混合物として、凍結乾燥形か、適当な緩衝液溶液となって存在する 。キットに採用される酵素類は、そのためのカタログが用意されているような酵 素でるることが理想的である。しかしユーザーが実験時に自分達自身の比較標準 を作ることを妨げるものは何もないので、もしユーザーが、成る未知のものが実 際に、与えられた属又は種のものであることを疑うならば、その人は既知のもの の同定されている特徴づけを作シ、それを未知のものの特徴づけと比較すればよ い。このように、キットはこのサブプロセスを行うのに必要なすべての要素を含 んでもよい０これらの要素とは、１以上の既知有機体（細菌のような）又は既知 有機体から分離されたＤＮＡを含む。その他に、キットは、広く小冊子、又は本 又はパンフレットと定義される「カタログ」又はコンピューターテープ又はディ スク、又ハコンピューターアクセスナンノく一等々を含み、これらは植物の種、 哺乳類の種、細菌の種、特に病理学的に重要な細菌、昆虫の種等のような成る群 の種々の有機体の同定された特徴づけを内蔵する。このようにしてユーザーは未 知有機体の特徴づけを用意し、これをカタログ内の特徴づけと視覚的に（又はコ ンピューターで）比較するだけでよい０キツトは又、一つオシラド・三燐酸を、 そしてもう一つの容器にはプライマーを含んでいても良い。このようにしてユー ザーは自分自身のプローブｃ　ＤＮＡを作ることができる。

最後に、キツ、トは、緩衝液、増殖培地、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌ クレオジッド−三燐酸、濾紙、ゲル原料、移し換え材料、オートラジオグラフィ ー補充品のような、本発明の技術を行うために必要な付加的要素のすべてを含ん でいても良い。それは又、抗生物質耐性配列プローブ、ウィルスプローブ又はそ の他の特異的性質をもつプローブも含んでいても良い。

これまで本発明を一般的に述べてきたが、本発明は一定の参考実験と実施例を参 照することによりより良く理解されるであろう。なお、実施例は単に説明の目的 のためにのみ記載されたものであり、特記しない限９本発明を制限する意図はな い。

細菌肉汁培養物を遠沈し、細胞を冷食塩水で洗った。

その細胞を、詰め込んだ（ｐａｃｋｅｄ　）細胞のグラム重量の約１０倍のｄ容 量の抽出緩衝液（０，１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０３ Ｍ　）リス　ｐＨ８，５）に懸濁させた。リゾチーム１ＯＷ／−を最終濃度０． ５　ｓｙ／ｗｔとなるように加えた。懸濁液を３７℃で３０分間インキュベート した。細胞破壊は、２５％、ＳＤＳを最終濃度２．５％になるように加え、温度 を１０分間６０℃６１ に上げることによっておこなった。水浴中で冷却後、メルカプトエタノールを最 終濃度１チになるように加えた。プロナー、ゼ■２０ｓＰ／ｄＯ，０２Ｍ）リス 緩衝液（ｐＨ７，４）を３７℃で２時間予備消化し、それから最終濃度ｘｓｙ／ ａｔになるように加えた。その溶液を３７℃で１８時間インキュベートした。フ ェノールは再蒸留したフェノール１ｊ１１二回蒸留した水Ｚ５　ｆｉ、飽和トリ ス塩基２７０ｍ、メルカプトエタノール１２−及び最終濃度１０　”Ｍになるよ うな量のＥＤＴＡを混合し、４℃でその混合物を分離せしめることにより調製し た。そのフェノールを洗浄用緩衝液（１０”％塩化ナトリウム、１０−３°Ｍ　 Ｅ　ＤＴＡ、１０　ｍＭ　）リスｐｌ（＆５）で洗った。それから等量の新鮮緩 衝液を加えた。

メルカプトエタノールを最終濃度０．１　％になるように加えた。溶液を混合し 、４℃で貯蔵した。調製したフェノール半容量とクロロホルム半容量を溶菌細胞 溶液に加えた。これを約１０分聞損とうし、３４００ＸＰで１５分間遠沈した０ 水相を２５■ガラスピペツトで除去した。境界にほとんど沈澱物がなくなるまで この抽出操作を繰返した。１／９容量の２Ｎ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）を水 相に加えた。２倍容量の一２０℃９５チェチルアルコールをフラスコの壁面に沿 ってゆっくシと注いだ。パスツールピペットの先端を溶融して閉じ、沈降ＤＮＡ をスプールするために用いた。高分子量ＤＮＡは緩衝液中に溶解した（　１０　 ”Ｍ　ＥＤＴＡ　。

１０”Ｍ）リスｐＨ７，４）　ｏ　Ｄ　Ｎ　Ａ濃度は、換算係数として吸光度１ 単位について３ｏりを用い、２６０ｎ＋−における吸光度によシ測定した。

ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化 ＥｃｏＲ１１１ｔｌＪ限エンドヌクレアーゼ反応は、０．１　Ｍ　）’）　ス− ＨＣｊｔ　ｐＨ７，５，０，０５Ｍ　ＮａＣ１５０，００５Ｍ　Ｍｐｃｎ２およ び１００　ａｙ／ｍｌ　修生血清アルブミン中で行われたｏ　ＥｃｏＲ１反応混 合物はＤＮＡ消化物につき５単位の酵素を食んでおり、これを３７℃で４時間イ ンキュベートシた。ＰＳＴ　ｌ　制限エンドヌクレアーゼ反応は０．００６Ｍ） リス−ＨＣβｐＨ７，４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００６Ｍ塩化マグネ シウム、Ｏ，ＯＯ６Ｍ２−メルカプトエタノール、および１００　Ｉｆ／ｗｅ仔 牛血清修生グミン中で行われた。ＰＳＴ　Ｉ反応混合物はＤＮＡ／μノにつき２ 単位の酵素を含み、これを３７℃で４時間インキュベートした。通常、１０μｉ のＤＮＡは最終容量４０＃ｆｉに消化された０１０倍濃度の緩衝液を加えた。滅 菌Ｗ溜水をＤＮＡ容量に応じて加えた。

λ−バクテリオファージＤＮＡは、断片の大きさ決定のためのマーカー帯を作る ため、ＥｃｏＲｌで制限された。普通２１’Ｐ”ＤＮＡは２０単位のＥｃｏＲｌ で消化されて最終容量２０＃１になった。

ゲル電　泳動法およびＤＮＡ転移 ＤＮＡ消化物にｍ２ｏｓまでのグリセロールおヨヒプロモフェノールブルー色素 を加えた。　λ　ＤＮＡ消消 化３の場合は、１ｘＥｃｏＲ）　緩衝液２０μｍを各２０μＬ反応混合物に加え た。普通は７５％グリセロール１５−１１およびＯ，，５％ブロモフェノール色 ｆｆ、　５　Ｊヲ各４０μに反応混合物に加えた。

消化した細１ｉｉＤＮＡ１０μりおよび消化したλＤＮＡ２＃りをパー・ウェル （ｐｅｒｗｅｌｌ）に入れ溶かしたアガロースで表面をおおう。消化物を０．０ ２　Ｍ酢酸ナトリウム、０．００２ＭＥＤＴＡ、０．０１８Ｍ　）リス塩基、お よび０．０２．８Ｍトリス　ＨＣｆｉｐＨ８，０５を含む０．８チアガロース中 、３５Ｖで、色素が１３〜１６ｍ泳動するまで電気泳動をおこなった。その後ゲ ルをこチジウムプロミド（０，０Ｏ５１Ｐ／ｊ）に浸し、λ　断片を見えるよう にするためにＵＶ光箱に置いた。ＤＮＡを上述のサウザーンの方法でニトロセル ロース濾紙に移した。ゲルは、振動台上で２０分間、変性溶液（１，５Ｍ塩化ナ トリウム、α５Ｍ水酸化ナトリウム）で処理した。変性溶液を中和溶液（３，０ Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス　Ｈ（Ｊｌ　ｐＨ７，５）　に置き代え、４ ０分後、そのゲルｔ−ｐＨ紙でチェックした。中和後、ゲルを６×ＳＳＣ緩衝液 （ＳＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で１ ０分間処理した０ゲルと、ニトロセルロース紙を通し、６ＸＳＳＣ’ｉ、ペーパ ータオルの束で１５時間吸引することによＱＤＮＡ断片をゲルからニトロセルロ ース紙に移した。３晒りロマトグラフ紙２枚の間にフィルターを置き、アルミホ イールで、光った側を外側にして包み、真空オープン中８０℃で４時間乾かした 。

