JPS6022912B2 - 微生物菌体の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物菌体の製造方法に関する。

近年、飼料，食料，医薬品、工業用原料等として微生物
菌体を有効に利用する方策が探究されている。

又微生物菌体を工業的に有効に製造するために、化学工
業で安価にかつ大量に供給される見通しのあるメタノー
ルを炭素源として使用することが期待されている。本発
明者等は、かかる事情に鑑み、主たる炭素源としてメタ
ノールを好気的に資化し、効率よく培養できる微生物菌
体を自然界より汎く探索した結果、細菌の新菌種シュー
ドモナス ワカャマェンシスを発見し、これを利用して
微生物菌体を経済的にかつ大量に製造する方法を確立し
た。

本発明の要旨は、シュードモナス ワカヤマェンシスに
属する細菌を、メタノールを主たる炭素源とする培地で
培養し、培養物より菌体を採取することを特徴とする、
微生物菌体の製造方法に存する。本発明における微生物
菌体は、菌学的性質からすればシュードモナス属に属す
るものとみられるが、シュードモナス属に属する公知の
菌種と比較すると種々の点で相違しているので、これを
新菌種と断定し、シュードモナス ワカャマェンシス（
ＰｓｅＭｏｍｏｎａｓｗａｋａ鼠ｍａｅｎｓｉｓ）と命
名した。

本発明における微生物菌体の代表的なものは、シユード
モナス ワカヤマエンシス ＤＳ一２５（微生物受託番
号 徴工研菌寄第４１０び号）であるが、この細菌の函
学的性質を次に示す。‘ａ’形態 肉汁液体培地及び肉汁寒天塔地にて３７０で３日間培養
した。

■ 細胞の形および大きさ：樺菌，（０．３〜０．４）
×（２．０〜２．２）ム■ 細胞の集団：単細胞または
双細砲。

■ 運動性の有無：運動性あり。

極鞭毛を有する。■ 胞子の有無：なし。

■ グラム染色性：グラム陰性 ■ 抗酸性：陰性 ‘ｂ｝ 次の各培地における生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養：３７０で３日間培養で旺盛な生
育。

コロニ−は外形が円形で大きさは３〜４肋。表面は粗面
、周辺は裂波状。乳黄白色で、光沢がなく、不透明。硬
度は粘稲。■ メタノール含有寒天平板培養：３７℃で
５日間培養で旺盛な生育。コロニーは外形が円形で大き
さは３〜４側。隆起はへそ状（中央部が凹状）。表面は
粗面、周辺は全縁。乳白色で光沢を有し不透明。硬度は
粘穂。■ 肉汁寒天斜面培養：３７０で３日間培養で接
種線に一様に生育。

隆起は中程度で、表面は平滑。辺縁は波状又は裂波状。
乳黄白色で「にぷい光沢を有し不透明。硬度は粘鋼。■
メタノール寒天斜面培養：３７ｑ０で５日間培養で接
種線に一様に生育。

隆起は中程度で、表面は平滑、辺縁は全縁。乳白色で、
光沢を有し不透明。硬度は粘鋼。■ 肉汁液体静暦培養
：３７０で３日間培養で生育は中程度。沈殿なし。表面
に菌膜を形成する。■ 肉汁液体振函培養：３７０で３
日間培養で全体に旺盛に生育し濁る。

沈殿あり。不透明。■ べプトン水液体振糧培養：３７
０で３日間培養で全体に旺盛に生育し、濁る。沈殿あり
。■ メタノール含有液体静畳培養：３７０で３日間培
養で旺盛に生育し、濁る。沈殿あり。薄い菌環を形成す
る。不透明。■ メタノール含有液体振盤培養：３７０
で３日間培養で旺盛に生育し、濁る。

沈殿あり。不透明。■ 肉汁穿刺培養：３７０で３日間
培養で、表面又は表面から１〜３柳の深さ迄生育する。

表面は乳黄白色。■ 肉汁ゼラチン穿刺培養：３７０で
５日間培養で表面の生育及び沈殿あり。

ゼラチンを液化する。■ リトマスミルク：３７０で培
養。

凝固する。‘ｃ’次の生理学的性質■ 硝酸塩の還元：
腸性 ■ 脱窒反応 ：陰性 ■ Ｍ庇テスト ：陰性 ■ ＶＰテスト ：陽・性 ■ インドールの生成：陰性 ■ 硫化水素の生成 ：陰性 ■ デンプンの加水分解：腸性 ■ クエン酸の利用：Ｋｏｓｅｒの培地で陽性■ 無機
窒素源 ：アンモニウム塩及び硝酸塩をそれぞれ利用す
る■ 色素の生成 ：キングＡ，Ｂ培地で有色色素を生
じない。

■ ウレアーゼ ：腸性 ■ オキシダーゼ：陽性 ■ カタラーゼ ：腸性 ■ 生育の範囲 ：後記のメタノール含有液体地を用い
、温度及びｐＨを変化した（ｐＨ‘まＨＣＩ又はＮａＯ
Ｈ水溶液の添加で調整した。

