FR2562087A1 - Procede de purification de la glucose-isomerase - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET LE TRAITEMENT D'UN EXTRAIT DE GLUCOSE-ISOMERASE POUR PURIFIER L'ENZYME. SELON L'INVENTION ON TRAITE UNE SOLUTION AQUEUSE DE L'ENZYME PAR UN DERIVE D'AMINE OU D'AMMONIUM REPONDANT A LA FORMULE GENERALE: (CF DESSIN DANS BOPI) OU R EST UN RADICAL HYDROCARBYLE AYANT AU MOINS 6ATOMES DE CARBONE, R EST UN RADICAL HYDROCARBYLE AYANT D'ENVIRON 8 A ENVIRON 20ATOMES DE CARBONE, R EST UN GROUPE ALKYLE INFERIEUR, R EST H OU UN GROUPE ALKYLE INFERIEUR ET X EST UN ANION, ET ON RECUPERE LE PRECIPITE CONTENANT L'ENZYME AINSI PRODUIT. APPLICATION : ON PEUT RESOLUBILISER LE COMPLEXE INSOLUBLE D'ENZYME POUR PRODUIRE UNE PREPARATION D'ISOMERASE STABLE, CONCENTREE ET PURIFIEE.

Description

La présente invention concerne la purification d'une solution aqueuse de

glucose-isomérase et en particulier le traitement de la solution par un composé d'amine ou d'ammonium pour former un

complexe insoluble contenant l'activité enzymatique.

La glucose-isomérase est une enzyme qui transforme le

glucose en fructose. On connalt dans la technique divers micro-

organismes qui produisent la glucose-isomérase. Par exemple, les microorganismes des genres Actinoplanes, Aerobacter, Ampullariella, Arthrobacter. Bacillus, Lactobacillus et Streptomyces produisent de

la glucose-isomérase. En général, la glucose-isomérase est principa-

lement produite par voie intracellulaire et la majeure partie de la glucose-isomérase se trouve donc à l'intérieur et/ou sur les parois cellulaires des micro-organismes. Il est donc nécessaire d'extraire

l'enzyme des cellules microbiennes pour produire l'enzyme soluble.

Le procédé d'extraction aboutit à une rupture au moins partielle de l'enveloppe cellulaire, laissant diffuser l'enzyme et d'autres substances cellulaires dans l'extrait d'enzyme microbienne. Donc, l'extrait enzymatique contient à la fois des impuretés solubles et insolubles. Les impuretés insolubles peuvent être facilement séparées par des techniques bien connues, telles que filtration ou centrifugation. Cependant, les impuretés solubles que l'on pense être des oligomères ou polymères biologiques, par exemple acides nucléiques, protéines non enzymatiques ou composants des parois

cellulaires, tels que des acides polyuroniques, etc., sont diffi-

ciles et coûteuses à éliminer parce qu'elles ont souvent des propriétés chimiques ou physiques semblables à celles du produit désiré. Les procédés pour l'élimination ou la séparation de

substances solubles indésirables des extraits enzymatiques micro-

biens sont bien connus. On peut trouver un résumé actuel de ces procédés dans le Volume XXII de "Methods of Enzymology", pages

273-287 et pages 476-556 (éd. W.E. Jakoby, Academic Press, New York).

Cet ouvrage décrit divers procédés pour la purification des enzymes, comme la séparation d'après la solubilité, la séparation d'après

l'affinité spécifique et les séparations chromatographiques.

De nombreux brevets décrivent également divers procédés pour la purification des enzymes. Le brevet U.S. 3 769 168,au nom de Masuda, dgcrit la purification de la e-amylase par adsorption, lavage et élution de l'enzyme par une solution ionique. Le brevet U.S. 3 912 595,auxnomsde Philipp et autres décrit la purification d'une solution d'enzyme hydrolytique par complexation réversible de l'enzyme sur un matériau de support granulaire dans une colonne, après quoi l'enzyme est récupérée par élution par un tampon. Le brevet U.S. 3 972 777,auxnomsde Yamada et autres,décrit un procédé pour raffiner la 8-galactosidase par adsorption sélective sur une résine échangeuse de cations,et ensuite élution de la 8galactosidase de la résine par un tampon. Tous ces procédés comportent la mise en contact d'une solution d'enzyme impure avec une matrice qui adsorbe ou fixe l'enzyme et ensuite l'élution de l'enzyme purifiée

de la matrice par addition d'une solution ionique.

Le brevet U.S. 4 347 322,auxnomsde Johnson et autres, indique un procedé. chromatographique pour la purification d'une

enzyme,dans lequel les impuretés solubles sont adsorbées préféren-

tiellement par une matière échangeuse d'ions. Dans le brevet U.S. 4 106 992,auxnomsde Vairel et autres, on soumet l'urokinase brute

à la chromatographie d'exclusion en utilisant une résine DEAE-

cellulose. Le procédé décrit concerne principalement l'élimination

des substances pyrogènes de l'urokinase.

