JPS5953035B2 - 発酵法によるイタコン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるイタコン酸の製造方法に関するも
のである。

すなわち、イタコン酸を生産する能力を有するロドトル
ラ属に属する酵母を、該酵母が資化しうる炭素源を含有
する栄養培地に接種して好気的に培養し、培養物中に生
成蓄積したイタコン酸を採取することを特徴とするイタ
コン酸の製造方法である。

これまで、微生物によるイタコン酸の製造法としては、
糸状菌であるアスペルギルス・イタコニカスおよびアス
ペルギルス・テレウスを用い糖質を原料とする方法等が
知られている。

また最近酵母であるキャンテ゛ダ・スピーシーズを培養
して、その培養物中にイタコン酸を蓄積させ得たという
報告がある。

本発明者らは、ブドウ糖を主炭素源として生育する酵母
を天然界から広く分離し、それらの酵母のイタコン酸生
産能を検討した。

その結果、リド１ヘルラ属に属する酵母がブドウ糖から
イタコン酸を生産することを見い出し本発明を完成した
。

本発明に使用される菌株、ロドトルラ・スピーシーズ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｐ、 ） ５Ｙ−６６８（
ＦＥＲＭ −Ｐ Ｎｏ、 ５３１８）およびＳＹ’−
７１８（ＦＥＲ：Ｍ−ＰＮｏ、 ５３１９）は、本発明
者らが１９７９年に花より分離した菌株で、その菌学的
性状はいずれも下記の通りである。

（ａ） 各培地における生育状態 （１）ＭＹ液体培地における生育状態 （イ）生育は僅かに濁る程度。

（ロ）細胞は２．０〜２，２Ｘ３．９〜５．６μ程度の
ものから２．９〜４．ＩＸ４．ＩＸ７，８〜８．６μ程
度の楕円形乃至伸長形のものが分布している。

（ハ）細胞の配列は単独。

に）増殖の形式は多極出芽。

（ホ）沈渣あり。

（へ）皮膜は形成する。

（ト）ガスは発生しない。

（２）ＭＹ寒天培地における生育状態 （イ）生育は良好。

（ロ）細胞はＭＹ液化培地に同じ。

（ハ）コロニーの周縁は金縁。

に）コロニーの隆起は扁平状。

（ホ）コロニーの光沢は半光沢。

（へ）コロニーの堅さはバタ一様。

（１−） コロニーの色はパールピンク。

（３）ポテト抽出寒天培地によるスライド培養（イ）仮
性菌糸および真正菌糸を形成する。

（ロ）分芽胞子を形成する。

（ハ）テリオスポア、かすがい連結は形成しない。

（ｂ＞ 子のう胞子の形成 ゴロドコワ培地、クレーン培地、野菜汁寒天培地で胞子
の形成は認められない。

（Ｃ） 射出胞子の形成 ＭＹ寒天平板培養で射出胞子を形成しない。

（ｄ） 各生理的性質 （１）最適生育条件： ｐＨ５，０〜６．０温度３０〜
３１℃ （２）生育の範囲： ｐＨ３，０〜７．５温度８〜３３
℃ （３）硝酸塩の同化：あり。

