JPH0824584B2 - 有機体の同定および特徴づけ方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細菌，植物および動物のような前核細胞お
よび真核細胞有機体を含む有機体を迅速且つ正確に特徴
づけおよび同定する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

生きている有機体の分類は伝統的に、多かれ少かれ任
意で、いくらか人為的な線に沿って行われてきた。例え
ば生物の世界は二つの界に分けられている：植物（Plan
tae）および動物（Animalia）。この分類は一般に知ら
れている有機体に対しては都合がよいが、単細胞生物の
ような有機体（例えば、緑靴毛虫類，細菌，藍藻類）に
対しては困難となる。なぜならばこれらは基本的にが
「植物」および「動物」とは違うからである。

有機体をその細菌の内部構造によって単純に分けるこ
とが提案された。このやり方では、すべての細胞生物は
前核性（prokaryotic）か真核性（eukaryotis）かのど
ちらかである。前核生物（prokaryotes）は真核生物（e
ukaryotes）ほど複雑でなく、それらには、単位膜組織
による内部の仕切りがなく、明瞭な核を欠いている。前
核細胞の遺伝情報は２本鎖の環状DNAにのって細胞質に
運ばれる。その他のDNAは細胞中に存在しない（ファー
ジ，細菌性ウィールス，および自律的複製のできる環状
DNAプラスミッドが存在する場合は除く）。他方、真核
生物には、多種多様の単位膜組織があり、これは多くの
機能成分を、特殊化され孤立化された領域に分離する役
目をもっている。例えば、遺伝情報（DNA）は明瞭に仕
切られた核の中に見出され、小器官である糸粒体（ミト
コンドリア）および（光合成有機体では）葉緑体中にも
見出される。真核細胞のゲノムの複製，転写および翻訳
は、細胞内の二又は三個所の別個の部位，核細胞質部
分，糸粒体および葉緑体でおこる。

しかしながら、前核生物と真核生物との差は、前核細
胞で糸粒体および葉緑体の比較を行う時、打砕かれる。
これらの細胞小器官は今日ではフリーリビング（free−
living）前核生物に由来するものと考えられており、そ
のフリーリビング前核生物は原始的真核生物と、内共生
（endosymiotic）関係に入り、究極的に宿主細胞の構造
と密接に統合され、独立的存在が不可能になったもので
ある（参照例,Fox,G.B.et al.「Science」209;457−463
（1980）p.462;Stanier,R.Y.et al.「The Microbial Wo
rld」第４版,Prentice−Hall社発行,1976,p.86）。例え
ばリボソームRNA遺伝子領域を担うマウスＬ細胞糸粒体
から得たDNAは大腸菌（Escherichia coli）リボソームR
NAとの顕著な配列相同性を示すことが証明され、内共生
モデルを強く支持している（Van Etten,R.A.et al,「Ce
ll」22:157−170（1980））。また、とうもろこし（Zea
mays）葉緑体の23S型リボソームRNAのヌクレオチド配
列は、大腸菌の23S型リボソームRNAと71％の相同性を有
することも示されている（Edwards,k.＆Kossel,H.,「Nu
cleic Acids Research」9:2853−2869（1981））；その
他の関連研究も（Bonen,L.＆Gray,M.W.,同上8:319−335
（1980））。更にその一般概念を支持している。

このモデルでは真核細胞は、性質からみると明らかに
前核性である小器官部分をもった、系統発生的「キメ
ラ」である。「前核性−真核性」二分法もまた広い分類
の方法としてすら欠点がある。

有機体の分類が科学的課題以上のものとなるのは、交
雑および育種（breedig）の目的で植物か動物を同定し
ようとする場合、およびいわゆる「より高等な」有機体
又はその他の媒体に感染するかも知れない微生物を、正
確且つ信頼をもって同定しようとする場合である。例え
ば植物栽培者，家畜飼育者又は魚飼育者は異種および異
型株を同定する迅速且つ信頼できる方法を得たいと思う
だろう。獣医，医師又は園芸家は、試験植物、および動
物組織中の感染性有機体（寄生虫，菌類，細菌等）およ
びウィールスを正確に同定したいと思うだろう。これら
有機体およびウィールスの種の正しい同定は特に重要な
ことである。

この問題は、細菌の同定について説明すると最も良く
わかる。細菌種の名前は、多くの菌株をあらわすのが普
通であり、一菌株は一個の細胞から派生する集団と考え
られる。種の菌株はその種を定義するのに役立つ属性の
相似な組み合わせをもっている。細菌種の、正確な定義
を表現することは、種の境を設けるために、種内の菌株
の多様さに対し境界を定めることが必要であるため難か
しい（Buchanan,R.E.,「International Bulletin of Ba
cteriogical Nomenclature and Taxonomy」,15:25−32
（1965））。種の定義を未知の細菌菌株の同定に実際に
応用するには表現型の属性を検出するための基質および
条件のような適切なプローブの選択、および同種からの
放射性物質で標識化されたDNAが必要である。菌株を同
定するための適切なプローブが選択されうるように、仮
に菌株を確認するスクリーニング法を用いることが必要
である。挑戦していることは、種の境界を厳密に定める
ことであり、好ましくは、種に特異的な情報を与える標
準プローブを使ってこれを行うことである。そうするこ
とにより種の定義づけが未知の菌株の同定に直接、且つ
等しく適用できる。

バージーのマニュアル・オブ・デターミネティブ・バ
クテリオロジー（Buchanan,R.B.and Gibbo−ns,N.B.編
集,1974,第８版,Willians＆Wil−kins社，バルチモア）
は最も理解し易い細菌分類法、特に命名法、基本型菌
株、関連文献等について示してある。しかしながら、こ
れは種の同定の出発点に過ぎないものである。なぜなら
が、特にこれは時代遅れであり、スペース的に限られる
ため種についての記述が簡単すぎるためである。（参照
例；ブレンナーD.J（Brenner D.J）「Manual of Clinic
al Microbiology」第３版，米国微生物学会，ワシント
ンD.C.,1980,1−６頁）。

細菌に用いた場合「種」という語は、或る他と区別で
きる特徴をもった、有機物の異なった種類として、又、
本質的な有機体組織の特徴において、一般に相互に近い
類似性をもった有機体の一群と定義されてきた。これら
の定義の問題点は、それらが主観的であるということで
ある（Brenner,同上,p2）。又、種は単に宿主の範囲，
病原性，或る糖の発酵の際にガスを生産するかしない
か、糖発酵が速いか遅いかのような基準に基づいて定義
されたこともあった。

1960年代には数的細菌分類法（コンピューター分類法
又は遺伝的表現型分類法とも呼ばれる）が広く用いられ
るようになった。数的分類法は、有機体の遺伝能力（po
tential）をできるだけ多く試験することに基づいてい
る。多数の特性に基づいて分類することにより、一定程
度の相似性をもった菌株のグループを形成することがで
き、これらを種と考えることができる。しかしながら、
或る一つの種を特徴づけるのに有効なテストが次の種の
ために役立つとは限らないので種のこの定義法は未知の
菌株の同定に直接的且つ実際的に適用できない。たとえ
これが種に特異的であると思われる属性を選ぶことによ
って、これらの属性が未知の菌株の確認のために用いら
れ、部分的に克服できるとしても、この種の定義法は間
接的に応用されているに過ぎない（Brenner,同上,p.2−
６参照）。その上一般的方法は、これを種を定めるため
の唯一の根拠として用いた場合、いくつかの問題をかか
えており、それらの中には用いるべき試験の数および性
質、その試験をどの程度評価すべきか関連性を反映させ
るためにはどのようにして、どの位の程度の類似性を選
ぶべきか、同じ類似性の基準がすべての群に適用できる
かどうか等がある。ヒューR.H（Hugh, R.H）およびギリ
アージG.L（Giliardi,G.L）著「Manual of Clinical Mi
crobiology」第２版，米国微生物協会，ワシントンD.
C.,1974,p.250−269には、ゲノムのフラクションを利用
して細菌の種を定める手段としての最少の表現型の特質
が列挙してある。一つの種の中から多数のそしてランダ
ムに選ばれた菌株試料を研究することによって、最も高
度に保存されているか又は非常に多くの菌株に共通であ
る属性を選びだし、種を定義することができる。最少特
性を使用するようになったことは進歩であり、菌株を仮
に同定するためのスクリーニング法から始め、適当な追
加の培地が選択できるようにする。次いでその菌株が最
少の特性のほとんどを有することを予想しながら当該種
に保存されている既知の属性を調べる。最少特性の中の
いくつかは当該種のすべての菌株にあらわれるわけでは
ない。これに関連した考え方としては、その属の種のタ
イプ、ネオタイプ又は確認済みの対照菌株の比較研究が
ある。各研究室によって培地および方法が異なるから、
この照合は必要であり、菌株この種の標準（standard）
であって、方法ではないのである。

細菌分類への分子レベルでのアプローチは二つのゲノ
ムをDNA−DNA再対合（reassociation）によって比較す
ることである。種の遺伝的定義には種の菌株が70％以上
関連しているという仮定が含まれる。DNA−DNA再対合で
菌株が同定できるのは、放射性標識DNAプローブと未知
のDNAが同じ種のものである場合のみである。しかしこ
の70％種一定義の実際的適用は、適切なプローブを選択
しなければならないことによって制限される。これは、
再対合群と相互関係がありそうにみえる表現型属性を選
択することにより一部は克服されるかもしれないが、こ
れらが単独で用いられた場合、DNA−DNA再対合による種
の定義はやはり間接的に適用されるにとどまる。

ブレンナー、前出、第３頁は、細菌の種を確認する理
想的手段は、遺伝子を分離し、直ちに当該菌株中に核酸
配列をあらゆる既知の種の何か（species−something）
の標準パターンと比較する、質量分光光度法分析に似て
いる「ブラックボックス」であると述べている。

しかしながらブレンナーは分離された遺伝子の一般的
配列を決めるための制限エンドヌクレアーゼ分析をする
ことはできるけれども、「我々は適切なブラックボック
ス、特に臨床研究室で使用するために適したブラックボ
ックスは手に入りそうもない。」と認めている。彼の言
葉は有機体のあらゆる種に等しくあてはめられる。

先行技術のこの短かい再検討から、未知の細菌および
その他の有機体を同定し、それを速かに分類し、特に病
原性有機体又は利用できる生化学反応をおこす有機体を
同定するための迅速，正確且つ信頼できる方法が今必要
であるとの結論に達する。その方法は臨床研究室で普遍
的に、そして容易に利用できるものでなければならない
し、行った試験の数や、臨床医の主観的偏見に依存して
はならず、又、過去の、偶発的又は必然的試行錯誤法
（Trial and error method）に依存してもいけない。更
に、いかなる生きている有機体の属および種の同定およ
び区別にも役立ち、獣医，植物栽培者，毒物学者，動物
飼育者，昆虫学者によって、又そのような同定が必要な
他の関連領域において容易に且つ信頼性をもって使える
方法であることも必要である。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明の目的は有機体、これに限定するもので
はないが特に微生物を、客観的に同定する迅速，正確且
つ信頼できる方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は細菌のような有機体を、有
機体のゲノムを利用して同定する方法を提供することで
ある。

本発明のもう一つの目的は、動物又は植物の病気の原
因を特徴づけ同定することができるように臨床研究室に
おいて病原性有機体の種および属を特徴づけ、同定する
方法を提供することである。

本発明の今一つの目的は、以上に述べた分類法に有用
な種々の生物物を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明のこれらおよびその他の目的は、以下において
より容易に判明するように、次の方法を提供することに
より達せられた。

未知の有機体を特徴づける方法にして、当該有機体か
ら得られる、プローブ有機体からの、又はその有機体に
由来するリボソームRNA情報−含有核酸とハイブリッド
形成又は再対合した制限エンドヌクレアーゼー消化DNA
のクロマトグラフ−パターンを、少くとも二種類の異な
る既知の有機体種の同等のクロマトグラフパターンと比
較することからなる方法。

