DE3511331A1

DE3511331A1 - Verfahren zum reinigen von waessrigen glucoseisomerase-loesungen

Info

Publication number: DE3511331A1
Application number: DE19853511331
Authority: DE
Inventors: Richard A. Clinton Ia. Johnson; Norman E. Ridgefield Conn. Lloyd
Original assignee: Nabisco Brands Inc
Current assignee: Stabra AG
Priority date: 1984-03-28
Filing date: 1985-03-28
Publication date: 1985-10-10
Also published as: GB8508085D0; US4634673A; FR2562087B1; DK138485D0; DK168960B1; JPS60224491A; GB2156355A; CA1237084A; HU199558B; DE3511331C2; JPH07114699B2; GB2156355B; FR2562087A1; DK138485A; HUT37457A; BE902048A; IT1208519B; IT8520090A0

Description

Verfahren zum Reinigen von wässrigen Glucoseisomerase-Lösungen

Die Erfindung betrifft die Reinigung einer wässrigen Glucoseisomerase-Lösung und insbesondere die Behandlung einer Lösung mit einem Amin unter Ausbildung eines unlöslichen Komplexes, welcher die Enzymaktivität enthält.

Glucoseisomerase ist ein Enzym, welches Glucose in Fructose umwandelt. Eine Reihe von Mikroorganismen ist bekannt, welche Glucoseisomerase bilden. Beispielsweise wird Glucoseisomerase von Mikroorganismen der Genera Actinoplanes, Aerobacter, Ampullariella, Arthrobacter, Bacillus, Lactobacillus und Streptomyces erzeugt. Im allgemeinen wird Glucoseisomerase zunächst intrazellular gebildet und daher findet man

den grösseren Anteil der Glucoseisomerase innerhalb und/oder auf den Zellwandungen der Mikroorganismen. Es ist deshalb erforderlich, das Enzym von den mikroben Zellen zu extrahieren, um das lösliche Enzym zu gewinnen. Bei dem Extraktionsverfahren findet zumindest eine teilweise Zerstörung der Zellhüllen statt und dadurch können das Enzym und andere Zellmaterialien in das mikrobe Enzymextrakt diffundieren. Das Enzymextrakt enthält daher sowohl lösliche als auch unlösliehe Vereunreinigungen. Die unlöslichen Verunreinigungen kann man einfach in bekannter Weise, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abtrennen. Die löslichen Verunreinigungen, von denen man annimmt, dass sie biologische Oligomere oder Polymere sind, z.B.

Nucleinsäuren, nicht-enzymatische Proteine oder Zellwandkomponenten, wie Polyharnsäuren und dergleichen, sind schwierig und aufwendig zu entfernen, weil sie häufig chemische und physikalische Eigenschaften, die dem gewünschten Produkt ähnlich sind, aufweisen.

Verfahren zum Entfernen oder Abtrennen von unerwünschten löslichen Materialien aus mikrobischen Enzymextrakten sind bekannt. Eine Zusammenfassung solcher Methoden findet man beispielsweise in Band XXII von

25 "Methods of Enzymology", Seiten 273 bis 287 und 476

bis 656 (herausgegeben von W.E. Jakoby, Academic Press, N.Y., N.Y.). Es werden dort zahlreiche Methoden für die Enzymreinigung, z.B. Trennverfahren, die auf der Löslichkeit beruhen, Trennverfahren, die auf der spezifischen Affinität beruhen, sowie chromatografische Trennverfahren beschrieben.

Auch in zahlreichen Patentschriften werden Reinigungsverfahren für Enzyme beschrieben. In US-PS 3 769 168 wird die Reinigung von ß-Amylase durch Adsorption, Waschen und Eluieren des Enzyms mit einer ionischen Lösung beschrieben. In US-PS 3 912 595 wird die Reinigung einer hydrolytischen Enzymlösung durch reversible Komplexbildung des Enzyms auf einem körnigen Trägermaterial in einer Säule beschrieben und anschliessend wird das Enzym durch Eluieren mit einem Puffer gewonnen. In US-PS 3 972 777 wird ein Verfahren zum Raffinieren von ß-Galactosidase durch selektive Adsorption auf einem sauren Kationenaustauschharz und anschliessendes Eluieren der ß-Galactosidase von dem Harz mit einem Puffer beschrieben. Bei allen diesen Methoden wird eine unreine Enzymlösung mit einer Matrix beschrieben, welche das Enzym adsorbiert oder bindet und dann wird das gereinigte Enzym von der Matrix durch Zugabe einer Ionenlösung eluiert.

Gemäss US-PS 4 347 322 wird die Enzymreinigung durch ein chromatografisches Verfahren vorgenommen, wobei die löslichen Verunreinigungen bevorzugt an einem Ionenaustauschmaterial adsorbiert werden. Gemäss US-PS 4 106 992 wird rohe Urokinase einer Exklusions-

25 chromatografie unter Verwendung von DEAE-Cellulose-

harz unterworfen. Das dort beschriebene Verfahren ist hauptsächlich auf die Entfernung von pyrogenen Substanzen aus Urokinase gerichtet.

In einer Reihe von Patentschriften wird die Reinigung von mikrobischen Enzymextrakten durch Ausfällung

beschrieben. So wird in US-PS 3 728 244 die Ausfällung von Verunreinigungen mit guaternären Ammonium-Verbindung gelehrt. Aus US-PS 3 794 562 ist das Ausfällen von Verunreinigungen unter Verwendung von Polyethylenimin bekannt. Gemäss US-PS 4 055 469 erfolgt die Ausfällung von Verunreinigungen unter Verwendung von synthetischen Polyelektrolyten. GB-PS 1 411 503 lehrt die Ausfällung von Verunreinigungen mit einem kationischen oberflächenaktiven Mittel. Bei allen diesen Patentschriften erfolgt die Ausfällung und Entfernung der Verunreinigungen während das aktive Enzym in Lösung verbleibt.