（４）脂肪の分解：なし。

（５）尿素の分解：あり。

（６）ゼラチンの液化：あり。

（７）浸透圧性：塩化ナトリウム８％（Ｗ／Ｖ）で生育
せず。

ブドウ糖４０％（Ｗ／Ｖ）で生育せず。（８）カロチノ
イドの生成：あり。

菌体のｎ−ヘキサン抽出液の吸収スペクトルを測定した
結果、４５０および４８０ｍμに極大吸収がある。

（９）顕著な有機酸の生成：イタコン酸を著量生成する
。

（１０）澱粉類似物質の生成：なし。

０１）ビタミンの要求性：なし。

α２）その他の生理的性質の特徴 （イ）エステルの生成：なし。

（ロ）リドマスミルク培地における反応：青変するが凝
固しない。

（ハ）リボフラビンの生成：なし。

（ｅ） 各炭素源の同化性 （１）Ｄ−アラビノース：あり。

（２）Ｌ−アラビノース：あり。

（３）Ｄ−リボース：あり。

（４）Ｄ−キシロース：あり。

（５）Ｄ−グルコース：あり。

（６）Ｄ−ガラクトース：あり。

（７）Ｌ−ラムノース：なし。

（８）Ｌ−ソルボース：あり。

（９）麦芽糖：あり。

（ｉｏ） シヨ糖：あり。

０１）乳糖：あり。

（１２） メリビオース：なし。

（１３）セルビオース：あり。

（神 トレハロース：あり。

（１５）’ ラフィノース：あり。

（１６）メレジトース：あり。

０′７）α−メチル−Ｄ−グルコシド；あり。

（１８）アルブチン：あり。

（１ｇ）可溶性澱粉：あり。

（２０）イヌリン：なし。

（２１）エタノール：あり。

ｃ２２）エリトリット：あり。

（２３）イノジット：あり。

（２４）・ Ｄ−マンニット：あり。

（２５） Ｄ−ソルビット：あり。

：２６）アトニット：あり。

ｎ ズルシット：なし。

（２８）グリセリン：あり。

（２９）サリシン：あり。

（３０） ＤＬ−乳酸ナトリウム：あり。

（３１）コハク酸ナトリウム：あり。

（３２） クエン酸ナトリウム：あり。

（３３） Ｄ−グルコン酸ナトリウム：あり。

（３４） ２ケト−Ｄ−グルコン酸カルシウム：あり
。

（ｆ） 各炭素源の発酵性 、（１） Ｄ−グルコース：なし。

（２）Ｄ−ガラクトース：なし。

（３）麦芽糖：なし。

（４）シヨ糖：なし。

（５）乳糖：なし。

（６）ラフィノース：なし。

（７）メリビオース：なし。

（８）トレハロース：なし。

（ｇ） キノンタイプ：Ｑ１０゜ （ｈ） 接合試験：いずれの供試菌株とも接合しない
。

供試菌株を挙げれば、ロドトルラ・スピーシーズ５Ｙ−
６６８（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、５３１８）および５Ｙ
−７１８（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、５３１９）、フイロ
バシデイウム・キヤプスリヂナム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄ
ｉｕｍｃａｐｓｕｌｉｇｅｎｕｍ） ＩＦＯ１１１９お
よび１１８５、ロイコスポ口リデイウム−ス１７ツテイ
（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｓｃｏｔｔｉｉ）
ＩＦＯＯ７３６、ロドスポリデイウム・トルロイデス（
Ｒｈｏｄｏｓｐｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）
ＩＦＯＯ４１３，０５５９，０８８０および１６３８
、ロドトルラ・グリチニス・ルフサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒ
ｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ ｒｕｆｕｓａ）ＩＦ０１５
３８、ロドトルラ・グリチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌ
ａ ｇｌｉｔｉｎｉｓ） ＩＦＯＯ６８８および０３８
９である。

以上の菌学的性状を基準として、ジエー・ロツダー（Ｊ
、 Ｌｏｄｄｅｒ）編、ザ・イースト・ア・タフソノミ
ックスタデイー第２版（１９７０年）、山田による呼吸
鎖に関与するキノン類の分子種に基づく微生物の分類〔
発酵と工業、３７．９４０ （１９７９））等により検
索を行うと、本菌株は、子のう胞子および射出胞子を形
成しないことから、子のう胞子酵母類および射出胞子酵
母類ではない。

また本菌株は真正菌糸、仮性菌糸を形成し、キノンタイ
プがＱ１０であるので、担子菌糸由来の酵母であると思
われるが、既知のメイテイングタイプの菌株と接合試験
を行ったが、接合しな力りた。

一方、本菌株はテリオスポアおよびかすがい連結を形成
しないことから、ロイコスポロリゾイウムおよびロドス
ポロリデイウムには属さない。

さらに本菌株はカロチノイド色素を生成し、炭素源を発
酵せず、尿素を分解し、澱粉類似物質を生成しないこと
から、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）である
と同定した。

ロドトルラ属に所属する公知の菌種の菌学的性状と比較
す慝と、ロドトルラ・シネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕ
ｌａ ５ｉｎｅｎｓｉｓ） ［微生物学報、１４（２
）、１４３ （１９７４））がもつとも類似した性状を
もっているが、本発明に使用する分離菌とロドトルラ・
シネンシスＣＢ５６９６２とは、下記の点で異なってい
る。