大腸菌　Ｒ−１３２３８および１６８型リボンームＲ，ＮＡに相補的な８２ｐ− 標識ＤＮＡを、鳥骨髄芽球症つイールス（ＡＭＶ）からの逆転写酵素を用いて合 成した。反応混合物は、５μにの０．２Ｍ　ジチオトレイトール、２５ｔ１．（ Ｄ　Ｉ　Ｍ　）　’）　スｐＨ８，０，８，３＃ｆｉ＋７）３Ｍ塩化カリウム、 ４０μにの０，１Ｍ　塩化マグネシウム、７０−タのアクチノマイシン、１４μ にの０．０４　Ｍ　ｄＡＴＰ。

ｌ　４　ｐｉ、の０．０４Ｍ　ｄＧＤＰ、　１４μλの０．０４ＭｄＴＴＰ。

および９６．７μにの水を含んでいた。次のものをプラスチック製チューブに加 えた：１３７．５μ２の反応混合物、１５μにの修生胸線プライマー（ｉ　０　 Ｗ／　＊　）　、７μλのＨ２Ｏ，３戒のｒＲＮＡ（４０ｐｙ１０Ｄ単位濃度を 用いると、２７６μり／μ℃となる）、４０μ込のデオキシシチジン　５ｒ　（ ３２ｐ　）三燐酸（１０−Ｃｉ／＊）、おヨ（ｊ　１３　＃ｊｉ（Ｄ　Ａ”Ｍ　 Ｖポリメラーゼ（ｆｉ９００単位／Ｓ、）Ｏ酵素反応を３７℃で１５時間行なっ た。その後、その溶液を５ｗｌづつのクロロホルムおよび調製フェノールで抽出 した。遠心分離後（ＪＳ１３．６０ＯＲＰＭ）、　水相を直接セファデックス■ Ｇ−５０カラム（１，５Ｘ２２偽）上に積層した。プラスチック製の１０−ピペ ットをカラムとして用いた。小さいガラスピーズ１個を先６５ 端に置き、ピンチ金具をつけたゴム管が装着され、１晩０．０５％ＳＤＳに浸し て膨潤した脱気Ｇ−５０を加えた。水相を壁に浴って直接Ｇ−５０に流し込み、 それから０．０５％ＳＤＳで溶出した。０．５　ｄずつの２０７ラクシヨンをプ ラスチック製バイアルに集めた。ピークフラクションを含むチューブは、３Ｈ− 識別器を用いて各試料毎に０．１分間計数を行い、全カウントを記録するセレン コツ計測法で発見した。ピークフラクションを合一した。アリコートをアクエシ ル■（市販で入手可）に加え、ｌ−当シの３２ｐのＣＰＭ（毎分力ウリボンーム ＲＮＡ遺伝子配列を含む断片を、フィルター上のＤＮＡを３２Ｐ　−ｒ　ＲＮＡ 　ｃ、ＤＮＡにハイブリッド化した後、オートラジオグラフィーによって検出し た。

フィルターを〜、）・イブリッド化混合液（３ｘＳＳＣ。

０．１チＳＤＳ、１００μｙ／ｄ変性および超音波処理した犬ＤＮＡおよびダイ ンハルト溶液（それぞれ０．２％の修生血清アルブミン、フィコール（Ｆｉｃｏ ｌｌ　）　、およびポリビニールピロリジン））中に、６８℃で１時間浸した。

３２Ｐ　ｒ　ＲＮＡ　ｃＤＮＡを４　ｘ　１０’　ＣＰＭ／＊の割で加え、ハイ ブリッド化反応液を６８℃で４８時間インキュベートした。それからフィルター を３ｘＳＳＣで洗い、次いでＯ６１％ＳＤＳで１５分間隔で２時間又は洗浄溶液 が約３．　ＯＯＯｃｐｍ　”Ｐ　／　ｄ　を含むようになるまで洗った。フィル ターを空気乾燥し、プラスチックラップで包み、コダックＸ−ＯＭＡＴＲフィル ムで一７０℃で約１時間オートラジオグラフィーを行った。

Ｂ、哺乳類実験。ムス・ムスキュラス・ドメステイクス（マウス）のｒ　ＲＮＡ プローブを１８Ｓ２よび２８８型および２８８型だけの［几ＮＡから合成した。

核酸をマウス肝から抽出し沈澱させた。高分子量ＤＮＡをスプールし、除去した 。残った核酸を遠沈法によρ集め、５０　ｍＭ　、　Ｍ　Ｐ　Ｃｎ　２および１ ００．Ｍ　トリス　ｐＨ７，４の緩衝液に溶かした。ＤＮＡ５ｅ　（ＲＮＡ５ｅ は含まず）を濃度５０１’ｊ／／匍になるまで加えた。混合物を３７℃で３０分 間インキュベートした。生成したＲＮＡを再抽出し、エタノール沈澱し、１ｍＭ 燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，８に溶解した。０．１　Ｍ　）リス　ｐＨ７，４ および０、　ＯＩ　Ｍ　ＢＤＴＡの５〜２０％スクロース勾配溶液を用意した。

試料を加え、その勾配をＳＷ４０回転子で７時間、３５ＫＲＰＭで回転させた。

フラクションを光学密度により集めた６既知の分子量マーカーとの比較により１ ８８および２８８フラクシヨンを選んだ。

すべての哺乳類実験で、リラックス（ｒｅｌａｘｅｄ　）　ハイブリッド化条件 を用いた。５４℃０洗浄処理は５４℃で行い、０．０５チＳＤＳを加えた３ｘＳ ＳＣで１５分間ずつ３回別々に洗った。

７ 参考実験１〜８に、ｒＲＮＡ情報含有グローブにて実施した実験を記載する。実 施例１〜３には、ヒストン遺伝子情報含有プローブ、トリプトファンオペロンｔ ｒｐ　Ｄ遺伝子情報含有グローブ、そしてα−フェトプロティン遺伝子情報含有 プローブを利用またコンピ−タシミュレーションをそれぞれ記載する。

ヌクレアごゼ分析によって定められる。

゛　□ 本実験例に用いられたＰ、アエルギノーザの数種の菌株は、種を同定する最少の 表現型特性を有する第２版、ＡＳＭ、１９７４．Ｉ）ｐ、２５０．２６９）　（ 第２表）。他に３つのシュードモナスおよび２つのアシネトバクタ−の（Ａｃ１ ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　）菌株を選び、種および属を比較した（第３表）。

第　２　表 菌株の比較のためＰ、アエルギノーザの最少表現１５１　１０７５２ ８０９、　７７０１ ８１０　８６８９ ８１１　８７０７ ８１２　８７０９ ８１５　１０１４５ １５５９　５ シー−トモナスおよびアシネトバクタ一種の比較のために用いた菌株は第３表に 列挙する。

第　３　表 種および属の比較のだめの、タイプ、ネオタイプおよび参照菌株に対応する閑株 ナンバ一種　ＦＬＨＡＴＣＣＮＣＴＣ菌株の状態Ｐ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　８ ．１５　１０１４５　１０３３２　タ　イ　プＰ、　５ｔｕｔｚｅｒｉ　２６０ １　１７５８８　ネオタイプＰ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　８１８　１３５２ ５　１００３８　ネオタイプＰ、　ｐｕｔｉｄａ　８２７　１２６３３　ネオタ イプＡ、ａｎｉｔｒａｔｕｓ　２２０８　１９６０６　タ　イ　フ。