Quaternäre Ammoniumverbindungen, die wenigstens einen langkettigen Kohlenwasserstoff-N-Substituenten enthalten sind oberflächenaktive Elektrolyten, die in Lösung Aggregate oder Mycele zu bilden vermögen. Diese Verbindungen kennzeichnen sich durch eine hydrophile quaternäre Aminogruppe und durch eine hydrophobe Kohlenwasserstoffkette. Zahlreiche quaternäre Ammoniumverbindungen haben breite Anwendung als antimikrobielle Mittel gefunden und zwar aufgrund ihrer Fähigkeit, Mikroorganismen zu inaktivieren oder zu inhibieren. Diese Eigenschaft ergibt sich wahrscheinlich durch die BiI-dung eines Anionen-Kationen-Komplexes zwischen dem positiv geladenen quaternären Amin und der negativ geladenen mikroben Oberfläche.

Quaternäre Ammoniumverbindungen bilden auch unlösliehe Anionen-Kationen-Komplexe mit einer Reihe von negativ geladenen Makromolekülen, wie Proteinen. Eine

Ausfällung, Inaktivierung, Denaturisierung, Redispergierung und Komplexbildung sind Phänomene, die aus der Reaktion von Proteinen mit quaternären Ammoniumverbindungen auftreten.
5

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zum Abtrennen von Glucoseisomerasewerten aus wässrigen Lösungen und ist dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung mit einer Aminverbindung der Formel

^R1 Ί- ^Ί

oder ^Λ2^^-Ν^τ Χ R.

* S ^R3

4 in Kontakt bringt, worin bedeuten:

2Q R- einen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens 6 Kohlenstoffatomen ,

R₇ einen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen,

R_ eine Niedrigalkylgruppe,

R. Wasserstoff oder eine Niedrigalkylgruppe, 3Q X ein Anion,

worauf man dann den so erhaltenen enzymhaltigen Niederschlag gewinnt.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Reinigen von Glucoseisomerase in einer wässrigen Lösung zur Verfügung. Die Glucoseisomerase wird mit einem tertiären oder quaternären Amin unter solchen Bedingungen in Berührung gebracht, dass das Amin mit der Isomerase unter Bildung eines unlöslichen Enzym-

Ϊ0 Amin-Komplexes reagiert. Der Isomerase-Amin-Komplex kann zu einer stark ionischen Lösung gegeben werden, in welcher der Komplex dissoziiert und dabei eine lösliche gereinigte und konzentrierte Isomerasezubereitung ergibt.

15

Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass gewisse Aminverbindungen bei dem Verfahren zum Reinigen von Glucoseisomerase-Zubereitungen verwendet werden können.

20

Die tertiären und guaternären Aminverbindungen, die erfindungsgemäss verwendet werden können, haben die allgemeine Formel

25

^R2~X^N oder „' ^N¹ X

und darin bedeuteten R₁ einen Kohlenwasserstoffrest, enthaltend wenigstens 6 Kohlenstoffatome, R₂ einen

Kohlenwasserstoffrest, enthaltend etwa 8 bis 20 Kohlenstoff atome, R₃ einen Niedrigalkylrest und R. Wasserstoff oder einen Niedrigalkylrest.

Die Kohlenwasserstoffreste sind vorzugsweise Alkyl, Cycloalkyl, Alken, Aryl und Aralkyl und können durch Gruppen, wie Halogengruppen, z.B. Chlor und Brom, oder durch Hydroxy, Alkoxy und dergleichen substituiert sein. Die Kohlenwasserstoffreste schliessen auch Kohlenwasserstoffketten, die durch Sauerstoff- oder Schwefelatome unterbrochen sind, also beispielsweise Ether- oder Thioetherbindungen ein, z.B. Diisobutylphenoxyethoxyethylreste und Diisobutylkresoxyethoxyethylreste.

15

X ist irgendein geeignetes anorganisches oder organisches Anion, z.B. ein Halogenid, Nitrat, Sulfat, Benzolsulfonat, Acetat etc., wobei das Anion gegenüber dem Enzym inert ist.

20

Beispiele für Amingruppen der obigen Formen, die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden können, sind Dimethylbenzyldodecylammonium-, Dimethyldilaurylammonium-, Stearyldimethylbenzylammonium-, Distearyldimethylammonium-, Diethyldioctadecylammonium-, Dimethyldidodecylammonium-, Dimethyldodecylnaphthylmethylammonium-, Dimethylhexadecyldichlorobenzylammonium- und Dimethyldiisobutylphenoxyethylbenzylammoniumsalze.

30

Gemäss der vorliegenden Erfindung wird wenigstens eine

der vorerwähnten Aminverbindungen zu dem zu reinigenden wässrigen Glucoseisomeraseextrakt unter solchen Bedingungen gegeben, dass das Amin mit der Glucoseisomerase unter Ausbildung eines unlöslichen Isomerase-Amin-Komplexes, der ausfällt, reagiert. Der unlösliche Isomerase-Amin-Komplex wird dann durch übliche Verfahren, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Zum Entfernen des Enzyms aus dem Niederschlag gibt man den Isomerase-Amin-Komplex zu einer ionisierten Salzlösung, in welcher der Komplex dissoziiert und die Isomerase und das Amin wieder in Lösung gehen. Die Aminverbindung kann dann aus der Enzymlösung durch Ultrafiltration gewonnen werden oder durch Abtrennen mit einem Kationenaustauschharz und man erhält eine gereinigte konzentrierte Glucoseisomerase-Zubereitung mit einer hohen spezifischen Aktivität (beispielsweise einer Aktivität pro mg Protein).