（１）ロドトルラ・シネンシスは乳糖、可溶性澱粉、Ｄ
−リボース、エリトリット、アトニットおよびＤＬ−乳
糖を資化しないが、本菌株は資化する。

（２）ロドトルラ・シネンシスは澱粉類似物質を生成す
るが、本菌株は生成しない。

（３）ロドトルラ・シネンシスは厚膜胞子を形成するが
、本菌株は形成しない。

種レベルの同定については、さらに詳しく検討する必要
があるので、本菌株はロドトルラ・スピーシーズ（Ｒｈ
ｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｐ、 ） とする。

本発明で使用する培地は、炭素源としては一般的にブド
ウ糖、ショ糖およびその他本菌株が利用し得る炭水化物
すべてが単独または混合状態で使用される。

また廃糖蜜、テ゛ンプン質の加水分解物、あるいは木材
糖化液のような菌が利用できる炭水化物を含有するもの
も同様炭素源として使用される。

また窒素源としては、例えば硫安、塩安、硝安、硝酸ソ
ーダ、リン安などの無機窒素源の他、尿素、酢安、ペプ
トン、酵母エキス、コーン・スチープ・リーカ−（Ｃ，
Ｓ、 Ｌ、 ）、アミノ酸液、肉エキス等が用いられる
。

これらの窒素源は、単独または組合せて使用することが
できる。

本菌株は硝酸塩を利用し得る菌であり、硝酸塩は良い窒
素源として用いられる。

いずれにしても、窒素源は炭素源に対して適当な量的割
合でこれを使用することが望ましい。

培養物中にイタコン酸を多量に蓄積させるためには、炭
素源の量に対して窒素源のそれをある程度まで少量含ま
せた培地、いいかえればいわゆるＣ／Ｎ率の比較的大き
い培地を使用することが望ましい。

ここに炭素源としてブドウ糖を用い、また窒素源として
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム
、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムとＣ，Ｓ、
Ｌ、を用いて行った実験例を示すと第１表のごとくであ
る。

第１表 窒素源の種類と濃度の影響 基礎培地ニブドウ糖１０％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、
Ｍｇ５０４−７Ｈ２００，０１％、Ｃ，Ｓ、 Ｌ、１ｍ
ｌ／ １とアデカノール３滴／ｌの組成の水溶液にＣａ
ＣＯ３を１％の割合に添加した培地。

供試菌株：ロドトルラ・スピーシーズＳＹ −６６８（
ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、５３１８） 培養条件： ５００ｍ１容坂ロフラスコに培地５０ｍ１
づつ分注殺菌した後、供試菌株を接種し、毎分１２０往
復、２６℃、５日間振盪培養した。

イタコン酸の定量：共立出版■微生物工学講座５黴の利
用工業、Ｐ７２〜７４、昭和３１年発行に記載の定量法
による。

すなわち、本例では窒素源を培地中に窒素として０．０
１〜０．０２％の濃度で含ませた培地においてイタコン
酸が最も多量に集積した。

本発明で使用する培地には、炭素源および窒素源のほか
に種々の無機栄養物をも含ませる必要があり、リン酸カ
リウム、リン酸ナトリウムと硫酸マグネシウム等を添加
すると好適なイタコン酸生産が得られる。

次の培地のｐＨとしては、使用する酵母菌の繁殖しうる
広い範囲が適用される。

しかし、イタコン酸の生産にはｐＨの影響があるので、
ｐＨ調整剤として、水酸化ナトリウムと塩酸を用いて、
酵母のイタコン酸の生産性について実験例を第２表に示
す。

第２表 ｐＨによるイタコン酸の生産性 基礎培地ニブドウ糖１０％、硝酸ナトリウム０．１％、
ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ｏ、０
１％、Ｃ，Ｓ、Ｌ、１ｍｌ／ １とアデカニール３滴／
１の組成の水溶液。

供試ｐＨ調整法：ｐＨ調整は水酸化ナトリウム、塩酸溶
液を用い、毎日２回行った。

供試菌株：ロドトルラ・スピーシーズＳＹ −６６８（
ＦＥＲＭ −Ｐ Ｎｏ、 ５３１８）培養期間： ５
００ｍ１容坂ロフラスコに培地５０ｍ１づつ分注殺菌し
た後、共訳菌株を接種し、毎分１２０往復、２６℃、５
日間振盪培養した。