Ａ、　Ｉｗｏｆｆｉｉ　４６２　７９７６　参　照アシネトバクタ一種を属を比 較するために選んだのは、それらが一定の属性を多くのシーートモナス種とＰ、 フルオレッセンス（Ｐ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）　１６．０１１０．０． ８．６．７．８．７．０；Ｐ、プチダ＜　Ｐ、　ｐｕＬｊ５１ａ　）２４．０． １５０．１０．０．８．９　；　Ａ、アニトラタス（Ａ、　ａｎｉ　ｔｒａｔｕ ｓ　）２０．０．１５．０．１２．５．９．８．７．８．６．１．５．２．４． ８．３．８．Ｚ８（最も小さい３断片の大きさは計算しなかった）；Ａ、ルオッ フィ（Ａ、　Ｉｗｏｆｆｉｉ　）　１２．０１１０．０、−６９− ９，１，７，０，６，４，５，７，５，５，５，３，４，８，４，４，３，６， ３，２，２，９（最も小さい３断片の大きさは計算しなかった）である。ＰＳＴ 　■消化物中の断片の大きさくキロベース対）を次に示す；Ｐ、ストウッゼリ　 ６．７．６．１．５．５：Ｐ、フルオレッセンス１０．０．９．４．７．８．７ 、０　；　Ｐ、プチダ１０．５．９．９．６．８．６．３．４．４　；Ａ、アニ トラタス３６．０．２８．０．２０５．１２０．１００．５．８．３．７．２． ６．２．４；Ａ、ルオッフィ９．９．８．７．７２．５．７．４．０．３．２． １７゜ Ｐ、アエルギノーザの７菌株から得られた・・イブリッドを形成した制限断片を 比較すると、この種は、１０１．９．４．７．６および５９キロベース対（ＫＢ Ｐ’）の、ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む断片のＥｃｏＲＩ−特異的組み合わせによ って定められる、という結論に達する（第１図）。

７、６　ＫＢＰ　ＥｃｏＲＩ　断片は、この試料では７菌株中４菌株にあられれ る。同様な情況が種の菌株のいくつかの表現型特性の中にもおこる。７菌株から の断片のＥｃｏＲＩ組み合わせがその呵株を２群に分けるために用いられるとい う事実は、Ｐ、アエルギノーザの最少表現型特性をもつ２つの種があるという推 論をひき出す。ＤＮＡをＰＡＴ　Ｉで消化した実験結果（第２図）からｓ　Ｅｃ 　ｏ　ＲＩ　７．６　ＫＢＰ断片によって示される菌株の変異は棟内の変異を表 わす、という結論を導く。な９．４．７，１．６，６および６．４　ＫＢ　ｐが あって、それがその種を定めているからである。９４および６．６ＫＢＰのＰＡ Ｔ　Ｉ　断片は、Ｐ、アエルギノーザの７菌株〜中６菌株に６られｉル；７．１ オ、１：び６４ＫＢＰ　ＰＳＴ　Ｉ断片は試料とした菌株のすべてにあられれる 。ＰＳＴＩ断片の変異は、ＥｃｏＲＩ　７，６ＫＢＰ　断片を含まない菌株にお こる；ＲＨ１５１は１０．１および８．２ＫＢＰ断片をもちｓ　ＲＨ８０９は９ ．４　Ｋ　Ｂ　Ｐ断片を含まないで、６．．０ＫＢＰ断片をもっている。そして タイプ菌株のＲＨ８１５は６゜６ＫＢＰ断片を含まない。ハイブリッドを形成し た断片のパターンは、酵素に特異的な保断片の変異があっても、それは同定化を 妨害するものではなく、疫学的研究に役立つことを証明するものと言える。

Ｐ、アエルギノーザ歯株におけるＢｃｏＲＩ　７．６ＫＢＰ断片の変異発生は、 他のシュードモナス種のタイプ菌株に見出されるハイブリッド形成ＥｃｏＲＩ　 断片を試験することによって展望的に考えられるかも知れない（第３図）。Ｐ、 ストウツエリ、Ｐ、フルオレッセンスおよびＰ、プチダのタイプ菌株は７．６　 Ｋ　Ｂ　Ｐ断片を含まないが、同じ大きさのＥｃｏＲＩ　断片を共通してもって いる；Ｐ、アエルギノーザおよびＰ、ストウ７１− ツエリは９．４　Ｋ　Ｂ　Ｐ断片を有し、Ｐ、ストウラエリおよびＰ、フルオレ ッセンスは１６ＫＢＰ断片を有し、Ｐ、フルオレノ、センスおよびＰ、プチダは ｌ０ＫＢＰ町斤をもっている。一般に断片の大きさは４つのシュードモナス種の タイプ菌株各々に特有なものである；そして各々の種のタイプ菌株はそれぞれ異 なるサイズ範囲の断片を有する。これらの一般的説明はＰＳＴＩ消化物について も言える（第４図）。

４つのシュードモナス種および２つのアシネトバクタ一種のそれぞれの断片パタ ーン又はそのＩ菌株を比較する場合、各属の種は似ているが、属同志は異なると 結論づけることができる。２つのアシネトバクタ一種は４つのシュードモナス種 に比べて、ハイブリッド形成断片サイズの範囲がより大きい。

大ｉ菌、バシルス・スリンシネンシス（Ｂａ’ｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅ ｎｓｉｓ　）およびＢ、スプチリス（ｆ３．５ｕｂｔｉｌｉｓ）で得られるよう な制限酵素地図の助けがなければ、どこで酵素がｒ　ＲＮＡ遺伝子を切るのか、 １ゲノムあたりのコピーの数および複数の遺伝子又は不均質遺伝子間に非相同性 フランキング部（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　）があるのかを予想する ことは不可能である。大腸菌のｒ几ＮＡｃＤＮＡプローブはｒＲＮＡ遺伝子配列 を含む若干の制限断片とはハイブリッドを形成しないかも知れないし、もしそう ならば、これは試験有機体と大腸醒との間に進化的距離又は分散があることを反 映している。ｒ　ＲＮＡの保存性質を用いてこれがその場合にあたらないと論す ることができる。しかしながらこれらは未知のいかなる種にも等しく適用できる 標準プローブがあるという利点に比べれば小さい問題である。

本研究に用いた菌株は第４表および第５表に列記する。

第　４　表 Ｂ、スプチリスのネオタイプ菌株および下級類似物（ｊｕｎｉｏｒ　ｓｙｎｏｎ ｙｍｓ）のタイプ菌株のそれぞれの菌株ナンＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　３０２１ 　６０５１　ネオタイプＢ、ｕｎｉｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ　２９９０　１５１ ３４　タ　イ　プＢ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕａｆａｃｉｅｎｓ　３０６１　２３３ ５０　タ　イ　プ７３ 第　５　表 ３０６３　Ｂ−３５４（ＮＲ８−２３１）　６６３３３０６４　Ｂ−３５６（Ｎ Ｒ８−２３８）　７０６７３０６５　ＮＲ８−２６５６４５５ ３０６６ＮＲ８−６５９７０６０ ３０６７ＮＲ８−７３０７００３ ３０６８ＮＲ８−７３７９４３ ３０６９ＮＲ８−７４１４３４４ ３０７０ＮＲ８−７７３８１８８ ３０７１ＮＲ８−１１０６４９４４ ’３０７２　Ｎｆ（、Ｓ−１１０７７４８０高分子量ＤＮＡが客々の菌株から分 離された。ＲＨ３０２１およびＲＨ２９９０の標識化ＤＮＡを用いて液体Ｄ　Ｎ −ＡＩＪ−；−Ｄ−Ｎ人ハイブリダイゼーションデータを集めた。

結果を第６表に示す。

第　６　表 標識化ＤＮＡプローブと、Ｂ、スブチリスの菌株かこのデータは二つのハイブリ ッド化群があることを示す。同様なデータが、Ｂ、スプチリスについて文献に報 告されている（８ｅｋｉ　ｅｔ　ａＬ　ｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕ ｒｎａｌｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｊ２５　： 　２５８−２７０（１ｇ７５））。これら２群をＲＨ３０２１および几１−１２ ９９０によって代表させることができる。リポソームＲＮＡ遺伝子の制限エンド ヌクレアーゼ分析が行われる時ＥｃｏＲＩ　消化物（第５図）は２群に分けるこ とができた。ｌａ　Ｈ３Ｏ２１によって代表される群は二つの強くハイブリッド 化する断片を有する（２１５および２．ＩＫＢＰ）。　ＲＨ２９９０によって代 表される群は二つの強くハイブリッド化する断片（２，，６および２．５ＫＢＰ ）を有する。