Plusieurs brevets indiquent la purification d'extraits d'enzymes microbiennes par précipitation. Le brevet U.S. 3 728 244, au nom de Borglum,indique la précipitation des impuretés par des composés d'ammonium quaternaire. Le brevet U.S. 3 794 562,atunomsde

Bergmeyer et autres,indique la précipitation des impuretés en uti-

lisant la polyéthylène-imine. Le brevet U.S. 4 055 469, aux noms de Snoke et autres,indique la précipitation des impuretés en utilisant des polyélectrolytes synthétiques. Le brevet britannique 1 411 503, auKnomsde Morisi et autres,indique la précipitation d'impuretés au moyen d'un agent tensioactif cationique. Tous ces brevets indiquent des procédés pour précipiter et séparer les impuretés,tandis que

l'enzyme active reste en solution.

Les composés d'ammonium quaternaire contenant au moins un substituant hydrocarboné à longue chaîne à l'azote sont des électrolytes tensioactifs qui peuvent former des agglomérats ou des

micelles en solution. Ces composés sont caractérisés parle grotpeanmo-

nium quaternaire hydrophile et par la chatne hydrocarbure hydrophobe.

De nombreux composés d'ammonium quaternaire ont trouvé une utilisa-

tion étendue comme agents antimicrobiens reposant sur leur aptitude à inactiver ou inhiber des micro-organismes. On pense que cette propriété est un résultat de la formation d'un complexe anion-cation entre le cation ammonium quaternaire et la surface microbienne

chargée négativement.

Les composés d'ammonium quaternaire forment également des complexes anioncation insolubles avec diverses macromolécules

négativement chargées comme les protéines. La précipitation, l'inac-

tivation, la dénaturation, la redispersion et la formation de complexessont toutes des phénomènes indiqués comme résultant de

l'interaction des protéines avec les composés d'ammonium quaternaire.

La présente invention concerne un procédé pour séparer la glucoseisomérase d'une solution aqueuse, qui comprend la mise

en contact de ladite solution aqueuse avec un dérivé d'amine ter-

tiaire ou un sel d'ammonium quaternaire de formule: RiR

R1 R __ _ _ _ _

2R2- N, ou R N X (

R3 3

R4 o: R1 est un radical hydrocarbyle ayant au moins 6 atomes de carbone; R2 est un radical hydrocarbyle ayant d'environ 8 à environ 20 atomes de carbone; R3est un groupe alkyle inférieur; R4 est H ou un groupe alkyle inférieur; et X est un anion;

et la récupération du précipité contenant l'enzyme ainsi produit.

La présente invention propose un procédé pour la puri-

fication de la glucose-isomérase en solution aqueuse. La glucose-

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isomgrase est mise en contact avec une amine tertiaire ou un sel d'am-

monium quaternaire dans des conditions o V'amine ou sel d'ammonium

agit avec l'isomérase pour former un complexe enzyme-amine insoluble.

Le complexe isomérase-amine peut être ajouté à une solution fortement ionique dans laquelle le complexe se dissocie pour produire une

préparation de glucose-isomérase concentrée, purifiée, soluble.

La demanderesse a découvert de façon surprenante selon l'invention que certains dérivés d'amines peuvent être utilisés dans

un procédé pour purifier les préparations de glucose-isomérase.

Les amines tertiaires-et sels d'amines quaternaires que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention sont représentés par les formules suivantes: R _R R2- N, 2N -N Xe

R. 6 (R

R4 dans lesquelles R1 est un radical hydrocarbyle contenant au moins 6 atomes de carbone, R2 est un radical hydrocarbyle contenant d'environ 8 à 20 atomes de carbone; R est un groupe alkyle inférieur, et R4 est un atome

d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur.

Les radicaux hydrocarbyles sont de préférence alkyle, cycloalkyle, alc9nyle, aryle et arylalkyle et peuvent être substitués par des halogènes, par exemple chlore et brome, ou des groupes hydroxy, alcoxy et analogues. Les radicaux hydrocarbyles s'entendent

également selon l'invention comme comprenant les chaînes hydro-

carbonées interrompues par des atomes d'oxygène ou de soufre, comme dans les liaisons éther ou thioether, par exemple les radicaux

diisobutylphénoxygthoxyethyle et diisobutylergsoxygthoxygthyle.

L'anion X peut être n'importe-quel anion inorganique ou organique convenable, tel qu'halogénure, nitrate, sulfate, benzènesulfonate, acetate, etc., l'anion étant inerte vis-à-vis de l'enzyme.

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A titre d'exemples de dérivés d'amines représentés par la formule cidessus que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention, on citera les sels de diméthylbenzyldodécylammonium,

diméthyldilaurylammonium, stéaryldiméthylbenzylammonium, distéaryl-

diméthylammonium, diéthyldioctadécylammonium, diméthyldidodécyl-

ammonium, diméthyldodécylnaphtaylméthylammonium, diméthylhexadécyl-

dichlorobenzylammonium et diméthyldiisobutylphénoxyéthylbenzyl-

ammonium. Selon la présente invention, l'un au moins des dérivés

d'amines décrits ci-dessus est ajouté à l'extrait aqueux de glucose-

isomérase à purifier dans des conditions o l'amine ou le sel d'ammo-

nium forme avec la glucose-isomérase un complexe isomérase-ammonium insoluble qui précipite. Le complexe insoluble isomérase-ammonium est ensuite séparé par une technique courante telle que filtration, centrifugation ou analogues. Pour séparer l'enzyme du précipité, on ajoute le complexe isomérase-ammonium à-une solution de sel ionisé dans laquelle le complexe se dissocie et l'isomérase et l'amine sont résolubilisées. Le dérivé d'amine peut ensuite être séparé de la solution d'enzyme par ultrafiltration ou par traitement par une résine échangeuse de cations, pour produire une préparation de

glucose-isomérase concentrée, purifiée, ayant une activité spéci-

fique élevée (par exemple,activité par mg de protéine).

