JPS60224491A - 酵素精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は水性グルコース・イソメラーゼ溶液の精製、さ
らに詳しくは、該溶液をアミンで処理して酵素活性を有
する不溶性不純物を形成させる方法に関する。

発明の背景 グルコース・イソメラーゼはグルコースをフラクトース
に変える酵素である。グルコース・イソメラーゼを産生
ずる種々の微生物が仰られている。

例えば、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ
　）、アエロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　）　、
ｙ　：ｙプラリエラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ　）
、アエロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）、バ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　、ラクトバチ７Ｌ／ス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　）およびストレプトミ
セス（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅＩＩ＋）属の微生物がグ
ルコース・イソメラーゼを産生する。一般に、グルコー
ス・イソメラーゼは主に細胞内で産生され、したがって
、グルコース・イソメラーゼの大部分は微生物の細胞壁
内および／または壁土に見出される口したがって、可溶
性酵素を得るには、酵素を微生物細胞から抽出する必要
がある。この抽出操作は、細胞外ｌ漠の少なくとも一部
を崩壊し、酵素および池の細胞物質を微生物酵素抽出物
中に拡散させる。

すなわち、酵素抽出物は可溶性および不溶性両方の不純
物を含有している。不溶性不純物は、濾過または遠・Ｕ
分離のような公知の方法で容易に分離できる。しかしな
がら、生物学的オリゴマーまたはポリマー、例えば、核
酸、非酵素的蛋白またはポリウロン酸のような細胞壁成
分などと考えられる可溶性不純物は、しばしば、所望の
産物と同様な化学的または物理的性質を有するので除去
が困・；’ｉ１８で、経費がかかる。

微生物酵素抽出物から望ましくない可溶性物質を除去ま
たは分離する方法はよく知られている。

これらの方法の最近の概要はダブリユウ・イー・ジャコ
ピー編、「メソッド・オブーエンザイモロジイ」（’Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　’、ｅｄ
、Ｗ、Ｅ。

Ｊａｋｏｂｙ　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　
Ｎ、Ｙ、、Ｎ、Ｙ、）第２２巻、２７３〜２８７頁およ
び４７６〜５５６頁に記載されている。溶解度に基く分
離、特異親和性に基く分離およびクロマトグラフィーに
よる分離のような種々の酵素精製法が記載されている。

また、多数の特許が種々の酵素精製法を記載している。

マスダ（Ｍｌｓｕｄａ　沖米国特許第３７６９１６８号
は吸着、洗浄およびイオン溶液による酵素の溶出−こよ
るβ−アミラーゼの精製を記載している。フィリップら
（Ｐｈ１ｌｉｐｐ　ｅＬ　ａｌ　）の米国特許第３９１
２５９５号はカラム中の粒状担体上で可逆的に酵素の複
合体を形成させ、ついで、緩衝液で酵素を溶出させるこ
とによる加水分解酵素液の精製を記載している。ヤマダ
ら（Ｙａｍａｄａ　ｅｔ　ａりの米国特許第３９７２７
７７号は酸カチオン交換樹脂上に選択的に吸着させ、つ
いで、緩衝液で樹脂からβ−ガラクトシダーゼを溶出さ
せるβ−ガラクトシダーゼの精製法を記載している。こ
れらの方法はいずれも、未精製酵素液を、酵素を吸着ま
たは結合するマトリックスと接触させ、イオン溶液を添
加して精製酵素をマトリックスから溶出する操作を含ん
でいる。

ジョンソンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）の米国特
許第４３４７３２２号は酵素精製用のクロマトグラフィ
ーを教示している。バイレルラ（Ｖａｉｒｅｌ　ｅｔａ
ｌ）の米国特許第４１０６９９２号では、粗ウロキナー
ゼを、ＤＦ、ＡＥ−セルロース樹脂を用いるクロ′７ト
グラフイーに付している。記載された方法は主としてウ
ロキナーゼからの発熱物質の除去にあてられている。

いくつかの特許が沈＃ｔこよる微生物酵素抽出物の精製
を教示している。ポルグラム（Ｂｏｒｇｌｕｍ　）の米
国特許第３７２８２４４号は第４級アンモニウム化合物
【こよる不純物の沈澱を教示している。

へ、＋Ｌ／グマイヤーら（Ｂｅｒｇ＋ｎｅｙｅｒ　ｅｔ
　ａｌ）の米国特許第３７９４５６２号はポリエチレン
イミンを用いる不純物の沈澱を教示している。ス／−り
ら（Ｓｎｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ）　の米国特許第４０５５
４６９号は合成ポリ電解質を用いる不純物の沈澱を数示
する。

モリシら（Ｍｏｒｉｓｉ　ｅｔａｌ　）の英国特許第１
４１１５０３号はカチオン界面活性剤による不純物の沈
澱を教示している。これらの特許はいずれも、不純物を
沈澱させて除去し、活性酵素を溶液中ζこ残す方法を教
示している。