本発明の又別の目的は次の方法を提供することにより
達せられた。

或るサンプル中の病原性の有機体感染を診断する方法
で、当該サンプル中の有機体を上述の方法により同定す
ることからなる方法。

本発明は、もし種が共通の種属形成事象に関連づけら
れる個々に分離した菌株の集合体であるならば、分散化
にもかかわらず、客観的に種の境界を定める、菌株が共
有する類似性があるはずであり、種の菌株はそれらの共
通の根源を探る手がかりとなる構造情報をもっているは
ずであるという発明者の認識に基づいている。有機体の
過去の歴史は最も多くセマンタイド（semantides）、DN
AおよびRNAの中に残っているから（Zuckerkandle.E.お
よびPauling,L,「Journal of Theoretical Biology」第
８巻:357−366（1965））、発明者は若干の保存遺伝子
に含まれる情報を利用する実験的アプローチはrRNAを使
用することであると結論した。リボソームRNAは蛋白合
成に構造的並びに機能的役割を有し（Schaup,「Journal
of Theoretical Biology」第70巻:215−224（197
8））、そしてrRNA−DNAハイブリッド化の研究から得ら
れた一般的結論は、リボソームRNA遺伝子の基本的配列
は他の大多数の遺伝子に比べて進化の過程で変化を受け
にくく、より保存されるらしいということである（Moor
e,R.L.著，「Current Topics In Microbiology and Imm
unobiology」,64巻,105−128（1974）,Spring−Verlag
社，ニューヨーク）。例えば、多数の細菌種から得られ
る16S型rRNAの一次構造は、オリゴヌクレオチッド分析
から推定された（Fox,G.B.et al著，「International J
ournal of Systematic Bacteriology」，第27巻:44−57
（1977））。大腸菌の数菌株の16S型オリゴマーカタロ
グには無視できる程の差がある（Uchida T.et al著；
「Journal of Molecular Evolution」,3巻:63−77（197
4））が、種間の実質的な差は細菌系統学的分類表作成
のために用いることができる（Fox,G.B.「Science」209
巻:457−463（1980）。或る一細菌種の異なる菌株は、
かならずしも同一ではなく、制限酵素地図は、異なるEc
oR Iサイトが大腸菌の二菌株のrRNA遺伝子中に生ずるこ
とを示している（Boros,I.A.et al著，「Nucleic Acids
Research」第６巻:1817−1830（1979））。細菌は保存
rRNA遺伝子配列を共有しているようにみえ、そしてその
他の配列は変化し得る（Fox,1977,同上）。

本発明者は更に、DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化
物は、或る種の有機体（例えば細菌）の菌株では相似す
るが、他の種の有機体の菌株では異なるrRNA遺伝子配列
を含む断片の組み合わせをもっていること、即ち菌株の
変異にもかかわらず、高い発生頻度をもち、最小共通遺
伝子型特質をもつ制限断片の、酵素の特異的組み合わせ
が種を決定することも見出した。これが本発明の本質で
ある。発明者はこの方法が、分類学（古典的）において
同一であるか異なっているかを問わず前核細胞性，真核
細胞性を問わず同定しようとする有機体以外の有機体か
らのリボソーム核酸プローブを用い、前核および真核DN
A両方に適用できるという点で一般的であることをも見
出した。

本発明は、制限エンドヌクレアーゼ消化物中のリボソ
ームRNA遺伝子配列を含むDNA断片を検出することに基づ
いて有機体を定める客観的方法を提供する。その検出は
DNA断片をプローブ有機体からのrRNA情報を含む核酸と
ハイブリッド化又は再対合させることによって行われ
る。

本発明の工程によって特徴づけられる「有機体」（こ
の言葉は「同定する」を含むと解釈される）という語に
よって、定義によりDNAを含む事実上すべての有機体を
意味する。この点に関して参考のために伝統的分類表に
ふれておくことが有用である。

植物および動物が含まれる、例えばモネラ（monera）
界には、ミコバクテリウム（myxobacteria），スピロヘ
ータ（spirochetes），ユーバクテリア（eubacteri
a），リケッチャー（rickettsiae）綱の分裂品（細菌）
および藍藻類：サイアノフィータ（cyanophytha）を挙
げることができる。植物界には、ユーグレノイド類（Eu
glenophta），緑藻類：クロロフィータ（Chlorophyt
a），クロロフィセエ（chlorophyceae）およびカロフィ
セエ（charophyceae）綱，クリンファータ（chrysopht
a）類キサントフィセエ（xanthophyceae），クリソフィ
セエ（chrysophyseae），バシラリオフィセエ（bacilla
riophyceae）綱；ピロフィータ（pyrrophyta）類デイノ
フラゲラータ（Dinoflagellates），褐藻類：ファオフ
ィータ（phaeophyta）；紅藻類：ロドフィータ（Rhodop
hta）；粘菌類：ミコマイコフィータ（Myxomycophyt
a），ミコマイセタ（myxomycetes），アクラシエ（acra
siaes），プラズモディオホレエ（Plasmodiophorea
e），ラブリンタリエ（labyrinthuleae）綱；ユーマイ
コフィータ：真菌類（Eumycophyta），フィコミセタ（p
hycomycetes），アズコミセタ（ascomycetes），バシド
ミセタ（basidomycetes）綱；蘚苔類，ヘパティエ（hep
aticae），アントセロテ（anthocerotae），ムスシ（mu
sci）綱；維管束植物トラケオフィータ（Tracheophyt
a），プシイロシダ（psilopsida），リコサイダ（lycop
syda），スヘノプシダ（sphenopsida），プテロプシダ
（pteropsids），スペルモプシダ（spermopsida）亜
類，サイカデ（cycadae），ジンクゴエ（ginkgoae），
コニヘレ（coniferae），グネテ（gneteae）およびアン
ギロスペルマエ（angiospermae）綱，デコチレドネエ
（dicotyledoneae），モノコチロエドネ（monocotyloed
oneae）亜綱が記載される。動物界には、原生動物亜
界，原生動物門プロトゾア（protozoa），プラスモドロ
マ（plasmodroma）亜門，フラゲラー（flagellata），
サルコデナ（sarcodina）およびスポロゾア（sporozo
a）綱；シリオフォーラ（ciliophora）亜門，シリアタ
（ciliata）綱；側生動物亜界，ポリヘラ（海綿動物門p
orifera），カルカレ（calcarea）綱，ヘキサチネーリ
ダ（hexactinellida）綱およびデスモスポギエ（desmos
pongiae）綱；中生動物亜界，中生動物門；後生動物亜
界ラディアタ（Radiata）部門，コレンテラタ（coelent
erata）門，ヒドロゾア（hydrozoa），シフォゾア（scy
phozoa），ウトゾア（authozoa）綱，ステノフォラ（ct
enophora）門，テンタクラータ（tentaculata）および
ヌダ（nuda）綱；プロトストミ（protostomia）部門扁
形動物門プラチエルミンタ（platyhelmintes），ツベル
ラナ（tubellana），トレマトーダ（trematoda）および
セストダ（cestoda）綱；ネメルチナ（nemertina）門，
アカントセファラ（acanthocephala）門；アシェルミン
タ（aschelmintles）門，ロチヘラ（rotifera），ガス
トロトリカ（gastrotricha），キノリンカ（kinorhynch
a），プリアプリダ（priapulida），ネマトーダ（nemat
oda）およびネマトモルファ（nematomorpha）属；エン
トプロクタ（entoprocta）門；エクトプロクタ（ectopr
octa）門，ギムノレーマタ（gymnolaemata）およびフィ
ラクトレマータ（phylactolaemata）綱；フオロニダ（p
horonida）門；ブラチオポダ（braciopoda）門，イナル
チクラタ（inarticulata）およびアルチクラータ（arti
culata）綱；モルスカ軟体動物（mollusca）門，アムフ
ィニューラ（amphineura），モノプラコフォラ（monopl
acophora），ガストロポーダ（gastropoda），スカフォ
ポーダ（scaphopoda），ペレサイポーダ（pelecypoda）
およびセファロポーダ（cephalopoda）綱；シプンクリ
ダ（sipunculida）門；エチウリーダ（echiurida）門，
アネリダ（annelida）門，ポリケータ（polychaeta），
オリゴケータ（oligochaeta）およびヒルディネア（hir
udinea）綱；オニコフィラ（onychophora）門；タルデ
ィグラダ（tardigrada）門；ペンターストイミダ（pent
astoimida）門，アルソロポーダ（arthropoda）門；ト
リロビータ（trylobita）門，ケリセラータ（chelicera
ta）亜門，キフォスラ（xiphosura），アラキミダ（ara
chmida），ピクノゴミダ（pycnogomida）綱，マンデブ
ラタ（mandibulata）亜門，クルスタエ（crustacea），
チロポダ（chilopoda），ディプロポーダ（diplopod
a），ポロポーダ（pauropoda），シンフィラ（symphyl
a）綱，コレンボラ（collembola），プロチュラ（protu
ra），ディプルラ（diplura），チサヌラ（thysanur
a），エフェメリダ（ephemerida），オドナタ（odonat
a），オルトプテラ（orthoptera），デルマプテラ（der
maptera），エンビニア（embiania），プレコプテラ（p
lecoptera），ゾラプテラ（zoraptera），コロデンティ
ア（corrodentia），マルロファガ（mallophaga），ア
ノプルラ（anoplura），チサスノプテラ（thysasnopter
a），ヘミプテラ（hemiptera），ノイロプテラ（neurop
tera），コレオプテラ（coleptera），ヒメノプテラ（h
ymenoptera），メコプテラ（mecoptera），シホナプテ
ラ（siphonaptera），デプテラ（diptera），トリコプ
テラ（trichoptera）およびレピドプテラ（lepidopter
a）目の昆虫類；デンテロストミア（Denterostomia）部
門の動物，ケトグナタ（chaetognatha）門，エチノデル
マタ（echinodermata）門，クリノイデア（crinoide
a），アステロデア（asterodea），オフィウロイデア
（ophiuroidea），エチノイデア（echinoidea），およ
びホロツロイデア（holoturoidea）綱，ポゴノフォラ
（pogonophora）門，ヘミコロデータ（hemichordata）
門，エンテロノイスタ（enteropneusta）およびプテロ
ブランキア（pterobranchia）綱；コルデータ（chordat
a）門，ウロコルデータ（urochordata）亜門，アシデア
シエ（ascidiaciae），タリアセエア（thaliaceae），
ラルバセア（larvacea）綱；セフアロコルデータ（ceph
alochordata）亜門，ベルテブラータ（vertebrata）亜
門，アグナタ（agnatha），コンドリキチエ（chondrich
thyes），オステキチス（osteichthyes），サッコテイ
ジ（saccopteiygii）亜綱，クロソプテリジ（crossopte
rygii）およびディプノイ（dipnoi）目，アンフィビア
（amphibia），レピチリア（repitilia），アベス（ave
s）およびマンマリア（mammalia）綱，プロトテリア（p
rototheria）亜綱，テリア（theria）亜綱，マルサピア
リス（marsupialis），インセクティボラ（insectivor
a），デルモプテラ（dermoptera），チロプテラ （chi
roptera），プリマチス（primates），エデタタ（edent
ata），フォリドータ（pholidota），ラゴモルファ（la
gomorpha），ロデンティア（rodentia），セタセエ（ce
taceae），カルニボラ（carnivora），ツブリデンター
タ（tubulidentata），プロボシデア（probosicdes），
ヒラコイデア（hyracoidea），シレニア（sirenia），
ペリソダクチラ（perissodactyla）およびアルチオダチ
ラ（artiodactyla）目を挙げることができる。目の下に
はまだ科、族、属、種および亜種まであり、亜種外の分
類群、株又は個体があることが知られている。更に、細
胞分類群、及び菌株又は個体がある。その上、培養細胞
（植物又は動物）も、ウィールスと同様同定することが
できる。これらの分類はこの出願において説明的目的の
ためにのみ用いられ、限定的に使用されるものでない。
同定する有機体は既知のものでも未知のものでもよいが
最も普通には未知のものである。

機能的には、本発明の目的のためにはすべての有機体
を真核細胞群と前核細胞群に分けるのが便利である。前
核有機体であると同定された場合には、エンドヌクレア
ーゼ消化にかけられるDNAは細胞の中、又は区画されて
いない染色体中に存在するものである。真核有機体と同
定された場合には、核DNA又は小器官内DNA（糸粒体DNA
又は葉緑体DNA）を用い、同様にエンドヌクレアーゼ消
化を行えばよい。