La quantité de sel ionisé nécessaire pour la redisso-

lution du complexe enzyme-amine précipité peut être facilement déterminée par des essais simples en utilisant des solutions de concentration variable, c'est-à-dire de force ionique variable, d'électrolytes appropriés parmi lesquels on préfère le chlorure de sodium, parce qu'il est économique et facilement disponible. On peut utiliser n'importe quel électrolyte,pour autant qu'il n'ait

pas d'effet nuisible sur la glucose-isomérase. La quantité néces-

saire de sel est déterminée comme la concentration minimale néces-

saire pour dissoudre le précipité. Comme le chlorure de sodium ne semble pas avoir d'effet remarquable sur l'enzyme, on peut l'utiliser en solution concentrée pour assurer une dissolution complète du

précipité.

Dans certains cas, la solution aqueuse d'enzyme à partir de laquelle on doit récupérer l'enzyme peut contenir des impuretés qui forment des précipités avec le dérivé d'amine buammonium) ajouté avant de précipiter l'enzyme désirée. Dans ces cas, l'addition de l'amine doit se faire en plusieurs stades, ordinairement en deux stades, les impuretés étant précipitées dans le premier,et enfin l'enzyme dans le second stade. La quantité d'amine nécessaire pour le premier stade est facile à déterminer en utilisant des parties aliquotes de la

solution d'enzyme initiale à laquelle on ajoute des quantités progres-

sives du dérivé d'amine. Le précipité formé à chaque addition est soumis à une détermination de l'activité enzymatique qui, une fois qu'elle est décelée, indique la quantité de précipitant nécessaire

pour la précipitation du premier stade.

Dans la mise en oeuvre de la présente invention, on préfère

utiliser des sels d'ammonium quaternaire de la formule générale ci-

dessus dans laquelle R2 est un radical alkyle contenant d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone, R1 est un radical contenant d'environ 6 à environ 10 atomes de carbone, R3 et R4 sont des radicaux alkyles inférieurs et X est un anion halogénure. On préfère en particulier les composés dans lesquels R2 est un radical alkyle ayant de 12 à 18 atomes de carbone, R1 est un radical arylalkyle ayant de 7 à 10 atomes de carbone, R3 et R4 sont des radicaux alkyles inférieurs et

X, est un anion halogénure.

Les composés particulièrement préférés peuvent être repré-

sentés par la formule générale: CH3 CnH2n+1 12 CHx CH3 dans laquelle n est un entier égal à 12, 14 ou 16 et X) est un anion halogénure. Un produit contenant ces composés est vendu par la Société Onyx Chemical Co., Jersey City, New Jersey, U.S.A., sous le nom de BTC-835. Le BTC-835 est un mélange de 50 % d'un composé 7de formule ci-dessus dans laquelle nest gal 14, 40 % d'un ompos de formule ci-dessus dans laquelle n est égal à 214, et 40 % d'un

d'un composé de formule ci-dessus dans laquelle n est égal à 12, et 106.

d'un composé de formule ci-dessus dans laquelle n est égal à 16.

Les conditions envisagées pour la mise en oeuvre de la présente invention peuvent varier selon la pureté et la concentration

de l'extrait d'isomérase et le dérivé d'amine particulier utilisé.

La quantité d'amine ou de sel d'ammonium utilisée doit être suffi-

sante pour précipiter pratiquement la totalité de l'enzyme active et elle est en général d'au moins 0,01 % (100 ppm) en poids par

volume. La quantité préférée est d'au moins environ 0,05 Z et ordi-

nairement d'environ 0,05 à environ 0,5 % (500 à 5 000 ppm). On préfère tout particulièrement une quantité d'environ 0,1 à 0,3 %

(1 000 à 3 000 ppm).

Le pH doit être dans la gamme d'environ 1 unité de pH au-dessus du point isoélectrique (pI) de l'enzyme à environ 1 unité de pH au-dessous du pKa du dérivé d'amine utilisé. De préférence, le pH a une valeur d'environ 5, 5 à environ 8,5, la valeur idéale étant d'environ 6,0 à environ 8,0 et on préfère en particulier

d'environ 7,0 à environ 7,4. -

La température peut varier dans une large gamme depuis pas plus de 0 C jusqu'au-dessous de la température à laquelle se produit la dénaturation ou inactivation thermique de l'enzyme. Pour raison de commodité, le procédé est généralement mis en oeuvre à

la température ambiante.