）ｐＨ６〜９の範囲で生育する。ｐＨ５及び１０では生
育しない。温度は５〜４０ｏｏで生育するが２５〜４０
℃が好適。４１℃では生育しない。

■ 酸素に対する態度：好気性 ■ ○一Ｆテスト（Ｈｕ亀戊ｉｆｓｏｎ 法による）；
グルコースを酸化的に代謝する。

■ 下記の糠類から酸及びガスの生成の有無：べプトン
水を用いて糖濃度１重量％、温度３７℃で１０日間培養
した。

酸 ガス ■ 糖類の資化性：後記のメタノール含有液体培地にお
いて、糖をメタ／ールの代りに使用し、糖濃度０．５重
量％、温度３７０で１０日間培養した。

【１１Ｌーアラピノース ＋ （２’Ｄ−キシロース 十 ‘３１ Ｄ−グルコース ＋（弱い）｛４｝
Ｄーマンノース ＋‘５｝ Ｄ−フラクト
ース ＋（弱い）（６１Ｄーガラクトース
＋（弱い）‘７１ 麦芽糖 ＋
Ｚ‘８１ ショ糖 十（弱い）
（９｝ 乳糖‘１０トレハロース ＋ （１１）Ｄーソルビツト ＋ （１２）Ｄ−マンニツト ＋ （１３）イノシツト ＋ （１Ｑ グリセリン 十 （１５）デンプン ＋ ‘ｄ’分離源：土壌 尚上記培養試験における、メタノール含有寒天塔地及び
メタノール含有液体培地は次の通りとした。

○｝ メタノール含有寒天培地 ＫＨ２Ｐ０４ １．５ 夕 、Ｎａ２ＨＰ０４ ３．２
夕 、（Ｎ比）２Ｓ０４ ３夕、ＭｇＳ０４・７日２
０ ０．５夕、ＣａＣ１２・２日２０ ０．１夕、Ｆｅ
Ｓ０４・７＆０ ０．０１２・ＺｎＳ。

４・７日２０１．４雌、ＣｕＳ。

４・９も。

〇．２５の９、Ｎａ２ＭＯＯ４・２日２００．２４の９
、Ｃ。Ｃ１２・母ＬＯＯ．２４の２、ＭｎＳ０４・斑２
０ １．２の９、寒天２０夕、蒸溜水１夕を１２０００
で１５分間殺菌した後、メタノール２０夕を無菌的に添
加したもの。‘２１メタノール含有液体培地 メタノール含有寒天培地において寒天２０夕を使用せず
、又メタノール量を５ターこしたもの。

実験方法は、「パージェィス マニュアル オブ デタ
ーミネイテイプバクテリオロ ジ ー 」（Ｂｅｒｇｅ
ｙ１ ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｎｎｊｎａｔ
ｉｖｅ母ｃｔｅｒｉｏｌｏ勘）第３版（１９７４年）、
「細菌学実習提要」（医科学研究所学友会編、改訂版１
９７３王丸善株式会社発行）及び「微生物の分類と同定
」（長谷川武治編著１９７５年東京大学出版会発行）に
従った。

前記の菌学的性質を前記のパージェィス マニュアルに
おける分類基準に従い検討すると、シュードモナス属に
属することが確認できた。

本菌と前記文献において分類されているシュードモナス
属の主要な２窃蚤とを、同書中の表に記載された性質に
おいて対比した。

炭素源の資化性以外の性質において対比すると「鞭毛を
有すること、４ｒｏで増殖しないこと、ゼラチンを液化
すること等からシュードモナス フアシリス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓｆａｃｉｌｉｓ）が最も近いと考えられ
る。

しかし本菌とシュードモナス フアシリスを資化性も含
めた全ての性質で対比すると、本菌の特徴とするメタノ
ールの資化性の他に、デンプンの加水分解性、乳糖の資
化性、ショ糖の資化性において相違する。又他の公知文
献からは、比較的近い菌種として特開昭４９一６１９２
号公報におけるシュードモナスメ タ ノールオキシダ
ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｔｈａｎｏｌｏ幻ｄ
ａｎｓ）、特関昭５０一１５４４８０号公報におけるシ
ユードモナス アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｍ鰹皿ｓａ）、特開昭５１一４１４９０号公報にお
けるシュードモナス メタノリチカ（ＰｓｅＭｏｍｏｎ
ａｓｍｅｔｈａｎｏｌｉｔｉｃａ）が挙げられる。