簡単に言うと、rRNA遺伝子配列、多分種レベル以下の
分類又は亜種以下の小分類（infrasubspecific subdivi
sion）を作り出すために用いることができる配列を分析
するために、高分子量DNAおよび／又は小環状DNAが有機
体から分離され同定されるのである。DNAは当業者には
周知の方法により抽出される。DNAを制限酵素によって
特殊の部位で切り、断片とする。この断片をゲル電気泳
動法のような標準クロマトグラフ系で、大きさによって
分ける。そのゲルを、当業者が周知の方法で、染色し、
大きさが既知の断片で作った標準曲線を用いて、断片の
大きさについて標準化する。次いで分離した断片をサウ
ザーン（Southern）のスポット法（Southern,E.M.「Jou
rnal of Molecular Biology」,38:503−517（1975），
ここに参照として挿入されている）により、亜硝酸セル
ローズ紙に移し、加熱によりそこに共有結合させる。rR
NA遺伝子配列を含む断片はそれから、rRNA情報を含む核
酸プローブとハイブリッド化する能力によって、位置が
定められる。核酸プローブは、非放射性物質で標識化さ
れるか、又は、好ましくは放射性物質で標識化される。
放射性物質で標識化する場合、プローブはリボソームRN
A（rRNA）でもよいし、逆転写によって合成されるか、
例えば切り込み翻訳（nick translation）によって標識
化され得るクローン断片上に含まれる、リボソームRNA
に相補的な放射性標識化DNA（rRNAcDNA）でもよい。

プローブは、後で見るように任意に選ばれた有機体か
ら得る。一度ハイブリッド化がおこったら、ハイブリッ
ドを形成した断片は、二重鎖の核酸を選択的に検出する
ことにより検出するか（非放射性標識化プローブ）、又
は例えばラジオオートグラフ法によって目に見えるよう
にする（放射性標識化プローブ）。ハイブリッドを形成
した各断片の大きさは、既述の標準曲線を用いて、移動
距離から決められる。ハイブリッド化量、ハイブリッド
化パターン、ハイブリッドを形成した断片の大きさが個
々に、又は組み合わせて有機体を同定するのに使用され
る。

このハイブリッド化からあらわれるパターンは、少く
とも二個、さもなければ多数の既知の標準有機体、属又
は種から得られた同等のクロマトグラフパターンと容易
に比較できる。予備的な広い分類が（例えば古典的分類
法を用いて）既に行われた後で、視覚による検査および
適当なクロマトグラフパターンとの照合により、核酸断
片の大きさの比較により、バンド強度（ハイブリッド化
量）により、又はこれらを組み合わせることによって比
較をおこなうことができる。理想的にはポイントーオブ
ーセール（point−of−sale）処理に用いられるよう
な、一次元コンピューターパターン認識装置によって比
較するのがよい。

発明者は前記の方法を用いる時は、同じ種の有機体の
クロマトグラフパターンは非常に似ており、わずかな差
は、菌株の変化による亜種間の差にとどまるが、種間の
差および属間の差（そしてもっと高レベルの分類におい
ても）は非常に大きい。

或る一つの種の株間において酵素−特異的断片の変異
のあることを利用して、種々の目的、例えば細菌の場
合、疫学的目的のために株をタイプ分けすることもでき
る。実際、制限酵素は種内の株を区別することができる
ものを選ぶことができる。

本研究に用いられる「プローブ有機体」（そしてそれ
から核酸プローブが得られる）は、上に挙げた有機体の
どれでもよく、真核有機体でも前核有機体でもよい。唯
一の制限は、rRNA−含有プローブが、未知有機体のDNA
のエンドヌクレアーゼ消化物と最大にハイブリッド化し
なければならない、という事実によって与えられる。

リボソームRNA情報−含有プローブに４種類ある： １）前核リボソームプローブ（特に細菌から得られたrR
NA）、２）真核糸粒体リボソームプローブ、３）真核葉
緑体リボソームプローブ、４）真核非−小器官性リボソ
ームプローブ。

DNA（エンドヌクレアーゼで消化される）の出所も４
種類ある： １）前核細胞DNA、２）真核糸粒体DNA、３）真核葉緑体
DNA、４）真核細胞核DNA。

斯くして次のハイブリッド化表が作られた（第１
表）。

表は、リボソームRNAプローブが未知の有機体体のDNA
と最大にハイブリッド形成することができることを示し
ている。例えば、或る真核有機体を同定するためには、
種−特異的糸粒体又は葉緑体DNAを抽出し、それをエン
ドヌクレアーゼで消化し、この消化物を前核リボソーム
RNAプローブか又は小器官から抽出した真核リボソーム
プローブとハイブリッド化すればよい。同様にして、前
核有機体を同定するためには、種−特異的細胞DNAを抽
出し、エンドヌクレアーゼでこれを消化し、消化物を前
核リボソームDNAプローブ又は小器官から抽出した真核
リボソームRNAプローブとハイブリッド化すればよい。
又、種−特異的核DNAを抽出、消化し、これを非−小器
官性の真核リボソームプローブとハイブリッド化するこ
とによっても、真核有機体を同定することができる。真
核細胞は、核、糸粒体、又は若干の場合では葉緑体系の
中の一つ又は何らかの組み合わせによって定めることが
できた。これらの交叉ハイブリッド化は、前に述べた、
真核小器官から抽出したrRNA核酸は、前核rRNA核酸と広
い相同性をもっているが、核−抽出真核DNAと、前核DNA
との間では当該相同性はそのように広くは存在しないと
いう事実に基づいている。

要約すれば、遺伝暗号は普遍的であるが故に、すべて
の細胞（真核細胞又は前核細胞）は暗号情報を蛋白質に
翻訳するためにリボソームを必要とするが故に、そして
リボソームRNAは高度に保存されているが故に、交叉−
ハイブリッド形成要素（第１表中の“＋”）間には十分
な相同性が存在し、この方法が有効であることが保証さ
れる。

消化すべきDNAおよびこれに付随するリボソームプロ
ーブの対の選択は任意であり、同定するべき有機体によ
るであろう。即ちそれは問われた問題によるだろう。例
えば、感染物質を検出し、同定する目的で、真核細胞
（例えば動物又は植物）中に存在する前核細胞の種（例
えば細菌）を検出する場合は、前核リボソームプローブ
を選び、小器官由来のDNAは抽出されないか、最小限量
抽出される条件で処理すればよい。このやり方を用いれ
ば、小器官由来のDNAと前核DNAとの干渉は最小であると
確信することができる。真核種（それは前核細胞によっ
ては感染されない）を前核リボソームプローブで同定す
る場合、例えば核から小器官を分離し、次いで小器官の
DNAのみを抽出するというようにして、小器官由来のDNA
の濃度を最大にするのが最も良い。前核有機体の感染を
受けた真核有機体を同定したい場合は、非−小器官、非
−前核細胞由来のリボソームプローブを用いるのが最良
である。なぜならばこのリボソームプローブは前核細胞
からのDNAとは十分にハイブリッドを形成しないからで
ある。

同じ界、又は同じ亜界、又は同じ部門、又は同門、又
は同じ亜門、又は同じ綱、又は同じ亜綱、又は同じ目、
又は同じ科、又は同じ族、又は同じ属からの一対（DNA
およびリボソームプローブ）を用いるのが好ましい。前
核DNAとハイブリッドを形成させるためには前核細胞リ
ボソームプローブ（例えば細菌のリボソームプローブ）
を用いるのが特に好ましい。このやり方で、前核有機体
の属、種および株を検出し、定量し、そして同定するこ
とができるだろう。最も好ましい前核リボソームプロー
ブの１つは細菌から得られるもので、その中でも特に、
使い易い、手に入り易いという点で大腸菌からのものが
よい。大腸菌から得たリボソームプローブは、いかなる
有機体にも、特にすべての前核有機体の同定に用いるこ
とができ、細菌のあらゆる属、種および菌株の同定のた
めに最も好ましい。他の、特に好ましい実施態様は、或
る与えられた科に由来する真核リボソームプローブを用
いて、同じ科の真核細胞有機体を同定することである
（例えば哺乳類有機体を確認するために哺乳類リボソー
ムプローブを用いる）。最も好ましいのは同じ亜科およ
び／又は目および／又は族の有機体から得たリボソーム
プローブとDNAを用いることである（例えばマウスの或
る種を同定する場合には、マウス由来のリボソームプロ
ーブを用いるのがよい）。

最も鋭敏で有効な対の系は、リボソームプローブの出
所と制限DNAの出所との間が進化的にあまり距離がない
か又は分散がより少い、という系である。

この技術に含まれる個々のステップは一般的に当業者
には知られている。これからそれらを、真核細胞および
前核細胞（適用できる場合）の両方に言及しつつ、又は
技術的に何らかの相異がある場合には、細胞の各々のタ
イプについて別々に、述べるつもりである。

第一段階は未知有機体からのDNAの抽出である。真核
細胞からの核DNAは当業者には既知の標準的方法によっ
て選択的に抽出することができる（例としてDrohan,W e
t al著，「Biochem.Biophys.Acta」,521（1978）,1−1
5,ここには参考文献として挿入されている）。小器官DN
Aは小さくて環状であるからスプーリング（spooling）
法が、非環状核DNAを、環状、小器官由来のDNAから分離
するのに役立つ。結果として、スプーリングされなかっ
た物質は、小器官由来のDNAを含み、これは密度勾配遠
心法によって個々に分離することができる。もう一つの
方法として、糸粒体（又は葉緑体）を、打ち砕いた細胞
の混合物から分離し、精製した糸粒体（又は葉緑体）フ
ラクションを小器官由来のDNAの調製に用い、精製した
核フラクションを核DNAの調製に用いる。（例えばBonen
L.and Gray M.W著「Nucleic Acids Research」8:319−
335（1980）参照）。

前核DNA抽出も当業者には良く知られている。例え
ば、工業的発酵懸濁液、寒天培地、植物又は動物組織又
は試料その他のような媒質中に存在する未知の細菌を、
高分子量DNAを抽出するように設定された周知の条件下
で処理する。例えば、未知の有機体の細胞を抽出緩衝液
に懸濁し、リボチームをこれに加え、この懸濁液をイン
キュベートする。細胞破壊は、洗浄剤の添加および／又
は温度上昇によって一層促進することができる。プロテ
アーゼ消化後クロロホルム／フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱を行ないDNAの抽出は完了する。フェノール
／クロロホルム抽出よりずっと早いもう一つの抽出法
は、エタノール沈澱を用いてDNAを速やかに分離する方
法である。この方法はDNAを直接コロニー又は少量の液
体培地から分離するために好んで使われる。この方法は
Davis,R.W.et al.著「A Manual for Genetic Engineeri
ng, Advanced Bacterial Genetics」（今後は「デービ
ス」と記す）、Cold Spring Harbor研究所,Cold Spring
Harbor,ニューヨーク,1980,p.120−121に記載されてい
る。

DNA（前核細胞又は真核細胞の（核又は核以外の））
は次の段階のために生理的緩衝液に溶解される。

抽出されたDNAの消化は制限エンドヌクレアーゼ酵素
で行う。どんな制限エンドヌクレアーゼ酵素でも用いる
ことができるが、勿論確認しようとするものと同じ種の
有機体から得たものでないならば、という条件がつく。
なぜならば、もしこの条件に反する場合は、DNAは完全
無傷のまま残るであろうから（このことが、結局は有機
体を同定することになるだろう。なぜならば酵素がそれ
自身の起源である種から得られたDNAを切断するとは思
われないからである）。特徴づけるべき有機体種は未知
であろうから、断片の消化物を得るには最少量の試行錯
誤が課されるが、これは熟練した当業者が不必要な実験
を行わずに日常的に実行できる程度の仕事である。可能
性のある制限エンドヌクレアーゼ酵素の例は、Bgl I,Ba
mH I,EcoR I,Pst I,Hind III,Bal I,Hga I,Sal I,Xba
I,Sac I,Sst I,Bcl I,Xho I,Kpn I,Pvu II,Sau IIIa,そ
の他である。デービス，同上,p.228−230もみよ。一種
類以上のエンドヌクレアーゼ混合物も消化のために用い
ることができる。普通は、DNAとエンドヌクレアーゼは
適当な緩衝液中で一緒に、適当な時間（１〜48時間の範
囲内、温度範囲は25℃−65℃で、好ましくは37℃）イン
キュベートする。

その結果得られたクロマトグラフパターンは、用いた
１又はそれ以上のエンドヌクレアーゼのタイプに依存す
るだろうし、エンドヌクレアーゼに特異的であるだろ
う。従って消化のためにどの酵素（１種類か又は数種
類）を用いたかに注意する必要がある。なぜならば、カ
タログに用いられる比較用パターンは、同じ酵素又は酵
素類を用いて作られていなければならないからである。