少なくとも１つの長鎖炭化水素Ｎ−置換基を有する第４
級アンモニウム化合物は界面活性電解質で、溶液中で集
合体またはミセルを形成することができる。これらの化
合物は親水性の第４級アミノ基と、疎水性の炭化水素鎖
によって特徴つけられる。多くの第４級アンモニウム化
合物は、それらの微生物を不活化または阻１トする能力
から抗微生物剤としての広範な用途が判明している。こ
の能力は陽性に帯電した第４級アミンと、陰性に帯電し
た微生物表面の間でアニオン−カチオン複合体が形成さ
れることによるものと考えられる。

第４級アンモニウム化合物はまた、蛋白のような陰性に
帯電した種々の高分子物質と不溶性のアニオン−カチオ
ン複合体を形成する。沈澱、不活化、変性、再分散およ
び複合体形成はいずれも、蛋白と第４級アンモニウム化
合物との４，１１互作用によって生じたと報告されてい
る現象である。

発明の概要 本発明は、水性溶液を式： 〔式中、ｋ□は少なくとも炭素数６のヒドロカルビル基
、Ｒ２は炭素数的８〜２０のヒドロカルビル基、Ｒ３は
低級アルキル％Ｘはアニオンを意味する〕 で示されるアミン化合物と接触させ、生じた酵素含有沈
澱（析出物〕を回１仮することを特徴とする水性溶液か
らのグルコース・イソメラーゼの分離方法に関する。

本発明は水性溶液中のグルコース・イソメラーゼの精製
法を提供するものである。該グルコース・イソメラーゼ
を第３級または第４級アミンと、アミンがイソメラーゼ
と相互作用して不溶性の酵素−アミン複自体を形成する
ような条件下で接触させる。このイソメラーゼーアミン
複合体は強いイオン性溶液に添加することができ、これ
により、複合体が解離して可溶性の精製、濃縮グルコー
ス・イソメラーゼ調製物が得られる。

意外にも、ある種のアミン化合物がグルコース・イソメ
ラーゼ調製物の精製法において使用できることが判明し
た。

本発明の方法で用いることのできる第３級および第４級
アミン化合物は式： 〔式中、ｋ□は少なくとも宍素数６のヒドロカルビル基
、Ｒ２は炭素数的８〜２０のヒドロカルビル基、Ｒ３は
低級アルキル、Ｒ４は水素または低級アルキルを意味す
る〕 で示される。

ヒドロカルビル基は、好ましくは、アルキル、シクロア
ルキル、アルケン、アリールおよびアラルキルで、例え
ば、クロロおよびブロモのようなハロゲン、ヒドロキシ
、アルコキシなどのような基で置換されていてもよい。

また、ヒドロカルビル基には、エーテルまたはチオエー
テル結合におけるごとく、酸素または硫黄原子で中［ｉ
された炭化水素鎖１例えば、ジインブチルフェノキシエ
トキシエチルおよびジイソブチルフレジキシエトキシエ
チル基も包含する。

Ｘはいずれの適当な無機または有機アニオンでモヨく、
ハロゲンイオン、硝酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオ
ン、酢酸イオンなどが挙げられる。

該アニオンは酵素Ｉこ対して不活性である。

前記の式で示される本発明の方法に用いることのできる
アミンの例としては、ジメチルベンジルドデシルアンモ
ニウム、ジメチルジラウリルアンモニウム、ステアリル
ジメチルベンジルアンモニウム、ジステアリルジメチル
アンモニウム、ジエチルジオクタデシルアンモニウム、
ジメチルジドデシルアンモニウム、ジメチルドデシルナ
フチルメチルアンモニウム、ジメチルヘキサデシルジク
ロロベンジルアンモニウムおよびジメチ「レジ・ｆツブ
チルフェノキシエチルベンジルアンモニウム塩が挙げら
れる。

発明の詳細 な説明によれば、アミンがグルコース・イソメラーゼと
相互作用して不溶性のイソメラーゼーアミン複合体を形
成して沈澱する条件下、少なくとも１つの前記アミンを
精製するグルコース・イソメラーゼ水性抽出物・りこ加
える。ついで、不溶性イソメラーゼーアミン複合体をｐ
過、遠心分離などの常法により分離する。沈澱物から酵
素を分離するには、イソメラーゼーアミン複合体をイオ
ン化塩溶液に加える。ここで複合体は解離し、イソメラ
ーゼおよびアミンが再溶解する。ついで、限外沖過また
はカチオン交換樹脂による処理で酵素溶液からアミン化
合物を分離し、高い特異活性（例えば％ｑ蛋白当りの活
性）を有する精製、濃縮グルコース・イソメラーゼ調製
物を得てもよい。

沈澱（析出）した酵素−アミン複合体の再溶解に必要な
イオン化塩の量は、適当な電解質、好ましくは、経済性
、入手しやすさから、塩化ナトリウムの種々の濃度、す
なわち、イオン強度の溶液を用いる簡単なテスト法で容
易に決定できる。グルコース・イソメラーゼに不利な影
響を与えない限り、いずれの電解質も使用できる。必要
な塩の最は該沈澱を溶解するのに必要な最少濃度として
決定される。塩化ナトリウムは酵素に、目につくような
影響は与えないので、沈澱の完全な溶解を保証する濃度
で用いることができる。