ＥｃｏＲＩ　データを用いてＢ、スプチリス菌株をＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド 化群の適当な所に置くことができる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化７０％ルー ルによれば、Ｂ、スプチリスは実際には二つの種である。しかしながら、ＰＳＴ 　Ｉ　データ（第６図）を考慮すれば、それらのグループを、共通の祖先又は種 属形成事象にかかわった二つの分散する集団と考えることができる。

Ｂ、スプチリスは１つの種であるとする結論は表現型データと相関している。第 ５表に並べた菌株は、ゴートンＲ，Ｅら著のｒＴｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ＪＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａ−ｎｄｂｏｏｋ　Ｎｏ　４２７　（ア メリカ農務省、農業リサーチサービス　ワシントンＤ−Ｃ−１ｐ３６−４１でＢ 、スブチリスと同定されている。制限分析は、ＤＮＡ−ＤＮＡバイブ５ リッド化データに匹敵するデータを用意することができるし、又、適切な酵素を 選ぶことによって、制限分析は分散にもか′かわらず種を十分に定めることがで きる。ＲＨ３０６１はＰＳＴ　Ｉサイトを失った。しかしながらＥｃｏＲＩ　デ ータは、その菌株がＢ、スプチリスであることを示唆する。同じことがＢｇｔ　 ＩＩデータ（第７図）およびＳａｃ　Ｉデータ（第８図）から結論づけられる。

バシルス　ボリミ力（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ　）実験第　７　 表 Ｂ、スプチリスおよびＢ、ポリミヵのネオタイプ株Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ３０ ２１　６０５１　ネオタイプＢ、　ｐｏｌｙｍｙｘａ３０７４　８４２　ネオタ イプＢ、　ｐｏｌｙｍｙｘａ３０６２　ＮＲ８１１０５ネオタイプＢ、　ｐｏｌ ｙｍｙｘａ３０７３　Ｎ几Ｓ−１１０５から派生した無胞子性突然変異体 Ｂ、スプテリスおよびＢ、ポリミカは、ＥｃｏＲＩデータ（第９図）、ＰＳＴ　 Ｉデータ（第１０図）Ｂｇｌ■データ（第１１図左）およびＳａｃ　Ｉ　データ （第１１図右）によって区別すると七ができる。ＰＳＴ　Ｉ　帯パターンにおけ る大きい差から、パシルス・ボリミヵは間違った属に入っていると結論づけるこ とができる。

両方の種は共に胞子を生成するが、それらは表現型的には似ていない。ＡＴＣＣ およびＮ几）ＬＬ両方の培養コレクションのＢ、ポリミカのタイプ菌株は同じ帯 パターンをもつことは確かである。しかし重要なデータは無胞子性突然変異体が 同定できるということである。もしそれらが胞子を作ることができないならばバ シルス種を同定することは非常にむずかしく、多分不可能だろう。

スイスマウス、ムス・ムスキュラス費トメスティクス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕ ｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ　）　（同系交配株）にストレプトコッカス°ニュー モニエ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅ’ｕｍｏｎｉａｅ）ＲＨ３０７７ （ＡＴＣＣ６３０３）の混濁懸濁液０．５　ｄを腹腔内に接種した。マウスが瀕 死の状態になった時、心臓、肺、肝を摘出した。高分子量ＤＮＡをこれら組織、 Ｓ、ニューモニエＲＨ３０７７およびスイスマウス器官から分離し、ＤＮＡを消 化するためのＥｃｏＲＩ　を用いて、ｒ　ＲＮＡ遺伝子の制限エンドヌクレアー ゼ分析の操作を行った。フィルターを３ＸＳＳＣで洗う以外に、２×１５分間　 ０．３　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃおよび０，０５チ８Ｄ８で洗った。オートラジオグラフ ィーを４８時間行った。データ（第１２図）は、Ｓ、ニューモニエが７ケのノー イブリッド形成断片によって定められることを示した（　１７．０、７７ ８．０．６．０，４．０．３３．２６および１．８ＫＢＦ）。

この細菌のｃ　ＤＮＡグローブは２つのマウスＤＮＡ断片（１４０および６．８ 　Ｋ　Ｂ　Ｐ　）とはちまり゛ハイブリッド化しない。ハイブリッド形成断片は 感染組織におけるＳ、ニューモニエの存在を知らせるものである。心臓ＤＮＡ抽 出物中には７帯すべてが見られる。肝ＤＮＡ抽出物中ではそれらの強度はよシ小 さいが、オートラジオグラフィーによシ全部を見ることができる。肺ＤＮＡ抽出 物中には６．０　Ｋ　Ｂ　Ｆ帯のみがあられれる。肺に細菌の数が少いのは、そ のマウスが肺炎よりむしろ敗血症にかかってやるためと説明することができる。

肺は培検で同質化を示していなかった。この検定の感度を調べるために、細菌Ｄ ＮＡをマウスＤＮＡで稀釈し、電気泳動にかけた。０１μ９細菌ＤＮＡを用いる と、７つの帯すべてをオートラジオグラフで見ることができた。１０／１９細菌 ＤＮＡでは、１７．０，８−０および・６、０．　Ｋ　Ｂ　Ｐ帯が見られた。１ ０　Ｓ、ニューモニエ細胞委たり６Ｘ１０　μｉｌｌ　ＤＮＡという数字を用い ると（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　２６：６Ｂ）、１０　μ ｌＨｊ：　２　Ｘ　１０　ＭＢ胞に相当する。拳法はこの感度レベルで感染症の 診断に役立つものである。

この参考実験も、細菌グローブがマウスに特異的なＥｃｏＲＩ　断片とハイブリ ッド化することを示している（第９図参照、１４０および６．８ＫＢＰを持つ断 片）。

これらの断片はマウス１８８および２８８型リボンームＲＮＡグローブによって 検出されたＥｃｏＲＩ断片に対応する（第１４図、前記は６．８　Ｋ　Ｂ　Ｐ断 片が２８８型ｒ几ＮＡ配列を含むことを示す。）細菌グローブは、哺乳類リポソ ームＲＮＡ遺伝子配列とはあまシよくハイブリッド化しないので、帯は強度がよ り小さく、細菌グローブおよび核唾乳類１）ＮＡＯ系は感度がより小さく、感染 している前核細胞のＤＮＡに対する選択性がはっきりあられれる。細菌プローブ をレーン＜１ａｎｅ）当シ１０μ９消化細菌ＤＮＡにハイブリッド化させた実験 で、細菌の帯は明らかに見えた時でもル−ン当り１０μ９消化ヒト又はマウス１ ）ＮＡに対するハイブリッド形成は発見されなかった。

これらの参考実験は、ｒＲＮＡ制限分析によって有機体を確認するという概念が 、細菌のみならず複雑な真核有機体にも成功裡に適用はれることを説明するもの である。

第１３図は哺乳類の属がムス・ムスキュラスードメスティクス１８Ｓおよび２８ ８型ｒ　、ＲＮ　Ａグローブで確認できること、およびムスのいくつかの種が区 別できることを示す。この図では、酵素はＰＳＴ　Ｉ　で、対象物およびそれぞ れの帯は次のようである。