エンドヌクレアーゼ消化後、種々の大きさの断片を含
むインキュベーション混合物は適当なクロマトグラフィ
ー法によって分離される。核酸消化物を大きさによって
分離することができて、その後の核酸プローブとのハイ
ブリッド化を可能とする方法ならなんでも用いることが
できる。好ましいのはゲル電気泳動法であり、特に好ま
しいのは、アガロース・ゲル電気泳動法である。この装
置では、DNA消化物は、普通は適当な緩衝液中で電気泳
動にかけられ、ゲルは普通は、臭化エチジウム溶液に浸
され、多分加えられる標準マーカー断片が見えるように
するためにUV−光−箱に置かれる。

分離し、目で見えるようにした後、そのDNA断片をサ
ウザーン法によりニトロセルローズ濾紙に移す（「Jour
nal of Molecular Biology」38:503−517（1975））。
この移し換えは、変性および中和段階後に行うことがで
き、普通は長時間かけ（約10−20時間）るか又は電気的
力をかけて、ゲルから濾紙へと移される。ゲルから濾紙
への移動を促進する機器は市販されている。受けとった
ニトロセルローズ濾紙は次いでDNAを濾紙に結合するた
め高温（60−80℃）で数時間加熱される。濾紙に結合し
たDNA消化断片のハイブリッド化に利用されるプローブ
は、核酸プローブであり、或る与えられたよくわかって
いる有機体から得られたものであることが望ましい。そ
れは検出可能なように標識化されているか、又は標識化
されていないかのどちらかであるが、検出可能なように
標識化されているものが望ましい。この場合には、核酸
プローブは、そのような有機体から得られた検出可能な
標識化リボソームDNA（rRNA）、リボソーム情報を含む
切り込み翻訳標識化DNAプローブ、リボソーム情報を含
むクローンDNAプローブ又はプローブ有機体からのリボ
ソームDNAに相補的である検出可能な標識化DNA（rRNAcD
NA）のいずれかである。組合せの選択によって、リボソ
ームプローブは前核細胞からのものでも真核細胞（細胞
質由来、又は小器官由来）からのものでもよい。最も好
ましいのは、検出可能な標識が放射性燐のような放射性
標識であることである（例、³²P，³H又は¹⁴C）。核酸プ
ローブは金属原子で標識化してもよい。例えば、ウリジ
ンおよびシチジンヌクレオチノドは共有結合水銀誘導体
を形成することができる。水銀と結合したヌクレオシド
・三燐酸は逆転写酵素を含む多くの核酸ポリメラーゼの
良い基質である（Dale et al.,「Proceedings of the N
ational Academy of Sciences」70:2238−2242,197
3）。天然核酸の直接的共有結合による水銀化が報告さ
れた（Dale et al.,「Biochemistry」14:2447−245
7）。水銀化重合体のリアニーリング（reannealing）性
は、対応する水銀のない重合体のそれと似ている（Dale
and Ward,「Biochemistry」14:2458−2469）。金属標
識化プローブは、例えば光−聴音スペクトロスコピー、
Ｘ線スペクトロスコピー、例えばＸ線蛍光、Ｘ線吸収又
は光子スペクトロスコピーによって検出することができ
る。

真核細胞および前核細胞からのrRNAの分離は、当業者
にはよく知られている。例えば真核細胞質リボソームか
らrRNAを調製するためには、RNAを全細胞又はリボソー
ムから抽出し、スクロース勾配遠心法により分離するこ
とができ、18S型および28S型フラクションを分子量既知
のマーカーを用いて集めることができる（例えばPerry,
R.P.およびKelly,D.E.,著「28Sおよび18SリボソームRNA
の生産が少量のアクチノマイシンＤによって阻害される
時の5S RNAの持続性合成」J.Cell.Physiol.,72:235−24
6（1968）、ここに参考文献として記されている）。当
然の結果として、小器官由来rRNAは、同様な方法で、小
器官フラクションから分離され精製される（例えばVan
Etten R.A. et al.,「Cell」22:157−170（1980）、又
はEdwards,K.et al.,「Nucleic Acids Reserch」,9:285
3−2869（1981））。

もし放射性標識化リボソームRNAプローブを用いるな
らば、このものは、適当な放射能をもつ化合物を含んだ
栄養物、又はそのような化合物を含む培養培地中で、生
育又は培養されたプローブ有機体から分離される。プロ
ーブが相補性DNAである場合（rRNAcDNA）、このもの
は、プローブ有機体から分離されたrRNAを放射性ヌクレ
オシド・三燐酸（例えば³²P−ヌクレオシド又は³H−ヌ
クレオシド）の存在下、逆転写することによって作られ
る。

標識化リボソームプローブは、又切り込み翻訳DNA分
子、特に小器官由来の全環状DNAから得られたものであ
ってもよい。具体的には、葉緑体又は糸粒体の環状DNA
が、放射性標識の存在下切り込み翻訳されることによっ
て標識化DNAリボソームプローブが得られる。葉緑体標
識化プローブは、葉緑体DNAと最も良くハイブリッド化
し、糸粒体標識化プローブは、糸粒体DNAと最も良くハ
イブリッド化するであろう。葉緑体（又は糸粒体）の切
り込み翻訳標識化リボソームプローブは、糸粒体（又は
葉緑体）DNAと２番目に良くハイブリッド化するであろ
う。それは、あまり好ましくない形ではあるが、全植物
（又は動物）のDNAともハイブリッド化するだろう。リ
ボソームプローブは、実用性を考慮した場合はこの方法
が良いとはいえないとしても真核細胞の核DNAからも切
り込み翻訳によって得られるかもしれない。これを実現
するより有用なアプローチは、真核細胞の核DNAからrRN
A遺伝子を切りとり（制限酵素により）、断片を分け、
リボソーム遺伝子配列を同定し（ハイブリッド化によっ
て）、そしてそのリボソーム遺伝子配列を分離する（電
気泳動法によって）ことである。次いで分離したrRNA配
列はプラスミド又はベクターに再結合され、適当な宿主
の形質転換（transformation）後³²P−含有媒質中でク
ローニングを行えばよい。もう一つの方法は、形質転換
宿主を増殖し、次いでDNAを分離し、切り込み翻訳によ
ってそれを標識化するか、又はDNAを分離し、rRNA配列
を切りとり、次いで標識化する。得られたリボソームプ
ローブはrRNAcDNAと同じ状態でハイブリッド化する（後
記参照）。

好ましい核酸プローブは、プローブ有機体からのrRNA
に相補的な、放射性標識化DNAである。具体的には、rRN
Aはプローブ有機体からリボソームを分離し、個々に分
け、そして適したRNAを上述のようにして実質的に精製
する。斯くして得られたリボソームRNAは、リボソーム
を含まず、運搬RNA（tRNA）。又は伝達RNA（mRNA）のよ
うな他のRNAもほとんど含まない。前核細胞rRNAは普通
は３種類のサブグループを含む。いわゆる5S,16S,およ
び23S−断片である。cDNAへの逆転写は３種類すべての
混合物で行なわれるか、さもなければ16Sおよび23S断片
の混合物で行われる。これら成分のうち一つだけ逆転写
を行うのは、或る状態では可能であるとはいえ、あまり
好ましくはない。真核rRNAは、普通は２種類のサブグル
ープ、18S型および28S型を含む。そしてcDNAへの逆転写
は18Sおよび28S断片の混合物か、これらの中の各々によ
って行われる。

他の種類のRNAをほとんど含まない純粋のrRNAを、cDN
Aに逆転写することのできる逆転写酵素と共にインキュ
ベートする。この場合より好ましいのは、仔牛甲状腺DN
A加水分解物のようなプライマーの存在下において、鳥
骨髄芽球症ウィールス（AMV）からの逆転写酵素とイン
キュベートすることである。混合物は適当なデオキシヌ
クレオシド三燐酸を含んでいなければならず、そのヌク
レオシドのうち少くとも一つは、例えば³²Pによって、
放射性標識化されている。例えば、デオキシシチジン
５′−（³²P）、デオキシチミジン５′−（³²P）、デオ
キシアデニン５′−（³²P）、又はデオキシグアニジン
５′−（³²P）・三燐酸が放射性ヌクレオシドとして用
いられる。30分〜５時間、25℃−40℃でインキュベート
し、クロロホルムおよびフェノールによる抽出および遠
心分離並びにクロマトグラフィー後、放射性標識化フラ
クションを合一し、cDNAプローブとする。実質的には純
粋な型の放射性標識化cDNAプローブ、即ち非標識化分子
がなく、他の型のRNAに相補的なcDNAもなく、蛋白性物
質もなく、膜、小器官等の細胞成分もない放射性標識化
cDNAプローブも、本発明の一面を構成する。好ましいプ
ローブは前核細胞の標識化rRNAcDNAで、最も好ましいの
は細菌の標識化rRNAcDNAである、プローブの種は、細菌
性微生物、例えばエンテロバクテリアセア（Enterobact
eriaceae），ブルセラ（Brucella）、バシルス（Bacill
us）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラクトバシル
ス（Lactobacillus）、ハエモフィルス（Haemophillu
s）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、ビブリ
オ（Vibrio）、ネイセリア（Neisseria）、バクトロイ
デス（Bactroides）科に含まれる種、およびその他の嫌
気性群、例えばレジオネラ（Legionella）等が使われ
る。本出願において前核細胞の実施例は、細菌性前核プ
ローブ有機体としての大腸菌の使用に限れているとはい
え、決してこの微生物に限られるものではない。プロー
ブとして放射性標識化型のcDNAの使用は、DNAのハイブ
リッド化中の安定性がより大きいので放射性標識化リボ
ソームRNAの使用より好ましい。

標識化cDNAプローブがrRNAの忠実なコピーでなければ
ならないこと、即ち合成が行われるあらゆる時に鋳型rR
NAの全ヌクレオタイド配列が転写されたものであること
を認識することが重要である。プライマーの使用はこの
点で必須である。cDNAが忠実なコピーであるこというこ
とは、ハイブリッド化後にこれが二つの特性をもってい
るという事実によって証明することができる： 1.cDNAは標識化rRNAの100％をリボヌクレアーゼ消化か
ら保護しなければならない；そして 2.標識化cDNAは、S1ヌクレアーゼに対する抵抗によって
わかるように、rRNAに特異的にアニールしなければなら
ない。

ベルジャンスキーM.Mらの「C.R.Acad.Sc Paris」t28
6,シリーズD.,p.1825−1828（1978）には大腸菌rRNAに
由来する³H−放射性標識化cDNAについて記載されてい
る。この研究におけるcDNAは、本発明のようにプライマ
ーの存在下逆転写酵素で調製したものではなく、リボヌ
クレアーゼU₂を用いてあらかじめ分割しておいたrRNAを
鋳型として用いDNAポリメラーゼＩで調製したものであ
る。ベルジャンスキーらのrRNA消化産物（RNAseU₂によ
る）は、最初のrRNAと異なる塩基比を有し、塩基および
／又は短かい断片が失なわれたことを示している。この
ようにして得られたcDNAは忠実なコピーではない。その
上ベルジャンスキーが用いたDNAポリメラーゼＩの使用
は、rRNAのヘテロ重合転写に対するホモ重合転写の優位
に拍車をかけることが知られている（参照、Sarin P.S.
et al.,「Biochem.Biophys.Res.Comm.」,59:202−214
（1974））。

これらをまとめると、「リボソーム」プローブは、
ａ）rRNA遺伝子を含むゲノムDNAから、クローニングお
よび／又は切り込み翻訳によって、 ｂ）リボソームRNAそれ自身から、又は ｃ）rRNAcDNAから、rRNAの逆転写によって得られる。

本発明工程の次の段階は、未知有機体からの分離DNA
消化物の、標識化していないか又は（好ましくは）放射
性標識化したrRNA又はcDNAプローブとのハイブリッド化
である。ハイブリッド化は未知有機体からの共有結合的
に標識化されたDNA消化物を含有する紙を、リボソーム
プローブを含むハイブリッド化混合物と接触することに
よって行われる。インキュベーションは加温下（50−70
℃）長時間かけて行い、その後、濾紙を洗って結合して
いない放射能を除去し（必要な場合）、次いで空気乾燥
し、検出の用意をする。もう一つの、上記方法より遥か
に迅速にできる、非常に好ましいハイブリッド化は、コ
ーンD.E（Kohne,D.E）らの「Biochemistry」16:5329−5
341（1977）に参考文献として記載の。室温フェノール
乳濁液再対合法である。