Le mécanisme du procédé de l'invention n'est pas complè-

tement élucidé. Cependant, on pense que le dérivé d'amine ou d'ammo-

nium agit:jvec 1a glucose-isomérase pour former un complexe inso-

]lble isonmrase-aanonium. Lorsque le complexe isomérase-ammonium est

ajouté à une solution fortement ionique, le complexe isomérase-ammo-

niui: se dissocie et l'isomérase et l'amine sont à nouveau solubles.

Les résultats obtenus par la présente invention sont inattendus. Il était très surprenant que les composés d'amines selon

l'invention, que l'on considère en général comme des agents inac-

tivants et dénaturants puissants des enzymes, puissent être utilisés

pour purifier des extraits de glucose-isomérase. De manière surpre-

nante, les sels d'ammonium quaternaires ou les amines tertiaires ne sont pas tous capables de donner les-résultats obtenus en utilisant les amines tertiaires et sels d'ammonium quaternaires spécifiés de la présente invention. Des sels d'axmonium quaternaires, tels que le chlorure d'hexadgcyltrimgthylammonium, ne forment pas de précipité dans les conditions de la présente invention, tandis que d'autres

composés d'ammonium, par exemple le chlorure d'octadécyltrimithyl-

ammonium, forment un léger précipitt qui ne présente pas d'activité enzymatique décelable. D'autres amines provoquent une perte notable

d'activité enzymatique, qu'il y ait ou non formation de précipité.

Les dérivés d'aminesspécialement efficaces sont ceux dans lesquels R1 est un groupe arylalkyle en C7-ClO, par exemple benzyle et naphtylm9thyle, R2 est un groupe alkyle en C12-C16, et R3 et R4 sont chacun un radical alkyle inférieur, spécialement méthyle. Il était également surprenant que le complexe isomérase-ammonium puisse être

dissocié si facilement en produisant une enzyme active purifiée.

Les procédés pour produire les extraits de glucose- À isomgrase utilisés comme produits de départ dans le procédé de la présente invention sont bien connus dans la technique. Par exemple, on peut obtenir un extrait enzymatique contenant la glucose-isomErase par fermentations de microorganismes d'une espèce connue comme produisant la glucose-isomdrase, extraction de l'enzyme des mycéliums

et séparation de la matière insoluble par des techniques connues.

Les extraits de glucose-isomgrase préférés peuvent être obtenus à partir de micro-organismes des genres Actinoplanes, Ampullariella, Aerobacter, Arthrobacter, Bacillus, Micromonospora, Microbispora, Microellobospora, Norcardia ou Streptomyces. L'extrait de glucose-isomérase peut être obtenu de manière typique à partir de micro-organismes de l'espèce Streptomyces rubigenosus, Streptomyces

olivochromogenes, Bacillus coagulans ou Bacillus stearothermophilus.

PROCEDES ANALYTIQUES

Protéine totale.

On détermine la protEine totale en utilisant un spectro-

photomètre Beckman module DK-2A à une longueur d'onde de 280 nm.

Activité d'isomgrase: IGIU IGIU est l'abréviation de International Glucose Isomerase Unit et représente la quantité d'enzyme qui transforme 1 micromole

de glucose en fructose par minute dans une solution contenant ini-

tialement 2 mole de glucose par litre, 0,02 mole de MgSO4 et 0,001 mole de CoCl2 par litre à un pH de 6,84 à 6,85 (maléate de sodium 0,2 M) mesuré à la température ambiante et à une température de 60"C. Les déterminations de glucose-isomérase sont effectuées par le procédé décrit par N.E. Lloyd et autres dans Cereal Chem.,

49, n 5, pages 544-553 (1972).

Activité d'isomérase immobilisée: FAU L'activité d'isomérase immobilisée est déterminée par la

technique suivante.

On pèse un échantillon d'isomérase immobilisée contenant 1400-2200 IGIU. On lave l'échantillon dans une fiole de 250 ml avec ml de solution de dosage au dextrose (préalablement chauffée à 650C) et 10 ml de solution de tris-hydroxymétlt'laminométhane (THAM) 0,1 M (pH 7,8). La solution de dosage au dextrose contient du dextrose 3,33 M, du sulfate de magnésium 20 mM, du sulfite de

sodium 10 mM, du THAM 100 mM et du chlorure de cobalt I mM (pH 7,8).

A 650C cette solution de dextrose a un pH de 7,0. On plonge le

flacon dans un bain-marie à 65 C et on l'agite pendant 1 heure.

On filtre le mélange sous vide à travers un Bichner de 45 mm muni d'un filtre à fibre de verre et pré-enduit avec 1 g d'auxiliaire de filtration. On rince le flacon et le gâteau d'enzyme avec de petites portions aliquotes de solution tampon de THAM 100 mM

(pH 7,8) pour un total de 100 ml.

On ajoute cette enzyme lavée à une fiole de 250 ml contenant 125 ml de solution de dosage au dextrose (préalablement équilibrée à 65 C). On lave quantitativement l'enzyme lavée dans la fiole avec 10 ml de tampon THMAM 10 mM (pH 7,8) et on secoue la fiole pendant exactement 60 min. On ajoute ensuite 12,0 ml d'acide acétique glacial et on secoue le mélange acidifié pendant 15 autres min. On filtre le mélange sous vide sur un Bichner de 45 mm muni d'un filtre à fibre de verre et pré-enduit avec environ 1 g d'auxiliaire de filtration. On lave le contenu de la fiole et du filtre par l'eau déminéralisée jusqu'à ce que l'on recueille environ

400 ml de filtrat. On dilue à 500 ml le filtrat refroidi à 25 C.