ｍｅｌｏｓｓｉｎｕｓ）　（マウス）　１４．５．１３．５．２．６．７・り ２ムス・六スキュラス・、ドメスティクス（マ゛ウス゛）１　３、５．、　２． ６ ３・力０ス°フデミリアリスｚ（（ｃａｎｉｓ　ｆａｍｉ’１ｉａｒ・ｉｓ）　 （犬・）１２．０ ４・カビア０ポルセルス（Ｃａｖｉａｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）　’、（モルモット 　）　１７０　、　１　４．０．　１　３．０．　８．８　、　５７　、　４． ７　および３．θ以下の帯１個 ５クリセトウラス°グリセウス（Ｃｒ１ｃｅｔｕｌｕｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　）（ ハムスター）２５．０，４．７ ６、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ　）　（ヒト）１５．０゜５ ．７ ７７エリス・カタス（Ｆｅ１ｉｓ　ｃａｔｕｓ　）　（猫）２０．０．９．．７ ８ラタス°ノル６ジカス（＆ｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ　）　（ラット）　 ２５ ９、ムス・ムスキュラス・ドメスティクス（マウス）１３．５．２．６ １０ムス・セルピコロー・セルピコロー（Ｍｕｓ　ｃｅｒｖｉｃｏｌｏｒｃｅｒ ｖｉｃｏｌｏｒ　）　（７ウス）１４．０，２．７几ムス・セルピコロー°バベ ウス（Ｍ　ｕｓ　５ｅｒｖｉｃｏｌｏｒｐａｐｅｕｓ）　（−ｒウス＞　１３． ５．２６１２、ムム・パハリ（Ｍｕｓ　ｐａｈａｒｉ　）　（７ウス）１３．０ ．３．７１３、ムス・コツキイ（Ｍｕｓ　ｃｏｏｋｉｉ　）　（−ｒウス）　１ ３．５．２．６ 第１４図はマウスおよび猫ＤＮＡが、２８ｓ型ｒＲＮＡ　ｃＤＮＡのみによって 区別できること、およびハイブリッド化した帯のパターンがグローブ配列の構成 、に４依７存することを示す。第１４図では酵素はＩＥｃｏＲＩで１、対象胸お まび、帯は次のようである。

１、　ムス・・ムスキュラス・ドメスティクス（マウス）田、　８　、に８・Ｐ ２　フエリス・カタス（猫）８．３ＫＢＰ第、１５′図では酵素は５ａｃＩ、対 象物および帯は次のス猿）　８．５．３．７．＜３．０ ２ラタス・ノルベジカス（ラット）２５０％９．５．３．６、〈３０ ３ムス′・ムスキュラス・ドメスティヵス（マウス）６８、〈３．０ ４フエリス・カタス（猫）９．５．５．３．４．０．＜３．０゜＜−３，０ ５、ホモ・サピエンス（ヒト）１ｏ５、＜　３．０６マカカ・ムラツタ（Ｍａｃ ａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ　）　（Ｌ’−ザス猿）９．８、〈３０ 第１５図（Ｓａｃ　１　消化）をその他の哺乳類の図と比較する時、ハイブリッ ド形成パターンが酵素に特異的であることがわかる。

第１６図は霊長類（ｐｒｉｍａｔｅｓ　）の動物が区別できることを示す。培養 細胞は、その元の種の組織と共通した帯を有し、異なるヒト培養細胞は帯が加わ ったり欠け８ま たシすることによって区別することができる。この図では、酵素はＥｃｏＲＩ　 で、対象物および帯は次の通シである。

１、エリスロセバス・バタス（ハタス猿）　＞　２２．０　。

１１．０、？、６．２．．６ ２、マカカ・ムラツタ（レーザス猿）２ＺＯ１１１，５、６ ３ホモ・サピエンス（ヒト））２２．０１２２．０，１６１６．０、＆　１．６ ．６ ４、　Ｍ　２４１／８８（ランガー猿　培養細胞）１４．０，７．２．５．７ ５、Ｈｅ、Ｌａ　（ヒト培養細胞）＞＆１，６．０も、Ｊ９６　（ヒト培養細胞 ）＞２２．０，２２．０１１６．０゜１　１．０．８．１．６．６ ７、ＡＯ（ヒト培養細胞）　ｌ’−０，１６，０，８，１，６６実施例に つの動物種（うにとマウス）の同定と特徴づけに関スるコンピュータシミュレー シミンをＨ４ヒストン遺伝子から得た保存ＤＮＡ配列を用いて実施した。

うに（Ｐｓａｍｍｅｃｈｉｎｕｓ　ｍ１ｌｉａｒｉｓ）に関するヒストンＨ４遺 伝子配列を以下に示す。ここで、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇは既知のヌクレオチドで表わし 、Ｎは現在知られていない部位を表わす（７８８塩基対）。

３ 類似したマウスＨ４遺伝子配列を以下に示す（９６８塩基対）。

−８５− 両者の前述の配列に関する相同の領域を以下に示す。

ここで、アステリスクは相同部位でないことを表示している。示した領域中、最 初の１１８塩基対は８０５チの相同性を有し、この実施例で保存ＤＮＡ配列プロ ーブとして用いられる（うに（上段）の塩基部分−４４９〜５６７番目を、マウ ス（下段）の塩基部分は２５７〜３７５番目に示した）。

８６− ＊　＊＊＊　＊　＊＊＊＊　＊＊＊ ＣＧＧＣＴＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣ−−ＴＴＧＧＣＴＡ　７８０ＡＧＧＣＴ Ａ−−４ＡＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＴ−−ＣＡＡ　５８４％＝８４．５０３ Ｆ（３４４２８９）＝、０００に＋００　Ｅ＝、０００制限工ンドヌクレアーゼ 切断部位を二つの配列から決定した。うにとマウスの配列における切断部位の一 覧を以下に示す。カッコ内に部位基がなければ、数字は切断部位のぎ側を示し、 認識部位のみは既知であることを示す。

