SU671738A3 - Способ получени биомассы микроорганизмов - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ танола, предпочтительЕ1о от 20 до 1.00 г/л. В среде также имеютс  азотсодержащие соединени  - такие, как аммиак , аммониевые соли, а также сульфа-ты или хлориды, нитрат, на ftp им ер щелочного металла, или мочевина. Концентраци  азотсодержащего соединени  кол,еблетс  в пределах 3-50 г/л. В питательной среде могут, присутствовать также фосфор, сера, магний и железо. В качестве источника фосфора используют фосфаты, например, К2НРО4 , , Na2HPO4, . или ( HPQj. или фосфорную кислоту, концентраци  которых находитс  в пре . 3-20 г/л. Источником серы мржет служить серна  кислота или сульфат (КНд)2 ЗОдкониентрацией 0,5-, 5,0 г/л. Металлы присутствуют в виде солей, например, MgSO4-7H2O (концентраци  0,2-2,0 г/л) и Fed-,,- (концентраци  0,01-0,1 г/л). Питательна  среда может также содержать следы других элементов в виде солей,, например, кальци , марганца , цинка, кобальта, молибдена, или бора. Примеры питательных сред приве дены в примерах 1 и 4. Процесс можно осуществл ть периодически , полунепрерывно или непрерывно . Когда процесс провод т непрерывно , то его можно начать согласно периодической схеме или с использованием более быстрой начальной стадии . При достижении равновесного со .сто ни  из питательной среды посто нно вывод т микроорганизмы, в то врем  как посто нный объем культуры поддерживают путем посто нного добавлени , свежей питагельной среды. В непрерывном процессе концентрацию метанола во вспыливающей жидкости растущей культурыподдерживают на уровне роста независимо от количества метанола в среде, питающей культуры , и эта концентраци  должна находитьс  пр1вдпочтительно на низшем урбвЙе, йё превышающем 0,01% об/об. Микроорганизмы выращивают в бродильном сосуде, например, в аппарате с перемешиванием или с разбрызги вателем, которые снабжают внутренним или вн,ешним охлаждением. Аэрацию культуры осуществл ют при помощи во духа, кислорода или обогащенного кис лородом., воз духа . Температуру культуры п.оддерживают 30-50 С, преимущественно 38-45С, рН среды --в пределах 6,01-8,0, предпоч тительно 6,4-7,4, путем добавлени  щелочи, например, NaOH, КОН, NH.OH, кислоты, например, H2SO, Микроорганизмы извлекают из пита тельной среды одним из стандартных методов, например, флоккул цией, се диментацией или осаждением с после84 дуюпщм центрифугированием или фильтрацией . Биомассу затем высушивают и используют в качестве источника протеина дл  пищевого сырь  дл  животных и человека./ Пример 1. Выделение смешанных культур. Извлечение смешанных культур 3MS 72 из соответствуюшегр сырь . Пи« тательна  среда , используема  в этом методе, обозначаетс  как DCRZ и имеет следующий состав, г/л: 5,0-50,0 Метанол Na2HPO4 КН2Р04 ( NH4.)2S04 4,5-9,0 Na-цитрат Na2MoO4 2H О До 1 л рН среды поддерживают 6,8 путем добавлени  щелочи, например, гидроокиси натри . Лабораторный бродильный чан (рабочий объем 2,4л) с DCRZ средой при 42°С и рН 6,8 .подвергают взбалтыванию и провод т барбота г воздухом (2 л/мин). Затем провод т инокул цию 100 г образца ила, полученного из потока сточной водыиз выпускного отверсти  в Sittingbourne, Англи , и дсэбавл ют метанол с концентрацией 0,5 об./об. Если наблюдают интенсивное помутнение культуры, добавл ют еще метанол (0,5 об./об.). При дальнейшем увеличении помутнени  в бродильный чан непрерывно подают DCR2 среду, содержащую 1 об./об. метано-. ла, .при скорости разбавлени  0,08 ч. При достижении равновесных условий, определ емых при помощи посто нной величины оптической плотности культуры , скорость разбавлени  постепенно увеличивают до 0,2 . Таким образом выдел ют культуру, обозначенную .ЗМБ 72. Пример 2. Выделение и идей-, тификаци  типичной смешанной культуpk C3MS.72)j 1 млобразца культуры DMB 72, полученной по способу примера 1, извлекают из бродильного чана, помещают в маленькие стекл нные бутыли и разбавл ют питательной средой DCRZ, не содержащей метанол, до концентрации 10, 10 или 10. По 0,1 мл образцов извлекают из бутылей и помещают на агаровые пластинки с пита тельной средой DCRZ и Lab Lemco. Каждую пластинку накрывают колпачком, на который (в случае пластинок с DCRZ) нанос т небольшие количества метанола. Пластинки затем перевертывают и термсстатируют при 42С 48 ч. Обследование пластинсэк по истечении этого времени показывает, что только один вид микроорганизмов (обозначенный EN) вырос на пластинках с DCRZ и что четыре вида микроорганизмов (обозначенные MU, FG , 31,, GB) вырастают на пластинках с Ьав Ьегасо. Ис-, пользу  петлю из платиновой проволоки , отдельные колонии каждого микроорганизма перенос т на новые пластин ки, содержага ие соответсвующую питательную среду, с целыо получени  чистых культур каждого вида..