ハイブリッド化後、この方法では適当にハイブリッド
形成した断片の選択的検出が必要である。この検出は、
ハイブリッド形成した断片が二重鎖構造であることを利
用し、これによる選択的方法（非標識化プローブの場
合）、ラジオオートグラフ法又はコンピューター化され
ていてもされていなくてもよく、これにより検出スピー
ドを増すのであろう適当な放射線スキャナー法（標識化
プローブの場合）によって行うことができる。これらの
方法は熟練した当業者にはよく知られており、この点で
これ以上記すことはないだろう。

この方法の最終産物は、特定の位置に種々の強度の明
および暗領域をもったクロマトグラフ帯パターンであ
る。これらの位置はEcoR I消化λバクテリオファージDN
Aのようなマーカーの分離法にかけることによって、特
定の断片サイズ（キロベース対）に容易に照合させるこ
とができる。このようにして帯相互の相対的位置も各帯
の絶対的大きさも容易に確かめることができる。未知有
機体の帯パターンをカタログ又はライブラリーにある帯
パターンと比較する。カタログ又はライブラリーには少
なくとも２から、ほとんど無限といってよい程の数の確
定せる種々の有機体の属および種のパターンを掲載する
本からなっていても良い。例えば人の病気を発生させる
病理学的に関係のある最近は約100と推定され、そのた
め、病原細菌の標準カタログは50〜150のそのようなパ
ターンを含むだろうと推定される。疫学的判定システム
のための細菌菌株の型のカタログもまた含まれていても
良い。

帯パターンは用いたエンドヌクレアーゼ酵素のタイプ
又はタイプ群に依存し、多分放射性標識化プローブの出
所（プローブ有機体）として用いられた特定の有機体
に、そして、又プローブ調製のために利用したリボソー
ムRNA情報の組成（例えば前核細胞の5S、16Sまたは23S
型サブタイプか、16Sおよび23S型のみか等）に依存する
だろう。こうして、カタログは各プローブ毎に、記録さ
れた帯サイズおよび相対的強度をもった、種々の酵素−
特異的帯パターンを含むかも知れない。濾紙に結合した
結合DNAの濃度が減るにつれて、最も強い帯のみが見え
るようになり、この又はこれらの帯のサイズで種を確認
することができる。これら帯パターンの一つずつは、そ
れぞれに完全なリボソームDNAで得られる帯パターンお
よび／又は或るサブタイプのみ含むリボソームDNAで得
られる帯パターンを含むかも知れない。叙上の変化又は
順列は、勿論、全てライブラリーに利用される。その上
真核有機体については、ライブラリーは一つのタイプの
DNA、又は小器官および／又は核−DNAの組み合わせを用
いることにより生じる諸パターンを含むかも知れない。
各DNA消化物のパターンは、プローブ組成に依るであろ
う。カタログは、もし１種類以上の株又は種が、抽出サ
ンプル中に存在していて、プローブによって検出される
場合、それから生ずるパターンを解釈できるように整理
されている。

ユーザーは、得られた帯パターンを視覚的に比較する
こともできるし、パターン認識用にプログラムされた一
次元のコンピューター式デジタルスキャナーによっても
比較することもできる。これらのコンピュータースキャ
ナーは、タイム−オブ−セール（time−of−sale）処理
（一般に利用される「スーパーマーケット」チェックア
ウトパターン読みとり装置）の当業者にはよく知られて
いる。理想としては、ライブラリー又はカタログは複数
の有機体の相対的帯パターンと、断片の分子量又はサイ
ズの絶対値とでコンピューターメモリーの中に入ってい
るべきである。そうなれば、カタログ比較は、貯蔵情報
要素の一つ又は両方（相対的パターンおよび／又は絶対
的サイズ要素）によって、未知のパターンをライブラリ
ーに存在するパターンの一つと照合することによって行
われる。標準と比較した時の各帯の強度は、ハイブリッ
ド化した結合DNAの量をあらわすこともできるので有機
体の存在の程度、例えば真核細胞中の前核細胞の存在の
程度を推定するのに用いることができる。

もしもユーザーが与えられた有機体の性質を確認し、
同定を更に進めたいと思うならば、そのようなユーザー
は、未知の有機体を第二の異るエンドヌクレアーゼで消
化し、得られた帯パターンを、二番目に選んだエンドヌ
クレアーゼの場合の有機体のカタログ帯パターンと比較
すればよい。この過程は、正確な同定を行うために必要
なだけ何回も繰返すことができる。しかしながら、普通
は単一プローブで一回分析をすれば大抵の場合は十分で
ある。

本発明およびその変法は無数に応用できる。本発明は
植物栽培者又は動物飼育者が彼等の対象物を正しく確認
するために用いてもよいし、臨床および微生物学研究室
で、真核細胞も含む何らかの媒体中に存在する細菌、寄
生虫又は菌類を同定するために用いてもよい。この後者
の場合は、この方法は標準微生物検定法として用いられ
る。なぜならば微生物の分離および増殖の必要がないか
らである。試験管内（in vitro）増殖および特徴づけ
は、現在、マイコバクテリウム・レプラ（Mycobacteriu
n leprae）（ライ病の病原菌）のような若干の微生物に
とっては不可能であり、必常的細胞内細菌（例えばリケ
ッチャー、グラミジア等）のような若干の微生物は標準
培地上では不可能であるか、不可能でなくても非常に危
険である（例えばB.アントラシス（B.anthracis）（炭
疽病の病原菌）。本法は核酸の単離に基づいており、そ
れは従来の細菌分離および特徴づけを行わないから、こ
れらの問題を排除することができる。この方法はこれま
で正式には記載のなかった微生物を検出することができ
ると思われる。その上本法は、種の異なる菌株を見分け
ることができ、これは、例えば細菌学における疫学的類
型化に役立つ。この方法は犯罪捜査で植物又は動物組織
を正しく、はっきりと同定するために、法医学実験室で
用いることができる。又作物被害の性質を確かめる場
合、昆虫学者が昆虫の種を速かに同定するためにも用い
られる。

更にこの方法を亜種以外の分類群（例えば植物根の窒
素酵素遺伝子；参照:Hennecke H291「Nature」354（198
1））の同定と結びつけることによって、この方法論は
個々の菌株の遺伝子型を調査し、同定するために用いる
ことができる。

この発明の方法は、微生物が見出されるあらゆる場所
で、微生物の同定に好ましく使用される。これら微生物
は生理学的物質中にも非生理学的物質中にも見出される
だろう。それらは工業的増殖培養基、培養肉汁等の中に
見出され、そして例えば遠沈法によって濃縮させられる
だろう。微生物が生理学的培地に見出されるのが好まし
いし、それが感染した動物源に見出されるのが最も好ま
しい。この後者の具体例では本法は動物、特に好ましい
のはヒトにおける細菌感染を診断するのに用いられる。
前核リボソームプローブによる細菌DNAの検出および同
定は高度に選択的で、動物（例えば哺乳類）DNAの存在
においてさえ障害なしにおこなえる。もし前核リボソー
ムプローブを用いるならば、糸粒体DNAとのハイブリッ
ド化を最小にする条件を選ぶか、糸粒体の帯を当該パタ
ーンから差し引くことができる。このようにしてこの技
術は臨床研究室、菌寄託機関、工業的発酵研究室等にお
いて用いることができる。

特に興味深いことは感染微生物の種および菌株の同定
に加えて、微生物の中に何らかの特殊な遺伝子配列の存
在を発見できる可能性のあることである。例えば、薬剤
耐性を仲介する伝達性プラスミッドＲ因子上に見出され
る抗生物質耐性配列の存在を検出することができる。標
識化Ｒ因子DNA又はクローン標識抗生物質耐性配列をハ
イブリッド化混合物に加えることによって、その有機体
の抗生物質耐性の有無を正しく決めることができる（正
規でない一本又は数本の帯があらわれる）。又、加えた
抗生物質耐性配列プローブ（１又は数種）の存在下で一
度ハイブリッド化した濾紙を再ハイブリッド化してもよ
い。又、別の方法として、未知のDNAをアリコートに分
け、第一のアリコートを同定のために、第二のアリコー
トを薬剤耐性配列の存否のために、第三のアリコートを
毒素遺伝子のために用いるというように試験することも
できる。又、別の方法として、一放射線核種（例えば³²
P）で標識化したリボソームプローブを別の放射線核種
（例えば³H又は¹⁴C）で標識化したＲ−因子プローブを
加えてハイブリッド化混合物中で用いることもできるだ
ろう。ハイブリッド化後、未知DNA中のＲ−因子DNAの存
在を、二種類のスキャナーによる走査でテストすること
ができる。一つは種および菌株同定のためであり（例え
ば³²P）、他の一つは薬剤耐性等のためのものである
（例えば³H又は¹⁴C）。この方法で実験者は、微生物の
分離および特徴づけをする必要なしに、属および種を同
定、菌株をタイプ分け、薬剤耐性、毒性生産若しくはそ
の他の特性、又は標識核酸配列若しくはプローブで検出
しうる種レベル以下の分類群のテストのすべてを、一つ
の実験で行うことができる。

Ｒ−因子は普遍的で、種の境界と交差しているので、
同定は、いかなる細菌属又は種においても、同じＲ−因
子プローブで行うことができる（参照:Tomkins,L.S.eta
l.J.Inf.Dis.,141:625−636（1981））。

更に、真核細胞又は前核細胞におけるウィールス又は
ウィールス関連配列の存在も本発明の方法を結合して検
出および同定することができる。「Manual of Clinical
Microbiology」第三版（発行者Lennette,E.H,Amer Soc
Microb1980,774−778）に掲載されているすべてのウィ
ールスを同定することができる。例えば、ピコルナヴィ
リデ（picornaviridae）、カリシヴィリデ（caliciviri
dae）、レオヴィリデ（reoviridae）、トガヴィリデ（t
ogaviridae）、オルトマイコヴィリデ（orthomyxovirid
ae）、パラマイコヴィリデ（paramyxoviridae）、ラブ
ドヴィリデ（rhabdoviridae）、レトロヴィリデ（retro
viridae）、アレナヴィリデ（arenaviridae）、コロナ
ヴィリデ（coronaviridae）、ブニアヴィリデ（bunyavi
ridae）、パブオヴィリデ（parvoviridae）、パポバヴ
ィリデ（papovaviridae）、アデノヴィリデ（adenoviri
dae）、ヘルペスヴィリデ（herpesviridae）、ヴィドヴ
ィリデ（vidoviridae）およびポキシヴィリデ（poxviri
dae）等。

１）ウィールス性ゲノムが宿主DNAに組み込まれている
場合（DNAウィールス例えばパポバヴィリデメンバー、R
NAウィールス例えばレトロヴィリデメンバー）は、高分
子量DNAを組織から抽出し、制限酵素によって消化す
る。全体的手順は細菌の場合と同様である。ウィールス
性プローブの選択は、この場合も、求められている課題
次第であり、「プローブウィールス」および検出すべき
ウィールス関連配列間の相同性の程度に依存する。都合
よい配列相同性を得るためには、プローブおよび組織の
配列がウィールスの同じ科属又は種に関係していること
が必要だろう。保存された配列の程度に加えて、ウィー
ルスプローブが宿主DNAのウィールス関連配列とハイブ
リッドを形成するかしないかは、ハイブリッド化の条
件、例えばストリンジェント条件であるかリラックス条
件であるかによって決まるだろう。ハイブリッド化の結
果は、宿主DNAに組み込まれたウィールス性配列がある
ことを示す一本の帯又は帯パターンであるだろう。この
情報は、発癌の予測に役立つ。クローン化ウィールス配
列を含む標識化相補性核酸プローブのいずれをもプロー
ブとすることができる。RNAウィールスの場合には、例
えばウィールスRNAを用いて逆転写酵素でDNAを作ること
ができ、DNAウィールスの場合には、例えば切り込み翻
訳によって標識化したウィールスDNAを用いることがで
きる。ここでも複数のプローブ、特に、異なる標識をし
たプローブを用いることができる。

同じ一般的特徴がDNAおよびRNAウィールスに等しくあ
てはまる。ウィールスのゲノムは相対的に小さく、沈降
核酸は遠心分離によって集めるのが好ましい。全操作を
核酸全部を用いて行ってもよいし、種々の操作を別々に
行ってもよい。遠心分離する前日に、細胞DNAをスプー
リングで、取り除くことにより、ウィールス核酸を濃縮
することができると考えられる。これは、ウィールスゲ
ノムが組み込まれているかどうかを調べるためにも用い
ることができる。