すなわち、本例ではｐＨ６，５付近が最もイタコン酸生
産に適していることが明らかとなった。

本発明では酵母菌の培養は好気的条件下で行われる。

通常の振盪培養法やタンクを用いる通気攪拌培養法等は
、その条件にかなっている。

この場合、消泡剤を必要とするときはシリコン樹脂等が
使用される。

培養温度は約２５〜３０℃の範囲がよい。

本発明では、イタコン酸は培養物から常法により分離採
取される。

たとえば、培地中にイタコン酸ナトリウムで存在する場
合には、遠心分離によって菌体等の不溶物を除去する。

得られた上澄液を陽イオン交換柑脂に通し脱塩した後、
減圧濃縮し、結晶を析出させ、濾過乾燥してイタコン酸
の結晶を得る。

必要に応じて再結晶する場合には粗結晶に水を加え、活
性炭を添加した後、濾過冷却して再結晶させ、分離、乾
燥してイタコン酸の結晶を得る。

次に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

実施例 １ グルコース（試薬１級）１０％、硝酸ナトリウム０．１
５％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０・０１％、およびＣ，Ｓ、 Ｌ、 ０．２ｍｌ （ｐ
Ｈ５，０）からなる培地５０ｍ１を５００ｍ１容坂ロフ
ラスコヘ分注殺菌後、あらかじめＭＹ寒天斜面培地で２
４時間３０℃で培養したロドトルラ・スピーシーズＳＹ
’−６６８（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、 ５３１８）を接
種し、３０℃で７日間振盪培養した。

培養中、１日２回ｐＨを水酸化ナトリウムで６．０に調
整した。

培養終了後、培地中のイタコン酸を定量したところ１４
．９ｍｇ／ｍｌであった。

実施例 ２ 実施例１の方法において、培地中のグルコースの代りに
蔗糖１０％を加えた培地を用いてロドトルラ・スピーシ
ーズ５Ｙ−６６８（ＦＥＲＭ −ＰＮｏ、 ５３１８）
を接種し、２６℃で７日間好気的に培養した。

培養終了後、培養液中に１２．５ｍｇ／ｍｌのイタコン
酸の生成が認められた。

実施例 ３ 実施例１の方法において、培地中のグルコースの代りに
ビート廃糖蜜１０％（グルコースとして６．２％）を加
えた培地を用いてロド１〜ルラ・スピーシーズ５Ｙ−７
１８（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、５３１９） を接種し
、別に殺菌した炭酸カルシウムを添加して、３０℃５日
間好気的に培養した。

培養終了後、培地中に５．２ｍｇ／ｍｌのイタコン酸の
生成が認められた。

実施例 ４ 実施例１と同じ培地１６．６１を３０１容のジャーファ
メンターに分注し、殺菌後、あらかじめ前記と同組成培
地９００ｍ１ （９本の５００ｍ１容三角フラスコに１
００ｍ１づつ分注し殺菌した培地）に２６℃、４８時間
、２２Ｏｒ、 ｐｏｍ、で振盪培養したロドトルラ、ス
ピーシーズ５Ｙ−６６８（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、５３
１８） を接種し、２６℃、通気量９１／分、攪拌数
３５Ｏｒ、 ｐ、 ｍ。

で７日間培養した。

培養中、１０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５，８〜６
．０にコントロールした。

培養終了後、培養液中のイタコン酸は２１ｍｇ／ｍｌで
あった。

この培養液１７．５１を８０℃に加熱し、遠心分離機で
菌体を除去した後、上澄液をダイヤイオン５ＫＩＢを通
し、脱塩した後、減圧濃縮（６０ｍｍＨｇ、５０〜６０
℃）し、約７８０ｍ１とした。

これを冷蔵庫（７℃）中で結晶化させ、濾過乾燥し約２
８０ｇの粗結晶を得た。

この粗結晶に水５００ｍ１を加え、８０℃に加熱溶解し
、活性炭５ｇを添加した後、熱時に？濾過し、再結晶さ
せ、生じた結晶をｉ濾過乾燥し、約２２４ｇのイタコン
酸の結晶（純度９９．９６％）を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ イタコン酸生産能を有するロドトルラ属に属する酵
   母を、該酵母が資化しうる炭素源を含む栄養培地で好気
   的に培養し、培養物中に生成されたイタコン酸を採取す
   ることを特徴とする発酵法によるイタコン酸の製造方法
   。