Таблица 1 386 П ть микроорганизмов, выделенньгх из 3MS 72, подвергают серии испытаний (1-30 в табл. 1) дл  определени , к какому виду микроорганизмов они относ тс . Рез1ультаты испытаний предс авлены в табл. 1, где (+) обозначает положительную реакцию в опыте, а (-) обозначает отрицательную реакцию. На основани1| этихрезультатов четыре микроорганизма классифицируют следующим обр азом: (NCZJB 11019) ; ми Pseudomonas sp. (NC3B 11021); FG Curtobacterium (NC3B 11022); ЛЬ Pseudomonas (NCJB 11020); GR Acinebacter

Окраска по Граму Палочка Палочка Форма Споры Пигмент

Диффузи  пигмента

Подвижность

Рост на воздухе

Каталаза

Оксидаза

Глюкоза (кислота)

, Hughu Leifson ;(OF испытание)

Рост на агаре МС Сои Key

Рост напитательном агаре

Рост на бульоне KCN

Зависимость роста оттемпературл ,

42

37

5

Рост на метиламине

Гемолиз (кров ной

агар)ровный светложелтый на крахмальном агаре

+ +

ч- +

+ + +

+ +

через 7 дней

Питатель- Питатель.г DCRZ + 0,5%ный агар ный агар : ный метанол.

+

+ +

+ +

+ +/- переменна  Палочка Палочка Палочка и кокк Серый Желтый

Испытание

- - а Переменный + Слегка - Обесцве- + чивание

-

+ - а +

4-

На основании полученных результатов нельз  классифицировать усваивающий метанол микроорганизм EN (NCZIB № 11040).

+ +

Слегка +

Нет роста

Нет роста

у-слегка- - Нет роста + Нет роста

Слегка + +

Реакцию микроорганизмов на р д других известных антибиотиков определ ют в нескольких опытах. Результаты испытаний представлены в табл. 2.