ウィールスプローブをハイブリッド化するためには、
そのプローブが未知有機体と同じ科、属又は種であるこ
とが必要だし、少くとも最も好ましい。反応条件、スト
リンジェントかリラックスかが、与えられたプローブと
関連性の低いゲノムとがハイブリッドを形成するか否か
を決める。プローブは、標識化されたクローンウィール
ス配列であるかも知れないし、完全なゲノム又はその一
部であるかも知れない。

前記したサウザーンに記載の方法は、大きいDNA断片
（約0.5キロペース以上）を、アルカリ変性後、ニトロ
セルロース紙に移し換えるために有用である。この方法
はDNAウィールスの場合には有用で、RNAウィールスの場
合には役に立たないかも知れない。RNAを活性化セルロ
ース紙（ジアゾベンジルオキシメチル紙）に移して共有
結合で結合させ、そしてこれをRNAウィールスのために
用いることができる。サウザーン法のトーマスによる変
法（Thomas,P.,「Proc.Nat.Acad.Sci」USA77:5201−520
5（1980））は、RNAおよび小さいDNA断片を、ハイブリ
ッド化のために、ニトロセルロース紙に効率的に移すの
に用いることができる。RNAおよび小DNA断片を、グリオ
キザールおよびジメチルスルフォキシドで変性し、アガ
ロースゲル中で電気泳動にかける。この操作で、100〜2
000ヌクレオタイドであるDNA断片、及びRNAは効率的に
移動し、ハイブリッド化中ニトロセルロース紙上に残留
する。これは、小さいリボソームDNA断片に対しても有
用である。そこで、最も好ましいのは制限酵素によって
消化された標本を分割し、その一部の核酸をグリオキザ
ールで変性することである。サウザーンおよびトーマス
操作法は、最大量の情報を与えるでろう。

２）DNAウィールスの場合、二重鎖（DS）ウィールスDNA
で制限分析を行うことによって存在するウィールスを同
定することができる。単鎖（SS）DNAウィールスは種々
異る長さのゲノムを有するだろう。ハイブリッドを形成
するプローブ（配列情報はDS−DNAに変換され得る）、
ハイブリッドを形成した断片のパターンおよび／又は１
若しくは複数のサイズはウィールスの同定に使用でき
る。ここでも又、相補性核酸プローブを得る多数の方法
がある。例えばDS−DNAの場合は、切り込み翻訳を用い
ることができ、SS−DNAの場合には、DNAポリメラーゼが
cDNA合成のために用いられる。

３）RNAウィールスの場合、RNAは制限エンドヌクレアー
ゼによって消化されない（配列情報はDS−DNAに変換さ
れたかも知れない）。異るRNAウィールスのゲノムは異
る大きさをもち、若干のRNAウィールスのゲノムには１
分子以上の分子がある。このことにより、或るプローブ
又は合一プローブによって検出された塩基配列に沿っ
て、RNAウィールスを同定することができる。プローブ
の１例は、ウィールスRNAを用いて合成したcDNAであ
る。

標本中の感染性病原菌を探す場合、その標本から核酸
を抽出することにより、又は先づ培地又は細胞で培養し
て病原菌の数をふやすこと、又は遠心法のような濃縮過
程を用いること又はすべてのアプローチを試みることに
よって直接的に探すことができる。

本発明から、その方法を実行するために必要な要素を
含む「キット」を作成することは容易である。そのよう
なキットは、試験管又はバイアルのような１個以上の容
器をその中にきっちりと詰められるように仕切られたキ
ャリヤーからなるものであろう。上記容器の一つは、非
標識化核酸プローブ又は例えば有機体プローブからのリ
ボソームRNAに対する放射性標識化cDNAのような検出可
能に標識された核酸プローブ（細菌を確認するためのキ
ットの場合は、前核細胞のrRNAcDNAが一層好ましい）を
含んでいて良い。標識化核酸プローブは、凍結乾燥の形
か又は必要ならば適当な緩衝液中に存在するだろう。１
又はそれ以上の容器は未知有機体からのDNAの消化に利
用される一種類かそれ以上のエンドヌクレアーゼ酵素を
含むだろう。これら酵素はそれだけで、又は混合物とし
て、凍結乾燥形か、適当な緩衝液溶液となって存在す
る。キットに採用される酵素類は、そのためのカタログ
が用意されているような酵素であることが理想的であ
る。しかしユーザーが実験時に自分達自身の比較標準を
作ることを防げるものは何もないので、もしユーザー
が、或る未知のものが実際に、与えられた属又は種のも
のであることを疑うならば、その人は既知のものの帯パ
ターンを作り、それを未知のものの帯パターンと比較す
ればよい。このように、キットはこのサブプロセスを行
うのに必要なすべての要素含んでもよい。これらの要素
とは、１以上の既知有機体（細菌のような）又は既知有
機体から分離されたDNAを含む。その他に、キットは、
広く小冊子、又は本又はパンフレットと定義される「カ
タログ」又はコンピューターテープ又はディスク、又は
コンピューターアクセスナンバー等々を含み、これらは
植物の種、哺乳類の種、細菌の種、特に病原学的に重要
な細菌、昆虫の種等のような或る群の種々の有機体のク
ロマトグラフィー帯パターンを内蔵する。このようにし
てユーザーは未知有機体の帯パターンを用意し、これを
カタログ内のパターンと視覚的に（又はコンピューター
で）比較するだけでよい。キットは又、一つの容器中に
はプローブ合成のためのプローブrRNAを、もう一つの容
器中には放射性標識化デオキシリボヌクレオシッド・三
燐酸を、そしてもう一つの容器にはプライマーを含んで
いても良い。このようにしてユーザーは自分自身のプロ
ーブrRNAcDNAを作ることができる。

最後に、キットは、緩衝液、増殖培地、酵素、ピペッ
ト、プレート、核酸、ヌクレオシッド・三燐酸、濾紙、
ゲル原料、移し換え材料、オートラジオグラフィー補充
品のような、本発明の技術を行うために必要な付加的要
素のすべてを含んでいても良い。それは又、抗生物質耐
性配列プローブ、ウィールスプローブ又はその他の特異
的性質をもつプローブも含んでいても良い。

これまで本発明を一般的に述べてきたが、本発明は一
定の実施例を参照することにより、より良く理解される
であろう。なお、実施例は単に説明の目的のためにのみ
記載されたものであり、特記しない限り本発明を制限す
る意図はない。

材料および方法 A.細菌 高分子量DNAの抽出 細菌肉汁培養物を遠沈し、細胞を冷食塩水で洗った。
その細胞を詰め込んだ（packed）細胞のグラム重量の約
10倍のml容量の抽出緩衝液（0.15M塩化ナトリウム、0.1
M EDTA、0.03MトリスpH8.5）に懸濁させた。リゾチーム
10mg/mlを最終濃度0.5mg/mlとなるように加えた。懸濁
液を37℃で30分間インキュベートした。細胞破壊は、25
％SDSを最終濃度2.5％になるように加え、濃度を10分間
60℃に上げることによっておこなった。水浴中で冷却
後、メルカプトエタノールを最終濃度１％になるように
加えた。プロナーゼ 20mg/ml0.02Mトリス緩衝液（pH7.
4）を37℃で２時間予備消化し、それから最終濃度1mg/m
lになるように加えた。その溶液を37℃で18時間インキ
ュベートした。フェノールは再蒸留したフェノール１
、二回蒸留た水2.5l、飽和トリス塩基270ml、メルカ
プトエタノール12ml及び最終濃度10^-3Ｍになるような量
のEDTAを混合し、４℃でその混合物を分離せしめること
により調製した。そのフェノールを洗浄用緩衝液（10^-1
Ｍ塩化ナトリウム、10^-3M EDTA、10mMトリスpH8.5）で
洗った。それから等量の新鮮緩衝液を加えた。メルカプ
トエタノールを最終濃度0.1％になるように加えた。溶
液を混合し、４℃で貯蔵した。調製したフェノール半容
量とクロロホルム半容量を溶菌細胞溶液に加えた。これ
を約10分間振とうし、3400×ｇで15分間遠沈した。水相
を25mgガラスピペットで除去した。境界にほとんど沈澱
物がなくなるまでこの抽出操作を繰返した。1/9容量の2
N酢酸ナトリウム（pH5.5）を水相に加えた。２倍容量の
−20℃95％エチルアルコールをフラスコの壁面に沿って
ゆっくりと注いだ。パスツールピペットの先端を溶融し
て閉じ、沈降DNAをスプールするために用いた。高分子
量DNAは緩衝液中に溶解した（10^-3M EDTA、10^-2Ｍトリ
スpH7.4）。DNA濃度は、換算係数として吸光度１単位に
ついて30μｇを用い、260nmにおける吸光度により測定
した。

DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化 EcoR I制限エンドヌクレアーゼ反応は、0.1Mトリス−
HCl pH7.5、0.05M NaCl、0.005M MgCl₂、および100μg/
ml仔牛血清アルブミン中で行われた。EcoR I反応混合物
はDNA/μｇにつき５単位の酵素を含んでおり、これを37
℃で４時間インキュベートした。PST I制限エンドヌク
レアーゼ反応は、0.006Mトリス−HCl pH7.4、0.05M塩化
ナトリウム、0.006M塩化マグネシウム、0.006M2−メル
カプトエタノール、および100μg/ml仔牛血清アルブミ
ン中で行われた。PST I反応混合物はDNA/μｇにつき２
単位の酵素を含み、これを37℃で４時間インキュベート
した。通常、10μｇのDNAは最終容量40μｌに消化され
た。10倍濃度の緩衝液を加えた。滅菌蒸留水をDNA溶量
に応じて加えた。λ−バクテリオファージDNAは、断片
の大きさ決定のためのマーカー帯を作るため、EcoR Iで
制限された。普通２μｇλDNAは20単位のEcoR Iで消化
されて最終容量20μｌになった。

ゲル電気泳動法およびDNA転移 DNA消化物に約20％までのグリセロールおよびブロモ
フェノールブルー色素を加えた。λDNA消化物の場合
は、１×EcoR I緩衝液20μｌを各20μｌ反応混合物に加
えた。普通は75％グリセロール15μｌおよび0.5％ブロ
モフェノール色素５μｌを各40μｌ反応混合物に加え
た。

消化した細菌DNA10μｇおよび消化したλDNA2μｇを
パー・ウエル（per well）に入れ溶かしたアガロースで
表面をおおう。消化物を0.02M酢酸ナトリウム、0.002M
EDTA、0.018Mトリス塩基、および0.028MトリスHCl pH8.
05を含む0.8％アガロース中、35Vで、色素が13〜16cm泳
動するまで電気泳動をおこなった。その後ゲルをエチジ
ウムプロミド（0.005mg/ml）に浸し、λ断片を見えるよ
うにするためUV光箱に置いた。DNAを上述のサウザーン
の方法でニトロセルロース濾紙に移した。ゲルは、振動
台上で20分間、変性溶液（1.5M塩化ナトリウム、0.5M水
酸化ナトリウム）で処理した。変性溶液を中和溶液（3.
0M塩化ナトリウム、0.5MトリスHCl pH7.5）に置き代
え、40分後、そのゲルをpH紙でチェックした。中和後、
ゲルを６×SSC緩衝液（SSC＝0.15M塩化ナトリウム、0.0
15Mクエン酸ナトリウム）で10分間処理した。ゲルと、
ニトロセルロース紙を通し、６×SSCを、ペーパータオ
ルの束で15時間吸引することによりDNA断片をゲルから
ニトロセルロース紙に移した。3mmクロマトグラフ紙２
枚の間にフィルターを置き、アルミホイールで、光った
側を外側にして包み、真空オーブン中80℃で４時間乾か
した。³² PリボソームRNA相補性DNAの合成（³²P−rRNAcDNA） 大腸菌Ｒ−13 23Sおよび16S型リボソームRNAに相補
的な³²P−標識DNAを、鳥骨髄芽球症ウィールス（AMV）
からの逆転写酵素を用いて合成した。反応混合物は、５
μｌの0.2Mジチオトレイトール、25μｌの1MトリスpH8.
0、8.3μｌの3M塩化カリウム、40μｌの0.1M塩化マグネ
シウム、70μｌのアクチノマイシン、14μｌの0.04M dA
TP、14μｌの0.04M dGDP、14μｌの0.04M dTTP、および
96.7μｌの水を含んでいた。次のものをプラスチック製
チューブに加えた:137.5μｌの反応混合物、15μｌの仔
牛胸線プライマー（10mg/ml）、７μｌのH20、３μｌの
rRNA（40μg/OD単位濃度を用いると、2.76μg/μｌとな
る）、40μｌのデオキシシチジン５′−（³²P）三燐酸
（10mCi/ml）、および13μｌのAMVポリメラーゼ（6,900
単位／μｌ）。酵酵反応を37℃で1.5時間行なった。そ
の後、その溶液を5mlずつのクロロホルムおよび調製フ
ェノールで抽出した。遠心分離後（JS13,600RPM）、水
相を直接セファデックス Ｇ−50カラム（1.5×22cm）
上に積層した。プラスチック製の10mlピペットをカラム
として用いた。小さいガラスビーズ１個を先端に置き、
ピンチ金具をつけたゴム管が装着され、１晩0.05％SDS
に浸して膨潤した脱気Ｇ−50を加えた。水相を壁に沿っ
て直接Ｇ−50に流し込み、それから0.05％SDSで溶出し
た。0.5mlずつの20フラクションをプラスチック製バイ
アルに集めた。ピークフラクションを含むチューブは、
³H−識別器を用いて各試料毎に0.1分間計数を行い、全
カウントを記録するセレンコフ計測法で発見した。ピー
クフラクションを合一した。アリコートをアクエゾル
（市販で入手可）に加え、1ml当りの³²PのCPM（毎分カ
ウント）をシンチレーション計数器によって測定した。