On détermine le pouvoir rotatoire R2 de la solution à 25 C avec une

cellule de 2 dm.

On traite un échantillon à blanc de la même manière que ci-dessus, sauf qu'on n'ajoute pas d'enzyme. On détermine également la rotation optique R1 du témoin à 25 C. Le degré d'isomérisation est calculé à partir de la relation suivante:

(R2 - R1)

I = aC L p dans laquelle a est la variation de rotation spécifique lorsque le

fructose est complètement converti en dextrose, C est la concen-

P tration de sucre dans la solution (0,15 g/ml) et L est la longueur

du tube du polarimètre (2 dm).

On calcule les unités d'activité fixées (FAU) de l'acti-

vité d'isomérase par l'équation suivante: FAU/g = JC/Kftw dans laquelle Kf est une constante (1,21 1 h FAU mg de glucose), t est la durée de réaction en heures (1 h), w est le poids en g de l'échantillon, C est la concentration initiale du mélange de réaction en mg par 125 ml (75 000 mg de glucose) et J est défini par la relation suivante: J = + + I e In

[ (CX)YAK @] n () - IeI -

dans laquelle I = degré d'isomérisation à l'équilibre en fraction e

molaire de fructose (0,513).

I = degré d'isomérisation en fraction molaire de fructose.

C = concentration molaire initiale de glucose (3,33 M).

m

K = constante de Michaelis pour le glucose (0,7 M).

s Il

K = constante de Michaelis pour le fructose (1,43 M).

1 unité IGIU = 15,8 unités FAU.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute-

fois en limiter la portée.

Exemple.I.

Cet exemple illustre la formation d'un complexe insoluble glucoseisomérase-amine et ensuite la dissociation du complexe dans

une solution ionique pour produire une préparation de glucose-

isomérase active purifiée.

On obtient un extrait de glucose-isomgrase à partir de micro-organismes d'une souche choisie du genre Streptomyces et on l'ajuste h pH 7,2. L'activité d'isomgrase de l'extrait est de IGIU/ml. A chaque récipient d'un groupe de neuf récipients, on ajoute 25 ml de l'extrait d'enzyme (total 1 000 IGIU). On ajoute h la température ambiante à chaque récipient une quantité appropriée

de BTC-835, chlorure de N-(alkyl en C12, C14, C16)-dim9thyl-benzyl-

ammonium (Onyx Chemical Co., Jersey City, New Jersey) en agitant constamment pendant 15 min. L'addition du BTC conduit à ia formation d'un précipité floculant blanc, même à la plus faible teneur de

0,01 % (100 ppm).

On sépare les précipités par centrifugation et on dose

l'activité d'isomérase dans des portions des surnageants résultants.

Les résultats sont donnés dans le tableau I ci-dessous.

Tableau I

Essai BTC % Activité soluble Fraction restant dans IGIU/ml les surna&eans_%__

1 0 40 100

2 0,0100 40 100

3 0,0500 20 50

4 0,1000 O O

0,1500 O 0

6 0,2000 O O

7 0,3000 O 0

8 0,4000 O O

9 0,5000 O O

Les résultats montrent qu'il ne reste pas d'activité

d'isomgrase soluble à une concentration de BTC de 0,1000 % ou plus.

A une concentration de BTC de 0,0500 % l'activité soluble restante

est de 50 %.

- Le précipité de l'essai 5 est remis en suspension dans ml de NaCl 0,5 N à la température ambiante et agité. Le précipité se redissout en quelques minutes. On dilue une portion de 0,5 ml de la solution résultante par 19, 5 ml de NaCl 0,5 N et le dosage

indique la présence d'activité d'isomérase.

Exemple 2

Cet exempte illustre l'utilisation du procède de l'inven-

tion pour produire une glucose-isomirase purifiée et concentrée.

On ajuste à pH 7,2 par NaOH un échantillon de 300 ml de l'extrait d'isomerase de l'exemple 1, ayant une activité totale

de 12 000 IGIU et une activité spécifique de 2,7 IGIU/mg de protéines.

On ajoute du BTC-835 pour donner une concentration finale de 0,1000 % et on agite pendant 15 min. On recueille le précipité formé par

filtration sur un filtrepré-enduit par un adjuvant de filtration.

On lave à l'eau le tourteau de filtration sur le filtre et on dose l'activité d'isomérase d'échantillons du filtrat et des eaux de

lavage. On ne décèle pas d'activité soluble.