Таблица 2

S S S S R R S

Сильно S R S

S R

S R

Примечание: S- чувствительный, R - стойкий Пример 3. Опыты с использо ванием усваивающего метанол микроор ганизма EN из 3MS 72. Установка состоит из Н-образной трубки, разделенной на две части ди ализной мембраной, размещенной в го ризонтальной секции трубки. Обе части трубки наполн ют 25 мл DCRZ сре ды и 0,2%-ным метанолом. В первой части трубки провод т три отдельных :опыта: i инокул ци  микроорганизмов EN; ii) то же; iiiiконтроль - без инокул ции. Во второй части трубки также провод  три опыта: , . i)контроль - без инокул ции; ii) инокул ци  смесью не усваивающих метанол микроорганизмов - MU. FG, 32, GR; iii) то же.В каждсм эксперименте получены следующие данные по конечной оптической платности (ОП): Часть II труб ЧастьIтрубки i) on 0 i ,70 ii) ii) on 0,55 iii) on 0,06 iii) Результаты опытов указывают на то, что наибольший рост микроорганиз мов наблюдаетс , когда EN выращивают в контакте со смесью не усваивающих метанол микроорганизмов MU, FG, dU, GR. Данные также показывают, что вещест о , выдел емое микроорганизмом EN, способно диффундировать через делительную мембрану и поглощатьс  микроорганизмами ми, FG, JL, GR, i. Чистыеусваивающие метанол микроорганизмы выращивают во взбалтываемой колбе с 500 мл среды DCRZ и 0,1% об./об. метанола, содержащего меченые атомы С . Колбу затем термостатируют при 42°С на ротационном шейкере с орбитальным радиусом 2,5 см при 20°С. Образующуюс  двуокись углерода абсорбируют гранулами гидроокиси натри , помещенньми в трубке, подсоединенной к колбе. Через два дн  опт,ическа  плотность культуры остаетс  посто нной, что свидетельствует об окончании роста, а в жидкости культуры не остаетс  метанола. Культуру затем центрифугируют при 10 000 об/мин и всплывающую жидкосгь стерильно фильтруют. ii. 100 мл этой всплывающей жидкости инокулиругот 1,0 мд культуры JMS 72, а затем культуру выращивают во взбалтываемой колбе по способу, описанному выше, На каждой стадии (i) и (ii) измер ют радиоактивность, обусловленную присутствием С ; в начале опыта; в образовавшихс  микроорганизмах; в всплывающей жидкости в конце; в образовавшемс  СО. На стадии (ii) метанол отсутствует и рост микроорганизмов обусловлен ростом не. усв аивающих метанол микроорганизмовв JMS 72. Результаты опытов видны из следующей схемы.

11 Метанол 1,0 г

0,36 г (сух.вее) усваивающих метанол микроорганизмов Обща  биомасс Таким образом, рост не усваивающих метанол микроорганизмов способ ствует увеличению общего выхода биомассы . Веществ о , выдел  емоё 5 св айв айЩййй та НОЛ микроорганизмами и необходимое дл  роста микроорганизмов, не усваивающих метанол, представл ет собой углеродный субстрат. Пример 4. Непрерывна  культура DMS 72. Семилитровый бродильный сосуд с рабочим объемом 4,2 л загружают DCRZ средой, содержащей 4,0 г/л метанола,, иинокулируют 100 мл культуры DMS 72, которую предварительно термостатируют при 42с в течение одного дн . рН среды поддерживают на

Вышеописанный эксперимент повтор ют , использу  усваивак ций метанол ми роорганйзм EN и смесь EN с не ус12

671738

Стади  i

0,08 г углерода в

всплывающей жидкости

Стади  ii 0,049 г .(сух,вес)

не усваивающих метанол микроорганизмов

Таблица 3

микроорганизмом приведены в 409 г (сух.вес) . , уровне 6,8, а .температуру - 42с. Культуру перемешивают при 1000 об/мин и аэрируют со скоростью 1 л/ч. Начало брожени  провод т по периодической схеме до получени  оптическ.ой плотности культуры 1,5 (625 мм). Непрерывную культуру получают .при скорости разбавлени  от 0,5 доО,6б ч. Равновесное состо ние поддерживают, по крайней мере, два дн  при каждой скорости разбавлени , исключа  0,66 ч Культуру в общем выдерживают 700 ч Коэффициенты выхода биомассы и данные о содержании протеина в биомассе полученной при каждой скорости разбавлени , приведены в табл. 3. 72 позвол ет также проводить процесс . « „., ... при более высоких скорост х разбавлени . Данные о содержании аминокислот в 3MS 72 и EN приведены в табл. 5. Таблица 5