Die Menge des für die Wiederauflösung des ausgefällten Enzym-Amin-Komplexes benötigten ionisierten Salzes kann in einfacher Weise durch einen einfachen Versuch, bei dem man Lösungen verschiedener Konzentrationen, d.h. Ionenstärken, von geeigneten Elektrolyten verwendet, wobei Natriumchlorid aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und der Verfügbarkeit bevorzugt wird. Jeder Elektrolyt kann verwendet werden, sofern er die Glucoseisomerase nicht negativ beeinflusst. Die jeweils benötigte Menge des Salzes stellt man fest als die minimale Konzentration die erforderlich ist, um den Niederschlag aufzulösen. Da Natriumchlorid keinerlei

merkliche Wirkung auf das Enzym hat, kann man es in konzentrierter Lösung verwenden, um ein vollständiges Auflösen des Niederschlags sicherzustellen.

In einigen Fällen kann die wässrige Enzymlösung, aus welcher das Enzym gewonnen werden soll, Verunreinigungen enthalten, die mit der zugegebenen Aminverbindung vor dem Ausfällen des gewünschten Enzyms Niederschläge ergeben. In solchen Fällen sollte die Zu-

gäbe des Amins stufenweise erfolgen und zwar im all- J

gemeinen in zwei Stufen, wobei in der ersten Stufe j

die Verunreinigungen ausfallen und in der zweiten Stufe dann das Enzym. Die Menge des für die erste Stufe verwendeten Amins lässt sich leicht dadurch bestimmen, dass man aliquote Teile der ursprünglichen Enzymlösung verwendet und dazu graduierte Mengen der Aminverbindung zugibt. Der bei jeder Zugabe gebildete Niederschlag wird auf die Enzymaktivität überprüft und wenn diese einmal festgestellt ist, ist dies ein Anzeichen für die Menge des erforderlichen Ausfällungsmittels für die Ausfällung in der ersten Stufe.

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet man vorzugsweise quaternäre Amine der vorgenannten allgemeinen Formeln, worin R2 einen Alkylrest mit etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen, R₁ einen Rest mit etwa 6 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, R-, und R₄ Niedrigalkylreste und X ein Halogenanion bedeuten. Noch bevorzugtere Verbindungen sind solehe, bei denen R₂ einen Alkylrest mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, R₁ einen Aralkylrest mit 7 bis 10

Kohlenstoffatomen, R₃ und R₄ Niedrigalkylreste und X einen Halogenrest bedeuten.

Ganz besonders bevorzugte Verbindungen haben die allgemeine Formel

10 ^C _n ^H2n+1

worin η eine ganze Zahl, die 12, 14 oder 16 entspricht, ist und X ein Halogenanion ist. Ein solche Verbindungen enthaltendes Produkt wird unter dem Handelsnamen BTC-835 von der Onyx Chemical Co., Jersey City, New Jersey, USA, vertrieben. BTC-835 ist eine Mischung aus 50 % einer Verbindung, in welcher η in der obigen Formel 14 ist, 40 % einer Verbindung, in welcher η in der obigen Formel 12 ist und 10 % einer Verbindung, in welcher η in der obigen Formel 16 ist.

Die Bedingungen unter denen man die vorliegende Erfindung durchführen kann, hängen von der Reinheit und der Konzentration des Isomeraseextraktes und der jeweils verwendeten Aminverbindung ab. Die Menge des verwendeten Amins soll ausreichen, um im wesentlichen das gesamte aktive Enzym auszufällen und beträgt im allgemeinen wenigstens 100 ppm auf einer Gewichts-pro-

ι Volumen-Basis. Die bevorzugte Menge beträgt wenig- [

stens etwa 500 ppm und im allgemeinen etwa 500 bis [

etwa 5.000 ppm. Ganz besonders bevorzugt wird eine t

Menge von etwa 1.000 bis etwa 3.000 ppm.

Der pH-Wert soll in einem Bereich liegen, der etwa eine pH-Wert-Einheit oberhalb des isoelektrischen Punktes (pi) des Enzyms und etwa eine pH-Wert-Einheit unterhalb des pKa der verwendeten Aminverbindung liegt. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert etwa 5,5 bis etwa 8,5, noch bevorzugter etwa 6,0 bis etwa 8,0 und ganz besonders bevorzugt etwa 7,0 bis etwa 7,4.

Die Temperatur kann in einem weiten Bereich variieren und zwar von 0⁰C bis zu der Temperatur, bei welcher eine Wärmedenaturisierung oder Inaktivierung des Enzyms eintritt. Der Einfachheit halber wird das Verfahren im allgemeinen bei Umgebungstemperatur

20 durchgeführt.

Der Mechanismus, nach dem das Verfahren abläuft, ist derzeit noch nicht genau bekannt. Man nimmt an, dass das Amin mit der Glucoseisomerase unter Ausbildung eines unlöslichen Isomerase-Amin-Komplexes reagiert. Gibt man den unlöslichen Isomerase-Amin-Komplex zu einer starken ionischen Lösung, dann dissoziiert der Isomerase-Amin-Komplex und Isomerase und Amin gehen wieder in Lösung.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzielbaren

Ergebnisse sind ausserordentlich überraschend. So war es sehr überraschend, dass man die vorliegenden Aminverbindungen zum Reinigen von Glucoseisomerase-Extrakten anwenden kann, weil man annahm, dass es sich hier um starke Enzyminaktivatoren und Denaturisierungsmittel handelt. Überraschenderweise sind nicht alle quaternären Ammoniumsalze und auch nicht alle tertiären Amine in der Lage, solche Ergebnisse zu erzielen, wie sie mit den speziellen tertiären Aminen und quaternären Ammoniumsalzen gemäss der vorliegenden Erfindung erzielt werden. Bekannte guaternäre Aminsalze, wie Hexadexyltrimethylammoniumchlorid bildet keinen Niederschlag unter den Bedingungen der vorliegenden Erfindung, während andere Aminverbindungen, z.B. Octadecyltrimethylammoniumchlorid eine geringe Menge eines Niederschlags ergibt, der jedoch keine nachweisbare Enzymaktivität aufweist. Andere Amine verursachen einen erheblichen Verlust an Enzymaktivität und zwar unabhängig davon ob sie einen Niederschlag bilden oder nicht. Die besonders wirksamen Aminverbindungen sind solche, bei denen R- eine Aralkylgruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, z.B. Benzyl und Naphthylmethyl, R₂ Alkyl mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen bedeutet und R₃ und R₄ jeweils Niedrigalkyl,

insbesondere Methyl, bedeuten. Es ist auch überraschend, dass man den Isomerase-Amin-Komplex so einfach wiederauflösen kann unter- Ausbildung eines gereinigten aktiven Enzyms.

Verfahren zum Herstellen von Glucoseisomerase-Extrakten, die als Ausgangsmaterialien beim erfindungsgemässen

Verfahren verwendet werden können, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann man ein Enzymextrakt, welches Glucoseisomerase enthält, dadurch erhalten, dass man Mikroorganismen einer Spezies, von der man weiss, dass sie Glucoseisomerase bilden, fermentiert, das Enzym aus den Mycelen extrahiert und unlösliches Material in bekannter Weise entfernt.

Bevorzugte Glucoseisomerase-Extrakte, die man von Mikroorganismen erhalten kann, sind solche der Genera Actinoplanes, Ampullarieila, Aerobacter, Arthrobacter, Bacillus, Micromonospora, Microellobospora, Norcardia oder Streptomyces. Typischerweise können Glucoseisomerase-Extrakte von Mikroorganismen der Spezies Streptomyces rubigenosus, Streptomyces olivochromogenes,

Bacillus coagulans oder Bacillus stearothermophilus erhalten werden.

ANALYSEMETHODEN

Gesamtprotein

25 Das Gesamtprotein wurde bestimmt unter Verwendung

eines Beckmann Model DK-2A Spektrofotometers bei einer Wellenlänge von 280· ΐημ.

Isomeraseaktivität-IGIU
30

IGIU ist die Abkürzung für Internationale Glucose Isomerase Unit und ist die Menge des Enzyms, die 1

Mikromol Glucose pro Minute in Glucose umwandelt und zwar in einer Lösung, die anfangs 2 Mol Glukose pro Liter, 0,02 Mol MgSO₄ und 0,001 Mol CoCl₂ pro Liter bei einem pH-Wert von 6,84 bis 6,85 (0,2 M Natriummaleat), gemessen bei Umgebungstemperatur und bei einer Temperatur von 6O⁰C, enthielt. Die Glucoseisomerase-Bestimmung wurde nach der Methode, die von N.E. Lloyd et al, Cereal ehem., 49, Nr. 5, Seiten

544 bis 553 (1972) beschrieben wird, durchgeführt. 10

Immobilisierte Isomeraseaktivität-FAU

Die immobilisierte Isomeraseaktivität wurde nach folgendem Verfahren bestimmt:

Eine immobilisierte Isomeraseprobe, enthaltend 1.400 bis 2.200 IGIU, wurde abgewogen. Die Probe wurde in einen 250 ml-Kolben mit 125 ml Dextrose-Assay-Lösung (vorher auf 65°C erwärmt) und 10 ml 0,1 Tris-hydroxymethylaminomethan (THAM)-Lösung (pH 7,8) gespült. Die Dextrose-Assay-Lösung enthielt 3,33 M Dextrose, 20 mM Magnesiumsulfat, 1OmM Natriumsulfit, 100 mM THAM und 1 mM Cobaltchlorid (pH-Wert 7,8). Bei 65°C hatte die Dextroselösung einen pH-Wert von 7,0. Der Kolben wurde in ein Wasserbad von 65⁰C eingetaucht und 1 Stunde geschüttelt. Die Mischung wurde durch einen 45 mm-Trichter mit einer groben Glasfritte mit einem Glasfaserfilter, das zuvor mit 1 g Filterhilfe beschichtet

30 worden war, im Vakuum filtriert. Der Kolben und der

Enzymkuchen wurden mit kleinen aliquoten Anteilen von

100 mM THAM-Pufferlösung (pH 7,8) bis zu einer Ge- E

samtmenge von 100 ml gelöst. [

Dieses gewaschene Enzym wurde zu einem 250 ml-Kolben, \

enthaltend 125 ml Dextrose-Assay-Lösung (zuvor bei 65⁰C ins Gleichgewicht gebracht),gegeben. Das gewaschene Enzym wurde quantitativ in dem Kolben zusammen mit 10 ml einer 10 mM THAM-Puffers 8pH 7,8) gespült und der Kolben wurde genau 60 Minuten geschüttelt. .10 Dann wurden 12,0 ml Eisessig zugegeben und die angesäuerte Mischung wurde weitere 15 Minuten geschüttelt. Die Mischung wurde durch einen 45 mm-Glastrichter mit grober Fritte, der mit einem Glasfaserfilter ausgerüstet war und zuvor mit 1 g Filterhilfe beschichtet worden war, im Vakuum filtriert. Der Kolben und der Trichterinhalt wurden mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, bis annähernd 400 ml Filtrat gesammelt worden waren. Das Filtrat wurde auf 25⁰C gekühlt und auf 500 ml verdünnt. Die Drehung der Lösung wurde mit

20 einer 2 dm-Zelle bei 25⁰C als R₂ bestimmt.