場合により、酵素を回収すべき水性酵素溶液は、所望の
酵素の沈澱に先立ち、添加したアミンと沈澱を形成する
不純物を含有しうる。このような場合、アミンの添加を
数回、通常、２回に分けて行なうべきで、最初の添加で
該不純物を析出させ、最後Ｊこ酵素を析出させる。最初
の添加ｌこ必要なアミンの量は、元の酵素溶液のいくつ
かの試料を用い、漸変する陸のアミン化合物を添加する
ことにより、容易に決定できる。各添加によって生じた
沈澱の酵素活性をテストし、いったん酵素活性が検出さ
れたら、そのアミンの量が最初の沈澱に必要な量である
。

本発明を実施するにおいては、ｋ２が炭素数的８〜１８
のアルキル、ｋｏが炭素数、Ｙ〕６〜１０の基、Ｒ３お
よびＲ４が低級アルキルおよびＸがハロゲンアニオンの
前記一般式で示される第４級アミンを用いることが好ま
しい。

もつとも好ましい化合物は式： 〔式中、ｎは１２．１４または１６の整数、Ｘはハロゲ
ンアニオンを意味する〕 で示される。これらの化合物を含有する製品が米国ニュ
ーシャーシー州、シャーシー・シティ−のオニクス・ケ
ミカル・カンパニー（０ｎｙｘ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ
、、Ｊｅｒｓｅｙ　Ｃ１ｔｙ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、
　Ｕ、Ｓ、Ａ＋）　＋こより、ＢＴＣ−８３５の商品名
で販売されている。

ＢＴＣ−８３５は、前記式において、ｎが１４の化合物
５０％、ｎが１２の化合物４０％およびｎが１６の化合
物１０％からなる混合物である。

本発明を実施するための条件は、イソメラーゼ抽出物の
純度および濃度、実際に用いるアミン化合物によって変
化しうる。用いるアミンの社は実質的に全ての活性酵素
を沈澱させるに十分な量とすべきで、一般に、Ｗ／Ｖ基
準で少なくとも１１００Ｐ２である。好ましい陸は少な
くとも約５ＱＱｐｐｍで、通常、約５ｏｏ〜ｓｏｏｏｐ
ｐｍである。もつとも好ましくは、約１０００〜３ＣＩ
ＯＰＰｍである。

ｐＨは、酵素の等電点（ｐｉ）より約１ｐＨ単位上で、
用いるアミン化合物のｐＫａより約１ｐＨ１１位下の範
囲とすべきである。好ましくは、ｐＨは約５．５〜８．
５、理想的には、約６，０〜８．０、もつとも好ましく
は、約７．０〜７．４である。

温度は、０℃のような低温から、酵素の熱変性または不
活化が起る温度より下までの広い範囲で変えることがで
きる。一般に、室温で行なうことが都合よい。

本発明の方法の作用機序は完全には判明していない。し
かしながら、アミンがグルコース・イソメラーゼと相互
作用して不溶性のイソメラーゼ−アミン複合体を形成す
るものと考えられる。不溶性のイソメラーゼ−アミン複
合体を晶イオン溶液に加えると、イソメラーゼ−アミン
複合体が［ｔし、イソメラーゼおよびアミンが再溶解す
る。

本発明で得られる結果は実に意外なことである。

すなわち１本発明で用いるアミン化合物は、一般に、強
力な酵素不活化剤および変性剤と考えら丸ており、これ
がグルコース・イソメラーゼを精製するために使用でき
るということは非常ｔこ意外なことである。驚くべきこ
とに、第４級アンモニウム塩の全て、あるいは第３級ア
ミンの全てが、本発明の特定の第３級アミンおよび第４
級アンモニウム塩を用いて得られる結果を与えることが
できるわけではないのである。ヘキサデシルトリメチル
アンモニウムクロライドのような公知の第４級アミン塩
は本発明の条件下で全く沈澱を形成せず、一方、他のア
ミン化合物、例えば、オクタデシルトリメチルアンモニ
ウムクロライドは、検出できるほどの酵素活性を示さな
いわずかな沈澱を形成する。他のアミンは沈澱の形成有
無にかかわりなく、酵素活性を著しく低Ｆさせる。特Ｇ
こ有効なアミン化合物はに１　が灰素数７９１０のアラ
ルキル、例えば、ベンジルおよびナフチルメチル、ｋ　
が炭素数１２〜１６のアルキルおよびＲ３およびＲ４が
、各々、低級アルキル、特にメチルのものである。また
、イソメラーゼ−アミン複合体が非常に容易に解殖して
精製活性酵素を生じることも意外なことである。

本発明の方法の出発物質として用いるグルコース・イソ
メラーゼ抽出物の製造方法は公知である。

例エバ、グルコース・イソメラーゼを含有する酵素抽出
物は、グルコース・イソメラーゼを産生することが知ら
れている種の微生物を培養し、菌糸から酵素を抽出し、
公知の方法で不溶物を除去することにより得られる。