ハイブリッド化およびオートラジオグラフィー リボソームRNA遺伝子配列を含む断片を、フィルター
上のDNAを³²P−rRNAcDNAにハイブリッド化した液、オー
トラジオグラフィーによって検出した。

フィルターを、ハイブリッド化混合液（３×SSC、0.1
％SDS、100μg/ml変性および超音波処理した犬DNAおよ
びダインハルト溶液（それぞれ0.2％の仔牛血清アルブ
ミン、フィコール（Ficoll）、およびポリビニールピロ
リジン））中に、68℃で１時間浸した。³²PrRNAcDNAを
４×10⁶CPM/mlの割で加え、ハイブリッド化反応液を68
℃で48時間インキュベートした。それからフィルターを
３×SSCで洗い、次いで0.1％SDSで15分間隔で２時間又
は清浄溶液が約3,000cpm³²P/mlを含むようになるまで洗
った。フィルターを空気乾燥し、プラスチックラップで
包み、コダックＸ−OMATRフィルムで70℃で約１時間オ
ートラジオグラフィーを行った。

B.哺乳類実験 ムス・ムスキュラス・ドメスティクス（マウス）のrR
NAプローブを18Sおよび28S型および28S型だけのrRNAか
ら合成した。核酸をマウス肝から抽出し沈澱させた。高
分子量DNAをスプールし、除去した。残った核酸を遠沈
法により集め、50mM MgCl₂および100mMトリスpH7.4の緩
衝液に溶かした。DNAse（RNAseは含まず）を濃度50μg/
mlになるまで加えた。混合物を37℃で30分間インキュベ
ートした。生成したRNAを再抽出し、エタノール沈澱
し、1mM燐酸ナトリウム緩衝液pH6.8に溶解した。0.1Mト
リスpH7.4および0.01M EDTAの５〜20％スクロース勾配
溶液を用意した。試料を加え、その勾配をSW40回転子で
７時間、35K rpmで回転させた。フラクションを光学密
度により集めた。既知の分子量マーカーとの比較により
18Sおよび28Sフラクションを選んだ。

すべての哺乳類実験で、リラックス（relaxed）ハイ
ブリッド化条件を用いた。54℃。洗浄処理は54℃で行
い、0.05％SDSを加え３×SSCで15分間ずつ３回別々に洗
った。

実施例１ 細菌の種は、リボソームRNA遺伝子の制限エンドヌク
レアーゼ分析によって定められる。

本実施例に用いられたP.アエルギノーザの数種の菌株
は、種を同定する最少の表現型特性を有する（Hugh R.
H.,et al.「Manual of Clinical Microbiology」第２
版,ASM,1974,pp,250−269）（第２表）。他の３つのシ
ュードモナスおよび２のアシネトバクター（Acinetobac
ter）の菌株を選び、種および属を比較した（第３
表）。

シュードモナスおよびアシネトバクター種の比較のため
に用いた菌株は第３表に列挙する。

アシネトバクター種を属を、比較するために選んだの
は、それらが一定の属性を多くのシュードモナス種と共
有するからである。

EcoR I消化物中の断片の大きさ（キロベース対）はP.
ストウッゼリ（P.stutzeri）16.0、12.0、9.4;P.フルオ
レッセンス（P.fluorescens）16.0、10.0、8.6、7.8、
7.0;P.プチダ（P.putida）24.0、15.0、10.0、8.9;A.ア
ニトラタス（A.anitratus）20.0、15.0、12.5、9.8、7.
8、6.1、5.2、4.8、3.8、2.8（最も小さい３断片の大き
さは計算しなかった）;A.ルオッフィ（A.lwoffii）12.
0、10.0、9.1、7.0、6.4、5.7、5.5、5.3、4.8、4.4、
3.6、3.2、2.9（最も小さい３断片の大きさは計算しな
かった）である。PST I消化物中の断片の大きさ（キロ
ベース対）を次に示す;P.ストウッゼリ6.7、6.1、5.5;
P.フルオレッセンス10.0、9.4、7.8、7.0;P.プチダ10.
5、9.9、6.8、6.3、4.4;A.アニトラタス36.0、28.0、2
0.5、12.0、10.0、5.8、3.7、2.6、2.4;A.ルオッフィ9.
9、8.7、7.2、5.7、4.0、3.6、3.2、2.7。

P.アエルギノーザの７菌株から得られたハイブリッド
を形成した制限断片を比較すると、この種は、10.1、9.
4、7.6および5.9キロベース対（KBP）の、rRNA遺伝子配
列を含む断片EcoR I−特異的組み合わせによって定めら
れる、という結論に達する（第１図）。

7.6KBP EcoR I断片は、この試料では７菌株中４菌株
にあらわれる。同様な情況が種の菌株のいくつかの表現
型特性の中にもおこる。７菌株からの断片のEcoR I組み
合わせがその菌株を２群に分けるために用いられるとい
う事実は、P.アエルギノーザの最少表現型特性をもつ２
つの種があるという推論をひき出す。DNAをPST Iで消化
した実験結果（第２図）から、EcoR I7.6KBP断片によっ
て示される菌株の変異は種内の変異をあらわす、という
結論を導く。なぜならば、PST I断片の１つの保存組み
合わせ、9.4、7.1、6.6および6.4KBPがあって、それが
その種を定めているからである。9.4および6.6KBPのPST
I断片は、P.アエルギノーザの７菌株の中６菌株にあら
われる;7.1および6.4KBP PST I断片は試料とした菌株の
すべてにあらわれる。PST I断片の変異は、EcoR I7.6KB
P断片を含まない菌株におこる;RH151は10.1および8.2KB
P断片をもち、RH809は9.4KBP断片を含まないで、6.0KBP
断片をもっている。そしてタイプ菌株のRH815は6.6KBP
断片を含まない。ハイブリッドを形成した断片のパター
ンは、酵素に特異的な保存組み合わせが種の決定に用い
られ得る、という結論を支持する。一つの種の菌株は多
分多数の断片を保存組み合わせとしてもっているのであ
ろう。若干の菌株に断片の変異があっても、それは同定
化を妨害するものではなく、疫学的研究に役立つことを
証明するものと言える。

P.アエルギノーザ菌株におけるEcoR I7.6KBP断片の変
異発生は、他のシュードモナス種のタイプ菌株に見出さ
れるハイブリッド形成EcoR I断片を試験することによっ
て展望的に考えられるかも知れない（第３図）。P.スト
ウッエリ、P.フルオレッセンスおよびP.プチダのタイプ
菌株は7.6KBP断片を含まないが、同じ大きさのEcoR I断
片を共通してもっている;P.アエルギノーザおよびP.ス
トウッエリは9.4KBP断片を有しP.ストウッエリおよびP.
フルオレッセンスは16KBP断片を有し、Ｐ。フルオレッ
センスおよびP.プチダは10KBP断片をもっている。一般
に断片の大きさは４つのシュードモナス種のタイプ菌株
各々に特有なものである；そして各々の種のタイプ菌株
はそれぞれ異なるサイズ範囲の断片を有する。これらの
一般的説明はPST I消化物についても言える（第４
図）。

４つのシュードモナス種および２つのアシネトバクタ
ー種のそれぞれの断片パターン又はその１菌株を比較す
る場合、各属の種は似ているが、属同志は異なると結論
づけることができる。２つのアシネトバクター種は４つ
のシュードモナス種に比べて、ハイブリッド形成断片サ
イズの範囲がより大きい。

大腸菌、バシルス・スリンジネンシス（Bacillusthur
ingiensis）およびB.ズブチルス（B.subtilis）で得ら
れるような制限酵素地図の助けがなければ、どこで酵素
がrRNA遺伝子を切るのか、１ゲノムあたりのコピーの数
および複数の遺伝子又は不均質遺伝子間に非相同性フラ
ンキング部（fiankingregions）があるのかを予想する
ことは不可能である。大腸菌のrRNAcDNAプローブはrRNA
遺伝子配列を含む若干の制限断片とはハイブリッドを形
成しないかも知れないし、もしそうならば、これは試験
有機体と大腸菌との間に進化的距離又は分散があること
を反映している。rRNAの保存性質を用いてこれがその場
合にあたらないと論ずることができる。しかしながらこ
れは未知のいかなる種にも等しく適用できる標準プロー
ブがあるという利点に比べれば小さい問題である。

実施例２ 制限分析と、DNA−DNA液体ハイブリッド化との比較： 本研究に用いた菌株は第４表および第５表に列挙す
る。

高分子量DNAが各々の菌株から分離された。RH3021お
よびRH2990の標識化DNAを用いて液体DNA−DNAハイブリ
ダイゼーションデータを集めた。結果を第６表に示す。

このデータは二つのハイブリッド化群があることを示
す。同様なデータが、B.ズブチリスについて文献に報告
されている（Seki et al,「International Journal of
Systematic Bacteriology」25:258−270（1975））。こ
れら２群をRH3021およびRH2990によって代表させること
ができる。リボソームRNA遺伝子の制限エンドヌクレア
ーゼ分析が行われる。EcoR I消化物（第５図）は２群に
分けることができた。RH3021によって代表される群れは
二つの強くハイブリッド化する断片を有する（2.15およ
び2.1KBP）。RH2990によって代表される群は二つの強く
ハイブリッド化する断片（2.6および2.5KBP）を有す
る。EcoR Iデータを用いてB.ズブチリス菌株をDNA−DNA
ハイブリッド化群の適当な所に置くことができる。DNA
−DNAハイブリッド化70％ルールによれば、B.ズブチリ
スは実際には二つの種である。しかしながら、PST Iデ
ータ（第６図）を考慮すれば、それらのグループを、共
通の祖先又は種属形成事象にかかわった二つの分散する
集団と考えることができる。B.ズブチリスは１つの種で
あるとする結論は表現型データと相関している。第５表
に並べた菌株は、ゴードンR.Eら著の「The Genus Bacil
lus」Agriculture Handbook No.427（アメリカ農務省、
農業リサーチサービス ワシントンD.C）p36−41でB.ズ
ブチリスと同定されている。制限分析は、DNA−DNAハイ
ブリッド化データに匹敵するデータを用意することがで
きるし、又、適切な酵素を選ぶことによって、制限分析
は分散にもかかわらず種を十分に定めることができる。
RH3061はPST Iサイトを失った。しかしながらEcoR Iデ
ータは、その菌株がB.ズブチリスであることを示唆す
る。同じことがBgl IIデータ（第７図）およびSac Iデ
ータ（第８図）から結論づけられる。