Eine Blindprobe wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben, jedoch ohne Zugabe des Enzyms, durchgeführt. Die optische Drehung der Blindprobe wurde ebenfalls bei 25⁰C als R₁ bestimmt. Der Isomerisierungsgrad wird nach folgender Gleichung berechnet:

τ = (^R2 -

ac L 30 ^P

worin a die spezifische Drehungsveränderung bedeutet, wenn Fructose vollständig in Dextrose umgewandelt ist, C die Konzentration des Zuckers in der Lösung (0,15 g/ml) und L die Länge des Polarimeterrohres (2 dm) ist.

Die fixierte Aktivitätseinheit (FAU) der Isomeraseaktivität wird wie folgt berechnet:

FAü/g = JC/K_ftw

worin K_f eine Ratenkonstante (1,21 I h FAU

mg

Glucose), t die Reaktionszeit in Stunden (1 h) , w das Gewicht in Gramm der Probe, C die Anfangskonzentration in mg pro 125 ml Reaktionsmischung (75.000 mg Glucose) bedeutet und J wie folgt definiert wird:

J =

- 1

worin bedeuten:

m s

= Isomerisierungsgrad beim Gleichgewicht als

Molfraktion von Fructose (0,513), = Isomerisierungsgrad als Molfraktion von Fructose,

= Anfangsmolkonzentration von Glucose (3,33 M) , = Michaelis-Konstante für Glucose (0,7 M) , = Michaelis-Konstante für Fructose (1,43 M)

Ein IGIU entspricht 15,8 FAU¹s.

Die folgenden Beispiele beschrieben die Erfindung.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Bildung eines unlösliehen Glucoseisomerase-Amin-Komplexes und die Dissoziation des Komplexes in einer ionischen Lösung unter Ausbildung einer gereinigten aktiven Glucoseisomerase-Zubereitung.

Ein Glucoseisomerase-Extrakt wurde aus Mikroorganismen eines ausgewählten Stammes von Streptomyces genes erhalten und auf den pH-Wert 7,2 eingestellt. Die Isomeraseaktivität des Extraktes betrug 40 IGIU/ml. Zu jedem von 9 Behältern wurden 25 ml des Enzymextraktes (1.000 IGIU-Gesamt) gegeben. Eine ausreichende Menge an BTC-835, N-Alkyl(C.₂, CL., C.,)-dimethyl-benzylammoniumchlorid (Onyx Chemical Co., Jersey City, New Jersey) wurde in jeden Behälter bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren während 15 Minuten gegeben. Die Zugabe von BTC ergab die Bildung eines weissen flockigen Niederschlags und zwar schon bei dem untersten Niveau von 100 ppm.

Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und Anteile der überstehenden Lösung wurden auf die Isomeraseaktivität untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle I gezeigt.

Tabelle I

Versuch	(BCT) ppm	Lösungsakti vität IGIü/ml	% Rest überste hende Fraktion
1	0	40	100
2	100	40	100
3	500	20	50
4	1 .000	0	0
5	1 .500	0	0
6	2.000	0	0
7	3.000	0	0
8	4.000	0	0
9	5.000	0	0

Die Daten zeigen, dass keine lösliche Isomeraseaktivität bei einer BTC-Konzentration von 1.000 ppm oder mehr verblieb. Bei einer BTC-Konzentration von 500 ppm betrug die restliche Löslichkeitsaktivität 50 %.

Der Niederschlag von Versuch 5 wurde in 5 ml 0,5 N NaCl bei Raumtemperatur resuspendiert und gerührt. In wenigen Minuten löste sich der Niederschlag wieder auf. Ein 0,5 ml-Anteil der erhaltenen Lösung wurde mit 19,5 ml NaCl verdünnt und eine Untersuchung zeigte eine Isomeraseaktivität.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bildung einer gereinigten und konzentrierten Glucoseisomerase.

Eine 300 ml-Probe des Isomeraseextraktes von Beispiel 1 mit einer Gesamtaktivität von 12.000 IGIU und einer spezifischen Aktivität von 2,7 IGIU/mg

Protein wurde mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. BTC-835 wurde bis zu einer Endkonzentration von 1.000 ppm zugegeben und dann wurde 15 Minuten gerührt. Der so gebildete Niederschlag wurde auf einer Vorbeschichtung von Filterhilfen durch Filtrieren gesammelt. Der gesammelte Kuchen wurde auf dem Filter mit Wasser gewaschen und Proben des Filtrats und des Waschwassers wurden auf Isomeraseaktivität untersucht. Es wurde keine Aktivität bei den Lösungen festgestellt.

Der Filterkuchen wurde mit 0,5 N NaCl eluiert. Das Natriumchlorideluat wurde mit Amicon 401 gerührten Zellen (Amicon Corp, Denver, MA) unter Verwendung einer XM100 (100.000 Mol Gewicht cut-off (MWCO))-

25 Membran ultrafiltriert. Das ültrafilterretentat

wurde mit 3 Volumenanteilen von 0,5 N NaCl zum Entfernen von restlichem ungebundenen BTC diafiltriert. Schliesslich wurde das Retentat durch wiederholte Diafiltration mit Wasser entsalzen. Das fertige Retentat enthielt insgesamt 8.860 IGIU mit einer spezifischen Aktivität von 43,32 IGIU/mg Protein. Insgesamt 73,8 %

der Ausgangs-Isomeraseaktivität wurden gewonnen und die spezifische Aktivität von 43,32 IGIU/mg Protein zeigte an, dass die Zubereitung wenigstens 90 %
Isomerase auf einer Proteinbasis enthielt. Es wurde somit eine Reinigung um etwa das 20-fache bei einer guten Aktivität erzielt.

10 Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt unter Verwendung eines Isomeraseextraktes, das aus einer
zweiten Fermentation des gleichen Streptomyces, das in Beispiel 1 verwendet wurde, erhalten wurde.