好ましいグルコース・イソメラーゼ抽出物はアクチップ
ラニス、アンプラリエラ、アエロバクタ−、アースロバ
フタ−、バチルス、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏ
ｎｏｓｐｏｒａ　）、ミクロビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｓｐｏｒａ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｅ目ｏｂ
ｏｓｐｏｒす、ノルカルシア　（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）
またはストレプトミセス属の微生物から得ることができ
る。典型的には、グルコース・イソメラーゼ抽出物はス
トレプトミセス・ルビゲノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ｒｕｂｉｇｅｎｏｓｕｓ　）、ストレプトミセス
・オリボクロモゲネｘ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏ
ｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）、バチルス、コア
ギュラ＝ｙス（ＢａｃＮｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ　
）ｉたはバチルス・ステアロサーモフィルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈＮ
ｕｓ　）種の微生物から得られる。

分析法 総蛋白 総蛋白はベックマン・モデルＤＫ−２Ａ分光光度計を用
いて２８０ｍμの波長で測定した。

イソメラーゼ活性（ＩＧｌ、Ｕ） ＩＧＩＵはインターナショナル・グルコース・イソメラ
ーゼ・ユニットの略で、当初、グルコース２モル／　（
ｌ　ｓ　Ｍｇ５０４０．０２モル／ｌおよびＣｏ　Ｃ１
２０，００１モル／４を含有する溶液中、ｐＨ６．８４
〜６．８５（０，２Ｍマレイン酸ナトリウム）で室温お
よび６０℃で測定した、１分当り、１マイクロモルのグ
ルコースをフラクトースに変える酵素の量である。グル
コース・イソメラーゼの測定はエヌ・イー・ルロイドら
、シリアル・ケミスト　リ　−（Ｎ、Ｅ、Ｌｌｏｙｅｄ
　ｅｔ　ａｊ、　Ｃ：ｅｒｅａｌ　Ｃｂｅｍ、）、４９
巻、５号、５４４〜５５３頁（１９７２年）に記載され
る方法で行なった。

固定化イソメラーゼ活性（ＦＡＵ） 固定化イソメラーゼ活性はつぎの方法で測定した。

１４００〜２２００ＩＧＩＵを含有する固定化イソメラ
ーゼ試料を秤取した。試料をデキストロース検定溶液（
予め６５℃に加温）１２５ｍｌおよび０．　Ｉ　Ｍ　）
リス−ヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔ　ＨＡ　Ｍ　
）溶液（ｐＨ７，８）　１０１１１で２５０　ｖｔｌフ
ラスコに洗い込んだ。デキストロース検定溶液はデキス
トロース３．３３Ｍ、硫酸マグネシウム２０ｍＭ、亜硫
酸ナトリウムｌ　Ｑ　ｍＭ、　１’ＨＡＭ　ｌ　００ｍ
Ｍおよび塩化コバル１−１　ｍＭを含有する（　ｐＨ７
，８）。

６５℃において、このデキストロース溶液はｐＨ７，０
を示す。フラスコを６５℃の水浴につけ、１時間振とう
した。混合液を、ｒ過助剤１ｇをプレコートしたガラス
繊維フィルターを付した４５ｍｇ粗ガラスｒ過器を通し
て真空沖過した。フラスコおよび酵素ケーキを少量のｌ
　Ｑ　ＱｍＭＴｌ（ＡＭ緩衝液（ｐＨ７，８）で洗浄し
、全層を１００ｍ１とした。

この洗浄した酵素を、デキストロース検定溶液（予め６
５℃で平衡）１２５ｍ／を含有する２５０ｍ１フラスコ
に入れた。洗浄した酵素をｌＱｍＭＴＨＡＭｉ緩衝液（
ｐＨ７，８）　１０ｔｔｔｌで定駈的をこフラスコに洗
い込み、フラスコを正確に６０分間娠とうした。ついで
、氷酢酸１２．　Ｏｔｒｒｌを加、え、この酸性化混合
液をさらに１５分間振とうした。混合液を、ｒ過助剤約
１ｇをプレコートしたガラス繊維フィルターを付した４
５ＭＭ粗ガラス沖過器を通して真空瀘過した。フラスコ
および沖過器内容物を、約４００ｔｔｔｌの吐液が集ま
るまで脱ミネラル水で洗浄した。ｒ液を２５℃に冷却し
、５００ｔｇｌに希釈した。溶１夜の旋光度を、２５℃
にて２　ｄｍセルを用いて測定し、Ｒ２とした。

酵素を加えない以外は前記と同様に操作してブランク調
製した。ブランクの旋光度も２５℃で測定し、ｋ□とし
た。異性化度をつぎの式から算出ＣＬ 〔式中、ａはフラクトースが完全Ｇこデキストロースに
変換されたときの比旋光度、Ｃ１は溶液中の１ＸＨｎ度
（０，１５ｆ／　／　ｔｔｔｌ　）、Ｌは旋光計の管長
（２ｄｍ）を意味する〕 イソメラーゼ活性の固定活性単位（１”ＡＵ）は次式よ
り算出される。