実施例３ 制限分析の安定性パターン及びその他 バシルス ポリミカ（Bacillus polymyxa）実験 B.ズブチリスおよびB.ポリミカは、EcoR Iデータ（第
９図）、PST Iデータ（第10図）Bal IIデータ（第11図
左）およびSac Iデータ（第11図右）によって区別する
ことができる。PST I帯パターンにおける大きい差か
ら、バシルス・ポリミカは間違った属に入っていると結
論づけることができる。両方の種は共に胞子を生成する
が、それらは表現型的には似ていない。ATCCおよびNRRL
両方の培養コレクションのB.ポリミカのタイプ菌株は同
じ帯パターンをもつことは確かである。しかし重要なデ
ータは無胞子性突然変異体が同定できるということであ
る。もしそれらが胞子を作ることができないならばバシ
ルス種を同定することは非常にむずかしく、多分不可能
だろう。

実施例４ マウス組織中の細菌種を分離せずに同定する スイスマウス、ムス、ムスキュラス・ドメスティクス
（Mus musculs domesticus）（同系交配株）にストレプ
トコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumonia
e）RH3077（ATCC6303）の混濁懸濁液0.5mlを腹腔内に接
種した。マウスが瀕死の状態になった時、心臓、肺、肝
を摘出した。高分子量DNAをこれら組織、S.ニューモニ
エRH3077およびスイスマウス器官から分離し、DNAを消
化するためのEcoR Iを用いて、rRNA遺伝子の制限エンド
ヌクレアーゼ分析の操作を行った。フィルターを３×SS
Cで洗う以外に、２×15分間0.3×SSCおよび0.05％SDSで
洗った。オートラジオグラフィーを48時間行った。デー
タ（第12図）はS.ニューモニエが７ケのハイブリッド形
成断片によって定められることを示した（17.0、8.0、
6.0、4.0、3.3、2.6および1.8KBP）。この細菌のcDNAプ
ローブは２つのマウスDNA断片（14.0および6.8KBP）と
はあまりハイブリッド化しない。ハイブリッド形成断片
は感染組織におけるS.ニューモニエの存在を知らせるも
のである。心臓DNA抽出物中には７帯すべてが見られ
る。肝DNA抽出物中ではそれらの強度はより小さいが、
オートラジオグラフィーにより全部を見ることができ
る。肺DNA抽出物中には6.0KBP帯のみがあらわれる。肺
に細菌の数が少いのは、そのマウスが肺炎よりむしろ敗
血症にかかっているためと説明することができる。肺は
剖検で固質化を示していなかった。この検定の感度を調
べるために、細菌DNAをマウスDNAで稀釈し、電気泳動に
かけた。0.1μｇ細菌DNAを用いると、７つの帯すべてを
オートラジオグラフで見ることができた。10^-3μｇ細菌
DNAでは、17.0、8.0および6.0KBP帯が見られた。10⁶S.
ニューモニエの細胞あたり５×10^-3μgDNAという数字を
用いると（Biochem Biophys Acta26:68）、10^-1μｇは
２×10⁷細胞に相当する。本法はこの感度レベルで感染
症の診断に役立ものである。

この実施例も、細菌プローブがマウスに特異的なEcoR
I断片とハイブリッド化することを示している（第９図
参照、14.0および6.8KBPをもつ断片）。これらの断片は
マウス18Sおよび28S型リボソームRNAプローブによって
検出されたEcoR I断片に対応する（第14図、前記は6.8K
BP断片が28S型rRNA配列を含むことを示す）。細菌プロ
ーブは、哺乳類リボソームRNA遺伝子配列とはあまりよ
くハイブリッド化しないので、帯は強度がより小さく、
細菌プローブおよび核哺乳類RNAの系は感度がより小さ
く、感染している前核細胞のDNAに対する選択性がはっ
きりあらわれる。細菌プローブをレーン（lane）当り10
μｇ消化細菌DNAにハイブリッド化させた実験で、細菌
の帯は明らかに見えた時でも１レーン当り10μｇ消化ヒ
ト又はマウスDNAに対するハイブリッド形成は発見され
なかった。

実施例５−８ 哺乳類実験 これらの実施例は、rRNA制限分析によって有機体を確
認するという概念が、細菌のみならず複雑な真核有機体
にも成功裡に適用されることを説明するものである。

第13図は哺乳類の属がムス・ムスキュラス・ドメステ
ィクス18Sおよび28S型rRNAプローブで確認できること、
およびムスのいくつかの種が区別できることを示す。こ
の図では、酵素はPST Iで、対象物およびそれぞれの帯
は次のようである。

1.ムス・ムスキュラス・メロスイナス（Mus musculus m
elossinus）（マウス）14.5。13.5、2.6 2.ムス・ムスキュラス・ドメスティクス（マウス）13.
5、2.6 3.カニス・ファミリアリス（Canis familiaris）（犬）
12.0 4.カビア・ポルセルス（Cavia porcellus）（モルモッ
ト）17.0、14.0、13.0、8.8、5.7、4.7および3.0以下の
帯１個 5.クリセトウラス・グリセウス（Cricetulus griseus）
（ハムスター）25.0、4.7 6.ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ヒト）15.0、5.
7 7.フェリス・カタス（Felis catus）（猫）20.0、9.7 8.ラタス・ノルベジカス（Ratus norvegicus）（ラッ
ト）12.5 9.ムス・ムスキュラス・ドメスティクス（マウス）13.
5、2.6 10.ムス・セルビコロー・セルビコロー（Muscervicolor
cervicolor）（マウス）14.0、2.7 11.ムス・セルビコロー・パペウス（Muscervicolor pap
eus（マウス）13.5、2.6 12.ムス。パハリ（Mus pahari）（マウス）13.0、3.7 13.ムス・コッキィー（Mus cookii）（マウス）13.5、
2.6 第14図はマウスおよび猫DNAが、28S型rRNAcDNAのみに
よって区別できること、およびハイブリッド化した帯の
パターンがプローブ配列の構成に依存することを示す。
第14図では酵素はEcoR Iで、対象物および帯は次のよう
である。

1.ムス・ムスキュラス・ドメスティクス（マウス）6.8K
BP 2.フェリス・カタス（猫）8.3KBP 第15図では酵素はSac I、対象物および帯は次のよう
である。

1.エリスロセバス・パタス（Erythrocebus patas）（パ
タス猿）8.5、3.7、＜3.0 2.ラタス・ノルベジカス（ラット）25.0、9.5、3.6、＜
3.0 3.ムス・ムスキュラス・ドメスティカス（マウス）6.
8、＜3.0 4.フェリス・カタス（猫）9.5、5.3、4.0、＜3.0、＜3.
0 5.ホモ・サピエンス（ヒト）10.5、＜3.0 6.マカカ・ムラッタ（Macaca mulatta）（レーザス猿）
9.8、＜3.0 第15図（Sac I消化）をその他の哺乳類の図と比較す
る時、ハイブリッド形成パターンが酵素に特異的である
ことがわかる。

第16図は霊長類（primates）の動物が区別できること
を示す。培養細胞は、その元の種の組織と共通した帯を
有し、異なるヒト培養細胞は帯が加わったり欠けたりす
ることによって区別することができる。この図では、酵
素はEcoR Iで、対象物および帯は次の通りである。

1.エリスロセバス・パタス（パタス猿）＞22.0、11.0、
7.6、2.6 2.マカカ・ムラッタ（レーザス猿）22.0、11.5、7.6 3.ホモ・サピエンス（ヒト）＞22.0、22.0、16.0、8.
1、6.6 4.M241/88（ランガー猿 培養細胞）14.0、7.2、5.7 5.HeLa（ヒト培養細胞）＞8.1、6.6 6.J96（ヒト培養細胞）＞22.0、22.0、16.0、11.0、8.
1、6.6 7.AO（ヒト培養細胞）22.0、16.0、8.1、6.6 8.X−381（レーザス猿）22.0、11.5、7.6 これで本発明について十分に述べたので、当業者には
本発明又はその実施例の原理又は目的をゆがめることな
く多くの変形および置換が広い範囲にわたって行われ得
ることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomona
s aeruginosa）の菌株から分離したDNAのEcoR I制限エ
ンドヌクレアーゼ消化を示す。プローブとして大腸菌の
16S型および23S型リボソームRNA（rRNA）に対するcDNA
を用いた。 第２図はシュードモナス・アエルギノーザ（P.aerugino
sa）菌株から分離したDNAのPst I制限エンドヌクレアー
ゼ消化を示す。プローブとして大腸菌の16S型および23S
型rRNAに対するcDNAを用いた。 第３図はグルコース−非発酵性グラム−陰性桿菌種から
分離したDNAのEcoR I制限エンドヌクレアーゼ消化を示
す。プローブとして大腸菌の16S型および23S型rRNAに対
するcDNAを用いた。 第４図はグルコース−非発酵性グラム−陰性桿菌種から
分離したDNAのPst I制限エンドヌクレアーゼ消化を示
す。プローブとして大腸菌の16S型および23S型rRNAに対
するcDNAを用いた。 第５図は種々のバシルス・ズブチリス（Bacillus subti
lis）菌株から分離したDNAのEcoR I制限エンドヌクレア
ーゼ消化を示す。プローブとして大腸菌の16S型および2
3S型rRNAに対するcDNAを用いた。 第６図は第５図と同じ菌株に対して、同じプローブで用
いて得られたPst Iデータを示す。 第７図は第５図および第６図と同じ菌株に対して同じプ
ローブを用いて得られたBgl IIデータを示す。 第８図は第５−７図と同じ菌株に対して、同じプローブ
を用いて得られたSac Iデータを示す。 第９図はB.ズブチリスおよびB.ポリミカ（B.polymyxa）
から分離したDNAのEcoR I制限エンドヌクレアーゼ消化
を示す。プローブとして大腸菌からの16S型および23S型
rRNAに対するcDNAを用いた。 第10図は第９図と同じ菌株に対して、同じプローブを用
いて得られたPst Iデータを示す。 第11図は第９図および第10図と同じ菌株に対して同じプ
ローブを用いて得られたBgl IIおよびSac Iデータを示
す。 第12図はプローブとして大腸菌からの16S型および23S型
rRNAに対するcDNAを用い、感染マウス組織から、EcoR I
消化DNA中のストレプトコッカス・ニューモニエ（Strep
tococcus pneumoniae）の検出を示す。 第13図はムス・ムスキュラス・ドメスティカス（Mus mu
sculus domesticus）（マウス）の細胞質リボソームか
らの18S型および28S型rRNAに対するcDNAを用い、哺乳類
の組織から分離したDNAのPst I消化を比較することによ
るマウス種の同定を示す。 第14図はムス・ムスキュラス・ドメスティカス28S型rRN
AcDNAプローブとハイブリッドを形成したマウスおよび
猫組織からのEcoR I消化DNAを示す。 第15図はムス・ムスキュラス・ドメスティカス18S型お
よび28S型rRNAcDNAプローブとハイブリッド形成した哺
乳類組織からのSac I消化DNAを示す。 第16図はムス・ムスキュラス・ドメスティカス18S型お
よび28S型rRNAcDNAプローブとハイブリッド形成した哺
乳類組織および細胞培養からのEcoR I消化DNAを示す。

フロントページの続き (56)参考文献 Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．179, Ｐ．539〜545（1980) Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．180, Ｐ．475〜477（1980) Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．182, Ｐ．502〜504（1981) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ．28（２），Ｐ．154〜168（1978) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ．30（１），Ｐ．７〜27（1980) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ．30（１），Ｐ．106〜122（1980) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ．30（３），Ｐ．547〜556（1980) Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎ ｅｔ．19，Ｐ．256〜261（1977)

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リボソームRNA（rRNA）の忠実なコピーで
   あり、検出可能なように標識化され、実質上純粋な形態
   である、前核有機体の検出又は同定のためのハイブリダ
   イゼーション反応に有用な前核リボソームRNAと相補的
   なDNA（rRNAcDNA）。
2. 【請求項２】放射性標識化又は金属標識化されたもので
   ある請求の範囲第１項のrRNAcDNA。
3. 【請求項３】前核rRNAが細菌rRNAである請求の範囲第１
   項のrRNAcDNA。
4. 【請求項４】rRNA以外のRNAに相補的なcDNAを実質上含
   まない請求の範囲第１項のrRNAcDNA。
5. 【請求項５】細胞成分を実質上含まない請求の範囲第１
   項のrRNAcDNA。
6. 【請求項６】プライマーの存在下、rRNAの逆転写によっ
   て得られた請求の範囲第１項のrRNAcDNA。
7. 【請求項７】DNA加水分解物プライマー用いるこによっ
   て得られた請求の範囲第６項のrRNAcDNA。
8. 【請求項８】鳥骨髄芽球症ウィールスからの逆転写酸素
   による逆転写によって得られた請求の範囲第６項のrRNA
   cDNA。