On élue le tourteau de filtration par NaCI 0,5 N. On soumet l'gluat de chlorure de sodium à l'ultrafiltration avec une cellule agitée Amicon 401 (Amicon Corp., Danvers, MA) en utilisant une membrane XM100 (limite de poids moléculaire 100 000). Le rêtentat d'ultrafiltration est soumis à la diafiltration avec trois portions de 5 volumes de NaCl 0,5 N pour éliminer le BTC non fixé résiduel. Enfin, le r9tentat est désionisé par diafiltration répétée par l'eau. Le r9tentat final contient un total de 8860 IGIU, avec une activité spécifique de 43,32 IGIU/mg de protéines. On récupère un total de 73,8 % de l'activité d'isomgrase initiale et. l'activité spécifique de 43,32 IGIU/mg de protéines indique que la préparation contient au moins 90 % d'isom6rasecalcul6e en protéines. On réalise donc une purification d'environ 20 fois avec une bonne récupération

d'activité.

Exem2l On réprte le mode opératoire de l'exemple 2 en utilisant un extrait d'isomérase obtenu à partir d'une seconde fermentation du

même Streptomyces décrit à l'exemple 1.

On ajuste à pH 7,2 une portion de 500 ml de l'extrait d'isomérase (total 14 000 IGIU) et on ajoute goutte à goutte du BTC-835 jusqu'à une concentration finale de 0,1000 %. On filtre la

suspension résultante après mélange avec 2 g d'auxiliaire de filtra-

tion et on lave le tourteau de filtration avec environ 100 ml d'eau.

Le filtrat et les eaux de lavage réunis ne contiennent pas d'activité

d'isomérase. On élue ensuite lentement in situ le tourteau de filtra-

tion lavé avec 300 ml de NaCl 0,5 N en une durée de 3 h. L'éluat salin est soumis à l'ultrafiltration avec une

membrane Amicon XM-50 (PM limite 50 000). Le rêtentat d'ultrafiltra-

tion est soumis à une diafiltration poussée avec NaCI 0,5 N et ensuite avec l'eau pour éliminer le BTC résiduel et le sel. Le rétentat final contient un total de 13 550 IGIU avec une activité spécifique de 43,4 IGIU/mg. La purification est donc aussi efficace qu'à l'exemple 2 et la récupération d'activité (94 %) est notablement

améliorée.

Exemle2I 4-

Cet exemple illustre le procédé de l'invention pour purifier un extrait d'isomérase obtenu à partir d'un micro-organisme

du genre Bacillus.

A. La source d'enzyme de départ est une poudre sèche consistant en cellules entières de Bacillus mélangées avec un auxiliaire de filtration comme support et identifiée sous le nom isomérase Novo SP-103 (Novo Industri A/S, Bagsvaerd, Danemark). La solubilisation de l'enzyme est effectuée par mise en suspension de la poudre dans un tampon Tris dilué, pH 7,0, et agitation pendant 2 h à la température ambiante après l'addition de lysozyme

(200 mg/100 g d'enzyme sèche).

On sépare ensuite la matière insoluble par filtration à travers un filtre pré-enduit d'auxiliaire de filtration et on chauffe le filtrat à 60 C et on le maintient pendant 20 min pour précipiter

les impuretés et pasteuriser l'extrait. Apres élimination des inso-

lubles par filtration sur filtre pré-enduit, on ajuste à pH 7,2 une portion de 10 ml de l'extrait (262 IGIU) et on ajoute du BTC-835

jusqu'à une concentration finale de 0,1500 %. On sépare par centri-

fugation le précipité blanc volumineux qui se forme presque immédiatement et on dose l'activité d'isomdrase d'une portion aliquote du surnageant. Il n'y a virtuellement pas d'activité initiale (250 IGIU) dans la fraction soluble, B. On traite une portion des extraits initiaux de la partie A par 0,1500 % de BTC-835 et on sépare par filtration et on jette la matière insoluble résultante. On utilise ensuite des portions de 25 ml (555 IGIU chacune) de l'extrait traité pour l'addition de diverses quantités de BTC-835 pour déterminer la concentration qui serait nécessaire pour précipiter l'isomgrase. Après addition du BTC, on sépare les précipités par centrifugation et on dose l'activité d'isomgrase dansdes portions aliquotes de la phase soluble. Les

résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II ci-dessous.

Tableau II

Essai BTC, % Activité soluble Soluble, % IGIU/ml Total IGIU (total 555 IGIU)

1 0,1000 10,36 259 46,6

2 0,2000 1,76 44 7,9

3 0,3000 1,76 44 7,9

4 0,5000 2,10 53 9,5

L'addition de BTC après prétraitement avec 0,1500 % pour éliminer les impuretés non enzymatiques, conduit à une perte presque totale de l'activité d'isomérase soluble à des concentrations de 0,2000 % de BTC ou plus. Une addition de 0,1000 Z conduit à la

précipitation de la moitié environ de l'activité soluble.

On met en suspension le précipité de chacun des essais ci-dessus dans 10 ml de NaCl 0,5 N. Les précipités se redissolvent rapidement. On réunit les solutions contenant les précipités dissous et on soumet à l'ultrafiltration avec une membrane XM-50. Apres diafiltration avec NaCI 0,5 N et avec l'eau, on analyse le rdtentat

pour doser l'activité d'isomgrase et la concentration de protéine.

La récupération totale d'activité est de 1103 IGIU. L'activité spécifique est de 4,16 IGIU/mg, rapportée à l'estimation de la

protéine par l'absorption des U.V.