Ｆ　Ａ　Ｕ　／　９−Ｊ　Ｃ／　Ｋ　ｒ　ｔ　ｗ１−１ 〔式中、Ｋｆは速度定数（１，２１Ｉｈｒ　ＦＡＵッグ
ルコース）、１は反応時間（１時間）、Ｗは試料重最（
ｇ）、Ｃは反応混合液１２５＊Ｊ当りの初期濃度（り）
（７５０００〜グルコース）、Ｊはつぎのとおり： （式中、Ｉｅはフラクトースのモル分率で示した平衡時
の異性化度（０，５１３）、■はフラクトースのモル分
率で示した異性化度、Ｃｍはグルコースの初期濃度（３
，３３Ｍ）、Ｋ、はグルコースのミバエリス定数（０，
７Ｍ）、Ｋｐはフラクトースのミバエリス定数（１，４
３Ｍ）を意味する〕〕ＩＩＧＩＵは１５．８ＦＡＵに等
しい。

実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ この実施例では不溶性グルコース・イソメラーゼーアミ
ン複合体の形成、ついで、イオン溶液中での該複合体の
解離による精製グルコース・イソメラーゼ調製物の製造
を説明する。

ストレプトミセス属の選定した株の徽生物力）らグルコ
ース・イソメラーゼ抽出物を得、ｐＨ７，２に調整した
。抽出物のイソメラーゼ活性は４０１ＧＩＵ／ｙ＋／で
あった。９個の容器の各々に酵素抽出物２５　ｍｌ　（
合計１０００ＩＧＩＵ）を加えた。

適当量のＢ　Ｔ　Ｃ：　−８３５、Ｎ−アルキルＣ１４
”１６　〕−ジジメチルベンジリレアンモニウムクロラ
イドオエックス・ケミカル・カンノぐニー）を室温で各
容器に加え、１５分間型拌を続番すた。

ＢＴＣの添加により、最低１　０　０　ＰＰｍのレベ！
しで内円凝集沈澱が形成された。

沈澱を遠・ｂ分ＡＩ＋こより除き、得られた上澄液の一
部のイソメラーゼ活性を検定した。結果を第１表に示す
。

第１表 このデータはＢＴＣ濃度が１　０　０　０　ＰＰｍ　以
上で可溶性イソメラーゼ活性が全く残存していないこと
を示す。５　０　０　ＰＰｍのＢ　Ｔ　Ｃ濃度で、可溶
性活性の残存率は５０％であっに０ 容器５からの沈澱を室温で０．５Ｎ　ＮａＣＡ’５ｇ／
に再懸濁し、攪拌した。沈澱は数分で再溶解した。

得られた溶液の０．　５　ｔｅ１部分を０．　５　Ｎ　
ＮａＣｌ　１　９．５ｔｔｔｌて希釈し、検定したとこ
ろ、イソメラーゼ活性を示した。

実施例２ この実施例では本発明の方法の精製、濃縮グルコース・
イソメラーゼの製造への使用を説明する。

総活性１２０００　１ＧＩＵ，比活性２．７１ＧＩＵ７
ｍｇ蛋白の、実施例１のイソメラーゼ抽出物の試料３　
０　０　ｌＲ１をＮａＯＨでｐＨ７，２ｊこ調整した。

１３　’ｒ　Ｃ：　−　８　３　５　ヲ加エテ最終濃度
を１　０　０　０　ｐｐｍとし、１５分間攪拌した。形
成した沈澱を、濾過助剤のプレコード上で濾過して集め
た。フィルターケーキをフィルター上、水で洗浄し、ｒ
液試料および洗液のーｒツメラーゼ活性を検定した。可
溶性活性は検出されなかった。

フィルターケーキを０．５Ｎ　ＮａＣ６で溶出した。

この塩化ナトリ１クム溶出液を、ＸＭ１００メンプラン
〔分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１０００００〕を用い
る米国マナチューセツツ州ダンバーズ、７　ミ．ｌ：ｌ
　ン壷）−ポレイション（４ｚｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ．。

Ｄａｎｖｅｒｓ，　ＭＡ　、　Ｕ．Ｓ．へ、）のアミコ
ン（　Ａｍｉｃｏｎ　）４０１攪拌セルで限外濾過した
。限外濾過ｐ；ｔ　ニーｙ物った未結合Ｂ’Ｔ　Ｃを除
去した。最後に、残留物を水でくり返し透析濾過して脱
塩した。最終の残留物は比活性４３．３２ＩＧＩＵ／＃
蛋白の、全体で６８６０ＩＧＩＵの活性を荷していた。

全体で、出発イソメラーゼ活性の７３．８％が回収され
、４３、３２ＩＧＩＵ／＃蛋白の比活性はこの調製物が
蛋白を基準として少なくともその９０％がイソメラーゼ
であることを示した。このように、良好な活性の回収で
、約２０倍もの精製を行なうことができた。