Ein 500 ml-Anteil des Isomeraseextraktes (14.000 IGIU gesamt) wurde auf den pH-Wert 7,2 eingestellt und dazu wurde bis zu einer Endkonzentration von

1.000 ppm tropfenweise BTC-835 gegeben. Die erhaltene Suspension wurde nach Zugabe von 2 g einer Filterhilfe filtriert und der Filterkuchen wurde mit etwa 100 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat plus die Waschwässer enthielten keine Isomeraseaktivität. Der gewaschene Filterkuchen wurde dann langsam in situ mit 300 ml 0,5 N NaCl während einer Dauer von 3 Stunden eluiert.

Das Salzeluat wurde mit einer Amicon-Membran XM-50
(50.000 MWCO) ultrafiltriert. Das Ultrafilterretentat wurde gründlich mit 0,5 N NaCl und dann mit Wasser

zur Entfernung von restlichem BTC und von Salz diafiltriert. Das letzte Retentat enthielt insgesamt 13.550 IGIU mit einer spezifischen Aktivität von 4 3,4 IGIU/mg. Die Reinigung war also ebenso erfolgreich wie in Beispiel 2 und die Aktivität (94 %) wurde erheblich erhöht.

10 Beispiel 4

In diesem Beispiel wurde das erfindungsgemässe Verfahren zum Reinigen eines Isomeraseextraktes, das aus Bacillus-Mikroorganismen erhalten worden war, angewendet.

(A) Die Ausgangs-Enzymquelle war ein Trockenpulver, bestehend aus Bacillus-Gesamtzellen, vermischt

20 mit einem Filterhilfenträger mit der Bezeichnung

Novo SP-104-Isomerase (Novo Industri A/S, Bagsvaerd, Dänemark). Die Enzymsolubilisierung erfolgte, indem man das Pulver in einem verdünnten Tris-Puffer, pH-Wert 7,0, suspendierte und 2 Stunden bei Raumtempe-

25 ratuf rührte, nachdem man Lysozym zugegeben hatte

(200 mg/100 g trockenes Enzym). Das unlösliche Material wurde durch ein Filter, das mit einer Filterhilfe vorbeschichtet war, abfiltriert und das Filtrat wurde auf 60⁰C erwärmt und 20 Minuten dabei gehalten, um

30 Verunreinigungen auszufällen und das Extrakt zu pasteurisieren. Nach der Entfernung der unlöslichen

Bestandteile über ein vorbeschichtetes Filter wurde ein 10 ml-Anteil des Extraktes (262 IGIU) auf den pH-Wert 7,2 eingestellt und dazu wurde BTC-835 bis zu einer Endkonzentration von 1.500 ppm gegeben. Der sich dabei unmittelbar bildende schwere weisse Niederschlag wurde abzentrifugiert und ein aliquoter Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde auf Isomeraseaktivität untersucht. Praktisch die gesamte Ausgangsaktivität (259 IGIU) befand sich in der löslichen Fraktion.

(B) Ein Teil des ursprünglichen Extraktes von Teil (A) wurde mit 1.500 ppm BTC-835 behandelt und

das dabei gebildete unlösliche Material wurde abfiltriert und verworfen. 25 ml (555 IGIU jeweils) des behandelten Extraktes wurden dann für die Zugabe von unterschiedlichen Mengen an BTC-835 verwendet, um festzustellen, welche Konzentration zur Ausfällung

20 der Isomerase erforderlich ist. Nach Zugabe von BTC

wurden die Niederschläge abzentrifugiert und aliquote Teile der löslichen Phase wurden auf Isomeraseaktivität untersucht und die Ergebnisse werden in Tabelle II zusammengefasst.

Tabelle II

Ver	(BTC)	Aktivität	i.d. Lösung	% Lösliches
such	ppm	IGIü/ml	Gesamt-IGIU..	(555 IGIU ges.)
1	1.000	10,36	259	46,6
2	2.000	1 ,76	44	7,9
3	3.000	1,76	44	7,9
4	5.000	2,10	53	9,5

Die Zugabe von BTC ergab, nach einer Vorbehandlung mit 1.500 ppm zur Entfernung der nicht-enzymatischen Verunreinigungen, nahezu den gesamten Verlust der Aktivität an löslicher Isomerase bei Konzentrationen von 2.000 ppm BTC oder höher. Die Zugabe von 1.000 ppm ergab einen Niederschlag von etwa der Hälfte der löslichen Aktivität.

Der Niederschlag aus jedem der obigen Versuche wurde in 10 ml einer 0,5N NaCl-Lösung suspendiert. Die Nie-

25 derschläge lösten sich schnell wieder auf. Die die

aufgelösten Niederschläge enthaltenden Lösungen wurden zusammengegeben und mit einer XM-50-Membran ultrafiltriert. Nach der Diafiltration mit 0,5 N NaCl und mit Wasser wurde das Retentat auf Isomeraseaktivität und Proteinkonzentration analysiert. Die gesamte gewonnene Aktivität betrug 1.103 IGIU. Die spezifische

Aktivität betrug 4,16 IGIU/mg, bezogen auf Protein, das durch UV-Absorption gemessen wurde.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von Glucoseisomerase-Extrakt mit unterschiedlichen guaternären Ammoniumverbindungen.

Gleiche Anteile des in Beispiel 3 beschriebenen Isomeraseextraktes wurden auf den pH-Wert 7 eingestellt und verschiedene quaternäre Ammoniumverbindungen wurden bis zu einer Endkonzentration von 2.000 ppm zugegeben. Die Bildung eines Niederschlags wurde als Beweis für eine Umsetzung zwischen dem Enzym und der quaternären Ammoniumverbindung angesehen.