７ 配　列　出現部位 ＡｃｙＩ　（ＧＰＣＧＱＣ）　４ｇ５ ＡＩｕＩ　（ＡＧＣＴ）　１４７　２６７ＡｓｕＩ　（ＧＧＮＣＣ）　２７７　 ５１４ＡｖａＩＩ　（ＧＧＬＣＣ）　５１４ ＣａｕＩ■（ＣＣＭＧＧ）２７６３７７Ｄｄｅ■（ＣＴＮＡＧ）３９６４２７ ｎｐ　ｎｒ−（ＧＡＴ　Ｃ）　３２６ Ｅ（ｏＢｌ蒼（Ｐ　ＰＡＴＱＱ）１８４ＥｃｏＲＩＩ　（ＣＣＬＧＧ） ３１ Ｆ・・４Ｈ■（ＧＣＮＧＣ）２５４ ＨａｅＩＩ　（ＰＧＣＧＣＱ＞　４９８ＨｇｉＣＩ（ＧＧＱＰＣＣ）４９４ ＨｇｉＪ■■（ＧＰＧＣＱＣ）４８３ ＭｂｏＩ　（ＧＡＴＣ）　３２４ Ｍｎ１Ｉ　（ＣＣＴＣ）　２６７３４２Ｍｎ１Ｉ　（ＧＡＧＧ）　４　４２　５ ４２８０２９９３１１３７２　４６３　４８４ Ｎａｒｌ　（ＧＧＣＧＣＣ）　４９５ ＮｓｐＢＩＩ　（ＧＣＭＧＣ）　２５６ＰｖｕＩ　（ＣＧＡＴＣＧ）　３２７ ＳｃｒＦＩ　（ＣＣＮＧＧ）　２７６３７７５３３ＳｆａＮＩ　（ＧＣＡＴＣ） 　４０９５２７ＴａＱＩ　（ＴＣＧＡ）　１１７３２７マ　ウ　ス 配　列　出現部位 ＡＣ）’Ｉ　（ＧＰＣＧＱＣ）　３０２５７１ＡｆｌＩＩ　（ＣＴＴＡＡＧ）　 ７３１ＡＩＬＩＩ　（ＡＧＣＴ）　２３４２５６６４８８１５８５５ＡｓｕＩ　 （ＧＧＮＣＣ）　１８４５４０６１１６２２ＡｖａＩＩ　（ＧＧＬＣＣ）　１８ ４ ＢｓｓＨＩＩ　（ＧＣＧＣＧＣ）　１６２ＣａｕＩＩ　（ＣＣＭＧＧ）　１３５ ＤｄｅＩ　（ＣＴＮＡＧ）　８０３８４０ＤｐｎＩ　（ＧＡＴＣ）　１９０ （ＥｃｏＢ）（ＡＧＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＡ）　７６６（Ｅｃｏ、ｐｌ）　 （ＡＧＡＣＣ）　４１８４９６８８２（Ｅｃｏｐｌ）　（ＧＧＴＣＴ）　２８５ ７７１８９ （Ｅｃｏｐ１５）　（ＣＡ（３ＣＡＧ）　７６５ＥｃｏＲＩ　（ＧＡＡＴＴＣ） 　２ ｈ　ｃ　ｏ　ＲＩ蒼　（ＰＰＡＴＱＱ）　４７９０８４５Ｅｃｏ几ＩＩ　（ＣＣ Ｌ（３Ｇ）　３３８３６８４４３５３６上’ｎｕ４ＨＩ　（ＧＣＮＧｃ）　３６ ６　５４３　５７４　５７７ＦｎｕＤＩＩ　（ＣＧＣＧ）　１６２１６４３８０ ４６１６８２ＦｏｋＩ　（ＧＧＡ’Ｅ’Ｇ）　５２６９０５　’９１０ＦｏｋＩ 　（ＣＡＴＣＣ）　１１１３２２３４６４４２５８７７１】４８ ＨａｅＩＩ　（ＰＧＣＧＣＱ）　３０５３１２５３７ＨａｅＩＩＩ　（ＧＧＣＣ ）　４０４５４２６１２６２４ＨｇａＩ　（ＧＡＣＧＣ）　４７２５７ｇＨｇｉ ＡＩ　（ＧＬ（３ＣＬＣ）　４８５ＨｇｉＣＩ　（ＧＧＱＰＣＣ）　２１３０１ ＨｇｉＪＩＩ　（ＧＰＧＣＱＣ）　１３５ＨｈａＩ　ＣＧＣＧＣ）　１６４　１ ６６　３０４３１１　３８０３９５４９４　５３６ ＨｉｎｆＩ　（ＧＡＮＴＣ）　６９２ ＨｐａＩＩ　（ＣＣ（３Ｇ）　’　７８１３５４０１ＨｐｈＩ　（ＴＣＡＣＣ） 　、　２２０　３３９４６２４９５Ｍｂ　ｏ　Ｉ　（ＧＡＴＣ）　１８８ ＭｂｏＩＩ　（ＧＡＡＧＡ）　１０５　１２４ＭｂｏＩＩ　（ＴＣＴ′ｌ’Ｃ） 　６２９Ｍｎ１Ｉ　（ｃｃ’Ｉ’ｃ）　２０２２２７２３６４１５５５９Ｍｎ１ Ｉ　（ＧＡＧＧ）　３　７６　２６１　４０７５５５ＭａｒＩ　（ＧＧＣＧＣＣ ）　３０２ ＮｓｐＢＩＩ　＜ＧＣＭＧＣ＞　３６８５４５５７６５７９ＰｖｕｌＩ　（ＣＡ （３ＣＴＧ）　２３４ＲｓａＩ　（ＧＴＡＣ）　５２３６６８ＳａｃＩＩ　（Ｃ Ｃ（３０ＧＧ）　６８３ＳｃｒＦＩ　（ＣＣＮ（３Ｇ）　１３５３４０３７０４ ４５５３８ＳｆａＮＩ　（ＧＡＴＧｃ）　１２７ ＳｆａＮＩ　（ＧＣＡ’ｉ’Ｃ）　３８５７５１ＴａＱＩ　（ＴＣＧＡ）　４０ ＴｔｈｌｌｌＩ　（ＧＡＣＩＮＮＮＧＴＣ）　４６６ＴｔｈｌｌｌＩＩ　（’ｌ ［’ＧＱＴＴＧ）　９５３ＸｍｎＩ　（ＧＡＡＮＮＩＮＮＴＴＣ）　４３９うに とマウスの配列は、　Ｈｈａ　Ｉ　（ＧＣＧＣ）と既述のグローブ配列間で比較 される。ウニ配列は２０２塩基対（ｂｐ）断片をつくるように、２９５と４９７ 番目の部位に切断部位を有しており、変性すればグローブ配列とハイブリッド化 する。マウス配列のＨｈａＩ（ＧＣＧＣ）部位（１６６，３０４，３１１および ３８００部位）は、６９と１３８の断片がグローブ配列で検出できることを示し ている。このように、うにの遺伝的特徴づけは２０２であり、マウスの場合は６ ９と１３８である。

１ 実施例２ プローブ　てト１プトフ　ンオペロンのｔｒ　Ｄ遺伝子の使用プローブとしてｔ ｒｐ　Ｄ遺伝子を使って、実施例１と同ｅにコンビーータシミーレーションを実 施した。これで、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　とサルモネラティフィムリウム （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　）が保存配列を含む制限断 片で識別され得るという結論を与える。

６８４塩基対（ｂｐ）の大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ｔｒｐ　Ｄ遺伝子を以下に 示す。

３６０　３７０　３８０　３９０　４．００６８３塩基対のサルモネラティフィ ムリウムｔｒｐ　Ｄ遺伝子を以下に示す。

９３ ５１０　５２０−　５３０　５４０　’　５５０５６０　５７０　５８０　５９ ０　６００６１０　６２０　６３０　６４０　６５０６６０　６７０　６８０ 両配列間の相同領域を次に示す。ここで、上段の配列は大腸菌であシ、下段の配 列はサルモネラティフィムリウムである。

實、〜ＬＯＯＡＴＧＡＡ■■弘胃百胱田Ｃ貞則λ仰ＣＷγひ、「Ｃ傾葦官ｍ后匪 バＣＡ−０：１ＡＴＴＡＡＱ１）０００人ＴｒｒＯＡ人ｃｍａん’ＩＩＪ１１） ７０人［ＡＯ］’ｒＧに■シＶ匡Ｋ（ｌ１ａ％−７８，３９＋０ Ｐ（２３６，１８５）−，０００Ｅ＋ＯＯＢ出、０００ＡＴＯＡＴＧＯＡ（ＷＩ ）ＡＧＡＯＯＩＩＴ−（７ＩＧＡ’ｌＸＩＫ３（７１ＧＡＴＡＴｒｍＡＴＡＡＯ ＡＴワＧＡ０Ｔ０３ＴＴ−ＯＡＣｒｎＸＩＧＡ−ＡＱ）（■鵬ＮｎＡＱＣｎＭＪ ３−ＡＡＯＣＩＡＡ−（ＤＯＴＯＡＴＡＡ四川望■ＡＣＫＸ用ＴＡＡｏｏＡＴＡ −ＡＧＡＣＧｏ’ＩＴ人−ｅＡＴ（Ｅ）σ■χト（ＧＡＯｋＡｆｍＡ−ＡＡＡ請 Ｔ００ＡＡＡ−Ｇｃｘ７Ｉ１００ＡＧｃｌＡ刊ｎ肛Ｎ■Ｍ、αχＨ℃皿ロ田α工 ０チー８０．２１５ Ｐ（４６５，３７３）＝　、０００Ｅ＋ＯＯＥ＝、０００両配列間制限部位を以 下に示す。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　） ＨｐａＩＩ　（ＣＣ（３Ｇ）　１８７　２２９　２５４　２７２２８３　４４３ ４６３　５０２　５０６　５９２ ＨｐｈＩ　（（３Ｇ’ｌ”ＧＡ）　１７７　５５２ＨｐｈＩ　（ＴＣＡＣＣ）　 ２８５５９７ＭｂｏＩ　（ＧＡＴＣ）　１３５　５６４サルモネラ　ティフィム リウム（Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉνｍ）ＨｐａｌＩ　（ＣＣα３）　１８７． ２４８　２５３　２８３　４４３　４６３　５０６ＨｐｈＩ　（ＧＧ’Ｉ’ＧＡ ）　１７７　５５２ＭｂｏＩ　（ＧＡＴＣ）　１３５　２０４　３１７　５６４ ＭＩＩＩＩ　（ＣＣＴＣ）　４１７ 大腸菌配列は１３５と５６４に１ｎｂｏ　Ｉ　（ＧＡＴｅ）部位を有、している 。領域１左２のグローブで検出されうる４２９−塩基対断片が存在する。同じ酵 素は、サルモネラ　ティフィムリウムの１３５，２０４．３１７　および５６４ の位置にもある。二つの相同領域のグローブは６９、・１１３および２４７塩基 対断片を検出する。