実施例３ 実施例１と同じストレプトミセスの第２回目の発酵で得
られたイソメラーゼ抽出物を用いて実施例２の操作をく
り返す。

イソメラーゼ抽出物５０（１＋／（総合１４０００ＩＧ
ＩＵ）をｐＨ７．２４こ調整し、８１°Ｃニー８　３　
５を滴下して最終濃度を１　０　０　０　ｐｐｍとした
。？得られた懸濁液を、濾過助剤２ｇを混合後、濾過し
、フィルターケーキを水約１００　ｍｌで洗浄した。ｒ
−液および洗液はイソメラーゼ活性を有していなかった
。ついで、洗浄したフィルターケーキをそのまま、３時
間を要して０．５Ｎ　ＮａＮａＣ１３Ｏ０でゆっくりと
溶出させた。

この塩溶出液をアミコンＸＭ−５０（５００００ＭＷＣ
Ｏ）メンプランで限外脚過した。、限外ｒ過残留物を０
．５へ　ＮａＣ／、ついで、水でよく透析−過して残っ
たＢ　Ｔ　Ｃおよび塩を除去した。最終の残留物は全体
で１３５５０１ＧＩＵ、比活性４３．４１０ＩＵ／ｑ蛋
白ｔｉしていた。このように、実施例２と同様に効率よ
く精製が行なえ、活性の回収（９４％〕が著しく向トし
た。

実施例４ この実施例ではバチルス属の微生物から得られたイソメ
ラーゼ抽出物を精製する本発明の詳細な説明する。

Ａ、出発酵素強はバチルス全菌体を吐湯助剤担体と混合
してなる乾燥粉末で、デンマーク国バグスベルド、ノボ
・インダストリ社（Ｎｏｖｏ　ＩｎｄｕｓｔｒｉＡ　／
　Ｓ　、　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ　、　Ｄｅｎｍａｒｋ　
）　のノボ（Ｎｏｖｏ）ＳＰ−１０３イソメラーゼと称
されるものである。

該粉末を希トリス緩衝液（ＰＨ７，０）に懸濁し、リゾ
チーム（２００１１１１Ｚ／１００ｇ乾燥酵素）を添加
後、室温で２時間攪拌して酵素を可溶化した。

ついで、吐湯助剤プレコートを通して吐湯して不溶物を
除去し、ｒ液を６０℃に加熱し、２０分間保持して不純
物を沈澱させ、抽出物を殺菌した。

プレコート吐湯して不溶物を除去後、抽出物１０屑１ｃ
２６２１’ＧＩＵ）をｐＩ−１７，２ｉこ調整し、Ｂ　
−１−Ｃ−８３５を加え、最Ｐ：ａ度を１５００　ＰＰ
ｍとし１こ。

はとんど同時に大計の内円沈澱が生じ、これを遠・Ｕ分
離して除き、上澄液の一部のイソメラーゼ活性を検定し
た。実質的に出発活性（２５０ＩＧＩＵ）の全てが可溶
性フラクション中ｆこあった。

Ｂ、前記Ａのはじめの抽出物の一部をＢ　ＴＣ−８３５
（１５００ＰＰｍ　）で処理し、得られた不溶物を沖去
し、すてた。この処理した抽出物の２５屑ｌづつ（各５
５５１ＧＩＵ）ｌこ、イソメラーゼを沈澱させるに必要
なりＴＣ−８３５の濃度を決定する１こめ、種々の量の
Ｂ’ｌ’Ｃ−３３５を添加した。

Ｂ　Ｔ　Ｃ添加後、沈澱を遠・Ｕ分離で除去し、可溶外
相の試料のイソメラーゼ活性を検定した。結果を第２表
に示す。

第２表 １５００　ＰＰ”　の前処理で非酵素不純物を除去後、
ＢＴＣを添ＴＪＤＴル、！：、、Ｂ　Ｔ　Ｃノ濃度２０
０゜ＰＰｍ　以上で可溶性イソメラーゼ活性がほとんど
完全にな（なった。１０００　ｐｐｍの添加は可溶性活
性の約半分を沈澱させる。

前記の各試ｑの沈澱ヲ０．５　Ｎ　ＮａＣ（１１０ｍ１
ＡＣ懸濁した。沈澱は速やかに再溶解した。溶解した沈
澱を含有する溶液をため、ＸＭ−５０メンブランで限外
吐湯した。Ｑ、５Ｎ　ＮａＣｅおよび水で透析ｒ過後、
残留物のイソメラーゼ活性および蛋白濃度を分析した。

総活性回収は１１０３１ＧＩＵであった。比活性は、紫
外部吸収で評価した蛋白基準で４．１６１ＧＩＵ／＃で
あった。

実施例５ この実施例では種々の第４級アンモニウム化合物でのグ
ルコース・イソメラーゼ抽出物の処理を説明する。

同社の実施例３のイソメラーゼ抽出物試料をｐＨ７に調
整し、種々の第４級アンモニウム化合物ヲ加え、最終濃
度を２０００　ＰＰｍとした。沈澱の生成を酵素と第４
級アンモニウム化合物の間の相互作用の証拠とした。