Es wurden die folgenden quaternären Verbindungen geprüft :

(1) BTC-835

Alkyl (C₁₅, C₁₄, C_1ß)dimethylbenzylammonium-Chlorid,

(2) ARQUAD 18-50
Octadecyltrimethylammoniumchlorid,

30 (3) CERTRIMIDE (CTAB)

Cetyltrimethylammoniumbromid,

(4) BTC-2125M (DUAL QUAT)

Alkyl (C₁₄, C₁₆, C₁₂, C₁₈)dimethylbenzyl~ ammoniumchlorid,

Alkyl (C₁₂/ C₁₄)dimethylethylbenzylammonium chlorid,

(5) HYAMINE 1622

Diisobutylphenoxyethoxyethyldimethylbenzylammoniumchlirid,

(6.) HYAMINE 2389

(MethyldodecyIben zy1)trimethy1ammoniumchlorid,

Methyldodecylxylenbis(tetramethyl)ammonium-

15	(7)	chlorid,
20	(8)	MAQUAT DLC 1214 Alkyl (C₁₂, C₁₄, C₁₆, C₁₈)dimethyl(dichloro benzyl)ammoniumchlorid,
	(9)	BTC-812 Octyldodecyldimethylammoniumchlorid,
25	Hexadecyltrimethylammoniumchlorid.

Die Verbindungen (T), (4), (5) und (7) bildeten grosse Mengen eines weissen Niederschlags. Eine geringere Ausfällung erfolgte mit den Verbindungen (8), (3) und (2), während mit den Verbindungen (9) und (6) kein Niederschlag gebildet wurde. Die Suspensionen

wurden zum Abtrennen der Niederschläge zentrifugiert und aliquote Teile der klaren, überstehenden Lösungen wurden auf Isomeraseaktivität untersucht. Die Ausfällungen wurden in 0,5.NNaCl resuspendiert, um den Enzym-quaternären Ammonium-Verbindungskomplex zu dissoziieren und das Enzym wieder in Lösung zu bringen. Aliquote Teile des resolubilisierten Niederschlags wurden auf Isomeraseaktivität untersucht, nachdem man eine Verdünnung mit 0,5NNaCl und -0,2 M Co vorgenommen hatte.

Die Ergebnisse werden in Tabelle III gezeigt.

Tabelle III

Verbindung Nr.	Ausfällung lösliche Akti vität IGIU	Aktivität der Ausfüllung IGIU	Gesamt- IGIU
1	+++ 101	1 .422	1.523
2	+ 1.772		1.772
3	+ 664		664
4	+++ 58	278	336
5	+++ 182	722	904
C.	_ 1 Q on		1 (ion
O 7	I .ozU +++ 8	272	I . OZU 280
8	++ 1.064	722	1.786
9	1.974		1 .974
Kontrolle	1.980		1.980

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5511331

Die vier Verbindungen, die den am stärksten sichtbaren Niederschlag in der grössten Menge ergaben, waren Verbindungen (1), (4), (5) und (7), die alle den N-Benzylsubstituenten enthielten. 5

BTC-812 (8), welches zwei langkettige Alkylgruppen enthielt, ergab einen Niederschlag, der sich physikalisch von dem Niederschlag unterschied, den man mit BTC-835 und den anderen Ausfallungsmitteln erhielt.

Die Gewinnung der Aktivität war in diesem Fall ausgezeichnet. Die Verbindungen (6) und (9) ergaben offensichtlich keine Ausfällung und nur eine sehr geringe Enzyminaktivierung. Die Verbindungen (3), (4) und (7) ergaben einen merklichen Verlust an Aktivität.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wird gezeigt, dass der unlösliche Komplex aus einem Enzym und einer quaternären Ammoniumverbindung enzymatisch aktiv ist.

Eine Probe des Isomeraseextraktes von Beispiel 4 wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und dann mit 1.500 ppm BTC-835 behandelt. Dazu wurde eine Filterhilfe gegeben und das unlösliche Material wurde abfiltriert. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und vermischt. Eine Probe wurde auf die Aktivität des immobilisierten Enzyms mittels des FAU-Verfahrens analysiert.

Das Ergebnis zeigte eine Aktivität, die 29 % der Ausgangsaktivität der Lösung entsprach.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird ein alternatives Verfahren verwendet, bei dem man ein stark saures kationisches Austauschharz zur Entfernung von BTC aus den wiederaufgelösten Isomerase-BTC-Ausfällungen verwendet.

Ein teilgereinigtes Isomerasekonzentrat wurde hergestellt indem man ein rohes Enzymextrakt mit einem Amicon CH4-Konzentrator unter Verwendung einer HIP100 Cartridge (100.000 MWCO) ultrafiltrierte. Das Ultrafilterretentat wurde mit 5 Volumina entionisiertem Wasser zur Entfernung von niedrigmolekulargewichtigen löslichen Stoffen diafiltriert. Das fertige Konzen-

20 trat hatte eine Stärke von 2.175 IGIU/ml und eine

Proteinkonzentration von 66,9 mg/ml (spezifische Aktivität 32,5 IGIU/mg).