このように、このプローブと酵素による大腸−の同定遺伝的特徴づけは４２９で あシ、サルモネ２　ティフィムリウムのそれは６９，１１３１．２４７である。

この実施例はヒトとラットのα−フェトプロティン遺伝子配列の中の相同領域（ エンドヌクレアーゼＭｎ　ｌ　Ｉ　（ＧＡＧＧ）の使用を示すものである。

ヒトのα−７エトプロテインメツセーゾｅＤＮＡ（１５７８塩基対）は以下の如 くである。

ｉｏ　２０　３０　４ｏ　ｓ。

６０　７０　８０　９０　１００ ９７ ４６０　４７０　４８０　４９０　５００５１０　５２０　５３０　５４０−　 ５５０５５０　５６０　５８０　５９０　６００６６０　６７０　６８０　６９ ０　７００７１０　７２０　７３０　７４０　７５０８１０　８２０　８３０　 ８４０　８５０８６０　８７０　８８０　８９０　９００９１０　９２０　’　 ９３０　９４０　９５０１０１０　１０２０　１０３０　１０４０　１０５０１ ０６０　１０７０　１０８０　１０９０　１１００１１１０　１１２０　１１３ ０　１１４０　１１５０１１６０　１１７０　１１８０　１１９０　１２００１ ２１０　１２２０　１２３０　１２４０　１２５０１２６０　１２７０　１２８ ０　１２９０　１３００１３１０　１３２０　１３３０　１３４０　１３５０９ １３６０　１３７０　１３８０　１３９０　１４００１４１０　１４２０　１４ ３０　１４４０　１４５０１４６０　１４７０　１４８０　１４９０　１５００ １５１０　１５２０　１５３０　１５４０　１５５０１５６０　１５７０ ラットのα−７エトプロテイン３′エンドｃＤＮＡｉｊ以下の如くである（５４ ０塩基対）。

６０　７０　ｇｏ　９０　’　１００ 両者の相同性の領域は以下の如くである（ヒト二上段、ラット：下段）。

チー８ａ８４５ Ｐ（２１９，ｚｇｓ）＝、ｏｏｏｇ＋ｏｏ　’Ｂ＝、０００１０１ ヒトとラット両者間の制限部位は以下の如くである。

ヒ　ト ＭｂｏＩＩ　（ＧＡＡＧＡ）　１０８２６１３２８１０６６１０６９１２３０Ｍ ｂｏＩＩ　（ＴＯＴＴＯ）　８８１９１６１３６１１４４９Ｍｎ１Ｉ　（ＯＯＴ Ｏ）　２７３５７４１１９０１２００１２１９１２４５１４３９Ｍｎ１Ｉ　（Ｇ ＡＧＧ）　４４４７３５８４４９６５３８８７１０７０１１６２１２５０１２７ ４１３７８１４０２１４３６１５４４ＭｂｏＩＩ　（ＧＡＡＧＡ）　４３５ ＭｂｏＩＩ　（ＴＣＩ’ＴＯ）　、１６８Ｍｎ１Ｉ　（ＯＯＴＯ）　１００１５ ９３２３Ｍｎ１Ｉ　（ＯＡ、ＧＧ）　３９９８１２２２６７３５７３８４４１２ 保存配列部分を含む断片（２４，３４，１０４および１０８塩基対）が、ヒトＤ ＮＡ′Ｉｒ：記述するものであることは計算できる。また、断片２４，５９．９ ０および１４５塩基対はラットＤＮＡｆ、記述する。一方、列間列は２４塩基対 断片を含み、それは、重要な断片の組み合せ（ｓｅｔ　）（分類学上の特徴）で ちる。