つぎの第４級化合物をテストした。

ｆｌｌＢＴｃ　−８３５ アルキル（Ｃ１２１Ｃ１４”１６）ジメチルベンジルア
ミノクロライド （２）アークオード（ＡＲＱＵＡＤ）１８−５０オクタ
デシルトリメチルアンモニウムクロライド ＋３１サ−トリ？−（１−（ＣＥＲＴＫＩＭＩＤＥ　、
ＣＴＡＢ）セチルトリメチルアツモニウムプロ°フィト
（４１ＢＴ（ニー２１２５Ｍ（ＤＵＡＬ　ＱＵＡＴ）７
″キ″（Ｃ１４”１６”１２”１８）ジメチルベンジル
アンモニウムクロライドアルキル（Ｃ、Ｃ）’）メチル
エチルベン２　１４ ジルアンモニウムクロライド （５）ハイアミン（ＨＹＡＭＩＮＥ）１６２２ジイソブ
チルフエノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモ
ニウムクロライド （６）ハイアミン２３８９ （メチルドデシルベンジル）トリメチルアンモニウムク
ロライド メチルドデシルキシレンビス（テトラメチル）γンモニ
ウムクロラ・ｆド ＋７１マクオート（ＭＡＱＵＡＩ’）　Ｄ　Ｌ　Ｃ１２
１４アルキル（Ｃ１２、Ｃ１４ＩＣ１６１Ｃ１８）ジメ
ｔル（ジクロロベンジル）アンモニウムクロライド ［８１Ｆ、−ｒｃ−８１２ オクチルドデシルジメチルアンモニウムクロライド （９）−一キサデシルトリメチルアンモニウムクロライ
ド 化合物（１）、（４）、（５１および（７）は大量の白
色沈澱を形成し、化合物（８）、（３）および（２）で
は沈澱が少なかった。−万、化合物（９）および（６）
は透明のままであった。懸濁液を遠心分離し、沈澱を除
き、透明な上澄液のイソメラーゼ活性を検定した。

沈澱を０．５Ｎ　ＮａＣ４１こ再懸濁させて酵素−第４
級アンモニウム化合物複合体を解離させ、酵素を再度可
溶化した。再度可溶化させた沈澱を０．５升 ＮＮａＣ１−Ｑ、２Ｍ　Ｇｏ　テ希釈後、イソメラーゼ
活性を検定した。結果を第３表に示す。

第３表 もつとも大量の沈澱を生じた４つの化合物、（月、［４
１，（５］３よび（７）はいずれもＮ−ベンジル置換基
を有している。

つた沈澱を示した。この場合の活性の回収は非常−こす
ぐれていた。化合物（６）および（９）は何ら明らかな
沈澱を生じず、酵素の不活化はほとんどなかった。化合
物（３１、（４）および（７）は著しい活性旧大を生じ
た。

実施例に の実施例では酵素および第４級アンモニウム化合物の不
溶性複合体が酵素同に活性であることを説明する。

実施例４のイソメラーゼ抽出物の試料をＰＩ−１７，２
４Ｃ調ｕ　ｔ、、ＢＴＣ−８３５（１５００ＰＰｍ）　
で処理し、吐湯助剤と混合し、不溶性物質をｒ取した。

フィルターケーキを水洗し、混合した。試料の固定化酵
素活性をＦＡＵ法で検定した。結果は。

出発可溶性活性２９％の表示活性を示した。

実施例７ この実施例では、再溶解したイソメラーゼＢＩＣ沈澱か
らＢＴＣを除去するための、強酸カチオン交換樹脂を用
いる別法を記載する。

粗酵素抽出物を、ＨＩＰ１００カートリッジ（１０００
００ＭＷＣＯ）を用いるアミコンＣＨ４濃縮器で眼外ρ
過して部分精製イソメラーゼ濃縮物を調製した。限外ｒ
過残留物を５倍容の脱イオン水で透析；廼過して残った
紙分Ｐ量物質を除去し１こ。最終濃縮物は２１７５ＩＧ
ＩＵ／、／の活性をＨし、蛋白濃度は６６．９Ｑ／＃ｌ
ｌであった（比活性３２．５　Ｉ　Ｇ　Ｉ　Ｕ／啼）。

このａ線動１０　ｍｉミラテ３００　ｍ１ＡＣ希釈Ｌ、
ＰＨ２７，２ｉこ調整した。この１容液にＢＴＣ−８３
５３００ツを添１１０し、懸濁液を３０分間攪拌した。

形成した沈＠を遠・ｂ分−難して集め、０．５　Ｍ　Ｎ
ａＣ４２５肩ｌｉこ再溶解した。この溶液に、湿潤ＡＧ
５０ＷＸ４（米［１カリフオルニア州、リッチモンド、
バイオ・ラド・ラボラドリース（Ｂｉｏ　ＫａｄＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　、　ＣＡ
　、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）製カチオンダ換樹脂（ナトリウム
型）　）　１　ｇｄｂ　ヲ加えた。ＰＨ、Ｅ　７．０に
調整し、懸濁液をおたやかに３０分間ｌｅｔ拌した。つ
いて、樹脂を沈降させ。

上澄液の一部分とり、紫外部吸収により可溶性蛋白（２
８０ｎｍての吸収〕およびＢＴＣ（２６２ｎｍでの吸収
）を分析した。この紫外部吸収分析は可溶性ＢＩＣが全
て離去されたことを示しｆこ。