Ein 10 ml-Anteil dieses Konzentrats wurde mit Wasser auf 300 ml verdünnt und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 300 mg BTC-835 gegeben und die Suspension wurde 30 Minuten gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit 25 ml 0,5 M NaCl wieder aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde 1 g (auf Trockenbasis) feuchtes AG50 W X4 (hergestellt von Bio Rad Laboratories,

Richmond, CA) Kationenaustauschharz (Natriumform) gegeben. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt und die Suspension wurde schwach während 30 Minuten gerührt. Dann liess man das Harz sich absetzen und ein aliguoter Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde für eine UV-Analyse auf lösliches Protein (Absorption bei 280 nm) und für BTC (Absorption bei 262 nm) entnommen. Die UV-Analysen zeigten die gesamte Entfernung an löslichem BTC. Ein weiterer aliquoter Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde genommen und 10-fach mit Wasser verdünnt. Die Abwesenheit eines Niederschlags bei dieser verminderten Salzkonzentration zeigte, dass das BTC mittels des Harzes entfernt worden war. Der Rest der überstehenden Flüssigkeit wurde vom Harz durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat wurde mit einer Amicon 201 gerührten Zelle unter Verwendung einer YM-30-Membran zur Entfernung von restlichem NaCl ultrafiltriert. Das restliche Ultrafilterretentat wurde auf Isomeraseaktivität und. Proteinkonzentration unter-

20 sucht. Die Ausbeute an Isomeraseaktivität betrug

19.4 000 IGIU oder mehr als 90 % der Ausgangsaktivität, korrigiert um die bei der Probenahme entstandenen Verluste. Die spezifische Aktivität betrug 40,12 IGIU/mg Protein.

Beispiel 8

in diesem Beispiel wird die Verwendung von verschiedenen guaternären und tertiären Aminen beim erfindungsgemässen Verfahren gezeigt. Die Verfahrensweise war

" ³⁵ ' 351133

im wesentlichen die gleiche wie in Beispiel 5. Eine erfolgreiche Enzymausfällung und Gewinnung von wenigstens 80 % der ausgefällten Aktivität wurde mit den folgenden Verbindungen erzielt: 5

MAQUAT MC 1412

Alkyl(C₁., C₁-, C_1fi)dimethylbenzylammonium-

chlorid, BTC-1010

Didecyldimethylammoniumchlorid,

BTC-1100

Alkyl (C₁₂' C.Jdimethyl-i-naphthylmethyl-15 ammoniumchlorid,

Stearyldimethylbenzylammoniumchlorid,

HYAMINE 3500

20 Alkyl (C₁₄/ C₁~, C_1fi)dimethylbenzylammonium-

chlorid,

Bei Verwendung der nachfolgenden Verbindungen fand entweder keine Enzymausfällung statt oder es trat eine inaktivierung ein:

VARIQUAT B-200 Benzyltrimethylammoniumchlorid,

ARQUAD 12-50

Dodecyltrimethylammoniumchlorid,

- 36 -

Dimethyldodecylamxn, Dimethylbenzylamin, Triisooctylamin.

Claims

HOFFMANN · EITLE & PARTNER ^:

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE

PATENTANWÄLTE DiPL.-ΙΝβ. W. EITLE . DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FClCHSLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H,-A. BRAUNS . DIPL.-ING. K. GDRG

DIPL.-ING. K. KOHLMANN . RECHTSANWALT A. NETTE

41 788 o/wa

NABISCO BRANDS, INC., PARSIPANNY, N.J. / USA

Verfahren zum Reinigen von wässrigen Glucoseisomerase-Lösungen

PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zum Abtrennen von Glucoseisomerase von wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeich net, dass man die wässrige Lösung mit einem Aminkomplex der allgemeinen Formel

oder

10

worin bedeuten:

ARABELLASTRASSE 4 · D-SOOO MÜNCHEN 81 · TELEFON CO 89J 9110S7 · TELEX 5-29619 CPATHE^ · TELEKOPIERER 9183 56 ""

_ ο —

R₁ einen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens Kohlenstoffatomen,

R₂ einen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen,

R- Niedrigalkyl,

R. H oder Niedrigalkyl und 10

X ein Anion,

in Berührung bringt und den dabei erhaltenen enzymhaltigen Niederschlag gewinnt. 15

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man den pH der Lösung auf etwa 5,5 bis etwa 8,5 einstellt.

3. Verfahren gemä-s Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass man den pH auf etwa 6 bis etwa 8 einstellt.

4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, da-25 durch gekennzeichnet , dass die Menge der Aminverbindung wenigstens 500 ppm, bezogen auf die wässrige Lösung, beträgt.

5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, da-30 durch gekennzeichnet , dass in der

Aminverbindung R₁ ein Alkyl mit etwa 8 bis etwa

18 Kohlenstoffatomen, R₂ ein Kohlenwasserstoffrest mit etwa 6 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, R- und R- jeweils Niedrigalkylgruppen und X ein Halogenanion bedeuten.

Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , dass die wässrige Lösung eine Aminverbindung der Formel

enthält, worin R₂ C H₂₁ bedeutet, worin η eine

ganze Zahl entsprechend 12, 14 oder 16 bedeutet und X ein Anion bedeutet, und dass man den so erhaltenen enzymhaltigen Niederschlag gewinnt.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch g e k e η η zeichnet , dass R₂ eine Mischung von Resten der Formel C H» ₊₁ ist, worin η 12, 14 oder

25 16 bedeutet.

8. Verfahren gemäss Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , dass der pH-Wert der wässrigen Lösung etwa 7,0 bis etwa 7,4 be-

30 trägt.

9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet / dass die Menge der wässrigen Aminverbindung wenigstens i.000 ppm, bezogen auf die wässrige Lösung, beträgt.

10. Verfahren gemäss Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , dass man in einer weiteren Stufe den abgetrennten enzymhaltigen

10 Niederschlag in einem wässrigen Medium wieder löst.

11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch g e k e η η zeichnet , dass das wässrige Medium ein

15 ionisiertes Salz einschliesst.

12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6 bis 11 , dadurch gekennzeichnet , dass die Aminverbindung ein Alkyl (C₁-, C ., C.₆)dimethyl-

20 benzylammoniumchlorid ist.

13. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , dass die Aminverbindung Octyldodecyldimethylammoniumchlorid, Stearyldimethylammoniumchlorid oder Didecyldimethylammoniumchlorid ist.