0,06 0,10 0,20 25 5 50 присутствие не усваивающих метанол ;микроорганизмс в в JMS 72 не вли ет iсущественно, на содержание аминокислот в -продукте. Пример 5. Соотношение микроорганизмов в CJMS 72 при-получении непрерывной культуры. непрерывную культуру 3MS 72 получают аналогично примеру 2. Во врем  опыта определение количества бактерий посевом на агар в чашках Петри провод т при каждой скорости разбавлени  дл  установлени  относительных размеров попул ций различных микроорганизмов . Образцы культуры, вз тые из бро51ильного сосуда, разбавл ют стериль .ным солевым раствором (0,85%-ным) до концентрации 0,1 мл х 10 и X 10®и по 0,1 мл разбавленных растворов помещают на высушенные двойные Lam .Lemco пластинки. Пластинки термостатируют при 42°С, а затем подсчитыва-. ют колонии различных типов микроорганизмов .. . Результаты представлены в табл. ,6. Таблица б

15

примен ема  в этом опыте, имеет .следующий состав, г/л:

3,000

Na2HP04

3,000 KHjPO 20,000 ( NH4)-Sa4

0,750 MgSO4 7H2O FeCl2

0,167 80 Смг/Л) Метанол CaCI Н.О

5,300

Г, 400 гпЗОд 7Н2О

1,300 СаЗОд SHgO

О- 20

Приме следовани .

Периодически полученную/культуру микроорганизма выращивают в 2,41 л среды DCRZ, содержащей 1,5% метанола , в -З-литровом лабораторном бродильном сосуде при 42с (без стерилизации после инокул ции). После достижени  плотности клеток 3,0 г/л

67173816

Продолжение табл. 6

1,200 1,400 0,800 2,400 До -1 (л) ьный сосуд за ой среды, а гурой 72. /чают концент эк равную

5Концентрацию метанола затем увеличивают ступенчато (приращение 1,0 г/л) до получени  концентрации сухого вёса1 леток 25 г/л в .следую42°С , щих услови х опыта: температура

0 pW 6,6 (контролируют КОН), перемешивание при 1500 об/мин, аэраци  51 л/мин, скорость разбавлени  0,07- 0,3 Ч-1

Результаты опыта приведены в табл. 7.

Т а б л, и ц а 7

2,0-16,0

0,22

-

чают при скорости разбавлени  0,05 ч. В течение двух дней в культуре по вл етс  .споронесущий микроорганизм, и культуру промывают.

В случае испрль.зрвани  смешанной культуры JMS 72, споронесущий микроорганизм непо вл етс  в культуре

Claims (1)

1. 300 дней. Да;нные опытов показывают, 17 что смешанна  культура имеет большую стойкость к. инфекции, чем чиста  культура усваивающего метанол микроорганизма . Непрерывно получают культуры микроорганизма EN 2,41 л среды DCRZ, содержащей 1% метанола, при рН 6,8 и 42° С. Наблюдаетс  пенообразование, достигающее размеров, требующих добавлени  кремнийосновных противопенных агентов три раза в течение б дне В случ:ае проведени  опыта с использованием 3MS 72, введени  противопенных агентов не потребуетс  в те чение 100 дней. Формула изобретени  Способ получени  биомассы микроорганизмов путем кул ьтивировани  бак терий рода Pseudomonas, усваивающих 3818 метанол, в анаэробных услови х на жидкой питательной среде, содержащей метанол, способный к ассимил ции, источник азота и- необходимыеминеральные соли., отличающийс  тем, что, с целью увеличени  роста микроорганизмов и выхода биомассы, в качестве микроорганизмов, усваивающих метанол, испЪльзуют штамм Pseii domonas NCJB 11040, культивирование которого осуществл ют в присутствии штаммов микроорганизмов, не усваивающих метанол: Pseudomonas ЫСЛВ 11019, №11022, Acinetobacter NCJB № 11020 и Curtobacterium NCjB № 11021. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Патент Великобритании 1270006, кл. С 6 F, 1972.