しかし本菌は、シュードモナス メタノールオキシダン
スとは硝酸塩を還元すること、ウレアータゼが腸性であ
ること、生育の温度及びｐＨの範囲、多数の各種の糠類
からの酸の生成、乳糖の資化性において相違する。又シ
ュードモナス アェルギノサとはＭＲテストが陰性であ
ること、ＶＰテストが陽性であること、生育の温度及び
ｐＨの範囲、肉０汁液体静暦培養での生育度及び沈殿を
生じないこと、乳糖が資化しないこと等において相違す
る。更に又、シュードモナス メタノリチカとは、硫化
水素を生成しないこと、デンプンを加水分解すること、
クエン酸を利用すること、生育の温度及夕びｐＨの範囲
、多数の各種の糖類からの酸の生成、乳糖を資化しない
こと、等において相違する。上記のように本菌は公知の
シュードモナス属のいずれとも著しい相違を有するもの
であることが確認できた。０ 従って本菌をシュードモ
ナス属の新菌種と断定したものである。

本発明における菌体の培養に当っては、好気的液体培養
法が好適である。

培養温度は５〜４００Ｃの範囲であって、好適には２５
〜４０ｑｏであり、ＰＨ‘ま６〜９であって、好適には
６〜８である。培養は回分培養でも連続培養でもよい。
培地には主たる炭素源としてメタノールを使用するが、
メタノールの量は５０夕／そ以下であるのが好ましい。
窒素源としては、無機物としてアンモニウム塩、硝酸塩
等が、有機物として尿素、カゼイン、コーンステイーブ
リカー、ベプトン、酵母エキス、肉エキス等が、燐源と
しては燐酸塩などが、硫黄源としては硫酸塩などが用い
られる。又マグネシウム、カリウム、カルシウム、ナト
リウム、鉄、マンガン、銅、亜鉛、モリブデン、コバル
ト、ホウ素などの金属源としてはその金属塩を適当量加
え、必要に応じてビタミン類、アミノ酸などの菌体の生
育に必ず必要とされる物質もしくは生長促進物質が添加
される。

又堵地としては、メタノール、窒素源「無機物、ビタミ
ン、アミノ酸等の生育に必須とされる物質もしくは生長
促進物質が適量含有されるものであれば天然塔地であっ
てもよい。培地の餌の調節はリン酸塩とアンモニアによ
るのが便利である。培養物より菌体を採取するには、炉
過、遠′０分離等を常法に従って行なえばよく、又洗膝
、乾燥を施すこともできる。

本発明によれば、化学工業から豊富に給されるメタノー
ルを主たる炭素源として利用でき、シュードモナス ワ
カャマェンシスに属する微生物菌休を収率よく大量に製
造することができる。

又得られた菌体は、蛋白質に富むので飼料、食料等に利
用できる他、医薬原料、工業用原料などに有効利用でき
る。以下に本発明の実施例を記す。

実施例 １ ＫＨ２Ｐ０４ １．５タＮａ
２ＨＰ０４ ３．２夕（Ｎ
日）２Ｓ０４ ３タＭｇＳ０４・
７日２０ ０．５夕ＣａＣ１２・
２ＬＯ ０．１タＦｅＳ０４１７日
２０ ０．０２タＺｎＳ。

４・７日２０ ２．８の。

ＣｕＳ。４・８Ｌ。

〇．５倣Ｎａ２ＮＬ。４・２日２０
０．４８の９Ｃ。

ＣＩ２・母も〇 ０‐４８のタＭｈ
Ｓ。４・９日２０ ２．４のタ蒸溜水
１〆上記の各成分からなる培地１００舷を容量が０．
５その０坂口フラスコに入れ、１２０つ０で１８分間殺
菌後、メタノール０．２夕を無菌的に添加した。

これに、メタノールの添加量を０．５重量％とした以外
は上記と同組成の培地で、３５ＣＯで２餌時間をかけて
前培養して得られたシュードモナス ワカャマェンシス
タＤＳ−２５の菌体を含む前培養液を０．母容量％とな
るよう楢菌し、３５午０で２独時間振糧培養を行なった
。培養物を遠心分離にかけて菌体を分離し、更に水洗を
行なった後、１００ｏｏで２４時間をかけて乾燥し、培
養物１夕当り０．９夕の割合で乾燥菌体を得０た。この
培養の対数増殖期の世代交代時間は１．５時間であった
。又菌体の粗蛋白含有量は７鷲重量％であった。実施例
２ 実施例１におけると同組成の培地５００の‘を容量夕が
１そのミニジャに入れ、１２０午０で１５分間殺菌後、
メタノールを５タ無菌的に添加し、これと同組成の培地
で３７０で２独特間前培養して得られたシュードモナス
ワカヤマヱンシスＤＳ−２５の菌体を含む前培養液を
２容量％となるよう楯菌し、１３０重量％アンモニア水
でｐＨを７．０に維持しつつ３７００で２畑時間通気鷹
梓条件下に培養を行なった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シユードモナスワカヤマエンシスに属する細菌を、
   メタノールを主たる炭素源とする培地で培養し、培養物
   より菌体を採取することを特徴とする、微生物菌体の製
   造方法。 ２ シユードモナスワカヤマエンシスに属する細菌が、
   シユードモナスワカヤマエンシスＤＳ−２５であること
   を特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の微生物菌体
   の製造方法。