１０；、４ 二 檀チー−９・・　― １゜。ｅＨ，＠ｍ　Ｎ 、、、、　、、　ｓＪ　ｈ　Ｉ ＬシＯεＨ日−１％ ８１０８８Ｍ　ｍ　１ ｏｔｏｅ　Ｈｕ　：”：’、’７１％　’８９０εＨ，ｌｌｌｔ１ｍ ＦＩＧ、　８ エ　エ　エ　エ　エ　エ　エ　エ　エ　エ　エ　エ　ＩＣｃ　匡　匡　工　ζ　 匡　ご　匡　α　匡　匡　匡匡・ξ゛・、゛」 （６ ＦＩＧ、　１１ 臣　臣　歪　臣 ”　−一 ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、　１３ ２ ＦＩＧ、　１５ １２３４５６７８ ＦＩＧ、　１６ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　未知有機体の遺伝子材料の既知の位置と対応して該未知有機体の遺伝子材料 の進化的な保存配列の一部又は全部の位置を決定し、（既知プローブ有機体のま たはそれ由来のリポソームＲＮＡ情報含有核酸とハイブリッド化又は再対合して いる未知有機体からの、制限エンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡｏクロマトグラフパ ターンを決定する方法を除く）、それによシ該未知有機体の同定のための遺伝子 的特徴づけを得、そして、当該保存配列由来の同定のための遺伝子特徴づけの少 なくとも２つの組み（既知の有機体種を定義している組み合せの各々）からの情 報と特徴づけを比較することよりなる未知有機体槽を特徴づける方法。 ２　既知の位置が、一つあるいはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に よって定められる請求の範囲第１項の方法。 ３、遺伝子材料がＤＮＡである請求の範囲第１項の方法。 ４、テロープ有機体又はそれ由来の又は一致配列の保存ＤＮＡ配列情報含有核酸 とノ・イブリッド化又は再対合している未知有機体からの制限エンドヌクレアー ゼ消化ＤＮＡのクロマトグラフパターンと、少な０３ くとも二つの異なる既知有機体積の相当するクロマトグラフパターンを比較する ことよ＃）々る請求の範囲第１項の方法。 ５、保存ＤＮＡ情報含有核酸が検出可能なように標識化されたものである請求の 範囲第４項の方法。 ６、保存ＤＮＡ情報−含有核酸が放射性標識化又は金属標識化されたものである 請求の範囲第５項の方法。 Ｌ　保存ＤＮＡ情報−含有核酸プローブが、ＲＮＡプローブでろる請求の範囲第 ４，５または６項のいずれかの方法。 ＆　保存ＤＮＡ情報−含有核酸プローブが、ＲＮＡと相補的なりＮＡである請求 の範囲第４，５または６項のいずれかの方法。 ９、保存ＤＮＡ情報−含有核酸プローブが、ＲＮＡと相補的な切れ込み翻訳また はクローン化ＤＮＡによって得られるＤＮＡである請求の範囲第４，５または６ 項のいずれかの方法。 １０、特徴づけされる未知有機体が試験管内培地中の菌株の１個の細胞又は複数 の細胞である請求の範囲第１項から４項いずれかの方法。 １１、特徴づけされる未知有機体およびプローブ有機体１０４ が両方共、界、豆稈、類、豆類、門、豆量、綱、亜綱、目、科、族又は属からな るものである請求の範囲第１項から４項のいずれかの方法。 １２、特徴づけされる未知有機体および当該グローブ有機体が共に真核有機体で ある請求の範囲第４項の方法０ １３、特徴づけされる未知有機体およびグローブ有機体が共に前核有機体である 請求の範囲第、４項の方法０１４、％徴づけされる未知有機体が真核有機体で、 グローブ有機体が前核有機体である請求の範囲第４項の１５、種のランク以下の 分類群又は亜種以下の細分を生ずるｌ又は複数の核酸配列の存在を検出す企こと をも含む請求の範囲第１２または１４％の方法。 １６、特徴づけされる未知有機体が前核性で、かつ、当該プローブ有機体が真核 性でおる請求の範囲第４項の方法。 １７、特徴づけされる前核有機体が、真核有機体の面前で選択的に検出される請 求の範囲第１３または１６項の方法。 １＆　前核有機体が細菌である請求の範囲第１７項の方法。 １９、特徴づけされる真核有機体のＤＮＡが核ＤＮＡで、真核グローブ有機体か らの保存ＤＮＡ情報−含有核酸が糸粒体又は葉緑体由来のものではない請求の範 囲第１２項の方法。 ２０、特徴づけされる真核有機体のＤＮＡが糸粒体ＤＮＡで、真核プローブ有機 体の保存ＤＮＡ情報−含有核酸が糸粒体又は葉緑体由来のものである請求の範囲 第１２項の方法。 ２１、特徴づけされる真核有機体のＤＮＡが葉緑体ＤＮＡで、真核グローブ有機 体の保存ＤＮＡ情報−含有核酸が糸粒体又は葉緑体由来のものである請求の範囲 第１２項の方法０ ２２、、％徴づけされる真核有機体のＤＮＡが糸粒体ＤＮＡ由来のものである請 求の範囲第１４項の方法。 ２３、特徴づけされる真核有機体のＤＮＡが葉緑体ＤＮＡ由来のものである請求 の範囲第１４項の方法。 ２４、保存ＤＮ’Ａ情報−含有核酸グローブが糸粒体又は葉緑体由来のものであ る請求の範囲第１６項の方法。 ２５、更に特徴づけされる未知真核有機体の中の、ウイールス又は種のランク以 下の分類群を作り出すウイールス由来のＤＮＡを確認することをも含む請求の範 囲第１２または１４項のいづれかの方法。 ０６ ２６、未知細菌のＤＮＡの既知の位置と対応して該、細菌のＤＮＡの進化論的な 保存配列の一部又は全部の位、置を決定しく既知プローブ有機体またはそれ由来 のリポソームＲＮＡ情報−含有核酸とハイブリッド化又は再対合している未知有 機体からの制限エンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡのクロマトグラフパターンを決定 するのと別の方法）、それによって未知細菌の同定のだめの遺伝子特徴づ、けを 得、そして当該保存配列由来の同定のための遺伝子特徴づけの少なくとも２つの 組み（未知の細菌種を定義している対の各々）からの情報とその特徴づけを比較 することよシなる試料中に存在する未知細菌種の細菌を同定する方法。 ２７、既知の位置が制限エンドヌクレアーゼ切断部位の一つまたはそれ以上によ って定義されるものである請求の範囲第２６項の方法。 ２８、プローブ細菌又はそれ由来又は一致配列の転換ＤＮＡ配列情報−含有核酸 と７・イブリッド化又は再対合している未知細菌からの制限エンドヌクレアーゼ 消化ＤＮＡのクロマトグラフパターンと、既知有機体の相当するりｐマドグラフ パターンを比較することか゛らなる請求の範囲第２６項の方法。 ２９．１未知細菌が発酵培地又は分泌−又は排出産物中に存在するものである請 求の範囲第２６項の方法。 ３０、未知細菌が真核組織の中、又は真核組織と共に存在する請求の範囲第２６ 項の方法。 ３１、当該細菌が動物又は植物細胞の中、又は細胞と共に存在する請求の範囲第 ３０項の方法。 ３２、当該細菌がヒト細胞の中、若しくはヒト細胞と共に存在するか、又は植物 根細胞と共に存在する請求の範囲第３０項の方法。 ３３、グローブ細菌からの保存ＤＮＡ情報−含有核酸が検出可能なように標識化 されたものである請求の範囲第２８〜３２項のいづれかの方法。 ３４、標識が放射性標識か又は金属標識である請求の範囲第３３項の方法。 ３５、プローブ細菌からの核酸がＲＮＡである請求の範囲第３３項の方法。 ３６、プローブ細菌からの核酸か、ＲＮＡに相補的なりＮＡである請求の範囲第 ３３項の方法。 ３７　未知細菌が植物又は動物に対して病原的である請求の範囲第２８〜３２項 のいづれかの方法。 ３８　更に種のランク以下の分類群、又は亜種以下の細１０８ 分を作ｐ出す１又は複数の核酸配列の存在を検出することを含む請求の範囲第２ ８〜３２項のいずれかの方法。 ３９．１又は複数の核酸配列がバクテリオファージゲノムの全部又は一部である 請求の範囲第３８項の方法。 ４０．１又は複数の核酸配列が、染色体外遺伝因子、グラスミド、又はエピソー ムの全部又は一部である請求の範囲第３８項の方法。 ４１．１又は複数の配列が、Ｒ−因子又は抗生物質耐性因子の暗号である請求の 範囲第３８項の方法。 ４２、既知細菌のクロマトグラフパターンが少くとも２つの異なる細菌のパター ンを含むカタログに存在するものである請求の範囲第２８項の方法。 ４３１又はそれ以上の容器をきっちシλ入れられるように仕切られたキャリヤー を含むキットにして、最初の１の容器にはプローブ有機体の、又はプローブ有機 体由来の、又は一致配列の保存遺伝子材料配列情報−含有核酸（リポソームＲ， ＮＡ情報−含有核酸でなく）が入っており、更にこのキットには、少くとも２つ の異なる既知有機体積のハイブリッド化又は再対合されたクロマトグラフ帯パタ ーンを有するカタログをも含むか、又はこのキットは少くとも２つの既知有機体 積もしくはこれらに由来する遺伝子材料を含むキット。 ４４、遺伝子材料がＤＮＡである請求の範囲第４３項の方法。 ４５．１又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素を入れた第二の容器をも含 む請求の範囲第４３または４４項のキット。 ４６、保存ＤＮＡ配列情報−含有核酸プローブが、検出可能なように標識化され たものである請求の範囲第４４項の方法。 ４７、その中にきっちりと１又はそれ以上の容器を入れるように仕切られたキャ リアーを含むキットにして、プローブ有機体の、又はプローブ有機体由来の、又 は一致配列の、検出可能に標識された核酸を含む保存ＤＮＡ配列情報−含有核酸 （リポソーム几ＮＡ情報−含有核酸でなく）を入れた第１の容器と、１又はそれ 以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素を含む第二の容器からなるキット。 ４＆保存ＤＮＡ配列情報−含有核酸プロープがＲＮＡである請求の範囲第４３． ４５または４７項のキット０ ４９、保存ＤＮＡ配列情報−含有核酸グローブがＲＮＡ１０ に相補的なりＮＡである請求の範囲第４３．４５または４７項のキット。 ５０．１又はそれ以上の検出可能なように標識化されたデオキシヌクレオシド三 燐酸の容器をも含む請求の範囲第４８項のキット。 ５１　プローブ有機体が前核有機体である請求の範囲第４３．４５または４７項 のキット。 ５２−グローブ有機体が真核有機体である請求の範囲第４３．４５または４７項 のいづれかのキット。 ５３、前核生物が細菌である請求の範囲第５１項のキット０ ５４、真核生物の核酸グローブがその小器官由来のものでおる請求の範囲第５２ 項のキット。 ５５、ｃＤＮＡが！２ｐ　、　１４Ｃ又は３Ｈで標識化されたものである請求の 範囲第４９項のキット。 ５６、　ｃＤＮＡが、それが由来するところのｒＲＮＡの忠災なコピーである請 求の範囲第４９項のキット。 ５７ウイールス核酸グローブの１又はそれ以上の容器をも含む請求の範囲第４３ ．４５または４７項のいづれかのキット。 ５＆カタログが、本、コンピューターテープ、コンピューターディスク又はコン ピューターメモリーである請求の範囲第４３．４５または４７項のいづれがのキ ット。 ５９、カタログがクィールスクロマトグ２７パターンをも含むものである請求の 範囲第４３．４５又は４７項のいづれかのキット。 ６０、カタログが亜種以下の分類上のパターンをも含むものである請求の範囲第 ４３．４５又は４７項のキット。 ｌ