Exemple-5

Cet exemple illustre le traitement d'un extrait de

glucose-isomérase avec divers composés d'ammonium quaternaire.

On ajuste à pH 7 des portions égales de l'extrait d'iso-

mérase décrit à l'exemple 3 et on ajoute les divers composés d'ammo-

* nium quaternaire jusqu'à une concentration finale de 0,2000 %. La formation d'un précipité est prise comme preuve d'une réaction entre

l'enzyme et le composé d'ammonium quaternaire.

On essaie les composés quaternaires suivants:

1. BTC-835

chlorure d'(alkyl en C12, C14, C16)-diméthylbenzyl-

ammonium

2. ARQUAD 18-50

chlorure d'octadécyltriméthylammonium

3. CERTRIMIDE (CTAB)

bromure de cétyltriméthylammonium

4. BTC-2125M (DUAL QUAT)

chlorure d'(alkyl en C14, C16, C12, C18)-diméthylbenzyl-

ammonium

chlorure d'(alkyl en C12, C14)-diméthyléthylbenzyl-

ammonium

5. HYAMINE 1622

chlorure de diisobutylphénoxyéthoxyéthyldiméthylbenzyl-

ammonium

6. HYAMINE 2389

chlorure de (méthyldodécylbenzyl)triméthylammonium chlorure de méthyldodécylxylènebis(tétraméthylammonium)

7. MAQUAT DLC 1214

chlorure d'(alkyl en C12, C14, C16, C18)-dimethyl-

(dichlorobenzyl)ammonium

8. BTC-812

chlorure d'octyldodécyldimgthylammonium

9. chlorure d'hexadécyltriméthylammonium.

Les composés 1, 4, 5 et 7 forment des précipités blancs copieux; une précipitation plus faible se produit avec les composés 8, 3 et 2, tandis que la solution reste claire avec les composés 9 et 6. On centrifuge les suspensions pour séparer les précipités par sédimentation et on dose l'activité d'isomérase dans

les surnageants clairs.

On remet en suspension les précipités dans NaCl 0,5 N pour dissocier le complexe enzyme-composé d'ammonium quaternaire et redissoudre l'enzyme. On dose l'activité d'isomgrase dans des portions aliquotes des précipités redissous après dilution par NaCl 0,5 N avec Co+ 0,2 M. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau III ci-dessous.

Tableau III

Composé Précipité Activité soluble Activité du préci- Total N IGIU pité récupérée, IGIU IGIU

1 +++ 101 1 422 1 523

2 + 1 772. .-- 1772

3 + 664 ----- 664

4 +++ 58 278 336

+++ 182 722 904

6 - 1 820 ----- 1820

7 +++ 8 272 280

8 ++ 1 064 722 1786

9 - 1 974.1 974

Témoin - 1 980 ----- 1980 Les quatre composés qui donnent la précipitation visible

la plus abondante, numéros 1, 4, 5 et 7, contiennent tous le substi-

tuant N-benzyle.

Le BTC-812 (composé n 8), qui contient deux groupes alkyles à longue chaîne, conduit à un précipit6 physiquement différent

17 2562087

de celuidi13TC-835 et des autres précipités. La récupération d'acti-

vité dans ce cas est excellente. Les composés 6 et 9 ne provoquent pas de précipitation évidente et l'inactivation de l'enzyme est très faible. Les composés 3, 4 et 7 provoquent des pertes notables d'activité. Exempnjle 6 Cet exemple démontre que le complexe insoluble d'une enzyme et d'un composé d'ammonium quaternaire est doué d'activité enzymatique. On ajuste à pH 7,2 un échantillon de l'extrait d'isomérase de l'exemple 4, on le traite pour atteindre une teneur de 0,1500 % en BTC-835, on mélange avec un auxiliaire de filtration et on recueille

par filtration la matière insoluble. On lave le tourteau de filtra-

tion par l'eau et on mélange. On dose l'activité enzymatique immo-

bilisée d'un échantillon par la technique FAU.

Les résultats montrent une activité exprimée qui est de

29 % de l'activité soluble initiale.

ExemtLple 7

Cet exemple décrit une variante au mode opératoire utili-

sant une résine échangeuse de cations fortement acide pour éliminer

le BTC des précipités isomérase-BTC redissous.

On prépare un concentré d'isomérase partiellement purifié

par ultrafiltration d'un extrait enzymatique brut avec un concentra-

teur Amicon CH4 en utilisant une cartouche HIPIO (PM limite 100 000).

On soumet le rétentat d'ultrafiltration à la diafiltration avec volumes d'eau desionisée pour éliminer les substances solubles résiduelles de bas poids moléculaire. Le concentré final a une activité de 2175 IGIU/ml et une concentration en protéine de 66,9mg/ml

(activité spécifique 32,5 IGIU/mg).