さらに上澄液の一部をとり、水で１０倍に希釈した。こ
の塩磨度の減少した段階で沈澱のないことは、ＢＴＣが
樹脂により除去されたことを示した、残りの上澄液を濾
過して樹脂を分離し、ｒ液を、ＹＭ−３Ｑメンプランを
用いるアミコン２０１１ｔｕ拌セルで限外濾過して残っ
たＮａＣ１を分離した。

最終の限外濾過残留物のイソメラーゼ活性および蛋白濃
度を検定した。イソメラーゼ活性の回収は１９４０００
ＩＧＩＵで、サンプリングロスを修正すると、出発活性
の９０％以上であった。比活性は４０．１２ＩＧＩＵ／
１Ｎｇ蛋白であった。

実施例８ この実施例では、本発明の方法における種々の第４級お
よび第３級アミンの使用を説明する。

実験方法は実施例５と実質的に同じである。

良好な酵素の沈澱および少なくとも８０％の沈澱活性の
回収がつぎの化合物によって達成された。

マクオートＭＣ１４１２ アルキル（Ｃ１４’　１２１Ｃ１６）　ジメチルベンジ
ルアンモニウムクロライド Ｂ’ｌ’Ｃ−１０１０ ジデシルジメチルアンモニウムクロライドＢ”Ｃ−１０
００ アルキル（ｃ　１２　、　（：１４　）ジメチＡｚｌ　
−す７チルメチルアンモニウムクロライド ステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド ハイアミン３５００ アルキ、＋１／（Ｃ１４，Ｃ１２，Ｃ１６）ジメチルベ
ンジルアンモニウムクロライド つぎの化合物を用いた場合は、酵素が全く沈澱しなかっ
たか、不活化が起らなかった。

バリクオ）（ＶＡｌｔＩＱＵＡＴ）Ｂ−２００ベンジル
トリメチルアンモニウムクロライドアークオード１２−
５０ ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドジメチルド
デシルアミン ジメチルペンジルアミン トリインオクチルアミン 特許出願人　ナビスコ・ブラング・インコーポレイテッ
ド代理人升瑚士青山　葆ほか２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 〔式中、ｋ□は少なくとも６個の炭素原子を有するヒド
   ロカルビル基、Ｒ２は約８〜２ｏの炭素原子を有するヒ
   ドロカルビル基、ｐ−３は低級アルキル、ｋ４は水素ま
   たは低級アルキル、Ｘはアニオンを意味する〕 で示されるアミン化合物と接触させ、生じた酵素含有沈
   澱を回収するこζを特徴とする水性溶液からのグルコー
   ス・イソメラーゼの分離方法。 （２）該溶液のｐＨが約５．５〜約８．５である前記第
   （１）項の方法。 ｆ３１ｐＨが約６〜約８である前記第（２）項の方法。 （４）アミン化合物の量が該水性溶液の少なくとも５０
   ０　ｐｐｍである前記第（１）項〜第＋３３項いずれか
   １つの方法。 （５）アミン化合物において、ｋ□が炭素数約８〜約１
   ８のアルキル、　Ｒ２力積素数約６〜１ｏのヒドロカル
   ビル基、ｋ３およびに４が、各々、低級アルキル、Ｘが
   ハライドアニオンである前記第（１）項〜第（４１項い
   ずれか１つの方法つ （６）該水性溶液が式： 〔式中、ｋ　はＣＨ（ｎは１２．１４また２　ｎ２０＋
   １ は１６の整数）、Ｘはアニオンを意味する〕で示される
   アミン化合物を含有する前記第（１）項〜第（５）項い
   ずれか１つの方法。 ｆ７＋１ｔ２がＣｎＨ２ｏ＋１　（ｎは１２．１４およ
   び１６）基の混合物である前記第（６１項の方法。 （８）該水性溶液のｐＨが約７．０〜７．４である前記
   第（６）項または第＋７１項の方法。 （９）該アミン化合物の量が、該水性溶液の少なくとも
   １００　Ｑ　Ｐ７ｎである前記第（６１項〜第（８）項
   いずれか１つの方法。 （１０）さらに、分離した酵素含有沈澱を水性溶媒に再
   溶解する１程を含む前記第（１）項〜第（９）項いずれ
   か１つの方法。 （１１）該水性溶媒がイオン化塩を含有する前記第（１
   ０９項の方法。 （１２）アミン化合物がアルキル（Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ
   １６）ジメチルベンジルアンモニウムクロライドである
   前記第（６）項〜第（１１）項いずれか１つの方法。 （１３）アミン化合物がオクチルドデシルジメチルアン
   モニウムクロライド、ジステアリルジメチルアンモニウ
   ムクロライドまたはジデシルジメチルアンモニウムクロ
   ライドである前記第ｆｉ１項〜第（１２）項いずれか１
   つの方法。 （１４）前記第（１）項〜第（１３）項いずれか１つの
   方法で得られたグルコース・イソメラーゼ−アミノ複合
   体。