On dilue par l'eau à 300 ml une portion de 10 ml de ce concentré et on l'ajuste à pH 7,2. On ajoute à cette solution 300 mg de BTC-835 et on agite la suspension pendant 30 min. On recueille par centrifugation le précipité formé et on le redissout dans 25 ml de NaCl 0,5 M. On ajoute à cette solution 1 g (en matière sèche) de résine échangeuse de cations (forme sodium) humide AG50 W X4

18 2562087

(fabriqué par la Société Bio Rad Laboratories, Richmond, CA). On ajuste le pH à 7,0 et on agite doucement la suspension pendant 30 min.

On laisse ensuite déposer la résine et on prélève une portion ali-

quote du surnageant en vue d'analyses U.V. pour le dosage de la protéine soluble (absorption à 280 rn) et du BTC (absorption à 262 nm). Les analyses U.V. montrent une élimination totale du BTC soluble. On prélève une autre portion aliquote du surnageant et on la dilue fois par l'eau. L'absence de précipité à cette concentration réduite en sel indique que le BTC a été séparé par la résine. On sépare le surnageant restant de la résine par filtration et on soumet le filtrat à l'ultrafiltration avec une cellule agitée Amicon 201 utilisant une membrane YM-30 pour séparer le NaCl résiduel. On dose l'activité d'isomérase et la concentration de protéine dans le rétentat d'ultrafiltration final. La récupération

d'activité d'isomgrase est de 19 4000 IGIU ou plus de 90 Z de l'acti-

vité initiale, après correction des pertes par prélèvement d'&chan-

tillons. L'activité spécifique est de 40,12 IGIU/mg de protéine.

Cet exemple illustre l'utilisation de diverses amines tertiaires et divers composés d'ammonium quaternaire dans le procédé de l'invention. La technique expérimentale est essentiellement la même que celle décrite à l'exemple 5. On obtient avec succès la précipitation de l'enzyme et une récupération d'au moins 80 Z de l'activité précipitée avec les composés suivants:

MAQUAT MC 1412

chlorure d'(alkyl en C14, C12, C16)-diméthylbenzyl-

ammonium

BTC-1010

chlorure de didécyldiméthylammonium

BTC-1100

chlorure d'(alkyl en C12, C14)-diméthyl-1-naphtylméthyl-

ammonium - Ch lorure de stgaryldim9thylbenzylammonium

HYAMINE 3500

chlorure d'(alkyl en C14, C12, C16)-dimgthylbenzyl-

ammonium.

19 22562087

Il n'y a pas de précipitation de l'enzyme, ou bien l'inactivation se produit, lorsque l'on utilise les composes suivants:

VARIQUAT B-200

chlorure de benzyltrim&thylammonium

ARQUAD 12-50

chlorure de dodgcyltriméthylammonium Diméthyldodecylamine Diméthylbenzylamine

Triisooctylamine.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la séparation de la glucose-isomérase d'une solution aqueuse, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact ladite solution aqueuse avec un dérivé d'amine de formule générale

R1 R1

R2 N ou R2 X o3R3 R4 o R1 est un radical hydrocarbyle ayant au moins 6 atomes de carbone; R2 est un radical hydrocarbyle ayant d'environ 8 à environ 20 atomes de carbone; R3 est un groupe alkyle inférieur; R est H ou un alkyle inférieur; et Aest un anion;

et on récupère le précipité contenant l'enzyme ainsi produit.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que le pH de ladite solution.est d'environ 5,5 à environ 8,5.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé

en ce que le pH est d'environ 6 à environ 8.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1

à 3, caractérisé en ce que la quantité du dérivé d'amine est d'au

moins 0,05 % de Ladite solution aqueuse.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 4, caractérisé en ce que dans Le dérivé d'amine, R2 est un radical alkyLe ayant d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone, R1 est un radical hydrocarbyle ayant d'environ 6 à environ 10 atomes de carbone, R3 et R4 sont chacun un groupe alkyle inférieur et

X est un anion halogénure.

21 2562087

6. Procédé selon L'une quelconque des revendications

1 à 5, caractérisé en ce que la solution aqueuse contient un composé d'amine de formule générale CH3

R2 CH 2-CH2

CH3 dans laquelle R2 est un groupe CnH2n+1, dans lequel n est un entier égal à 12, 14 ou 16, et X est un anion

et en ce qu'on récupère le précipité contenant l'enzyme ainsi produit.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que R2 est un mélange de radicaux de formule CnH2n+l dans lesquels

n est égal à 12, 14 et 16.

8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que le pH de ladite solution aqueuse est d'environ 7,0 à

environ 7,4.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6

à 8, caractérisé en ce que la quantité dudit composé d'amine est

d'au moins environ 0,1000 % de ladite solution aqueuse.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire de redissolution dans un milieu aqueux du précipité contenant l'enzyme

qui a été séparé.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé

en ce que le milieu aqueux comprend un sel ionisé.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications

6 à 11, caractérisé en ce que le composé d'amine est le chlorure

d'(alkyl en C12, C14, C16)-diméthylbenzylammonium.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications

I à 12, caractérisé en ce que le composé d'amine est le chlorure

d'octyldodécyldiméthylammonium, le chlorure de stéaryldiméthyl-

ammonium ou le chlorure de didécyldiméthylammonium.

14. Complexe glucose-isomérase-amine ou ammonium, caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé selon l'une

quelconque des revendications I à 13.